KR20180002772A - 유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 바이오매스를 이용하여 유기산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 유글레나를 질소 결핍 조건 하에서 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 또는 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정 중 어느 것과, 질소 결핍 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는 방법에 의해, 유글레나를 사용하여 숙신산 등의 유기산을 생산하는 것에 관한 것이다.

Description

유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법

본 발명은 유글레나를 사용하여 폴리부틸렌숙시네이트(PBS)의 원료 등으로서 유용한 숙신산으로 대표되는 유기산을 생산하는 방법, 및 그 방법으로 얻어지는 유글레나의 배양 산물에 관한 것이다.

종래의 석유계 플라스틱을 대체하는 새로운 플라스틱 소재로서, 바이오매스를 원료로 하는 바이오매스 플라스틱, 및 자연계에 있어서 미생물의 작용에 의해 분해되는 생분해성 플라스틱의 연구 개발이 근년 진행되고 있다. 바이오매스 플라스틱과 생분해성 플라스틱의 양쪽의 성질을 갖는 생분해성 바이오매스 플라스틱으로서는, 예를 들어 폴리락트산(PLA), 전분 수지, 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 및 폴리부틸렌숙시네이트(PBS) 등이 알려져 있다.

PBS는, 숙신산과 1,4-부탄디올로부터 축합 반응에 의해 합성되며, 유용성이 높은 생분해성 바이오매스 플라스틱으로서 알려져 있다. 원료인 숙신산은, 종래 석유를 원료로서 합성되었지만, 최근에는, 옥수수나 사탕수수 등으로부터 유래하는 당질을 사용하여, 종속 영양 세균의 발효에 의한 생산 등도 행해지고 있다. 그러나, 식료계 식물을 원료로 하면, 식료 및 사료용 수요와의 경합이 발생하여, 안정 공급면에서의 문제를 수반한다. 그 때문에, 기존의 식료 생산과 경합하지 않는 바이오매스를 원료로 하여 숙신산을 생산하는 것이 바람직하다.

당해 바이오매스로서는, 근년에는 조류(algae)가 주목받고 있다. 그 중에서도 유글레나(미도리무시)는, 광합성에 의해 여러 가지 화합물을 생산하는 능력을 갖고, 연료 생산에도 이용할 수 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들어 특허문헌 1에는, 바이오 연료의 원료가 되는 왁스 에스테르를 고함유하는 유글레나의 생산 방법이 개시되어 있다.

일본 특허 공개 제2013-153730호 공보

이제까지 여러 가지 조류에 대하여 연구가 행해지고 있음에도 불구하고, 숙신산 등의 유기산을 다량으로 산생하는 조류의 종류 및 배양 조건 등은 아직 알려져 있지 않다. 본 발명은 조류에 의해 숙신산 등의 유기산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 여러 가지 조류를 검토한 결과, 유글레나를 질소 결핍 조건 하에서, 혹은 유기 또는 무기 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 종속 영양 조건 하에서 배양한 후에, 혐기 조건 하에서 인큐베이트함으로써, 유기산을 많이 포함하는 배양 산물이 얻어짐을 알아냈다. 본 발명의 요지는 이하와 같다.

(1) 유글레나를, 질소 결핍 조건 하에서 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 및 질소 결핍 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는, 유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법.

(2) 질소 결핍 배양 공정을 3일 이상 행하는, (1)에 기재된 방법.

(3) 유글레나를, 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정, 및 종속 영양 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는, 유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법.

(4) 혐기 배양 공정의 배양 산물로부터 유기산을 함유하는 배양액을 취출하는 공정을 더 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(5) 혐기 배양 공정 전에, 질소 결핍 배양 공정 또는 종속 영양 배양 공정의 배양 산물에 포함되는 유글레나 세포체를 농축하는 공정을 더 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(6) 유글레나가 야생형 유글레나인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7) 유기산이 숙신산인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(8) 유글레나가 산생한 유기산을 100mg/L 이상의 농도로 함유하는, 유글레나를 배양하여 얻어지는 배양 산물.

