CN107737146B - 竹节参片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

竹节参片及其制备方法，属于医药技术领域。取部分竹节参超微粉在水中浸泡后，将滤液和药渣分离；将羟丙基甲基纤维素在滤液中溶解后，得粘合剂；搅拌条件下将粘合剂喷洒在乳糖、预胶化淀粉、另一部分竹节参超微粉和药渣的混合料中，制得软材，再经过筛、干燥、与硬脂酸镁混合后压片。取得富含三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3等营养成分的竹节参片，具有携带和服用方便的特点。具有活血化瘀、止血止痛，强身健体；增强免疫力和抗疲劳等作用。

Description

竹节参片及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域。
背景技术
竹节参( Panax japonicas C. A. M ey)为五加科( Araliaceae) 人参属(Panax) 植物，其根入药，中国药典各版对其都有记载，传统药性：甘、微苦、温，主要用于病后虚弱，劳嗽咳血，咳嗽痰多，跌打损伤。自古有人参补气第一，三七补血第一之说，而竹节参两者兼备，既有类似人参的滋补强壮作用，又有类似竹节参的散瘀止痛、止血祛痰作用，但却未像同属五加科人参属的人参（P. ginseng）、西洋参（P.quinquefolius）和三七（P.notoginseng）那样广泛应用。
近年来的民间调研和中医临床用药处方整理发现该药的药用价值不仅活血止血、提高免疫力；对身虚头痛、血疲头痛、老年性头痛和风湿性关节炎等都有非常好的疗效。
近期我们对野生竹节参用原子吸收法测定含硒量每kg高达3.9178mg；对人体有益的铁、锰、锌含量都较栽培三七为高；高效液相色谱定量结果人参皂苷Rg3含量高达0.8231%，而三七不含有人参皂苷Rg3这一抗癌有效成分；高效液相色谱同时检测出竹节参中含有较高的三七皂苷R1，人参皂苷Re，人参皂苷Rb1 人参皂苷Rd，人参皂苷Rg1。
发明内容
为了扩大五加科人参属药用植物的有效利用资源，本发明提出一种竹节参片。
本发明有效成份三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3至少分别占竹节参片总质量的0.16%、1.16%、0.95%、0.06%、1.62%、0.21%。
本发明制备的竹节参片的脆碎度、崩解度、溶出度均符合《中国药典》2015 版片剂项下质量要求。其中富含三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3等营养成分，具有携带和服用方便的特点。具有活血化瘀、止血止痛，强身健体；增强免疫力和抗疲劳等作用。
本发明另一目的是提出以上产品的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1）将竹节参超声清洗后干燥、粉碎，得竹节参超微粉；
2）取部分竹节参超微粉在水中浸泡后，将滤液和药渣分离；
3）将羟丙基甲基纤维素在滤液中溶解后，得粘合剂；
4）搅拌条件下将粘合剂喷洒在乳糖、预胶化淀粉、另一部分竹节参超微粉和药渣的混合料中，制得软材；
5）将软材过筛，取得湿颗粒；
6）将湿颗粒干燥；
7）将干燥的颗粒与硬脂酸镁混合后压片。
竹节参民间多打粉服用，粉末状竹节参因吸附空气漂浮在上不易被水润湿，干粉常进入食道或气道引起剧烈咳嗽，制备片剂可克服此项不足，携带贮存方便，耐受性好。
竹节参根木质化程度较高，根皮纤维含皂苷等多类有效成分但常规粉碎细度有限，压片后膨胀率大，压不成型；经气流粉碎获得的超微粉，粒径达纳米级，膨胀率降低；同时细胞破壁，内容物充分暴露，利于药效成分在有限体液中的溶出；配以适当辅料造粒后，可以制备出符合质量要求的片剂。
竹节参根表面纹理的泥土常规方法不易去除；采用超声清洗的方法省时省力，洁净效率高。
乳糖是片剂常用填充剂，组方用含有一分子结晶水的乳糖（α-乳糖，分子量360.3），无吸湿性，可压性好，性质稳定，与大多数药物不起化学反应。
预胶化淀粉属多功能辅料，也是片剂常用填充剂，具有良好的流动性、可压性、自身润滑性和干粘性、崩解性。
