CN106074264A

CN106074264A - 一种添加剂及包含该添加剂的化妆品

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Publication number: CN106074264A
Application number: CN201610520361.8A
Authority: CN
Inventors: 洪民华; 刘丹; 张营; 洪奇; 吕智; 卢艳花; 何浩; 郭苗苗
Original assignee: SHANGHAI INOHERB COSMETIC CO Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: SHANGHAI INOHERB COSMETIC CO Ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明提供了一种积雪草提取物，其中包括质量百分比为20％‑99％的羟基积雪草苷。本发明还提供了一种积雪草提取物的制备方法以及在化妆品领域的应用。该积雪草提取物采用改进提取工艺，添加的溶剂无毒或易挥发，减少了纯化步骤的工作量；增加了纯化步骤，得到的积雪草提取物中羟基积雪草的含量更高。本发明提供的积雪草提取物，具有优异的抗衰老性能，以及修复受损细胞的能力，此外，还具有优良的保湿性能和细胞抗炎症能力，可以作为优良的复合型添加剂加入到化妆品中。

Description

一种添加剂及包含该添加剂的化妆品

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种添加剂及其制备方法和包含该添加剂的化妆品，尤其涉及一种积雪草提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

积雪草为伞形科植物积雪草(Centella asiatica L.Urban)的干燥全草或带根全草。性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效，临床上用于跌打损伤、流行性脑脊髓膜炎、传染性肝炎等。积雪草属(Centella)植物，全世界约有20种，主要分布于南北半球热带和亚热带地区，我国仅产积雪草1中，广布于华东、华南、中南及西南诸省区，从其生长环境看，积雪草喜生长于阴湿的草地或水沟边。

积雪草成分多为三萜类化合物，其中积雪草苷(Asiaticoside)及羟基积雪草苷(Madecassoside)的药理活性丰富，临床作用广泛，为积雪草中的主要活性成分，一般也将该两者的含量作为积雪草质量的指标。

卢茂芳等(积雪草提取纯化工艺的研究，湖南中医药大学学报，2007年第27卷第1期第16-19页)采用2次水提法对积雪草的提取工艺进行优化，第一次加10倍量水提取2h，第二次加8倍量水提取1.5h。使用该方法可以节省原料，缩短工时，降低成本，利于工业化大生产。韩伟等(酶法提取积雪草苷，南京工业大学学报(自然科学版)，2009年第31卷第3期第18-22页)采用酶提法提取积雪草中的积雪草苷，筛选出酶解的最优工艺参数为：纤维素酶与底物积雪草质量比未1:50，积雪草与溶剂水的质量比为1：25，在pH＝6.0，酶解温度为40℃的条件下酶解1.5h。酶解法提取速率快，工艺条件温和，且活性组分的得率高。

此外，高效液相色谱法也能分离得到高纯度的积雪草苷和羟基积雪草苷。虽然现有的积雪草的提取方法较多，但其主要用于医药用途，在化妆品领域的应用还比较少，而且也未见到高纯度羟基积雪草苷提取工艺的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种积雪草提取物，并研究了该提取物在化妆品领域中的应用。

本发明的第一个方面在于提供一种积雪草提取物，所述积雪草提取物中所述羟基积雪草苷的质量百分含量为20％-99％，优选为40-90％，如50％、80％等。

作为本发明的一个优选实施例，所述积雪草提取物中还包括积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸中的任意一种或其组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述积雪草苷的含量为0-20％，优选为0.5％-15％，如2％、10％等。

作为本发明的一个优选实施例，所述积雪草提取物中还可以包括左施松樟酮(pinocamphone)，左旋薄荷酮(menthone)，胡薄荷酮(pulelgone)，α-蒎烯(α-pinene)，β-蒎烯(β-pinene)，棕檬烯(limonene)，1-8-桉叶素(1,8-cineole)，对-聚伞花素(p-cymene)，异薄荷酮(isomenthone)，异松樟酮(isopinocamphone)，芳樟醇(linalool)，薄荷醇(mentholk)及α-松油醇(α-terpineol)中的任意一种或几种组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述积雪草提取物可以是水提物、醇提物、油提物、超临界CO₂提取物中的任意一种或几种的组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述积雪草原料中重金属的含量小于100ppm，优选为小于50ppm，如30ppm，更优选为小于10ppm。

作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为乙醇提取物、水提取物、临界CO₂提取物中的一种或几种组合。

本发明的第二个方面在于提供一种积雪草提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、取清洗后的积雪草粉末，向其中加入5-30体积倍量的溶剂浸提至少2次，每次0.5h-3.5h，混合每次浸提得到的提取液，得到混合提取液；

