CN115531286A - 一种舒敏抗老型精华素 - Google Patents

Abstract

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种舒敏抗老型精华素。一种舒敏抗老型精华素，按100重量份数计，所述精华素的原料配方包含以下组分：沙棘干细胞提取物5～10份；多元醇保湿剂2～4份；尿囊素0.03～0.05份；EDTA‑二钠0.02～0.04份；卡波姆30～45份；氢化蓖麻油1～3份；防腐剂0.01～0.02份；香精0.015～0.03份；余量为水。本申请采用额外添加生物诱导子的继代培养基，培养得到的沙棘干细胞提取物中活性成分含量高，且具有很强的抗氧化活性，能够通过清除自由基等起到抗衰老作用。由此，本申请将所述沙棘干细胞提取物作为原料，结合添加不同的辅料，得到了一种精华素的配方。经测定，该精华素具有很强的抗衰老活性，同时具有较强的保湿能力，进一步发现其对皮肤的致敏性也有所降低。

Description

一种舒敏抗老型精华素

技术领域

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种舒敏抗老型精华素。

背景技术

植物是许多重要药用化学物质的来源。许多植物含有抗病毒、抗菌、抗癌和抗氧化等生理活性的化合物，对人类的肿瘤、衰老、心血管等多种疾病的防治具有重要意义。植物是探究新药的理想来源，因此越来越多的研究者关注植物次生代谢产物的生产。沙棘为胡颓子科落叶灌木或小乔木，分布在我国华北、西北、东北及西南等地，具有良好的经济价值和生态效益。沙棘含有多种维生素、黄酮类化合物、三萜及甾体类化合物、蛋白质、氨基酸、脂肪酸类、有机酸、糖和微量元素等多种物质。沙棘具有保护心血管、调节免疫力、保护肝脏、降血脂、抗炎、抗氧化等作用。

获取药用植物次生代谢产物的方法有许多种，目前多数是从药用植物中直接提取。但是很多药用植物生长缓慢，次生代谢产物的量低而且许多仅存于特定的植物器官中，难以适应现代制药工业生产的需求；采用化学合成也难以实现原料供应，因为很多次生代谢产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径繁杂，合成成本高。因此，尤其是对于一些珍稀濒危的中药来说，植物细胞培养依旧是获取次生代谢产物相对可行的选择。根据文献得知，利用诱导子来提高次生代谢产物，也是目前在药用植物细胞培养中常用的方法，其中最常用的是生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子主要包括病原菌(真菌、细菌、病毒与酵母)与植物细胞成分，其中主要是细胞壁水解产物，而非生物诱导子主要是起诱导作用的理化因子。

目前通过植物细胞培养成功的例子已经有很多，如从红豆杉中培养获得紫杉醇，从紫草中培养获得紫草素，从人参中培养获得人参皂苷等。尽管如此，植物细胞培养在工业生产中还存在很多局限性，如传统植物细胞培养需经历一个脱分化过程，但脱分化细胞的次生代谢产物丰度非常低，甚至根本没有，而且在这个过程中会发生体细胞突变，导致细胞系遗传稳定性降低；另外在长期培养过程中，细胞会受到环境的影响，增长慢、收益率低，阻碍其商业化生产。

植物干细胞又称为分生组织，是相对于植物体内已经分化的成熟组织而言的，是植物体内未分化的细胞。植物分生组织根据其位置可以分为顶端分生组织和侧生分生组织两大类。其中顶端分生组织包括茎尖分生组织和根尖分生组织；侧生分生组织包括维管形成层和木栓形成层。植物干细胞是生长发育的源泉和信号调控中心。它是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续分裂能力，是拥有永久生存能力的“不朽细胞”。植物干细胞培养技术是利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，在传统细胞培养的基础上，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞体系。

传统药用植物细胞培养需要经过脱分化过程，脱分化过程往往不彻底，出现部分分化现象；细胞不稳定，易出现体细胞突变现象，长期培养时，在培养初始阶段生长良好，但随着培养时间的延长，细胞生长速度降低，很多细胞出现褐变及死亡，细胞形态也发生变化；而药用植物干细胞培养的干细胞系在长期培养时，能保持稳定快速生长，形态也不会发生很大变化。当植物细胞以细胞团的形式而不是作为单个细胞被培养时，这种细胞团由于内外环境的差异，导致细胞生长发生变化。因此，在建立细胞的悬浮培养时，细胞的聚集度越低，越有利于细胞的生长。在进行大规模培养时，细胞容易受生物反应器中剪切力和细胞聚集的影响出现生长速度降低等问题。来自形成层的干细胞系含有大量的液泡，对剪切力灵敏度低，并且具有较低的聚集性，细胞生长能力不会受到影响。在低于-70℃的超低温条件下，有机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。传统组织培养的细胞在低温储藏之后存活率低，且恢复生长能力的延迟期漫长，而来自形成层的干细胞系在低温储藏后存活率很高，并能较快地重新生长。

