CN110054709A - 一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法 - Google Patents

一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于桦褐孔菌多糖提取方法技术领域，具体涉及一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法。本发明主要解决了目前桦褐孔菌多糖提取方法存在提取率低、重金属含量高、有效成分易受热分解、提取成本高等问题。本发明主要包括有提取、精制和干燥等步骤，其中提取步骤采用循环柱层析提取法，精制步骤采用沉淀法，干燥步骤采用喷雾干燥或超低温冷冻干燥法。经过循环柱层析提取，桦褐孔菌多糖提取率可达80％以上，多糖纯度均可达60％以上，含水量仅为3％到4.5％，且有效成分不分解、提取成本低。

Description

一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法
技术领域
本发明属于桦褐孔菌多糖提取方法技术领域，具体涉及一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法。
背景技术
桦褐孔菌，又名白桦茸、桦树茸，是一种寄生在白桦、榆树和银桦等树干或树皮上的药用真菌，主要分布在北纬45°-50°的地区。多年来，桦褐孔菌作为民间药物被应用于癌症、肝病、糖尿病等多种疾病的防治和治疗方面。桦褐孔菌具有多种活性成分，如多糖、萜类、酚酸类、黑色素类及木质素等。
药用真菌多糖是真菌中十分重要的活性成分，它能够调节细胞的新陈代谢，抑制细胞的分裂，具有很高的药用价值。在临床上已经有大量的案例能够证实，真菌多糖具有提高免疫力、抗凝血、抗衰老等多种重要的作用，而且其毒副作用非常小。目前，桦褐孔菌多糖提取方法主要包括溶剂浸提法、物理方法辅助提取、酶提取等方法，但存在提取率低、重金属含量高、有效成分易受热分解、提取成本高等问题。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法。
解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理
选择成熟的桦褐孔菌，干燥并研磨成粉；桦褐孔菌粉不宜过细，否则溶剂流动困难，提取柱压增大；桦褐孔菌粉过粗会造成提取溶剂浸润困难，耗时较长不利于工业化应用。
2)原料浸泡
按桦褐孔菌粉与提取溶剂重量比为1：3.67的比例将桦褐孔菌粉加入提取溶剂中，室温下浸泡1h至桦褐孔菌粉充分吸胀；如果材料前期未完全干燥，可根据材料含水量调整至上述料液比。
3)装柱
将充分吸胀的桦褐孔菌与提取溶剂一起转入层析柱中，于25℃温度下，用柱层析洗脱的方法将多糖从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来；为达到高效率提取的目的，洗脱过程必须严格按照柱层析中物质洗脱的方法；
4)循环柱层析提取
层析柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液可直接用于第2根层析柱的提取，依次类推；大规模连续生产时，用3根或更多层析柱组合成一条连续自动的生产线，可以不间断收取提取液进入下一道大孔树脂分离工序。经检测经过循环柱层析提取，桦褐孔菌多糖提取率可达80％。
5)大孔树脂的预处理
AB-8大孔树脂依次用95％的酒精、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的10～15倍，蒸馏水以1.5BV/小时的流速充分洗涤5BV；
6)大孔树脂柱层析纯化
将循环柱层析提取的提取液以1.5BV/小时的流速加入预处理后的大孔树脂层析柱中，加提取液体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加提取液后柱上吸附12小时；
7)蒸馏水洗脱
待多糖完全吸附后，用蒸馏水以2BV/小时流速洗涤树脂柱5BV，洗脱过程中，多糖以暗红色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标；经检测桦褐孔菌多糖回收率可达80％。
8)减压浓缩
洗脱液60℃减压浓缩至除去部分水；
