WO2024029494A1 - 微細藻類によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生産方法 - Google Patents

微細藻類によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生産方法 Download PDF

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WO2024029494A1
WO2024029494A1 PCT/JP2023/027966 JP2023027966W WO2024029494A1 WO 2024029494 A1 WO2024029494 A1 WO 2024029494A1 JP 2023027966 W JP2023027966 W JP 2023027966W WO 2024029494 A1 WO2024029494 A1 WO 2024029494A1
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WO
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nad
microalgae
culture
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euglena
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快 石田
彰紘 小乾
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株式会社ニデック
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate

Definitions

  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NAD is an important biomolecule that is involved in energy metabolism as a coenzyme that catalyzes redox reactions, and is also involved in intracellular functions such as DNA damage response and gene expression control. In addition, it is used industrially as a reagent for clinical trials and as a coenzyme for substance production.
  • Patent Document 1 discloses a method for recovering oxidized ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide by contacting yeast cells with an acid.
  • Patent Documents 2 and 3 disclose a method for producing NAD using a mutant species of the genus Candida, which is a type of yeast.
  • heterotrophic organisms require organic substances (organic carbon sources) such as glucose and blackstrap molasses as carbon sources necessary for their own growth.
  • organic carbon sources organic substances
  • fossil fuels are used as raw materials and in processes such as high temperature and high pressure.
  • the techniques disclosed in Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Documents 1 and 2 all use heterotrophic organisms and add organic matter to the medium raw material.
  • Patent Document 3 a method for producing NAD using methanol as a carbon source is studied.
  • fossil fuels are still used as raw materials and in the synthesis process.
  • the technology disclosed herein aims to provide a method for producing NAD that suppresses environmental burden.
  • microalgae which are autotrophic organisms
  • microalgae belonging to a specific genus are cultured in a medium supplied with an NAD precursor. It was discovered that the amount of NAD in the microalgae increased, and the production method disclosed herein was created.
  • the technology disclosed herein is a method for producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms, which comprises producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms such as Chlorella sp., Cyanidioschizon sp.
  • the method includes culturing microalgae belonging to any of the genus Euglena in a medium supplied with an NAD precursor, and collecting the microalgae from the medium after the culture.
  • the microalgae prepared by the production method are autotrophic organisms. Then, by culturing specific microalgae in a medium supplied with an NAD precursor, the NAD precursor acts to induce accumulation of NAD in the microalgae.
  • the technology disclosed herein is a method for producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms, and is a method for producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms under autotrophic conditions in an environment with or without light.
  • the method includes culturing microalgae belonging to either the genus Dioscizon or the genus Euglena in a medium supplied with an NAD precursor, and collecting the microalgae from the medium after the culture.
  • the microalgae prepared by the above production method are autotrophic organisms. Then, by culturing specific microalgae in a medium supplied with an NAD precursor, the NAD precursor acts to induce accumulation of NAD in the microalgae.
  • the above production method is then carried out under autotrophic conditions. That is, the above production method basically does not require addition of an organic carbon source. Therefore, the production method described above makes it possible to produce NAD with reduced environmental impact.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein is characterized in that the microalgae belong to the genus Chlorella, and nicotinamide is supplied as the NAD precursor. Thereby, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Chlorella.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein is characterized in that the microalgae belong to the genus Cyanidioscizon and quinolinic acid is supplied as the NAD precursor. Thereby, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Cyanidioscizon.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein is characterized in that the microalgae belong to the genus Euglena, and at least one of nicotinamide, quinolinic acid, and nicotinic acid is supplied as the NAD precursor. Thereby, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Euglena.
  • the microalgae are cultured in a medium supplied with an NAD precursor for one hour or more.
  • the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor supplied to the medium can be suitably expressed.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein includes culturing the microalgae under autotrophic conditions in an environment exposed to light. Thereby, the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor can be more suitably expressed.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein includes culturing the above-mentioned microalgae under autotrophic conditions in an environment without exposure to light. Thereby, the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor can be more suitably expressed.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein includes culturing the microalgae described above under mixotrophic conditions. Thereby, the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor can be more suitably expressed.
  • a preferred embodiment of the production method disclosed herein includes culturing the microalgae described above under heterotrophic conditions. Thereby, the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor can be more suitably expressed.
  • FIG. 1 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the second embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 4 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on algal growth in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 5 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain.
  • FIG. 1 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the second embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing the influence of the
  • FIG. 6 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on algal growth in the NAD production method using Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain.
  • FIG. 7 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 8 is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on algal growth in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 9 shows Synechocystis sp.
  • FIG. 10 shows Synechocystis sp. This is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on algal growth in the NAD production method using PCC6803 strain.
  • FIG. 11 is a graph showing the time course of the amount of NAD accumulated after nicotinamide (100 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 12 is a graph showing the time course of algal growth after nicotinamide (100 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 10 shows Synechocystis sp. This is a graph showing the influence of the type and concentration of NAD precursors on algal growth in the NAD production method using PCC6803 strain.
  • FIG. 11 is a graph showing the time course of the amount of NAD accumulated after nicotinamide (100 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Chlorella vulgaris
  • FIG. 13 is a graph showing the time course of the amount of NAD accumulated after supplying quinolinic acid (1,000 ⁇ M) in the NAD production method using Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain.
  • FIG. 14 is a graph showing the change over time in the growth rate of algae after quinolinic acid (1,000 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain.
  • FIG. 15 is a graph showing the time course of the amount of NAD accumulated after nicotinic acid (100 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 16 is a graph showing the time course of algal growth after nicotinic acid (100 ⁇ M) is supplied in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between nicotinamide concentration and NAD accumulation amount in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the concentration of quinolinic acid and the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain.
  • FIG. 19 is a graph showing the relationship between the concentration of nicotinic acid and the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 20 is a graph showing the amount of NAD (nmol/gFW) for each light and dark condition during culture after nicotinamide supply in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 21 is a graph showing the measurement results of OD 750 values for each light and dark condition during culture after nicotinamide supply in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 22 is a graph showing the amount of NAD (nmol/gFW) for each light irradiation condition during culture under autotrophic conditions in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 20 is a graph showing the amount of NAD (nmol/gFW) for each light and dark condition during culture after nicotinamide supply in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 21 is a graph showing the measurement results of OD 750 values for each light and dark condition during culture after nicotinamide supply
  • FIG. 23 is a graph showing the measurement results of OD 750 values for each light irradiation condition during culture under autotrophic conditions in the NAD production method using Chlorella vulgaris NIES-2170 strain.
  • FIG. 24 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the third embodiment.
  • FIG. 25 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the fourth embodiment.
  • FIG. 26 is a graph showing the relationship between nicotinamide concentration and NAD accumulation amount in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • FIG. 27 is a graph showing the relationship between the concentration of quinolinic acid and the amount of NAD accumulated in the NAD production method using Euglena gracilis NIES-48 strain.
  • NAD refers to NAD + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide), NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide), NADP + (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), and NADPH ( Refers to the general term for reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate).
  • NAD can take two states in vivo: NAD + and NADH.
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NADP is a coenzyme that catalyzes many redox reactions in living organisms, including photosynthesis.
  • NADP can take two states, NADP + and NADPH, in vivo.
  • autotrophic conditions refers to an environment in which organisms grow without taking in organic carbon sources from the outside. Furthermore, a growth environment in the presence of inorganic salts such as minerals, vitamins, etc. is also included in “autotrophic conditions”.
  • organic carbon source refers to exogenous organic substances (eg, saccharides, etc.) that can serve as a carbon source necessary for the growth of living organisms.
  • light means light containing visible light having a wavelength used by microalgae for photosynthesis.
  • FIG. 1 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the first embodiment.
  • NAD is provided, for example, in preparation S101 of specific microalgae (hereinafter also referred to as “step S101") and supply S102 of an NAD precursor (hereinafter also referred to as “step S102").
  • step S101 preparation S101 of specific microalgae
  • step S102 supply S102 of an NAD precursor
  • step S103 culturing S103 under autotrophic conditions
  • step S104 microalgae S104
  • the production method disclosed herein may further include other steps at any stage.
  • step S101 specific microalgae used in the production method disclosed herein are prepared.
  • the specific microalgae are microalgae belonging to any of the genus Chlorella, the genus Cyanidioschyzon, and the genus Euglena.
  • the term "microalgae” as used herein includes species, varieties, and mutant species belonging to the genus Chlorella, the genus Cyanidioscizon, and the genus Euglena.
  • such microalgae also include mutant strains. Examples of mutant strains include genetic mutant strains and mutant strains obtained by recombination, transduction, transformation, and the like.
  • the method for obtaining such microalgae can be any known method and is not particularly limited. For example, it may be collected naturally, purchased commercially, or obtained through a preservation institution or depository institution. Furthermore, subcultured strains thereof may be used, or mutant strains may be created and used by known methods.
  • the microalgae of the genus Chlorella used in the technology disclosed herein are not particularly limited, but examples of the genus Chlorella include Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa, and Chlorella saccharo. phila) , Chlorella regularis, Chlorella sorokiniana, etc., and Chlorella vulgaris is preferably used.
  • the genus Cyanidioschyzon used in the technology disclosed herein is not particularly limited, but an example of the genus Cyanidioschyzon is Cyanidioschyzon merolae.
  • the genus Euglena used in the technology disclosed herein is not particularly limited, but examples of the genus Euglena include Euglena gracilis, Euglena acus, Euglena caudata, and Euglena cadae.
  • Euglena chadefaudii Euglena deses, Euglena granulata, Euglena intermedia, Euglena mutabilis lena mutabilis
  • Euglena proxima Euglena proxima Euglena viridis, Euglena vermiformis, Euglena piride, Euglena oxyuris, Euglena oxyuris spirogyra
  • Euglena gracilis is preferably used.
  • step S102 an NAD precursor is supplied to the microalgae-containing medium (hereinafter also referred to as "culture solution") prepared in step S101.
  • NAD precursor an NAD precursor in a known NAD biosynthesis circuit can be used.
  • nicotinic acid, nicotinamide, and quinolinic acid are preferably used.
  • accumulation of NAD can be suitably induced in microalgae.
  • the timing of supplying the NAD precursor to the medium may be before or after adding the microalgae to the medium, or may be added at the same time as the microalgae.
  • nicotinamide when using microalgae of the genus Chlorella, can be particularly preferably used as the NAD precursor. According to this configuration, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Chlorella.
  • the concentration of the NAD precursor in the culture solution is, for example, 1 ⁇ M or more, preferably 10 ⁇ M or more, and more preferably 100 ⁇ M or more, from the viewpoint of the effect of inducing NAD accumulation. Further, the concentration of the NAD precursor in the culture solution is preferably 1,000 ⁇ M or less, particularly preferably 100 ⁇ M or less, from the viewpoint of NAD production efficiency.
  • quinolinic acid when using microalgae belonging to the genus Cyanidioscizon, quinolinic acid can be particularly preferably used as the NAD precursor. According to this configuration, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Cyanidioscizon.
  • the concentration of the NAD precursor in the culture solution is, for example, 1 ⁇ M or more, preferably 10 ⁇ M or more, and more preferably 100 ⁇ M or more, from the viewpoint of the effect of inducing NAD accumulation.
  • the concentration of the NAD precursor in the culture solution is preferably 2,500 ⁇ M or less, particularly preferably 1,000 ⁇ M or less, from the viewpoint of NAD production efficiency.
  • nicotinic acid, nicotinamide, and quinolinic acid when using microalgae of the genus Euglena, nicotinic acid, nicotinamide, and quinolinic acid can be particularly preferably used as the NAD precursor. According to this configuration, accumulation of NAD can be more suitably induced in microalgae belonging to the genus Euglena.
