CN115873141A

CN115873141A - 一种海参体壁多糖及其提取、解析方法

Info

Publication number: CN115873141A
Application number: CN202211098877.XA
Authority: CN
Inventors: 李川; 王莞婷; 史亚丽; 曹君
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-09-07
Filing date: 2022-09-07
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明提供了一种海参体壁多糖的提取和解析方法，包括如下步骤：A)海参体壁制浆、冻干成粉，脱脂，酶解，醇沉，得到预处理后样品；B)将预处理后样品脱色、除蛋白，透析、冻干得到海参粗多糖；C)将海参粗多糖通过分级柱层析，冷冻干燥得到海参精多糖；D)对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。本发明以海参体壁为原料，进行预处理、酶解醇沉、脱色、除蛋白、分级柱层析、冻干即得成品。所得多糖结构完整且纯度高，为富含硫酸基的海参多糖提取纯化制备提供了有效手段。

Description

一种海参体壁多糖及其提取、解析方法

技术领域

本发明涉及水产品加工技术领域，尤其是涉及一种海参体壁多糖及其提取、解析方法。

背景技术

我国海洋资源甚是丰富，开发利用海洋生物资源已成为一个重要领域和发展方向，其中海洋多糖由于其抗炎、抗肿瘤、抗病毒等活性，成为现在关注的热点之一。不同海参品种中的活性杂多糖结构和活性存在较大差异，多糖的分离提纯，及结构分析测定是研究其生物活性的基础，对于其构效关系的研究十分重要，且对于海参资源的开发利用具有一定的社会价值和经济价值。

目前，国内专利对于海参多糖的开发已有所涉及。如现有专利CN102605031A公开了一种以海参内脏为原料，采用生物酶解技术、膜分离技术提取海参多糖、海参多肽的方法。海参下脚料中所含蛋白质及总糖的提取率可达到60～70％，目标产物中的有效活性成份含量较高，而且不含有溶剂残留，安全性高。专利CN 104513322A公开了一种碱提取海参多糖方法,一般使用稀NaOH溶液或KOH溶液进行提取，此法可以从组织中对海参多糖进行较完全的提取，但多糖分子有可能被碱进一步降解，因此在提取时所采用使用的稀碱溶液的浓度在5％—10％之间，温度保持在10℃以下。

目前，专利中未见以体壁制备海参精多糖，同时对海参多糖结构系统解析的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种海参精多糖的提取方法，本发明海参精多糖的提取率高、纯度高，同时结构完整。

本发明提供了一种海参体壁多糖的提取和解析方法，包括如下步骤：

A)海参体壁制浆、冻干成粉，脱脂，酶解，醇沉，得到预处理后样品；

B)将预处理后样品脱色、除蛋白，透析、冻干得到海参粗多糖；

C)将海参粗多糖通过分级柱层析，冷冻干燥得到海参精多糖；

D)对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。

优选的，步骤A)所述脱脂为丙酮脱脂；所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。

优选的，步骤A)所述酶解为采用木瓜蛋白酶酶解；所述酶解参数为10400u/g，所述酶加入量为0.2～0.5g。

优选的，步骤A)所述醇沉为采用无水乙醇沉淀；所述醇沉后为静置10～12h离心。

优选的，步骤B)所述脱色为活性炭脱色，所述脱色具体为40℃搅拌脱色60min；所述除蛋白为采用三氟乙酸除蛋白。

优选的，步骤B)所述透析为采用截留分子量为8000Da的透析袋透析48h；所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。

优选的，步骤C)所述分级柱层析具体为先采用DEAE-Sepharose Fast Flow柱分级分离，洗脱后再经Sephadex G-100柱纯化。

优选的，所述洗脱为采用梯度浓度的NaCl溶液洗脱；所述洗脱具体为:

使用含0M，0.05M，0.5M，1M，1.5M，2M，3M和4MNaCl的0.1M乙酸钠溶液洗脱，设置1mL/min的流速，5min/管，收集洗脱溶液.

