KR102627349B1 - 희토류 존재 하에서 미세조류의 배양을 통한 유용물질 생산방법 - Google Patents

희토류 존재 하에서 미세조류의 배양을 통한 유용물질 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 희토류 존재 하에서 미세조류의 배양을 통한 유용물질(파리밀론, 바이오디젤)의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 수계 정화에 활용되는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)를 희토류를 포함하는 환경에서 배양함으로써, 유용물질인 파라밀론(paramylon) 및 바이오디젤(fatty acid methyl ester, FAME) 생산을 효과적으로 증대시킬 수 있다.

Description

희토류 존재 하에서 미세조류의 배양을 통한 유용물질 생산방법{Method of producing useful substances through culturing microalgae in the presence of rare earth elements}
본 발명은 희토류 존재 하에서 미세조류의 배양을 통한 유용물질(파리밀론, 바이오디젤)의 생산방법에 관한 것이다.
희토류는 반도체 공정, 차량 생산, 광학 공정 등에 사용되는 원소로 현대 공업에 반드시 필요한 물질이다. 희토류 사용량이 증가하면서 환경으로 배출되는 희토류량도 크게 증가하고 있는 실정이다. 일반적인 호수나 강 내 희토류 농도는 낮아서 문제가 되지 않지만, 공장이나 희토류 광산 근처 수계 내 희토류 농도는 0.8-130 mg/L로 굉장히 높다. 적은 양의 희토류도 인체 내에 축적되면 암, 동맥경화 등 질병을 일으킬 수 있어서 수계 내 희토류 제거는 중요한 사회적 문제가 되고 있다.
한편, 유글레나(Euglena)는 일본에 있어서는 「녹색벌레(insect green)」의 일본 명칭으로 널리 알려져 있으며, 일반적으로 늪, 연못, 논 등의 담수에 생식하고 있는 미생물의 학술명이다. 유글레나는 엽록체를 가지고 광합성을 활발하게 수행하는 한편, 편모나 세포수축에 의한 운동성을 가지는 등의 동물적인 특징을 나타내는 것으로부터 분류학상에 있어서, 식물과 동물 양쪽의 분류에 속하는 매우 희귀한 미생물이라고 말할 수 있다. 현재, 유글레나를 함유하는 조류에 의한 유용물질 생산의 가능성에 관해서 각종 산업계가 주목하고 있다. 조류를 건조시킨 것은, 식품으로서의 실용화가 일부에서 이미 수행되고 있으며, 고등식물에 비하여 석유 유래의 화성품 대체원료, 혹은 연료의 원료 등 유용물질을 고수율로서 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문이다.
이러한, 유글레나는 탄수화물로서 파라밀론(Paramylon)을 세포 내에 축적한다. 파라밀론은 약 700개의 글루코스가 β-1,3- 결합에 의해 중합한 고분자체의 입자이다. 한편, 유글레나는 혐기 상태에 놓이면, 저장 다당인 파라밀론을 분해하여 지방산과 지방 알코올로 이루어지는 왁스 에스테르를 최종 산물로 하는 왁스 에스터 발효를 진행한다.
희토류가 미세조류에 미치는 영향도 일부 연구되었으나, 주로 희토류가 미치는 독성에 대한 연구가 주를 이루고 있다. 특히, 희토류를 이용하여 미세조류 유용물질의 생산량을 증대시키는 연구는 전무한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 희토류가 미세조류의 성장 및 유용물질 생산에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 미세조류로서 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)를 희토류가 함유된 물에 배양하였으며, 그 결과 희토류가 유글레나의 성장을 촉진시키고, 동시에 유용물질(파라밀론, 지질)의 생산을 증대시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-2013-0048234호
따라서 본 발명의 목적은 고부가가치 물질인 파라밀론(베타글루칸)을 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고부가가치 물질인 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester)를 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 희토류 존재 하에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 희토류는 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 어븀(Er), 툴륨(Tm), 이터븀(Yb), 루테륨(Lu), 스칸듐(Sc) 및 이트륨(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 희토류는 1 내지 100 μM의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 희토류 존재 하에서 성장이 증대될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 유글레나(Euglena)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 호기 조건 하에서 종속영양 배양일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양물의 파라밀론 생산량은 1.2 ~ 1.4 g/L/일(day)일 수 있다.
