CN101695513B - 一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用。本发明公开的组合物是由人参次苷和真菌多糖组成，其重量配比人参次苷∶真菌多糖为1∶0.01～500，优选重量配比为人参次苷∶真菌多糖为1∶0.1～50。本发明还公开了该组合物的制备方法。本发明组合物具有提高免疫功能和抗肿瘤作用，且疗效明显优于单独使用人参次苷或真菌多糖，适用于肿瘤的治疗。

Description

一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用。

背景技术

人参是具有千年历史的滋补强壮中药，据现代研究表明，人参中最主要的活性成分为人参皂苷(gensenosides)，人参皂苷具有提高机体免疫功能的作用。因此，人参皂苷及其复方产品的研究均已经广泛开展，例如名为“具有抗肿瘤活性的药物”的发明专利(CN99101777.3)和“担子菌亚门和五加科提取物的生理活性组合物”的发明专利(CN01807160.0)。前者公开了一种含有比例为10∶5∶3的灵芝真菌、云芝真菌和人参根水煎液的抗肿瘤剂；后者公开了一种通过热水提取得到的包含属于担子菌亚门多孔菌科的热水提取物和属于五加科植物根的热水提取物的组合物，该组合物具有降血糖和抗肿瘤活性。

专利组合物均为真菌和人参根的水提取物，其活性成分除了真菌多糖和人参皂苷外，还有大量的人参多糖、蛋白质、色素和无机盐等，组成成分复杂，活性物质基础不明确，有效成分含量低，尤其是其产品中的人参皂苷是固有的人参总皂苷而非经过转化后次生形成的高活性人参次生皂苷。

人参次生皂苷又称人参次苷，为人参皂苷在一定条件下失去糖配体而新生成的皂苷，由于次生皂苷失去了极性大的糖配体，其极性降低了，所以又称为低极性人参皂苷。人参次苷通常由人参(Panax ginseng)、西洋参(Panax quinquefolius)、三七参(Radix Notoginseng)、竹节参(Panax japonicus)、绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)或其他人参属(Panax)植物和绞股蓝属(Gynostemma)植物的根、茎、叶、花和果实的皂苷提取物、总皂苷、二醇组皂苷、三醇组皂苷和人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、F1、F2、Rg1、三七皂苷R1等单体皂苷进行高温高压水解(韩国专利号192678)、酸水解(CN02144780.2、CN01133408.8)、碱水解(CN00123074.3、CN03134090.3)、酶水解(CN200610047112.8)或微生物发酵方法(CN02132403.4、CN03101549.2)断裂糖苷键失去糖配体而制备得到的次生产物，包括人参次苷提取物、人参总次苷、人参二醇组次生皂苷、人参三醇组次生皂苷以及人参皂苷F4、Rg2、Rg3、Rg4、Rg5、Rg6、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、RK1、RK2、RK3、C-K等次生皂苷及次生苷元Ppd、Ppt等。人参次苷在参属和绞股蓝属植物中的含量极低，甚至不存在，其中Rg3在白参中的含量仅为0.0003％，在红参中的含量约为0.03％；Rh2和C-K在天然人参中并不存在，仅在红参中含有约0.001％Rh2，而C-K只是人参皂苷的肠道菌代谢产物。与人参皂苷相比，人参次苷具有更低的极性、更高的生物利用度和更强的生理活性，如人参皂苷Rg3、Rh1、Rh2、C-K及其苷元Ppd等均具有杀死癌细胞的显著作用，且毒性很低，无副作用。其中人参皂苷Rg3已经成功申报了肿瘤治疗药物并已有拿到药品批准文号，人参皂苷Rh2、C-K及其苷元Ppd也在进行肿瘤治疗的临床研究过程中。

真菌多糖是一种生物效应调节剂，其免疫调节作用和对肿瘤的治疗作用已受到人类的广泛地重视，一批真菌多糖产品在许多国家已被用到了临床上，并取得了显著疗效，如香菇多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖、云芝多糖、灵芝多糖、樟芝多糖、裂褶菌多糖、绣球菌多糖、冬虫夏草多糖、北虫草多糖、桑黄多糖、酵母多糖等，这些多糖均具有良好的免疫调节作用以及直接抑制肿瘤的功效，其主要活性成分为β-葡聚糖或者以β-葡聚糖为主的杂聚糖。众多实验研究表明，β-葡聚糖，尤其是β-1，3-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖在提高免疫功能和抑制肿瘤生长方面具有良好的作用，如香菇多糖(CN 93102815.9)、猪苓多糖(CN 95115855.4)、云芝多糖(CN 200710032475.9)等。