优选的，所述步骤D)具体为：

所述海参精多糖采用高效液相色谱和离子色谱进行单糖组成的分析；

所述海参精多糖通过高效液相色谱的LC系统测定多糖的均一性和分子量

所述海参精多糖通过红外光谱和核磁共振光谱解析多糖的分子结构，通过VeriosG4 UC扫描电子显微镜和X射线衍射仪观察多糖形貌以及分析多糖晶体结构。

本发明提供了一种海参体壁多糖，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。

与现有技术相比，本发明提供了一种海参体壁多糖的提取和解析方法，包括如下步骤：A)海参体壁制浆、冻干成粉，脱脂，酶解，醇沉，得到预处理后样品；B)将预处理后样品脱色、除蛋白，透析、冻干得到海参粗多糖；C)将海参粗多糖通过分级柱层析，冷冻干燥得到海参精多糖；D)对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。本发明以海参体壁为原料，进行预处理、酶解醇沉、脱色、除蛋白、分级柱层析、冻干即得成品。所得多糖结构完整且纯度高，为富含硫酸基的海参多糖提取纯化制备提供了有效手段。

附图说明

图1足海参多糖的DEAE洗脱曲线(A)、HLP-I(B)和HLP-Ⅱ(C)的Sephadex G-100洗脱曲线；

图2是冻干玉足海参多糖；

图3是标准单糖和HLP的HPAEC-PAD色谱图谱(A)；标准单糖和HLP的HPLC色谱图(B)；HLP-I的高效液相色谱图单糖组成分析(C)；

图4是HLP-I的HPSEC色谱图；

图5是HLP-I的红外光谱图(A)、1H NMR谱(B)、13C NMR谱(C)、COSY谱(D)、TOCSY谱(E)、HSQC谱(F)、NOESY谱(G)、HMBC谱(H)；

图6是HLP-I的扫描电子显微镜图(A)(B)(2000×和10000×)和原子力显微图(C)(D)；

图7是X射线衍射曲线的晶体结构分析。

具体实施方式

本发明提供了一种海参体壁多糖及其提取、解析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

D)对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。

本发明提供的一种海参体壁多糖的提取方法首先将海参体壁制浆、冻干成粉，脱脂，酶解，醇沉，得到预处理后样品；

本发明所述海参体壁制浆具体为:将干燥的海参体壁浸泡20～24h(置于冰箱中冷藏，封保鲜膜，下同)，期间至少更换2次水，最后一次浸泡用蒸馏水。去除内脏和体腔膜后，绞肉机绞碎，冻藏备用(最好用玻璃平皿)。所述冻干成粉的所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。

本发明所述脱脂具体为丙酮脱脂；同时加入木瓜蛋白酶、EDTA溶液和半胱氨酸缓冲液。

本发明所述乙酸钠、木瓜蛋白酶、EDTA、半胱氨酸和水的质量比为：3.28:0.26:0.58:0.24.

所述酶解为采用木瓜蛋白酶酶解；所述酶解参数为10400u/g，所述酶加入量为0.2～0.5g。

在本发明其中一个具体实施例中，步骤A)具体为：

海参体壁制浆、冻干成粉，丙酮浸泡脱脂，加入木瓜蛋白酶、EDTA溶液和半胱氨酸缓冲液，搅拌离心，取上清液，加入1氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，室温放置后离心，沉淀复溶于NaCl:乙醇(100:15V/V)溶液中。加入无水乙醇沉淀，静置10～12h后离心。

将预处理后样品脱色、除蛋白，透析、冻干得到海参粗多糖。

所述脱色为活性炭脱色，所述脱色具体为40℃搅拌脱色60min；所述除蛋白为采用三氟乙酸除蛋白。所述透析为采用截留分子量为8000Da的透析袋透析48h；所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。在本发明其中一个具体实施例中，步骤B)具体为：