因竹节参粉木质纤维含量高不易粘合，故选用粘合力强的羟丙基甲基纤维素（HPMC）做粘合剂使用，常用浓度2%～5%。
本发明采用部分竹节参超微粉的水提液代替常水做HPMC溶剂的优点：一是溶出的有效成分先行释药可以先行发挥疗效，与后续有限体液使粉末药材溶出药效成分接续；二是溶解在提取液中的蛋白质、多糖的水溶粘性物质使HPMC溶解速度变慢，利于其溶解完全，对HPMC也有增粘作用；湿润的药渣容易与其他物料干粉混合均匀同时赶除吸附在干粉中的空气，利于被粘合剂润湿，制备出湿度适宜的软材。
乳糖、预胶化淀粉和HPMC都是亲水性物质，都有利于片剂的胃肠道润湿崩解和药效成分溶出。为了增加颗粒的流动性和防止粘冲，加入疏水性润滑剂硬脂酸镁。
本发明制备工艺合理，方便工业化生产，取得的产品稳定性好。
进一步地，本发明所述步骤1）中干燥的环境温度为85℃。竹节参药味浓郁，说明其含有易挥发性成分，低温干燥时间过长和高温干燥都将造成挥发性及对热不稳定成分损失，经实验考察确定85℃可以达到比较好的干燥效果，且有效成份流失小。
所述步骤2）中，用于浸泡的竹节参超微粉的粒径<500nm，浸泡用水的温度为50℃，浸泡时间为0.5～1小时。采用该粒径的竹节参超微粉粒径达纳米级，膨胀率降低；同时细胞破壁，内容物充分暴露，利于药效成分在有限体液中的溶出；配以适当辅料造粒后，可以制备出符合质量要求的片剂。本发明采用一次短时提取工艺，如温度过低，则提取效率不高，而如温度过高，会使药材中淀粉类物质糊化增加粘性，不利于对HPMC的溶解。如时间过长纤维类成分吸水膨胀过度也不利于下一步的混合干燥工艺的进行。经预实验考察，一定水量50℃，浸泡0.5～1小时可达到理想使用效果。
所述步骤3）中，先在滤液温度为80℃～90℃的条件下进行羟丙基甲基纤维素的浸泡1～2小时，然后将滤液降至室温温度搅拌均匀。由于羟丙基甲基纤维素溶于冷水，而不溶于热水。据此，制备羟丙基甲基纤维素水溶液时，将其置于80℃～90℃热水中，使其缓缓分散与水化，冷却后搅拌可溶解完全；若直接用冷水溶解，则因溶解速度过快，在颗粒表面形成胶粘层，阻止水分渗透，造成溶解不完全，影响使用。另外在溶解初期也不宜进行搅拌，因高分子材料溶解初期是大分子链舒展扩散的缓慢过程，此过程不可采取加速措施，搅拌会缠绕成团不利于扩散；经过1～2小时的浸泡，会确保高分子链充分舒展和扩散，此时再实施搅拌可得均匀溶解液。
所述步骤 4）中，先将乳糖、预胶化淀粉和竹节参超微粉混合均匀，再混入药渣，然后喷洒粘合剂。干粉需先行混合然后再与湿药渣混合才能混合得均匀，如果乳糖、预胶化淀粉和竹节参超微粉的其中任何一种干粉先行和湿药渣混合，在一定的混合时间湿药渣粘上少量的任何一种干粉都不可能均匀混合，而且乳糖的溶解和进一步渗透进湿药渣还会增加乳糖分散的不均匀性，预胶化淀粉对湿药渣的先行粘附或成团也不利于混合。乳糖和预胶化淀粉与竹节参超微粉都是干粉很容易混合均匀，再与湿药渣混合不会出现明显的溶解和渗透粘附，混合效率高。
所述步骤 6）中，干燥的环境温度为60～65℃。经实验考察，湿颗粒在60～65℃鼓风干燥约3小时，含水分3%左右，压片符合各项要求。颗粒中含适量的水分可增加药物粒子的可塑性，减小弹性防止裂片；另外，颗粒中的水分存在于孔隙中，而孔隙则联接成毛细管，当颗粒受压时，毛细管中的水分被挤出来，并在颗粒的表面形成薄膜状，可以减少颗粒间及颗粒与模圈壁之间的摩擦力，可使颗粒排列的更紧密，结合力大；还可使压力传递更好，压力分布均匀，所以片剂的硬度较大，根据竹节参超微粉压片特性，经实验确认颗粒水分含量控制在3%左右，压出的片剂硬度适宜。
所述步骤 7）中，将混合物过16目筛整粒后再压片。考虑到是植物药材粉末压片，属于较大较重片，同时经过实验验证，16目筛制备的较大颗粒比较适宜本药材压片；干燥后颗粒虽然变小，但为防止干颗粒破碎，造成细分较多，仍采用16目筛整粒，即拆分了粘结颗粒团，也保证绝大部分颗粒的完整和均匀性，压制片剂时空气排出较顺畅，有效防止裂片。