虽然目前已经出现了上述的真菌多糖、人参次苷产品以及真菌提取物与人参提取物组成的组合物专利，但是未见真菌多糖与人参次苷的组合物专利或研究报道。

发明内容

本发明通过对临床研究中明确具有提高人体免疫功能和抑制癌细胞活性的真菌多糖和人参次苷进行合理配伍，提供了一种能提高免疫功能、抑制和杀死肿瘤细胞的组合物。该组合物主要通过真菌多糖激活人体免疫功能，通过低极性人参次苷抑制肿瘤细胞增殖和毛细血管生成，两者相互协同增效杀死肿瘤细胞，最终达到预防和治疗癌症的目的，且效果明显优于单用真菌多糖或人参次苷。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术解决方案：

这种具有提高免疫功能、抑制毛细血管生成和杀死肿瘤细胞功能的抗癌组合物由真菌多糖和人参次苷组成，其重量配比为人参次苷∶真菌多糖＝1∶0.01～500，其中优选重量配比为人参次苷∶真菌多糖＝1∶0.1～50。

人参次苷包括人参次苷提取物、人参总次苷、人参二醇组次生皂苷、人参三醇组次生皂苷以及单体人参皂苷F4、Rg2、Rg3、Rg4、Rg5、Rg6、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、RK1、RK2、RK3、C-K等次生皂苷及其次生苷元Ppd、Ppt中的一种或几种。

人参次苷是由人参、西洋参、三七参、竹节参、绞股蓝或其他人参属、绞股蓝属植物的根、茎、叶、花或果实的皂苷提取物、总皂苷、二醇组皂苷、三醇组皂苷和人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、F1、F2、Rg1、三七皂苷R1等单体皂苷经高温高压水解、酸水解、碱水解、酶水解或微生物发酵方法中的一种或几种方法制备得到的皂苷含量为1％~99％的人参次苷，较佳的，人参次苷中皂苷含量为50％-95％，优选皂苷重量百分比为50~95％人参次生皂苷有效部位或次生人参皂苷单体。

上述人参次苷的获取方法均为现有技术，也可通过市购途径获得。

真菌多糖包括香菇(Lentinula Edodes)多糖、灰树花(Grifola frondosa)多糖、姬松茸(Agaricus blazei)多糖、云芝(Coriolus versicolor)多糖、灵芝(Ganoderma lucidum)多糖、紫芝(Ganoderma sinensis)多糖、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)多糖、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)多糖、蘑菇(Agaricus brunnescens)多糖、木耳(Auricularia auricula)多糖、毛木耳(Auricularia polytricha)多糖、皱木耳(Auricularia delicata)多糖、银耳(Tremellafuciformis)多糖、茶色银耳(Tremella foliacea)多糖、金耳(Tremella aurantia)多糖、裂褶菌(Schizophyllum commne)多糖、绣球菌(Sparassis latifolia)多糖、猴头菇(Hericium erinaceus)多糖、鸡腿菇(Copyinds comatus)多糖、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)多糖、阿魏侧耳(Pleurotus ferulae)多糖、金针菇(Flammulina velutipes)多糖、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)多糖、蝙蝠蛾拟青霉(Paceilomyces hepialid)多糖、蝙蝠蛾多毛孢(Hirsutella hepialid)多糖、北虫草(Cordyceps militaris)多糖、桑黄(Phellinus igniarius)多糖、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)多糖、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多糖、产朊假丝酵母(Candida utilis)多糖、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)多糖、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)多糖中的一种或几种。是以真菌为原料，采用热水提取、乙醇沉淀、超滤、葡聚糖凝胶过滤、DEAE纤维素柱层析中的一种或几种方法制备得到的糖含量为10％~99％的真菌多糖，包括来源于真菌的水提取物、多糖有效部位和多糖有效成分，优选糖重量百分比为50~95％的真菌多糖有效部位或真菌多糖纯品。真菌多糖的主要活性成分为β-葡聚糖或者以β-葡聚糖为主的杂聚糖，其中。根据糖苷键的不同β-葡聚糖可分为β-1，2-葡聚糖、β-1，3-葡聚糖、β-1，4-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖，或者他们的聚合物或混合物。

上述真菌多糖的获取方法均为现有技术，也可通过市购途径获得。

优选的，本发明的组合物为灰树花多糖和人参总次苷的组合。优选重量配比为人参总次苷∶灰树花多糖＝1∶0.1～50。在具体实施例中，列举了人参总次苷∶灰树花多糖＝1∶4。

