CN105229140B - 裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法 - Google Patents

裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法 Download PDF

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Abstract

提供一种为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD‑1株(保藏号FERM BP‑11530)或其变异株并且至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类。提供一种多糖类的制造方法，其通过培养作为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD‑1株(保藏号FERM BP‑11530)或其变异株并且至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类作为多糖类产生生物来制造多糖类。提供一种有机化合物的制造方法，其通过培养作为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD‑1株(保藏号FERM BP‑11530)或其变异株并且至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类来制造选自多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素及蛋白质所组成的群组中的至少1种有机化合物。

Description

裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法
相关申请的相互参引
本申请主张日本专利申请2013-067558号的优先权，该申请通过引用纳入本申请说明书的记载中。
技术领域
本发明涉及裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法。
背景技术
裸藻属微藻类也称为绿虫藻，其作为通过培养产生裸藻淀粉等多糖类等的微生物是已知的。
以往，作为裸藻属微藻类，已知有多种，例如，纤细裸藻(Euglena gracilis)NIES-48株是已知的(专利文献1)。
这种裸藻属微藻类通过培养产生裸藻淀粉等多糖类，并在细胞内蓄积该多糖类。
另外，就这种裸藻属微藻类而言，根据培养条件，可将蓄积的多糖类向蜡酯转化，或产生多糖类的同时也产生蛋白质。而且，所产生的在该微藻类的细胞内蓄积的多糖类、脂质、蛋白质等有机化合物可用于燃料和食品等用途。
但是，这种裸藻属微藻类存在产生多糖类等有机化合物的性能不一定充分的问题。
现有技术文献：
专利文献
专利文献1:日本特开平07-070207号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明鉴于上述问题点等，课题在于提供一种至少能够充分地产生多糖类的裸藻属微藻类。另外，本发明的课题在于提供一种能够充分地得到多糖类的多糖类的制造方法。另外，本发明的课题在于提供一种能够充分地得到选自多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质所组成的群组中的至少1种有机化合物的有机化合物的制造方法。
解决课题的方法
为解决上述课题，本发明的裸藻属微藻类的特征在于，其为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(保藏号FERM BP-11530)或其变异株，并且为至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类。
本发明的多糖类的制造方法的特征在于，通过培养作为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(保藏号FERM BP-11530)或其变异株的至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类作为多糖类产生生物来制造多糖类。
作为本发明的多糖类的制造方法的一个方案，可以采用在所述培养中使用的培养液含有15-30g/L葡萄糖的方案。
另外，作为本发明的多糖类的制造方法的其他方案，可以采用在所述培养中使用的培养液含有酵母分解物的方案。
另外，作为本发明的多糖类的制造方法的其他方案，可以采用在所述培养中使用的培养液具有AF6培养基的组成的方案。
另外，作为本发明的多糖类的制造方法的其他方案，可以采用所述多糖类为裸藻淀粉的方案。
本发明的有机化合物的制造方法的特征在于，通过培养作为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(保藏号FERM BP-11530)或其变异株的至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类，制造选自多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质所组成的群组中的至少1种有机化合物。
附图说明
图1是比较纤细裸藻(Euglena gracilis)的18S rRNA基因碱基序列的表。