  • the concentration of nicotinic acid or nicotinamide in the culture solution is, for example, 1 ⁇ M or more, preferably 10 ⁇ M or more, and more preferably 100 ⁇ M or more, from the viewpoint of the effect of inducing NAD accumulation.
  • the concentration of nicotinic acid or nicotinamide in the culture solution is supplied before and simultaneously with the addition of Euglena microalgae
  • the concentration of nicotinic acid or nicotinamide is preferably 100 ⁇ M or less from the viewpoint of proliferation of Euglena microalgae.
  • the concentration of nicotinic acid or nicotinamide in the culture solution is preferably 1,000 ⁇ M or less from the viewpoint of NAD production efficiency.
  • the concentration of quinolinic acid in the culture solution is, for example, 1 ⁇ M or more, preferably 10 ⁇ M or more, more preferably 100 ⁇ M or more, and 1,000 ⁇ M or more, from the viewpoint of the effect of inducing NAD accumulation. is even more preferable. Further, the concentration of quinolinic acid in the culture solution is preferably 10,000 ⁇ M or less from the viewpoint of NAD production efficiency. Note that the upper limit of the concentration of quinolinic acid in the culture solution may be about 33,000 ⁇ M (0.55 mg/L) or less from the viewpoint of solubility of quinolinic acid in water.
  • the culture medium used in the technology disclosed herein can be selected as appropriate depending on the type of microalgae and the culture environment, based on the known culture medium used for normal culture of microalgae under autotrophic conditions. can.
  • Examples of the medium include Bold's Basal medium (hereinafter referred to as "BBM medium”), Modified Allen's medium (hereinafter referred to as “MA medium”), Cramer and Myers medium (hereinafter referred to as "CM medium”). ), AY medium, etc.
  • BBM medium, MA medium, CM medium, etc. are suitably used.
  • inorganic salts such as minerals, vitamins, etc. may be mixed in the medium. .
  • microalgae are cultured under autotrophic conditions. Therefore, it is basically not necessary to add an organic carbon source to the culture medium. This makes it possible to produce NAD with reduced environmental burden.
  • the pH of the medium used here can be appropriately selected depending on the type of microalgae and the culture environment.
  • the pH is, for example, 3 to 10, preferably 3.5 to 9, and more preferably 3.5 to 8.
  • the genus Cyanidioscizon is acidophilic, so the pH may be, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1.5 to 2.5.
  • a buffer solution for pH adjustment may be added to the medium as appropriate.
  • known substances can be used, such as 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid (HEPES), sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, and the like.
  • step S103 the microalgae prepared in step S101 are cultured under autotrophic conditions.
  • the culture conditions do not necessarily have to be constant.
  • the culture conditions may be changed as appropriate during step S103 as long as the conditions are such that culture under autotrophic conditions is possible.
  • the culture time in step S103 is preferably 1 hour or more, and more preferably 3 hours or more, after the NAD precursor supply S102, from the viewpoint of the NAD accumulation-inducing effect of the NAD precursor. Further, from the viewpoint of sustainability of the induction effect, the time is preferably 48 hours or less, and more preferably 24 hours or less. Further, when step S103 is performed before supplying S102 of the NAD precursor, the culture time in step S103 is not particularly limited, but may be, for example, 4 days or more, and may be, for example, 7 days or less, preferably 6 days or less.
  • the temperature in step S103 can be selected as appropriate depending on the type of microalgae and the culture environment.
  • the temperature is, for example, 15 to 40°C, preferably 20 to 37°C, and more preferably 25 to 35°C.
  • the temperature is, for example, 25 to 55°C, preferably 30 to 50°C, and more preferably 30 to 47°C.
  • microalgae are cultured under autotrophic conditions in a lighted environment using a light source.
  • the microalgae used in the technology disclosed herein have photosynthetic ability. That is, under such an environment, microalgae can accumulate NAD while producing the energy necessary for their own growth by performing photosynthesis. In addition, such energy production allows the microalgae to exhibit better proliferation ability. Thereby, NAD can be accumulated more suitably.
  • lighted environment refers to an environment in which visible light with a wavelength that allows photosynthesis is emitted to microalgae.
  • the light source is not particularly limited as long as it includes the wavelength used by microalgae for photosynthesis, and for example, one that emits white light with a wavelength range of 380 nm to 800 nm is used.
  • the light source may be either natural light or artificial light, and for example, sunlight, fluorescent lamps, LED (Light Emitting Diode) lamps, incandescent lamps, halogen lamps, HID (High Intensity Discharge) lamps, etc. are preferably used.
  • Irradiation from the light source may be continuous irradiation or non-continuous irradiation that repeats a light period and a dark period. In the case of discontinuous irradiation, the cycle of light and dark periods is not particularly limited as long as it does not interfere with autotrophic conditions, and can be appropriately selected according to the type of microalgae and culture environment.
  • the light intensity of the light source can be expressed in terms of photon flux density ( ⁇ mol photons ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 ). Such a photon flux density can be measured using a photon meter or the like.
  • the light intensity of the light source is preferably approximately 5 to 2,000 ⁇ mol photons ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 , and approximately 30 to 1 ⁇ mol photons ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 from the viewpoint of the amount of light energy necessary for autotrophic culture of microalgae and strong light stress. ,000 ⁇ mol photons ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 is more preferable.
  • the culture device a known culture device such as an open pond type, a raceway type, or a tubular photobioreactor may be used, or a lab-scale culture device such as a tube culture or a flask culture may be used.
  • a culture method both static culture and shaking culture can be used, but shaking culture is preferable from the viewpoint of proliferation of microalgae. Further, the shaking culture may be performed by reciprocating shaking or rotating shaking.
  • step S104 microalgae are collected from the culture solution.
  • microalgae may be collected by centrifuging the culture solution using a centrifuge or the like and then removing the supernatant.
  • the microalgae may be collected by filtering the culture solution using a filter having a smaller pore size than the microalgae in the culture solution.
  • these are merely examples, and such collection methods are not limited to these.
  • new microalgae may be cultured using the culture solution after collecting the microalgae.
  • deficient components such as inorganic salts and vitamins, a buffer solution, and the like may be added as appropriate to the culture solution after collecting the microalgae.
  • the culture solution after collecting the microalgae may be additionally mixed with a separately prepared culture solution.
  • NAD can also be extracted from the obtained microalgae.
  • a known method can be used to extract NAD from microalgae. Examples include, but are not limited to, a crushing method, an ultrasonic method, an enzyme method, and the like.
  • NAD obtained by the above method can be extracted in any desired state as NAD + , NADH, NADP + or NADPH by a known method such as extraction with acid or alkali.
  • FIG. 2 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the second embodiment.
  • the process may be the same as in the first embodiment except that the specific microalgae is prepared S101, then cultured under autotrophic conditions S103, and in parallel, the NAD precursor is supplied S102. That is, in the NAD production method disclosed herein, the NAD precursor can be supplied S102 during the culture S103 under autotrophic conditions, and then the culture S103 under autotrophic conditions can be continued. Note that the timing of the supply S102 of the NAD precursor in the second embodiment is not particularly limited.
  • the culture S103 under autotrophic conditions before supplying the NAD precursor is preferably performed in an environment exposed to light.
  • the effect of the NAD precursor to induce accumulation of NAD can be suitably expressed.
  • FIG. 24 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the third embodiment.
  • the culture may be the same as the first embodiment except that culture S203 under mixotrophic conditions is performed instead of culture S103 under autotrophic conditions.
  • step S203 the microalgae prepared in step S101 are cultured under mixotrophic conditions.
  • the culture conditions do not necessarily have to be constant.
  • the culture conditions may be changed as appropriate during step S203 as long as the conditions allow culture under mixotrophic conditions.
  • mixedotrophic conditions refers to an environment in which organisms grow while taking in organic carbon sources and carbon dioxide as carbon sources from the outside. In other words, conditions are shown in which photosynthesis is also carried out while utilizing an external carbon source.
  • the medium used in step S203 can be selected as appropriate based on the type of microalgae and the culture environment, based on known media used for normal culture of microalgae under mixotrophic conditions. can. Examples include, but are not limited to, Koren and Hunter medium (KH medium), Hunter medium, Modified Bristol's medium (MBM medium), and the like.
  • An organic carbon source may be mixed into the medium if necessary. Examples of the organic carbon source include glucose, molasses, ethanol, and acetic acid. Furthermore, inorganic salts such as minerals, vitamins, etc. may be mixed into the medium.
  • Other conditions of the culture medium (pH of the culture medium, etc.) may be the same as those in step S103 (autotrophic conditions), so redundant explanation will be omitted.
  • carbon dioxide present in the atmosphere can be used as a carbon source, it is preferable to additionally supply a carbon dioxide source.
  • the carbon dioxide source is not particularly limited, as conventionally known sources can be used without any restrictions, but for example, supplying with a gas containing carbon dioxide (e.g., carbon dioxide gas, etc.), sodium hydrogen carbonate, acetic acid, etc. can be used. can. Further, if necessary, the medium may be stirred in order to suitably supply carbon dioxide into the medium.
  • Step S203 may be the same as step S103 (autotrophic conditions) except for the above points. Therefore, redundant explanation will be omitted here.
  • FIG. 25 is a flow diagram schematically showing the NAD production method according to the fourth embodiment. Here, it may be the same as the first embodiment except that culture S303 under heterotrophic conditions is performed instead of culture S103 under autotrophic conditions.
  • step S303 the microalgae prepared in step S101 are cultured under heterotrophic conditions.
  • the culture conditions do not necessarily have to be constant.
  • the culture conditions may be changed as appropriate during step S303, as long as the conditions are such that culture under heterotrophic conditions is possible.
  • heterotrophic conditions refers to an environment in which living organisms grow without photosynthesizing while taking in organic carbon sources as carbon sources.
  • the medium used in culture S303 under heterotrophic conditions should be selected as appropriate based on the known culture medium used for normal culture of microalgae under mixotrophic conditions, depending on the type of microalgae and the culture environment. I can do it.
  • the medium used in culture S303 under heterotrophic conditions may be the same as the medium used in culture S203 under mixotrophic conditions.
  • step S303 other than the above-mentioned points may be the same as in step S103 (autotrophic conditions). Therefore, redundant explanation will be omitted here.
  • the culture conditions for microalgae may be appropriately switched between two or more types of autotrophic conditions, mixotrophic conditions, or heterotrophic conditions.
  • NAD obtained by the technology disclosed herein can be used in a wide range of industrial fields. For example, they may be used as reagents for clinical trials in the fields of biochemistry and physiology, coenzymes for substance production, nutritional supplements, and the like.
  • Example 1 Production of NAD by supplying NAD precursor using microalgae of the genus Chlorella] (Method) ⁇ Preparation of Chlorella microalgae and culture medium> Chlorella vulgaris NIES-2170 strain (hereinafter referred to as "chlorella”) was prepared as a microalgae belonging to the genus Chlorella.
  • Chlorella Chlorella vulgaris NIES-2170 strain
  • a medium was used that was set to a final concentration of 10 mM and a pH of 7.2 using HEPES in order to prevent pH changes in the medium before and after culture.
  • the culture conditions were as follows: continuous irradiation for 24 hours using a three-wavelength daylight white fluorescent lamp at a light intensity of 40 to 50 ⁇ mol photons ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 , and shaking culture at 30° C. and 100 rpm for 4 days. After culturing, the OD 750 value of the culture solution was measured in order to evaluate the influence of NAD precursors on the proliferation of Chlorella. Thereafter, the culture solution was collected into a tube whose tare weight had been weighed in advance, and the chlorella cells were precipitated by centrifugation (15,000 rpm, 4° C., 10 minutes). After centrifugation, the supernatant in the tube was removed to collect Chlorella cells.
  • the weight of the tube containing the collected chlorella cells was weighed, and the weight of the tube was deducted from the tare weight, which was determined as the weight of the chlorella cells.