(9) 유기산이 숙신산인, (8)에 기재된 배양 산물

(10) 유글레나를 배양한 후에 얻어지는 배양액인, (8) 또는 (9)에 기재된 배양 산물.

(11) 유글레나를, 질소 결핍 조건 하에서 3일 이상 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 및 질소 결핍 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는 방법에 의해 유글레나를 배양하여 얻어지는, (8) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 배양 산물.

(12) 유글레나를, 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정, 및 종속 영양 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는 방법에 의해 유글레나를 배양하여 얻어지는, (8) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 배양 산물.

(13) 상기 유글레나가 야생형인, (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 배양 산물.

(14) 유글레나를, 질소 결핍 조건 하에서 3일 이상 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 질소 결핍 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정, 및 혐기 배양 공정에서 얻어진 배양 산물로부터 유글레나 세포체를 채취하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 유글레나 세포체.

(15) 유글레나를, 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정, 및 종속 영양 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정, 및 혐기 배양 공정에서 얻어진 배양 산물로부터 유글레나 세포체를 채취하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 유글레나 세포체.

본 발명에 따르면, 조류 바이오매스인 유글레나를 이용하여 PBS 등의 원료로서 유용한 숙신산으로 대표되는 유기산을 생산하는 것이 가능하게 된다. 또한, 유기산의 생산과 동시에, 유용한 유글레나 세포체도 얻을 수 있다.

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2015-095993호의 명세서, 특허청구범위 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명의 방법은, 유글레나를, 질소 결핍 조건 하에서 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 또는 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정 중 어느 것과, 당해 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 목적 화합물인 숙신산 등의 유기산은, 혐기 배양 공정에서 얻어지는 배양 산물 중에 포함된다. 또한, 본 명세서에 있어서 「배양 산물」이란, 유글레나를 배양하여 얻어지는 모든 산물을 포함하는 개념이다. 보다 구체적으로는, 유글레나를 배양조에 넣은 배양액 중에서 배양한 경우에는, 유글레나 세포체 및 유글레나가 산생한 물질을 포함하는 배양액 모두, 즉 배양조의 내용물 모두를 포함하는 개념이다.

유글레나(유글레나, 일본명: 미도리무시)는 유글레나속에 속하는 미생물의 총칭이다. 유글레나는, 운동성을 갖는 조류이며, 그 대다수는, 편모 운동을 하는 동물적 성질과, 엽록체를 갖고 광합성을 행하는 식물적 성질의 양쪽을 겸비한다는 것이 알려져 있다. 유글레나의 구체예로서는, 유글레나 아쿠스(Euglena acus), 유글레나 카우다타(Euglena caudata), 유글레나 체이드파우디(Euglena chadefaudii), 유글레나 데세스(Euglena deses), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 유글레나 그래눌라타(Euglena granulata), 유글레나 인터미디아(Euglena intermedia), 유글레나 무타빌리스(Euglena mutabilis), 유글레나 옥시유리스(Euglena oxyuris), 유글레나 프록시마(Euglena proxima), 유글레나 스파이로자이라(Euglena spirogyra), 유글레나 비리디스(Euglena viridis), 유글레나 베르미포르미스(Euglena vermiformis) 등을 들 수 있다. 이들 중, 본 발명의 방법에서는, 종래 널리 연구에 이용되고 있는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)를 적합하게 사용할 수 있다.

유글레나는, 유전자 재조합을 행하지 않은 야생형 유글레나를 사용하면, 배양 시에 자연계와의 유전자 교잡 등을 배려할 필요가 없기 때문에, 옥외에서도 배양할 수 있고, 배양에 드는 비용을 억제할 수 있기 때문에 바람직하다. 그러나, 이것에 한정되는 것은 아니며, 숙신산 등의 유기산을 많이 산생하도록 유전자 재조합을 행한 유글레나를 사용해도 된다.