同样优选的，本发明的组合物为香菇多糖与人参皂苷Rg3的组合。优选重量配比为人参皂苷Rg3∶香菇多糖＝1∶0.1～50。在具体实施例中，列举了人参皂苷Rg3∶香菇多糖＝1∶1。

本发明的组合物只需将所选的真菌多糖与人参次苷按比例混合即可获得。

本发明的组合物可用于制备具有预防肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖、辅助治疗肿瘤、增强免疫力作用或抑制毛细血管增生作用的制剂。

所述肿瘤可为肺癌，肝癌，鼻咽癌，膀胱癌，乳腺癌，脑肿瘤，胃癌，子宫癌，直肠癌，结肠癌，肌肉瘤，卵巢癌，淋巴瘤，甲状腺癌，胰腺癌诸类型的肿瘤。

在使用上述组合物时，是将安全有效量的组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常是约1mg/kg体重～约200mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还进一步公开了一种具有防治肿瘤作用的制剂，它含有安全有效量的前述组合物以及药学上可接受的载体。

所述制剂类型包括但不限于：胶囊剂、片剂、颗粒剂、干预混剂、粉剂、口服液和针剂等。

所述药学上可接受的载体可为天然或合成的一种或多种有机或无机成分，本发明的组合物与其相混合有助于抗体发挥作用。可作为医药学上可接受的载体及其组分的物质包括糖类；纤维素及其衍生物；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂；多元醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂；着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。

将人参次苷和真菌多糖按配比混合均匀后作为活性成分，加入适量辅料按常规工艺制成最终产品。本发明的组合物具有显著的提高机体免疫功能，抑制肿瘤细胞的增殖和毛细血管增生的功能，适用于癌症的预防和治疗，可以用于提高机体的免疫机能和肿瘤的治疗，且疗效明显优于单独使用人参次苷或真菌多糖。

本组合物安全无毒，当人参次生皂苷与真菌多糖的质量比在2∶8时，小鼠的最大耐受量为10g，比氯化钠的安全性(LD₅₀＝4g/kg)还好。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下将举实例说明，但这并不意味是对本发明的限制。

实施例1

取人参次苷提取物(皂苷重量比为1％)10kg和香菇多糖(糖重量比为95％)0.1kg，粉碎成细粉，加入硬脂酸镁0.05kg，混合均匀，灌装胶囊。

实施例2

取人参皂苷Rh2(皂苷重量比为90％)0.1kg和姬松茸多糖(糖重量比为10％)50kg，粉碎成细粉，加入微晶纤维素10kg、羧甲基淀粉钠2kg，混合均匀，湿法制粒，干燥，加滑石粉2kg、硬脂酸镁0.3kg，按常规片剂制备工艺制成片剂。

实施例3

取绣球菌多糖(糖重量比为30％)10kg和人参皂苷元Ppd(苷元重量比为80％)1kg，粉碎成细粉，加入微晶纤维素2kg、羧甲基淀粉钠0.2kg，混合均匀，湿法制粒，干燥，加硬脂酸镁0.1kg，按常规颗粒剂制备工艺制成颗粒剂。

实施例4

取人参二醇组次苷(皂苷重量比为90％)0.2kg和樟芝多糖(糖重量比为50％)10kg用纯水溶解，过滤，按常规工艺灌装成口服液。

实施例5

取灰树花多糖(糖重量比为40％)40kg和人参总次苷(皂苷重量比为80％)10kg，粉碎成细粉，加入硬脂酸镁0.3kg，混合均匀，分装成散剂。

实施例6

取注射用香菇多糖(糖重量比为99％)1kg和注射用人参皂苷Rg3(皂苷重量比为99％)1kg，用10L注射用水溶解，过滤，按常规冻干工艺灌装成粉针剂。

实施例7人参次苷与真菌多糖组合物延长S180小鼠生存期实验

1.材料与方法

1.1材料

药物：真菌多糖为灰树花多糖(糖重量比为40％)，批号060308，购自浙江方格药业有限公司；人参总次苷(皂苷重量比为80％)，批号为060206，采用酸水解工艺自制；取上述灰树花多糖与人生总次苷，按实施例5方法配制而成，即为灰树花多糖与人参总次苷组合物，批号为060501；环磷酰胺(CTX)，200mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号06012321。

实验动物和细胞系：昆明种小鼠，雌性，体重18±2g，由中国科学院上海实验动物中心提供。Sarcoma 180腹水型瘤株(S180)，购自中国科学院上海药物研究所。

