CN113801184A - 一种羟基积雪草苷的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及一种羟基积雪草苷的纯化方法。具体包括如下步骤：(1)以甲醇为溶剂，将羟基积雪草苷粗品溶解；(2)浓缩，蒸除溶剂；(3)加入晶种，降温并析晶；(4)过滤，干燥，即得。本发明通过选择打浆溶剂、打浆溶剂体积、纯化方式、溶解体积、浓缩析晶体积、析晶温度、干燥方式和温度、干燥方式和温度等关键影响因素，有效的控制了羟基积雪草苷晶体成核和晶体成长速度，从而保证了产品的晶体质量。使用本发明的纯化方法，可得到白色或类白色结晶性粉末，其甲醇溶剂残留小于0.3％，羟基积雪草苷的含量高于90％。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种羟基积雪草苷的纯化方法。
背景技术
羟基积雪草苷又名羟基积雪草甙，英文名Madecassoside，其CAS号为34540-22-2，分子式：C48H78O20，分子量：975.13，结构如式Ⅰ所示：
现代药理研究报道，羟基积雪草苷具有祛疤痕、促进伤口愈合等作用，可用于治疗皮肤溃疡，如顽固性创伤、皮肤结核、麻风等。目前羟基积雪草总苷主要从积雪草中提取得到，积雪草含有三萜类、多炔烯烃类、黄酮类、生物碱和多元酚成分(包括正二十七烷、2,4,6-三叔丁基苯、β一谷甾醇、月桂酸、山奈酚、对羟基苯甲酸、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖、积雪草酸、羟基积雪草酸、终油酸、万寿菊素、槲皮素、二十六醇辛酸酯、胡萝卜苷、香草酸、丁二酸、积雪草二糖苷等)，上述成分与羟基积雪草苷结构差异较大，通过结晶可以有效清除上述杂质。但积雪草苷(式Ⅱ)和积雪草苷B(式Ⅲ)两成分，其结构与羟基积雪草苷的较为接近，仅通过常规的结晶纯化方法很难除掉，是羟基积雪草苷制备过程中主要杂质，因此，如何有效去除积雪草苷B和积雪草苷对羟基积雪草苷的质量控制尤为重要。
目前已有报道中，关于羟基积雪草苷的纯化工艺主要有：通过制备型高效液相色谱分析方法，以环糊精作为流动相添加剂法分离，缺点为：使用溶剂量较大，生产成本较高，不适用于未来工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种羟基积雪草苷的纯化方法。
本发明羟基积雪草苷的纯化方法是以现有方法制备的羟基积雪草苷粗品为原料，经过精制结晶步骤，制得相对晶型更好，溶解残留少，有关物质含量高的羟基积雪草苷产品。
其中，羟基积雪草苷可通过如下方法制得：
CN102477063A公开了一种羟基积雪草苷与积雪草苷B的提纯方法，通过制备型高效液相色谱进行分离纯化的得到高纯度的羟基积雪草苷。
CN107903296A公开了一种羟基积雪草苷的提纯方法，通过大孔树脂柱进行分离纯化的得到高纯度的羟基积雪草苷。
CN101983966B公开了一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺，低积雪草苷含量总苷在50～65℃下用甲醇加热溶解，冷却结晶分别得到高纯度的羟基积雪草苷和积雪草苷，但采用该工艺得到的羟基积雪草苷纯度和收率均较低。
羟基积雪草苷的制备方法不限于上述方法，可以为其它现有技术的羟基积雪草苷粗品制备方法。
本发明羟基积雪草苷的纯化方法，包括如下步骤：
(1)以甲醇为溶剂，将羟基积雪草苷粗品溶解；
(2)浓缩，蒸除溶剂；
(3)加入晶种，降温并析晶；
(4)过滤，干燥，即得。
其中，
步骤(1)优选加热溶解，所述溶解温度为60-65℃；
步骤(1)中甲醇体积量为羟基积雪草苷粗品重量的10-20倍，即10-20V；优选的，甲醇体积量为15V；具体为20.00g羟基积雪草苷粗品加入300mL甲醇；
步骤(2)中在40-50℃，P≤-0.08MPa条件下，浓缩至体系剩余体积为7-9V后停止浓缩；
步骤(3)中加入羟基积雪草苷粗品0.01倍量的羟基积雪草苷晶种，自然降温至20-30℃，保温析晶0.5-1.0小时；
步骤(4)中将滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物。
进一步的，步骤(4)中过滤后可取样进行HPLC检测，若有关含量小于90％，重复步骤(1)至(3)后继续进行检测。
优选的，纯化方法为：
向500ml反应瓶中依次加入15V(300mL)无水甲醇和羟基积雪草苷(20.00g)，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至60-65℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于40-50℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至7-9V后停止浓缩；向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至20-30℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼取样进行HPLC检测。
若有关含量小于90％，重复此结晶操作后继续进行检测；有关含量大于90％后，将滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物。
本发明以现有方法制备的羟基积雪草苷粗品为原料，经过精制结晶步骤，制得相对晶型更好，溶解残留少，有关物质含量高的羟基积雪草苷产品。通过选择打浆溶剂、打浆溶剂体积、纯化方式、溶解体积、浓缩析晶体积、析晶温度、干燥方式和温度等关键影响因素，有效的控制了羟基积雪草苷晶体成核和晶体成长速度，从而保证了产品的晶体质量。使用本发明的纯化方法，可得到白色或类白色结晶性粉末，其甲醇溶剂残留小于0.3％，羟基积雪草苷的含量高于90％。
以下通过试验例进一步说明本发明纯化方法的优化过程：
1.1打浆溶剂
表1羟基积雪草苷打浆溶剂
选择异丙醇、甲醇和乙腈对羟基积雪草苷的打浆效果进行考察。根据表1试验结果可知，甲醇作为打浆溶剂得到羟基积雪草苷的有关含量明显提高，而其它溶剂打浆效果较差，因此最终确定甲醇作为打浆溶剂。
1.2打浆溶剂体积
表2羟基积雪草苷打浆溶剂体积