所述竹节参片的制备方法，其特征在于所述竹节参超微粉、乳糖、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素和硬脂酸镁的投料比为2∶1∶1∶0.015～0.02∶0.025～0.03。从成型和经济两方面考虑，经反复实验确定以上投加量的乳糖压成的竹节参片光洁美观，硬度适中，符合片剂各项质量要求。采用以上投加量的预胶化淀粉压成的竹节参片符合片剂各项质量要求。采用以上投加量的硬脂酸镁可使压片后片面光滑美观，片子的崩解和药效成分溶出都符合要求。并且，采用以上用料，取得的药片中药效成分质量百分含量可达：三七皂苷R1≥0.1%，人参皂苷Re≥1.0%，人参皂苷Rb1≥0.9%，人参皂苷Rd≥0.05%，人参皂苷Rg1≥1.6%，人参皂苷Rg3≥0.2%。
附图说明
图1为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3混合标准品溶液紫外-可见（200～600nm）光谱扫描图。
图2为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd混合标准品高效液相色谱图。
图3为测定竹节参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd含量高效液相色谱图。
图4为人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱图。
图5为测定竹节参片中人参皂苷Rg3含量高效液相色谱图。
图6为竹节参片溶出度曲线。
图7为大鼠空白血浆HPLC分析结果。
图8为人参皂苷Rg3对照品溶液加入大鼠空白血浆混合进样HPLC分析结果。
图9为灌胃给予竹节参片后大鼠血浆HPLC分析结果。
图10为灌胃给予参一胶囊后大鼠血浆HPLC分析结果。
图11为竹节参片及市售参一胶囊同样人参皂苷Rg3量给药后，在大鼠血浆中药物浓度-时间均数对比曲线。
具体实施方式
一、竹节参片的制备：
1、竹节参超微粉的制备：
将竹节参根加水超生清洗三次，15分钟/次；沥干后85℃鼓风干燥6小时，干燥至可用手掰断为止。
将以上干燥的竹节参根经江阴市新友机械制造有限公司生产的WF80 型万能粉碎机粗粉碎后，再用四川丰能粉体设备厂生产的FNQ-110型气流粉碎机超微粉碎，取得竹节参超微粉。
经英国马尔文仪器有限公司ZEN 3690 型激光粒度测定仪检测，竹节参超微粉的平均粒径为169.2nm。
2、竹节参片的制备：
称取竹节参超微粉0.67kg，加二倍质量50℃水，搅拌浸泡0.5～1小时。
然后以三层纱布滤出药渣，备用。
滤液热至85℃后将0.02kg的羟丙基甲基纤维素加入其中，放置1～2小时，待滤液温度降至室温搅拌均匀，得粘合剂。
将1kg乳糖、1kg预胶化淀粉和1.33kg竹节参超微粉混合过60目筛三遍，置于混合机中混合10分钟，再加入滤出的药渣，继续混合20分钟；在快速搅拌下喷洒粘合剂，混合均匀取得软材，该软材轻握成团、轻压即散。
将制好的软材过16目筛整粒后制成湿颗粒。
将制好的湿颗粒置烘房，于60～65℃鼓风干燥约3小时，测定水分含量约3%。
将干燥好的颗粒加入0.03kg硬脂酸镁，过16目筛网整粒并混合均匀，压制成片。
二、竹节参片的质量检验：
1、竹节参片的外观性状：
制备的竹节参片呈均匀浅棕色，且表面光滑，无杂斑，无异物，硬度适中，大小均一。
2、竹节参片的片重差异：
取竹节参片20片，精密称定总重量为10.268g，计算平均片重为0.5431g。再分别精密称定每片的重量，重量差异限度（%）=（片重–平均片重）÷平均片重×100%，结果见下表。
Figure 362713DEST_PATH_IMAGE001
由以测定和上表计算结果可知，重量限度差异没有超出±5%，符合《中国药典》2015版的规定。
3、竹节参片的硬度：
取10片竹节参片，分别用上海黄海药检仪器有限公司生产的YPD-300DE型硬度仪测定其硬度，结果见下表。
（单位：kg）
Figure 843635DEST_PATH_IMAGE002
测定结果显示：竹节参片的硬度均超过5kg，符合《中国药典》2015版中药片剂项下规定。
4、竹节参片的脆碎度：
取10片竹节参片，精密称定平均片重为0.5465g，将其置于上海黄海药检仪器有限公司生产的CJY-300C型片剂脆碎度检测仪的圆筒中，4min转动100次，取出观察均无裂片或碎片，然后用吹风机吹去粉末，精密称定平均片重为0.5456g，减失重量为0.16%，符合《中国药典》2015版片剂项下脆碎度应小于1%的规定，测定结果见下表。
