CN113655130B - 一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法及应用。本发明的人参皂苷Ro的HPLC检测方法包括以下步骤：(1)制备人参皂苷Ro的对照品溶液；(2)采用高效液相色谱紫外检测器法，检测对照品溶液，检测条件包括：流动相为乙腈‑磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述磷酸水溶液的pH为4.0‑6.0。梯度洗脱的条件包括：0～16min，乙腈由23％提升到49％；16～28min，乙腈由49％提升到100％；28～36min，乙腈由100％降低至23％。本发明的检测方法，基线稳定，Ro出峰的峰形好，能够加快人参皂苷Ro的检出时间，缩短检测周期，快捷灵敏，保留时间稳定可靠，可应用于人参及其制品的质量控制。

Description

一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法及应用
技术领域
本发明属于中药技术检测领域，具体地说，涉及一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法及应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体恤欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生产等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。
目前由于过度采挖、环境破坏等，野生人参资源几乎灭绝，大田栽培是人参的主要来源。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，栽培技术复杂以及农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。大田栽培人参供应难以满足市场的需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。
人参化学成分复杂，现代药物学研究表明，人参皂苷是人参内在质量的重要指标之一。人参皂苷Ro为齐墩果酸型人参皂苷，在水中有较大的溶解度。人参皂苷Ro对中枢神经有一定的安定作用，具有可促进纤维蛋白溶解系统活化等药理特性。人参皂苷的测定方法有大量研究报道，而人参皂苷RO的报道却较少。现有的人参皂苷RO的检测方法大多为LC/MS二级阵列检测器、蒸发光散射检测器法，也有采用HPLC紫外检测器法测定人参皂苷RO，但存在检测周期长、批次之间不稳定，偏差大的问题。
申请号为CN201611215164.1的中国申请公开了一种红参中5种皂苷类成分的含量测定方法，采用高效液相法同时测定红参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1及人参皂苷Ro五种皂苷类成分，其中人参皂苷Ro的保留时间超过了25min，检测周期长，效果较低。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法及应用。本发明的检测方法，能够加快人参皂苷Ro的检出时间，缩短检测周期，快捷灵敏，稳定可靠，可应用于人参及其制品的质量控制。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种人参皂苷Ro的HPLC检测方法，包括以下步骤：
(1)制备人参皂苷Ro的对照品溶液；
(2)采用高效液相色谱紫外检测器法，检测对照品溶液，检测条件包括：流动相为乙腈-磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述磷酸水溶液的pH为4.0-6.0。
本发明中通过控制流动相中磷酸水溶液的pH，能够稳定的控制人参皂苷Ro的保留时间，用磷酸调水相PH的范围(4.0-6.0)可以调节人参皂苷Ro的保留时间，变化范围在8.0-15min之间，PH值越小保留时间越大，峰形越好，可根据自己的实验条件调节PH值的大小，避开和其他的标品峰重合，也可避开部分杂质的干扰。当磷酸水溶液的pH不在该范围时，基线则不稳定，无法进行试验。
本发明的人参皂苷Ro的HPLC检测方法，能够加快人参皂苷Ro的检出时间，缩短检测周期，快捷灵敏，稳定可靠，可应用于人参及其制品的质量控制。
进一步的方案，所述磷酸水溶液的pH为4.3-5.5。当流动相磷酸水溶液的pH为4.3-5.5时，基线稳定，且峰形较好；另外，pH越低，峰形越好，检测精度好。
进一步的方案，所述磷酸水溶液的pH为4.6。
进一步的方案，所述梯度洗脱的条件包括：0～16min，乙腈由23％提升到49％；16～28min，乙腈由49％提升到100％；28～36min，乙腈由100％降低至23％。
发明人经过大量实验发现，采用如上的洗脱梯度时，基线稳定，峰形好，为人参皂苷Ro的定检出提供了基础。
进一步的方案，所述梯度洗脱的条件包括：0～16min，乙腈由23％提升到49％，体积流量0.6mL/min；16～17min，乙腈由49％提升到100％，体积流量1.0mL/min；17～28min，乙腈维持100％，体积流量1.0mL/min；28～29min，乙腈由100％降低至23％，体积流量1.0mL/min；29～36min，乙腈维持23％，体积流量1.0mL/min。
本发明的梯度洗脱条件下，初期流量小，后期流量较大，有利于准确检测Ro样品含量。
进一步的方案，检测条件还包括：检测波长为203nm；柱温为30℃；进样量为10uL。
进一步的方案，色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18柱，长度为250mm×4.6mm，粒径为5um。