图2是表示用18S rRNA基因作成的系统树的图。
图3A是表示RAPD解析的带型的照片。
图3B是表示RAPD解析的带型的照片。
图3C是表示RAPD解析的带型的照片。
图4是表示在异养培养中的微藻类的葡萄糖转化率及微藻类的干燥重量的图表。
图5是表示在光能异养培养中微藻类的培养时间和微藻类的干燥重量的图表。
图6是表示在pH条件不同的各培养基中光能异养培养时的微藻类的培养时间和微藻类的干燥重量的图表。
图7是表示在pH条件不同的各培养基中光能异养培养时的微藻类的培养时间和微藻类的干燥重量的图表。
图8A是表示在光能异养培养中从好氧条件向厌氧条件转换时的微藻类的培养时间和单位细胞的裸藻淀粉含有率的图表。
图8B是表示在光能异养培养中从好氧条件向厌氧条件转换时的微藻类的培养时间和单位培养液的裸藻淀粉量的图表。
图9A是表示在光能异养培养中从好氧条件向厌氧条件转换时的微藻类的培养时间和单位细胞的脂质含有率的图表。
图9B是表示在光能异养培养中从好氧条件向厌氧条件转换时的微藻类的培养时间和单位培养液的脂质量的图表。
具体实施方式
以下，对于本发明的裸藻属微藻类的一实施方案详细地进行说明。
本实施方案的裸藻属微藻类为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(保藏号FERM BP-11530)或其变异株，其为至少具有多糖类的产生能力的裸藻属微藻类(以下，也简称为裸藻属微藻类或微藻类)。
本实施方案的裸藻属微藻类起到至少能够充分地产生多糖类的效果。
所述裸藻属微藻类为在水中浮游并生存的生物。另外，所述裸藻属微藻类为单细胞性，其是因株不同而稍微不同的大小大概为10μm到50μm的微小的藻类。
以下示出所述裸藻属微藻类的性质的详细情况。
(裸藻属微藻类的形态性质)
所述裸藻属微藻类的营养型细胞具有鞭毛，并活跃地运动。另外，细胞的形状大致为纺锤形。在细胞内，除了核、叶绿体、线粒体等一般的细胞器以外，还有称为眼点的红色的细胞器。
(裸藻属微藻类的生理学性质或生物化学性质)
(1)培养基：在主要由淡水构成的培养液中能够增殖(即使利用来自废水的有机物也可增殖)。
(2)光合作用能力：能够通过光合作用进行光能自养增殖。
(3)含有色素：包括叶绿素a、叶绿素b、及其他类胡萝卜素类。
(4)同化蓄积物质：蛋白质、脂质(蜡酯)、多糖类(裸藻淀粉)。
(5)增殖温度范围：15℃-35℃(最适温度25℃)。
(6)合适增殖pH范围：pH3.5-5.5(但是，即使在左侧所述pH范围外也可增殖)
(裸藻属微藻类的基因信息)
所述裸藻属微藻类具有以序列编号1表示的18S rDNA(18S rRNA基因)。
此外，18S rRNA基因的解析可通过作为微藻类的鉴定方法而常用的方法来进行。具体地，18S rRNA基因的解析可通过例如实施例中记载的方法来进行。
就所述裸藻属微藻类的18S rRNA基因中的碱基序列而言，可以用BLAST同源性检索，与从GenBank得到的已知的裸藻属微藻类的18S rRNA基因的碱基序列进行比较。对于与已知的裸藻属微藻类的序列相同性的一致程度比较后的结果，在后面的实施例中示出。
此外，作为数据库，也可以使用EMBL、DDBJ等。
进一步地，可以使用分子系统树作成软件Mega5程序(Tamura等.2011，Mol.Biol.Evol.28：2731-2739)，根据最大似然法作成分子系统树。关于作成的分子系统树，在后面的实施例中示出详细内容。
通过如上所述方法，由后述实施例的结果，所述裸藻属微藻类被鉴定为Euglena gracilis，并命名为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株。
所述纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株在2013年6月28日(原保藏日2013年3月25日)在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(NITE-IPOD(邮政编号292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室)在布达佩斯条约的规定下，以保藏号FERM BP-11530进行国际保藏。
如上所述，所述裸藻属微藻类因为在细胞内具有叶绿体，所以通过光合作用可增殖。即，所述裸藻属微藻类为光能自养生物。
另外，所述裸藻属微藻类利用葡萄糖等有机营养素作为营养素也可增殖。即，所述裸藻属微藻类也是异养生物。
这样，所述裸藻属微藻类仅通过光能自养可增殖，仅通过异养可增殖，同时进行光能自养及异养也可增殖。
就所述变异株而言，例如，通过实施一般的突然变异处理、或由继代培养引起适应或者自然变异来制作。
可用一般的变异原进行所述突然变异处理。作为变异原，例如，可列举具有变异原作用的药剂、紫外线等。作为具有变异原作用的药剂，例如，可列举链霉素、氧氟沙星、甲磺酸乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、溴尿嘧啶等核苷酸碱基类似物、或吖啶类等。
接着，对于本发明的多糖类的制造方法的一实施方案进行说明。
本实施方案的多糖类的制造方法是通过培养所述裸藻属微藻类至少制造多糖类的方法。
本实施方案的多糖类的制造方法起到能够充分地得到多糖类的效果。
详细地，就本实施方案的多糖类的制造方法而言，具有在至少含有水的培养液中培养所述裸藻属微藻类的培养步骤。