9)干燥
减压浓缩后的浓缩液在-20℃预冷2小时后，再经-80℃真空冷冻干燥12小时得褐色粉末；或者将减压浓缩后的浓缩液以进风口温度为145℃，进料流速10mL/分钟的条件喷雾干燥得褐色粉末。经检测两种干燥途径下制得的桦褐孔菌粉末中多糖纯度均可达60％或以上，含水量仅为3％到4.5％。
进一步，所述提取溶剂为使用氢氧化钠调整pH为13的蒸馏水。pH对桦褐孔菌多糖的溶剂提取效果影响显著，当PH为13水溶液作为提取溶剂时提取率最高。
更进一步，所述层析柱中充分吸胀的桦褐孔菌高度材料应为柱直径的5倍，洗脱流速为1BV/小时，柱内液面必须始终高于充分吸胀的桦褐孔菌材料。
再进一步，所述循环柱层析提取用3根及以上层析柱组合成一条连续自动提取、纯化线。
本发明采用以上技术方案，流程如图1所示，主要包括有提取、精制和干燥等步骤，其中提取步骤采用循环柱层析提取法，精制步骤采用沉淀法，干燥步骤采用喷雾干燥或超低温冷冻干燥法。经过循环柱层析提取，桦褐孔菌多糖提取率可达80％以上，多糖纯度均可达60％以上，含水量仅为3％到4.5％，且有效成分不分解、提取成本低。
附图说明
图1为桦褐孔菌多糖循环柱层析提取流程图；
图2为不同料液比对桦褐孔菌多糖溶剂提取率的影响；
图3为不同pH提取液对桦褐孔菌多糖提取率的影响；
图4为不同提取时间对桦褐孔菌多糖提取率的影响；
图5为不同温度对桦褐孔菌多糖柱层析提取率的影响；
图6为溶剂吸附及提取动力学；
图7-10为桦褐孔菌多糖柱层析提取流速影响曲线；
图11-13为桦褐孔菌多糖柱层析提取径高比影响曲线；
图14为桦褐孔菌多糖循环柱层析提取曲线；
图15为浸泡提取与循环柱层析提取比较。
具体实施方式
实施例1
本实施例中的一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理
选择成熟的桦褐孔菌，干燥并研磨成粉；
2)原料浸泡
按桦褐孔菌粉与提取溶剂重量比为1：3.67的比例将桦褐孔菌粉加入提取溶剂中，室温下浸泡1h至桦褐孔菌粉充分吸胀；所述提取溶剂为使用氢氧化钠调整pH为13的蒸馏水。
3)装柱
将充分吸胀的桦褐孔菌与提取溶剂一起转入层析柱中，于25℃温度下，用柱层析洗脱的方法将多糖从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来；所述层析柱中充分吸胀的桦褐孔菌高度材料应为柱直径的5倍，洗脱流速为1BV/小时，柱内液面必须始终高于充分吸胀的桦褐孔菌材料。
4)循环柱层析提取
层析柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液可直接用于第2根层析柱的提取，第2根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液直接用于第3根层析柱的提取；
5)大孔树脂的预处理
AB-8大孔树脂依次用95％的酒精、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的10倍，蒸馏水以1.5BV/小时的流速充分洗涤5BV；
6)大孔树脂柱层析纯化
将循环柱层析提取的提取液以1.5BV/小时的流速加入预处理后的大孔树脂层析柱中，加提取液体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加提取液后柱上吸附12小时；
7)蒸馏水洗脱
待多糖完全吸附后，用蒸馏水以2BV/小时流速洗涤树脂柱5BV，洗脱过程中，多糖以暗红色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标；减压浓缩
8)减压浓缩
洗脱液60℃减压浓缩至除去部分水；
9)干燥
减压浓缩后的浓缩液在-20℃预冷2小时后，再经-80℃真空冷冻干燥12小时得褐色粉末；
实施例2
本实施例中的一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理
选择成熟的桦褐孔菌，干燥并研磨成粉；
2)原料浸泡
按桦褐孔菌粉与提取溶剂重量比为1：3.67的比例将桦褐孔菌粉加入提取溶剂中，室温下浸泡1h至桦褐孔菌粉充分吸胀；所述提取溶剂为使用氢氧化钠调整pH为13的蒸馏水。
3)装柱