(질소 결핍 배양 공정 및 종속 영양 배양 공정)

질소 결핍 배양 공정에서는, 질소 결핍 조건 하에서, 예를 들어 질소 결핍 배지를 사용하여, 유글레나를 호기적으로 배양한다. 질소 결핍 조건 하에서 배양하면, 당초는 유글레나 세포체 중에 축적된 질소원이 이용되지만, 그것을 모두 자화해 버린 후에는, 유글레나는 질소 결핍 상태에 빠진다. 유글레나는 그 스트레스에 따라 숙신산 등의 유기산을 산생하여 세포체 내에 축적할 것이라고 생각된다. 질소 결핍 배양 기간은 3일 이상이며, 특히 4일 이상, 특히 5일 이상, 또한 6일 이상으로 하면, 유기산을 보다 많이 축적할 것으로 생각되므로 바람직하다.

유글레나의 질소 결핍 배지를 사용한 호기적 배양의 조건은, 종래의 유글레나의 배양법에 있어서 알려진 것을 사용할 수 있다. 배양 온도는, 통상 20 내지 34℃의 범위 내로 하는 것이 효율적인 생육을 위해 바람직하다. 또한, 배지에는 공기를 버블링하는 것이 바람직하며, 특히 유글레나는 CO₂를 자화하기 때문에, 1 내지 5％의 CO₂를 포함하는 공기를 배지 중에 버블링하는 것이 보다 바람직하다. 호기적 배양은 광조사 하(명조건 하)에서 행하는 것이 바람직하며, 명암 사이클, 특히 개일리듬(circadian rhythm)에 준한 명암 사이클 조건 하(예를 들어 12시간 명암 사이클)에서 행하는 것이 보다 바람직하다. 명조건 하에 있어서의 광 강도는, 30 내지 200μmol m^-2s^-1의 범위로 하는 것이 바람직하다. 배지의 pH는 3 내지 8의 범위로 하는 것이 바람직하다.

유글레나의 배양에는, 예를 들어 크래머-마이어(Cramer-Myers) 배지(CM 배지), 허트너(Hutner) 배지 및 코렌-허트너(Koren-Hutner) 배지, AY 배지 등의 공지된 배지의 일부 조성을 변경한 개변(modification) 배지를 사용할 수 있다. 배지의 개변에는, 질소 결핍 조건으로 하기 위한 질소원의 제거가 포함된다. 예를 들어, CM 배지라면, 조성으로부터 인산암모늄((NH₄)₂HPO₄)을 제외함으로써 질소 결핍 조건으로 할 수 있다. 또한, 질소 결핍 조건이란, 배지 중의 질소 농도가 N 원자 환산으로 0.1mmol/L 이하, 특히 0.01mmol/L 이하인 상태를 의미한다.

유글레나의 배양에 사용하는 배지의 개변에는, 유글레나의 증식을 촉진하는 영양원, 혹은 유기산의 생합성 원료가 되는 탄소원의 추가도 포함될 수 있다. 유글레나의 배양은, 탄소원이 추가된 배지를 사용하여, 완전 종속 영양 조건 하에서, 혹은 광합성과 배지에 추가된 탄소원을 병용 가능한 조건 하(본 명세서에 있어서, 이러한 광합성을 병용하는 조건도 종속 영양 조건의 개념에 포함되는 것으로 함)에서 행해도 된다. 종속 영양 조건 하에서 유글레나의 배양을 행함으로써, 독립 영양 조건 하에서 배양을 행하는 경우와 비교하여, 유기산을 보다 많이 축적하게 된다. 상술한 질소 결핍 배양 공정은, 종속 영양 조건 하에서 배양을 행하는 종속 영양 배양 공정으로 치환할 수 있다. 종속 영양 배양 공정은, 배지로부터 질소원이 제거되지 않은, 질소 충족 조건 하에서 행해도 된다. 종속 영양 배양 공정은, 상이한 구성의 배지를 사용하는 것 이외에는, 질소 결핍 배양 공정과 마찬가지로 실시할 수 있다.

