KR102089449B1

KR102089449B1 - 유글레나 그라실리스 및 박테리움 비브리오 나트리에젠스 공동배양을 통한 파라밀론의 생산방법

Info

Publication number: KR102089449B1
Application number: KR1020180148670A
Authority: KR
Inventors: 최윤이; 김지영; 오정주; 전민서
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-03-16

Abstract

본 발명은 박테리움 비브리오 나트리에젠스와 유글레나 그라실리스를 공동 배양하여 유글레나의 성장을 촉진시키고, 베타글루칸 중합체인 파라밀론 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파라밀론의 생산방법은 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양함으로써 유글레나 그라실리스 생장을 촉진시키며 파라밀론 생산을 증대시킬 수 있는바, 베타글루칸 중합체인 파라밀론을 효과적으로 생산할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에서는 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양시 파라밀론 생산을 최대한으로 도출할 수 있는 최적의 접종 배양 농도비율 및 박테리아 접종 시기를 확인하였는바, 베타글루칸 원료 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유글레나 그라실리스 및 박테리움 비브리오 나트리에젠스 공동배양을 통한 파라밀론의 생산방법{Production method of paramylon by co-cultivation of Euglena gracilis and bacterium Vibrio natriegens}

본 발명은 박테리움 비브리오 나트리에젠스와 유글레나 그라실리스를 공동 배양하여 유글레나의 성장을 촉진시키고, 베타글루칸 중합체인 파라밀론 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

베타-1, 3-글루칸(β-1, 3-glucan)은 면역력 강화, 항산화 작용, 콜레스테롤과 혈압 수치 조절 등에 도움이 되는 것으로 알려진 물질이다. 이러한 기능 덕분에 화장품, 건강기능식품 등 다양한 곳에 활용되고 있으며, 수요가 증가함에 따라서 베타글루칸 생산 원료에 대한 관심도 증가하고 있는 추세이다. 베타글루칸은 버섯, 곡물, 박테리아 등 다양한 생물에 존재하고 있으나, 이들로부터의 베타글루칸 생산은 효율이 낮거나 추출법이 어려운 실정이다.

유글레나(Euglena)는 일본에 있어서는 「녹색벌레(insect green)」의 일본 명칭으로 널리 알려져 있으며, 일반적으로 늪, 연못, 논 등의 담수에 생식하고 있는 미생물의 학술명이다. 유글레나는 엽록체를 가지고 광합성을 활발하게 수행하는 한편, 편모나 세포수축에 의한 운동성을 가지는 등의 동물적인 특징을 나타내는 것으로부터 분류학상에 있어서, 식물과 동물 양쪽의 분류에 속하는 매우 희귀한 미생물이라고 말할 수 있다. 현재, 유글레나를 함유하는 조류에 의한 유용물질 생산의 가능성에 관해서 각종 산업계가 주목하고 있다. 조류를 건조시킨 것은, 식품으로서의 실용화가 일부에서 이미 수행되고 있으며, 고등식물에 비하여 석유 유래의 화성품 대체원료, 혹은 연료의 원료 등 유용물질을 고수율로서 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문이다. 유글레나는 탄수화물로서 파라밀론(Paramylon)을 세포 내에 축적한다. 파라밀론은 약 700개의 글루코스가 β-1,3- 결합에 의해 중합한 고분자체의 입자이다.

미생물간 공동 배양을 통하여 새로운 물질을 생산하거나 원하는 특정 물질을 더 많이 생산하도록 하는 방법에 관한 연구는 많이 진행되어 오고 있다. 그러나 이러한 시도가 유글레나 종을 대상으로는 많이 연구되지 않았으며 특히 파라밀론 생산량 증대를 시도한 경우는 전무하다.

이에 본 발명자는 유글레나 그라실리스와 다른 미생물간 공동배양을 통해 유글레나의 성장을 촉진시킴으로써 베타글루칸 중합체인 파라밀론 생산을 효과적으로 증대시킬 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 진행하였으며, 그 결과 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양하는 경우 유글레나 그라실리스 생장을 촉진시키며 파라밀론 생산을 증대시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히, 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양시 파라밀론 생산을 최대한으로 도출할 수 있는 최적의 접종 배양 농도비율 및 박테리아 접종 시기를 최초로 규명하였다.