  • the collected Chlorella cells were frozen at -80°C and subjected to NAD quantification. Note that the measurement results of the OD 750 values of the culture medium were compared based on relative values (control is set as 1) with respect to the NAD precursor untreated group (control).
  • the amount of NAD according to this example was calculated by quantifying the amount of NAD (H) and the amount of NADP (H) by cycling assay, and calculating the total sum.
  • Quantification of NAD(H) 15 ⁇ l of 100% ethanol, 100 ⁇ l of 0.1M HEPES-KOH (pH 7.5), 2.5 ⁇ l of 1.2 mM 2,6-Dichlorophenolindophenol (DCPIP), 20 mM 1-Methoxy- 10 ⁇ l of 5-methylphenazinium methylsulfate (1-methoxy PMS), 17.5 ⁇ l of autoclaved distilled water, and 35 ⁇ l of a quantitative sample were mixed.
  • FIG. 3 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in chlorella. From these results, an increase in the amount of NAD in chlorella was observed in the nicotinamide-treated group. From this, it was found that nicotinamide favorably induces NAD accumulation in chlorella.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the proliferation of Chlorella. From these results, no suppression of Chlorella proliferation was observed in all treated plots. Therefore, it was found that none of the NAD precursors had any effect on the growth of Chlorella.
  • Example 2 Production of NAD by supplying NAD precursor using microalgae of the genus Cyanidioscizon] (Method)
  • a microalga of the genus Cyanidischyzon Cyanidischyzon merolae NIES-3377 strain (hereinafter referred to as "Shison") was prepared.
  • MA medium pH 2.5 to which nicotinic acid, nicotinamide, or quinolinic acid was added at a concentration of 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, or 1,000 ⁇ M was prepared as a medium.
  • Evaluation was performed using the same culture conditions, NAD extraction conditions, and NAD quantification conditions as in Example 1, except that the above-mentioned medium was used.
  • the OD750 value of the culture solution was measured, and the OD750 value was expressed as a relative value (control is set as 1) with respect to the NAD precursor-untreated group (control). compared.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in Schizon. From these results, an increase in the amount of NAD in Schison was observed in the quinolinic acid treated group. From this, it was found that quinolinic acid suitably induces NAD accumulation in Schizon.
  • FIG. 6 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the proliferation of Schizon. From these results, no suppression of Schizon proliferation was observed in all treated plots. Therefore, it was found that none of the NAD precursors had any effect on the growth of Schizon.
  • Example 3 Production of NAD by supplying NAD precursor using microalgae of the genus Euglena] (Method) Euglena gracilis NIES-48 strain (hereinafter referred to as "Euglena”) was prepared as a microalga of the genus Euglena.
  • a CM medium (pH 3.5) to which nicotinic acid, nicotinamide, or quinolinic acid was added at a concentration of 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, or 1,000 ⁇ M was prepared as a medium.
  • a CM medium was prepared in which quinolinic acid was added at a concentration of 10,000 ⁇ M.
  • Evaluation was performed using the same culture conditions, NAD extraction conditions, and NAD quantification conditions as in Example 1, except that the above NAD precursor and medium were used.
  • the OD680 value of the culture solution was measured, and the OD680 value was expressed as a relative value (control is set as 1) with respect to the NAD precursor-untreated group (control). compared.
  • FIG. 7 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in Euglena.
  • the results of the amount of NAD accumulated in Euglena at 1,000 ⁇ M in the nicotinic acid-treated group and at 1,000 ⁇ M in the nicotinamide-treated group, cells could not be recovered due to growth inhibition and the amount of NAD could not be measured. I didn't show it. From these results, an increase in the amount of NAD was observed. Furthermore, when comparing the treatment sections in which the amount of NAD precursor added was 100 ⁇ M, the greatest increase in the amount of NAD was observed in the nicotinic acid treatment section. FIG.
  • Example 4 Study of NAD production by supplying NAD precursor using Synechostis microalgae
  • Synechocystis sp. PCC6803 strain (hereinafter referred to as "Synechocystis") was prepared.
  • a BG-11 medium pH 8.0 to which nicotinic acid, nicotinamide, or quinolinic acid was added at a concentration of 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, or 1,000 ⁇ M was prepared as a medium.
  • a medium with a HEPES concentration of 30 mM was used in order to prevent pH changes in the medium before and after culture.
  • Evaluation was performed using the same culture conditions, NAD extraction conditions, and NAD quantification conditions as in Example 1, except that the above NAD precursor and medium were used.
  • the OD730 value of the culture solution was measured, and the OD730 value was calculated as a relative value (control is set to 1) with respect to the group not treated with NAD precursors (control). compared.
  • FIG. 9 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in Synechocystis. These results showed that NAD accumulation was not as high as in the microalgae shown in Examples 1 to 3 in any of the NAD precursor treated plots.
  • FIG. 10 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the proliferation of Synechocystis. From these results, growth inhibition of Synechocystis was observed at 1,000 ⁇ M in the nicotinic acid treated group, and at 10 ⁇ M and 100 ⁇ M in the quinolinic acid treated group. Therefore, in Synechostis, no NAD accumulation-inducing effect by NAD precursors was observed.
  • FIG. 11 shows the results of changes over time in the amount of NAD in chlorella due to the supply of nicotinamide. Note that "Nam” in FIGS. 11 and 12 refers to nicotinamide. From these results, it was confirmed that the amount of NAD in chlorella accumulated from 1 hour after the supply, and that the accumulation of NAD reached its peak 24 hours after the supply.
  • FIG. 12 shows the results of the change in Chlorella proliferation over time due to the supply of nicotinamide. From these results, no suppression of Chlorella proliferation was observed in all treated plots.
  • FIG. 13 shows the results of changes over time in the amount of NAD in Schison due to the supply of quinolinic acid.
  • Qa in FIGS. 13 and 14 refers to quinolinic acid. From these results, it was observed that the amount of NAD in Schison was accumulated from 1 hour after the supply, and 24 hours after the supply, the accumulation of NAD was the same as when cultured for 7 days with quinolinic acid added in advance.
  • FIG. 14 shows the results of the time course of Schizon proliferation due to the supply of quinolinic acid. From these results, no suppression of Schizon proliferation was observed in all treated plots.
  • Example 1 Sample the culture solution after 0 (control), 1, 3, 6, 12, 24, and 48 hours of nicotinic acid supply, and calculate the amount of NAD using the same NAD extraction conditions and NAD quantification conditions as in Example 1. Evaluation was performed using a relative value (control is set as 1) to the amount of NAD after 0 hours of nicotinic acid supply (control). In addition, in order to evaluate the influence of NAD precursors on the proliferation of Euglena depending on the culture time, we measured the OD680 value of the culture medium for each sample, and compared the relative value to the group not treated with NAD precursors (control). 1).
  • FIG. 15 shows the results of changes over time in the amount of NAD in Euglena due to the supply of nicotinic acid.
  • “Na” in FIGS. 15 and 16 refers to nicotinic acid. From these results, it was confirmed that the amount of NAD in Euglena was accumulated from 1 hour after the supply, and that the accumulation of NAD reached its peak 24 hours after the supply.
  • FIG. 16 shows the results of changes over time in the proliferation of Euglena due to the supply of nicotinic acid. From these results, no suppression of Euglena proliferation was observed in all treated plots.
  • Example 8 Examination of NAD precursor concentration in Chlorella microalgae
  • Chlorella was prepared as a microalgae.
  • Chlorella was cultured for 7 days under continuous light irradiation for 24 hours.
  • nicotinamide was supplied to the culture solution containing Chlorella at a concentration of 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, 1,000 ⁇ M, or 10,000 ⁇ M, and the culture conditions were not changed (with continuous light irradiation for 24 hours). Culture was continued.
  • NAD precursor untreated group (0 ⁇ M, control)
  • culture was performed in parallel under the same conditions as above except that no NAD precursor was added.
  • the culture solution 24 hours after the nicotinamide supply was sampled, and NAD was extracted and quantified under the same NAD extraction conditions and NAD quantification conditions as in Example 1. Then, the calculated NAD amount was compared with the relative value (control is set as 1) with respect to the NAD precursor untreated group (control).
  • FIG. 17 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in chlorella. Compared to the control, NAD accumulation was observed in all nicotinamide-treated groups. When comparing the nicotinamide treatment concentrations, a peak in NAD accumulation was observed in the nicotinamide treatment groups of 10 ⁇ M and 100 ⁇ M.
  • FIG. 18 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the amount of NAD accumulated in Schizon. Accumulation of NAD was observed in all quinolinic acid treated groups compared to the control. When comparing the treatment concentrations of quinolinic acid, a peak in NAD accumulation was observed in the groups treated with 1,000 ⁇ M and 2,500 ⁇ M of quinolinic acid.
  • CM medium pH 3.5
  • nicotinic acid was supplied to the culture medium containing Euglena at a concentration of 100 ⁇ M, 250 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1,000 ⁇ M, 2,500 ⁇ M, 5,000 ⁇ M, or 10,000 ⁇ M, without changing the culture conditions (light 24 ⁇ M).
  • Euglena culture was continued (with continuous irradiation for hours).
  • NAD precursor untreated group (0 ⁇ M, control)
  • culture was performed in parallel under the same conditions as above except that no NAD precursor was added.
  • each culture solution was sampled, and NAD was extracted and quantified under the same NAD extraction conditions and NAD quantification conditions as in Example 1. Then, the calculated NAD amount was compared with the relative value (control is set as 1) with respect to the NAD precursor untreated group (control).
  • FIG. 19 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the NAD accumulation amount of nicotinic acid. Compared to the control, NAD accumulation was observed in the treated areas other than the 10,000 ⁇ M nicotinic acid treated area. When comparing the treatment concentrations of nicotinic acid, a peak in NAD accumulation was observed in the group treated with 1,000 ⁇ M nicotinic acid.
  • FIG. 20 shows the amount of NAD per g weight of Chlorella (nmol/gFW) for each light and dark condition during culture. From these results, when chlorella was cultured under the condition of continuous light irradiation for 24 hours after supplying nicotinamide, the amount of NAD was found to be higher than that without illumination.
  • FIG. 21 shows the measurement results of OD 750 values for each light and dark condition during culture. From these results, no difference in OD 750 value was observed depending on the presence or absence of illumination.
  • Example 12 Study of light irradiation conditions during culture under autotrophic conditions
  • FIG. 22 shows the amount of NAD per g weight of Chlorella (nmol/gFW) for each light irradiation condition during culture.
  • FIG. 23 shows the measurement results of OD 750 values for each light irradiation condition during culture.
  • the amount of NAD per gram of weight of chlorella was approximately the same. Therefore, it was found that even if the light irradiation is discontinuous, the same effect of inducing NAD accumulation by the NAD precursor as in the case of continuous irradiation can be obtained.
  • CM medium pH 3.5
  • nicotinamide was supplied to the culture solution containing Euglena at a concentration of 100 ⁇ M, 250 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1,000 ⁇ M, 2,500 ⁇ M, or 5,000 ⁇ M, without changing the culture conditions (24 hours of continuous light irradiation).
  • Culture of Euglena continued.
  • an NAD precursor untreated group (0 ⁇ M, control)
  • culture was performed in parallel under the same conditions as above except that no NAD precursor (nicotinamide) was added.
  • the culture solution 24 hours after the nicotinamide supply was sampled, and NAD was extracted and quantified under the same NAD extraction conditions and NAD quantification conditions as in Example 1. Then, the calculated NAD amount was compared with the relative value (control is set as 1) with respect to the NAD precursor untreated group (control).
  • FIG. 26 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the NAD accumulation amount of nicotinamide. Accumulation of NAD was observed in all treated plots compared to the control. When comparing the treatment concentrations of nicotinamide, a peak in NAD accumulation was observed in the group treated with 1,000 ⁇ M nicotinamide.