进一步的方案，步骤(1)中，制备人参皂苷Ro、Re和Rc的对照品溶液的方法包括：取人参皂苷Ro标准品13mg，人参皂苷Re、Rc标准品各12mg到25ml容量瓶中，加甲醇制成人参皂苷Ro质量浓度为0.52mg/mL，人参皂苷Re、Rc质量浓度分别为0.48mg/mL的对照品溶液，经0.22um滤膜过滤，备用。
进一步的方案，人参皂苷RO的保留时间在8.00-15min之间；
优选的，流动相中，磷酸水溶液的pH为4.6时，人参皂苷RO的保留时间稳定，峰形好，操作方便。
样品溶液的制备：
称取新鲜人参的粉碎样品1.00g(按含水量折算出干物质的量)，加入80％的甲醇溶液定容至10ml，混匀、超声30分钟，再用0.20um的滤膜过滤，备用。
本发明中所述新鲜人参包括人参不定根。
进一步的方案，所述人参不定根的培养方法包括：将成熟人参清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根。
目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。
鉴于成熟人参参龄较长，成熟度高，不易再进行分化，目前还没有可以直接从成熟人参诱导不定根的报道。而本发明经过大量的试验，意外的发现在特定诱导培养基上，成熟人参切片可以直接诱导产生不定根，如此，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
进一步的方案，所述诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-0.6mg/L激动素，0.75-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/LWPM培养基。
上述方案的诱导培养基，实现了成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
本方案中，萘乙酸是植物生长调节剂，赤霉素是植物激素，都可以促进不定根形成。激动素为一种细胞分裂素，可以促进细胞的分裂。柠檬酸和抗坏血酸能够产生协同抗氧化的作用，防止成熟人参离体组织褐变，有利于从成熟参离体组织直接诱导不定根。诱导培养基中各个成分协同作用，最终实现了从成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，而不需要诱导愈伤组织的中间步骤。
进一步的方案，所述诱导培养基还包括20-60g/L蔗糖和1-6g/L植物凝胶。
进一步的方案，所述诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基。
进一步的方案，所述诱导培养基还包括30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶。
上述成分配比下的诱导培养基，对成熟参的产生不定根的诱导效果最好，产生的不定根数量多，质量好，有利于下一步扩繁，提高不定根中的活性成分含量。
进一步的方案，所述液体培养基为以B5培养基、WPM培养基或者以1/2MS培养基为基础培养基，含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖。
本发明中，对诱导产生的不定根进行进一步的液体培养时，可以采用常规培养的培养基，如1/2MS培养基，与常用的不定根的培养基保持一致，说明通过本发明一步法诱导产生的不定根，与其他两步法无异，均可以采用常规培养基培养，同时还缩短了诱导时间，降低了污染风险。
进一步的方案，所述切片为宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片。
进一步的方案，人参不定根的培养方法，包括以下步骤：
(1)将成熟人参清洗消毒后，切片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出人参不定根；
(2)将步骤(1)获得的人参不定根接种到和步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)将步骤(2)获得的人参不定根，剪切成小段，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根。
进一步的方案，所述成熟人参的参龄为3年以上；优选的，成熟人参的参龄为6年以上。
作为一种优选的实施方案，所述成熟人参为百年人参。百年人参在自然界非常罕见，具有很高的食用、药用价值，可补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。其价值远大于种植的参龄短的人参。本发明不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从百年人参切块直接一步诱导获得不定根，不但可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，还可以获得母本百年老参中特有的功能成分，从而获得营养价值更好的不定根。
进一步的方案，将所述成熟人参的主根部、或芦头、或艼部、或支根、或须根清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根。
进一步的方案，所述人参选自野山参、移山参，林下参，园参；
优选的，所述人参为野山参。作为一种具体的优选实施方式，本发明的培养不定根的步骤具体包括：
(1)不定根的诱导