한국등록특허 제10-2013-0048234호 한국공개특허 제10-2015-0134350호 한국공개특허 제10-2018-0002772호

따라서 본 발명의 목적은 고부가가치 물질인 파라밀론(베타글루칸)을 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 파라밀론의 생산능이 증진된 유글레나 그라실리스 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 유글레나 그라실리스와 박테리아를 공동배양하는 단계; 및 상기 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 박테리아는 박테리움 비브리오 나트리에젠스일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유글레나 그라실리스와 박테리아는 1:10의 농도 비율로 접종되어 공동배양될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유글레나 그라실리스는 지수기(exponential phase)의 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양물은 파라밀론을 건중량 기준 9.5 ~ 10 g/L로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양하는 단계를 포함하는, 파라밀론 생산이 증진된 유글레나 그라실리스 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법으로 생산된 파라밀론은 평균 과립 입자 사이즈가 3 ~ 4μm일 수 있다.

본 발명에 따른 파라밀론의 생산방법은 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양함으로써 유글레나 그라실리스 생장을 촉진시키며 파라밀론 생산을 증대시킬 수 있는바, 베타글루칸 중합체인 파라밀론을 효과적으로 생산할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에서는 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양시 파라밀론 생산을 최대한으로 도출할 수 있는 최적의 접종 배양 농도비율 및 박테리아 접종 시기를 확인하였는바, 베타글루칸 원료 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 박테리아 종류별 유글레나와의 공동배양에 따른 유글레나의 건중량 및 파라밀론 생산 증가량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 박테리아 접종 비율에 따른 유글레나의 건중량 및 파라밀론 생산량 변화를 나타낸 것이다. (A: 유글레나, B: 박테리아)
도 3은 박테리아 접종 시기에 따른 유글레나의 파라밀론 생산량 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 박테리아와 유글레나 공동 배양에 따른 파라밀론 과립의 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 박테리아와 유글레나 공동 배양에 따른 파라밀론 구조를 비교한 것이다.

본 발명은 유글레나 그라실리스와 박테리아를 공동배양하는 공정을 통해 파라밀론을 생산하는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 명세서에서 언급하는 ‘유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)’는 담수에 사는 원생생물 중 하나로, 비타민의 일종인 알파-토코페롤(α-tocopherol), 베타글루칸 중합체인 파라밀론(paramylon), 지질 등 다양한 유용물질을 생산할 수 있다. 특히 암배양 조건에서 당배양을 할 경우 파라밀론 함량이 건중량 대비 60% 이상일 뿐만 아니라 세포벽이 존재하지 않아 파라밀론 추출도 다른 생물에 비해 비교적 쉽다. 또한 파라밀론 구조가 베타-1, 3 결합으로 이루어져 있기 때문에 다른 결합이 섞여 있는 버섯, 곡물로부터 추출한 베타글루칸보다 기능이 뛰어나다고 볼 수 있다.

본 명세서에서 언급하는 ‘파라밀론(paramylon)’는 유글레나류의 세포내 저장물질로서 베타글루칸 중합체이다.

본 발명의 파라밀론의 생산방법은 유글레나 그라실리스와 박테리아를 공동배양하는 단계; 및 상기 배양물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 박테리아는 박테리움 비브리오 나트리에젠스일 수 있다.

본 발명의 하기 실시예에서는 유글레나와 공동배양이 가능한 박테리아 종류를 선별하기 위하여 박테리아의 종류로 슈도모나스(Pseudomonas sp), 비브리오 나트리에젠스(Vibrio natriegens), 페니바실러스 용인엔시스(Paenibacillus yonginensis), 스핑고모나스 파나시테라에(sphingomonas panaciterrae) 각각을 유글레나와 공동배양하였으며, 그 결과 비브리오 나트리에젠스만이 유글레나와 공동배양시 유글레나의 생장을 촉진시킬 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 구체예에서 상기 유글레나 그라실리스와 박테리아는 1:10의 농도 비율로 접종되어 공동배양될 수 있으며, 상기 유글레나 그라실리스는 지수기(exponential phase)의 세포일 수 있다.

본 발명의 하기 실시예에서는 유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양시 파라밀론 생산을 최대한으로 도출할 수 있는 최적의 접종 배양 농도비율 및 박테리아 접종 시기를 확인하였으며, 그 결과 유글레나 그라실리스와 박테리아는 1:10의 농도 비율로 접종 배양하는 경우 파라밀론 생산이 가장 우수하였으며, 박터리아 접종 시기는 유글레나 그라실리스가 지수기(exponential phase) 세포일 때 파라밀론 생산이 가장 우수한 것으로 나타났다.

