ITRM20100160A1 - Silenziamento costitutivo chimicamente inducibile di geni facilitanti la produzione di biocarburanti e la raccolta di biomassa in microalghe - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione:
Chlamydomonas reinhardtii è un’alga verde unicellulare. Il recente sequenziamento dell’intero genoma di C. reinhardtii ha aperto la strada per studi di post-genomica (Merchant et al. 2007). Chlamydomonas ha un ciclo vitale veloce, è trasformabile e cresce in terreni semplici. Grazie ai vantaggi sopra elencati, Chlamydomonas è un sistema utile per la produzione di proteine eterologhe di interesse farmaceutico (Franklin and Mayfield 2004) e per la produzione di bioidrogeno (Melis et al. 2007).
Per l’espressione di geni esogeni in Chlamydomonas si usano promotori costitutivi come Rbcs2 (Stevens et al. 1996), Hsp70A-RbcS2 (Schroda et al. 2000) e PsaD (Fischer and Rochaix 2001) o promotori inducibili come Nitl (indotto dalla mancanza di ammonio nel terreno di crescita) (Ohresser et al. 1997), Cahl (indotto da basse pressioni di C02) (Kucho et al. 1999) e Cyc6 (indotto dall’assenza di Cu2+ o dall’aggiunta nel terreno di crescita di Ni2+ o Co2+) (Quinn et al. 2003). Per quanto invece concerne il silenziamento di specifici geni, un diverso numero di geni sono stati silenziati ad oggi utilizzando vettori contenenti promotori costitutivi e ripetizioni invertite (IR) in accordo con la tecnologia dell’interferenza di RNA (RNAi) (Rohr et al. 2004). Promotori costitutivi forti normalmente utilizzati per innescare il silenziamento mediato da IR sono il promotore PsaD e il promotore di fusione HSP70/RbcS2. Per quanto concerne invece i promotori inducibili, l’unico promotore ad essere stato utilizzato ad oggi per indurre il silenziamento di specifici geni è il promotore Nitl (Koblenz and Lechtreck 2005). Utilizzando tale promotore, Koblenz e colleghi hanno mostrato che è possibile indurre il silenziamento di un gene codificante una proteina del citoscheletro (centrina) crescendo Chlamydomonas in un terreno privo di NH4CI. La reversione del silenziamento è poi ottenuta trasferendo le cellule in un nuovo terreno contenente ammonio. Alcuni svantaggi intrinseci all’uso del promotore Nitl sono: la sua lenta cinetica di attivazione in quanto sono richiesti circa 6 giorni affinché la maggior parte delle cellule mostrino un fenotipo silenziato caratterizzato dalla mancanza di fibre di centrina nel citoscheletro. Inoltre l’attivazione del promotore Nitl è ottenuta attraverso ripetuti lavaggi e sostituzione del terreno di crescita con un terreno privo di ammonio. E’ evidente come questa procedura non sia applicabile a grandi volumi di coltura, in considerazione delle difficoltà tecniche di centrifugare colture algali anche di pochi metri cubi, nonché il consumo di energia insito nel processo di centrifugazione.
L’utilità dei promotori inducibili per indurre il silenziamento di specifici geni è evidente se si considera che questa procedura permetterebbe il controllo di alcuni processi cellulari solo dopo che la coltura ha raggiunto determinate densità cellulari, permettendo di-limitare eventuali effetti di tossicità e ottimizzando in questo modo la resa di molecole prodotte. Inoltre, per la produzione di bioidrogeno, specifici prodotti genici debbono essere espressi o silenziati in momenti precisi del ciclo di crescita. Attualmente la produzione di idrogeno in Chlamydomonas è eseguita trasferendo l’alga in terreni privi di solfato, tramite centrifugazione e risospensione in tali terreni. Il passaggio da un tipo di terreno all’ altro è eseguito attraverso ripetuti lavaggi e centrifugazioni. Come anche per l’attivazione del silenziamento del promotore Nifi, è evidente come questa procedura sia economicamente insostenibile su scala industriale.