作为所述培养液，优选含有促进微藻类增殖的营养素和水的培养液。
作为所述营养素，可列举无机营养素或有机营养素等。
作为所述无机营养素，例如，可列举含氮的无机化合物、含磷的无机化合物等。另外，作为所述无机营养素，例如，可列举钾离子、铁离子、锰离子、钴离子、锌离子、铜离子、钼离子、镍离子等。
所述无机营养素的培养液的浓度通常为一般所知的程度的浓度。
作为所述有机营养素，例如，可列举葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)等单糖类；维生素B6、B12等维生素类；精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸等氨基酸；苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸等有机酸；乙醇等醇类等。
作为所述培养液的组成，例如，可采用后述的“AF-6培养基”的组成、“Cramer-Myers培养基”的组成、“Hutner培养基”的组成、或者与这些组成类似的组成等。
在所述培养步骤中，优选培养液含有15-30g/L作为碳源的葡萄糖。另外，优选培养液含有酵母分解物(后述)。另外，优选培养液具有AF6培养基的组成。
就所述培养步骤而言，例如，可在收纳上述的培养液和微藻类混合后的混合物的槽内等实施。
在所述培养步骤中，通过对微藻类照射光，能够使微藻类进行光合作用。即，在所述培养步骤中，可进行光能自养培养。
若在所述培养步骤中对微藻类照射光，则微藻类通过光合作用将二氧化碳摄入到细胞内，在至少产生裸藻淀粉等多糖类的同时可增殖。进一步地，微藻类在产生蛋白质及脂质、色素和维生素类等二次代谢物等的同时可增殖。
在所述培养步骤中对微藻类照射的光只要是使微藻类进行光合作用的光即可，没有特别限定。作为该光，例如，可采用来自太阳的自然光、或来自照明的光等人工光等。
在所述光能自养培养步骤中照射的光的强度没有特别限定，通常为50μmol/m2·s至200μmol/m2·s。
在所述培养步骤中，可以使对微藻类照射光的期间和不对微藻类照射光的期间交替地重复。
即，在所述培养步骤中，可以使进行光能自养培养的期间和不进行光能自养培养的期间交替地重复。
在所述培养步骤中照射光的期间通常为相当于出现日光的白天时间的8小时至15小时。另外，为了抑制微藻类的光合作用而不照射光的暗条件的期间通常为相当于不出现日光的夜晚时间的9小时至16小时。这些期间可根据状况或目的而变化。
此外，不照射光的暗条件下为光合作用光量子通量密度(PPFD)为50μmol/m2·s以下的条件。
另一方面，在所述培养步骤中，可在上述营养素之中的有机营养素的存在下进行培养微藻类的异养培养。若在所述培养步骤中在有机营养素的存在下培养微藻类，则微藻类将有机营养素摄入到细胞内，在至少产生裸藻淀粉等多糖类的同时可增殖。
即，在所述培养步骤中，可进行光能自养培养及异养培养之中的至少一种。
在所述培养步骤中，在能够进一步促进微藻类的增殖这一点上，优选同时进行光能自养培养及异养培养二者。即，在所述培养步骤中，优选进行光能异养培养。
作为在所述异养培养和光能异养培养中使用的有机营养素，优选采用所述裸藻属微藻类可利用的、乙醇等醇，葡萄糖或果糖等单糖类等，或含有这些成分的废弃物等。进一步地，在能够确实地进一步促进所述裸藻属微藻类增殖这一点上，优选合用酵母或酵母分解物(以下，也称酵母提取物)作为有机营养素。
此外，作为含有上述各有机营养素的至少一部分的物质，可列举酿造酒、蒸馏酒、清酒粕、烧酒粕、糖蜜、废糖蜜等。而且，这些酒类等可作为有机营养素的供给源在异养培养或光能异养培养中使用。
所述酿造酒为通过酵母使含有糖分的原料进行醇发酵而成，并且未实施蒸馏处理的酒。
由于所述酿造酒未进行蒸馏处理，并且含有因酵母而产生的醇发酵代谢物，因此除了乙醇、水以外，还含有酵母产生的葡萄糖(glucose)等糖类、蛋白质、氨基酸、维生素、磷、钾等营养素。
作为所述酿造酒，可列举啤酒、清酒、葡萄酒、以谷物为原料的酿造酒、以豆为原料的酿造酒、以薯为原料的酿造酒、或以糖为原料的酿造酒等。
就所述啤酒而言，通过麦芽内的酶至少使麦芽中所含有的淀粉发生糖化从而产生糖分，进一步通过啤酒酵母使该糖分进行醇发酵而作成。即，只要是至少使用麦芽作为原料如上所述制作的啤酒，即使进一步使用了其他原料，也包含于本说明书的啤酒中。
作为所述麦芽，通常使用大麦的麦芽。
就所述清酒(日本酒)而言，通过酒曲使米中所含有的淀粉发生糖化从而产生糖分，进一步通过酵母使该糖分进行醇发酵而作成。
所述葡萄酒由通过酵母至少使葡萄果汁进行醇发酵而作成。
作为所述酵母，例如，可列举属于酵母菌(Saccharomyces)属的酵母，具体地，可列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。
另外，作为所述酵母，例如，可列举所谓的清酒酵母、所谓的葡萄酒酵母、或所谓的啤酒酵母等。
作为所述酵母分解物(酵母提取物)，可列举通过所述酵母自溶而产生的酵母自溶物、使酵母与热水接触从而破坏细胞壁而得到的物质、或通过酶破坏酵母的细胞壁而得到的物质等。
在所述培养步骤中，为维持微藻类的氧气呼吸，可以对培养液供给含有氧气的气体。另外，在所述培养步骤中，为了促进微藻类的光合作用，可以对培养液供给含有二氧化碳的气体。
这种气体的供给可以通过将培养液曝气、搅拌培养液等进行。
具体地，在所述培养步骤中，为了对微藻类供给呼吸用氧气，例如可利用空气将培养液曝气。另外，在所述培养步骤中，为促进微藻类的光合作用，例如，可利用含有较多二氧化碳的尾气等将培养液曝气。