将充分吸胀的桦褐孔菌与提取溶剂一起转入层析柱中，于25℃温度下，用柱层析洗脱的方法将多糖从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来；所述层析柱中充分吸胀的桦褐孔菌高度材料应为柱直径的5倍，洗脱流速为1BV/小时，柱内液面必须始终高于充分吸胀的桦褐孔菌材料。
4)循环柱层析提取
层析柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液可直接用于第2根层析柱的提取，第2根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液直接用于第3根层析柱的提取；
5)大孔树脂的预处理
AB-8大孔树脂依次用95％的酒精、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的15倍，蒸馏水以1.5BV/小时的流速充分洗涤5BV；
6)大孔树脂柱层析纯化
将循环柱层析提取的提取液以1.5BV/小时的流速加入预处理后的大孔树脂层析柱中，加提取液体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加提取液后柱上吸附12小时；
7)蒸馏水洗脱
待多糖完全吸附后，用蒸馏水以2BV/小时流速洗涤树脂柱5BV，洗脱过程中，多糖以暗红色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标；减压浓缩
8)减压浓缩
洗脱液60℃减压浓缩至除去部分水；
9)干燥
将减压浓缩后的浓缩液以进风口温度为145℃，进料流速10mL/分钟的条件喷雾干燥得褐色粉末。
实施例3
本实施例中的一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理
选择成熟的桦褐孔菌，干燥并研磨成粉；
2)原料浸泡
按桦褐孔菌粉与提取溶剂重量比为1：3.67的比例将桦褐孔菌粉加入提取溶剂中，室温下浸泡1h至桦褐孔菌粉充分吸胀；所述提取溶剂为使用氢氧化钠调整pH为13的蒸馏水。
3)装柱
将充分吸胀的桦褐孔菌与提取溶剂一起转入层析柱中，于25℃温度下，用柱层析洗脱的方法将多糖从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来；所述层析柱中充分吸胀的桦褐孔菌高度材料应为柱直径的5倍，洗脱流速为1BV/小时，柱内液面必须始终高于充分吸胀的桦褐孔菌材料。
4)循环柱层析提取
层析柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液可直接用于第2根层析柱的提取，第2根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液直接用于第3根层析柱的提取；
5)大孔树脂的预处理
AB-8大孔树脂依次用95％的酒精、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的13倍，蒸馏水以1.5BV/小时的流速充分洗涤5BV；
6)大孔树脂柱层析纯化
将循环柱层析提取的提取液以1.5BV/小时的流速加入预处理后的大孔树脂层析柱中，加提取液体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加提取液后柱上吸附12小时；
7)蒸馏水洗脱
待多糖完全吸附后，用蒸馏水以2BV/小时流速洗涤树脂柱5BV，洗脱过程中，多糖以暗红色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标；减压浓缩
8)减压浓缩
洗脱液60℃减压浓缩至除去部分水；
9)干燥
减压浓缩后的浓缩液在-20℃预冷2小时后，再经-80℃真空冷冻干燥12小时得褐色粉末。
图1为桦褐孔菌多糖循环柱层析提取流程图；
图2为提取液中不同料液比对桦褐孔菌多糖溶剂提取率的影响。从图2可知溶剂对桦褐孔菌多糖的提取呈先增大后减小的趋势，当料液比为1：40时多糖提取率最高，达85.56％。
图3为pH对桦褐孔菌多糖溶剂提取率的影响。从图3可知，pH对桦褐孔菌多糖的溶剂提取效果影响显著，当PH为13水溶液作为提取溶剂时提取率最高，多糖含量为5.866mg/ml，综上所述，确定桦褐孔菌多糖的最佳提取溶剂为pH13的水溶液。