In una precedente invenzione (Giuliano and Ferrante 2008) abbiamo .descritto l’uso di terreni modificati per ottenere l’espressione chimicamente regolata e reversibile del promotore Cyc6. Nella presente invenzione estendiamo l’uso di tali terreni e metodi, uniti alla tecnologia dei microRNA artificiali (amiRNA) (Molnar et al. 2009), per indurre il silenziamento selettivo e indotto dall’aggiunta di ioni Ni2+ di due geni endogeni di Chlamydomonas·. il gene SulP, codificante un trasportatore del solfato, il cui silenziamento innesca la produzione di idrogeno (Chen et al. 2005) e il gene RSP3, componente del complesso radiale del flagello (Williams et al. 1989), il cui silenziamento inibisce la motilità cellulare. L’applicazione industriale di tale silenziamento è evidente, permettendo da un lato di produrre idrogeno da grandi volumi di coltura e dall’altro di accelerare la sedimentazione della biomassa aigaie in seguito all’induzione del promotore Cyc6. L’attivazione del promotore innescata dall’aggiunta di Nichel determina il silenziamento di entrambi i geni già a 64 ore dall’aggiunta dell’induttore.
Inoltre, l’uso della tecnica degli amiRNA (Molnar et al. 2009) usata nella presente invenzione presenta i seguenti vantaggi rispetto a quella dell’RNAi (Yamasaki et al.
2008):
• Una maggiore percentuale di trasformanti silenziati (10-30% contro 0.1-0.5% dello RNAi)
• Una maggiore specificità nel silenziamento del gene di interesse riducendo al minimo la possibilità di silenziare geni untarget e permettendo di silenziare specifici geni appartenenti a una data famiglia multigenica
• Una maggiore stabilità del fenotipo silenziato
Al fine di indurre il silenziamento di geni specifici' in Chlamydomonas reìnhardtìì, il vettore pSL18Cyc6_polylinker (Giuliano and Ferrante, 2008) (Ferrante et al. 2008) utilizzato per l’espressione inducibile in Chlamydomonas è stato modificato inserendovi la sequenza di 246 paia di basi di un microRNA precursore (Molnar et al. 2009) fra i siti XbaI e BglII, e generando il vettore pCyc6RNA3 (Figura 1). Al fine di indurre il silenziamento dei geni SulP e RSP3, sono stati disegnati 2 differenti microRNA artificiali (amiRNA) tramite il software WMD (http.7/wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mimatools.pl?page=6). I due diversi amiRNA hanno come bersaglio due regioni diverse del trascritto maturo in modo di rendere più probabile il corretto appaiamento dell’ amiRNA sulla sequenza target sul mRNA, che potrebbe non essere accessibile in alcuni punti a causa della formazione di strutture secondarie. La sequenza dell’ amiRNA (Tabella 1) è contenuta in due oligonucleotidi complementari lunghi 90 paia di basi che, ama volta appaiati, vengono.clonati all’interno del sito unico Spel presente al centro della sequenza del microRNA precursore.
Le coppie di oligonucleotidi contenenti i due diversi amiRNA per il silenziamento dei geni SulP e RSP3 sono stati clonati nel vettore pChlamyRNA3 (Molnar et al. 2009) per il silenziamento costitutivo e nel vettore pCyc6RNA3 per il silenziamento inducibile dando origine ai vettori pChlamyRNA3SULPl, pChlamyRNA3SULP2, pCyc6RNA3SULPl, pCyc6RNA3 SULP2, pChlamyRNA3RSP3_l, pChlamyRNA3RSP3_2, pCyc6RNA3RSP3_l, pCyc6RNA3RSP3_2. Questi vettori sono stati utilizzati per trasformare il ceppo cwl5 (per il gene SulP ) e il ceppo CC124 (per il gene RSP3 ) di Chlamydomonas reinhardtii (Kindle 1990). I trasformanti generati con il vettore pChlamyRNA3 hanno permesso di valutare Fefficacia dei due diversi amiRNA.
Al fine di valutare l’efficacia dei due diversi microRNA aventi come bersaglio SulP, si è utilizzato un semplice saggio colorimetrico basato sull’espressione dell’arisulfatasi (ARS) che è un enzima a localizzazione periplasmica, indotto in condizioni di deprivazione di zolfo (de Hostos et al. 1988). La ARS viene indotta in colture cresciute in concentrazioni limitanti di solfato solo dopo il silencing di SulP (Chen et al. 2005). L’attività ARS viene misurata a seguito dell’aggiunta di un substrato cromogenico (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl sulfate potassium salt, indicato con l’abbreviazione XS04). E’ possibile rendere quantitativo questo saggio misurando la OD595delle colture prima e dopo l’aggiunta del substrato. Tramite questo saggio è stato possibile stabilire che il microRNAl è più efficace del microRNA2 nel silenziare il gene SulP (Figura 2, Pannelli A e B), in quanto le percentuali di trasformanti silenziati sono rispettivamente il 48% e 35% di quelli analizzati. Al fine di valutare il silenziamento del gene RSP3, è stato messo a punto un saggio di sedimentazione in cuvetta: 1 mi di coltura di 24 diverse linee trasformate con i due costrutti contenenti i due diversi amiRNA, è stato posto in cuvetta e ne è stata letta P-QD595subito e dopo un periodo al buio di 3 ore. I dati sono stati riportati come differenza fra le due OD (OD). Valori OD più alti indicano trasformanti potenzialmente silenziati che presentano velocità di sedimentazione accelerata (Figura 3, Pannello A). Tali trasformanti, indicati con numeri in grassetto nella Figura 3 Pannello B, hanno un ridotto livello di proteina RSP3 rispetto al ceppo wild type CC124. Tramite questo saggio è stato possibile stabilire che il microRNA2 è più efficace nel determinare il silenziamento di RSP3 rispetto al numero 1. Eseguiti questi saggi preliminari sui costrutti contenenti il promotore^costitutivo, si è proceduto all’ analisi quantitativa dei trasformanti inducibili silenziati nei geni SulP e RSP3 tramite esperimenti di Real-Time RT PCR (SulP) e_ Western blotting _ (RSP3). .
