CN103124560A - 制备积雪草提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备精制的积雪草提取物的方法，所述提取物包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物。该方法包括：通过吸附树脂；用包含至少30%重量的醇溶剂的洗脱剂洗脱；和使用包含水和醇溶剂的溶剂混合物进行重结晶的步骤。
Description
本发明涉及制备积雪草(Centella asiatica)提取物的方法，所述提取物包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物。
积雪草属于伞形科(Apiaceae)，具体而言是天胡荽亚科。该植物是已知的，并且已经被传统医学使用了3000年以上。对于它的愈合、镇静、止痛、抗抑郁和抗微生物特性，是很令人感兴趣的。
积雪草的活性化合物是五环三萜类，其为三萜苷配基类的形式：积雪草酸(式I)和羟基积雪草酸(式II)，或者为三萜异苷类的形式：积雪草皂苷(式III)、羟基积雪草苷(式IV)和Terminoloside(式V)。
Terminoloside是羟基积雪草苷的位置异构体，并且具有相同的糖链，即葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖链。Terminoloside的萜环与Terminolic acid的萜环结构相当。
根据发明人的知识，目前还没有检测到积雪草皂苷的异构体。但是，可以假定存在积雪草皂苷的位置异构体，其具有与存在于羟基积雪草苷和Terminoloside之间的类似的异构现象。
积雪草的杂苷类，积雪草皂苷和羟基积雪草苷，是该植物中分别形成积雪草酸和羟基积雪草酸的储备形式的糖复合物。
三萜分子由于其调节和激活胶原合成的活性而令人关注。从积雪草中提取的苷配基和杂苷类特别是促进1型和3型胶原合成。这些活性物质主要用于促进愈合和治疗静脉功能不全的药物方面。它们也用于化妆品方面，作为抗皱纹和抗蜂窝组织剂。在现有技术中更普遍应用的积雪草的活性化合物是积雪草酸和羟基积雪草酸以及积雪草皂苷。
由于羟基积雪草苷在水中非常易溶，其通常在常规的脂溶性活性物质提取方法的过程中被清洗的水所带走。
国际申请WO 2004/062678提供了制备积雪草提取物的方法，所述提取物包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物，该方法包括通过液/液萃取、随后浓缩所得的水-醇相并连续过滤来选择性去脂的步骤，该顺序用于从羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物中提取出积雪草皂苷。但是，羟基积雪草苷使一部分积雪草皂苷增溶，这部分残余的积雪草皂苷需要通过硅胶色谱来取出，而硅胶色谱是成本较高的纯化技术，在工业规模生产上并不常见。
令人惊奇地，发明人开发了新的提取方法，用于制备包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物。在该方法中，发明人使用了新的步骤来纯化包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的溶液。
本发明涉及在吸附树脂上通过的步骤在制备包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物中的应用。
本发明方法中使用的吸附树脂有利地是适合于吸附积雪草中包含的三萜杂苷类的树脂，例如苯乙烯-二乙烯基苯或者酚醛(formo-phenolic)型吸附树脂。
本发明还涉及制备包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物的方法，该方法包括以下步骤：
α)将包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的水溶液通过吸附树脂，和
β)将所述吸附树脂用包含至少30%重量的醇溶剂和任选的水的洗脱剂洗脱。
在本说明书的范围内，术语“醇溶剂”是指包含至少一个-OH醇官能团的溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、甘油，更特别是甲醇和乙醇。