将离心所得沉淀配置成0.5％的溶液，按照0.75％固液比添加活性炭脱色，抽滤得上清液。添加的三氯乙酸(TCA)溶液，去除沉淀，获得多糖溶液经截留分子量为8000Da的透析袋透析46～48h，冻干得到海参粗多糖。

将海参粗多糖通过分级柱层析，冷冻干燥得到海参精多糖；

本发明所述分级柱层析具体为先采用DEAE-Sepharose Fast Flow柱分级分离，洗脱后再经Sephadex G-100柱纯化。

具体的，所述洗脱为采用梯度浓度的NaCl溶液洗脱；所述洗脱具体为填充已充分脱气的DEAE-FF填料，用0.1M乙酸钠缓冲液平衡。称取的样品，加入缓冲液溶解后；所述样品和缓冲液的比例为200～300mg：10～15mL；

将配好的多糖溶液过0.45μm滤膜后，加入至层析柱中。使用含0M，0.05M，0.5M，1M，1.5M，2M，3M和4M NaCl的0.1M乙酸钠溶液洗脱，设置1mL/min的流速，5min/管，收集洗脱溶液。使用Sephadex G-100进一步纯化。称取HLP-I冻干粉，加入含2M NaCl的0.1M乙酸钠缓冲液中；所述HLP-I冻干粉和2M NaCl的0.1M乙酸钠的比例为：100～200mg：5～10mL。充分溶解后过0.45μm滤膜，流速设置为0.5mL/min。收集洗脱组分，每管收集5mL。

在本发明其中一个具体实施例中，步骤C)具体为：

粗多糖在0.1M乙酸钠的溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow柱上进行分级分离，用梯度浓度的NaCl溶液洗脱。将获得的组分再经Sephadex G-100柱分离纯化。3500Da透析袋截流，真空浓缩，冷冻干燥36～48h后得海参精多糖。

对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。

单糖组成分析通过离子色谱和高效液相色谱联合进行，较离子色谱法而言，高效液相色谱能更准确地分离出来海参多糖特有的单糖。

本发明所述海参精多糖采用高效液相色谱和离子色谱进行单糖组成的分析

在本发明其中一个具体实施例中，所述高效液相色谱的参数具体为：

单糖组成通过柱前PMP衍生的高效液相色谱(HPLC)方法测得。

用3mL三氟乙酸(4M)溶解6mg的样品，配制成2mg/mL的混合液，移至安瓿管中密封并于120℃水解4h。反应结束后冷却至室温，取100μL水解液加入等体积甲醇，用氮气吹干以除去三氟乙酸，重复上述操作3次至样品管恒重。吹干的样品用100μL的超纯水溶解，加入等体积0.6M NaOH溶液混合均匀后，继续加入等体积的0.5M PMP-甲醇溶液进行柱前衍生化反应，在70℃水浴中反应1.5h。反应结束冷却至室温后，取出100μL反应物与50μL盐酸(0.3M)中和，加入氯仿1mL和900μL水，剧烈振摇混匀并离心5min后弃去氯仿层，水相层继续加入1mL氯仿，重复3次萃取。最后取上层(水相层)使用0.22μm水系滤膜进行过滤后进行高效液相色谱检测。单糖标准品配制为1mg/mL的溶液和多糖水解液同时进行衍生化标记。

液相色谱工作参数

Table 1 HPLC working parameters

在本发明其中一个具体实施例中，所述离子色谱的参数具体为：

将样品完全酸水解后用超纯水稀释，通过0.22μm水系滤膜，进样。配置不同浓度的各单糖标液和混标液，使用HPACE-PAD法对样品进行分析。配备Carbo Pac TMPA 20(4mm×250mm)离子色谱柱，设置0.5mL/min流速，流动相A为UP水，采用百分比表示。