본 발명의 방법으로 파라밀론을 생산하는 경우 배양물의 건중량 기준 9.5 ~ 10 g/L로 파라밀론이 포함할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 방법으로 생산된 파라밀론은 평균 과립 입자 사이즈가 3 ~ 4μm일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

유글레나 배양 및 성장, 파라밀론 측정

본 발명에서는 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis strain Z) 종을 이용하였다. 위 미세조류는 Culture Collection of Autotrophic Organisms at the Institute of Botany of the Academy of Sciences of the Czech Republic에서 구매하였다. 배양 배지는 Modified Hutner’s medium을 이용하였으며, 1L 3차 증류수에 (단위: g) glucose, 20; glutamic acid, 5; malic acid, 5; glycine, 2.5; asparagine, 2; urea, 0.4; succinic acid, 0.1; KH₂PO₄, 0.4; MgSO₄ _·7H₂O, 0.14; MgCO₃, 0.4; CaCO₃, 0.1; trace elements solution, 10mL/L; vitamin solution, 10mL/L 와 H₃BO₃ solution, 10ml/L를 첨가하였다. Trace elements solution은 1L 3차 증류수에 (단위: g) (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ _·6H₂O, 2.1; ZnSO₄ _·7H₂O, 1.1; MnSO₄ _·H₂O, 0.58; (NH₄)₅Mo₇O₂₄ _·4H₂O, 0.18; CoSO₄ _·7H₂O, 0.024; CuSO₄ _·5H₂O, 0.077 와 NaNO₃ _·4H₂O, 0.074를 첨가하여 제조하였다. Vitamin solution은 thiamin, 0.06 g 및 cyanocobalamin 0.005 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었으며, H₃BO₃ solution은 0.029 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었다. 배지는 121℃에서 20분간 멸균을 한 후 사용하였다. 500 mL 삼각플라스크(DURAN 제조)에 250 mL의 배지를 넣어 시드 배양(seed cultivation)을 하였으며, 배양 온도는 28℃ 였으며, 암조건에서 150 rpm 으로 교반해주었다.

유글레나 건중량은 1.45um 공극 크기를 가진 필터를 이용하여 측정하였다.

파라밀론 추출을 위하여 유글레나 세포를 99.9% 에탄올로 2번 헹궈준 다음 0.1 M 인산나트륨 버퍼(pH 7.6)에 트립신(1 g/L)을 넣어 37℃에서 하루 이상 보관하였다. 그 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 요소를 녹인 용액(500 g/L)을 넣어 헹궈준 다음 3차 증류수로 2번 더 헹궈주었다. 추출된 파라밀론은 건조 오븐에서 하루 이상 말려 무게를 측정하였다. 파라밀론 과립의 크기를 측정하기 위해서 주사전자현미경을 이용하였다. 파라밀론 구조 분석을 위해서는 핵자기공명 ¹³C을 이용하였다.

< 실시예 2>

다양한 종류의 박테리아와 유글레나의 공동 배양

본 실험에서는 유글레나와 공동배양이 가능한 박테리아 종류를 선별하기 위하여 박테리아의 종류로 슈도모나스(Pseudomonas sp. DSM 25356, Pseudomonas sp. DSM 25842), 비브리오 나트리에젠스(Vibrio natriegens KCTC 12726), 페니바실러스 용인엔시스(Paenibacillus yonginensis KCTC 33428), 스핑고모나스 파나시테라에(sphingomonas panaciterrae KCTC 42346) 각각을 유글레나와 공동배양하였다. 상기 박테리아들은 모두 식물호르몬의 일종인 옥신(Indole-3-acetic acid, IAA)을 생산한다고 알려진 균주이다. 위 박테리아 균주들은 한국생물자원센터(KCTC) 또는 독일생물자원센터(DSMZ)로부터 분양받았다.