虽然甲醇作为打浆溶剂得到羟基积雪草苷含量较高，但是甲醇作为打浆溶剂的收率较低，因此对甲醇的用量进行了考察(5V、10V、20V)。根据表2试验结果可知，随着甲醇用量的增加，得到羟基积雪草苷含量有一定的提高，但收率明显降低。推测可能是其他杂质与羟基积雪草苷的结构较为接近，在甲醇中的溶解度有一定差别。后续对纯化方式进行筛选，考察是否能够通过重结晶有效提高羟基积雪草苷含量和结晶收率。
1.3纯化方式
表3羟基积雪草苷纯化方式
由于甲醇打浆收率较低，因此对纯化方式进行了考察。根据表3试验结果可知，采用相同体积甲醇溶解后浓缩析晶得到羟基积雪草苷含量和收率明显提高，且产品性状较好。因此，选择重结晶方式纯化提高羟基积雪草苷的含量，并进行不同结晶条件的筛选。
1.4溶解体积
表4羟基积雪草苷溶解体积
本发明对不同溶解体积进行了考察。根据表4试验结果可知，随着甲醇体积的减少，羟基积雪草苷的溶解速率明显增降低，当甲醇体积小于10.0V，部分羟基积雪草苷不能溶解。对于本发明所述羟基积雪草苷而言，若重结晶过程中溶解不充分可能会导致部分杂质包裹，从而导致结晶纯化效果变差。因此，确定溶解体积为15.0V，减少溶剂用量，便于生产操作，同时可以保证羟基积雪草苷的快速溶解。
1.5浓缩析晶体积
表5羟基积雪草苷浓缩析晶体积
本发明对不同重结晶的浓缩析晶体积进行了考察。根据表5试验结果可知，随着浓缩剩余体积的减少，羟基积雪草苷含量变化较小，但收率变化较大。浓缩析晶体积为7.0-9.0V时，得到羟基积雪草苷含量和收率均较高。
1.6析晶温度
表6羟基积雪草苷析晶温度
本发明对不同析晶温度(20-30℃、10-20℃、-10-0℃)进行了考察。根据表6试验结果可知，随着析晶温度的降低，羟基积雪草苷的有关含量变化较小，但收率明显降低，分析是由于羟基积雪草苷在甲醇中的界面能偏小，较难形成晶体，不同温度条件下羟基积雪草苷晶体的诱导期不同。因此，综合考虑确定最优析晶温度为20～30℃。
1.7干燥方式和温度
表7羟基积雪草苷干燥方式
表8羟基积雪草苷干燥温度
根据文献报道，羟基积雪草苷的热稳定性较差，因此本发明进行了羟基积雪草苷在甲醇溶液中的稳定研究，根据表7试验结果可知，羟基积雪草苷在甲醇溶液中，50-60℃条件下搅拌2小时，观察到降解，积雪草苷含量明显降低。因此，优先考察低温干燥条件，是否可以得到合格的羟基积雪草苷。
根据表8试验结果可知，当干燥温度为40-45℃时，得到羟基积雪草苷的甲醇残留含量较高，干燥温度提高至55-60℃得到羟基积雪草苷的甲醇残留含量为0.030％，符合ICHQ3C中限度要求；同时相较于真空干燥，鼓风干燥得到的羟基积雪草苷有关含量略有降低。因此，确定干燥方式为55-60℃真空干燥8-10小时，可以得到甲醇溶剂残留符合限度的羟基积雪草苷。
2样品检测
2.1分析方法
2.1.1气相色谱
分析方法：中国药典2015年版四部通则0861第二法
色谱条件：以6％氰丙基和94％聚二甲硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱；起始温度为40℃，维持10分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持10min；进样口温度为200℃，检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为85℃，平衡时间30min。
供试品溶液的制备：取取本发明实施例1样品约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入2ml N,N-二甲基甲酰胺使溶解，密封，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称取甲醇适量，置量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中约含甲醇300μg的溶液，精密量取2ml，置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。
测定法：取供试品溶液与对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，甲醇的残留量均应符合规定。
2.1.2液相色谱
参考依据：中国药典2015版一部积雪草总苷
分析方法：照高效液相色谱法(通则0512)测定
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈：水(2mmol/L倍他环糊精)＝24:76为流动相；检测波长为205nm，柱温为30℃。
供试品溶液的制备：取本发明实施例1样品适量，用50％甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含本品为1mg的溶液。
测定法：精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.2检测结果
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
市售羟基积雪草苷纯度为70-85％，纯度较低，不适用于药学研究。本发明过程简单、生产成本低、污染少、产品收率和纯度高，适合于工业化生产，同时不涉及毒性大的溶剂，具有环保、对仪器设备要求不高等优点。
附图说明
图1甲醇300ppm标准限度气相图谱
图2本发明样品甲醇溶剂残留气相图谱
图3含量测定空白对照液相图谱
图4本发明样品含量测定液相图谱
具体实施方式
为更好的理解本发明，提供如下实施例，但其不够构成对本发明保护范围的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用物料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
向500ml反应瓶中依次加入300mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至60℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于50℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至8V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至25℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼取样进行HPLC检测，有关含量大于90％后，将滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物16.2g，纯度91.58％。