在所述培养步骤中，优选地，通过曝气等将氧气及二氧化碳供给至培养液中，并且同时进行光能自养培养及异养培养。即，在所述培养步骤中，为了促进微藻类的氧气呼吸及光合作用，优选地，一边通过曝气等将含有氧气及二氧化碳两者的气体供给至培养液，并且在有机营养素的存在下进行异养培养，一边通过照射光进行光能异养培养。
在所述培养步骤中，在白天等，通过对微藻类照射光的同时对培养液供给二氧化碳，能够促进微藻类的光合作用。另外，在夜晚等不照射光时，在有机营养素的存在下对培养液供给空气，能够对微藻类进行异养培养。
通过这样实施培养步骤，有进一步促进微藻类的增殖，而且，进一步促进由微藻类产生裸藻淀粉等的优点。
就所述培养步骤的培养温度而言，只要是微藻类能够增殖的温度即可，没有特别限定。作为该培养温度(培养液的温度)，具体地，例如，采用15℃-35℃，优选采用20℃-30℃。
就所述培养步骤的培养液的pH而言，只要是微藻类能够增殖的pH即可，没有特别限定。作为该pH，例如，采用2.5-5.5。
此外，为了调整培养液的pH，可在培养液中添加盐酸之类的无机酸，也可在培养液中添加乙酸之类的有机酸。通过在培养液中添加有机酸，有微藻类利用该有机酸作为有机营养素并增殖的优点。
另外，为了调整培养液的pH，可在培养液中添加碱试剂。作为碱试剂，通常使用氢氧化钠或氢氧化钾等。
在所述培养步骤中，为了使所述裸藻(Euglena)属微藻类产生蜡酯，可以抑制向培养液的氧气供给。
具体地，在所述培养步骤中，例如，通过停止向培养液的充气，或对培养液供给不含氧气的惰性气体等，能够在厌氧条件下培养微藻类。
在所述培养步骤中，通过在厌氧条件下进一步培养在细胞内蓄积了裸藻淀粉等多糖类的微藻类，裸藻属微藻类可以使裸藻淀粉向蜡酯转化，并在细胞内蓄积该脂质。
在所述培养步骤中，在能够进一步促进蜡酯的产生这一点，优选在厌氧条件下并且在不照射光的暗条件下，培养微藻类。
另一方面，在所述培养步骤中，为了使所述裸藻(Euglena)属微藻类产生蛋白质，可以在对培养液供给氧气的同时，在含有氮的无机营养素或含有氮的有机营养素的存在下培养微藻类。
在所述培养步骤中，通过如上所述地培养微藻类，能够使微藻类增殖的同时，使微藻类产生多糖类、脂质、或蛋白质等有机化合物，并能够在微藻类的细胞内蓄积这类有机化合物。
另外，在所述培养步骤中，通过适当调整培养条件，也能使微藻类产生所说的除上述有机化合物以外的色素、维生素C或维生素E等维生素类、蛋白质、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸等脂肪酸这些有机化合物。
而且，在细胞内蓄积了这些有机化合物的微藻类可以作为可在食品、医药、饲料、化工产品、或燃料等各种用途中使用的生物质而利用。
作为所述多糖类，例如，可列举裸藻淀粉(β-1,3-葡聚糖)。裸藻淀粉由约700个葡萄糖键合而成。
作为所述脂质，例如，可列举蜡酯。蜡酯是由高级脂肪酸和高级醇类进行酯键合而成的，作为蜡酯，例如，可列举由C-14的脂肪酸和C-14的高级醇进行酯键合而成的蜡酯。
此外，在本实施方案的多糖类的制造方法中，可以进行与后述的有机化合物的制造方法同样的步骤。
接着，对本发明的有机化合物的制造方法的一实施方案进行说明。
就本实施方案的有机化合物的制造方法而言，通过进行上述的培养方法(培养步骤)，制造选自多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质所组成的群组中的至少1种作为有机化合物。
本实施方案的有机化合物的制造方法起到能够充分地获得选自多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质所组成的群组中的至少1种有机化合物的效果。
其中，关于维生素C、维生素E、色素、及蛋白质，通过进行多糖类的制造方法，可与多糖类一起制造。
优选地，本实施方案的有机化合物的制造方法具有：上述培养步骤；浓缩步骤，其进一步地提高培养后的微藻类的分量；干燥步骤，其通过使经过了浓缩步骤的微藻类的水分进一步减少来使微藻类干
燥。此外，在所述有机化合物的制造方法中，浓缩步骤和干燥步骤不是必需的。
就所述浓缩步骤而言，例如，可通过使用一般的浓缩装置来进行。
作为所述浓缩装置，具体地，可列举例如通过气浮浓缩、重力浓缩、膜浓缩、带式浓缩等，使微藻类的分量提高从而浓缩的装置。另外，作为所述浓缩装置，为进一步提高微藻类的分量，可使用脱水装置。
作为所述脱水装置，具体地，例如，可列举真空脱水机、加压脱水机(压滤机)、带式压力机、螺旋压力机、离心浓缩脱水机(螺旋沉降器)、或多重圆盘脱水机等。
就所述浓缩步骤而言，根据制造的多糖类、脂质、蛋白质等的利用用途，可仅通过浓缩装置进行，也可通过浓缩装置及脱水装置二者进行。
就所述干燥步骤而言，例如，可通过对经过了浓缩步骤的微藻类进行加热、或将经过了浓缩步骤的微藻类在减压下放置等来进行。
就经过了所述浓缩步骤的微藻类、经过了干燥步骤的微藻类而言，因为在细胞内可含有多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质之中的至少1种，所以例如可直接在食品等用途中利用。
另外，就经过了浓缩步骤的微藻类、经过了所述干燥步骤的微藻类而言，根据需要，通过实施一般的提取处理，可从微藻类提取出多糖类、脂质、维生素C、维生素E、色素、及蛋白质之中的至少1种作为有机化合物。提取出的有机化合物例如可在食品原料或燃料的用途中利用。