步骤2、将步骤1得到的混合提取液浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液即为所述积雪草提取物。

作为本发明的一个优选实施例，步骤2中将所述混合提取液在1-20kPa、20-60℃条件下旋转蒸发浓缩至所述积雪草粉末的1-10倍体积。

作为本发明的一个优选实施例，步骤2中还可以包括将所述浓缩液纯化、干燥步骤中的任意一个或其组合。

作为本发明的一个优选实施例，步骤2中还可以包括将浓缩液以500-300r/min转速离心2-20min，取上清液，得到所述积雪草提取物。

作为本发明的一个优选实施例，步骤2中还可以包括将所述浓缩液流过层析柱进行纯化，所述层析柱为大孔吸附树脂、液相色谱柱中的任意一种或几种组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述大孔吸附树脂纯化过程的条件为pH值＝3-6，温度为25℃-50℃，优选为30℃-40℃，洗脱剂的流速为2-4BV/h。

作为本发明的一个优选实施例，所述大孔吸附树脂的型号为AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一种或几种。

作为本发明的一个优选实施例，所述液相色谱柱纯化过程的条件为pH值＝3-6，温度为25℃-50℃，优选为30℃-40℃，洗脱剂的流速为2-4BV/h。

作为本发明的一个优选实施例，所述液相色谱柱为C18柱。

作为本发明的一个优选实施例，所述洗脱过程中，以20％-80％的乙醇水溶液作为洗脱剂，所述洗脱剂的流速为2-4BV/h，洗脱温度为30℃-50℃。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述的浸提工艺中的溶剂为水、体积含量为30％-90％乙醇、超临界CO₂等中的任意一种或几种组合，优选为水和/或乙醇及其组合。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1中，所述积雪草提取物每次的浸提条件为：浸泡2-5h，在50℃-120℃，提取1.5-3h。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1中，所述积雪草在0.8-1.3MPa压力下提取，优选为1.0-1.2MPa，如1.1MPa。

作为本发明的一个优选实施例，所述干燥的方法为电加热干燥、喷雾干燥、热空气干燥中的任意一种或几种组合，优选为喷雾干燥。

本发明的第三个方面在于提供上述任意一种积雪草提取物的应用。

所述积雪草提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外表面的制品。

其中，本发明所述积雪草提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品和/或护肤品。

本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种积雪草提取物的日化用品，优选为包含上述任意一种积雪草提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。

其中，所述营养性添加剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：尿酸、乳清酸、芦荟苷、壬二酸、松香酸、松萝酸、壳聚糖、丝肽、丝素、卵磷脂、表皮细胞生长因子、珍珠粉、胶原蛋白、胶原水解物、透明质酸及其盐、蛋膜素、植物甾醇、氯化溶菌酶、硫酸软骨素钠、蜂乳、蜂胶、蜂蜜、甘草酸、甘草次酸、γ-亚麻酸、曲酸及其酯、赤霉酸、甘氨酸、L-天冬氨酸及其盐、L-胱氨酸及其盐、DL-丙氨酸、L-丝氨酸、DL-丝氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、肌醇、麦芽醇、泛酸盐、D-泛醇、视黄醇醋酸酯、尿囊素、吡哆醇盐酸盐、可的松、烟酰胺、维生素、胸腺素、茜草素、柠檬烯、黄芩黄素、脱氧胆酸、愈疮木萸、橙皮素、鞣酸、二硫化硒、茶皂苷、柠檬酸三乙酯、丁基羟基甲苯、植酸、聚氯化二甲基二烯丙基铵。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述积雪草提取物的含量为0.001％-60％，如0.003％，40％，优选为0.005％-30％，如10％、20％等。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品选自以下形式中的任意一种或几种组合：霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾剂等。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品中还包括辅料，所述辅料选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素等中的任意一种或几种组合。

本发明提供的积雪草提取物，采用改进提取工艺，添加的溶剂无毒或易挥发，减少了纯化步骤的工作量；增加了纯化步骤，得到的积雪草提取物中羟基积雪草的含量更高。本发明提供的积雪草提取物，具有优异的抗衰老性能，以及修复受损细胞的能力，此外，还具有优良的保湿性能和细胞抗炎症能力，可以作为复合型添加剂加入到化妆品中。