배지에 추가하는 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스나 프룩토오스 등의 당류, 에탄올 등의 알코올류, 아세트산이나 말산 등의 카르복실산이나, 글루탐산 등의 아미노산과 같은 유기산 또는 그의 염 등, 및 탄산수소나트륨 등의 무기 탄소 화합물을 들 수 있다. 예를 들어, 배지 중에 에탄올을 0.5 내지 1.0용량％ 첨가하면, 유글레나의 생육 촉진으로 이어진다. 또한, 탄소원 이외의 영양원으로서, 염화칼륨이나 염화마그네슘 등의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 염을 배지에 첨가해도 된다. 배지에 추가하는 탄소원으로서는, 당류 및 유기산이 바람직하며, 그 중에서도 글루코오스, 그리고 아세트산 및 그의 염이 특히 바람직하다. 배지에 추가하는 탄소원은, 배지의 다른 성분과의 밸런스의 관점에서, 1 내지 200mM, 특히 1 내지 100mM, 특히 1 내지 20mM의 범위의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

질소 결핍 배양 공정 또는 종속 영양 배양 공정에 사용하는 유글레나는, 미리 통상의 질소 결핍이 아닌 배지를 사용하여 전배양(pre-culture)되어 있는 것을 사용한다. 바람직하게는 1일 이상, 특히 2일 이상, 특히 3일 이상 전배양한 유글레나가 분산된 배양액을 채취하여 원심 분리하고, 필요에 따라 탈이온수로 세정한 후, 배지에 첨가하거나 하여, 질소 결핍 조건 하 또는 종속 영양 조건 하에 둔다. 배양 공정의 개시 시에 있어서의 유글레나 세포체의 농도를 10 내지 20g/L, 배양 공정의 완료 시에 있어서의 유글레나 세포체의 농도를 20 내지 50g/L로 하면, 유글레나의 생육 효율, 나아가 유기산의 산생 효율의 면에서 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서, 유글레나 세포체의 중량은, 특별히 언급하지 않는 경우에는 건조 중량을 의미한다. 유글레나 세포체의 건조 중량은, 유글레나가 분산된 배양액의 소정량을 샘플링하여, 원심 분리, 세정 및 동결 건조 등의 공정을 거쳐 수분을 제거한 후의 유글레나 세포체를 측정하여 얻어지는 중량이다. 따라서, g/L의 단위로 표시되는 유글레나 세포체의 농도란, 배양액 1리터당 포함되는 유글레나 세포체의 건조 중량을 의미한다.

(혐기 배양 공정)

혐기 배양 공정에서는, 상기의 질소 결핍 배양 공정 또는 종속 영양 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트한다. 혐기 조건 하의 인큐베이트는, 바람직하게는 암조건에서 행해진다. 여기서, 「암조건」이란, 구체적으로는, 광 강도가 1μmol m^-2s^-1 이하인 약광 조건 또는 광이 없는 암흑 조건을 말한다.

「혐기 배양」이란, 혐기 발효라고도 할 수 있는 공정이며, 유글레나가 혐기 조건 하에서 에너지를 획득하기 위해, 혐기 호흡에 의해 유기물을 산화하여, 숙신산 등의 유기산과 이산화탄소를 생산하는 이화대사를 의미한다. 또한, 「혐기 조건」이란, 유글레나가 호기 호흡을 행할 수 있는 최저 산소량을 하회하는, 실질적으로 산소가 존재하지 않는 조건이며, 산소 농도가, 통상에서는 1％ 이하, 바람직하게는 0.5％ 이하, 특히 0.2％ 이하, 더 완전하게는 무산소(산소량이 검출 한계 이하)의 조건을 의미한다. 유글레나는, 호기이면서도 질소 결핍 조건 하 또는 종속 영양 조건 하에서 배양하면 세포 내에 숙신산 등의 유기산을 축적하지만, 그것을 더 혐기이면서도 암조건에서 배양하면, 숙신산 등의 유기산의 생합성이 더 촉진되고, 또한 유기산을 세포 외로 방출하게 된다고 생각된다. 혐기 조건은, 배양조 내의 기상 중에 있어서의 산소 농도를 상기 범위 내로 조정함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 기상 중의 기체를, 질소나 아르곤 등의 불활성 가스로 치환함으로써 달성할 수 있다.