图4为桦褐孔菌多糖对pH13的水溶液溶出液中多糖的浓度变化曲线。从图4可知，随着提取时间的延长，多糖含量呈上升的趋势，3小时后浓度趋于平衡，当提取时间超过5小时后多糖浓度反而下降，因此确定桦褐孔菌材料浸泡处理时间为3小时。
图5为柱层析提取时，不同温度对桦褐孔菌多糖柱层析提取率的影响。从图5可知当温度为25℃时多糖含量最高为13.32，随着温度的升高多糖浓度反而有下降的趋势。由此确定桦褐孔菌多糖提取的最适温度为25℃。
图6为在25℃下，采用pH13水溶液提取时，提取材料对提取溶剂的吸附动力学曲线及多糖的提取动力学曲线。从图6可知，在浸泡提取时间达到60分钟时，溶剂吸附及多酚的溶出浓度达到平衡，每g提取材料可吸附3.67毫升pH13的水溶液。因此后续柱层析提取时选择材料浸泡时间为60分钟，浸泡料液比为1：3.67。
图7-10为桦褐孔菌多糖柱层析提取流速影响的洗脱曲线，当流速为1BV/h时有明显的提取峰，且在100ml附近时洗脱值几乎完成。因此柱层析提取流速为1BV/h最适。
图11-13为为桦褐孔菌多糖柱层析提取径高比影响的曲线，由图8可知当径高比为1:5时，有明显的峰值，且在洗脱液使用100ml时洗脱几乎完成。因此，柱层析提取桦褐孔菌多糖时最适径高比为1:5。
图14为循环柱层析提取柱中桦褐孔菌多糖的洗脱曲线。从图9可知，随着提取液的循环次数的增加，洗脱液中多糖的浓度越来越高。同时我们发现，在循环柱层析提取过程中，洗脱液中多糖浓度保持在10～30mg/mL的范围内，波动幅度小。较小的浓度波动有利于工业化生产过程中的质量控制。
图15为浸泡提取与循环柱层析提取结果比较，从图14可知，采用循环柱层析提取，多糖提取率显达到160.3mg/g显著好于传统浸泡提取119.4mg/g。
所述循环柱层析提取还可以用3根及以上层析柱组合成一条连续自动提取、纯化线。

Claims (4)

1.一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)原料预处理
选择成熟的桦褐孔菌，干燥并研磨成粉；
2)原料浸泡
按桦褐孔菌粉与提取溶剂重量比为1：3.67的比例将桦褐孔菌粉加入提取溶剂中，室温下浸泡1h至桦褐孔菌粉充分吸胀；
3)装柱
将充分吸胀的桦褐孔菌与提取溶剂一起转入层析柱中，于25℃温度下，用柱层析洗脱的方法将多糖从层析柱内的桦褐孔菌中洗脱出来；
4)循环柱层析提取
层析柱内流出的洗脱液以1个柱体积为单位收集，第1根层析柱的提取液上AB-8大孔树脂柱吸附后流出的平液可直接用于第2根层析柱的提取，依次类推；
5)大孔树脂的预处理
AB-8大孔树脂依次用95％的酒精、0.1mol/L盐酸、0.1mol/LNaOH分别浸泡12小时后装入层析柱至层析柱中树脂的高度为柱直径的10～15倍，蒸馏水以1.5BV/小时的流速充分洗涤5BV；
6)大孔树脂柱层析纯化
将循环柱层析提取的提取液以1.5BV/小时的流速加入预处理后的大孔树脂层析柱中，加提取液体积以不超过大孔树脂柱体积的4.5倍量为佳，加样时柱大孔树脂柱内不得产生气泡、断层；加提取液后柱上吸附12小时；
7)蒸馏水洗脱
待多糖完全吸附后，用蒸馏水以2BV/小时流速洗涤树脂柱5BV，洗脱过程中，多糖以暗红色条带向下移动，可作为层析洗脱时的目测指标；减压浓缩
8)减压浓缩
洗脱液60℃减压浓缩至除去部分水；
9)干燥
减压浓缩后的浓缩液在-20℃预冷2小时后，再经-80℃真空冷冻干燥12小时得褐色粉末；或者将减压浓缩后的浓缩液以进风口温度为145℃，进料流速10mL/分钟的条件喷雾干燥得褐色粉末。
2.根据权利要求1所述的高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于：所述提取溶剂为使用氢氧化钠调整pH为13的蒸馏水。
3.根据权利要求2所述的高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于：所述层析柱中充分吸胀的桦褐孔菌高度材料应为柱直径的5倍，洗脱流速为1BV/小时，柱内液面必须始终高于充分吸胀的桦褐孔菌材料。
4.根据权利要求3所述的高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于：所述循环柱层析提取用3根及以上层析柱组合成一条连续自动提取、纯化线。
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