1.2方法

瘤种保存与传代：自腹腔荷瘤小鼠无菌取瘤细胞，经灭菌生理盐水(NS)稀释后无菌操作接种于正常成年小鼠腹腔，每7天传1代。

荷瘤模型制作方法：处死腹腔传代7天的S180荷瘤小鼠，无菌操作取腹水。灭菌NS稀释腹水调整瘤细胞浓度至8×10⁶个/ml，瘤细胞死亡率＜5％。按无菌操作要求将瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔，0.2ml/只。

腹腔荷瘤生存期实验：80只小鼠，除10只用于正常对照组外，其余均腹腔荷瘤，次日随机分为7组，每组10只。分组包括腹腔荷瘤模型组；CTX治疗组；联用治疗组：CTX+灰树花多糖人参总次苷组合物低、中、高剂量组；CTX+灰树花多糖组；CTX+人参总次苷组。各组都在腹腔荷瘤次日起灌胃(i.g.)给药，每天一次，每次给药0.1ml/10g。CTX为腹腔注射(i.p.)给药，50mg/kg，连用7天；灰树花多糖人参总次苷组合物低、中、高剂量分别为250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg；人参总次苷组为200mg/kg、灰树花多糖组800mg/kg，用至死亡前1天。观察生存期和一般情况。

统计学处理：计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2.结果

与CTX联用，灰树花多糖人参总次苷组合物中、高剂量组能显著延长S180小鼠生存期，灰树花多糖人参总次苷组合物低剂量组、灰树花多糖组、人参总次苷组都具有延长S180小鼠生存期的趋势，但是无显著性差异。且灰树花多糖人参总次苷组合物有剂量依赖趋势，剂量高效果显著，结果见表1。

表1灰树花多糖人参总次苷组合物对S180腹腔荷瘤小鼠生存期的影响(n＝10，x±s)

^△与CTX组比较

实施例8人参次苷与真菌多糖组合物对S180皮下荷瘤小鼠的抑瘤实验

1.材料与方法

1.1材料

药物：真菌多糖为灰树花多糖(糖重量比为40％)，批号060308，购自浙江方格药业有限公司；人参总次苷(皂苷重量比为80％)，批号为060206，采用酸水解工艺自制；取上述灰树花多糖与人生总次苷，按实施例5方法配制而成，即为灰树花多糖与人参总次苷组合物，批号为060501；环磷酰胺(CTX)，200mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号06012321。

实验动物和细胞系：昆明种小鼠，雌性，体重18±2g，由中国科学院上海实验动物中心提供。Sarcoma 180腹水型瘤株(S180)，购自中国科学院上海药物研究所。

1.2方法

瘤种保存与传代：自腹腔荷瘤小鼠无菌取瘤细胞，经灭菌生理盐水(NS)稀释后无菌操作接种于正常成年小鼠腹腔，每7天传1代。

荷瘤模型制作方法：处死腹腔传代7天的S180荷瘤小鼠，无菌操作取腹水。灭菌NS稀释腹水调整瘤细胞浓度至8×10⁶个/ml，瘤细胞死亡率＜5％。按无菌操作要求将瘤细胞悬液接种于右前肢腋下皮下，0.2ml/只。

对皮下荷瘤鼠的实验观察：80只小鼠，除10只用于正常对照组外，其余均皮下荷瘤，次日随机分为7组，每组10只。分组包括皮下荷瘤模型组；CTX治疗组；联用治疗组：CTX+灰树花多糖人参总次苷组合物低、中、高剂量组；CTX+灰树花多糖组；CTX+人参总次苷组。各组都在腹腔荷瘤次日起灌胃(i.g.)给药，每天一次，给药剂量0.1ml/10g。CTX为腹腔注射(i.p.)给药，给药剂量30mg/kg，连用7天；灰树花多糖人参总次苷组合物低、中、高剂量分别为250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg；人参总次苷组为200mg/kg；灰树花多糖组800mg/kg，用至处理前1天，于皮下荷瘤后第12天处理。用药过程观测一般情况。各批次动物处理时，先称体重，处死后取瘤、胸腺、脾脏并称重，进而换算出抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数；另取右后肢股骨做骨髓有核细胞(BMNC)计数。