清洗成熟人参的主根部，消毒除菌后，切成宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片，接种到含有4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基的诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出人参不定根。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的人参不定根接种到和步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的人参不定根，剪切成长度为1-2cm左右的组织，接种到含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖的液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根。
本发明的第二目的是提供一种如上任意一种方案或者组合方案所述的人参皂苷Ro的HPLC检测方法在人参和人参制品的质量检测中的应用。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明的人参皂苷Ro的HPLC检测方法，能够加快人参皂苷Ro的检出时间，缩短检测周期，快捷灵敏，稳定可靠，可应用于人参及其制品的质量控制。
2、常用的乙腈和水的梯度洗脱人参皂苷RO的保留时间极不稳定，无法判断人参皂苷RO在样品中的准确位置，进而无法检测样品中人参皂苷RO。而本发明中通过控制流动相中磷酸水溶液的pH，能够稳定的控制人参皂苷Ro的保留时间，用磷酸调水相PH的范围(4.0-6.0)可以调节人参皂苷Ro的保留时间，变化范围在8.0-15min之间，PH值越小保留时间越大，峰形越好，可根据自己的实验条件调节PH值的大小，避开和其他的标品峰重合，也可避开部分杂质的干扰。
3、本发明的检测方法，改进了梯度洗脱条件，并配合梯度洗脱控制各阶段的体积流量，从而加快了人参皂苷Ro的检出时间，缩短了检测周期，提高了效率。
4、本发明的不定根的培养方法，实现了采用一步法，将成熟人参的各部分处理后接种到诱导培养基中直接诱导出人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，降低污染风险。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是本发明实施例1中对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Re的保留时间为9.846min，人参皂苷Ro的保留时间为14.124min，人参皂苷Rc的保留时间为14.935min。
图2是本发明实施例1中样品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为14.087min，人参皂苷Re的保留时间为9.840min。
图3是本发明实施例2中对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为10.579min，人参皂苷Re的保留时间为9.761min，人参皂苷Rc的保留时间为14.772min。
图4是本发明实施例3中对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为12.462min，人参皂苷Re的保留时间为9.788min，人参皂苷Rc的保留时间为14.870min。
图5是本发明实施例4中对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为14.360min，人参皂苷Re的保留时间为9.880min，人参皂苷Rc的保留时间为15.003min。
图6是本发明实施例5中对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro和人参皂苷Rc的保留时间重合，为14.956min，人参皂苷Re的保留时间为9.867min。
图7是本发明对比例1中检测对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为7.647min，人参皂苷Re的保留时间为9.665min，人参皂苷Rc的保留时间为14.687min；
图8是本发明对比例1中再次检测对照品溶液的色谱图；其中，人参皂苷Ro的保留时间为8.299min，人参皂苷Re的保留时间为9.637min，人参皂苷Rc的保留时间14.677min；
图9是采用本发明实施例6诱导培养基诱导不定根的示意图；
图10是采用对比例2的诱导培养基诱导不定根的示意图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1仪器与试剂
安捷伦Agilent 1260infinity II高效液相色谱仪，配有1260infinity II型液相色谱泵，1260infinity II型自动进样器1260，infinity II可变波长紫外检测器；XS205DU电子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；S210PH计，梅特勒-托利多公司。
对照品人参皂苷Ro(批号C18S8G43979)，购于上海源叶生物科技有限公司，含量98％以上；乙腈、甲醇为色谱纯；水为18.25MΩ·CM现制的超纯水，水机厂家为上海杲森仪器设备有限公司；其余试剂为分析纯。对照品人参皂苷Rc和人参皂苷Re。
2、对照品溶液的制备
取人参皂苷Ro标准品13mg、人参皂苷Rc 12mg和人参皂苷Re 12mg到25ml容量瓶中，加甲醇制成人参皂苷Ro质量浓度Ro为0.52mg/mL、人参皂苷Rc浓度为0.48mg/mL和人参皂苷Re的浓度为0.48mg/mL的对照品溶液，经0.22um滤膜过滤，备用。
样品溶液的制备
称取培养的新鲜人参不定根的粉碎样品1.00g(按含水量折算出干物质的量)，加入80％的甲醇溶液定容至10ml，混匀、超声30分钟，再用0.20um的滤膜过滤，备用。
3.HPLC检测方法
色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18柱(250mm×4.6mm，5um)；