혐기 배양에 제공되는 배양 산물은, 원심 분리한 후에 상청을 폐기하고, 침전된 유글레나 세포체를 소량의 새로운 배지에 분산시키거나 하여, 미리 유글레나 세포체를 농축하면, 유글레나 세포체가 배양액 중에 유기산을 방출하기 쉬워지고, 혐기 배양 공정 후의 배양액에 있어서의 유기산 함유량이 높아지기 때문에 바람직하다. 농축은, 배양 산물의 용량에 대한, 혐기 배양 공정에 제공되는 유글레나 세포체 분산액의 용량이 1/10 이하, 특히 1/20 이하, 특히 1/50 이하, 또한 1/75 이하가 되도록 행하면, 혐기 배양 공정 후의 배양액에 있어서의 유기산 함유량이 보다 높아지기 때문에 바람직하다. 또한, 농축을 위한 방법은 원심 분리에 한정되는 것은 아니며, 다른 공지된 방법, 예를 들어 필터 여과에 의해 분산질을 집적하는 등의 방법으로 행해도 된다.

혐기 배양 공정에 있어서의 배지는, 상기의 질소 결핍 배양 공정 및 종속 영양 배양 공정과 마찬가지의 것을 사용해도 되고, 혹은 유글레나의 증식을 촉진하는 영양원을 갖지 않는 완충액을 사용해도 된다. 배양에 사용할 수 있는 완충액으로서는, 헤페스(HEPES) 버퍼, 트리스(Tris) 버퍼, PBS 버퍼, 몹스(MOPS) 버퍼, 메스(MES) 버퍼 등을 들 수 있다. 그 밖에, 혐기 배양 공정에 있어서의 배양 조건은, 공기 버블링을 행하지 않는 것 이외에는 상기의 질소 결핍 배양 공정 및 종속 영양 배양 공정과 마찬가지로 해도 되지만, 진탕 배양으로 하면, 혐기 배양 공정 후의 배양액에 있어서의 유기산 함유량이 보다 높아지기 때문에 바람직하다.

혐기 배양은, 적어도 1일 이상 행하는 것이 바람직하며, 2일 이상, 특히 3일 이상 행하는 것이 보다 바람직하다. 혐기 배양을 제공함으로써, 유글레나는 숙신산 등의 유기산을 배양액 중에 방출한다. 혐기 배양 후의 배양액 중에는, 배양 종료 직후의 비농축 상태로 100mg/L 이상, 바람직하게는 200mg/L 이상, 특히 바람직하게는 300mg/L 이상의 숙신산이 포함된다. 혐기 배양 후의 배양액 중의 숙신산 함유량은, 배양 조건을 최적화함으로써, 800mg/L 이상, 1000mg/L 이상, 나아가 1500mg/L 이상으로 하는 것도 가능하다. 따라서, 혐기 배양 후의 배양액 중에는, 배양 종료 직후의 비농축 상태로, 100mg/L 이상, 200mg/L 이상, 300mg/L 이상, 800mg/L 이상, 1000mg/L 이상, 또는 1500mg/L 이상의 유기산이 포함될 수 있다. 또한, 산생되는 유기산(특히 숙신산)은 항균 작용을 갖기 때문에, 특정한 세균 등이 증식하는 것을 방지할 수 있다.

혐기 배양 후의 배양액 중의 유기산 함유량은, 배양 산물을 원심 분리하여 채취한 상청을 건조시켜 얻어진 샘플을, 예를 들어 HPLC 등에 의해 분석함으로써 구할 수 있다. 혐기 배양 후의 유글레나 세포체의 건조 중량에 대한, 상청에 포함되는 유기산의 중량 비율은 0.5중량％ 이상인 것이 바람직하고, 특히 1중량％ 이상, 또한 1.5중량％ 이상인 것이 보다 바람직하다.

