CN114316078A

CN114316078A - 一种海参多糖的制备方法与应用

Info

Publication number: CN114316078A
Application number: CN202011065921.8A
Authority: CN
Inventors: 李振国; 郑顺亮; 李伟; 胡杰文; 南志远; 周剑波; 郭予茜; 李长江; 张凯; 夏珂
Original assignee: HAINAN JIUZHITANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: HAINAN JIUZHITANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种海参多糖的制备方法，其制备方法如下：(1)取干燥海参，粉碎成粗颗粒，加水酶解后，离心取上清液，上清液减压浓缩至原体积的1/5，再离心(离心条件同上)取上清液；上清液经三次盐析醇沉，沉淀再用无水乙醇洗涤两次，挥干乙醇后得海参多糖粗品；(2)将海参多糖粗品用纯水溶解，上阴离子层析柱(OH^‑)，用纯水及梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液；(3)将上述NaCl洗脱液进行超滤脱盐，超滤截留液减压浓缩并冷冻干燥，即为海参多糖。海参多糖可用于制备抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力等药物或保健品，具有预防血栓的功效，对老年人、血栓高风险人群具有良好的辅助预防作用。

Description

一种海参多糖的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种海参多糖及其制备方法与应用。

技术背景

海参是传统滋补中药材，对海参的功效认可度高，但加工方法与服用方法简单而单一，吸收效果不能保障，容易造成营养成分的浪费。

海参是我国传统保健品,具有极高的保健及营养价值,也是海洋功能食品的重要研究对象。海参多糖作为海参的重要活性成分之一,具有抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力等多种生物活性。海参多糖的研究主要集中在海参体壁,体壁多糖包括海参硫酸软骨素(SC-CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)2种组分(张健等，海参多糖制备、化学分析及生物活性研究进展[J]，食品安全质量检测学报，2018，9(08):1730-1736)。

海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)是海参的主要功效成分之一，属于岩藻聚糖硫酸酯类化合物，具有多种生理调节功能，在功能食品的开发方面展现出良好的应用前景。目前关于SC-FUC结构研究的报道仍十分稀少，结构信息的匮乏限制了SC-FUC的深入研究及开发利用。

现有的海参多糖传统提取工艺可分为五类：酸法、碱法、酶法、盐法和热水浸提法等，其基本原理都是根据海产品的特性，改变蛋白的外界环境，从而把多糖分离出来。由于上述方法在提取过程中会使用大量的淡水和酸碱盐，属于高能耗产业，排放的酸碱盐对周围的环境产生一定的生态影响，不符合绿色可持续性经济发展模式，且提取工艺相对粗放。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种结合生物酶解技术、盐析醇沉法、柱层析纯化脱色以及膜分离技术脱盐来提取海参多糖的方法，既能减少能源的消耗，又能提高海参多糖的提取率。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种制备海参多糖的方法，包括以下步骤：

1)海参多糖粗品的提取：将海参粉碎，加入纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭活酶，离心，取上清液减压浓缩至原体积的20％-25％，重复离心，取上清液经三次盐析醇沉处理，得海参多糖粗品；

2)将上述海参多糖粗品用纯水溶解，上阴离子交换层析柱(OH^-)，依次用纯水及梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集用NaCl溶液洗脱时的洗脱液；

3)将上述收集的洗脱液进行超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖。

其中步骤1)中，将干燥海参，粉碎(粉碎成粗颗粒)，加入海参重量8-12倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解。海参粉碎为粗颗粒，利于反应进行。

其中步骤1)中，酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量为海参重量的1％-3％，pH6.0-7.0，温度50℃-60℃，时间4-6h。优选地，酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量为海参重量的3％，pH 6.5，温度60℃，时间6h。

其中步骤1)中，离心速度为4000-15000rpm。更优选地，离心速度为15000rpm。

其中步骤1)中，盐析醇沉处理包括步骤：上清液中加入乙酸钾至终浓度为0.5M，加入乙醇至终浓度为60％(v/v)，离心，得沉淀A；沉淀A用纯水溶解，加入乙酸钾至终浓度为1.0M，加入乙醇至终浓度为40％(v/v)，离心，得沉淀B；沉淀B用纯水溶解，加入乙酸钾至终浓度为1.0M，加入乙醇至终浓度为40％(v/v)，离心，得沉淀C；沉淀C用无水乙醇洗涤，挥干乙醇，得海参多糖粗品。