또한, 본 발명은 희토류 존재 하에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 배양물을 혐기 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하는, 지방산 메틸 에스테르의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 희토류는 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 어븀(Er), 툴륨(Tm), 이터븀(Yb), 루테륨(Lu), 스칸듐(Sc) 및 이트륨(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 유글레나(Euglena)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 호기 조건 하에서 종속영양 배양일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법으로 생산된 지방산 메틸 에스테르의 생산량은 70 ~ 80 mg/L/일(day)일 수 있다.
본 발명의 방법은 수계 정화에 활용되는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)를 희토류를 포함하는 환경에서 배양함으로써, 유용물질인 파라밀론(paramylon) 및 바이오디젤(fatty acid methyl ester, FAME) 생산을 효과적으로 증대시킬 수 있다.
도 1은 다양한 농도(1, 5, 10, 30, 100 μM)의 란타넘을 처리한 조건에서 종속영양 배양된 유글레나 글라실리스 배양물의 배양 일차에 따른 건조 중량을 측정한 결과이다.
도 2는 다양한 농도(1, 5, 10, 30, 100 μM)의 란타넘을 처리한 조건에서 유글레나 글라실리스를 배양한 후 배지 내 잔류 포도당 농도를 측정한 결과이다.
도 3은 유글레나 글라실리스 배양 전·후의 배지 내 란타넘의 농도(mg/L)를 측정한 결과이다.
도 4는 100 μM 농도의 LaCl3, FeCl3 또는 AlCl3를 처리한 후 4일차 배양에서 유글레나 그라실리스의 건조 중량을 측정한 결과이다.
도 5는 란타넘(100 μM)을 처리한 조건에서 종속영양 배양된 유글레나 글라실리스 바이오매스 내 인(P), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg) 및 칼륨(K) 함량을 측정한 결과이다(A: 인, B: 칼슘, C: 마그네슘, D: 칼륨).
도 6은 유글레나 그라실리스 배양에 있어서 란타넘을 처리하지 않거나(대조군) 또는 처리한 조건(처리군)에서 왁스 에스터 발효 전·후에 따른 파라밀론 및 FAME 전체 수율을 측정한 결과이다(A: 대조군, B: 처리군).
도 7은 유글레나 그라실리스 배양에 있어서 란타넘을 처리하지 않거나(대조군) 또는 처리한 조건(처리군)에서 왁스 에스터 발효 전·후에 따른 파라밀론 및 FAME의 1일 생산량을 나타낸 것이다(A: 왁스 에스터 발효 전, B: 왁스 에스터 발효 후).
도 8A는 다양한 희토류(세륨, 네오디뮴, 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴 각 30 μM))를 처리한 조건에서 4일차 배양한 유글레나 그라실리스의 건조 중량을 측정한 것이며, 8B는 다양한 희토류(세륨, 네오디뮴, 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴 각 30 μM))를 처리한 조건에서 4일차 배양한 유글레나 그라실리스의 왁스 에스터 발효(2일) 후 FAME 수율을 측정한 결과이다.
도 9는 하천수에 희토류 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴 각 30 μM)을 처리한 조건에서 4일차 배양한 유글레나 그라실리스의 건조 중량을 측정한 결과이다.
도 10은 하천수에 희토류 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴 각 30 μM)을 처리한 조건에서 유글레나 글라실리스를 4일간 배양한 후 하천수 내 희토류의 농도(mg/L)를 측정한 결과이다.
도 11은 하천수에 희토류 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴 각 30 μM)을 처리한 조건에서 4일차 배양한 유글레나 그라실리스의 왁스 에스터 발효(2일) 후 FAME 수율을 측정한 결과이다.