作为所述提取处理，例如，可采用通过乙醇或己烷等有机溶剂提取上述的有机化合物的提取处理、或通过亚临界状态的CO2溶剂提取上述的脂质等的提取处理等。
就上述的实施方案的裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法而言，虽然如上述例示所述，但本发明不限定于上述例示的裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法。
另外，在不损害本发明的效果的范围内，可以采用在一般的裸藻属微藻类、多糖类的制造方法、及有机化合物的制造方法中所使用的各种方案。
即，本发明不限定于上述实施方案，在本发明的意图的范围内可适当地进行设计改变。另外，本发明的作用效果也不受上述实施方案限定。
应该认为本次公开的实施方案在所有方面均是例示，而不是用于限制的内容。本发明的范围不是根据上述的说明，而是根据权利要求来表示。另外，对于本发明的范围，意在包括与权利要求的范围均等的意思及范围内的所有的改变。
实施例
下面列举实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明不限定于这些。
(裸藻属微藻类的采集及分离)
将从长崎县的湖沼采集的湖水接种到AF-6培养基(后述)中，在室温下照射荧光灯的光并培养2个月。
通过微量吸管将培养后的培养基中的对象微藻类进行分离。将分离后的微藻类在AF-6培养基中，照射荧光灯的光并在室温下培养。
(裸藻属微藻类的鉴定)
[碱基序列的确定]
为了确认分离后的微藻类是属于裸藻属的品种，进行下述的操作。
即，用裸藻属微藻类18S rRNA基因专用引物组(Zakrys等.2002，Journal ofPhycology 38：1190-1199)，通过DNA测序仪(Beckman Coulter公司制“CEQ8000”)确定培养后的裸藻属微藻类的18S rRNA基因的碱基序列。序列表的序列编号1中示出确定后的碱基序列。
[碱基序列的比较]
用BLAST同源性检索，将确定后的碱基序列与从GenBank得到的已知的裸藻属微藻类的18S rRNA基因的碱基序列进行比较。另外，比较与已知的裸藻属微藻类的序列相同性的一致程度。图1中示出分离后的裸藻属微藻类的18S rRNA基因的碱基序列与已知的裸藻属微藻类的18S rRNA基因的碱基序列的比较表。
另外，用分子系统树作成软件Mega5程序(Tamura等.2011，Mol.Biol.Evol.28：2731-2739)，根据最大似然法作成分子系统树。图2中示出其系统树。
其结果为，鉴定如上所述的分离后的微藻类是属于裸藻属的品种(Euglena gracilis Klebs)。此外，图2中的EOD-1株的Ka、Kb、Na、及Nb是标注在分离后的微藻类的试验样品上的标记。即使使用任意一种试验样品，也能得到同样的效果。
[RAPD解析]
进一步地，为了将分离后的裸藻属微藻类和已知的裸藻属微藻类进行比较，通过RAPD解析(Random Amplified Polymorphic DNA)(参考文献：Williams等.(1990)NucleicAids Res.18(22),6531-6535)，得到分离后的裸藻属微藻类的带型和国立环境研究所保存株6株的带型。
RAPD解析的PCR条件如下所述。
样品数：3
引物1：AAATCGGGCTG：RAPD-6序列编号2
酶：Ex Taq(TAKARA公司制)
反应缓冲液量：50μL
DNA模板量：约0.5ng
PCR的温度条件：如表1所示。详细地，在94℃处理1分钟后，进行35次(94℃1分钟、40℃45秒钟、72℃1分钟)的重复处理，然后在72℃处理7分钟。
电泳条件：2.5质量％琼脂糖凝胶、100V、40分钟
[表1]
[RAPD解析的比较对象株]
Euglena gracilis NIES-47
Euglena gracilis NIES-48
Euglena gracilis NIES-49
Euglena gracilis NIES-253
Euglena gracilis NIES-286
Euglena gracilis NIES-2149
进一步地，更换引物，同样地通过PCR进行RAPD解析。
引物2：ATCGGGTCCG：RAPD-4序列编号3
引物3：GCGATCCCCA：RAPD-3序列编号4
此外，上述引物2-4的碱基序列记载于Mostafa等.(2011)Molecules 16,2598-2608。
图3A中示出用上述引物1进行了RAPD解析的结果(带型)。另外，图3B、图3C分别示出用上述引物2及3进行了RAPD解析的结果。此外，图3A-图3C中的EOD-1株的Ka、Na分别与图2中的Ka、Na相对应。
由RAPD解析的结果可知，如上所述的分离后的裸藻属微藻类的带型与已知的裸藻属微藻类的带型不同。因此，判断如上所述的分离后的裸藻属微藻类是与已知的裸藻属微藻类不同的株。
于是，将如上所述的分离后的裸藻属微藻类命名为纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株。
(裸藻属微藻类的培养)
为了培养裸藻属微藻类，准备下述物质，在下述的培养条件下进行培养步骤。
“本发明的裸藻属微藻类株”：
裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株
(保藏号：FERM BP-11530)