实施例2
向500ml反应瓶中依次加入360mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至65℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于50℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至7V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至25℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物17.0g，纯度91.00％。
实施例3
向500ml反应瓶中依次加入200mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至60℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于45℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至8V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至20℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物16.1g，纯度90.42％。
实施例4
向500ml反应瓶中依次加入400mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至65℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于50℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至9V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至30℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物15.7g，纯度92.01％。
实施例5
向500ml反应瓶中依次加入360mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至60℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于45℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至8V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至30℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物16.6g，纯度91.53％。
实施例6
向500ml反应瓶中依次加入260mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至65℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于40℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至7V后停止浓缩。向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至20℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物17.01g，纯度91.05％。
Claims (9)
1.一种羟基积雪草苷的纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)以甲醇为溶剂，将羟基积雪草苷粗品溶解；
(2)浓缩，蒸除溶剂；
(3)加入晶种，降温并析晶；
(4)过滤，干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，甲醇加热溶解，溶解温度为60-65℃。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，甲醇体积量为羟基积雪草苷粗品重量的10-20倍，即10-20V。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，甲醇体积量为15V。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在40-50℃、P≤-0.08MPa条件下，浓缩至体系剩余体积为7-9V后停止浓缩。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入羟基积雪草苷粗品0.01倍量的羟基积雪草苷晶种，自然降温至20-30℃，保温析晶0.5-1.0小时。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将滤饼于55-60℃，P≤-0.08MPa条件下真空干燥8-10小时，得到羟基积雪草苷精制物。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中过滤后可取样进行HPLC检测，若有关含量小于90％，重复步骤(1)至(3)后继续进行检测。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，
向500ml反应瓶中依次加入300mL无水甲醇和20.00g羟基积雪草苷，搅拌混合10-15分钟，搅拌升温至60-65℃，待羟基积雪草苷完全溶解后将结晶体系于40-50℃，P≤-0.08MPa条件下浓缩至体系至7.0-9.0V后停止浓缩；向结晶体系加入0.20g羟基积雪草苷，自然降温至20-30℃后保温析晶0.5-1.0小时，将反应体系过滤，滤饼取样进行HPLC检测。
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