본 발명은 a) 희토류 존재 하에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 b) 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 언급하는 ‘희토류(rare earth elements)’는 자연계에 매우 드물게 존재하는 원소기호 57번부터 71번까지의 란탄계 원소 15개와, 21번인 스칸듐 및 39번인 이트륨 등 총 17개 원소를 총칭한다. 자세하게는, 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 어븀(Er), 툴륨(Tm), 이터븀(Yb), 루테륨(Lu), 스칸듐(Sc), 이트륨(Y) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 희토류는 1 내지 100 μM의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 희토류 존재 하에서 배양될 수 있는 미세조류는 유글레나(Euglena)일 수 있으며, 바람직하게는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)일 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 ‘유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)’는 담수에 사는 원생생물 중 하나로, 비타민의 일종인 알파-토코페롤(α-tocopherol), 베타글루칸 중합체인 파라밀론(paramylon), 지질 등 다양한 유용물질을 생산할 수 있다. 특히 암(暗)배양 조건에서 당배양을 할 경우 파라밀론 함량이 건중량 대비 60% 이상일 뿐만 아니라 세포벽이 존재하지 않아 파라밀론 추출도 다른 생물에 비해 비교적 쉽다. 또한 파라밀론 구조가 베타-1, 3 결합으로 이루어져 있기 때문에 다른 결합이 섞여 있는 버섯, 곡물로부터 추출한 베타글루칸보다 기능이 뛰어나다고 볼 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 ‘파라밀론(paramylon)’은 유글레나류의 세포 내 저장물질로서 베타글루칸 중합체이다.
본 발명의 방법에 있어서, a) 단계는 희토류 존재 하에서 미세조류를 호기 조건 하에서 종속영양 배양하는 단계일 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서는, 미세조류인 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)를 Modified Hutner’s medium에서 배양시 LaCl3 스톡 용액(최종 농도 1~100 μM)을 첨가하여 28℃ 온도의 암조건에서 4일 이상 배양하였다.
상기 배양 과정을 거친 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 배양물은 파라밀론 생산량이 약 1.4 g/L/일(day)일 수 있으며, 이러한 결과는 무처리군(약 1.0 g/L/일(day)) 대비 40% 증대된 생산성을 나타낸다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 희토류 존재 하에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 ⅱ) 배양물을 혐기 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하는, 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 희토류는 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 어븀(Er), 툴륨(Tm), 이터븀(Yb), 루테륨(Lu), 스칸듐(Sc) 및 이트륨(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 희토류 존재 하에서 배양될 수 있는 미세조류는 유글레나(Euglena)일 수 있으며, 바람직하게는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, ⅰ) 단계는 희토류 존재 하에서 미세조류를 호기 조건 하에서 종속영양 배양하는 단계일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, ⅱ) 단계는 미세조류 배양물을 왁스 에스터 발효시키는 단계로서, 자세하게는 호기 조건 하에서 종속영양 배양한(4일간 배양) 미세조류 배양물을 2일간 공기 순환이 되지 않는 혐기 조건에서 28℃, 암실에서 발효시키는 단계이다.
상기 방법으로 생산된 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 생산량은 약 80 mg/L/일(day)일 수 있으며, 이러한 결과는 무처리군(약 50 mg/L/일(day)) 대비 60% 증대된 생산성을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
<1-1> 유글레나 그라실리스 배양
본 실험에서는 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis strain Z) 종을 이용하였다. 위 미세조류는 체코 과학 아카데미 식물학 연구소(Institute of Botany of the Academy of Sciences of the Czech Republic)의 CCALA(Culture Collection of Autotrophic Organisms)에서 구매하였다.