  • FIG. 27 shows the results of evaluating the influence of NAD precursors on the NAD accumulation amount of quinolinic acid. It was confirmed that the amount of NAD accumulated was significantly increased in the group treated with 10,000 ⁇ M of quinolinic acid.
  • Section A A method for producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms, in which the genus Chlorella, Cyanidioschizon, or Euglena is produced in an environment with or without light.
  • a method for producing NAD which comprises culturing microalgae belonging to the above in a medium supplied with an NAD precursor, and collecting the microalgae from the medium after the culture.
  • Item 1 A method for producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms, the method comprising producing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) using microorganisms under autotrophic conditions in an environment with or without light from Chlorella spp., Cyanidioscizon spp.
  • a method for producing NAD comprising culturing microalgae belonging to any of the genus Euglena in a medium supplied with an NAD precursor, and collecting the microalgae from the medium after the culture.
  • Item 2 The method according to item A or item 1, wherein the microalgae belong to the genus Chlorella, and nicotinamide is supplied as the NAD precursor.
  • Item 3 The method according to item A or item 1, wherein the microalgae belong to the genus Cyanidioscizon and quinolinic acid is supplied as the NAD precursor.
  • Item 4 The method according to Item A or Item 1, wherein the microalgae belong to the genus Euglena, and the NAD precursor is supplied with at least one of nicotinamide, quinolinic acid, and nicotinic acid.
  • Item 5 The method according to Item A or any one of Items 1 to 4, wherein the microalgae are cultured in a medium supplied with the NAD precursor for 1 hour or more.
  • Item 6 The method according to Item A or any one of Items 1 to 5, which comprises culturing the microalgae under autotrophic conditions in an environment exposed to light.
  • Item 7 The method according to item A or any one of claims 1 to 5, which comprises culturing the microalgae under autotrophic conditions in an environment without exposure to light.
  • Item 8 The method according to item A or any one of claims 1 to 5, which comprises culturing the microalgae under mixotrophic conditions.
  • Item 9 The method according to item A or any one of claims 1 to 5, which comprises culturing the microalgae under heterotrophic conditions.
  • microalgae are collected in the middle of culture S103 under autotrophic conditions, and the collected microalgae are suspended in a medium again (in other words, the medium is replaced), and then the NAD precursor is supplied S102. You may go.
  • the culture conditions for example, changing the culture device, etc.
  • supply S102 of the NAD precursor may be performed multiple times. For example, during the cultivation S103 under autotrophic conditions, supplying S102 of the NAD precursor may be performed, and then, while continuing the cultivation S103 under autotrophic conditions, supplying S102 of the NAD precursor may be performed again. .

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Abstract

本開示は、微生物を用いた、環境負荷を抑制したＮＡＤの生産方法を提供することを目的とする。ここに開示される技術は、微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、光を当てた、または、当てない環境において、クロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、上記培養後の培地から前記微細藻類を回収することと、を含む。かかる構成によれば、特定の微細藻類に対しＮＡＤ前駆物質がＮＡＤの蓄積を誘起せしめる働きをする。また、独立栄養条件下で上記微細藻類の培養を行うことで、環境負荷を抑えられる。したがって、上記生産方法によって、環境負荷を抑えたＮＡＤの生産を実現することができる。

Description

微細藻類によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生産方法
　ここに開示される技術は、微細藻類によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤ」ともいう。）の生産方法に関する。なお、本出願は２０２２年８月３日に出願された日本国特許出願第２０２２－１２４２０８号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　ＮＡＤは、酸化還元反応を触媒する補酵素としてエネルギー代謝に関わる他、ＤＮＡ損傷応答や遺伝子発現制御等の細胞内機能に関わる重要な生体分子である。また、産業上は、臨床試験用の試薬や物質生産のための補酵素として用いられている。
　一般的に、微生物を用いたＮＡＤの工業的な生産方法は、例えば、非特許文献１～３に示されるように、細菌や酵母を培養し、培養菌体から目的物を抽出することで生産される。一方で、特許文献１には、酵母菌体に酸を接触することで酸化型β―ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを回収する方法が開示されている。さらに、特許文献２および３には、酵母菌の一種であるキャンディダ属の変異種を用いたＮＡＤの製造方法が開示されている。
日本国特許出願公開平８－８９２７５号公報 日本国特許出願公開平１０－１９１９６３号公報 日本国特許出願公開平６－４６９５４号公報
Production of Nicotinamide Adenine Dinucleotide by Saccharomyces carlsbergensis. , Sakai, et al., 1973, Agr.Biol.Chem., 37(5), 1041-1048 Accumulation of Nicotinamide Adenine Dinucleotide in Baker's Yeast by Secondary Culture., Sakai, et al., 1973, Agr.Biol.Chem., 37(5), 1049-1056 LEVELS OF NICOTINAMIDE NUCLEOTIDE COENZYMES IN LACTIC ACID BACTERIA. , Takebe and Kitahara, 1963, J. Gen. Appl. Microbiol.  9(4), 31-40
　ところで、従属栄養生物は、自身の生育に必要な炭素源として、グルコースや、廃糖蜜等の有機物（有機炭素源）が不可欠となる。かかる有機物の製造では、その原料や高温高圧等のプロセスにおいて、化石燃料を使用する。化石燃料は、近年、その枯渇が懸念されており、また、使用時の温室効果ガスの排出により、環境の負荷がかかるといった問題点を有している。非特許文献１～３、特許文献１および２に開示される技術は、いずれも従属栄養生物を用いており、培地原料に有機物を添加している。また、特許文献３においては、炭素源としてメタノールを用いたＮＡＤの製造方法が検討されている。しかしながら、メタノールを製造する場合もやはり、原料や合成工程において化石燃料を用いる。
　ここに開示される技術は、上記事情を鑑み、環境負荷を抑制したＮＡＤの生産方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、独立栄養生物である微細藻類の中でも特定の属に属する微細藻類に対し、ＮＡＤ前駆物質を供給された培地で培養を行うことで、該微細藻類のＮＡＤ量が増加することを見出し、ここに開示される生産方法を創出した。
　ここに開示される技術は、微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、光を当てた、または、当てない環境において、クロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、上記培養後の培地から前記微細藻類を回収することと、を含む。
　かかる構成によれば、上記生産方法で用意する上記微細藻類は、独立栄養生物である。そして、特定の微細藻類をＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することにより、該ＮＡＤ前駆物質が該微細藻類におけるＮＡＤの蓄積を誘起せしめる働きをする。
　ここに開示される技術は、微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、光を当てた、または、当てない環境において、独立栄養条件下でクロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、上記培養後の培地から前記微細藻類を回収することと、を含む。
　かかる構成によれば、環境負荷を抑制した微生物を用いたＮＡＤの生産方法が提供される。詳述すると、まず、上記生産方法で用意する上記微細藻類は、独立栄養生物である。そして、特定の微細藻類をＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することにより、該ＮＡＤ前駆物質が該微細藻類におけるＮＡＤの蓄積を誘起せしめる働きをする。そして、上記生産方法は、独立栄養条件下で行われる。即ち、上記生産方法では有機炭素源の添加を基本的に必要としない。したがって、上記生産方法により、環境負荷を抑えたＮＡＤの生産を実現することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類がクロレラ属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミドを供給することを特徴とする。これにより、より好適にクロレラ属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類がシアニディオシゾン属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてキノリン酸を供給することを特徴とする。これにより、より好適にシアニディオシゾン属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類がユーグレナ属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミド、キノリン酸、ニコチン酸のうち少なくとも１つを供給することを特徴とする。これにより、より好適にユーグレナ属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類をＮＡＤ前駆物質が供給された培地で１時間以上培養する。これにより、培地に供給されたＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果を好適に発現することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、光を当てた環境において、上記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む。これにより、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果をより好適に発現することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、光を当てない環境において、上記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む。これにより、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果をより好適に発現することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類を混合栄養条件下で培養することを含む。これにより、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果をより好適に発現することができる。
　ここに開示される生産方法の好ましい一態様では、上記微細藻類を従属栄養条件下で培養することを含む。これにより、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果をより好適に発現することができる。