附图说明

图1为自然状态下积雪草提取物对I型胶原蛋白分泌的影响；

图2为过氧化氢对HDF细胞存活率的影响；

图3为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；

图4为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；

图5为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1含量的影响；

图6为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞LOR含量的影响；

图7为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HAS3含量的影响；

图8为积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HA含量的影响；

图9为不同种类细菌比例对THP-1细胞IL-1β浓度的影响；

图10为积雪草提取物对痤疮丙酸杆菌损伤的THP-1细胞中IL-1β含量的影响。

具体实施方式

积雪草提取物的制备

实施例一

取重金属含量为5ppm的积雪草原料10kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到煎锅中，然后向煎锅中加入去离子水100L，浸泡2h，加热煮沸，并保持微沸2h，提取结束后，再加入100L去离子水，浸泡2h，加热煮沸，并保持微沸2h，提取结束后，混合两次的提取液，得到混合提取液。于45℃、5kPa条件下旋蒸浓缩混合提取液至5kg，得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为20％，积雪草苷的质量含量为2.5％，积雪草总苷的含量为30％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.22ppm，镉的含量为0.31ppm，砷的含量为0.23ppm，铜的含量为1.85ppm，汞的含量未检出。

实施例二

取重金属含量为10ppm的积雪草原料8kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到煎锅中，然后向煎锅中加入去离子水80L，浸泡1.5h，加热煮沸，并保持微沸2.5h，提取结束后，再次加入64L去离子水，浸泡2h，加热煮沸，并保持微沸2h，提取结束后混合两次的提取液，于5kPa、微沸条件下旋蒸浓缩至5kg，离心，得到上清液，将上清液经过D101大孔吸附树脂纯化，调节浓缩液pH值＝4，在15℃吸附3h，吸附饱和，然后于35℃，无水乙醇、95％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液梯度洗脱，其中无水乙醇优选为食品级乙醇，食品级乙醇的用量为上清液的2倍体积。

向纯化后的上清液中加入10g市售羟基积雪草苷，于常压、0℃下静置结晶12h，过滤得滤饼，滤饼经热空气干燥至恒重，得到半成品，该半成品经内包装、外包装后得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为80％，积雪草苷的质量含量为6.5％，积雪草总苷的含量为95％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.28ppm，镉的含量为0.26ppm，砷的含量为0.21ppm，铜的含量为1.63ppm，汞的含量未检出。

实施例三

取重金属含量为8ppm的积雪草原料20kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到密封煎锅中，然后向煎锅中加入去离子水200L，浸泡2.5h，将密封煎锅升压至1.2MPa，加热煮沸，并保持微沸2h，调节系统压力至1.01MPa，过滤，得到一次滤液和一次滤渣。向滤渣中再次加入180L去离子水，浸泡2h，将密封煎锅升压至1.2MPa，加热煮沸，并保持微沸2.5h，调节系统压力至1.01MPa，过滤，得到二次滤液和二次滤渣。

重复上述提取方法2次，混合每次的提取液，于50℃、8kPa条件下旋蒸浓缩至5kg，离心，得到上清液，将上清液经过色谱柱纯化，纯化过程的工艺条件为：30℃、乙醇为洗脱剂、pH值＝5，其中乙醇优选为食品级乙醇，食品级乙醇的用量为上清液的2倍体积。

向纯化后的上清液中加入10g市售羟基积雪草苷，于常压、-4℃下静置结晶12h，过滤得滤饼，滤饼经80℃热空气干燥至恒重，得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为60％，积雪草苷的质量含量为10％，积雪草总苷的含量为85％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.28ppm，镉的含量为0.23ppm，砷的含量为0.24ppm，铜的含量为1.23ppm，汞的含量未检出。

实施例四

取重金属含量为5ppm的积雪草原料20kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到煎锅中，然后向煎锅中加入70％的乙醇水溶液150L，浸泡2h，于1.1MPa压力下，加热煮沸，并保持微沸2h，过滤，得到一次滤液和一次滤渣，向滤渣中加入200L去离子水，浸泡2h，于1.1MPa压力下，加热煮沸，并保持微沸2.5h，过滤，得到二次滤液和二次滤渣。

将二次滤液和一次滤液混合后，于40℃、5kPa条件下旋蒸浓缩至5kg，离心，得到上清液，将上清液经过色谱柱纯化，纯化过程的工艺条件为：30℃、乙醇为洗脱剂、pH值＝5，其中乙醇优选为食品级乙醇，食品级乙醇的用量为上清液的2倍体积。