배양 배지는 Modified Hutner’s medium을 이용하였으며, 1L 3차 증류수에 (단위: g) glucose, 20; glutamic acid, 5; malic acid, 5; glycine, 2.5; asparagine, 2; urea, 0.4; succinic acid, 0.1; KH2PO4, 0.4; MgSO4·7H2O, 0.14; MgCO3, 0.4; CaCO3, 0.1; trace elements solution, 10mL/L; vitamin solution, 10mL/L; 및 H3BO3 solution, 10ml/L를 첨가하였다. Trace elements solution은 1L 3차 증류수에 (단위: g) (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O, 2.1; ZnSO4·7H2O, 1.1; MnSO4·H2O, 0.58; (NH4)5Mo7O24·4H2O, 0.18; CoSO4·7H2O, 0.024; CuSO4·5H2O, 0.077; 및 NaNO3·4H2O, 0.074를 첨가하여 제조하였다. Vitamin solution은 thiamin, 0.06 g 및 cyanocobalamin 0.005 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었으며, H3BO3 solution은 0.029 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었다. 배지는 121℃에서 20분간 멸균을 한 후 사용하였다. 500 mL 삼각플라스크(DURAN 제조)에 250 mL의 배지를 넣어 시드 배양(seed cultivation)을 하였으며, 배양 온도는 28℃ 였으며, 암조건에서 150 rpm 으로 교반해주었다.
<1-2> 란타넘 처리
유글레나 그라실리스의 배양물을 Modified Hutner’s medium(250mL 삼각 플라스크에 100mL)에 접종하였다. 초기 세포 농도는 106 cells/mL였다. LaCl3 스톡 용액(증류수에 용해)을 0.2μm 시린지 필터로 여과하고 배지에 첨가하여 최종 농도가 각각 1, 5, 10, 30, 100μM이 되도록 준비하였다. 동일한 부피의 증류수를 대조군에 첨가하였다.
란타넘(La)에 의해 유도된 성장 자극 메커니즘을 확인하기 위해 LaCl3 대신 FeCl3 또는 AlCl3를 첨가하였다(농도: 100μM). 클라트린 매개 세포내이입(clathrin-mediated endocytosis) 테스트의 경우, 세포를 클라트린 매개 세포내이입 억제제(tyrphostin 23)(10μM)로 처리하였다. 모든 원액은 주사기 필터(공극 크기: 0.2μm)를 통해 여과하여 멸균되었다. 세포를 호기성 조건에서 96시간 동안 배양하였다.
<1-3> 성장 모니터링
건조 중량 측정을 위해 세포를 증류수로 세척하고 유리 섬유 필터(기공 크기: 0.45 μm)로 여과하였다. 여과지를 오븐에서 건조시키고 세포 여과 후 종이의 무게에서 원래의 여과지의 무게를 빼서 건조중량을 측정하였다.
세포와 배지를 원심분리를 통해 분리하고 상층액을 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 여과된 용액은 배지 분석에 사용되었다. 잔류 포도당 농도를 측정하기 위해 굴절률 검출기(RID-20A, Shimadzu, Japan)를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다.
동결건조된 바이오매스/배양 배지의 원소(Mg, K, Ca, P 및 La)는 유도결합 플라즈마 발광 광도법(inductively coupled plasma-optical emission spectrometry, ICP-OES) 또는 유도결합 플라즈마 질량 분광법(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)으로 정량화되었다.
<1-4> 왁스 에스터 발효
왁스 에스터 발효는 96시간 배양된 세포로 수행되었다. 배양된 시료(세포 + 배지)를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브 캡을 단단히 밀봉하여 공기 순환을 방지하였다. 튜브를 48시간 동안(흔들지 않고) 암실에서 28℃에서 인큐베이션하였다.
<1-5> 대사물질 측정
파라밀론 추출을 위하여 유글레나 세포를 99.9% 에탄올로 2번 헹궈준 다음 0.1 M 인산나트륨 버퍼(pH 7.6)에 트립신(1 g/L)을 넣어 37 ℃에서 하루 이상 보관하였다. 그 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 요소를 녹인 용액(500 g/L)을 넣어 헹궈준 다음 3차 증류수로 2번 더 헹궈주었다. 추출된 파라밀론은 건조 오븐에서 하루 이상 말려 무게를 측정하였다.