其中步骤2)中，NaCl溶液的浓度为0.5-3.0mol/L。

其中步骤2)中，将海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱(OH^-)，依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、2-3倍柱体积的0.3-0.6mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的0.9-1.2mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的1.8-2.4mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集用1.8-2.4mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。然后用约3mol/L NaCl溶液洗脱以清洗层析柱。优选的，依次分别用3倍柱床体积的纯水和0.5、1.0、2.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用2.0mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。然后用约3mol/L NaCl溶液洗脱以清洗层析柱。

其中步骤3)中，将步骤2)收集的洗脱液经5KD中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，于50℃-60℃，真空度≤-0.085MPa条件下减压浓缩，冷冻干燥，得海参多糖。

优选地，步骤3)中，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补水，补水至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液、透过液中Cl^-均为阴性。

本发明的另一目的是提供一种上述任意方法制备的海参多糖。

本发明的再一个目的是上述任意方法制得的海参多糖在制备抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力的药品或保健品或食品中的应用。

本发明的有益效果体现在：1)通过三次盐析醇沉，有效去除酶解上清液中的部分蛋白(不溶物)，避免样品堵塞层析柱中的树脂孔隙和降低层析柱载样量，从而保障层析柱洗脱行为的重复性、提升填料的使用寿命，同时能提高多糖纯度及降低样品中的残留蛋白；2)通过阴离子交换柱层析，有效纯化海参多糖粗品。海参岩藻聚糖是聚阴离子多糖，它在溶液中呈强电荷的聚阴离子状态，理论上，它与阴离子交换树脂可以用阴离子交换树脂实现与其他非聚阴离子物质分离。海参多糖得率可达到3.6～4.3％，多糖含量可达65％以上。

具体实施方式

通过实施例进一步详细描述本发明。以下实施例仅用于举例说明的目的，不应理解为对本发明保护范围的任意限制。除非特别说明，实施例中所用的材料、试剂和仪器均为普通市售或常规产品。

D204型阴离子层析柱：郑州勤实科技有限公司

实施例1海参多糖的制备

1)海参多糖粗品的提取：称取3kg干燥糙海参，粉碎成粗颗粒，加入海参重量8倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的1％，pH6.0，温度50℃，时间6h；酶解完毕后，煮沸灭活酶，管式离心机15000rpm离心，取上清液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)至原体积的20％，再次管式离心机15000rpm离心，取上清液；上清液第一次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为0.5M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为60％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第二次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第三次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀，沉淀再用无水乙醇洗涤两次，挥干乙醇后得362.4g海参多糖粗品，得率为12.08％。

2)将上述海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱(OH^-)，依次用3倍柱床体积的纯水和0.4、0.9、2.1、3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用2.1mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。

3)将上述收集的洗脱液进行5KD的中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)，并冷冻干燥，得108.8g海参多糖，海参多糖得率为3.63％。

实施例2海参多糖的制备

1)海参多糖粗品的提取：称取3kg干燥糙海参，粉碎成粗颗粒，加入海参重量10倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的2％，pH7.0，温度55℃，时间5h；酶解完毕后，煮沸灭活酶，管式离心机12000rpm离心，取上清液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)至原体积的25％，再次管式离心机16000rpm离心，时间10-15min，取上清液；上清液第一次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为0.5M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为60％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第二次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第三次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀，沉淀再用无水乙醇洗涤两次，挥干乙醇后得370.1g海参多糖粗品，得率为12.34％。

2)将上述海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱(OH^-)，依次用3倍柱床体积的纯水和0.6、1.1、1.9、3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用1.9mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。

3)将上述收集的洗脱液进行5KD的中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)，冷冻干燥，得115.3g海参多糖，海参多糖得率为3.84％。

实施例3海参多糖的制备

1)海参多糖粗品的提取：称取3kg干燥糙海参，粉碎成粗颗粒，加入海参重量12倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的3％，pH6.5，温度60℃，时间6h；酶解完毕后，煮沸灭活酶，管式离心机14000rpm离心，取上清液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)至原体积的20％，再次管式离心机14000rpm离心，取上清液；上清液第一次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为0.5M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为60％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第二次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第三次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀，沉淀再用无水乙醇洗涤两次，挥干乙醇后得420.6g海参多糖粗品，得率为14.02％。