Figure 420110DEST_PATH_IMAGE003
5、竹节参片的崩解时限：
取6片竹节参片，分别置于上海黄海药检仪器有限公司生产的SY-3D片剂四用仪中的崩解时限测定装置中，测定其崩解时限，结果见下表。
Figure 612057DEST_PATH_IMAGE004
由上表可见：竹节参片均在15min之内崩解，符合《中国药典》2015版片剂项下常释片崩解度要求。
6、竹节参片的薄层色谱定性鉴别：
6.1供试品溶液的制备：
取竹节参超微粉称重为0.5524g，另取1片竹节参片称重为0.5465g，研碎；分别加甲醇10ml振摇，放置10min滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使其溶解。
6.2对照品溶液的制备：
取三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1对照品均0.1mg，分别加1ml甲醇使溶解；取人参皂苷Rg3对照品0.1mg，加1ml甲醇使溶解。
6.3薄层层析：
分别吸取竹节参超微粉、竹节参片供试品溶液和三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷、甲醇和水（体积比为7︰3︰0.5）的混合溶剂为展开剂，滴加2滴冰醋酸并混匀后进行薄层层析，当展开剂到达预定前沿位置时停止展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加热至斑点显色清晰，同时置于365nm紫外灯下检视。可见竹节参超微粉和竹节参片的薄层层析行为完全一致，点样原点展开后都呈现明显的11个斑点，其中有一个斑点与三七皂苷R1的斑点展开距离完全一致，Rf值都为0.40；另有一个斑点与人参皂苷Rb1的斑点展开距离完全一致，Rf值都为0.19；还有一个斑点与人参皂苷Rg1的斑点展开距离完全一致，Rf值都为0.58。由此鉴别出竹节参超微粉和竹节参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1的存在。
分别吸取竹节参超微粉、竹节参片供试品溶液和人参皂苷Rg3对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇、乙酸乙酯和水（体积比为4︰1︰5）的混合溶剂为展开剂，滴加2滴冰醋酸并混匀后进行薄层层析，当展开剂到达预定前沿位置时停止展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加热至斑点显色清晰，同时置于365nm紫外灯下检视，可见竹节参超微粉和竹节参片的薄层层析行为完全一致，点样原点展开后都呈现明显的9个斑点，其中有一个斑点与人参皂苷Rg3的斑点展开距离完全一致，Rf值都为0.3472。由此鉴别出竹节参超微粉和竹节参片中人参皂苷Rg3的存在。
以上各个层析结果显示：供试品与对照品相应的位置上，出现相同色光的斑点，证明含有相应同一化合物。选定三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1、Rg3为定性鉴别指标是根据竹节参、三七、人参中所含药效成分以及薄层展开条件等确定的，能够很好的显示鉴别结果。
7、高效液相色谱法测定竹节参片中皂苷成分含量：
7.1药效指标成分选择：
三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd是竹节参和三七的共有成分，Rg3是竹节参和人参的共有成分，功效作用明确，故选其作为药效指标成分进行含量测定。
7.2对照品溶液和供试品溶液的制备：
精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3对照品各0.1mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇︰水=7︰3定容至刻度，50℃超声20min使溶解，得浓度为0.01mg/mL的对照品溶液待用。