바이오디젤 생산량을 측정하기 위하여 지방산 메틸화 키트(Nacalai Tesque, Japan)와 지방산 메틸 에스터 정제 키트(Nacalai Tesque, Japan)를 활용해 유글레나 바이오매스로부터 지방산을 추출하고 트랜스 에스테르화 반응을 통하여 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl ester, FAME)으로 전환하였다. 지방산 메틸 에스테르 함량 및 조성은 DB-23 모세관 컬럼(길이: 30m, 내부 직경: 0.25mm, 필름 두께: 0.25μm)이 장착된 가스 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS, Agilent 6890N Network GC system with a 5973)로 분석되었다. 오븐 온도는 50℃에서 1분 유지 후 25℃/분 속도로 175℃까지 올린 다음 4℃/분 속도로 200℃까지 올리고 12분간 유지하였다. 지방산 메틸 에스테르의 정량화를 위해 질량 스펙트럼 특성 및 머무름 시간을 FAME 표준(SupelcoTM 37 Component FAME Mix, Sigma-Aldrich, USA)과 비교하였다.
<1-6> 기타 희토류 원소 처리
유글레나 그라실리스의 성장에 대한 다른 희토류 원소의 영향을 확인하기 위해 여과된 CeCl3 또는 NdCl3 용액을 유글레나 그라실리스의 배양물에 첨가하였다(최종 농도: 100μM). 또한, 혼합 용액(LaCl3 30μM, CeCl3 30μM, NdCl3 30μM)을 첨가하여 희토류 혼합물의 효과도 확인하였다. 세포를 호기성 조건에서 96시간 동안 배양한 후 48시간 동안 혐기성 조건에서 왁스 에스터 발효를 수행하였다.
<1-7> 희토류 혼합물을 첨가한 하천수에서의 유글레나 그라실리스 배양
하천수는 고려대학교 인근 하천(37°35'10.4"N, 127°01'14.7"E)에서 채취하였다. 수집된 물은 0.2μm 필터로 여과하고 암실에서 4℃에 보관하였다. 영양분을 공급하기 위해 10g/L의 포도당과 5g/L의 효모 추출물을 여과된 하천수에 첨가하였다. 용액을 121℃에서 20분 동안 고압증기멸균을 통해 멸균하고 용액의 pH를 산성 조건(pH ≤ 4.5)에 맞도록 조정하였다. 하천수에 첨가된 희토류 농도는 LaCl3 30μM, CeCl3 30μM 및 NdCl3 30μM이었다.
<1-8> 통계 분석
얻어진 데이터의 통계적 분석을 위해 SAS(Statistical Analysis System) 소프트웨어를 사용하였다. Duncan의 다중 범위 검정은 유의 수준을 평가하기 위해 수행되었다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결과
<2-1> 유글레나 그라실리스의 성장에 대한 란타넘의 영향
본 발명에서는 유글레나 그라실리스에 대한 란타넘(La)의 용량 의존적 효과를 확인하기 위해 세포를 다양한 농도의 란타넘(0, 1, 5, 10, 30 및 100μM)으로 처리하고 건조 중량을 모니터링하였다.
그 결과 도 1에서 보는 바와 같이 란타넘(La) 처리는 유글레나 그라실리스의 성장을 자극하였고, 자극 효과는 농도 의존적인 경향을 보여주었다. 최대 건조 중량은 배양 4일차에 기록되었으며 이후 점차 감소하는 것으로 나타났다. 배양 4일차에 100μM 처리한 세포의 건조 중량은 10.27g/L로 대조군(무처리, 0μM)보다 16.3% 높았다. 또한, 특히 100μM 농도에서 란타넘(La) 처리된 세포는 대조군 세포보다 더 많은 포도당을 소비하는 것으로 나타났다(도 2 참조). 포도당이 유글레나 그라실리스의 종속영양적 성장을 위한 주요 탄소원임을 고려할 때, 포도당 소비가 높을수록 간접적으로 유글레나 그라실리스의 높은 성장(건조 중량)을 나타낸다. 이에, 상기와 같은 결과는 란탄(La) 처리가 유글레나 그라실리스의 포도당 흡수를 촉진하여 성장 촉진을 유도함을 나타낸다.