在步骤α)期间，将包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的溶液通过吸附树脂，使这些三萜异苷类能优先吸附。
在步骤β)中使用的洗脱剂任选地是未稀释的醇溶剂，或者有利的是醇溶剂和水的混合物，优选包含50%-80%的醇溶剂，优选60%-70%的醇溶剂。
在该方法的一个有利的备选方案中，在步骤α)之前进行步骤a)，用于通过水或包含至少10%重量的水和任选的醇溶剂的溶剂混合物来提取积雪草的地上部分，由此获得包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的水溶液。
在本说明书的范围内，术语“积雪草的地上部分”是指积雪草叶，其由具有不超过5cm的叶柄的叶片组成。
使用该植物的地上部分有利地从积雪草植物中提取活性物质，主要目的是为了不破坏其根部，因此能够使这种多年生植物自然更新。
在本发明的方法的一个有利的备选方案中，提取步骤包括浸软步骤，在此期间，所述地上部分在搅拌下在水中或在包含水和任选的醇溶剂的溶剂混合物中被浸软。
在本说明书的范围内，“溶剂混合物”特别是指至少两种溶剂的混合物，优选两种溶剂的混合物，例如水和一种醇溶剂。
浸软是使用水或包含至少10%重量的水和任选的醇溶剂的溶剂混合物，在通常为20-90℃、优选50-70℃的温度下、尤其是50℃左右的温度下，以[积雪草]:[溶剂混合物]为1:2到1:20的比例，有利地进行通常20-180分钟的时间。
所得到的浸软混合物通常进行过滤，获得包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的水溶液。该过滤一般通过连续过滤来进行，通常使用600μm、100μm和25μm孔隙率的滤器。
在本发明的方法的一个备选方案中，在上述提取步骤后获得的水溶液任选地进行浓缩以减少进行处理的体积，得到包含2%-25%的干物资的浓缩溶液。
所得到的浓缩溶液任选地被碱化，有利地通过加入强无机碱来实现，例如固体或水溶液形式的碱性氢氧化物，例如氢氧化锂LiOH、氢氧化钠NaOH或氢氧化钾KOH，生石灰CaO，熟石灰Ca(OH)2，以便将浓缩溶液的pH调节到优选为8-12的pH值。所述强无机碱优选地选自NaOH、KOH和CaO。
加入强碱通常能够使金属和其他容易与强碱反应的物质发生沉淀，并通过过滤除去。一般来说，沉淀或絮凝的蛋白质和树脂状化合物随后通过过滤从碱化的混合物中除去。
在上述过滤步骤后得到的滤液可以接着任选地被酸化，有利地通过加入强无机酸来酸化，例如磷酸H3PO4、盐酸HCl、硝酸HNO3、硫酸H2SO4、高氯酸HClO4、氢溴酸HBr，或加入有机酸，例如带有一个或多个-COOH羧酸官能团的芳族或非芳族的有机化合物，例如甲酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸或碳酸。该酸化步骤适合于将滤液的pH调节到优选为5-7的pH值。所述强无机酸优选地选自H3PO4和HCl。所述有机酸优选地选自柠檬酸或碳酸。
所形成的盐和沉淀的化合物一般通过过滤从酸化的混合物中除去。
在该方法的一个有利的备选方案中，步骤β)之后进行以下步骤：
b)将步骤β)后获得的洗脱液通过脱色树脂，由此得到脱色的水相，和
c)将脱色的水相真空浓缩，由此获得包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物。
优选地，所得到的混合物由羟基积雪草苷、25%-65%的Terminoloside和20%-40%的积雪草皂苷组成。
优选地，所得到的提取物包含按提取物总重量计的25%重量-65%重量的Terminoloside和羟基积雪草苷的混合物，以及20%-40%重量的积雪草皂苷。
在本发明的方法的一个有利的备选方案中，在步骤β)后得到的洗脱液首先用活性炭处理。加入活性炭通常可以通过固定脂肪酸或氧化产物使洗脱液脱色。
该洗脱液(任选地用活性炭处理过)随后可以通过蒸馏醇溶剂来浓缩。浓缩的洗脱液接着例如过滤除去在水相中的不溶化合物。一部分积雪草皂苷通常在洗脱液浓缩期间沉淀，随后通常通过过滤分离。
在步骤b)期间，将在步骤β)中获得的洗脱液(任选地用活性炭处理过、任选地被浓缩和过滤)通过脱色树脂例如强阴离子苯乙烯-氯化物型树脂来脱色。