Silenziamento SulP : La figura 4 pannello A mostra il risultato di un saggio ARS eseguito su 5 trasformanti contenenti il costrutto pCyc6RNA3SULPl che hanno dimostrato aumentata attività ARS dopo induzione con 30 uM Nichel. Questi trasformanti sono stati scelti per un’analisi di Real-Time RT PCR al fine di quantificare il livello di silenziamento. I dati mostrano che i trasformanti indotti hanno un ridotto livello di mRNA SulP rispetto a quelli non indotti (Figura 4, Pannello B). Alcuni trasformanti mostrano una riduzione del messaggero SulP anche in condizioni non induttive (0 uM Nichel). 2 trasformanti (B1 e*B9) mostrano un elevata riduzione del messaggero SulP (rispettivamente 5,5 e 6,4 volte) dopo induzione con Nichel.
Per verificare il silenziamento del gene RSP3, sono state condotte analisi di Western blotting su trasformanti che presentavano una maggiore tendenza a sedimentare sul fondo della cuvetta. La Figura 5 Pannello A mostra un’analisi Western eseguita su 24 trasformanti contenenti il costrutto pCyc6RNA3RSP3_2, 64 ore dopo l’aggiunta del Nichel. I trasformanti indicati<“>da numeri in grassetto mostrano ridotti livelli di proteina RSP3 rispetto al ceppo wild type CCÌ24. Un’ analisi della cinetica di scomparsa della proteina RSP3 effettuata sul trasformante numero 20 (Fig. 5, Pannello B) mostra che il livello della proteina è inferiore quello del non indotto e del Wild type 64 ore dopo l’aggiunta del Nichel. Questo è in accordo con i dati di attivazióne del promotore Cyc6 (Giuliano and Ferrante, 2008) (Ferrante et al. 2008), secondo cui l’attività massima del promotore è raggiunta 40 ore dopo l’aggiunta dell’ induttore.
Questi dati complessivamente mostrano che il promotore Cyc6 è in grado di indurre il silenziamento specifico di geni tramite la tecnologia degli amiRNA, in quanto sia la misurazione dei livelli di mRNA SulP tramite Reai Time RT-PCR, sia la misurazione dei livelli di proteina RSP3 tramite Western blot evidenziano che, a seguito dell’induzione da Nichel dei trasformanti, si osserva una riduzione di mRNA SulP o di proteina RSP3.
L’impiego di un promotore inducibile dall’aggiunta di un induttore chimico al terreno di coltura per indurre il silenziamento di specifici geni in microalghe è un fatto del tutto nuovo e non descritto in precedenza. Sono inoltre nuovi il silenziamento inducibile del gene SulP, e del gene RSP3. Inoltre, i silenziamenti inducibili di questi specifici geni trovano ima potenziale applicazione industriale: il primo nella produzione biologica di idrogeno (Chen et al. 2005), il secondo nella induzione della sedimentazione della _ biomassa aigaie, un fatto che permetterebbe la raccolta più veloce ed efficiente di tale biomassa per scopi industriali. Infine, è nuovo il^saggio spettrofotometrico di — sedimentazione messo a punto, che permette un rapido “screening” di ceppi algali per l’isolamento di linee che presentino una velocità di sedimentazione ottimale per la crescita in fotobioreattore . .