糖梯度洗脱程序

Table 5 Gradient elution conditions for the separation ofmonosaccharide

本发明所述海参精多糖通过高效液相色谱的LC系统测定多糖的均一性和分子量。

在本发明其中一个具体实施例中，使用Agilent 1200系列LC系统(AgilentTechnologies，Palo Alto，USA)在25℃下对高性能尺寸排阻色谱-多角度激光散射(HPSEC-MALLS)进行了测量。流动相为0.1M NaNO3水溶液，流速为0.6mL/min，比折射率增量(dn/dc)设定为0.145mL/g。依据基本的光散射方程通过静态光散射的Zimm方法计算分子量。

本发明所述海参精多糖通过红外光谱和核磁共振光谱解析多糖的分子结构，通过Verios G4 UC扫描电子显微镜和X射线衍射仪观察多糖形貌以及分析多糖晶体结构。

在本发明其中一个具体实施例中，红外光谱分析。将样品和KBr混合物(1:100,w/w)压缩成薄片并转移到FT-IR光谱仪(Nicolet 6700,Thermo Fisher ScientificTechnology Co.,Ltd,USA)。在400-4000cm-1范围内记录FT-IR光谱，扫描64次。

在本发明其中一个具体实施例中，核磁共振(NMR)光谱。将氘代多糖(50mg)溶解在0.6mL D2O中并进行1D和2D NMR实验。所有实验均在Bruker AVANCE光谱仪(BrukerBioSpin，Rheinstetten，Germany)上进行。1H和13C NMR光谱在298.2K条件下使用600.58和151.01MHz质子频率采集，并用MestReNova 14.0软件处理。二维核磁共振实验，包括1H-1H相关光谱(1H-1H COSY)、1H-13C异核单量子相干(HSQC)、异核多键相关(HMBC)、总相关光谱(TOCSY)和效应光谱(NOESY)，进行结构分析。

本发明对于上述制备方法已经有了清楚的描述，在此不再赘述。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种海参体壁多糖及其提取、解析方法进行详细描述。

实施例1

步骤1，样品预处理：

海参(重量约320g)体壁制浆、冻干成粉，600mL丙酮浸泡脱脂，加入木瓜蛋白酶、EDTA溶液和半胱氨酸缓冲液，于60℃搅拌反应24h。4500g离心15min取上清液，加入128mL氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，室温放置24h后离心，沉淀复溶于1200mL 4M NaCl:乙醇(100:15V/V)溶液中。加入2.8L无水乙醇沉淀，静置12h后离心。

步骤2，多糖的提取纯化：

讲离心所得沉淀配置成0.5％的溶液，按照0.75％固液比添加活性炭，40℃搅拌脱色60min，抽滤得上清液。添加体积分数为10％的三氯乙酸(TCA)溶液，去除沉淀，获得多糖溶液经截留分子量为8000Da的透析袋透析48h，冻干得到海参粗多糖。200mg粗多糖在0.1M乙酸钠(10mL)中的溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6cm×30cm)上进行分级分离，填充已充分脱气的DEAE-FF填料，用0.1M乙酸钠缓冲液平衡。称取200mg的样品，加入10mL缓冲液溶解后，将配好的多糖溶液过0.45μm滤膜后，加入至层析柱中。使用含0M，0.05M，0.5M，1M，1.5M，2M，3M和4MNaCl的0.1M乙酸钠溶液洗脱，设置1mL/min的流速，5min/管，收集洗脱溶液。使用Sephadex G-100进一步纯化，称取100mg的HLP-I冻干粉，加入5mL含2M NaCl的0.1M乙酸钠缓冲液中，充分溶解后过0.45μm滤膜，流速设置为0.5mL/min。收集洗脱组分，每管收集5mL。

苯酚-硫酸盐法用于测量每支试管中的糖含量。将获得的组分再经Sephadex G-100柱(2.5×75cm)分离纯化。3500Da透析袋截流，真空浓缩，冷冻干燥48h后得海参精多糖。