取10片竹节参片，研碎后精密称取平均片重量为0.5507g，加甲醇︰水=7︰3溶液10ml，混匀50℃超生15分钟滤至10ml容量瓶中，定容至刻度待测。
7.3检测波长的确定：
精密量取7.2项下制备的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3对照品溶液各1ml，混匀后用上海合利仪器有限公司生产的UV3900型紫外仪在200～600nm范围进行光谱扫描，结果见图1。
图1中：横坐标表示波长，单位：纳米（nm）；纵坐标表示吸收度（缩写符号Abs)；图1显示上述混标溶液在203nm处有最大吸收，由此确定液相色谱定量检测波长为203nm。
7.4色谱条件：
色谱柱：Symmetry C18（填料5μm，柱4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱：
人参皂苷Rg3的含量测定，洗脱梯度是：0～10min，46%～55%乙腈；10～15min，55%乙腈；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量测定，洗脱梯度是：0～5min，15%～20%乙腈；5～30min，20%～23% 乙腈；30～50min，23%～40%乙腈；50～60min，40%乙腈；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：203nm；进样量：40μl。
7.5标准方程的计算：
精密配制0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/ml系列浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3溶液，分别注入高效液相色谱仪，以浓度C对峰面积S进行线性回归，结果表明，在0.025~1.6mg/ml浓度范围内，各皂苷浓度与峰面积线性关系良好。
回归方程依次为：
三七参皂苷R1是S=996732C+56432（R2=0.9922）。
人参皂苷Rg1是S=106C–19703（R2=0.9995）。
人参皂苷Re是S=914362C+3737（R2=0.9936）。
人参皂苷Rb1是S=2×106C–60727（R2=0.9999）。
人参皂苷Rd是S=106C–13115（R2=0.9971）。
人参皂苷Rg3是S=106C–49912（R2=0.9926）。
7.6精密度试验：
精密吸取7.2项下配制的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3对照品溶液，按7.4色谱条件重复进样5次，记录其峰面积，计算结果表明该方法精密度良好，见下表。
Figure 223167DEST_PATH_IMAGE005
以上RSD为相对标准偏差。
7.7稳定性试验：
定量吸取7.2项下制备的同一浓度三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3对照品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、48 h不同的时间间隔按7.4色谱条件进样，记录其峰面积，结果表明48 h内各皂苷溶液稳定性良好。见下表。
Figure 734045DEST_PATH_IMAGE006
7.8加样回收率试验（以Rg3为考察指标）：
精密吸取已知含量的同一批9份竹节参片供试品溶液各 1 mL，分为低、中、高3组，分别加入7.2项下配制的人参皂苷Rg3对照品溶液0.2 ml、0.3ml、0.5 ml制备样品溶液，混匀，按7.4条件注入液相色谱仪，分别重复进样三次，记录其峰面积，计算RSD值，结果显示，加样回收率平均值为99.82%，RSD=1.67%，高、中、低三个浓度的回收率符合含量测定要求，表明该方法加样回收率良好，见下表。
Figure 797816DEST_PATH_IMAGE007
7.9竹节参片中皂苷类指标成分含量测定：