Tabella 1
Plasmide Target ' Sequenza Posizione amiRNA
pCyc6RNA3 SULP 1 SulP TTAGTAAACAG 3’UTR (1647-pChlamyRNA3 SULP 1 TGAGTCCCCG 1667) pCyc6RNA3 SULP2 SulP TGAATTGCAAA 3’UTR (1955-pChlamyRNA3 SULP2 GGACCGGATC 1976) pCyc6RNA3RSP3_l RSP3 TAAATCCATAC CDS (1766- _ pChlamyRNA3RSP3_l GCTGCGCAXT 1786) . _<~>pCyc6RNA3RSP3_2 RSP3 TCGATAAAGAG 5’UTR(72-pChlamyRNA3RSP3_2 ATGCTCCTAG 92) Legende delle figure — Figura 1: Mappa schematica delle cassette di silenziamento in pChlamyRNA3 e in pCyc6RNA3. All 'interno del sito di restrizione Spel viene clonata la coppia di oligonucleotidi lunghi 90 basi contenenti il microRNA artificiale.
Figura 2: Attività ARS di 48 trasformanti ottenuti trasformando il ceppo wild type cwl5 con i plasmidi pChlamyRNA3SULPl (Pannello A) e pChlamyRNA3SULP2 (Pannello B). L’attività ARS è indicata come rapporto fra la densità ottica dopo l’aggiunta del substrato XS04 e quella prima dell’aggiunta del suddetto substrato. Valori prossimi a 1 indicano -scarsa o nulla attività ARS.
Figura 3: Saggio spettrofotometrico in cuvetta eseguito sui trasformanti . ottenuti,trasformando il ceppo wild type CC124 con il plasmide pChlamyRNA3RSP3_2 (Pannello A). Le frecce indicano i trasformanti con accelerata velocità di sedimentazione che mostrano un ridotto livello di proteina RSP3 rispetto al wild type secondo analisi di Western blotting (Pannello B). Tali trasformanti con ridotto livello di proteina RSP3 sono indicati da numeri in grassetto nel Pannello B. La freccia in basso nel pannello B indica la proteina RSP3. L’anticorpo utilizzato per la proteina RSP3 è Fox 1473 mentre la principale banda aspecifica è stata utilizzata come controllo interno di caricamento (dati non mostrati)
Figura 4: Saggio ARS eseguito su 5 trasformanti ottenuti trasformando il ceppo cwl 5 con il plasmide pSL18Cyc6SULPl, selezionati da un precedente screening tramite induzione con 30 uM Nichel (Pannello A). I trasformanti indotti presentano induzione di attività ARS rispetto ai non indotti. Pannello B: Analisi di Reai Time RT PCR eseguita sui 5 trasformanti con attività ARS inducibile mostrati nel pannello A. La quantità del - messaggero SulP è stata normalizzata con l’RNA ribosomale 28S. Inoltre i dati sono stati normalizzati con i valori di SulP/28S relativi al wild type indotto e non indotto.
Figura 5: Western blotting eseguito su 24 trasformanti ottenuti trasformando il ceppo CC124 con il plasmide pSL18Cyc6RSP3_2. I numeri in grassetto indicano trasformanti con un ridotto livello di proteina RSP3 rispetto al ceppo wild type CC124 (Pannello A). Pannello B: Analisi di cinetica di silenziamento nel trasformante 20 del Pannello A. E’ evidente come a 64 ore dall’aggiunta del Nichel i livelli della proteina RSP3 siano ridotti rispetto al trasformante non indotto e al wild type. In entrambi i casi Γ anticorpo utilizzato anti-RSP3 è Fox 1473 mentre la principale banda aspecifica è stata utilizzata come controllo interno di caricamento (Pannello B2, mentré i dati non sono stati mostrati nel Pannello A). La frecce indicano la proteina RSP3.
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Claims (2)
- Rivendicazioni 1) Sistema basato sull’uso di un promotore inducibile dall’aggiunta di una sostanza chimica nel mezzo di crescita, per generare il silenziamento inducibile di specifici geni tramite l’uso di microRNA artificiali in microalghe.
- 2) Sistema come nella rivendicazione 1, dove la microalga è Chlamydomonas reinhardtii 3) Sistema come nella rivendicazione 1, dove il promotore è il promotore del gene Cyc6 e l’induttore è il Nichel. - 4) Sistema come nella rivendicazione 1, dove i geni silenziati trovano un’applicazione industriale nella produzione di biocarburanti o nella raccoltardella biomassa aigaie 5) Sistema come nella rivendicazione 1, dove i geni silenziati sono implicati nel trasporto intracellulare del solfato o nella motilità flagellare. 6) Metodo spettrofotometrico per lo “screening” di ceppi algali, al fine di isolare ceppi che presentino ima velocità di sedimentazione<">ottimale per la crescita in fotobioreattore e la successiva raccolta della biomassa. _
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