经过脱蛋白HLP的蛋白含量从原有的4％降至0.26％，TCA法脱蛋白率达到93.5％，相比于Sevag法更简便且能达到良好的脱蛋白效果。将所提取的粗多糖依次经过柱层析的分离纯化后，获得精多糖组分，分别标记为HLP-I和HLP-Ⅱ，对应于使用1.5和2.0M NaCl洗脱的61-68管和79-84管。(图1A)。组分I进一步纯化，收集主峰后，获得单一多糖(图2B)。经过计算从玉足海参中提取的粗多糖的提取率约为体壁干重的4.3％，组分I和II的产率(占HLP粗多糖)分别是6.9％和4.2％。感官评价中，组分I多糖溶液有轻微气味，冻干粉呈微棕色，溶解性良好；组分II冻干粉成乳白色，复溶性较差(图2)

步骤3，单糖组成分析：

高效液相色谱

单糖组成通过柱前PMP衍生的高效液相色谱(HPLC)方法测得。用3mL三氟乙酸(4M)溶解6mg的样品，配制成2mg/mL的混合液，移至安瓿管中密封并于120℃水解4h。反应结束后冷却至室温，取100μL水解液加入等体积甲醇，用氮气吹干以除去三氟乙酸，重复上述操作3次至样品管恒重。吹干的样品用100μL的超纯水溶解，加入等体积0.6M NaOH溶液混合均匀后，继续加入等体积的0.5M PMP-甲醇溶液进行柱前衍生化反应，在70℃水浴中反应1.5h。反应结束冷却至室温后，取出100μL反应物与50μL盐酸(0.3M)中和，加入氯仿1mL和900μL水，剧烈振摇混匀并离心5min后弃去氯仿层，水相层继续加入1mL氯仿，重复3次萃取。最后取上层(水相层)使用0.22μm水系滤膜进行过滤后进行高效液相色谱检测。单糖标准品配制为1mg/mL的溶液和多糖水解液同时进行衍生化标记。

表1 液相色谱工作参数

Table 1 HPLC working parameters

离子色谱法

表2 单糖梯度洗脱程序

Table 5 Gradient elution conditions for the separation ofmonosaccharide

由于高效阴离子交换色谱法(HPAEC)和PA-20柱分离效果的限制，半乳糖胺和鼠李糖的峰时间非常接近(图3A)。在结构分析中，HPSEC和PMP-HPLC与Agilent C18柱再被用来测量单糖组成。高效液相色谱法中鼠李糖和半乳糖胺峰相距较远(图3B)。根据HPLC出峰位置和时间对各峰进行积分定量(图3C)，可得HLP-I中单糖组成有氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖和岩藻糖，其摩尔比为0.07：0.45：1：0.19：2.40。

步骤4，均一性和分子量的测定：

使用Agilent 1200系列LC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，USA)在25℃下对高性能尺寸排阻色谱-多角度激光散射(HPSEC-MALLS)进行了测量。流动相为0.1MNaNO3水溶液，流速为0.6mL/min，比折射率增量(dn/dc)设定为0.145mL/g。依据基本的光散射方程通过静态光散射的Zimm方法计算分子量。

HLP-I的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和Z均分子量(Mz)分别测定为1.062×105Da、0.652×105Da和6.232×105Da。HPSEC-RI色谱图上窄而对称的峰(图4)和相对较低的多分散指数值(1.63，PDI＝Mw/Mn)表明了HLP-I的纯度较高，均一性较好。

步骤5，分子结构解析

步骤5.1，红外光谱分析。将样品和KBr混合物(1:100,w/w)压缩成薄片并转移到FT-IR光谱仪(Nicolet 6700,Thermo Fisher Scientific Technology Co.,Ltd,USA)。在400-4000cm^-1范围内记录FT-IR光谱，扫描64次。