在本发明的方法的一个有利的备选方案中，脱色的水相接着任选地连续通过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂来处理，以便从水相除去溶解的盐和不希望的化合物。有利地，所用的阳离子树脂是具有磺酸酯型官能团的强阳离子树脂。有利地，所用的阴离子树脂是具有季铵型官能团的强阴离子树脂。在本发明的方法范围内，离子交换树脂的顺序是重要的，以便提高残余的酸性部分的固定。虽然如此，但也可以按照需要逆转该顺序。
连续通过阳离子和阴离子树脂可以有利地重复进行，或者甚至可以将脱色的水相通过所述树脂的混合床来进行。
在步骤c)期间，将脱色的水相(任选地通过阳离子和阴离子树脂进行处理)进行真空浓缩，所得浓缩物通常真空干燥或喷雾干燥。可以有利地通过使用切向过滤膜技术在有机或无机膜上进行浓缩，使用具有200kDa到100kDa的截断阈值的介质(即，使用具有200-100,000g/mol的分子量的分子)。
在步骤c)之后，获得通常包含按提取物总重量计为25%重量-65%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物以及20%重量-40%重量的积雪草皂苷的积雪草提取物。
在步骤c)之后，获得通常包含按提取物总重量计为25%重量-65%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
在步骤c)之后，获得通常包含按提取物总重量计为20%重量-40%重量的积雪草皂苷的积雪草提取物。
在本发明的范围内，术语“积雪草皂苷”是指根据式III的化学分子，任选地处于与任何其齐墩果烷型异构体的混合物中。
本发明还涉及制备精制的包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物的方法，该方法包括使用包含水和醇溶剂的溶剂混合物将按照上述方法获得的提取物重结晶的步骤。
适合于重结晶步骤的醇溶剂的例子包括乙醇、甲醇和丁醇或其混合物。
在本说明书的范围内，术语“精制的积雪草提取物”是指包含按提取物总重量计超过50%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
所述提取物通常包含按提取物总重量计低于15%重量的积雪草皂苷。
本发明的方法的重结晶步骤适合于除去积雪草皂苷的主要部分，因此增加了在所得精制的提取物中羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的含量。
重结晶纯化技术是基于化合物在溶剂中的热和冷溶解度的差异。固体化合物的溶解度通常随着温度上升。因此，当在热溶剂中溶解时，可以通过将溶液冷却到其过饱和状态而诱导其重结晶。因此，重结晶包括将待纯化的固体化合物置于一般在沸点下的溶剂或溶剂混合物中，随后冷却溶液，诱导固体结晶，随后过滤分离。溶质也可以通过蒸发溶剂浓缩而沉淀。
更具体而言，重结晶步骤包括以下步骤：
d)将根据上述方法的步骤c)得到的提取物溶解在达到40℃-70℃的温度的包含水和醇溶剂的溶剂混合物中，由此得到溶液，
e)将步骤d)得到的溶液温度降低到-20℃至30℃，由此得到冷却的混合物，
f)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
g)浓缩滤液，由此得到精制的包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物。
在本发明的范围内，重结晶溶剂混合物是包含水和醇溶剂的溶剂混合物。特别有利的重结晶溶剂混合物包含70%的水和30%的醇溶剂，优选乙醇或甲醇，优选达到55℃-65℃的温度，尤其是60℃左右。
重结晶溶剂混合物任选地达到沸腾，以使待纯化的提取物溶解。
在步骤c)后得到的提取物溶解期间，通常将溶剂混合物逐滴加入，以便能够在全部提取物溶解之时停止加入溶剂。
接着将所得溶液冷却，以便诱导积雪草皂苷结晶。温度的降低通常是缓慢的和逐步的，有利地历经1-250小时，优选100-250小时，以便增加所形成的积雪草皂苷晶体的纯度，因此在这些晶体中未捕获Terminoloside和羟基积雪草苷，这能够降低这些化合物在母液中的含量。冷却的混合物的温度通常为-10℃到10℃，优选-5℃到5℃。