(已在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心保藏)
“已知的裸藻属微藻类株”：
裸藻属微藻类(Euglena gracilis)NIES-48株
(从独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施获得)
“培养容器”：300-500mL烧瓶等，如后述
“向培养液的气体的供给”：130rpm的振荡
(通过振荡培养液将空气供给至培养液中)
“培养温度”：28℃
“培养时间”：如后述
“培养液的pH”：如后述
“用于培养的培养液中的成分”：
采用表2、表3中示出的组成作为基本组成。
此外，表2中示出的组成为相对于由独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施公开的“AF-6培养基”的组成，添加了“P IV metals”培养基的组成(由独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施公开)成分的组成。另外，培养液中所含有的营养素以外的为水。
另外，表3中示出的组成以Cramer-Myers培养基的组成为基础。
[表2]
以AF-6培养基为基础的组成
NaNO<sub>3</sub> 140mg/L
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 22mg/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 10mg/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 5mg/L
MgSO<sub>4</sub>7H<sub>2</sub>O 30mg/L
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 10mg/L
柠檬酸铁 2mg/L
柠檬酸 2mg/L
生物素 2μg/L
维生素B1盐酸盐 10μg/L
FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.98mg/L
Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 5mg/L
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.18mg/L
CoCl<sub>2</sub>6H<sub>2</sub>O 0.02mg/L
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.11mg/L
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.0125mg/L
MES 400mg/L
维生素B6 1μg/L
维生素B12 1μg/L
[表3]
“微藻类的培养前的初期重量”：0.78g/L(干燥重量)
“有机营养素”：根据培养适当改变下述物质
·葡萄糖
·酵母提取物(酵母自溶物)-产品名“Dried Yeast Extract D-3”日本制药公司制
·作为酿造酒的啤酒-市售啤酒(麦芽的使用率为66.7％以上)乙醇5容量％
在实施例1-4、比较例1-4中，在暗条件下进行异养培养，在除此以外的实施例及比较例中，进行光能异养培养。以下示出将微藻类进行光能异养培养时的培养条件的详细情况。
“光照射条件”：12小时光照射后、12小时暗处
“光的强度”：光合作用光量子通量密度(PPFD)-约100μmol/m2·s或约200μmol/m2·s
(实施例1)
在500mL的坂口烧瓶中加入200mL表2中示出的组合物。进一步地，添加葡萄糖及酵母提取物，以使葡萄糖成为15g/L的浓度，酵母提取物成为5g/L的浓度。进一步地，通过添加盐酸将pH调整至4.0，从而制备培养液。
然后，通过在上述的培养条件下、并且在暗条件下(即，异养培养条件下)振荡烧瓶，将裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株培养3天，进行培养步骤。
(实施例2-4)
除了改变葡萄糖量以使培养液中的葡萄糖浓度分别成为20g/L、25g/L、30g/L浓度这一点以外，与实施例1同样地进行培养步骤。
(比较例1)
除了代替裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株，将裸藻属微藻类(Euglena gracilis)NIES-48株培养5天这一点以外，与实施例1同样地进行培养步骤。
(比较例2-4)
除了改变葡萄糖量以使培养液中的葡萄糖浓度分别成为20g/L、25g/L、30g/L浓度的点以外，与比较例1同样地进行培养步骤。
分别测定进行各实施例及各比较例的培养步骤后的微藻类的干燥重量。另外，通过下述计算式求出添加的营养素的转化率。
转化率(％)＝
因培养而增加的藻的干燥重量(g/L)/消耗的葡萄糖浓度(g/L)
图4中示出各实施例及各比较例中的培养后的藻的干燥重量和转化率的结果。
由图4所掌握的，可以说裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株比已知的NIES-48株的生物质生产量高。
(实施例5)