図１は、第１の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。 図２は、第２の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。 図３は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度がＮＡＤ蓄積量に及ぼす影響を示すグラフである。 図４は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度が藻類の増殖性に及ぼす影響を示すグラフである。 図５は、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度がＮＡＤ蓄積量に及ぼす影響を示すグラフである。 図６は、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度が藻類の増殖性に及ぼす影響を示すグラフである。 図７は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度がＮＡＤ蓄積量に及ぼす影響を示すグラフである。 図８は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度が藻類の増殖性に及ぼす影響を示すグラフである。 図９は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度がＮＡＤ蓄積量に及ぼす影響を示すグラフである。 図１０は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３株を用いたＮＡＤ生産方法において、ＮＡＤ前駆物質の種類と濃度が藻類の増殖性に及ぼす影響を示すグラフである。 図１１は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミド（１００μＭ）供給後のＮＡＤ蓄積量に関する経時推移を示すグラフである。 図１２は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミド（１００μＭ）供給後の藻類の増殖性に関する経時推移を示すグラフである。 図１３は、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株を用いたＮＡＤ生産方法において、キノリン酸（１，０００μＭ）供給後のＮＡＤ蓄積量に関する経時推移を示すグラフである。 図１４は、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株を用いたＮＡＤ生産方法において、キノリン酸（１，０００μＭ）供給後の藻類の増殖性に関する経時推移を示すグラフである。 図１５は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチン酸（１００μＭ）供給後のＮＡＤ蓄積量に関する経時推移を示すグラフである。 図１６は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチン酸（１００μＭ）供給後の藻類の増殖性に関する経時推移を示すグラフである。 図１７は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミドの濃度とＮＡＤ蓄積量の関係を示すグラフである。 図１８は、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株を用いたＮＡＤ生産方法において、キノリン酸の濃度とＮＡＤ蓄積量の関係を示すグラフである。 図１９は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチン酸の濃度とＮＡＤ蓄積量の関係を示すグラフである。 図２０は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミド供給後の培養時における明暗条件毎のＮＡＤ量（ｎｍｏｌ／ｇＦＷ）を示すグラフである。 図２１は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミド供給後の培養時における明暗条件毎のＯＤ７５０値の測定結果を示すグラフである。 図２２は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、独立栄養条件下における培養時の、光照射条件毎のＮＡＤ量（ｎｍｏｌ／ｇＦＷ）を示すグラフである。 図２３は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株を用いたＮＡＤ生産方法において、独立栄養条件下における培養時の、光照射条件毎のＯＤ７５０値の測定結果を示すグラフである。 図２４は、第３の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。 図２５は、第４の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。 図２６は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、ニコチンアミドの濃度とＮＡＤ蓄積量の関係を示すグラフである。 図２７は、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株を用いたＮＡＤ生産方法において、キノリン酸の濃度とＮＡＤ蓄積量の関係を示すグラフである。
　以下、ここに開示される技術に係る実施の形態を説明する。なお、本明細書において言及していない事柄であって、ここに開示される技術の実施に必要な事柄は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。ここに開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、本明細書において「Ａ～Ｂ」として表現される数値範囲には、ＡおよびＢが含まれるとともに、「好ましくはＡより大きい」および「好ましくはＢより小さい」の意を包含するものとする。
　本明細書において「ＮＡＤ」とは、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、およびＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の総称を指す。ＮＡＤは生体内中において、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨの二つの状態を取り得る。さらに、生体内において、ＮＡＤ+のアデニンリボース部分の２‘－ヒドロキシ基がリン酸化することで、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）になり得る。ＮＡＤＰは、光合成をはじめとする生体内における多くのの酸化還元反応を触媒する補酵素である。そして、ＮＡＤＰも同様に、生体内においてＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨの二つの状態を取り得る。
　なお、本明細書において「独立栄養条件」とは、外部から有機炭素源を取り込むことなく、生物が生育する環境を示す。また、ミネラルなどの無機塩類や、ビタミン等の存在下における生育環境も「独立栄養条件」に包含する。本明細書において「有機炭素源」とは、生物の生育に必要な炭素源とし得る外因性の有機物（例えば糖類等）を指す。また、本明細書中において「光」とは、微細藻類が光合成に用いる波長を有する可視光を含む光を意味する。
（ＮＡＤ生産方法の概要）
　ここで開示されるＮＡＤの生産方法について、図１を参照しつつ説明する。図１は、第１の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。
　ここで開示される技術において、ＮＡＤは、例えば、特定微細藻類の用意Ｓ１０１（以下、「ステップＳ１０１」ともいう。）と、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２（以下、「ステップＳ１０２」ともいう。）と、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３（以下、「ステップＳ１０３」ともいう。）と、微細藻類の回収Ｓ１０４（以下、「ステップＳ１０４」ともいう。）と、を含む方法によって生産される。ただし、かかる順序はこれに限定されるものではない。また、ここに開示される生産方法において、任意の段階で更に他のステップを含んでもよい。
（特定微細藻類の用意Ｓ１０１）
　ステップＳ１０１では、ここに開示する生産方法に用いる特定の微細藻類を用意する。ここで、特定の微細藻類とは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、およびユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属のいずれかに属する微細藻類である。また、本明細書における「微細藻類」は、クロレラ属、シアニディオシゾン属、およびユーグレナ属に属する種、変種、変異種を包含する。また、かかる微細藻類は変異株も包含する。変異株は、例えば、組換え、形質導入、形質転換等により得られた遺伝子変異株や突然変異株等が挙げられる。
　かかる微細藻類の入手方法は、公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、天然で採取したものでもよいし、市販品を購入してもよいし、保存機関や寄託機関を通じて入手してもよい。また、それらを継代培養したものを用いてもよいし、公知の方法で変異株を作出して用いてもよい。
　ここに開示される技術で用いられるクロレラ属の微細藻類は特に限定されないが、クロレラ属の例として、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）などが挙げられ、クロレラ・ブルガリスが好適に用いられる。
　ここに開示される技術で用いられるシアニディオシゾン属は特に限定されないが、シアニディオシゾン属の例として、シアニディオシゾン・メローラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ）が挙げられる。
　ここに開示される技術で用いられるユーグレナ属は特に限定されないが、ユーグレナ属の例として、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ユーグレナ・アクス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ａｃｕｓ）、ユーグレナ・カウダタ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｃａｕｄａｔａ）、ユーグレナ・キャデファウディ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ）、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｄｅｓｅｓ）、ユーグレナ・グラヌラタ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｎｕｌａｔａ）、ユーグレナ・インタミディア（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ユーグレナ・ムタビリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｍｕｔａｂｉｌｉｓ）、ユーグレナ・プロキシマ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｒｏｘｉｍａ）、ユーグレナ・ビルディス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｖｉｒｉｄｉｓ）、ユーグレナ・バーミフォミス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ）、ユーグレナ・ピリデ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｉｒｉｄｅ）、オオミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｏｘｙｕｒｉｓ）、ツマブキミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｓｐｉｒｏｇｙｒａ）などが挙げられ、ユーグレナ・グラシリスが好適に用いられる。
（ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２）
　ステップＳ１０２では、ステップＳ１０１で用意した微細藻類を含有した培地（以下、「培養液」ともいう。）に対し、ＮＡＤ前駆物質を供給する。
　ＮＡＤ前駆物質は、公知のＮＡＤ生合成回路におけるＮＡＤ前駆物質を用いることができる。ここでは、ニコチン酸、ニコチンアミド、キノリン酸が好適に用いられる。かかる構成によれば、好適に微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。ＮＡＤ前駆物質を培地に供給するタイミングは、微細藻類を培地に添加する前でも後でもよく、微細藻類と同時に添加してもよい。
　ここに開示される技術において、クロレラ属の微細藻類を用いる場合、ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミドが特に好ましく用いることができる。かかる構成によれば、より好適にクロレラ属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。クロレラ属の微細藻類を用いる場合、培養液中のＮＡＤ前駆物質の濃度は、ＮＡＤ蓄積性の誘起効果の観点から例えば１μＭ以上であり、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上がより好ましい。また、培養液中のＮＡＤ前駆物質の濃度は、ＮＡＤの生産効率の観点から１，０００μＭ以下が好ましく、１００μＭ以下が特に好ましい。
　ここに開示される技術において、シアニディオシゾン属の微細藻類を用いる場合、ＮＡＤ前駆物質としてキノリン酸が特に好ましく用いることができる。かかる構成によれば、より好適にシアニディオシゾン属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。シアニディオシゾン属の微細藻類を用いる場合、培養液中のＮＡＤ前駆物質の濃度は、ＮＡＤ蓄積性の誘起効果の観点から例えば１μＭ以上であり、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上がより好ましい。また、培養液中のＮＡＤ前駆物質の濃度は、ＮＡＤの生産効率の観点から２，５００μＭ以下が好ましく、１，０００μＭ以下が特に好ましい。
　ここに開示される技術において、ユーグレナ属の微細藻類を用いる場合、ＮＡＤ前駆物質としてニコチン酸、ニコチンアミド、キノリン酸が特に好ましく用いることができる。かかる構成によれば、より好適にユーグレナ属の微細藻類にＮＡＤの蓄積を誘起することができる。ユーグレナ属の微細藻類を用いる場合、培養液中のニコチン酸あるいはニコチンアミドの濃度は、ＮＡＤ蓄積性の誘起効果の観点から例えば１μＭ以上であり、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上がより好ましい。一方で、培養液中のニコチン酸あるいはニコチンアミドの濃度は、ユーグレナ属の微細藻類を添加する前および同時に供給する場合は、ユーグレナ属の微細藻類の増殖性の観点から、１００μＭ以下が好ましい。ユーグレナ属の微細藻類を添加した後の場合、ＮＡＤの生産効率の観点から培養液中のニコチン酸あるいはニコチンアミドの濃度は、１，０００μＭ以下が好ましい。また、ユーグレナ属の微細藻類を用いる場合、培養液中のキノリン酸濃度は、ＮＡＤ蓄積性の誘起効果の観点から例えば１μＭ以上であり、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上がより好ましく、１，０００μＭ以上がさらに好ましい。また、培養液中のキノリン酸の濃度は、ＮＡＤの生産効率の観点から１０，０００μＭ以下が好ましい。なお、培養液中のキノリン酸の濃度の上限は、キノリン酸の水への溶解性の観点から、約３３，０００μＭ（０．５５ｍｇ／Ｌ）以下であり得る。
　ここで開示される技術で用いられる培地は、通常の微細藻類の独立栄養条件下の培養に使用される公知の培地をもとに、微細藻類の種類や培養環境に合わせて適宜選択することができる。培地としては、例えば、Ｂｏｌｄ‘ｓ　Ｂａｓａｌ培地（以下、「ＢＢＭ培地」と言う。）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｌｌｅｎ’ｓ培地（以下、「ＭＡ培地」と言う。」、Ｃｒａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｍｙｅｒｓ培地（以下、「ＣＭ培地」と言う。）、ＡＹ培地等が挙げられる。ここでは、ＢＢＭ培地、ＭＡ培地およびＣＭ培地等が好適に用いられる。また、培地中にミネラルなどの無機塩類、ビタミン等を混合してもよい。
　なお、後述する独立栄養条件下での培養Ｓ１０３においては、微細藻類を独立栄養条件下で培養する。したがって、培地中に有機炭素源の添加を基本的に必要としない。これにより、環境の負荷が抑制されたＮＡＤの生産を行うことができる。