步骤5.2核磁共振(NMR)光谱。将氘代多糖(50mg)溶解在0.6mL D2O中并进行1D和2D NMR实验。所有实验均在Bruker AVANCE光谱仪(Bruker BioSpin，Rheinstetten，Germany)上进行。¹H和¹³C NMR光谱在298.2K条件下使用600.58和151.01MHz质子频率采集，并用MestReNova 14.0软件处理。二维核磁共振实验，包括1H-1H相关光谱(1H-1H COSY)、1H-13C异核单量子相干(HSQC)、异核多键相关(HMBC)、总相关光谱(TOCSY)和效应光谱(NOESY)，进行结构分析。

如图5A所示，3478.53cm^-1处的强吸收带代表了糖残基中O-H的伸缩振动。2929.85cm^-1附近的带与糖环中C-H的伸缩振动有关。大约1739cm^-1和1650cm^-1处的峰归属于羧酸产物的-COOH弯曲振动以及葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖中C-O的弯曲和拉伸振动。1253.12cm^-1处的信号归属于硫酸基团(O＝S＝O)的不对称伸缩振动，这是硫酸化多糖的典型特征。1050.93cm^-1的吸收峰处于多糖的指纹区(400-1300cm^-1，可用于区别不同化合物结构上的微小差异)，可识别HLP-I中的特定化学基团，其是由C-O-C伸缩振动产生的。962.47、850.71和686.36cm^-1的不对称吸收峰也表明HLP-I中存在丰富的硫酸盐基团。820cm^-1-850cm^-1附近波段具有明显差异，可能与硫酸基团在多糖链结构中不同的取代位置有关。在850.71cm^-1处C-O-S伸缩振动的特征峰表明了岩藻糖残基C-4位含有轴向的硫酸盐基团。

如图5B所示，1H NMR图谱中异头质子信号区的化学位移是5.0-5.8ppm，说明存在α型硫酸岩藻糖残基，且HLP-I中的硫酸基团取代类型为Fuc2,4S，Fuc4S，Fuc0S。Fuc和GalNAc的甲基质子(-CH₃)的信号范围在1.1-1.4ppm和1.8-2.1ppm区域，进行信号积分获得面积比例为1.05：1.00。¹³C NMR谱图进一步说明了HLP-I多糖的碳骨架是由L-Fuc和D-GalNAc和D-GlcUA组成，且D-GalNAc和D-GlcUA为β异头碳构型(图5C)。

根据HLP-I的HSQC光谱数据(图5F)，属于H和I单元的H-1信号的位置分别为5.62ppm和5.32ppm。使用¹H-¹H COSY(图5D)光谱进一步分析共振系统的其他信号。H-2(4.39ppm)和H-4(4.58ppm)信号处于低场位置验证了H单元中C-2和C-4位均存在硫酸盐基团。H-3(3.91ppm)和H-4(4.14ppm)信号证实了I单元在O-3、O-4处的硫酸化。如图5E所示，信号A、B、C来自GalNAc、GalpNAc4S6S、GalpNAc4S的(H-1，C-1)，(H-2，C-2)，(H-3，C-3)，(H-4，C-4)、(H-5，C-5)和(H-6，C-6)。信号D、E和F来自GlcA、GlcA2S和GlcpA2S3S的(H-1，C-1)，(H-2，C-2)，(H-3，C-3)，(H-4，C-4)和(H-5，C-5)。GalNAc4S6S中H-4和H-6的化学位移与GalNAc相比处于低场，表明其O-4和O-6位被硫酸化。根据HMBC和NOESY中的相关峰，明确了糖苷键的残基序列。图5H中4.39/3.86ppm和4.64/4.43ppm的两个清晰信号(分别表示为D1/A3、B3、C3和H1、B1、C1/D1、E1、F1)表明GlcA与GalN的C-3位相连，而后者与GalNAc的C-3位置相关。分配H1(D)/H3(E)、H1(G，I)/H3(E)和H1(G，I)/H3(F)相互作用的交叉峰验证了GlcA在O-3处的岩藻糖基残基取代。