除了使用300ml的三角烧瓶这一点；使用添加了啤酒从而相对于50mL表2中所示的组合物、来自啤酒的乙醇浓度成为2.5容量％的培养液这一点；在培养液中不添加酵母提取物这一点；重复12小时的光照射环境和12小时暗环境进行培养这一点；培养时间为7天这一点以外，通过与实施例1同样地，培养裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株，进行培养步骤。此外，光合作用光量子通量密度(PPFD)为约100μmol/m2·s。
(实施例6)
除了在培养液中添加酵母提取物以使上述的酵母提取物浓度成为2g/L这一点以外，与实施例5同样地进行培养步骤。
(比较例5)
除了代替裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株，培养裸藻属微藻类NIES-48株这一点以外，与实施例5同样地进行培养步骤。
(比较例6)
除了在培养液中添加酵母提取物以使上述的酵母提取物浓度成为2g/L这一点以外，与比较例5同样地进行培养步骤。
在进行实施例5、6、比较例5、6的培养步骤的同时，分别测定培养1、2、3、4、5、7天后的微藻类的干燥重量。图5中示出其结果。
由图5所掌握的，可知裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株即使是在光能异养培养的条件下培养，与已知的NIES-48株相比，也具有高的生产性。
(实施例7-12)
除了使用表3中示出的组合物代替表2中示出的组合物这一点；将培养液的初期pH分别改变为pH5.5、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH8.5、或pH9.0这一点；将培养时间改变为10天这一点以外，与实施例5同样地进行培养步骤。
在进行实施例7-12的培养步骤的同时，分别随时间测定培养后的微藻类的干燥重量。图6中示出其结果。
(实施例13-17)
除了使用表3中示出的组合物代替表2中示出的组合物这一点；光合作用光量子通量密度(PPFD)为约200μmol/m2·s这一点；将培养液的初期pH分别改变为pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、或pH5.5这一点；将培养时间改变为10天这一点以外，与实施例5同样地进行培养步骤。
(实施例18、19)
除了使用表3中示出的组合物代替表2中示出的组合物这一点；将培养液的初期pH分别改变为pH3.5、或pH5.5这一点；将培养时间改变为10天这一点以外，与实施例5同样地进行培养步骤。
在进行实施例13-19的培养步骤的同时，分别随时间测定培养后的微藻类的干燥重量。图7中示出其结果。
(实施例20)
除了培养时间为7天这一点以外，通过与实施例5同样地，培养裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株，进行培养步骤。
此外，从培养开始到2天后，通过振荡烧瓶，在好氧条件下进行培养，其后停止振荡，通过供给惰性气体(氮气)，在厌氧条件下进行培养。
(比较例7)
除了代替裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株，培养裸藻属微藻类(Euglena gracilis)NIES-48株这一点以外，与实施例20同样地进行培养步骤。
此外，从培养开始到4天后，通过振荡烧瓶，在好氧条件下进行培养，其后停止振动，通过供给惰性气体(氮气)，在厌氧条件下进行培养。
每天测定通过实施例20及比较例7的培养产生的裸藻淀粉及脂质(蜡酯)的量。
培养后的裸藻淀粉量的测定按下述次序进行。即，将培养后的微藻类和培养液的混合物(40mL)放入离心管中，进行离心分离。重复2次在离心分离后的沉淀物中添加纯水使其悬浊并进行第二次离心分离的操作。然后，在离心分离后的沉淀物中添加少量的纯水并使其悬浊，使悬浊物冷冻干燥。这样，除去培养液的成分。
接着，正确地量取400mg左右冷冻干燥后的微藻类的细胞至称量后的离心管(作为空白值)中。加入丙酮使其悬浊，除去离心分离后的上清液。重复5次左右利用丙酮的洗涤操作，直至上清液的颜色消失。这样，除去了微藻类产生的色素成分。
接着，使用十二烷基硫酸钠溶液，进行将裸藻淀粉以外的成分除去的操作。即，在除去色素成分后的残渣中加入20mL的1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，使其悬浊后，在100℃加热10分钟。然后，除去离心分离后的上清液。重复2次这种操作后，使用纯水代替SDS溶液，重复3次同样的操作，洗涤除去SDS。
最后，将每个离心管放入到105℃的干燥器内，除去水分，测定加入了裸藻淀粉的离心管的重量。然后，由与上述空白值的差求出裸藻淀粉量。
另一方面，培养后的蜡酯量的测定通过BLIGHT-DYER法进行。
图8A及图8B中示出在实施例20及比较例7的培养中随时间测定裸藻淀粉的量的结果。另外，图9A及图9B中示出随时间测定脂质(蜡酯)的量的结果。
由图8A及图8B所掌握的，与以往的裸藻属微藻类(Euglena gracilis)NIES-48株相比较，裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株的裸藻淀粉的产生速度比NIES-48株快。另外，EOD-1株的单位细胞的裸藻淀粉含量为约55％以上，比NIES-48株多。