　ここで用いられる培地のｐＨは、微細藻類の種類や培養環境に合わせて適宜選択することができる。クロレラ属またはユーグレナ属の場合は、例えばｐＨ３～１０であり、ｐＨ３．５～９であることが好ましく、ｐＨ３．５～８であることがより好ましい。一方で、シアニディオシゾン属は、好酸性であることから、例えば、ｐＨ１～５であればよく、ｐＨ１～３であることが好ましく、ｐＨ１．５～２．５であることがより好ましい。
　また、培地にはｐＨ調整のための緩衝液を適宜添加してもよい。緩衝液は、公知の物質を用いることができ、例えば、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が用いられる。
（独立栄養条件下での培養Ｓ１０３）
　ステップＳ１０３では、ステップＳ１０１で用意した微細藻類を独立栄養条件下で培養する。なお、ステップＳ１０３においては、必ずしも培養条件を一定にする必要はない。独立栄養条件下での培養が可能な条件内であれば、ステップＳ１０３の途中で培養条件を適宜変更してもよい。
　ステップＳ１０３における培養時間は、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２後においては、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤ蓄積性の誘起効果の観点から、１時間以上が好ましく、３時間以上がより好ましい。また、かかる誘起効果の持続性の観点から４８時間以下が好ましく、２４時間以下がより好ましい。また、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２前にステップＳ１０３を行う場合、ステップＳ１０３における培養時間は特に限定されないが、例えば４日以上であり得、例えば７日以下、好ましくは６日以下であり得る。
　ステップＳ１０３における温度は、微細藻類の種類や培養環境に合わせて適宜選択することができる。クロレラ属またはユーグレナ属の場合は、例えば１５～４０℃であり、２０～３７℃であることが好ましく、２５～３５℃であることがより好ましい。一方で、シアニディオシゾン属は、例えば２５～５５℃であり、３０～５０℃であることが好ましく、３０～４７℃であることがより好ましい。
　いくつかの好適な実施形態において、ステップＳ１０３では、光源を用いて、光を当てた環境において微細藻類を独立栄養条件で培養する。ここに開示される技術で用いられる微細藻類は、光合成能力を持つ。即ち、かかる環境下において、微細藻類は光合成を行うことにより、自らの生育に必要なエネルギーを産生しながら、ＮＡＤの蓄積が可能となる。また、かかるエネルギー産生により、微細藻類の増殖性がより好適に発現する。これにより、より好適にＮＡＤを蓄積せしめることができる。なお、本明細書における「光を当てた環境」とは、微細藻類に対し、光合成が可能な波長の可視光が放射されている環境を指す。
　光源は、微細藻類が光合成に用いる波長を含むものであれば特に限られず、例えば、３８０ｎｍ～８００ｎｍの波長域を持つ白色光を放射するものが用いられる。光源は、自然光、人工光のいずれを用いてもよく、例えば、太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）灯、白熱灯、ハロゲン灯、ＨＩＤ（Ｈｉｇｈ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）ランプ等が好ましく用いられる。光源の照射は、連続照射でもよく、また、明期と暗期を繰り返す非連続照射でもよい。非連続照射の場合、明期と暗期の周期は、独立栄養条件の妨げにならない限りは、特に限定されるものではなく、微細藻類の種類や培養環境に合わせて適宜選択することができる。
　ここに開示される技術では、光源の光強度は光量子束密度（μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ・ｍ－２・ｓ－１）で表すことができる。かかる光量子束密度は、光量子計等を用いて測定することができる。光源の光強度は、微細藻類の独立栄養培養に必要な光エネルギー量、また、強光ストレス性の観点からおおよそ５～２，０００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ・ｍ－２・ｓ－１が好ましく、おおよそ３０～１，０００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ・ｍ－２・ｓ－１がより好ましい。
　培養装置は、オープンポンド型、レースウェイ型、管状フォトバイオリアクター等の公知の培養装置を用いてもよく、チューブ培養、フラスコ培養等のラボスケールの培養装置を用いてもよい。培養方法は、静置培養、振盪培養のいずれも用いることができるが、微細藻類の増殖性の観点から、振盪培養が好ましい。また、振盪培養は、往復振盪であっても、回転振盪であってもよい。
（微細藻類の回収Ｓ１０４）
　ステップＳ１０４では、培養液から微細藻類を回収する。
　かかる微細藻類の回収方法は公知の方法を用いることができる。例えば、遠心分離機等を用いて培養液を遠心処理した後、上清を取り除くことにより微細藻類を回収してもよい。また、培養液中の微細藻類より小さい孔径を有するフィルターを用いて培養液を濾過することにより、微細藻類を回収してもよい。ただし、これらは例示にすぎず、かかる回収方法はこれらに限定されない。
　なお、微細藻類を回収した後の培養液を用いて、新たな微細藻類の培養を行ってもよい。ただし、必ずしも微細藻類を回収した後の培養液をそのまま新たな微細藻類の培養に供する必要はない。例えば、上記微細藻類を回収した後の培養液に無機塩類やビタミンなどの不足成分や緩衝液などを適宜添加してもよい。また、上記微細藻類を回収した後の培養液と、別途で準備した培養液と、を追加で混合してもよい。
　ステップＳ１０４では、得られた微細藻類からＮＡＤを抽出することもできる。微細藻類からＮＡＤを抽出する方法は、公知の方法を用いることができる。例えば、圧潰法、超音波法、酵素法などが挙げられるが、これらに限定されない。
　更に、上記した方法で得られたＮＡＤは、例えば、酸あるいはアルカリによる抽出等、公知の方法によってＮＡＤ+、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ+、または、ＮＡＤＰＨ、のいずれか所望の状態で抽出することができる。
　ここまで、第１の実施形態を例に、図１を参照しながらここに開示されるＮＡＤ生産方法について説明したが、上記実施形態は一例に過ぎない。ここに開示されるＮＡＤ生産方法は、他にもさまざまな形態にて実施することができる。
　図２は、第２の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。ここでは、特定微細藻類の用意Ｓ１０１に次いで、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３を行い、並行してＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２が行われること以外は、第１の実施形態と同様でよい。すなわち、ここに開示されるＮＡＤの生産方法においては、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３の途中でＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２を行い、その後独立栄養条件下での培養Ｓ１０３を継続することができる。なお、第２の実施形態におけるＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２のタイミングは、特に限定されるものではない。
　なお、第２の実施形態では、ＮＡＤ前駆物質供給前における独立栄養条件下での培養Ｓ１０３は、光を当てた環境で培養することが好ましい。これにより、ＮＡＤ前駆物質のもつＮＡＤの蓄積を誘起する効果を好適に発現することができる。ただし、終始光を当てた環境で独立栄養条件下での培養Ｓ１０３を一貫して行う必要はない。例えば、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２後に、光を当てない環境に条件を変更して独立栄養条件下での培養Ｓ１０３を継続してもよい。
　図２４は、第３の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。ここでは、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３に代えて、混合栄養条件下での培養Ｓ２０３が行われること以外は、第１の実施形態と同様であってよい。
　（混合栄養条件下での培養Ｓ２０３）
　ステップＳ２０３では、ステップＳ１０１で用意した微細藻類を混合栄養条件下で培養する。なお、ステップＳ２０３においては、必ずしも培養条件を一定にする必要はない。混合栄養条件下での培養が可能な条件内であれば、ステップＳ２０３の途中で培養条件を適宜変更してもよい。なお、本明細書において「混合栄養条件」とは、外部から有機炭素源と二酸化炭素とを炭素源として取り込みながら生物が生育する環境を示す。即ち、外部からの炭素源を利用しつつ光合成も行われる条件を示す。
　ステップＳ２０３（混合栄養条件）で用いられる培地は、通常の微細藻類の混合栄養条件下の培養に使用される公知の培地を基に、微細藻類の種類や培養環境に併せて適宜選択することができる。これに限定されないが、例えば、Ｋｏｒｅｎ　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ培地（ＫＨ培地）、Ｈｕｎｔｅｒ培地、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂｒｉｓｔｏｌ’ｓ培地（ＭＢＭ培地）、等が挙げられる。培地中には必要に応じ、有機炭素源を混合してもよい。上記有機炭素源としては、例えば、グルコース、糖蜜、エタノール、酢酸などが挙げられる。また、培地中にミネラルなどの無機塩類、ビタミン等を混合してもよい。その他培地の条件（培地のｐＨ等）はステップＳ１０３（独立栄養条件）と同様であってもよいため、重複する説明は省略する。
　炭素源としての二酸化炭素は、大気中に存在するものを利用することができるが、追加で二酸化炭素源を供給することが好ましい。二酸化炭素源は、従来公知のものを制限なく用いることができるため、特に限定されないが、例えば、二酸化炭素を含むガス（例えば、炭酸ガス等）による供給、炭酸水素ナトリウム、酢酸などを用いることができる。また、必要に応じ、二酸化炭素を培地中に好適に供給するために培地を攪拌してもよい。
　ステップＳ２０３では、上記した点以外のことは、ステップＳ１０３（独立栄養条件）と同様であってもよい。そのため、ここでは重複する説明は省略する。
　図２５は、第４の実施形態に係るＮＡＤの生産方法を模式的に示すフロー図である。ここでは、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３に代えて、従属栄養条件下での培養Ｓ３０３が行われること以外は、第１の実施形態と同様であってよい。
　（従属栄養条件下での培養Ｓ３０３）
　ステップＳ３０３では、ステップＳ１０１で用意した微細藻類を従属栄養条件下で培養する。なお、ステップＳ３０３においては、必ずしも培養条件を一定にする必要はない。従属栄養条件下での培養が可能な条件内であれば、ステップＳ３０３の途中で培養条件を適宜変更してもよい。なお、本明細書において「従属栄養条件」とは、有機炭素源を炭素源として取り込みながら、光合成を行うことなく生物が生育する環境を示す。
　従属栄養条件下での培養Ｓ３０３で用いられる培地は、通常の微細藻類の混合栄養条件下の培養に使用される公知の培地を基に、微細藻類の種類や培養環境に併せて適宜選択することができる。従属栄養条件下での培養Ｓ３０３で用いられる培地は、混合栄養条件下での培養Ｓ２０３で用いられる培地と同様であってもよい。また、ステップＳ３０３では、上記した点以外のことは、ステップＳ１０３（独立栄養条件）と同様であってもよい。そのため、ここでは重複する説明は省略する。
　なお、本技術の効果を著しく損なわない限りにおいて、微細藻類の培養条件を独立栄養条件、混合栄養条件または従属栄養条件の２種以上を適宜切り替えながら行ってもよい。
（用途）
　ここに開示される技術によって得られたＮＡＤの用途は、幅広い産業分野で用いることができる。例えば、生化学、生理学分野等の臨床試験用の試薬や、物質生産のための補酵素、栄養補助食品などの用途に用いられてもよい。
　以下、ここに開示される技術に関するいくつかの例を説明するが、本技術を係る例示に限定することを意図したものではない。なお、例１～１２では、全ての例において独立した３つの培養（即ち、ｎ＝３）を実施した。また、図３～２３の値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
［例１：クロレラ属の微細藻類を用いた、ＮＡＤ前駆物質供給によるＮＡＤの生産］
（方法）
＜クロレラ属の微細藻類と培地の用意＞
　クロレラ属の微細藻類として、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＮＩＥＳ-２１７０株（以下、「クロレラ」という。）を用意した。
　培地として、ニコチン酸、ニコチンアミドまたはキノリン酸が１０μＭ、１００μＭまたは１，０００μＭとなるように添加されたＢＢＭ培地をそれぞれ準備した。なお、ニコチン酸処理区およびキノリン酸処理区においては、培養前後の培地のｐＨ変化を防ぐ目的で、ＨＥＰＥＳを用いて終濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．２に設定した培地を用いた。また、各処理区に対応するＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培地を並行して準備した。そして、クロレラを、初期濃度がニコチンアミド処理区においてはＯＤ７５０（波長が７５０ｎｍであるときの光学濃度）＝０．１、ニコチン酸およびキノリン酸処理区においてはＯＤ７５０＝０．０１となるように添加して培養した。
＜培養、回収＞
　培養条件は、三波長昼白色蛍光灯を用いて４０～５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ・ｍ－２・ｓ－１の光強度で２４時間連続照射し、３０℃にて、１００ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。培養後、ＮＡＤ前駆物質によるクロレラの増殖性への影響を評価するため、培養液のＯＤ７５０値を測定した。その後、培養液を、予め風袋重量を秤量したチューブに回収し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）にてクロレラ細胞を沈殿させた。遠心分離後、チューブ内の上清を除去することでクロレラ細胞を回収した。回収したクロレラ細胞入りのチューブの重量を秤量し、チューブの風袋を差し引いたものをクロレラ細胞の重量とした。回収したクロレラ細胞は－８０℃で凍結し、ＮＡＤ定量に供した。なお、培地のＯＤ７５０値の測定結果は、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
＜ＮＡＤの抽出＞
　ここでは、本実施例に係るＮＡＤの定量に供するためのサンプルの抽出をＮＡＤ（Ｐ）+（酸化型）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型）のそれぞれについて行った。
（１）ＮＡＤ（Ｐ）+（酸化型）の定量用サンプルの抽出
　凍結したクロレラ細胞入りのチューブに０．２Ｍ　ＨＣｌを２５０μｌ加え、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて５秒間超音波処理（Ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ：Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｏｕｔｐｕｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ：２）を行った。その後、チューブを沸騰した湯中に１分間浸漬した後、氷上にてチューブを冷却した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後、チューブ内の上清を１５０μｌ回収し、新しい１．５ｍｌプラスチックチューブに移した。回収した上清に０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．６）を１５μｌ、０．２Ｍ　ＮａＯＨを１２０μｌ加え、ボルテックスミキサーで撹拌したものを定量用サンプルとした。
（２）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型）の定量用サンプルの抽出