冷却的混合物包括了形成的晶体和特别包含Terminoloside和羟基积雪草苷的母液，将混合物过滤，除去在所达到的温度下不溶的结晶和/或沉淀的固体化合物。所分离的晶体通常含有超过75%的积雪草皂苷，可以再使用。
所述滤液，也称为母液，将其通过蒸馏浓缩，并且通常真空干燥。
获得了积雪草的精制提取物，其通常包含按提取物总重量计超过50%重量、或超过60%、或超过70%的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物。
该提取物还包含按提取物总重量计低于15%重量、或低于10%的积雪草皂苷。
本发明还涉及制备纯化的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物的方法,该方法包括使用包含水和醇溶剂的溶剂混合物将上述方法的步骤g)所得的精制提取物纯化的步骤。
在本说明书的范围内，术语“纯化的积雪草提取物”是指包含按提取物总重量计超过90%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。该提取物通常包含按提取物总重量计低于6%重量的积雪草皂苷。
本发明的方法的纯化步骤通常能够除去超过40%或超过50%比例的在精制的积雪草提取物中包含的积雪草皂苷。
根据本发明的一个备选的实施方案，所述纯化步骤包括以下步骤：
h)向上述方法的步骤g)所得的精制提取物中加入达到温度25℃-65℃的包含醇溶剂和任选的水的溶剂混合物，由此得到溶液，
i)将溶液的温度降低到-20℃到30℃，由此得到冷却的混合物，
j)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
k)浓缩滤液，由此得到纯化的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
在步骤h)期间向上述方法的步骤g)所得的精制提取物中加入的溶剂混合物有利地包含至少85%重量的醇溶剂，优选至少95%。该溶剂混合物有利地达到30℃-50℃的温度，尤其是45℃左右的温度。
在步骤g)所得的提取物溶解期间，通常将溶剂混合物逐滴加入，以便能够在全部提取物溶解之时停止加入溶剂。
接着将所得溶液冷却，通常是缓慢的和逐步的，有利地历经1-250小时，优选达到-15℃到15℃，优选-10℃到0℃，尤其是约-5℃。
冷却的混合物包括了形成的晶体和特别包含Terminoloside和羟基积雪草苷的母液，将混合物过滤，除去在所达到的温度下不溶的结晶和/或沉淀的固体化合物。所得滤液，也称为母液，将其通过蒸馏浓缩，并且通常真空干燥。
在本发明的方法的纯化步骤后，纯化的积雪草提取物通常包含按提取物总重量计超过90%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物。该提取物还包含按提取物总重量计低于6%重量的积雪草皂苷。
该纯化步骤可以有利地重复2-3次，以提高纯化的积雪草提取物中的羟基积雪草苷和Terminoloside的含量。重复该纯化步骤能够达到按提取物总重量计超过95%重量或甚至超过98%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物，以及按提取物总重量计低于3%重量或低于1%重量的积雪草皂苷。
步骤g)所得的精制的积雪草提取物和步骤k)所得的纯化的积雪草提取物可以任选地通过硅胶制备色谱进行后续纯化，以便提高其各自的羟基积雪草苷和Terminoloside含量。该色谱步骤使用作为洗脱溶剂的包含醇溶剂和水的溶剂混合物来进行。
在本说明书的范围内，在制备色谱期间使用的洗脱剂通常是极性溶剂。有利地，该溶剂是水和醇溶剂例如乙醇的混合物，优选包含水和乙醇以1:1的比例(50%水和50%乙醇)。
在本发明的范围内，在制备色谱期间使用的固定相是非极性的固定相。有利地，所述固定相由接枝的非极性的硅石组成。所述非极性的接枝侧链有利地具有2-18个碳原子，更有利地是12-18个碳原子。
本发明还涉及制备纯化的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将积雪草的地上部分使用水或包含至少10%重量的水和任选的醇溶剂的溶剂混合物进行提取，由此得到溶液，
α)将所述溶液通过吸附树脂，
β)将所述吸附树脂用包含至少30%重量的醇溶剂和任选的水的洗脱剂洗脱，由此得到洗脱液，
b)将洗脱液通过脱色树脂，由此得到脱色的水相，