혐기 배양 후의 배양액 중에 포함되는 유기산은, 숙신산 외에, 예를 들어 시트르산, 말산 및 락트산 등을 들 수 있다. 시트르산 이외의 유기산의 함유량은, 숙신산에 비하여 극히 적어지는 경우가 많다. 혐기 배양 후의 배양액 중에 포함되는 말산 및 락트산의 양은, 각각 숙신산 함유량의 1/5 이하, 특히 1/6 이하, 특히 1/7, 또한 1/10 이하여도 된다. 말산 및 락트산의 양이 적은 것은, 유용성이 보다 높은 숙신산의 분리 정제의 관점에서 바람직하다. 또한, 혐기 배양 후의 배양액 중에는, 그 밖의 하기와 같은 유용한 화합물이 포함될 수 있다: 3-히드록시프로피온산, 말론산, 프로피온산, 세린, 아세토인, 아스파라긴산, 푸마르산, 3-히드록시부티로락톤, 트레오닌, 아라비니톨, 푸르푸랄, 글루탐산, 이타콘산, 레불린산, 프롤린, 크실리톨, 크실론산, 아코니트산, 시트르산, 2,5-푸란디카르복실산, 글루카르산, 리신, 레보글루코산, 소르비톨. 그들의 함유량은, 숙신산 함유량의 1/5 이하, 특히 1/6 이하, 특히 1/7, 또한 1/10 이하여도 된다.

혐기 배양 후의 배양 산물에는, 배양액 중뿐만 아니라, 유글레나 세포체에도 유기산이 포함된다. 유글레나 세포체 중에 포함되는 유기산은, 물 또는 유기 용매로 추출함으로써 취출할 수 있다. 그 때, 초음파 파쇄 장치 등에 의해 기계적인 힘을 가하거나, 혹은 리소자임 등의 효소를 첨가하거나 하여 세포막을 파괴해도 된다. 또한, 유글레나 세포체 중에도, 유기산뿐만 아니라, 상기에 설명한 바와 같은 유용한 화합물이 포함될 수 있다.

혐기 배양 후에 얻어진 유기산을 함유하는 배양 산물로부터는, 종래 공지된 방법에 의해 고순도의 유기산을 정제하는 것이 가능하다. 예를 들어, 배양 산물을 원심 분리하여 채취한 상청을 건조시켜 얻어진 생성물은, 이온 교환 수지 등으로 탈염하고, 결정화나 칼럼 크로마토그래피 등의 방법에 의해, 고순도의 숙신산으로 정제할 수 있다.

혐기 배양 후에 얻어진 배양 산물 중의 유글레나 세포체는, 함유되는 유기산뿐만 아니라, 세포체 그 자체도 유용성을 갖는다. 유글레나 세포체는, 수많은 비타민, 미네랄, 아미노산, 불포화 지방산 등을 함유한다는 것이 알려져 있으며, 식품 혹은 영양 보조 식품 또는 사료로서 유용하다. 또한, 본 발명의 방법으로 혐기 배양 후에 얻어지는 유글레나 세포체에서는, 혐기 배양 동안에 세포체에 함유되는 당질이 감소되어 있기 때문에, 본 발명의 방법에 따르면, 종래보다 고부가 가치인 저당질의 유글레나 세포체를 제공하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서, 상기에 설명한 질소 결핍 배양 공정 또는 종속 영양 배양 공정과 혐기 배양 공정을 포함하고, 또한 혐기 배양 공정에서 얻어진 배양 산물로부터 원심 분리 등에 의해 유글레나 세포체를 채취하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어진 유글레나 세포체에 관한 것이기도 하다.

또한, 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 있어서 혐기 배양 공정 후의 배양액 중에는, 배양 종료 직후의 비농축 상태로 100mg/L 이상, 바람직하게는 200mg/L 이상, 특히 바람직하게는 300mg/L 이상의 유기산이 포함된다. 보다 바람직하게는, 혐기 배양 공정 후의 배양액 중에는, 배양 종료 직후의 비농축 상태로 100mg/L 이상, 바람직하게는 200mg/L 이상, 특히 바람직하게는 300mg/L 이상의 숙신산이 포함된다. 따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 유글레나가 산생한 유기산(숙신산)을 100mg/L 이상의 농도로 함유하는, 유글레나를 배양하여 얻어지는 배양 산물, 특히 배양액에 관한 것이다. 유글레나를 포함하는 다른 조류를 배양한 후의 배양액이며, 이러한 다량의 유기산을 포함하는 것은 이제까지 알려져 있지 않다.

