CN101323637A - 一种积雪草甙及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种积雪草甙及其制备方法，它是以积雪草为原料，用水或低碳醇提取，提取液经过柱层析分离纯化、树脂脱色、析晶、重结晶、干燥而制得的以积雪草甙为主要成分的提取物，其中积雪草甙的重量含量≥95％。本发明利用现代生物提取技术，采用水提或醇提、柱层析分离纯化、脱色、析晶、重结晶的工艺路线从积雪草中提取积雪草甙，通过树脂柱层析和重结晶来提高积雪草甙的纯度，使得提取物中积雪草甙的重量含量达95％以上(HPLC法测定)；而且其工艺流程简单，生产周期短，有机溶剂用量省，生产成本低，适于大批量生产。

Description

一种积雪草甙及其制备方法

(一)技术领域：

本发明涉及一种积雪草甙及其制备方法，属于药用活性成分的提取技术领域。

(二)背景技术：

积雪草为双子叶植物伞形科植物积雪草的全草或带根全草，具有清热利湿，消肿解毒之功效；用于治疗湿热黄疸，痢疾风疹、喉肿、肿毒和跌打损伤等。积雪草甙是积雪草提取物中的有效成分之一。积雪草甙具有多种药理作用：(1)美容：有抗氧化作用，祛除老死角脂层，促进皮肤的新陈代谢，增加皮肤的弹性及光滑，补充营养素。(2)保健：调节内分泌，改善肠道功能，延缓衰老，改善记忆，改善贫血，促进睡眠，改善肠胃功能。(3)减肥：降低胆固醇，清除多余脂肪与降低超重，调节大脑的神经递质，补充大脑神经中枢的营养。(4)促进伤口愈合和治愈皮肤损伤：能治疗皮肤溃疡，如顽固性创伤、皮肤结核、麻风等。对小鼠、豚鼠、兔肌肉注射或皮下植入时可促进皮肤生长、局部白细胞增多、结缔组织血管网增生、粘液分泌增加、毛和尾的生长加速等。(5)调节免疫功能：积雪草甙可抑制自身抗体的形成，降低免疫球蛋白，改善细胞免疫功能。(6)抗菌：对金黄色葡萄菌、溶血型链球菌、各种痢疾杆菌、伤寒杆菌均有抑制作用。(7)抗溃疡作用：可抑制大鼠幽门结扎溃疡和应激性溃疡。(8)对中枢神经的作用：刺激中心神经系统，从而改善记忆和抗疲劳。(9)镇静、安定作用：可用于治疗失眠症。另据文献报道，积雪草甙对静脉功能不全而致的长期不能愈合的下肢溃疡及外伤病例、手术或创伤引起的肌腱粘连、灼伤等因素所致的创面恢复后的瘢痕疙瘩以及硬皮病均有一定疗效。积雪草甙还能轻度抑制乙酰胆碱的作用，并用于乳腺增生的治疗。

积雪草甙的保健、药用功效如此之多，但到目前为止，很少有关于从积雪草中提取高纯度积雪草甙的相关报道。CN1491656A公开了从积雪草中提取积雪草提取物的工艺步骤，但该提取物的主要成分为积雪草甙和羟基积雪草甙，二者在提取物中的含量为10～95％，没有将积雪草甙和羟基积雪草甙分开。CN101210040A公开了一种积雪草甙化学对照品的分离制备方法，可获得纯度大于98％的积雪草甙化学对照品，但该方法是以重量含量30～97％的积雪草甙提取物为原料进行分离提纯的，必须先从积雪草中提取出一定含量的积雪草甙提取物。

(三)发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：采用先进的工艺方法从积雪草中提取、分离、纯化积雪草甙，其工艺流程简单，生产成本低，所得提取物中积雪草甙的含量高。

本发明的技术方案：一种积雪草甙，它是以积雪草为原料，用水或低碳醇提取，提取液经过柱层析分离纯化、树脂脱色、析晶、重结晶、干燥而制得的以积雪草甙为主要成分的提取物，其中积雪草甙的重量含量≥95％。