c)将脱色的水相浓缩，由此获得提取物，
d)将步骤c)得到的提取物溶解在达到40℃-70℃的温度的包含水和醇溶剂的溶剂混合物中，由此得到溶液，
e)将步骤d)得到的溶液的温度降低到-20℃至30℃，由此得到冷却的混合物，
f)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
g)浓缩滤液，由此得到精制的提取物，
h)向上述方法的步骤g)所得的精制提取物中加入达到温度25℃-65℃的包含醇溶剂和任选的水的溶剂混合物，由此得到溶液，
i)将溶液的温度降低到-20℃到30℃，由此得到冷却的混合物，
j)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
k)浓缩滤液，由此得到纯化的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
实施例
实施例1
制备积雪草的粗提取物
将1公斤的积雪草叶(切下的叶)浸没在20升加热到70℃的水中。将混合物在搅拌下使之浸软2小时，通过在逐步增加孔隙率(600μm、随后100μm、随后25μm)的滤器上连续过滤来过滤该混合物。
这产生了16.2升的粗制液体提取物，包含2%干物质，具有按干物质总重量计为11.8%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及10.9%重量的积雪草皂苷的滴度。
制备半精制的积雪草提取物
将粗制液体提取物通过RES-00820(Burgundy)型吸附树脂，并且所述树脂接着用由70%乙醇和30%水(v/v)组成的洗脱剂洗脱。
将回收的乙醇洗脱液通过RES-01541(Burgundy)型阴离子脱色树脂，并将脱色相通过蒸馏脱醇并真空浓缩，由此得到脱色的水性浓缩液。将该浓缩液冷冻干燥。
这产生了70g半精制的提取物，具有按提取物总重量计为47.2%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及37.4%重量的积雪草皂苷的滴度。
制备精制的积雪草提取物
将半精制的提取物溶解在达到温度60℃的包含70%水和30%甲醇的溶液中。在所述提取物完全溶解后，将溶液温度历经240小时降低到温度5℃(低温恒温器，随后储存在冷藏库中)。
将所得冷却的混合物过滤，将滤液通过蒸馏脱醇并真空浓缩，由此得到精制的水性浓缩液。接着将该浓缩液冷冻干燥。
这产生了45g精制的提取物，具有按提取物总重量计为67.2%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及低于10%重量(4.5%)的积雪草皂苷的滴度。
制备纯化的积雪草提取物
将精制的提取物溶解在达到温度45℃的包含5%水和95%甲醇的溶液中。在所述提取物完全溶解后，将溶液温度历经120小时降低到温度5℃。
将所得冷却的混合物过滤，将滤液通过蒸馏脱醇并真空浓缩，由此得到纯化的水性浓缩液。接着将该浓缩液冷冻干燥。
这产生了20g纯化的提取物，具有按提取物总重量计超过90%重量(91.2%)的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及低于6%重量(3.1%)的积雪草皂苷的滴度。
实施例2
制备积雪草的粗提取物
将1公斤的积雪草叶(切下的叶)浸没在15升加热到50℃的70%体积的乙醇中。将混合物在搅拌下使之浸软2小时，通过在逐步增加孔隙率(600μm、随后100μm、随后25μm)的滤器上连续过滤来过滤该混合物。
接着将滤液通过蒸馏脱醇，将浓缩的滤液过滤。
这产生了3.7升的粗制液体提取物，包含9%干物质，具有按干物质总重量计为11.2%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及8.6%重量的积雪草皂苷的滴度。
制备半精制的积雪草提取物
将粗制液体提取物通过RES-00408(Burgundy)型吸附树脂，并且所述树脂接着用由60%乙醇和40%水(v/v)组成的洗脱剂洗脱。
将回收的乙醇洗脱液接着蒸馏脱醇，并通过RES-01953(Burgundy)型阴离子脱色树脂，随后通过RES-01747(Burgundy)型阳离子交换树脂，随后通过RES-02056(Burgundy)型阴离子交换树脂。将所得的脱色且去离子化的相真空浓缩，由此得到脱色且去离子化的水性浓缩液。将该浓缩液冷冻干燥(任选地用喷雾干燥替换)。