向纯化后的上清液中加入10g市售羟基积雪草苷，于常压、4℃下静置结晶12h，过滤得滤饼，滤饼经热空气干燥至恒重，得到半成品，该半成品经内包装、外包装后得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为70％，积雪草苷的质量含量为3％，积雪草总苷的含量为85％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.20ppm，镉的含量为0.10ppm，砷的含量为0.21ppm，铜的含量为1.63ppm，汞的含量未检出。

实施例五

取重金属含量为5ppm的积雪草原料20kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到煎锅中，调节温度、压力至CO₂的超临界条件，向煎锅中注入200L的CO₂，提取2h，过滤，得到一次滤液和一次滤渣。重复提取一次，过滤，得到二次滤液和二次滤渣。

将二次滤液和一次滤液混合后，于45℃、5kPa条件下旋蒸浓缩至5kg，离心，得到上清液，将上清液经过色谱柱纯化，纯化过程的工艺条件为：30℃、乙醇为洗脱剂、pH值＝5，其中乙醇优选为食品级乙醇，食品级乙醇的用量为上清液的2倍体积。于10kPa、25℃旋转蒸发纯化后的溶液30min，除去其中的乙醇，得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为30％，积雪草苷的质量含量为1.5％，积雪草总苷的含量为35％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.20ppm，镉的含量为0.13ppm，砷的含量未检出，铜的含量未检出，汞的含量未检出。

实施例六

取重金属含量为8ppm的积雪草原料10kg，使用去离子水清洗2遍后粉碎，将粉碎后的积雪草原料加入到煎锅中，然后向煎锅中加入无水乙醇100kg，常温浸泡2h，加热煮沸，并保持微沸2h，过滤，得到一次滤液和一次滤渣，向滤渣中再次加入80kg无水乙醇，浸泡2h，加热煮沸，并保持微沸1.5h，过滤，得到二次滤液和二次滤渣。

将二次滤液和一次滤液混合后，70℃浓缩后离心，取上清液，以壳聚糖用量0.4mL/g，将药液浓缩为原来浓度的1.2倍，絮凝温度为70℃，然后经干燥后得半成品，该半成品经内包装、外包装后得到积雪草提取物。

使用C18液相色谱柱，以体积比乙腈：2mmol/Lβ环糊精(磷酸调节pH＝4)＝24：76为流动相，该积雪草提取物中羟基积雪草苷的质量含量为30％，积雪草苷的质量含量为10％，积雪草总苷的含量为50％。

该积雪草提取物中铅的含量为0.33ppm，镉的含量为1.36ppm，砷的含量0.36ppm，铜的含量3.84ppm，，汞的含量3.67ppm，。

积雪草提取物对HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL的人HDF细胞或HaCat细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每个样品设3个复孔。

将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养6h。

将本发明提供的终浓度为1mg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的积雪草提取物加入到96孔细胞培养板中，向空白组中加入等体积的细胞培养液。于37℃、包含5％CO₂的细胞培养箱中孵育48h。

然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTT100μL，于37℃、包含5％CO₂的细胞培养箱中黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150μL DMSO，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波长，检测吸光度。

计算细胞存活率，结果如表1所示：

表1，积雪草提取物对人HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响

积雪草提取物浓度(mg/mL)	1	0.1	0.01	0
					HDF存活率(％)	65	82	93	100
HaCat存活率(％)	56	83	90	100

以细胞存活率高于80％为对人HDF细胞和HaCat细胞无毒的标准，由表1可知，本发明提供的积雪草提取物对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.1mg/mL，本发明提供的积雪草提取物对人HaCat细胞无毒的最高浓度为0.1mg/mL，因此，确定积雪草提取物的浓度0.1mg/mL为后续的试验浓度。

积雪草提取物的抗衰老性能

自然状态下积雪草提取物对HDF细胞胶原蛋白分泌的影响

为了考察本发明提供的积雪草提取物对HDF细胞胶原蛋白分泌的影响，本实施例将试验分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL细胞，每孔100μL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。

向标准组中加入50μL标准液，向实验组中加入10μL上清液和40μL本发明提供的积雪草提取物的稀释液，向对照试验组加入对比实施例制备的积雪草提取物，空白组中不加样品，分别于37℃孵育1h，并洗板5次，每组样品设3个复孔。

向四组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50μL，于37℃温育30min，洗涤5次。

向四组样品中分别加入50μL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37℃温育30min，洗涤5次。

向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50μL，轻轻震荡混匀，于37℃避光孵育30min，向四组样品中加入终止液50μL。

以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表2和图1所示。

表2，积雪草提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响

组别	I型胶原蛋白含量(％)
		实验组	125.19
对照实验组	105.28
		空白组	100

胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了I型胶原蛋白的表达及I型胶原蛋白被基质金属蛋白酶MPP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。