수생 시스템에서 란타넘(La)의 생물학적 정화를 위해서는 란타넘(La)을 제거하는 미세조류의 능력이 가장 중요하다. 유글레나 그라실리스의 종속영양 배양 후, 배지에 남아 있는 란타넘(La)의 농도를 ICP-MS를 이용하여 측정한 결과 0.02 mg/L였으며, 이는 란타넘(La)의 99.9%가 성공적으로 제거되었음을 나타낸다(도 3 참조).
<2-2> 란타넘에 의한 성장 촉진 메커니즘
유글레나 그라실리스의 성장 촉진이 염화물 이온이 아닌 란타넘(La) 이온에 의해 유도되었음을 확인하기 위해 유글레나 그라실리스의 성장에 대한 FeCl3 또는 AlCl3(100 μM)의 추정 효과를 조사하였다.
그 결과 LaCl3 처리된 배양 4일차 세포의 건조 중량은 9.31g/L로 대조군(8.50g/L)보다 높은 것으로 나타난 반면, FeCl3 또는 AlCl3 처리된 세포의 건조 중량은 각각 8.45 및 8.20 g/L로 대조군과 통계적으로 다르지 않았다(도 4 참조).
상기와 같은 결과를 통해 유글레나 그라실리스의 성장 촉진이 염화물 이온에 의해 유도되는 것이 아니며 란타넘 이온에 의해 유도됨을 확인하였다. 또한, 모든 3가 이온(즉, Fe3+ 및 Al3+)이 미세조류 유글레나 그라실리스의 성장 자극을 유발하는 것은 아니며, 자극 효과가 La3+에서만 유래함을 확인하였다.
한편, 유글레나 그라실리스 바이오매스를 ICP-MS로 분석하여 다른 영양소/원소(P, Ca, Mg 및 K)의 흡수도 측정하였다. 인(P)은 미세조류 성장에 필수적인 영양소이며, 인(P)의 농도는 DNA 및 ATP를 포함한 많은 대사 산물의 빌딩 블록이기 때문에 세포의 대사 활동에 상당한 영향을 미친다. 칼슘(Ca)은 아미노산과 같은 다양한 생체 분자와 상호 작용하기 때문에 세포 내 메신저로 간주된다. 다른 원소(Mg 및 K)도 미세조류 대사에 중요하다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 바이오매스 내 모든 원소의 함량은 대조군 대비 란타넘(La) 처리 시료에서 더 높은 것을 확인하였다. 란타넘(La) 처리된 유글레나 그라실리스의 인(P) 및 칼슘(Ca) 함량은 대조군과 통계적으로 차이가 없었지만, 란타넘(La) 처리된 세포의 인(P), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg) 및 칼륨(K) 함량은 대조군 보다 각각 1.05배, 1.22배, 1.43배, 1.43배 높았다. 이러한 원소는 미세조류의 대사에 필수적이기 때문에 원소 흡수의 향상은 세포의 대사 활성을 증가시켜 성장을 촉진할 수 있다.
상기와 같은 결과를 통해 란타넘(La) 처리에 의해 유발되는 유글레나 그라실리스의 성장 자극 메커니즘이 영양소 흡수(포도당 및 미량원소/다량원소)의 증가와 관련이 있음을 확인하였다.
<2-3> 란타넘 처리된 유글레나 그라실리스에 의한 대사물질 생산량 변화
유글레나 그라실리스는 색소, 파라밀론, 지질과 같은 다양한 부가가치 대사산물을 생산할 수 있다. 종속영양 조건에서 유글레나 그라실리스는 많은 양의 파라밀론을 축적한다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 배양 4일차에 대조군 및 란타넘(La) 처리된 세포의 파라밀론 수율은 각각 4.19 및 5.37g/L 이었다. 이와 같은 결과를 통해, 유글레나 그라실리스 배양시 란타넘(La) 처리가 파라밀론 생산량이 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 대조군 및 란타넘(La) 처리군 모두에서 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율은 3중량% 미만으로 매우 낮게 나타냈다.