上述积雪草甙的制备方法为：取积雪草，用水或低碳醇加热回流或超声提取1～3次，每次5～180min，合并提取液，浓缩，离心，上清液进大孔树脂柱进行纯化，先用水再用低碳醇洗柱，收集醇洗脱液；洗脱液进脱色树脂柱，收集流出液，再用低碳醇进行洗脱，将洗脱液和流出液合并，浓缩后放置12～72小时，析出晶体，用低碳醇加热溶解晶体，溶解液浓缩后放置12～72小时，析出晶体，洗涤，干燥，即得积雪草甙。所用的积雪草原料可以是鲜积雪草或干积雪草。

上述制备方法中，可用加热渗漉提取代替加热回流或超声提取，渗漉速度0.1～2BV/h，渗漉时间4～24小时。

更具体的制备方法为：将积雪草粉碎(粉碎后有利于有效成分的充分溶出)，用2～20倍(优选为3～12倍)重量的水或低碳醇加热渗漉、加热回流或超声提取，合并提取液，浓缩至提取液体积的1/10～1/2，离心，上清液进大孔树脂柱进行纯化，先用纯化水洗柱1.5～4h，再用低碳醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集醇洗脱液(为树脂重量的1～4倍)；洗脱液进脱色树脂柱，收集流出液，再用树脂重量2～6倍的低碳醇进行洗脱，将洗脱液和流出液合并，浓缩至其体积的1/15～1/2，放置12～72小时，析出晶体，抽滤，洗涤，用5～15倍晶体重量的低碳醇加热至35～90℃溶解晶体，将溶解液浓缩至其体积的1/15～1/2，放置12～72小时，析出晶体，抽滤，洗涤，干燥，粉碎，即得积雪草甙。

加热渗漉提取时，温度为40～60℃；加热回流提取时，温度为30～100℃，提取时间为每次1～3小时；超声提取时，工作频率15～80KHz，提取时间为每次5～100min。

以上所述的低碳醇为甲醇、乙醇、丁醇或戊醇，其体积浓度为30％～100％。当采用回流提取时，提取次数和醇浓度是影响收率和含量的关键因素，提取次数优选为2次，醇浓度优选为30％～95％。

所述的浓缩均为真空浓缩，浓缩温度40～60℃，真空度0.06～0.1MPa。

提取液离心时采用三足离心，转速为1700r/min。

大孔树脂柱纯化时，液体流速为0.5～2BV/h。

所述的大孔树脂柱是以苯乙烯为骨架的D101型、HPD-100型、D130型或AB-8型大孔吸附树脂。申请人经过筛选实验发现，这几种大孔吸附树脂对积雪草甙的纯化效果更好，而且其价格便宜，可以多次重复使用，成本较低。

所述的脱色树脂柱为大孔型脱色树脂柱、中性氧化铝树脂柱或者活性炭柱。

与现有技术相比，本发明利用现代生物提取技术，采用水提或醇提、柱层析分离纯化、脱色、析晶、重结晶的工艺路线从积雪草中提取积雪草甙，通过树脂柱层析和重结晶来提高积雪草甙的纯度，使得提取物中积雪草甙的重量含量达95％以上(HPLC法测定)；而且其工艺流程简单，生产周期短，有机溶剂用量省，生产成本低，适于大批量生产。

(四)具体实施方式：

本发明的实施例1：积雪草甙的制备方法，其步骤如下：

1)提取：将鲜积雪草粉碎后投入洁净的提取罐中，加入8倍重量的60％(v/v)乙醇，控制温度在85℃，第一次回流提取2h(从溶液沸腾开始计时)，然后压出药液，第二次再加入6倍重量的60％(v/v)乙醇，回流提取2h，合并提取液。

2)浓缩、离心：将提取液导入洁净的浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为0.08MPa，浓缩至提取液体积的1/6；浓缩后的提取液通过三足离心机离心，转速为1700r/min；

3)柱层析纯化：离心上清液直接进型号为AB-8的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为1.5BV/h；先用纯化水洗柱至流出液清澈，水洗约2.5小时，再用60％(v/v)乙醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集带醇味的洗脱液，收集醇洗脱液为树脂重量的3倍。

4)脱色：将收集的洗脱液直接进大孔型脱色树脂柱，收集流出液，再用相当于树脂重量4倍的60％(v/v)乙醇进行洗脱；将洗脱液和流出液合并，进行真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为0.08MPa，浓缩至原液(浓缩前液体)体积的1/8。