由表2可知，向HDF细胞中添加本发明提供的积雪草提取物后，皮肤中的I型胶原蛋白含量为原来的125.19％，而向HDF细胞中加入采用现有技术制备的积雪草提取物后，I型胶原蛋白的含量为105.28％，说明本发明提供的积雪草提取物相对于现有技术制备的积雪草提取物，更能够显著促进I型胶原蛋白的表达，可以作为潜在的抗老化添加剂。

过氧化氢对HDF细胞存活率的影响

选取不同浓度的过氧化氢，如50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM和1000μM，与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用MTT法检测不同浓度的过氧化氢对HDF细胞存活率的影响。

取培养至浓度为10⁵个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL。于37℃、含有CO₂的培养箱中贴壁培养6h，每板做复孔3个。

使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h；向每个样品孔中加入浓度为0.5mg/mL的MTT 100μL，于37℃、含有CO₂的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。

去除上清液，向样品中加入150μL DMSO，震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。

测试结果如图2所示，人HDF细胞于浓度为50-800μM的过氧化氢共孵育3-9h后，人HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μM时，细胞存活率低于50％。200μM过氧化氢作用6h后，细胞存活率降到70％。

积雪草提取物对经过过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响

本试验分为空白组、实验组、阳性对照组和对照试验组。

取培养至密度为10⁵个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100μL，每孔设3个复孔。于37℃，含有CO₂的培养箱中贴壁培养6h。

空白组中不加入样品，实验组中加入本发明提供的积雪草提取物，对照实验组加入对照试验制备的积雪草提取物，阳性对照组中加入维甲酸。

实验组、阳性对照组和对照实验组利用过氧化氢损伤建模。

向四组试验中的每孔加入0.5mg/mL的MTT 100μL，于37℃、5％CO₂的黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO 150μL，震荡检测吸光度，计算细胞存活率，细胞存活率采用如下计算公式：

其中，空白组既未加入过氧化氢，也未加入积雪草提取物。

表3，积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响

组别	空白组	阴性对照组	阳性对照组	实验组	对照实验组
						细胞存活率(％)	100	70	89	83	75

由图2、图3可知，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞的存活率降低至70％以下，而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入维甲酸后，HDF细胞的存活率提高至89％，如表3中阳性对照组所述。向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的积雪草提取物后，人HDF细胞的存活率达到83％，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的积雪草提取物后，人HDF细胞的存活率为75％，即本发明提供的积雪草提取物相对于现有技术制备的积雪草提取物，其修复受损肌肤的能力与维甲酸接近，能够显著修复过氧化氢对HDF细胞造成的损伤。

积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响

本试验分为空白组、实验组、对照试验组、阴性对照组和阳性对照组。

取培养至密度为10⁵个/mL的HDF细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL，每孔设3个复孔。于37℃，含有CO₂的培养箱中贴壁培养6h。

空白组、阴性对照组中不加入样品，实验组1中加入本发明提供的积雪草提取物，对照实验组加入采用对比实施例制备的积雪草提取物，向阳性对照组中加入维甲酸。

实验组、阳性对照组和对照实验组利用过氧化氢损伤建模。

向每孔中加入0.5mg/mL的MTT 100μL，于37℃、5％CO₂的黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO 150μL，震荡检测吸光度，计算胶原蛋白含量，结果如表4和图3所示：

表4，积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响

由表4和图4可知，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞I型胶原蛋白分泌量变为未损伤时的73.67％，如阴性对照组所示。而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入维甲酸后，HDF细胞中I型胶原蛋白的分泌量提高至94％，如阳性对照组所述。向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的积雪草提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量为78％。向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的积雪草提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量达到80.25％，稍高于加入现有技术提供的积雪草提取物后人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量，说明本发明提供的积雪草提取物具有优良的修复细胞损伤的能力，能够显著修复过氧化氢对HDF细胞造成的损伤，是优良的抗衰老化妆品添加剂。

积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞基质金属蛋白酶(MMP-1)的影响

材料与试剂

细胞培养液 24孔细胞培养板

细胞培养箱过氧化氢

离心机 ELISA试剂盒

测试步骤

本测试分为标准组、空白组、实验组和对照实验组。

取对数生长期的浓度为10⁵个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔1mL，于37℃，含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组中加入本发明提供的积雪草提取物，向标准组加入标准物，空白组中不添加样品。