药用植物干细胞培养作为一种新技术，是植物细胞培养的一个新阶段，其为解决传统细胞培养遇到的问题提供了一个全新的解决方案。但是到目前为止，药用植物干细胞培养仍然存在着一些不足和疑问。如来源于人参形成层的干细胞系提取物和培养物的抗衰老和抗氧化活性不是依赖于人参皂苷的作用，而且植物干细胞培养得到的细胞系中含有与常规野山参细胞不同的活性成分。但是由形成层得到的干细胞系是否含有与常规野山参不同的活性成分，以及为什么会合成新的活性物质，这种新的物质是什么，这一系列问题目前尚未得到更为深入的研究。

虽然已经利用植物干细胞培养技术成功得到某些药用植物的干细胞，但是植物不同，干细胞培养的建立方法也可能有所不同，因此还需要一定的实验对目前的方法进行完善。目前，药用植物干细胞技术由于各种原因还没有广泛应用。但是随着该技术的完善和推广，其巨大优势会逐渐显现出来，并将大大推动与之相关的食品、医药和化妆品等行业的发展。

发明内容

为了解决以上的技术问题，本申请提供了一种新的植物干细胞提取物及其制备方法，为化妆品领域提供了更多原料的选择，也进一步拓宽了干细胞植物提取物的来源和应用。本申请采用干细胞组织分离培养技术得到了沙棘形成层干细胞，同时通过大量实验得到优化后的、额外添加生物诱导子的继代培养基。后续实验检测发现，由该培养基培养得到的沙棘干细胞提取物中活性成分含量高，且具有很强的抗氧化活性，能够通过清除自由基等起到抗衰老作用。由此，本申请将所述沙棘干细胞提取物作为原料，结合添加不同的辅料，得到了一种精华素的配方。经测定，该精华素具有很强的抗衰老活性，同时具有较强的保湿能力，进一步对其进行安全评估发现其对皮肤的致敏性也有所降低。

为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种舒敏抗老型精华素，按100重量份数计，所述精华素的原料配方包含以下组分：

作为优选，按100重量份数计，所述精华素的原料配方由以下组分构成：

作为优选，所述多元醇保湿剂包含丙二醇、丙三醇、丁二醇、山梨醇、聚乙二醇和葡萄糖中的一种或多种。

作为优选，所述防腐剂为乙基己基甘油、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类中的一种。

作为优选，所述沙棘干细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

1)外植体消毒：选取沙棘外植体中生长状态良好的枝条，用洗洁精浸泡搓洗，再用蒸馏水搓洗干净，滤纸吸干外植体表面水分，将嫩茎剪成1cm小段，用75％酒精浸泡，无菌水清洗3次，然后用2％的HgCl浸泡，无菌水清洗5次备用；

2)无菌接种和培养：在超净工作台中将步骤1)消毒好的茎段表皮撕下，切成块状，倒置放于WPM培养基中，在培养箱中25℃，100r/min震荡暗箱培养，14天后将形成层干细胞转移至继代培养基中，每21天继代一次，得到沙棘形成层干细胞；