　ＮＡＤ（Ｐ）+の定量用サンプルの抽出において使用した試薬のうち、０．２Ｍ　ＨＣｌを０．２Ｍ　ＮａＯＨに、０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．６）を０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に、０．２Ｍ　ＮａＯＨを０．２Ｍ　ＨＣｌに変更したこと以外は、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の定量用サンプルの抽出と同様の手順でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量用サンプルの抽出を行った。
＜ＮＡＤの定量＞
　本実施例に係るＮＡＤ量は、サイクリングアッセイにより、ＮＡＤ（Ｈ）量、ＮＡＤＰ（Ｈ）量をそれぞれ定量し、総和を求めることで算出した。
（１）ＮＡＤ（Ｈ）の定量
　１００％エタノールを１５μｌ、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を１００μｌ、１．２ｍＭ　２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＰＩＰ）を２．５μｌ、２０ｍＭ　１－Ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（１－メトキシＰＭＳ）を１０μｌ、オートクレーブ済み蒸留水を１７．５μｌ、定量用サンプルを３５μｌ混合した。かかる混合液に対し、１，７７０ｕｎｉｔ／ｍｌ　Ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを１０μｌ加えて、ピペッティングで混合した後、５９５ｎｍの波長の光における吸光度の経時変化を分光光度計で測定した。また、定量用サンプルに代えて、標準溶液を用いて同様の測定を行うことでＮＡＤ（Ｈ）の定量用の検量線を作成した。作成した検量線を用いて、ＮＡＤ（Ｈ）量を算出した。
（２）ＮＡＤＰ（Ｈ）の定量
　１０ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇ６Ｐ）を１０μｌ、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を１００μｌ、１．２ｍＭ　ＤＣＰＩＰを５μｌ、２０ｍＭ　１－メトキシＰＭＳを５μｌ、オートクレーブ済み蒸留水を２０μｌ、定量用サンプルを３５μｌ混合した。かかる混合液に対し、２１５ｕｎｉｔ／ｍｌ　Ｇ６Ｐ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを５μｌ加えて、ピペッティングで混合した後、５９５ｎｍの波長の光における吸光度の経時変化を分光光度計で測定した。また、定量用サンプルに代えて、標準溶液を用いて同様の測定を行うことでＮＡＤＰ（Ｈ）の定量用の検量線を作成した。作成した検量線を用いて、ＮＡＤＰ（Ｈ）量を算出した。
（３）ＮＡＤ総量の算出と評価
　算出したＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）の総和をＮＡＤ量とし、該ＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図３に、ＮＡＤ前駆物質によるクロレラのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。かかる結果から、ニコチンアミド処理区において、クロレラのＮＡＤ量の増加が認められた。このことから、ニコチンアミドがクロレラに対し、ＮＡＤの蓄積を好適に誘起することが分かった。図４に、ＮＡＤ前駆物質によるクロレラの増殖性への影響評価の結果を示す。かかる結果から、全ての処理区について、クロレラの増殖性の抑制は認められなかった。従って、いずれのＮＡＤ前駆物質についてもクロレラの生育には影響がないことが分かった。
［例２：シアニディオシゾン属の微細藻類を用いた、ＮＡＤ前駆物質供給によるＮＡＤの生産］
（方法）
　シアニディオシゾン属の微細藻類として、Ｃｙａｎｉｄｉｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ　ＮＩＥＳ－３３７７株（以下、「シゾン」という。）を用意した。
　培地として、ニコチン酸、ニコチンアミドまたはキノリン酸が１０μＭ、１００μＭまたは１，０００μＭとなるように添加されたＭＡ培地（ｐＨ２．５）をそれぞれ準備した。なお、各処理区に対応するＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培地を並行して準備した。そして、シゾンを初期濃度がＯＤ７５０＝０．１となるように添加して培養した。
　上記の培地を用いたこと以外は、例１と同様の培養条件、ＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いて評価を行った。また、培養後、ＮＡＤ前駆物質によるシゾンの増殖性の影響を評価するため、培養液のＯＤ７５０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図５に、ＮＡＤ前駆物質によるシゾンのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。かかる結果から、キノリン酸処理区において、シゾンのＮＡＤ量の増加が認められた。このことから、キノリン酸がシゾンに対し、ＮＡＤの蓄積を好適に誘起することが分かった。図６に、ＮＡＤ前駆物質によるシゾンの増殖性への影響評価の結果を示す。かかる結果から、全ての処理区について、シゾンの増殖性の抑制は認められなかった。従って、いずれのＮＡＤ前駆物質についてもシゾンの生育には影響がないことが分かった。
［例３：ユーグレナ属の微細藻類を用いた、ＮＡＤ前駆物質供給によるＮＡＤの生産］
（方法）
　ユーグレナ属の微細藻類として、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　ＮＩＥＳ－４８株（以下、「ユーグレナ」という。）を用意した。
　培地として、ニコチン酸、ニコチンアミドまたはキノリン酸が１０μＭ、１００μＭまたは１，０００μＭとなるように添加されたＣＭ培地（ｐＨ３．５）をそれぞれ準備した。キノリン酸処理区では、上記に加えて、キノリン酸が１０，０００μＭとなるように添加したＣＭ培地を準備した。なお、各処理区に対応するＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培地を並行して準備した。そして、ユーグレナを初期濃度がＯＤ６８０＝０．０５となるように添加して培養した。
　上記のＮＡＤ前駆物質および培地を用いたこと以外は、例１と同様の培養条件、ＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いて評価を行った。また、培養後、ＮＡＤ前駆物質によるユーグレナの増殖性の影響を評価するため、培養液のＯＤ６８０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図７に、ＮＡＤ前駆物質によるユーグレナのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。なお、ユーグレナにおけるＮＡＤ蓄積量の結果について、ニコチン酸処理区における１，０００μＭ、また、ニコチンアミド処理区における１，０００μＭでは、生育阻害により細胞が回収できず、ＮＡＤ量の測定ができなかったため図示しなかった。かかる結果から、ＮＡＤ量の増加が認められた。また、ＮＡＤ前駆物質の添加量が１００μＭの各処理区間で比較した場合、ニコチン酸処理区において、もっともＮＡＤ量の増加が認められた。図８に、ＮＡＤ前駆物質によるユーグレナの増殖性への影響評価の結果を示す。かかる結果から、ニコチン酸処理区における１，０００μＭ、また、ニコチンアミド処理区における１，０００μＭにおいて、ユーグレナの生育阻害が認められた。一方で、ニコチン酸処理区における１０μＭ及び１００μＭ、また、ニコチンアミド処理区における１０μＭ及び１００μＭではユーグレナの増殖性の抑制は認められなかった。なお、キノリン酸処理区については、例３で実施した全ての濃度において、ユーグレナの増殖性の抑制は認められなかった。
［例４（比較例）：シネコスティス属の微細藻類を用いた、ＮＡＤ前駆物質供給によるＮＡＤの生産の検討］
　シネコシスティス属の微細藻類として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３株（以下、「シネコシスティス」と言う。）を用意した。
　培地として、ニコチン酸、ニコチンアミドまたはキノリン酸が１０μＭ、１００μＭまたは１，０００μＭとなるように添加されたＢＧ－１１培地（ｐＨ８．０）をそれぞれ準備した。なお、ニコチン酸処理区およびキノリン酸処理区においては、培養前後の培地のｐＨ変化を防ぐ目的で、ＨＥＰＥＳ濃度を３０ｍＭに設定した培地を用いた。また、各処理区に対応するＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培地を並行して準備した。そして、シネコシスティスを初期濃度がＯＤ７３０＝０．１となるように添加して培養した。
　上記のＮＡＤ前駆物質および培地を用いたこと以外は、例１と同様の培養条件、ＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いて評価を行った。また、培養後、ＮＡＤ前駆物質によるシネコシスティスの増殖性の影響を評価するため、培養液のＯＤ７３０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図９に、ＮＡＤ前駆物質によるシネコシスティスのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。かかる結果では、いずれのＮＡＤ前駆物質処理区においても、例１～３で示した微細藻類ほどのＮＡＤの蓄積が見られなかった。図１０に、ＮＡＤ前駆物質によるシネコシスティスの増殖性への影響評価の結果を示す。かかる結果から、ニコチン酸処理区における１，０００μＭ、また、キノリン酸処理区における１０μＭ及び１００μＭにおいて、シネコシスティスの生育阻害が認められた。したがって、シネコスティスにおいては、ＮＡＤ前駆物質によるＮＡＤ蓄積性の誘起効果は認められなかった。
［例５：クロレラ属の微細藻類での、独立栄養培養条件下における培養時間の検討］
（方法）
　微細藻類として、クロレラを用意した。まず、ＢＢＭ培地に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．１になるようにクロレラを添加した。次に、例１と同様の培養条件で４日間、定常期に達するまでクロレラを培養した。定常期に達した後、クロレラ入りの培養液に対し、ニコチンアミドを１００μＭになるように供給し、培養条件を変更せずにクロレラの培養を継続した。ニコチンアミド供給０（コントロール）、１、３、６、１２、２４および４８時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いてＮＡＤ量を算出し、ニコチンアミド供給０時間後（コントロール）のＮＡＤ量に対する相対値（コントロールを１とする）で評価を行った。また、ＮＡＤ前駆物質による培養時間ごとのクロレラの増殖性への影響を評価するため、各サンプルについて培養液のＯＤ７５０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１１に、ニコチンアミドの供給による、クロレラのＮＡＤ量の経時推移の結果を示す。なお、図１１および図１２中の「Ｎａｍ」は、ニコチンアミドを指す。かかる結果から、供給１時間後からクロレラのＮＡＤ量の蓄積が認められ、供給２４時間後に該ＮＡＤの蓄積がピークを迎えたことが認められた。図１２に、ニコチンアミドの供給による、クロレラの増殖性の経時推移の結果を示す。かかる結果から、全ての処理区について、クロレラの増殖性の抑制は認められなかった。
［例６：シアニディオシゾン属の微細藻類での、独立栄養条件下における培養時間の検討］
（方法）
　微細藻類として、シゾンを用意した。まず、ＭＡ培地（ｐＨ２．５）に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．１になるようにシゾンを添加した。次に、例１と同様の培養条件でシゾンを６日間培養した。その後、シゾン入りの培養液に対し、キノリン酸を１，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せずにシゾンの培養を継続した。キノリン酸供給０（コントロール）、１、３、６、１２および２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングした。また、比較として、キノリン酸を１，０００μＭ供給した培地にシゾンを添加し、７日間培養したこと以外は上記と同じ条件の培養を行い、かかる培養液をサンプルに供した。例１と同様のＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いて、上記したサンプルに対し、ＮＡＤ量を算出し、キノリン酸供給０時間後（コントロール）のＮＡＤ量に対する相対値（コントロールを１とする）で評価を行った。また、ＮＡＤ前駆物質による培養時間ごとのシゾンの増殖性への影響を評価するため、各サンプルについて培養液のＯＤ７５０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１３に、キノリン酸の供給による、シゾンのＮＡＤ量の経時推移の結果を示す。なお、図１３および図１４中の「Ｑａ」は、キノリン酸を指す。かかる結果から、供給１時間後からシゾンのＮＡＤ量の蓄積が認められ、供給２４時間後に該ＮＡＤの蓄積が、予めキノリン酸を添加して７日間培養した場合と同程度となった。図１４に、キノリン酸の供給による、シゾンの増殖性の経時推移の結果を示す。かかる結果から、全ての処理区について、シゾンの増殖性の抑制は認められなかった。
［例７：ユーグレナ属の微細藻類での、独立栄養条件下における培養時間の検討］
（方法）
　微細藻類として、ユーグレナを用意した。まず、ＣＭ培地（ｐＨ３．５）に対し、初期濃度がＯＤ６８０＝０．０５になるようにユーグレナを添加した。次に、例１と同様の培養条件でユーグレナを６日間培養した。その後、ユーグレナ入りの培養液に対し、ニコチン酸を１００μＭになるように供給し、培養条件を変更せずにユーグレナの培養を継続した。ニコチン酸供給０（コントロール）、１、３、６、１２、２４および４８時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件、ＮＡＤの定量条件を用いてＮＡＤ量を算出し、ニコチン酸供給０時間後（コントロール）のＮＡＤ量に対する相対値（コントロールを１とする）で評価を行った。また、ＮＡＤ前駆物質による培養時間ごとのユーグレナの増殖性への影響を評価するため、各サンプルについて培養液のＯＤ６８０値を測定し、ＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１５に、ニコチン酸の供給による、ユーグレナのＮＡＤ量の経時推移の結果を示す。なお、図１５および図１６中の「Ｎａ」は、ニコチン酸を指す。かかる結果から、供給１時間後からユーグレナのＮＡＤ量の蓄積が認められ、供給２４時間後に該ＮＡＤの蓄積がピークを迎えたことが認められた。図１６に、ニコチン酸の供給による、ユーグレナの増殖性の経時推移の結果を示す。かかる結果から、全ての処理区について、ユーグレナの増殖性の抑制は認められなかった。
　例５～７の結果から、ＮＡＤ前駆物質供給後の微細藻類の培養時間は、１時間以上であると、ＮＡＤ前駆物質の微細藻類に対するＮＡＤ蓄積性の誘起効果が発現し、２４時間でＮＡＤ蓄積性のピークを迎えることが分かった。また、例５～７のいずれの結果においても、微細藻類の増殖性の抑制は認められなかった。
［例８：クロレラ属の微細藻類における、ＮＡＤ前駆物質濃度の検討］
（方法）
　微細藻類として、クロレラを用意した。まず、ＢＢＭ培地に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．０１になるようにクロレラを添加した。次に、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、７日間クロレラを培養した。そして、クロレラ入りの培養液に対し、ニコチンアミドを１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１，０００μＭまたは１０，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せず（光２４時間連続照射のまま）クロレラの培養を継続した。また、ＮＡＤ前駆物質未処理区（０μＭ、コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培養を並行して行った。ニコチンアミド供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。そして、算出したＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１７に、ＮＡＤ前駆物質によるクロレラのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。コントロールと比較して、いずれのニコチンアミド処理区においても、ＮＡＤの蓄積が見られた。ニコチンアミドの処理濃度で比較すると、ニコチンアミド１０μＭおよび１００μＭ処理区において、ＮＡＤの蓄積性のピークがみられた。