诱导建立过氧化氢损伤模型。小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书，取10μL细胞悬液进行实验。以空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光度。根据标准品对应的MMP-1的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的吸光度值，在回归方程上计算出实验组中MMP-1的浓度。

表5，积雪草提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1含量的影响

组别	MMP-1浓度(％)
		空白组	100
阴性对照组	167.21
		阳性对照组	125
实验组	158
		对照实验组	166

由表5和图5可知，人HDF细胞经过过氧化氢刺激后，HDF细胞中的MMP-1水平显著上升至167％，如阴性对照组所示。加入维甲酸后，MMP-1的值有所降低，如表5中的阳性对照组所示。而向过氧化氢刺激过的HDF细胞中加入本发明提供的积雪草提取物后，MMP-1的含量降低至158％，而向过氧化氢刺激过的HDF细胞中加入采用现有技术制备的积雪草提取物后，HDF细胞中MMP-1的含量为166％，说明本发明提供的积雪草提取物相对于现有技术制备的积雪草提取物具有更明显的抑制MMP-1的能力。这说明，在氧化应激条件下，本发明提供的积雪草提取物具有抑制MMP-1表达的能力。

积雪草提取物的保湿性能

皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤对水的维持作用：

1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；

皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。

2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。

积雪草提取物对HaCat细胞兜甲蛋白表达的影响

角质层是由角质形成细胞构成的坚韧有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化学物质内渗和体液外渗的作用，其中含量最高的角蛋白叫做兜甲蛋白，约占角蛋白的80％，兜甲蛋白的含量会直接影响皮肤水分的流失状况。

本试验通过考察HaCat细胞兜甲蛋白(LOR)的表达来考察本发明提供的积雪草提取物的保湿性能。

本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期的浓度为10⁵个/mL的HaCat细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔细胞液1mL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的积雪草提取物，向对照实验组中加入一定量采用对照试验制备的积雪草提取物，标准组和空白组中不加入样品，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h；

弃除上清液，用预冷PBS冲洗细胞两次，在培养孔中加入100μL裂解液，冰上裂解细胞10min，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。

按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；

利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组LOR表达量采用蛋白量矫正，结果如表6和图6所示。

表6，积雪草提取物对LOR表达的影响

由表6可知，添加本发明提供的积雪草提取物后，人HaCat细胞中LOR含量能比不添加本发明提供的积雪草提取物和添加现有技术制备的积雪草提取物均高，LOR含量为空白试验的1.11倍，说明本发明提供的积雪草提取物保湿性比现有技术制备的积雪草提取物的保湿性好。

积雪草提取物对HDF细胞透明质酸合成酶(HAS3)表达量的影响

正常皮肤中，HA主要由HAS合成，HAS主要包括三种，分别为HAS1、HAS2、HAS3，其中HAS3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保湿能力最强的物质，因此，皮肤中HAS3的含量提高能够间接促进皮肤的保湿能力。

本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL的HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔细胞液1mL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的积雪草提取物，向对照实验组细胞液中加入一定量采用对照试验制备的积雪草提取物，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h；

按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；

利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组HAs3表达量采用蛋白量矫正，结果如表7和图7所示。

表7，积雪草提取物对HAS3表达的影响

组别	HAS3含量(％)
		实验组	159.87
对照实验组	128.14
		空白组	100

由表7和图7可知，添加本发明提供的积雪草提取物后，人HaCat细胞中HAS3含量比不加入积雪草提取物时的含量提高了接近60％，比加入采用现有技术制备的积雪草提取物时的含量提高了近25％，说明本发明提供的积雪草提取物能够显著提高了细胞的保湿性能，可以作为添加剂加入到化妆品中。

积雪草提取物对透明质酸分泌的影响

在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。

本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期的浓度为10⁵个/mL的人HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔细胞液1mL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的积雪草提取物，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h；

小心收集上清培养基，离心后得到上清液，备用。

向标准组中加入50μL标准液，向实验组中加入10μL上清液和40μL本发明提供的积雪草提取物的稀释液，向对照实验组中加入10μL上清液和40μL采用现有技术制备的积雪草提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37℃孵育1h，并洗板5次。

向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50μL，于37℃避光孵育30min，向四组样品中加入终止液50μL。

以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光光度值，并根据吸光度值计算细胞液中HA的含量，结果如表8和图8所示。