2)将上述海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱(OH^-)，依次用3倍柱床体积的纯水和0.5、1.0、2.0、3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用2.0mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。

3)将上述收集的洗脱液进行5KD的中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)并冷冻干燥，得130.1g海参多糖，海参多糖得率为4.34％。

对比例1海参多糖的制备

海参多糖粗品的提取：称取3kg干燥糙海参，粉碎成粗颗粒，加入海参重量12倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的3％，pH6.5，温度60℃，时间3h；后续操作同实施例3，得303.9g海参多糖粗品，得率为10.13％；得92.7g海参多糖，海参多糖得率为3.09％。

对比例2海参多糖的制备

1)海参多糖粗品的提取：称取3kg干燥糙海参，粉碎成粗颗粒，加入海参重量12倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的3％，pH6.5，温度60℃，时间6h；酶解完毕后，煮沸灭活酶，管式离心机14000rpm离心，取上清液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)至原体积的1/5，再次管式离心机14000rpm离心，取上清液作为海参多糖粗品溶液。

2)将上述海参多糖粗品溶液上D204型阴离子层析柱(OH^-)，依次用3倍柱床体积的纯水和0.5、1.0、2.0、3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用2.0mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液；

3)将上述收集的洗脱液进行5KD的中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)并冷冻干燥，得117.3g海参多糖，海参多糖得率为3.91％。

分别取实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2所得的海参多糖，采用苯酚-硫酸法测其总多糖含量；采用Folin-酚法测定残留蛋白含量；其检测结果见表1。

表1：实施例及对比例制备所得海参多糖的得率、总多糖含量及残留蛋白含量

从表1中可以看出，(1)实施例1至实施例3所得的多糖得率及含量均较高，随着酶添加量的增加，多糖得率及含量也随之略有提高；实施例3与对比例1的制备方法区别主要在酶解时间的长短，由表1数据可得：在一定范围内延长酶解时间能够提高多糖的得率和含量；(2)实施例1至实施例4、对比例1的制备方法均有盐析醇沉的操作步骤，其海参多糖样品中残留蛋白含量均在0.2％左右，而对比例2缺少了盐析醇沉的步骤，其残留蛋白含量较高(1.97％)，因此盐析醇沉步骤的加入在保障层析柱洗脱行为重复性、提升填料使用寿命的同时，能有效降低样品中的残留蛋白。

Claims

1.一种制备海参多糖的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，将干燥海参粉碎，加入海参重量8-12倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解；酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量为海参重量的1％-3％，pH 6.0-7.0，温度50℃-60℃，时间4-6h；离心速度为4000-15000rpm。

3.如权利要求2所述的方法，其中步骤1)中，酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量为海参重量的3％，pH 6.5，温度60℃，时间6h。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，盐析醇沉处理包括步骤：上清液中加入乙酸钾至终浓度为0.5M，加入乙醇至终浓度为60％(v/v)，离心，得沉淀A；沉淀A用纯水溶解，加入乙酸钾至终浓度为1.0M，加入乙醇至终浓度为40％(v/v)，离心，得沉淀B；沉淀B用纯水溶解，加入乙酸钾至终浓度为1.0M，加入乙醇至终浓度为40％(v/v)，离心，得沉淀C；沉淀C用无水乙醇洗涤，挥干乙醇，得海参多糖粗品。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，NaCl溶液的浓度为0.5-3.0mol/L。

6.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，将海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱，依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、2-3倍柱体积的0.3-0.6mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的0.9-1.2mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的1.8-2.4mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集用1.8-2.4mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。

7.如权利要求1所述的方法，其中步骤3)中，将步骤2)收集的洗脱液经5KD中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，于50℃-60℃，真空度≤-0.085MPa条件下减压浓缩，冷冻干燥，得海参多糖。

8.如权利要求1所述的方法，其中步骤3)中，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补水，补水至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液、透过液中Cl^-均为阴性。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述的方法制备的海参多糖。

10.如权利要求9所述的海参多糖在制备抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力的药品或保健品或食品中的应用。