3)收集培养沙棘形成层干细胞后的继代培养基，过滤浓缩后保留其中的活性成分，将该培养基浓缩液和沙棘形成层干细胞的裂解物保存于4℃备用，即为沙棘干细胞提取物。

作为优选，所述继代培养基的制备方法为：以WPM培养基为基础培养基，进一步添加生物诱导子。

作为优选，所述WPM培养基的配方为：20g/L蔗糖、1.8mg/L NAA、0.1g/L Vc、300mg/LL-谷氨酰胺和8g/L琼脂，pH为5.8。

作为优选，所述生物诱导子为尖孢镰刀菌和黑曲霉中的一种或两种。

作为优选，所述生物诱导子为尖孢镰刀菌。

作为优选，所述尖孢镰刀菌的用量为20-40mg/L。

采用本技术方案的有益效果是：首先，本申请主要是针对沙棘干细胞设计的培养基和培养方法，旨在得到活性更强，含量更高的沙棘干细胞提取物，其中通过多种生物诱导子的筛选得到了两种菌株，尤其是添加一定浓度的尖孢镰刀菌后，能够极大地促进沙棘干细胞继代培养过程中活性物质的生成。本申请制备得到的沙棘干细胞提取物经试验检测，证明其具有很强的自由基清除率，能够减少皱纹产生，同时促进成纤维细胞的增殖。其次，虽然沙棘干细胞中的活性物质含量较丰富，但基本为油性物质，起保湿作用的多糖类含量较低，长期使用易产生皮肤红肿不适等问题，因此，本申请通过不同辅料的添加的得到一种保湿能力较强的精华素，对其进行功效评价发现，在不影响其抗衰老活性的基础上，还大大降低了对皮肤的刺激性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清查、完整的描述，进而进一步解释发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1沙棘干细胞提取物制备

原料：沙棘购自呼伦贝尔产地，黑曲霉和尖孢镰刀菌来自中国国家微生物保藏中心，蔗糖、NAA、Vc、L-谷氨酰胺、琼脂、尿囊素、EDTA-二钠、卡波姆、氢化蓖麻油、香精、乙基己基甘油、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类、丙二醇、丙三醇、丁二醇、山梨醇、聚乙二醇和葡萄糖购自市售产品。

制备方法：

1)外植体消毒：选取沙棘外植体中生长状态良好的枝条，用洗洁精浸泡搓洗，再用蒸馏水搓洗干净，滤纸吸干外植体表面水分，将嫩茎剪成1cm小段，用75％酒精浸泡，无菌水清洗3次，然后用2％的HgCl浸泡，无菌水清洗5次备用；

2)无菌接种和培养：在超净工作台中将步骤1)消毒好的茎段表皮撕下，切成块状，倒置放于WPM培养基中，在培养箱中25℃，100r/min震荡暗箱培养，14天后将形成层干细胞转移至继代培养基中，每21天继代一次，得到沙棘形成层干细胞；

3)收集培养沙棘形成层干细胞后的继代培养基，过滤浓缩后保留其中的活性成分，将该培养基浓缩液和沙棘形成层干细胞的裂解物保存于4℃备用，即为沙棘干细胞提取物。

其中，WPM培养基的配方为：20g/L蔗糖、1.8mg/LNAA、0.1g/LVc、300mg/LL-谷氨酰胺和8g/L琼脂，pH为5.8。

继代培养基的制备方法为：以WPM培养基为基础培养基，进一步添加生物诱导子。

本申请实施例仅展示采用以下几种不同的生物诱导子培养基培养得到的沙棘干细胞提取物，均采用上述制备方法得到，除使用的生物诱导子及其浓度不同，其余步骤均一致。

沙棘干细胞提取物1：尖孢镰刀菌40mg/L；

沙棘干细胞提取物2：尖孢镰刀菌60mg/L

沙棘干细胞提取物3：黑曲霉60mg/L；

沙棘干细胞提取物4：尖孢镰刀菌20mg/L和黑曲霉60mg/L；

沙棘干细胞提取物5：酵母提取物10mg/L；

沙棘干细胞提取物6：花生四烯酸1mg/L；

沙棘干细胞提取物7：无生物诱导子添加。

实施例2活性成分含量测定

糖测定：参照GB5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》的方法，采用示差折光检测器，ZXBridgeAmide色谱柱(3.5μm，4.6mm×250mm)，柱温保持40℃，进样量为10μL；流动相为90％乙腈水∶0.1％氨水，流速为1.0mL/min。分别取果糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇用水配制成质量浓度20mg/mL的标准溶液，稀释至不同浓度进样，根据浓度和相应峰面积得到标准曲线。准确移取1mL沙棘干细胞提取物至50mL离心管，加10mL水后，再依次加入2mL硫酸锌和2mL亚铁氰化钾，涡旋1min，用水定容至25mL，10000r/min离心5min后取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤后直接进样。

有机酸测定：高效液相色谱条件：采用紫外检测器，InertSustain-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，进样量为20μL，柱温保持在30℃；流动相为0.05mol/LKH2PO4溶液(用20％磷酸调为pH2.70)，等度洗脱20min，流速为0.6mL/min。取草酸、抗坏血酸、乳酸、奎宁酸、苹果酸和柠檬酸标准溶液用流动相稀释至不同浓度的后分别进样，根据浓度和相应峰面积得到有机酸标准曲线。将沙棘干细胞提取物用流动相稀释10倍，然后用0.45μm微孔滤膜过滤后进样。