5)析晶：浓缩液放置18小时，析出大量的晶体，抽滤，用60％(v/v)乙醇洗晶体。

6)重结晶：用10倍晶体重量的30％(v/v)乙醇加热至80℃溶解晶体，将溶解液真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为0.08MPa，浓缩至溶解液体积的1/5，浓缩液放置15小时，析出大量的晶体，抽滤，用30％(v/v)乙醇洗净晶体。

7)干燥：将晶体真空干燥，粉碎，得积雪草甙。

本发明的实施例2：按以下步骤制备积雪草甙：

1)提取：将干积雪草粉碎后投入洁净的提取罐中，加入12倍重量的水，控制温度在100℃，第一次回流提取3h(从溶液沸腾开始计时)，然后压出药液，第二次加入5倍重量的水，回流提取2h，第三次再加入2倍重量的水，回流提取1h，合并提取液。

2)浓缩、离心：将提取液导入洁净的浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在60℃，真空度为0.1MPa，浓缩至提取液体积的1/2；浓缩后的提取液通过三足离心机离心，转速为1700r/min；

3)柱层析纯化：离心上清液直接进型号为HPD-100的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为1.0BV/h；先用纯化水洗柱至流出液清澈，水洗约3小时，再用85％(v/v)乙醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集带醇味的洗脱液，收集醇洗脱液为树脂重量的2倍。

4)脱色：将收集的洗脱液直接进中性氧化铝树脂柱，收集流出液，再用相当于树脂重量6倍的75％(v/v)乙醇进行洗脱；将洗脱液和流出液合并，进行真空浓缩，温度控制在60℃，真空度为0.1MPa，浓缩至原液(浓缩前液体)体积的1/12。

5)析晶：浓缩液放置40小时，析出大量的晶体，抽滤，用45％(v/v)乙醇洗晶体。

6)重结晶：用12倍晶体重量的65％(v/v)乙醇加热至90℃溶解晶体，将溶解液真空浓缩，温度控制在60℃，真空度为0.1MPa，浓缩至溶解液体积的1/10，浓缩液放置30小时，析出大量的晶体，抽滤，用45％(v/v)乙醇洗净晶体。

7)干燥：将晶体真空干燥，粉碎，得积雪草甙。

本发明的实施例3：按以下步骤制备积雪草甙：

1)提取：将鲜积雪草粉碎后加入2～3倍重量的80％(v/v)甲醇浸润6小时，使积雪草原料充分膨胀，分次均匀地装入渗漉器中，压紧，放置8～48小时后再加入17～18倍重量的80％(v/v)甲醇，加热至50℃开始渗漉，渗漉速度为1BV/h，时间15小时，收集渗漉液。

2)浓缩、离心：将渗漉液导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在40℃，真空度为0.06MPa，浓缩至提取液体积的1/10；浓缩后的提取液通过离心机离心，转速为1700r/min；

3)柱层析纯化：离心上清液直接进型号为D101的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为0.5BV/h；先用纯化水洗柱至流出液清澈，水洗约1.5小时，再用70％(v/v)甲醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集带醇味的洗脱液，收集醇洗脱液为树脂重量的1倍。

4)脱色：将收集的洗脱液直接进活性炭柱，收集流出液，再用相当于树脂重量2倍的70％(v/v)甲醇进行洗脱；将洗脱液和流出液合并，进行真空浓缩，温度控制在40℃，真空度为0.06MPa，浓缩至原液(浓缩前液体)体积的1/2。

5)析晶：浓缩液放置15小时，析出大量的晶体，抽滤，用30％(v/v)甲醇洗晶体。

6)重结晶：用5倍晶体重量的60％(v/v)甲醇加热至50℃溶解晶体，将溶解液真空浓缩，温度控制在40℃，真空度为0.06MPa，浓缩至溶解液体积的1/2，浓缩液放置12小时，析出大量的晶体，抽滤，用30％(v/v)甲醇洗净晶体。