<실시예>

이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 시험 수순

(1) 유글레나의 배양(질소 충족 또는 결핍 조건 하)

야생형 유글레나 그라실리스(유글레나사로부터 취득, 질소 충족 하의 통상의 배양 환경에서 1 내지 2주일 정도 전배양을 행한 것)는, 초기 유글레나 세포체 농도를 10 내지 20g/L로 하고, 표 1에 나타내는 조성을 갖는 개변 크래머-마이어 배지(개변 CM 배지, pH3.5)를 사용하여, 25℃, 12시간 명암 사이클에서, 1％의 CO₂를 포함하는 공기를 버블링하면서 인큐베이터 중에서 호기적으로 정치(static) 배양하였다. 광 강도는 50 내지 100μmol m^-2s^-1로 하였다. 배양은 1L의 배양 용기를 사용하여 행하였다. 또한, 배양을 질소 결핍 하에서 행하는 경우에는, 개변 CM 배지의 조성으로부터 질소원인 (NH₄)₂HPO₄를 제외하였다.

(2) 혐기 배양

상기 (1)에서 얻어진 배양액을 소정량 채취하여 원심 분리(5000rpm×5분)하고, 상청을 버렸다. 얻어진 유글레나 세포체를 10mL의 20mM HEPES-KOH 버퍼(pH7.8)에 현탁하고, 20mL 용량의 바이알병에 옮겼다. 바이알병에는 고무 마개를 하여 주사 바늘을 2개 찌르고, 그 한쪽으로부터 질소 가스를 1시간 도입하였다. 또한, 그 동안, 바이알병은 30℃의 광 조사 환경 하에 놓였다. 1시간 후에 주사 바늘을 제거하고, 알루미늄 호일로 차광한 바이알병을 25℃의 인큐베이터에 넣고, 진탕 배양을 행하였다. 3일 후 또는 6일 후에 마개를 열고, 내용물을 15mL 튜브로 옮겨 바로 원심 분리하였다(10,000rpm×2분). 얻어진 상청은, 다른 튜브로 옮겨, 동결 건조시켰다.

혐기 배양 전의 유글레나 세포체의 건조 중량은, 별도로, 상기 (1)에서 얻어진 배양액을 50mL만큼 채취하여 튜브에 넣고, 원심 분리 후에 상청을 버리고, 또한 세포체를 멸균수로 2회 세정함으로써 염을 제거하고, 1일 이상 -80℃에서 동결 건조한 것의 중량을 측정함으로써 산출하였다.

(3) 유기산 정량

브로모티몰 블루를 사용한 포스트 라벨법에 의해 분석을 행하였다. 상기 (2)에서 얻어진 상청의 동결 건조물을, 여과 완료된 100μL의 3mM 과염소산 수용액에 용해시키고, 포토다이오드 분석 검출기 및 2개의 칼럼(RSpak KC-811, 쇼와 덴코사제)을 구비한 고속 액체 크로마토그래프(LC-2000Plus, 니혼 분코사제)에 의해 분석하였다. 0.2mM 브로모티몰 블루 용액(15mM 인산나트륨 버퍼 중)을 사용하여 유기산을 정량하고, 파장 445nm에서 피크를 검출하였다. 칼럼 온도는 60℃로 하고, 3mM 과염소산 수용액 및 0.2mM 브로모티몰 블루 용액의 유속은 각각 1.0mL/분 및 1.5mL/분으로 하였다.