总黄酮测定：参照DB43T476—2009《植物源性食品中总黄酮的测定》。取芦丁用水配制成不同浓度的标准溶液，各取1mL依次加入2.0mL三氯化铝溶液(2.5g/100mL)，2.0mL醋酸钾溶液(9.82g/100mL)，混匀，体积分数30％的乙醇定容至50mL，静置15min，以水为空白，于波长415nm处测吸光度值，绘制芦丁标准曲线。沙棘干细胞提取物(4000r/min)离心10min，移取1mL上清液置于50mL容量瓶中，同上操作，于波长415nm处测吸光度值。总黄酮含量以芦丁计。

总酚测定：采用Folin-ciocalteu法，将没食子酸标准溶液稀释至不同浓度，各取0.5mL上述浓度的标液，加2.5mL蒸馏水，再加入0.5mLFolin-ciocalteu显色剂和1.5mL7.5％Na₂CO₃溶液，混合均匀。室温避光1h后，于波长765nm处测定吸光度值，以蒸馏水作为空白对照，绘制没食子酸标准曲线。将沙棘干细胞提取物4000r/min离心10min，准确移取0.5mL上清液，按照上述方法进行显色反应，于波长765nm处测定吸光度值。总酚含量以没食子酸计。

表1不同样品中活性成分的含量

实施例3抗氧化活性检测

取沙棘干细胞提取物样品分别配制浓度为1.0mg/mL溶液进行体外抗氧化测定；

DPPH自由基(DPPH·)清除能力测定：参照Nagai等方法，分别量取2mL不同样品溶液于具塞试管中，加入浓度为0.2mmol/LDPPH甲醇溶液1mL。密封后混匀，于25℃恒温并避光反应1h，测定517nm处的吸光值A_i。用等体积的甲醇溶液代替DPPH溶液为样品对照组A_j，消除样品溶液对吸光值的影响，等体积的蒸馏水代替样品溶液作空白对照，测吸光度为A₀，清除率(％)＝1-(A_i-A_j)/A₀×100。

结果如表2所示，本申请制备的沙棘干细胞提取物的自由基清除率达到了96％以上，具有较高的抗氧化活性。其中选用的不同生物诱导子所得到的沙棘干细胞提取物样品的活性有较大差别，本申请实验中，酵母提取物和花生四烯酸对沙棘干细胞的诱导作用较弱，黑曲霉和尖孢镰刀菌分别单独使用的诱导作用较强，但共同诱导时并无明显协同作用，活性还略有下降。另外，当添加的尖孢镰刀菌的浓度为50mg/L时，可以看到自由基清除率下降至82.10％，结合表1实验数据发现，其中沙棘干细胞提取物2样品中黄酮类和酚类成分含量也有较大程度的下降，说明生物诱导子的浓度也是影响沙棘干细胞活性成分生成的一个重要因素，且同时本申请的诱导子属于最适浓度型，即活性物质的合成要求诱导子处于一个合适的浓度下，才能表现出较强的活性。

表2不同样品的抗氧化能力测定

实施例4精华素的制备及其抗衰老活性测定

精华素制备：将尿囊素、EDTA-二钠、多元醇保湿剂充分搅拌混合，加热至80～90℃作为A溶液；然后将氢化蓖麻油加入A溶液，保持温度80～90℃下搅拌均匀得到B溶液；再向B溶液中加入卡波姆和去离子水，搅拌均匀后降温至40-50℃，继续加入沙棘干细胞提取物、防腐剂和香精，搅拌均匀后降至室温，得到精华素样品。

表3精华素配方设计

表4不同样品的抗氧化能力测定

从表4的实验数据可以发现，采用本申请的配方将沙棘干细胞提取物制成精华素，其抗衰老活性几乎不受辅料影响，且仍随沙棘干细胞提取物浓度的增加而增强。

实施例5精华素的保湿能力测定

实验条件：测试环境温度为25℃，相对湿度为40-45％，保持相同的室内灯光条件，进行实时动态监测。

测试前准备：选取三组志愿者，年龄在20-40周岁，测试皮肤无创伤。在测试2-3天前，受试部位不能使用任何化妆品或外用药品。试验前，受试者需要清洁受试部位，清洁后，可同时标记多个区域，每个测试区域之间间隔至少1cm，在恒温恒湿环境中静坐30min后测基础数据，期间不能喝水和饮料，呈测试状态放置，保持放松状态。