流动相为乙腈-磷酸溶液，其中，磷酸溶液的pH为4.6；
梯度洗脱程序：0～16min，乙腈由23％提升到49％，体积流量0.6mL/min；16～17min，乙腈由49％提升到100％，体积流量1.0mL/min；17～28min，乙腈维持100％，体积流量1mL/min；28～29min，乙腈由100％降低至23％，体积流量0.6mL/min；29～36min，乙腈维持23％，体积流量0.6mL/min。
检测波长203nm；柱温:30℃；进样量:10uL。
4、检测结果
检测对照品溶液的色谱图如图1所示，其中，人参皂苷Re的保留时间为9.846min，人参皂苷Ro的保留时间为14.124min，人参皂苷Rc的保留时间为14.935min。
检测样品溶液的色谱图如图2所示，其中，人参皂苷Re的保留时间为14.087min，人参皂苷Ro的保留时间为14.087min。
样品溶液中，人参皂苷Ro的含量占人参总干物质的量的0.1063％。
表1鲜人参粉碎人参皂苷Ro的含量(％)
名称 人参皂苷Ro的含量(％)
鲜人参 0.1063
实施例2
本实施例采用的仪器、试剂与实施例1相同，与实施例1的区别在于，本实施例中流动相为乙腈-磷酸溶液，其中，磷酸溶液的pH为5.5，其他检测方法参照实施例1进行。
本实施例检测对照品溶液的色谱图如图3所示，其中，人参皂苷Ro的保留时间为10.579min，人参皂苷Re的保留时间为9.761min，人参皂苷Rc的保留时间为14.772min。
实施例3
本实施例采用的仪器、试剂与实施例1相同，与实施例1的区别在于，本实施例中流动相为乙腈-磷酸溶液，其中，磷酸溶液的pH为PH＝5.0，其他检测方法参照实施例1进行。
本实施例检测对照品溶液的色谱图如图4所示，其中，人参皂苷Ro的保留时间为12.462min，人参皂苷Re的保留时间为9.788min，人参皂苷Rc的保留时间为14.870min。
实施例4
本实施例采用的仪器、试剂与实施例1相同，与实施例1的区别在于，本实施例中流动相为乙腈-磷酸溶液，其中，磷酸溶液的pH为PH＝4.3，其他检测方法参照实施例1进行。
本实施例检测对照品溶液的色谱图如图5所示，其中，人参皂苷Ro的保留时间为14.360min，人参皂苷Re的保留时间为9.880min，人参皂苷Rc的保留时间为15.003min。
实施例5
本实施例采用的仪器、试剂与实施例1相同，与实施例1的区别在于，本实施例中流动相为乙腈-磷酸溶液，其中，磷酸溶液的pH为PH＝4，其他检测方法参照实施例1进行。
本实施例检测对照品溶液的色谱图如图6所示，其中，人参皂苷Ro和人参皂苷Rc的保留时间重合，为14.956min，人参皂苷Re的保留时间为9.867min。该实施例中，人参皂苷Ro和人参皂苷Rc无法分离。
对比例1
本对比例参照实施例1的检测方法，区别在于流动相为乙腈和水(PH＝6.20)，洗脱梯度相同，在同一天采用同一批流动相检测对照品溶液，检测人参皂苷Ro的保留时间变化。
结果如图7和图8所示，第一次检测时，人参皂苷Ro的保留时间在7.647min，而在采用相同条件再次检测时，其保留时间在8.299min，因此采用乙腈和水为流动相，保留时间很不稳定。
实施例1-5中采用的新鲜人参不定根可由实施例6-10的方法培养获得。
实施例6
(1)不定根的诱导
将20年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
本实施例中，步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图9所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，成熟野山参切片上直接诱导产生了不定根。
实施例7
(1)不定根的诱导
将6年龄的园参的芦头清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括6mg/L萘乙酸，0.2mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，1.2g/L柠檬酸，0.1g/L抗坏血酸，20g/L蔗糖、5g/L植物凝胶，4g/L B5培养基和1.8g/L WPM培养基，pH值为5.6。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.6。
与实施例6结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。实施例1中采用的不定根为本实施例培养的不定根。
实施例8
(1)不定根的诱导
将10年龄的林下参的艼部清洗、消毒除菌后，切成宽0.7cm、长0.7cm和厚0.5mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括5mg/L萘乙酸，1mg/L赤霉素，0.1mg/L激动素，0.75g/L柠檬酸，0.03g/L抗坏血酸，40g/L蔗糖，4g/L植物凝胶，2g/L B5培养基和1g/L WPM培养基，pH值为6.0。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为2cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，WPM培养基和30g/L蔗糖，pH值为6.0。
与实施例6结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例9
(1)不定根的诱导
将15年龄的移山参的主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括1mg/L萘乙酸，0.5mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，1.5g/L柠檬酸，1g/L抗坏血酸，50g/L蔗糖、6g/L植物凝胶，1g/L B5培养基和2.4g/L WPM培养基，pH值为5.7。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，B5培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.7。