统计学处理：计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2.结果

CTX组、与CTX联用的灰树花多糖人参总次苷组合物小、中、高剂量组、灰树花多糖组和人参总次苷组均能抑制S180的生长。其中CTX组抑瘤作用显著；与CTX联用时，灰树花多糖人参总次苷组合物小剂量组、灰树花多糖组和人参总次苷组的抑瘤作用显著，灰树花多糖人参总次苷组合物中、高剂量组的抑瘤作用极显著。联用CTX时，灰树花多糖人参总次苷组合物比灰树花多糖组或人参总次苷组更能促进胸腺指数、脾脏指数的回升。灰树花多糖人参总次苷组合物对荷瘤与CTX协同所致的骨髓有核细胞的减少都有明显的促进回升作用，且剂量越大回升作用越强。结果见表2、3。由此可见，人参次苷与真菌多糖组合物的活性明显高于单用人参次苷或真菌多糖。

表2灰树花多糖人参总次苷组合物对皮下荷瘤小鼠的抑瘤作用(n＝10，x±s)

^*与对照组比较，^△与CTX组比较。

表3灰树花多糖人参次苷组合物对皮下荷瘤小鼠免疫器官和骨髓有核细胞数的影响(n＝10，x±s)

^*与对照组比较，^△与CTX组比较。

实施例9真菌多糖与人参次苷组合物对小鼠B16-BL6细胞自发性肺转移的抑瘤实验

1.材料与方法

1.1材料

药物：真菌多糖为香菇多糖(糖重量比为99％)，批号060304，购自福洲梅峰制药厂；人参次苷RG3(皂苷重量比为99％)，批号为060201，购自同田生物技术有限公司；取上述香菇多糖与人参次苷RG3，按实施例6方法配制而成，即为香菇多糖人参次苷RG3组合物060601；环磷酰胺(CTX)，200mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号06012321。

实验动物和细胞系：C57BL/6小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞高转移株，购自中国科学院上海药物研究所。

1.2方法

荷瘤模型制作方法：将生长状态良好的B16-BL6细胞用0.25％胰蛋白酶消化，离心收集细胞，无菌PBS洗涤，用无菌生理盐水配制成1×10⁷个/ml细胞悬液。

实验观察：120只小鼠，分成正常组；荷瘤对照组；紫杉醇治疗组；香菇多糖人参次苷RG3组合物低、中、高剂量组；香菇多糖组；人参次苷RG3组，共8组，每组15只。正常组外，其余每只小鼠后肢爪垫皮下接种50μl(含5×10⁵个瘤细胞)。各组都在荷瘤次日起腹腔注射给药，每周5次，连续5周，每次给药0.1ml/10g。紫杉醇的剂量为10mg/kg；香菇多糖人参次苷RG3组合物低、中、高剂量分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg；人参次苷RG3组和香菇多糖组的剂量各为100mg/kg。接种瘤液后3周，当瘤体≥10mm³时，将小鼠用乙醚麻醉，无菌条件下切除患肢。2周后处死动物，解剖取肺，称重，计算肺系数。将肺Bouins液固定，于解剖显微镜下计数肺转移结节数。采用Mann Whithey U-检验进行统计学处理。

2实验结果

紫杉醇和香菇多糖人参次苷RG3组合物高、中剂量组对小鼠B16-BL6细胞自发性肺转移具有显著抑制作用，香菇多糖人参次苷RG3组合物低剂量组、香菇多糖组和人参次苷RG3组对小鼠细胞自发性肺转移具有抑制趋势，但无显著性差异，结果见表4。

表4香菇多糖人参次苷RG3组合物对小鼠B16-BL6细胞自发性肺转移的抑制作用

Claims (9)

1.一种具有抗肿瘤作用的组合物，由人参次苷和真菌多糖组成，所述真菌多糖为灰树花多糖或香菇多糖，所述人参次苷为人参总次苷或人参皂苷RG3。

2.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述人参次苷与真菌多糖的重量比为1∶(0.01-500)。

3.如权利要求2所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述人参次苷与真菌多糖的重量比为1∶(0.1-50)。

4.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述人参总次苷中皂苷含量为50％-95％。

5.如权利要求1所述具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述真菌多糖是以真菌为原料，采用热水提取、乙醇沉淀、超滤、葡聚糖凝胶过滤及DEAE纤维素柱层析中的一种或几种方法制备得到的糖含量为10％-99％的真菌多糖。

6.如权利要求5所述具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述真菌多糖中的糖含量为50-95％。

7.如权利要求1-6任意一项所述的组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于制备具有预防肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖、辅助治疗肿瘤、增强免疫力作用或抑制毛细血管增生作用的制剂。

8.一种具有抗肿瘤作用的制剂，它含有安全有效量的权利要求1-6任意一项所述的具有抗肿瘤作用的组合物以及药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述具有防治肿瘤作用的制剂，其特征在于，所述制剂类型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、干预混剂、粉剂、口服液或针剂。