分别称取3份竹节参片各7片，平均片重分别为3.7695g、3.8364g、3.7329g，置于100ml的容量瓶中，用甲醇和水的7︰3体积比混合形成的水溶液定容至100ml，50℃超声处理20min，静置后，定量吸取上清液，0.45 μm膜滤过，按7.4条件注入液相色谱仪，测得峰面积，代入7.5项下标准方程，计算竹节参片中皂苷成分含量，结果见图2～5。
图2为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd混合标准品溶液高效液相色谱图，洗脱梯度是：0～5min，15%～20%乙腈；5～30min，20%～23% 乙腈；30～50min，23%～40%乙腈；50～60min，40%乙腈，出峰时间分别为：三七皂苷R1是21.952min、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd顺序为26.892、27.842、47.500、52.011min。
图2中横坐标是出峰时间，单位为分钟（min）；纵坐标是吸收度 (缩写符号AU)。
以下其它高效液相色谱图的纵横坐标相同。
图3为竹节参片供试品溶液高效液相色谱图，洗脱梯度是：0～5min，15%～20%乙腈；5～30min，20%～23% 乙腈；30～50min，23%～40%乙腈；50～60min，40%乙腈，出峰时间分别为：三七皂苷R1是22.032min、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd顺序为26.959、27.886、47.501、52.051min。
图4为人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱图，洗脱梯度是：0～10min，46%～55%乙腈；10～15min，55%乙腈，人参皂苷Rg3在保留时间9.268min位置呈现色谱峰。
图5为测定竹节参片中人参皂苷Rg3含量高效液相色谱图，洗脱梯度是：0～10min，46%～55%乙腈；10～15min，55%乙腈，保留时间9.510min位置呈现的色谱峰归属于竹节参片中的人参皂苷Rg3。
标准样品对照法定量计算出竹节参片中皂苷类药效成分的质量百分含量为：三七皂苷R1：0.4700%、人参皂苷Re：3.0460%、人参皂苷Rb1：2.0888%、人参皂苷Rd：0.0921%、人参皂苷Rg1：2.5109%、人参皂苷Rg3：0.2698%。
8、竹节参片溶出度测定：
8.1 吸收度A值的测定：
取竹节参片20片，精密称定，计算平均片重为0.5425；将药片研成细粉状，再精密称取相当于平均片重6倍量（为使吸光度值在0.3~0.7误差较小的测量范围内）的W片粉 =3.2555；置250ml锥形瓶中，定量加入0.1mol/L盐酸溶液250ml，摇匀，置37℃水浴超生20min，经0.45μm滤膜滤过后于紫外分光光度计0.1mol/L盐酸为空白溶液，203nm波长处测定吸收度A片粉= 0.6182。
8.2样品的测定：
取6片竹节参片，总片重为W样品，其对应100%溶出的吸收度理论值为A理论，用上海黄海药检仪器有限公司生产的RCZ-683型溶出度仪，桨叶法测定，37℃0.1mol/L盐酸溶液250ml为溶出介质，转速为100r/min，分别在5、10、15、20、30、40、50和70min 取溶出液5ml滤过，0.1mol/L盐酸溶液为空白，203nm波长处测定吸收度Ai（i为1～7），计算累积溶出量：
Figure 793454DEST_PATH_IMAGE008
取样测定三次取平均值绘制溶出度曲线，结果见图6。
图6中A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7分别代表在5、10、15、20、30、40、50和70min时取样测定的溶出液吸收度，由测定的吸收度按累积溶出量计算公式可计算出药物在各时间点的累计释放百分比。
由图6可见：在竹节参片投入溶出杯15分钟后，药物溶出已达80%以上，符合常释片释药量要求；20分钟后溶出曲线逐渐趋于平顶，释药基本完全。
三、本发明竹节参片与市售参一胶囊的生物等效性考察：
1、大鼠灌胃给药后血药浓度考察：