与实施例6结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
实施例10
(1)不定根的诱导
将百年的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
与实施例6结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
对比例2
本对比例与实施例6的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
本对比例步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图10所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，采用对比例1的培养基无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果，与对比例2图片展示类似，无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚乙酸，WPM，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果：第一周，通体颜色变黄，第三周，颜色加深，中部开始变成褐色，第五周，全部变成褐色，并呈干枯状。
试验例1方法学验证
1.线性关系考察
采用的流动相为：乙腈和磷酸水溶液(PH＝4.3)测定人参皂苷Ro的保留时间
方法：精密吸取人参皂苷对照品溶液0.010、0.020、0.040、0.080、0.160mL定容至1mL，10ul进样，以进样中人参皂苷质量(y)对峰面积积分值(X)作图，得到线性回归方程，结果见表1。
表1人参皂苷单体的回归方程
名称 保留时间 回归方程 r 线性范围/ug
人参皂苷RO 14.360 Y＝4.7720X-4.4401 0.99978 5.10-81.54
2.精密度实试验
按照实施例1中的色谱条件，用乙腈和磷酸水溶液(PH＝4.3)流动相，取对照品溶液10uL,重复进样6次，人参皂苷Ro峰面积的RSD为0.50％，结果表明仪器精密度良好。
3.重复性试验
按照实施例1中的色谱条件，用乙腈和磷酸水溶液(PH＝4.7)流动相，取对照品溶液10uL,重复进样6次，人参皂苷RO保留时间在13.913-13.957分钟之间，RSD为0.13％，结果表明用PH＝4.7的磷酸水-乙腈溶液作为流动相重复性好。
4.稳定性试验
按照实施例1中的色谱条件，用乙腈和磷酸水溶液(PH＝4.7)流动相，两天后从新过滤使用，取对照品溶液10uL,重复进样6次，人参皂苷RO保留时间在13.944-13.989分钟之间，RSD为0.13％，结果表明用PH＝4.7的磷酸水-乙腈溶液作为流动相检测稳定性良好。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (5)

1.一种人参中人参皂苷Ro、人参皂苷Rc和人参皂苷Re的HPLC检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备人参皂苷Ro、人参皂苷Rc和人参皂苷Re的对照品溶液和样品溶液；
（2）采用高效液相色谱紫外检测器法，检测对照品溶液和样品溶液，检测条件包括：流动相为乙腈-磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述磷酸水溶液的pH为4.3-5.5；检测波长为203nm；
色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18柱，长度为250 mm×4.6mm，粒径为5um；
所述梯度洗脱的条件包括：0～16min，乙腈由23％提升到49％，体积流量0.6 mL／min；16～17 min，乙腈由49％提升到100％，体积流量1.0 mL／min；17～28min，乙腈维持100％，体积流量1.0 mL／min；28～29 min，乙腈由100%降低至23％，体积流量1.0 mL／min；29～36min，乙腈维持23％，体积流量1.0 mL／min；
步骤（1）中，样品溶液的制备包括：称取培养的新鲜人参不定根的粉碎样品1.00g，加入80%的甲醇溶液定容至10ml，混匀、超声30分钟，再用0.20um的滤膜过滤。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的pH为4.6。
3.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，检测条件还包括：柱温为30℃；进样量为10uL。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，步骤（1）中，制备人参皂苷Ro的对照品溶液的方法包括：取人参皂苷Ro标准品13mg、人参皂苷Rc标准品 12mg和人参皂苷Re标准品 12mg到25ml容量瓶中，加甲醇制成人参皂苷Ro质量浓度为0.52mg/mL、人参皂苷Rc浓度为0.48mg/mL和人参皂苷Re的浓度为0.48mg/mL的对照品溶液，经0.22um滤膜过滤，备用。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，人参皂苷RO的保留时间在8.00-15min之间。
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