7)干燥：将晶体干燥，粉碎，得积雪草甙。

本发明的实施例4：按以下步骤制备积雪草甙：

1)提取：将干积雪草粉碎后投入提取罐中，加入7倍重量的95％(v/v)乙醇，超声提取80min，收取药液，再加入3倍重量的95％(v/v)乙醇，超声提取50min，合并提取液；超声工作频率为15～80KHz。

2)浓缩、离心：将提取液导入浓缩器中进行真空浓缩，温度控制在55℃，真空度为0.07MPa，浓缩至提取液体积的1/8；浓缩后的提取液通过离心机离心，转速为1700r/min；

3)柱层析纯化：离心上清液直接进型号为D130的大孔吸附树脂柱进行纯化，液体流速为2BV/h；先用水洗柱至流出液清澈，水洗约4小时，再用50％(v/v)乙醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集带醇味的洗脱液，收集醇洗脱液为树脂重量的4倍。

4)脱色：将收集的洗脱液直接进大孔型脱色树脂柱，收集流出液，再用相当于树脂重量5倍的50％(v/v)乙醇进行洗脱；将洗脱液和流出液合并，进行真空浓缩，温度控制在45℃，真空度为0.09MPa，浓缩至原液(浓缩前液体)体积的1/15。

5)析晶：浓缩液放置72小时，析出大量的晶体，抽滤，用60％(v/v)乙醇洗晶体。

6)重结晶：用15倍晶体重量的50％(v/v)乙醇加热至35℃溶解晶体，将溶解液真空浓缩，温度控制在50℃，真空度为0.07MPa，浓缩至溶解液体积的1/15，浓缩液放置70小时，析出大量的晶体，抽滤，用40％(v/v)乙醇洗净晶体。

7)干燥：将晶体干燥，粉碎，得积雪草甙。

Claims (10)

1.一种积雪草甙，其特征在于：它是以积雪草为原料，用水或低碳醇提取，提取液经过柱层析分离纯化、树脂脱色、析晶、重结晶、干燥而制得的以积雪草甙为主要成分的提取物，其中积雪草甙的重量含量≥95％。

2.权利要求1所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：取积雪草，用水或低碳醇加热回流或超声提取1～3次，每次5～180min，合并提取液，浓缩，离心，上清液进大孔树脂柱进行纯化，先用水再用低碳醇洗柱，收集醇洗脱液；洗脱液进脱色树脂柱，收集流出液，再用低碳醇进行洗脱，将洗脱液和流出液合并，浓缩后放置12～72小时，析出晶体，用低碳醇加热溶解晶体，溶解液浓缩后放置12～72小时，析出晶体，洗涤，干燥，即得积雪草甙。

3.根据权利要求2所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：用加热渗漉提取代替加热回流或超声提取，渗漉速度0.1～2BV/h，渗漉时间4～24小时。

4.根据权利要求2或3所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：将积雪草粉碎，用2～20倍重量的水或低碳醇加热渗漉、加热回流或超声提取，合并提取液，浓缩至提取液体积的1/10～1/2，离心，上清液进大孔树脂柱进行纯化，先用纯化水洗柱1.5～4h，再用低碳醇洗柱至洗脱液澄清、透明，收集醇洗脱液；洗脱液进脱色树脂柱，收集流出液，再用树脂重量2～6倍的低碳醇进行洗脱，将洗脱液和流出液合并，浓缩至其体积的1/15～1/2，放置12～72小时，析出晶体，抽滤，洗涤，用5～15倍晶体重量的低碳醇加热溶解晶体，将溶解液浓缩至其体积的1/15～1/2，放置12～72小时，析出晶体，抽滤，洗涤，干燥，粉碎，即得积雪草甙。

5.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：所述的低碳醇为甲醇、乙醇、丁醇或戊醇，其体积浓度为30％～100％。

6.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：所述的浓缩均为真空浓缩，浓缩温度40～60℃，真空度0.06～0.1MPa。

7.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：提取液离心时采用三足离心，转速为1700r/min。

8.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：大孔树脂柱纯化时，液体流速为0.5～2BV/h。

9.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂柱是以苯乙烯为骨架的D101型、HPD-100型、D130型或AB-8型大孔吸附树脂。

10.根据权利要求4所述积雪草甙的制备方法，其特征在于：所述的脱色树脂柱为大孔型脱色树脂柱、中性氧化铝树脂柱或者活性炭柱。