表8，积雪草提取物对HA分泌的影响

组别	HA含量(％)
		实验组	131.92
对照实验组	105
		空白组	100

由表8和图8可知，添加本发明提供的积雪草提取物后，人HDF细胞中HA含量比未加入积雪草提取物时，提高了近32％，比加入采用现有技术提取的积雪草提取物时，提高了25.6％，说明本发明提供的积雪草提取物相对于现有技术得到的积雪草提取物，能够明显促进HDF细胞分泌HA，有效保持细胞中水分，并进而起到保湿的作用。

积雪草提取物的抗炎性能

性激素紊乱、皮脂腺痤疮丙酸杆菌的大量繁殖、皮脂腺导管的异常角化、皮脂的大量分泌、炎症等反应会导致痤疮的发生。祛痘化妆品也一般以抑制痤疮的发病为因素为目标。

炎症因子白介素-1β(IL-1β)是一种促炎性细胞因子，由单核-巨噬细胞在摄取抗原抗体复合物或者抗原呈递过程中产生。大量分泌时，主要通过刺激使T细胞和B细胞活化，同时诱导环氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合成酶、粘附分子等效应蛋白的表达，参与炎性反应。同时，在多种细胞中，IL-8和TNF-α皆可由外源IL-1β诱导产生。

痤疮丙酸杆菌在毛囊内定植及侵袭后，机体的免疫细胞，如单核细胞，可能通过其模式识别受体，如Toll样受体等，对痤疮丙酸杆菌识别后，通过激活多种信号途径，诱导一系列天然及获得性免疫应答来抵抗其入侵。通过释放多种促炎因子及趋化因子，如IL-1β、IL-8、TNF-α等，招募各种免疫细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等，聚集于入侵的局部，来杀灭致病性的痤疮丙酸杆菌，导致受累毛囊炎症的发生。

建立抗炎祛痘模型

将人单核细胞THP-1细胞培养于含10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的培养箱培养，每2-3天传代一次。

取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为1×10⁶个/mL，接种于96孔培养板中，取厌氧条件下培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，在80℃水浴条件下加热30min制成活菌悬液或热灭活菌悬液。按细菌：细胞分别为1：1、10：1和100：1的比例将制备的活菌悬液或热灭活菌悬液加入96孔板中，以不加药物孵育为阴性对照，以只加PBS溶液为空白对照。置于37℃恒温，5％CO₂及饱和湿度的培养箱培养24h。采用ELISA法测细胞上清中IL-1β的含量变化。

ELISA法检测IL-1β含量的步骤如下：

(1)确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。

(2)将1000pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL和1.56pg/mL的标准品各0.1mL依次加入一排7孔中，1孔只加积雪草提取物稀释液的作为零孔。向培养孔中加入100μL已用积雪草提取物稀释液稀释的积雪草提取物，于37℃反应90min。

(3)除去酶标板内的液体，将准备好的抗人IL-1β抗体工作液按每孔0.1mL依次加入，TMB空白显色孔除外，于37℃反应60min。

(4)除去酶标板内的液体，使用PBS洗涤3次，每次浸泡1min左右。

(5)将准备好的ABC工作液按每孔0.1mL依次加入，TMB空白显色孔内不加ABC工作液，于37℃反应30min。

(6)除去酶标板内液体，PBS洗涤5次，每次浸泡1-2min左右。

(7)按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应25min。

(8)按每孔0.1mL依次加入TMB终止液。

(9)用酶标仪在450nm测定OD值。

(10)根据各孔的吸光度值在标准曲线上找出对应的IL-1β的浓度。

采用不同浓度的P.acnes(热灭活菌和活菌)刺激THP-1细胞不同时间时，测得细胞上清液中IL-1β的含量如图9所示，当细菌浓度较低或是热灭活时，IL-1β的分泌量较少，当选择活菌，菌浓度较高时，细胞上清液中IL-1β含量较多，变化显著。因此，后续实验中选用活细菌：细胞＝100：1，孵育24h。

积雪草提取物对THP-1细胞存活率的影响

本发明采用噻唑兰(MTT)法检测积雪草对THP-1细胞增殖的影响。

将本发明提供的积雪草提取物用DMSO配制成100mg/mL的母液冻存，备用。

测试开始前，取配制好的母液20μL，向母液中加入980μL细胞培养液，配制成2mg/mL的储备加药浓度。

取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度至2×10⁴个/mL，将培养后的细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔设3个复孔。

向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的积雪草提取物，使每孔中积雪草提取物的终浓度分别为1mg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL，孵育48h，对照组的培养孔中不加样品，孵育48h。