HLP-I的H/C化学位移数据，如表3所示。基于上述结构分析，HLP-I包含三种主要单糖(GlcUA、GalNAc和Fuc)，主链结构与一些海参体壁FGs类似。因此，推测HLP-I是一种具有类FGs结构的硫酸化糖胺聚糖，且硫酸取代发生在GalNAc的O-4和O-6位。此外，HLP-I具有不同硫酸化模式(Fuc2、4S、Fuc3、4S和Fuc0S)的岩藻糖支链。

步骤6，多糖形貌观察

通过Verios G4UC扫描电子显微镜(SEM，Thermo Fisher Scientific Co.，Ltd，USA)观察冻干的多糖。将样品分散到载物台上，并用离子溅射镀膜机镀金。施加5kV的加速电压用于SEM观察。表面微观结构由配备多模式扫描探针显微镜的AFM 5500M(日立株式会社，东京，日本)识别。多糖用乙醇分散，吸附，然后在空气中(25℃)的2.0×2.0μm扫描区域内以0.4Hz成像。Agilent 5500分析软件用于估计分子的高度。

图6A、B分别是HLP-I和HLP-Ⅱ放大2000和10000倍的SEM图片。透析后的HLP-I呈链状结构，含有一些小颗粒和聚集体。放大2000倍后，观察到许多大小不一的鹅卵石状颗粒且具有孔洞结构(图6A)。进一步放大10000倍后，观察到其表面更加光滑均匀(图6B)。如图6C所示，测得单条HLP-I多糖链的平均高度大约在3.75-8.95nm范围内，低于15-50nm，表明HLP-I没有三重链螺旋构象。此外，分子内作用力的存在促进了具有多个羟基的HLP-I分子的聚集。表面粗糙度可通过图像中所提取的不同结构参数来量化，包括最大轮廓峰高(Rp)、平均粗糙度值(Ra)和最大高度(Rz)。Rq、Ra、Rp和最大轮廓谷深(Rv)分别为0.20-0.24nm、0.15-0.20nm、0.43-0.61nm和0.45-0.51nm。通过结合Rp和Rv数据，计算得出Rz为0.94-1.06nm。

步骤7，多糖晶体结构分析

测试在室温(25℃)下使用X射线衍射仪(Rigaku D-Max 2500，RigakuCorporation，Japan)上完成。以4°/min的速度在4-40°的2θ范围内扫描图谱。

如图7所示，在4°-40°范围内测量了HLP-I的XRD图谱。在2θ＝21.78°处检测到较宽且低强度的衍射峰，因此，说明HLP-I为半结晶聚合物，即其中既有结晶结构也有无定形部分。

表3 HLP-I的¹H和¹³C NMR光谱的归属

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种海参体壁多糖的提取和解析方法，其特征在于，包括如下步骤：

D)对海参精多糖的组成、分子量和结构进行解析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述脱脂为丙酮脱脂；所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述酶解为采用木瓜蛋白酶酶解；所述酶解参数为10400u/g，所述酶加入量为0.2～0.5g。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述醇沉为采用无水乙醇沉淀；所述醇沉后为静置10～12h离心。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)所述脱色为活性炭脱色，所述脱色具体为40℃搅拌脱色60min；所述除蛋白为采用三氟乙酸除蛋白。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)所述透析为采用截留分子量为8000Da的透析袋透析48h；所述冻干参数为-60～-25℃，真空度1-3bar，10-14h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C)所述分级柱层析具体为先采用DEAE-Sepharose Fast Flow柱分级分离，洗脱后再经Sephadex G-100柱纯化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱为采用梯度浓度的NaCl溶液洗脱；所述洗脱具体为:

使用含0M，0.05M，0.5M，1M，1.5M，2M，3M和4M NaCl的0.1M乙酸钠溶液洗脱，设置1mL/min的流速，5min/管，收集洗脱溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D)具体为：

所述海参精多糖通过红外光谱和核磁共振光谱解析多糖的分子结构，通过Verios G4UC扫描电子显微镜和X射线衍射仪观察多糖形貌以及分析多糖晶体结构。

10.一种海参体壁多糖，其特征在于，由权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到。