2. 시험 결과

(1) 시험 1

질소 충족 하, 또는 질소 결핍 하에서 11일간 배양하여 얻어진 배양액 800mL를 원심 분리하여 얻어진 유글레나 세포체를 10mL의 버퍼에 현탁하고, 3일간 혐기 배양하였다. 혐기 배양 후의 배양액에 포함되어 있던 유기산의 양을 표 2에 나타낸다. 질소 충족 하에서 배양한 유글레나를 혐기 배양에 제공해도, 얻어진 상청 중에는 숙신산은 거의 포함되어 있지 않고, 혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량에 대한 숙신산의 양은 0.08중량％에 지나지 않았다. 한편, 질소 결핍 하에서 11일간 배양하여 유글레나를 혐기 배양에 제공한바, 얻어진 상청 중에는 다량의 숙신산이 포함되어 있고, 그 양은 혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량에 대하여 1.9중량％이며, 질소 충족 하에서 배양한 샘플에 있어서의 숙신산량의 20배 이상(혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량 기준)이나 달하였다. 또한, 시트르산은 HPLC 차트에 있어서의 피크가 다른 성분과 겹쳤기 때문에 정량이 불가능하였지만, 차트로부터 숙신산과 동일 정도의 양의 시트르산이 산생됨이 추찰되었다.

(2) 시험 2

질소 결핍 하에서 11일간 또는 14일간 배양하여 얻어진 배양액 800mL를 원심 분리하여 얻어진 유글레나 세포체를 10mL의 버퍼에 현탁하고, 3일간 혐기 배양하였다. 혐기 배양 후의 배양액에 포함되어 있던 유기산의 양을 표 3에 나타낸다. 어느 배양 일수의 경우에 있어서도, 얻어진 상청 중에는 다량의 숙신산이 포함되어 있고, 그 양은 혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량에 대하여 각각 7.5중량％ 및 3.1중량％였다.

(3) 시험 3

질소 결핍 하에서 14일간 배양하여 얻어진 배양액 800mL를 원심 분리하여 얻어진 유글레나 세포체를 10mL의 버퍼에 현탁하고, 6일간 혐기 배양하였다. 혐기 배양 후의 배양액에 포함되어 있던 유기산의 양을 표 4에 나타낸다. 시험 2의 결과와 비교하면, 혐기 배양의 일수를 3일간에서 6일간으로 해도 숙신산의 함유량에 큰 변화는 보이지 않았다. 혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량에 대한 숙신산의 함유량은 4.8중량％였다. 또한, 시험 1 내지 3의 결과에 있어서의 숙신산 함유량의 변동은, 배양 용기인 인큐베이터 중의 위치 및 그에 수반하는 광의 조사 정도 등의 상이에 기인한 것이라고 추찰되었다.

(4) 시험 4

질소 충족 하, 10mM의 아세트산나트륨을 첨가한 CM 배지, 혹은 대조로서 첨가물을 첨가하지 않는 CM 배지를 사용하여, 14일간 배양하여 얻어진 배양액 20 내지 100mL를 원심 분리하고, 얻어진 유글레나 세포체를 10mL의 버퍼에 현탁하고, 3일간 혐기 배양하였다. 또한, 질소 충족 하에서의 배양은, 광 강도를 200μmol m^-2s^-1로 설정하여 행하였다. 혐기 배양 전의 세포체의 건조 중량에 대한 숙신산의 함유량은, 대조에서 1.1중량％, 배지에 아세트산나트륨을 첨가한 경우에 1.5중량％였다. 또한, 다른 시험예와 비교하여 숙신산 생산량이 적은 것은, 사용한 유글레나 세포체의 양이 적었기 때문이라고 생각된다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서 중에 원용되는 것으로 한다.

Claims (7)

1. 유글레나를, 질소 결핍 조건 하에서 호기적으로 배양하는 질소 결핍 배양 공정, 및 질소 결핍 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는, 유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 질소 결핍 배양 공정을 3일 이상 행하는, 방법.
3. 유글레나를, 탄소원을 포함하는 배지를 사용하여 호기적으로 배양하는 종속 영양 배양 공정, 및 종속 영양 배양 공정에서 얻어진 배양 산물을 혐기 조건 하에서 인큐베이트하는 혐기 배양 공정을 포함하는, 유글레나를 사용한 유기산의 생산 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혐기 배양 공정의 배양 산물로부터 유기산을 함유하는 배양액을 취출하는 공정을 더 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혐기 배양 공정 전에, 질소 결핍 배양 공정 또는 종속 영양 배양 공정의 배양 산물에 포함되는 유글레나 세포체를 농축하는 공정을 더 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유글레나가 야생형 유글레나인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유기산이 숙신산인, 방법.