由扬州大学比较医学研究院省级实验动物中心提供的SD大鼠12只（280±20g），公母各半，随机分为两组，每组9只，禁食不禁水18h。大鼠灌胃给药，给药剂量为330mg/kg。受试制剂组给予自制竹节参片，参比制剂组给予与竹节参片受试制剂组同样人参皂苷Rg3含量的市售参一胶囊（吉林亚泰制药股份有限公司生产，每粒胶囊含人参皂甙Rg3 10mg），分别于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、24眼眶静脉丛取血，将全血置于肝素管中，于3000r/min离心15min，取上清液0.3ml，将上清液置于1.5ml离心管中，加入乙腈0.6ml，涡旋混合2min，于3000r/min离心15min，吸取上清液，用0.45μm滤膜过滤，滤液按7.4项下色谱条件进样，流动相洗脱梯度为：0～10min，46%～55%乙腈；10～15min，55%乙腈，结果见图7～10。
图7为空白血浆HPLC分析结果。
由图7可见：在保留时间8分钟以后没有色谱峰，预计血浆中内源性物质对人参皂苷Rg3的测定无干扰。
图8为人参皂苷Rg3对照品溶液定量加入大鼠空白血浆混合进样HPLC分析结果。由图8可见：保留时间9.325分钟有一色谱峰，此为人参皂苷Rg3的流出时间。
图9为灌胃给予竹节参片后大鼠血浆HPLC分析结果。由图9可见：保留时间9.286分钟有一色谱峰，归属竹节参片中人参皂苷Rg3所为。
图10为灌胃给予参一胶囊后大鼠血浆HPLC分析结果。由图10可见：保留时间9.540分钟有一色谱峰，归属参一胶囊中人参皂苷Rg3所为。
根据7.5项下标准方程，将测得的Rg3峰面积折算成浓度，结果均以平均值±SD表示，采用DAS 2.0软件在生物等效性项下，对大鼠体内的药动学数据进行拟合处理，求出相关药代动力学参数，对评价生物等效性的药代动力学参数AUC0-t 和Cmax作对数转换。
目前生物等效检验的唯一标准是双单侧t检验及（1-2α）%置信区间法，本实验采用药动学处理软件DAS2.0对结果进行分析，在生物等效性项下，将两种待比较制剂的Cmax和AUC分别取对数后，进行不同样品间的方差分析。用90%置信区间的双单侧t检验法对自制竹节参片和市售参一胶囊在大鼠体内的生物等效性进行统计分析，评价两制剂间的生物等效性。依据2015版中国药典中生物等效性评价标准：经对数转换后，受试制剂的AUC在参比制剂的80%~125%，受试制剂的Cmax在参比制剂的 70%~143%，则两制剂生物等效。
大鼠灌胃自制竹节参片和市售参一胶囊后，分别于0.5、1 、2 、3 、4 、6 、8 、12 、16 、24 h眼眶静脉丛取血，处理进样。将测得的峰面积按7.5项下标准方程，折算成不同时间点血药浓度，结果见表以下两表。
自制竹节参片大鼠给药后的血药浓度（A药）
Figure 259070DEST_PATH_IMAGE009
市售参一胶囊大鼠给药后的血药浓度（R药）
Figure 550636DEST_PATH_IMAGE010
2、数据处理：
将大鼠灌胃后各时间点Rg3药时数据用DAS 2.0软件在生物等效性项下方法进行处理，经模型拟合，得到自制竹节参片及市售参一胶囊给药后在大鼠血浆中药物浓度-时间均数对比曲线，结果见药代动力学参数表10～11。
表10 大鼠血浆中Rg3的药动学参数(平均值±标准差，n=6)
Figure 101703DEST_PATH_IMAGE011
表11 大鼠单剂量灌胃本发明制备的竹节参片（A药）和市售参一胶囊（R药）后的Cmax比值A/R和相对生物利用度（A︰R）
Figure 760087DEST_PATH_IMAGE012
3、生物等效性评价：
3.1方差分析：
对两种制剂的Cmax 、AUC0-t、AUC0-∞进行对数转换后，进行方差分析，结果见以下三个分析表所示。
lnCmax的方差分析结果表
Figure 581675DEST_PATH_IMAGE013
lnAUC0-t的方差分析结果表
Figure 808257DEST_PATH_IMAGE014
lnAUC0-∞的方差分析结果表
Figure 846620DEST_PATH_IMAGE015
3.2双单侧t检验及（1-2α）%置信区间：
对两种制剂的双单侧t检验及（1-2α）%置信区间分析，结果见以下各表。