배양 배지는 비브리오 나트리에젠스의 경우엔 Marine Broth medium 2216 (BD Difco), 페니바실러스 용인엔시스와 스핑고모나스 파나시테라에의 경우엔 TSA 배지, 슈도모나스 배양을 위해서는 Nutrient Broth medium (BD Difco)를 이용하였다. 박테리아 배양은 28℃에서 150 rpm 으로 교반해주었다. 유글레나 공동 배양을 위해서는 Euglena Medium을 이용하였으며, Euglena Medium은 1L 3차 증류수에 (단위: g) sodium acetate, 1; beef extract, 1; tryptone, 2; yeast extract, 및 CaCl₂·H₂O, 0.01을 넣어 제조하였다. 공동 배양은 150 mL 삼각플라스크에 100 mL의 Euglena Medium을 넣고 150 rpm, 28℃에서 배양하였다. 유글레나의 초기 접종 농도는 1×10⁶ cells/mL였으며, 박테리아는 실험에 따라 1:1, 1:10, 1:50의 비율(세포수 기준)로 접종하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 유글레나와 비브리오 나트리에젠스를 공동배양하는 경우만이 유글레나의 건중량 및 파라밀론 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해 공동 배양을 위한 박테리아는 비브리오 나트리에젠스(Vibrio natriegens) 종을 선택하였다.

< 실시예 3>

비브리오 박테리아 접종 비율에 따른 유글레나의 건중량 및 파라밀론 생산량 변화

본 발명의 방법에 따라 유글레나 세포에 비브리오 박테리아를 1:1, 1:10, 1:50의 비율로 공동 배양을 하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 박테리아(비브리오 나트리에젠스)와 공동배양한 경우 유글레나의 건중량 및 파라밀론 생산량이 증가하였으며, 유글레나:박테리아 비율이 1:10일 때 가장 높은 증가 효과를 확인할 수 있었다. 상기 결과에 의해 유글레나와 비브리오 박테리아를 공동 배양 하는 것은 유글레나의 성장 및 대사물질 생산을 촉진시키는 효과가 있음을 시사한다.

< 실시예 4>

비브리오 박테리아 접종 시기에 따른 유글레나의 파라밀론 생산량 변화

본 발명의 방법에 따라 박테리아 최적 접종 시기를 찾기 위하여 유글레나:박테리아 비율을 1:10으로 하여 유글레나의 성장 시기(oh, 72h, 120h)에 따라 박테리아를 접종하였으며, 이에 따른 변화를 확인하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 박테리아(비브리오 나트리에젠스)를 첨가한 시점 이후로 파라밀론 생산량이 증가하였다. 특히, 유글레나가 지수생장기(exponential stage)일 때 파라밀론 생산 촉진 효과가 가장 크게 나타났다. 참고로, 지수기(exponential phase)는 미세조류의 발육 과정에서 원형질의 증대가 최대, 또한 일정한 속도가 되는 시기를 의미한다. 세대시간이 가장 짧고 대사 산물이 원형질의 합성에 가장 활발하게 이용되는 시기이다.

< 실시예 5>

파라밀론 모양 및 구조 분석

도 4과 도 5는 유글레나가 생산한 파라밀론의 모양과 구조를 분석한 것이다. 파라밀론 모양은 주사전자현미경(S-4700, Hitachi)을 사용하여 분석하였으며, 구조는 핵자기공명 ¹³C을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 유글레나가 생산한 파라밀론의 모양이 유글레나 단독 배양에서보다 박테리아박테리아(비브리오 나트리에젠스)와 함께 공동배양했을 때 과립의 크기가 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 비브리오 박테리아가 유글레나가 생산하는 파라밀론의 크기에 영향을 미침을 의미한다.

파라밀론 구조를 ¹³C 핵자기공명을 이용한 분석한 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이 유글레나와 비브리오 박테리아간 공동 배양을 진행하더라도 파라밀론의 구조(베타-1, 3 결합)는 변하지 않음을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 공동 배양이 파라밀론의 생산을 증가시키는 한편 파라밀론의 구조에는 영향을 미치지 않기 때문에 상업적으로 이용하는데 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양한 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 유글레나 그라실리스와 박테리아는 1:10의 농도 비율로 접종되어 공동배양되는 것을 특징으로 하는 파라밀론의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 유글레나 그라실리스는 지수기(exponential phase)의 세포인 것을 특징으로 하는 파라밀론의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양물은 파라밀론을 5 ~ 6g/L의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 파라밀론의 생산방법.
유글레나 그라실리스와 박테리움 비브리오 나트리에젠스를 공동배양하는 단계를 포함하는, 파라밀론 생산이 증진된 유글레나 그라실리스 생산 방법.
제6항에 있어서,
상기 방법으로 생산된 파라밀론은 평균 과립 입자 사이즈가 3 ~ 4μm인 것을 특징으로 하는, 파라밀론 생산이 증진된 유글레나 그라실리스 생산 방법.