向每孔中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，保证每孔内MTT的终浓度为0.5mg/mL，将培养板置于含有CO₂的培养箱中继续培养4h，以3000rpm/min转速离心后，小心吸除培养孔内的上清液，向每孔中加入100μLDMSO，震荡10min，使结晶物完全溶解后，放置于酶标仪上，选取570nm为测量波长，630nm为参照波长测量每孔样品的吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：

采用MTT法测试了药物对细胞的毒性作用，其目的在于找出一个合适的安全剂量范围，测试结果如表8所示。

表9，积雪草提取物对THP-1细胞的存活率的

积雪草提取物浓度(mg/mL)	1	0.1	0.01	0
					THP-1存活率(％)	110	132	103	100

以THP-1细胞存活率高于80％为对人THP-1细胞无毒的标准，由表7可知，本发明提供的积雪草提取物对人THP-1细胞无毒的最高浓度为1mg/mL，因此，确定积雪草提取物的最高浓度1mg/mL为后续的试验浓度。

积雪草提取物对炎症因子IL-1β的影响

当THP-1细胞发生炎症反应时，会特异性产生IL-1β，因此，可以用IL-1β的含量间接反映THP-1细胞发生炎症的程度。

具体测试方法如下：

将THP-1细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、含5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天传代一次。

取指数生长期的THP-1细胞，用培养液调节细胞密度至1×10⁶/mL，接种于96孔细胞培养板中，向实验组的细胞培养板中加入终浓度为0.1μg/mL的本发明提供的积雪草提取物，向对照实验组的细胞培养板中加入终浓度为0.1μg/ml、对照试验中制备的积雪草提取物，孵育4h。

取厌氧培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌悬液，按细菌：细胞＝100：1的比例加入96孔板中，以不加痤疮丙酸杆菌为阴性对照组，以只加PBS溶液为空白组。置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h。采用ELISA法测细胞上清中IL-1β的含量变化，IL-1β的抑制率采用如下公式计算：

结果如表10所示：

表10，积雪草提取物对IL-1β分泌的影响

以对IL-1β的抑制率在60％以上作为抗炎效果明显的标准，此时抗炎药物可以有效降低由痤疮丙酸杆菌诱导上调的炎症因子的释放，减弱痤疮周围T、B细胞等的活化以及中性粒细胞等的聚集，减少由于抗原入侵导致的局部发热、肿胀，从而达到减轻炎症甚至消炎的目的。

由表10可知，向正常的人THP-1细胞中加入痤疮丙酸杆菌后，IL-1β的含量增高至原来的760.38％，向经过痤疮丙酸杆菌刺激的THP-1细胞中加入本发明提供的积雪草提取物后IL-1β的含量降低至265.14％，即本发明提供的积雪草提取物对IL-1β的抑制率为65.76％。向经过痤疮丙酸杆菌刺激的THP-1细胞中加入采用现有技术制备的积雪草提取物后IL-1β的含量降低至431.28％，即现有技术制备的积雪草提取物对IL-1β的抑制率为43.28％。说明本发明提供的积雪草提取物相对于现有技术制备的积雪草提取物，具有更明显的炎症抑制作用。

综上所述，本发明提供的积雪草提取物具有明显的抗氧化性、保湿性和抗炎性，可以作为添加剂应用到化妆品中，此外，该积雪草提取物还可以作为保健品、药品等应用在相应领域。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述积雪草提取物的质量含量为0.001％-50％。

2.根据权利要求1所述的化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述积雪草提取物包含羟基积雪草苷，所述积雪草提取物中所述羟基积雪草苷的质量百分含量为20％-99％。

3.一种积雪草提取物，其特征在于，所述积雪草提取物中所述羟基积雪草苷的质量百分含量为20％-99％。

4.根据权利要求3所述的积雪草提取物，其特征在于，所述积雪草提取物中还包括积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸中的任意一种或其组合，所述积雪草苷的质量含量为0-20％。

5.根据权利要求3或4所述的积雪草提取物，其特征在于，所述积雪草提取物中重金属的含量小于100ppm。

6.一种如权利要求3-5任一项所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中还包括将浓缩液以500-300r/min转速离心2-20min，取上清液，得到所述积雪草提取物。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中还可以包括将所述浓缩液流过大孔吸附树脂进行纯化，所述大孔吸附树脂纯化过程的条件为pH值＝3-6，温度为25℃-50℃洗脱剂的流速为2-4BV/h。

9.一种如权利要求3-5任一项所述的积雪草提取物的应用，其特征在于，应用于制备涂覆于皮肤外表面的制品。

10.根据权利要求9所述的积雪草提取物的应用，其特征在于，所述制品为化妆品和/或护肤品。