［例９：シアニディオシゾン属の微細藻類における、ＮＡＤ前駆物質濃度の検討］
（方法）
　微細藻類として、シゾンを用意した。まず、ＭＡ培地（ｐＨ２．５）に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．１になるようにシゾンを添加した。次に、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、６日間シゾンを培養した。そして、シゾン入りの培養液に対し、キノリン酸を５００μＭ、１，０００μＭ、２，５００μＭ、５，０００μＭ、７，５００μＭまたは１０，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せず（光２４時間連続照射のまま）シゾンの培養を継続した。また、ＮＡＤ前駆物質未処理区（０μＭ、コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培養を並行して行った。キノリン酸供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。そして、算出したＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１８に、ＮＡＤ前駆物質によるシゾンのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。コントロールと比較して、いずれのキノリン酸処理区においても、ＮＡＤの蓄積が見られた。キノリン酸の処理濃度で比較すると、キノリン酸１，０００μＭおよび２，５００μＭ処理区において、ＮＡＤの蓄積性のピークがみられた。
［例１０：ユーグレナ属の微細藻類における、ＮＡＤ前駆物質濃度（ニコチン酸）の検討］
（方法）
　微細藻類として、ユーグレナを用意した。まず、ＣＭ培地（ｐＨ３．５）に対し、初期濃度がＯＤ６８０＝０．０５になるようにユーグレナを添加した。次に、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、６日間ユーグレナを培養した。そして、ユーグレナ入りの培養液に対し、ニコチン酸を１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１，０００μＭ、２，５００μＭ、５，０００μＭまたは１０，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せず（光２４時間連続照射のまま）ユーグレナの培養を継続した。また、ＮＡＤ前駆物質未処理区（０μＭ、コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培養を並行して行った。ニコチン酸供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。そして、算出したＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図１９に、ＮＡＤ前駆物質によるニコチン酸のＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。コントロールと比較して、１０，０００μＭニコチン酸処理区以外の処理区において、ＮＡＤの蓄積が見られた。ニコチン酸の処理濃度で比較すると、ニコチン酸１，０００μＭ処理区において、ＮＡＤの蓄積性のピークがみられた。
［例１１：独立栄養条件下の培養におけるＮＡＤ前駆物質供給後の明暗条件の検討］
（方法）
　微細藻類として、クロレラを用意した。まず、ＢＢＭ培地に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．０１になるようにクロレラを添加した。そして、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、７日間クロレラを培養した。その後、クロレラ入りの培養液に対し、ニコチンアミドを１００μＭになるように供給した。ニコチンアミド供給後、光２４時間連続照射（２４時間照明ＯＮ）、あるいは、照明無し（２４時間照明ＯＦＦ）の条件に分けて、他の条件は変更せずにクロレラの培養を継続した。ニコチンアミド供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。また、培養時の明暗条件によるクロレラ量への影響を評価するため、各サンプルについて培養液のＯＤ７５０値を測定した。
（結果）
　図２０に、クロレラの重量ｇ当たりＮＡＤ量（ｎｍｏｌ／ｇＦＷ）を、培養時の明暗条件毎に示す。かかる結果から、ニコチンアミドを供給後、クロレラを光２４時間連続照射の条件で培養した場合、照明無しに比べ、ＮＡＤ量が多く見られた。図２１に、ＯＤ７５０値の測定結果を培養時の明暗条件毎に示す。かかる結果から、照明の有無による、ＯＤ７５０値の差異は認められなかった。
［例１２：独立栄養条件下の培養時における光照射条件の検討］
（方法）
　微細藻類として、クロレラを用意した。まず、ＢＢＭ培地に対し、初期濃度がＯＤ７５０＝０．０１になるようにクロレラを添加した。そして、光２４時間連続照射（２４時間照明ＯＮ）、あるいは、光１２時間／日の非連続照射（１２時間照明ＯＮ－１２時間照明ＯＦＦの連続サイクル）の条件に分けたこと以外は、例１と同様の培養条件で、７日間クロレラを培養した。その後、クロレラ入りの培養液に対し、ニコチンアミドを１００μＭになるように供給した。ニコチンアミド供給後、培養条件を変更せずにクロレラの培養を継続した。ニコチンアミド供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。また、培養時の明暗条件によるクロレラ量への影響を評価するため、各サンプルについて培養液のＯＤ７５０値を測定した。
（結果）
　図２２に、クロレラの重量ｇ当たりＮＡＤ量（ｎｍｏｌ／ｇＦＷ）を、培養時の光照射条件毎に示す。また、図２３に、ＯＤ７５０値の測定結果を培養時の光照射条件毎に示す。図２３に示すように、２４時間連続照射条件でクロレラを培養した場合、１２時間／日の非連続照射条件で培養した場合と比較して、ＯＤ７５０値が高かった。一方で、図２２に示すように、いずれの光照射条件においても、クロレラの重量ｇ当たりのＮＡＤ量はほぼ同程度であった。したがって、光照射が非連続であっても、連続照射の場合と同等に、ＮＡＤ前駆物質によるＮＡＤ蓄積性誘起効果が得られることが分かった。
［例１３：ユーグレナ属の微細藻類における、ＮＡＤ前駆物質濃度（ニコチンアミド）の検討］
（方法）
　微細藻類として、ユーグレナを用意した。まず、ＣＭ培地（ｐＨ３．５）に対し、初期濃度がＯＤ６８０＝０．０５になるようにユーグレナを添加した。次に、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、６日間ユーグレナを培養した。そして、ユーグレナ入りの培養液に対し、ニコチンアミドを１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１，０００μＭ、２，５００μＭまたは５，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せず（光２４時間連続照射のまま）ユーグレナの培養を継続した。また、ＮＡＤ前駆物質未処理区（０μＭ、コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質（ニコチンアミド）が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培養を並行して行った。ニコチンアミド供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。そして、算出したＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図２６に、ＮＡＤ前駆物質によるニコチンアミドのＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。コントロールと比較して、全ての処理区において、ＮＡＤの蓄積が見られた。ニコチンアミドの処理濃度で比較すると、ニコチンアミド１，０００μＭ処理区において、ＮＡＤの蓄積性のピークがみられた。
［例１４：ユーグレナ属の微細藻類における、ＮＡＤ前駆物質濃度（キノリン酸）の検討］
（方法）
　微細藻類として、ユーグレナを用意した。まず、ＣＭ培地（ｐＨ３．５）に対し、初期濃度がＯＤ６８０＝０．０５になるようにユーグレナを添加した。次に、例１と同様の培養条件で、光２４時間連続照射条件下にて、６日間ユーグレナを培養した。そして、ユーグレナ入りの培養液に対し、キノリン酸を２５０μＭ、５００μＭ、１，０００μＭ、２，５００μＭ、５，０００μＭまたは１０，０００μＭになるように供給し、培養条件を変更せず（光２４時間連続照射のまま）ユーグレナの培養を継続した。また、ＮＡＤ前駆物質未処理区（０μＭ、コントロール）として、ＮＡＤ前駆物質（キノリン酸）が未添加であること以外は上記と同じ条件とした培養を並行して行った。キノリン酸供給２４時間後の培養液をそれぞれサンプリングし、例１と同様のＮＡＤの抽出条件およびＮＡＤの定量条件で、ＮＡＤの抽出および定量を行った。そして、算出したＮＡＤ量をＮＡＤ前駆物質未処理区（コントロール）に対する相対値（コントロールを１とする）で比較した。
（結果）
　図２７に、ＮＡＤ前駆物質によるキノリン酸のＮＡＤ蓄積量への影響評価の結果を示す。キノリン酸１０，０００μＭ処理区において、ＮＡＤの蓄積量が顕著に増加したことが確認された。
　以上の通り、ここで開示される技術の具体的な態様として、以下の各項に記載のものが挙げられる。
項Ａ：微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、光を当てた、または、当てない環境において、クロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、上記培養後の培地から上記微細藻類を回収することと、を含むＮＡＤ生産方法。
項１：微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、光を当てた、または、当てない環境において、独立栄養条件下でクロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、上記培養後の培地から上記微細藻類を回収することと、を含むＮＡＤ生産方法。
項２：上記微細藻類がクロレラ属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミドを供給することを特徴とする、項Ａまたは項１に記載の方法。
項３：上記微細藻類がシアニディオシゾン属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてキノリン酸を供給することを特徴とする、項Ａまたは項１に記載の方法。
項４：上記微細藻類がユーグレナ属であって、上記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミド、キノリン酸、ニコチン酸のうち少なくとも１つを供給することを特徴とする、項Ａまたは項１に記載の方法。
項５：上記微細藻類を上記ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で１時間以上培養することを特徴とする、項Ａまたは項１～４のいずれか１項に記載の方法。
項６：光を当てた環境において、上記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む、項Ａまたは項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項７：光を当てない環境において、上記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む、項Ａまたは請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項８：上記微細藻類を混合栄養条件下で培養することを含む、項Ａまたは請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項９：上記微細藻類を従属栄養条件下で培養することを含む、項Ａまたは請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
　以上、ここに開示される技術の実施形態を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した実施形態を様々に変形、変更したものが含まれる。
　例えば、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３の途中で微細藻類を回収し、上記回収した微細藻類を再度培地に懸濁した（換言すれば、培地を交換した）ものにＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２を行ってもよい。この際、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３の途中で培養条件（例えば、培養装置の変更など）を変更してもよい。また、ここに開示される技術において、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２を複数回行ってもよい。例えば、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３の途中で、ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２を行い、その後、独立栄養条件下での培養Ｓ１０３を継続する中で再度ＮＡＤ前駆物質の供給Ｓ１０２を行ってもよい。
Ｓ１０１　　　　　特定微細藻類の用意
Ｓ１０２　　　　　ＮＡＤ前駆物質の供給
Ｓ１０３　　　　　独立栄養条件下での培養
Ｓ１０４　　　　　微細藻類の回収
Ｓ２０３　　　　　混合栄養条件下での培養
Ｓ３０３　　　　　従属栄養条件下での培養

Claims (9)

  1. 　微生物を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生産する方法であって、
    　光を当てた、または、当てない環境において、クロレラ属、シアニディオシゾン属、またはユーグレナ属のいずれかに属する微細藻類を、ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で培養することと、
    　前記培養後の培地から前記微細藻類を回収することと、を含むＮＡＤ生産方法。
  2. 　前記微細藻類がクロレラ属であって、前記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミドを供給することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記微細藻類がシアニディオシゾン属であって、前記ＮＡＤ前駆物質としてキノリン酸を供給することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記微細藻類がユーグレナ属であって、前記ＮＡＤ前駆物質としてニコチンアミド、キノリン酸、ニコチン酸のうち少なくとも１つを供給することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記微細藻類を前記ＮＡＤ前駆物質が供給された培地で１時間以上培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 　光を当てた環境において、前記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　光を当てない環境において、前記微細藻類を独立栄養条件下で培養することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記微細藻類を混合栄養条件下で培養することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記微細藻類を従属栄養条件下で培養することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
     
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