方法及步骤：

参照QB/T 4256-2011化妆品保湿功效评价指南的评价方法。

①测试样品按一定用量进行单次涂布，使用乳胶指套将试样均匀涂布于试验区内，并记录实际的涂样量。

②皮肤分析测试仪对受试部位进行测量，每个区域平行测定至少3次。先测量各测试区域的初始值(样品使用前)，然后再设定时间后测试受试区域的皮肤水分含量。

③分别测量涂抹后30min、1h和4h后受试区域的皮肤含水量。同一个受试者的测试必须使用同一仪器由同一个测量人员完成，两次测量之间应清洁测量探头。

实验结果如表5所示：

表5不同样品的保湿能力测定

从表5实验数据中可以发现，精华素1和精华素2样品的保湿能力较好，使用后的志愿者皮肤中含水量达到70％左右，且在4h后也能维持在较高范围。而其他配方的精华素样品含水量最高为67.18％，4h后含水量均大幅下降，说明按照本申请提供的配方，采用多元醇保湿剂、卡波姆和沙棘干细胞提取物，并以一定浓度制备，才能得到保湿效果优异的精华素样品。

实施例6精华素对皮肤刺激性评价

按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定选取30名合格的志愿者，0.2mL样品添加于滤纸片上，空白对照为去离子水，将滤纸片放在斑试器内，将斑试器固定于受试者前臂曲侧，用手掌轻微按压斑试器，使它均匀地贴敷于皮肤上，期间不可进行剧烈运动或洗澡等。取下斑试器24h、48h后分别观察皮肤所呈现的状态，按表6标准记录皮肤反应。

表6皮肤不良反应分级标准

表7不同精华素的皮肤斑贴实验结果

表7可以看出，去除斑贴24h和48h后，采用本申请配方制备得到的精华素1和精华素2对受试志愿者的皮肤反应等级均为阴性反应，与此同时，使用杀鸡干细胞提取物比例较高的精华素5样品在使用24h后出现2例1级可疑反应和1例2级反应，48h后原2级转变为1级，原1级中一位志愿者的红斑消除转为阴性反应，说明沙棘干细胞提取物的浓度对皮肤刺激性有影响。另外，精华素4和精华素6样品中均出现3例2级反应，说明多元醇保湿剂和卡波姆可以有效缓解沙棘干细胞提取物的刺激性，协同使用能够减少对皮肤的刺激性，从而大大降低其对皮肤的致敏性。

Claims (10)

1.一种舒敏抗老型精华素，其特征在于，按100重量份数计，所述精华素的原料配方包含以下组分：

余量为水。

2.根据权利要求1所述的精华素，其特征在于，按100重量份数计，所述精华素的原料配方由以下组分构成：

余量为水。

3.根据权利要求1或2所述的精华素，其特征在于，所述多元醇保湿剂包含丙二醇、丙三醇、丁二醇、山梨醇、聚乙二醇和葡萄糖中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的精华素，其特征在于，所述防腐剂为乙基己基甘油、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类中的一种。

5.根据权利要求1或2所述的精华素，其特征在于，所述沙棘干细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

1)外植体消毒：选取沙棘外植体中生长状态良好的枝条，用洗洁精浸泡搓洗，再用蒸馏水搓洗干净，滤纸吸干外植体表面水分，将嫩茎剪成1cm小段，用75％酒精浸泡，无菌水清洗3次，然后用2％的HgCl浸泡，无菌水清洗5次备用；

2)无菌接种和培养：在超净工作台中将步骤1)消毒好的茎段表皮撕下，切成块状，倒置放于WPM培养基中，在培养箱中25℃，100r/min震荡暗箱培养，14天后将形成层干细胞转移至继代培养基中，每21天继代一次，得到沙棘形成层干细胞；

3)收集培养沙棘形成层干细胞后的继代培养基，过滤浓缩后保留其中的活性成分，将该培养基浓缩液和沙棘形成层干细胞的裂解物保存于4℃备用，即为沙棘干细胞提取物。

6.根据权利要求4所述的精华素，其特征在于，所述继代培养基的制备方法为：以WPM培养基为基础培养基，进一步添加生物诱导子。

7.根据权利要求5所述的精华素，其特征在于，所述WPM培养基的配方为：20g/L蔗糖、1.8mg/L NAA、0.1g/L Vc、300mg/L L-谷氨酰胺和8g/L琼脂，pH为5.8。

8.根据权利要求5所述的精华素，其特征在于，所述生物诱导子为尖孢镰刀菌和黑曲霉中的一种或两种。

9.根据权利要求7所述的精华素，其特征在于，所述生物诱导子为尖孢镰刀菌。

10.根据权利要求8所述的精华素，其特征在于，所述尖孢镰刀菌的用量为20-40mg/L。