이에, 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율과 생산성을 높이기 위해 "왁스 에스터 발효"라고 하는 유글레나 그라실리스의 고유한 대사 과정을 사용하였다. 유글레나 그라실리스 세포에 축적된 파라밀론은 혐기성 조건에서 왁스 에스터 발효를 통해 지방산과 지방 알코올로 빠르게 전환된다. 따라서 배양 조건을 호기성에서 혐기성으로 전환하는 것은 유글레나 그라실리스의 바이오디젤 생산을 향상시키는 좋은 전략이다. 본 실험에서는, 배양 4일째(호기성 조건에서) 세포를 혐기성 조건으로 옮기고 2일 동안 배양 후 대사산물(파라밀론 및 지방산)을 분석하였다(총 6일 배양: 4일 호기성 배양 및 2일 혐기성 배양).
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 대조군 및 란타넘(La) 처리된 세포의 파라밀론 수율은 왁스 에스터 발효 후 극적으로 감소하였다(6A: 대조군, 6B: 처리군). 특히, 대조군 세포의 파라밀론 수율은 6일째 0.19g/L로 4일째에 비해 95.6% 감소하였다(도 5A). 란타넘(La) 처리된 세포의 파라밀론 수율도 혐기성 배양 후 유의하게 감소하였다(5.37 ~ 0.40g/L)(도 6B). 대조적으로, 대조군과 란타넘(La)-처리된 세포 모두의 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율은 4일에 비해 6일째에 증가하였다. 란타넘(La)-처리된 세포(9.49 wt.%)의 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율은 9.49 wt.%로 나타나, 대조군 세포의 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율인 6.81 wt.% 대비 두드러지게 높게 나타났다. 이와 같은 결과를 통해, 유글레나 그라실리스 배양시 란타넘(La) 처리가 바이오디젤 생산에 유리함을 확인할 수 있었다.
또한, 수율(g/L)과 함께 경제성 평가를 위해서는 FAME 생산성(mg/L/일)을 고려해야 한다. 도 7은 대조군 및 란타넘(La) 처리된 유글레나 그라실리스의 왁스 에스터 발효 전·후에 따른 파라밀론 및 FAME의 1일 생산량을 나타낸 것이다(7A: 왁스 에스터 발효 전, 7B: 왁스 에스터 발효 후). 왁스 에스터 발효 후 대조군과 란타넘(La) 처리된 유글레나 그라실리스의 지방산 메틸 에스터(FAME) 생산성은 각각 49.23 및 78.76 mg/L/일로 나타나(도 7B 참조), 란타넘(La) 처리가 바이오디젤 생산성을 향상시키는 것으로 나타났다. 일반적으로 대부분의 미세조류의 지방산 메틸 에스터(FAME) 생산성은 60mg/L/일 미만이다. 따라서 상기와 같은 결과를 통해, 유글레나 그라실리스가 저렴한 바이오디젤 공급원료이며 배지에 란타넘(La)이 존재하면 유글레나 그라실리스 기반 바이오디젤 생산을 위한 경제적 실행 가능성을 충족하는 데 도움이 될 수 있을 것으로 판단되었다.
<2-4> 유글레나 그라실리스의 성장에 대한 다른 희토류 원소의 영향
산성광산배수(acid mine drainage)와 같은 희토류 오염수에는 란타넘(La) 뿐만 아니라 세륨(Ce), 네오디뮴(Nd) 등 다른 희토류도 포함되어 있기 때문에, 이들 희토류 혼합물(La, Ce, Nd)이 유글레나 그라실리스의 성장과 지질 생성에 미치는 영향도 조사하였다.