这产生了60g半精制的提取物，具有按提取物总重量计为47.2%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及27.4%重量的积雪草皂苷的滴度。
制备精制的积雪草提取物
将半精制的提取物溶解在达到温度60℃的包含70%水和30%甲醇的溶液中。在所述提取物完全溶解后，将溶液温度历经240小时降低到温度5℃(低温恒温器，随后储存在冷藏库中)。
将所得冷却的混合物过滤，将滤液通过蒸馏脱醇并真空浓缩，由此得到精制的水性浓缩液。接着将该浓缩液冷冻干燥。
这产生了35g精制的提取物，具有按提取物总重量计为67.5%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及13.2%重量的积雪草皂苷的滴度。
制备纯化的积雪草提取物
将精制的提取物溶解在达到温度45℃的包含5%水和95%甲醇的溶液中。在所述提取物完全溶解后，将溶液温度历经120小时降低到温度5℃。
将所得冷却的混合物过滤，将滤液通过蒸馏脱醇并真空浓缩，由此得到纯化的水性浓缩液。接着将该浓缩液冷冻干燥。
这产生了20g纯化的提取物，具有按提取物总重量计超过90%重量(91.5%)的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的滴度以及低于6%重量(4.6%)的积雪草皂苷的滴度。
Claims (6)
1.制备精制的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物的方法，该方法包括以下步骤：
α)将包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的水溶液通过吸附树脂，
β)将所述吸附树脂用包含至少30%重量的醇溶剂和任选的水的洗脱剂洗脱，和
重结晶的步骤，该步骤使用包含水和醇溶剂的溶剂混合物，所述醇溶剂优选地选自乙醇、甲醇和丁醇，
由此得到所述精制的积雪草提取物。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤α)之前进行以下步骤：
a)将积雪草的地上部分使用水或包含至少10%重量的水和任选的醇溶剂的溶剂混合物进行提取，
由此获得包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的水溶液。
3.根据权利要求1或2任一项的方法，其中在步骤β)之后进行以下步骤：
b)将步骤β)后获得的洗脱液通过脱色树脂，由此得到脱色的水相，
c)将脱色的水相浓缩，
由此获得包含羟基积雪草苷、Terminoloside和积雪草皂苷的混合物的积雪草提取物。
4.根据权利要求3的方法，其中重结晶步骤包括以下步骤：
d)将步骤c)得到的提取物溶解在达到40℃-70℃的温度的包含水和醇溶剂的溶剂混合物中，由此得到溶液，
e)将步骤d)得到的溶液的温度降低到-20℃至30℃，由此得到冷却的混合物，
f)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
g)浓缩滤液，
由此得到精制的包含按提取物总重量计超过50%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
5.制备纯化的包含羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物的方法，该方法包括使用包含水和醇溶剂的溶剂混合物将根据权利要求1-4任一项的方法所得到的精制提取物进行纯化的步骤。
6.根据权利要求5的方法，其中所述纯化步骤包括以下步骤：
h)向根据权利要求1-4任一项的方法所得到的精制提取物中加入达到温度25℃-65℃的包含醇溶剂和任选的水的溶剂混合物，由此得到溶液，
i)将溶液的温度降低到-20℃到30℃，由此得到冷却的混合物，
j)将冷却的混合物过滤，由此得到滤液，
k)浓缩滤液，
由此得到纯化的包含按提取物总重量计超过90%重量的羟基积雪草苷和Terminoloside的混合物的积雪草提取物。
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