lnCmax的双单侧t检验及（1-2α）%置信区间结果表（A/R）
Figure 918481DEST_PATH_IMAGE016
lnAUC0-t的双单侧t检验及（1- 2α）%置信区间结果表（A︰R）
Figure 358689DEST_PATH_IMAGE017
表17 lnAUC0-∞的双单侧t检验及（1- 2α）%置信区间结果（A︰R）
Figure 992058DEST_PATH_IMAGE018
图11为本发明方法制得的竹节参片及市售参一胶囊与竹节参片同样人参皂苷Rg3量给药后，在大鼠血浆中药物浓度-时间均数对比曲线。由图11可见：竹节参片与参一胶囊血药浓度达峰时间基本一致，血药浓度-时间曲线下面积基本一致，说明直观看两种制剂也具有生物等效性。
四、小结：
本实验对制得的竹节参片进行质量检查，结果显示其在外观性状、重量差异、崩解时限、溶出等方面均符合2015版中国药典的规定，质量可靠。
薄层色谱鉴别条件是参考文献资料和经预实验确定的，如人参皂苷Rg3抗癌疗效确认故选择为鉴别项，但曾尝试与其他皂苷成分在同一条件下鉴别均不理想，故单独鉴别；另外在展开剂中加2滴冰醋酸可有效防止拖尾现象。
高效液相色谱法梯度洗脱等测定竹节参片中皂苷成分含量条件也是参考文献资料和经分别对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3标准品HPLC行为预实验确定的，Rg3与其它皂苷成分同一条件下分离度欠佳，故分开检测。
生物等效性研究实验中，比较药动学参数Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞及相对生物利用度可知，单次给药后，自制竹节参片和市售参一胶囊的血药浓度均快速上升，达峰浓度后缓慢下降。给药后24h内两种药品的血药浓度差别不大，自制竹节参片稍高于市售，两者达峰时间均是3h。依据2015版中国药典《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》，由统计软件方差分析结果可知，药剂间P<0.01，说明两制剂间差异具有统计学意义。双单侧t检验及（1-2α）%置信区间结果显示，A药（本发明制备的竹节参片）和R药（市售参一胶囊）药动学参数lnCmax [1-2α]置信区间为101.3%～102.8%，处于70%～143%范围内，说明在达峰程度上，两种制剂生物等效；lnAUC0-24)的[1-2α]置信区间为101.6%～103.0%，在置信区间80%～125%内，lnAUC0-∞的[1-2α]置信区间为91.3%～93.1%，也在置信区间80%～125%内，说明在吸收方面，两种制剂具有生物等效性。

Claims (1)

1.一种竹节参片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）竹节参超微粉的制备：
将竹节参根加水超声 清洗三次，15分钟/次；沥干后85℃鼓风干燥6小时，干燥至可用手掰断为止，再经粉碎后得到竹节参超微粉；
2）竹节参片的制备：
称取竹节参超微粉0.67kg，加二倍质量50℃水，搅拌浸泡0.5～1小时，然后以三层纱布滤出药渣，备用；
滤液热至85℃后将0.02kg的羟丙基甲基纤维素加入其中，放置1～2小时，待滤液温度降至室温搅拌均匀，得粘合剂；
将1kg乳糖、1kg预胶化淀粉和1.33kg竹节参超微粉混合过60目筛三遍，置于混合机中混合10分钟，再加入滤出的药渣，继续混合20分钟；在快速搅拌下喷洒粘合剂，混合均匀取得软材，该软材轻握成团、轻压即散；
将制好的软材过16目筛整粒后制成湿颗粒；
将制好的湿颗粒置烘房，于60～65℃鼓风干燥3小时，测定水分含量3%；
将干燥好的颗粒加入0.03kg硬脂酸镁，过16目筛网整粒并混合均匀，压制成片得到竹节参片，所述竹节参片的有效成份三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3至少分别占竹节参片总质量的0.16%、1.16%、0.95%、0.06%、1.62%、0.21%。
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