另外，由图9A及图9B所掌握的，裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株的脂质(蜡酯)的产生速度更快，单位细胞的蜡酯含量在更短的期间内变高。
另外，用下述表4及表5中示出的组成的培养基，在下述的培养条件下进行培养步骤。
(实施例21)
通过对作为微藻类的上述EOD-1株进行光能异养培养，培养2天。
(比较例8)
通过对作为微藻类的上述NIES-48株进行光能异养培养，培养2天。
作为培养基，采用在将Hutner培养基改变后的培养基(以下也称“改性的Hutner培养基”)中添加了30g/L葡萄糖的培养基。具体的组成如表4所示，另外，液体中所含有的营养素以外的为水。作为表4中的含有微量金属的溶液，使用具有下述表5的组成的含有微量金属的溶液。微量金属成分以外的为水。
培养方法的详细情况如下所述。
“培养液”：用盐酸将pH调整至4.0
“培养容器”：500mL坂口烧瓶
“培养前的装料”：将200mL培养液和培养前微藻类收纳于坂口烧瓶中
(由于初期生物质量合到一起，因此以EOD-1株计为220mL、
以NIES-48株计为236mL)
“培养时的温度”：28℃
“培养时的明暗条件”：在遮光的暗条件下培养
“培养时的好氧条件”：将坂口烧瓶固定到震荡机中，通过以130rpm的往复振荡运转，将空气供给至培养液中
[表4]
改性的Hutner培养基：添加葡萄糖
glucose(葡萄糖) 30g/L
Asparagine(天冬酰胺) 2g/L
glutamic acid(谷氨酸) 5g/L
malic acid(苹果酸) 5g/L
glycine(甘氨酸) 2.5g/L
urea(尿素) 0.4g/L
succinic acid(琥珀酸) 0.1g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.4g/L
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.14g/L
MgCO<sub>3</sub> 0.4g/L
CaCO<sub>3</sub> 0.1g/L
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.021g/L
维生素B1(Vitamin B<sub>1</sub>) 0.6mg/L
维生素B12(Vitamin B<sub>12</sub>) 0.05mg/L
含有微量金属(Trace metals)的溶液 10mL/L
[表5]
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1.1g/L
MgSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.58g/L
(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.18g/L
CoSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.024g/L
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.077g/L
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.029g/L
NaNO<sub>3</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.074g/L
与上述同样地算出培养2天后的藻的干燥重量(生物质生产量)和葡萄糖的转化率。表6中示出结果。
[表6]
培养2天后 实施例21(EDO-1株) 比较例8(NIES-48株)
干燥重量(g/L) 24.50 11.50
葡萄糖转化率(％) 76 33
由表6所掌握的，与以往的裸藻属微藻类(Euglena gracilis)NIES-48株相比较，裸藻属微藻类(Euglena gracilis)EOD-1株的生物质生产能力更优异，另外，具有更优异的葡萄糖转化率。
产业上的可利用性
就本发明的微藻类、本发明的多糖类的制造方法、及本发明的有机化合物的制造方法而言，由于通过培养可得到裸藻淀粉等多糖类、蜡酯等脂质、蛋白质等有机化合物，因此可适当地使用。
就得到的有机化合物而言，通过直接在微藻类的细胞内蓄积或藉由提取处理等取出，能够在健康食品、医药品、饲料、化工产品、或燃料等用途中利用。具体地，作为通过培养在微藻类的细胞内蓄积的有机化合物的脂质，例如，可从细胞内取出并作为燃料的原料适当地使用。

Claims (6)

1.一种裸藻属微藻类，其是保藏号FERM BP-11530的纤细裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株，并至少具有多糖类的产生能力。
2.一种多糖类的制造方法，其通过培养权利要求1所述的裸藻属微藻类作为多糖类产生生物来制造多糖类。
3.根据权利要求2所述的多糖类的制造方法，其中，在所述培养中使用的培养液含有15-30g/L葡萄糖。
4.根据权利要求2或3所述的多糖类的制造方法，其中，在所述培养中使用的培养液含有酵母分解物。
5.根据权利要求2或3所述的多糖类的制造方法，其中，所述多糖类为裸藻淀粉。
6.一种有机化合物的制造方法，其通过培养权利要求1所述的裸藻属微藻类来制造选自裸藻淀粉和蜡酯的至少1种有机化合物。
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