그 결과 도 8A에서 나타낸 바와 같이, 희토류 처리는 유글레나 그라실리스의 성장을 향상시키는 것을 확인하였다. 특히, 세륨(Ce) 100μM, 네오디뮴(Nd) 100μM 및 희토류 혼합물(La, Ce, Nd) 처리된 세포의 건조 중량은 대조군(6.19g/L) 대비 각각 30.1%, 17.6% 및 13.4% 더 높은 것으로 나타났다(Ce 처리군: 8.05g/L, Nd 처리군: 7.28g/L, 희토류 혼합물 처리군: 7.02 g/L). 또한, 왁스 에스터 발효 후 FAME 수율도 대조군에 비해 희토류 처리된 세포에서 유의미하게 증가된 것으로 나타나, 란타넘(La) 처리에 따른 FAME 수율 증대 경향과 유사하게 나타났다(도 8B 참조).
<2-5> 실제 환경 조건에서 희토류 제거 가능성 확인
상기에서는 Modified Hutner’s medium을 기반으로 한 실험실 수준에서 유글레나 그라실리스에 의한 희토류 원소 제거 및 바이오디젤 생산을 확인하였다.
본 실험에서는 실제 환경 조건에서 유글레나 그라실리스를 이용한 희토류 제거 및 바이오디젤 생산 가능성을 확인하기 위해, 하천수를 채수하여 일정 농도의 희토류 혼합물(란타넘, 세륨, 네오디뮴; 각 30 μM)을 처리한 후 유글레나 그라실리스를 배양하였다. 질소, 인 공급을 위하여 효모 추출물 5 g/L를 넣어줬고, 탄소원 공급을 위하여 글루코스 10 g/L를 넣어주었다.
배양 4일차에 대조군 및 희토류 처리된 세포의 건조 중량을 측정한 결과, 대조군은 3.32g/L, 희토류 혼합물 처리군은 3.68g/L로 나타났다(도 9 참조). 유글레나 그라실리스를 Modified Hutner’s medium로 배양했을 때와 비교하여 실제 하천수와 함께 배양했을 때 건조 중량이 유의하게 감소하였다. 하천수와 배지 사이의 양분 농도의 차이가 하천수의 낮은 성장에 기여했을 수 있다. Modified Hutner’s medium에 비해 하천수에서 유글레나 그라실리스의 성장이 다소 감소했지만, 희토류 원소의 존재가 유글레나 그라실리스의 성장을 향상시키는 것을 확인하였다.
한편, 유글레나 그라실리스 재배 후 하천수의 잔류 희토류 원소를 측정하였으며, 그 결과 유글레나 그라실리스가 하천수 내의 희토류를 효과적으로 제거하는 것을 확인하였다(도 10 참조). 하천수의 모든 희토류(La, Ce, Nd) 농도는 유글레나 그라실리스 배양 후 두드러지게 감소하였으며, 이는 유글레나 그라실리스가 실제 환경 조건에서 희토류를 제거하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
또한, 하천수에서 배양한 유글레나 그라실리스의 왁스 에스터 발효 후 희토류 처리된 세포의 지방산 메틸 에스터(FAME) 수율을 대조군 세포와 비교하였다. 그 결과 FAME 수율이 대조군(8.31wt.%)에 비해 희토류 혼합물을 처리군(9.96wt.%)에서 20.0% 증가한 것으로 나타났다(도 11 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 희토류 존재 하에서 미세조류를 배양하는 단계; 및
    배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 희토류는 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 어븀(Er), 툴륨(Tm), 이터븀(Yb), 루테륨(Lu), 스칸듐(Sc) 및 이트륨(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 희토류는 1 내지 100 μM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 희토류 존재 하에서 성장이 증대되는 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 유글레나(Euglena)인 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 호기 조건 하에서 종속영양 배양인 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양물의 파라밀론 생산량은 1.2 ~ 1.4 g/L/일(day)인 것을 특징으로 하는, 파라밀론의 생산방법.
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