CN108721203A - 一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法。本发明提供的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，以重量百分含量计算，包含以下组分：牡丹干细胞提取物0.05～0.3％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物0.5～10％、牡丹籽油提取物5～15％、甘油1～10％。本发明提供的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品不含任何化学添加剂，具有效果持久稳定、适用面广等优点。同时，本发明还提供了一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的制备方法。

Description

一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，被称为“万能细胞”。而植物干细胞是植物胚后发育形成各种组织和器官的细胞来源和信号调控中心，有些植物可以存活几百甚至上千年，它们之所以具有如此顽强的生命力，是因为其体内终生保留着不同类型的干细胞。这些干细胞位于各器官的特定部位，如茎尖生长点、根尖生长点和维管形成层等，能通过细胞分裂进行自我更新，为器官的生长发育提供细胞来源。
牡丹属于毛莨科芍药属植物，具有“国色天香”之称。其根皮可以入药，其中含有牡丹酚和植物甾醇等生物活性成分。有研究表明，牡丹花蕊细胞中提取出来的黄酮，对H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞损伤具有保护作用。具体地来说，牡丹花蕊提取出的黄酮，可以显著地提高RAW264.7细胞的增殖能力；牡丹花蕊黄酮各剂量组分能够提高细胞及细胞培养液中总的抗氧化能力，增强谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物酶、过氧化氢酶活性，提高还原型谷胱甘肽含量；降低细胞及细胞培养液中丙二醛含量从而提高细胞内乳酸脱氢酶的活性。总而言之，牡丹花蕊中的黄酮具有RAW264.7细胞的抗氧化作用。因此，牡丹干细胞具有较强的抗氧化能力，是一种纯天然、环保、无污染的抗衰老植物干细胞。
然而，由于植物细胞培养技术在培养期间无法维持稳定的，较快的细胞增殖与高的代谢产物的问题，限制了牡丹抗衰老植物干细胞的应用。为了解决该问题，中国专利申请CN201410463235.4A公开了一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，该发明研究了一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，包含无菌苗的获得、组织破碎、细胞悬浮液的获得、悬浮细胞的调控等步骤。上述发明公开了一种可以快速获得大量的秋牡丹细胞的方法，该方法具有操作简单，细胞增殖速度快，可以大量生产秋牡丹细胞的优点。然而，这种方法需要用到剧毒的氯化汞，对环境造成很大的影响，而且生产出的秋牡丹干细胞用途很少。
有关研究表明，从牡丹花瓣中提取的提取酪氨酸酶抑制物，可以有效地抑制色斑的形成，具有美白、延迟衰老的功效。还有研究表明，牡丹籽油具有良好的赋形作用，其柔软润滑，其含有的亚油酸是组成细胞膜的原材料，具有活血化瘀、消炎杀菌、促进细胞再生、激活末梢神经、强化新陈代谢，增强细胞活力的功能，且牡丹籽的出油率高达80％。并且牡丹籽油已经能够制作成为一种生肌膏，以全方共奏清热解毒、祛腐生肌之功，促进创面坏死组织脱落、肉芽组织生长上皮组织修复，明显缩短了创面愈合时间。
现今市面上销售的美白护肤品，其美白成分大多都是合成的化合物，免不了存在一些副作用，很容易使人皮肤过敏。而本研究提取出的多种活性成分如干细胞、酪氨酸酶抑制物、牡丹籽油等都是天然原料牡丹中提取分离的，化学结构和生物活性都没有改变，而其又有多重效能，且具有各效能持久稳定，适用面广，无副作用或副作用小等优点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺点，提供一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法。本发明提供的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，含多种天然的美白抗氧化因子易于被皮肤吸收，能够有效抑制酪氨酸酶活性，使皮肤白皙，且效果稳定，适用面广。
本发明所采用的技术方案为：
一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，包括以下组分及其重量百分数：牡丹干细胞提取物0.05％～0.3％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物0.5％～10％、牡丹籽油提取物5％～15％、甘油1％～10％、乳化剂3％～5％、增稠剂1.0％～1.2％、防腐剂0.1％～0.3％、丁二醇1.5％～2.0％、去离子水56.2％～87.85％。
优选地，所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，包括以下组分及其重量百分数：牡丹干细胞提取物0.15％～0.25％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物3％～6％、牡丹籽油提取物8％～10％、甘油4％～6％、乳化剂3.5％～4.5％、增稠剂1.0％～1.2％、防腐剂0.15％～0.25％、丁二醇1.6％～1.8％、去离子水70.0％～78.6％。
优选地，所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品由以下组分及其重量百分数组成：牡丹干细胞提取物0.2％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物5％、牡丹籽油提取物9％、甘油5％、乳化剂4.0％、增稠剂1.1％、防腐剂0.2％、丁二醇1.7％、去离子水72.8％。
优选地，所述增稠剂为卡波姆、丙烯酸酯、黄原胶中的一种或几种；
优选地，所述防腐剂为羟苯甲酯、羟苯丙酯、羟甲基咪唑烷基脲中的一种或几种；
优选地，所述乳化剂为甘油单硬脂酸酯、月桂醇硫酸酯钠、十二烷基硫酸钠中的一种或几种。
其中，所述牡丹干细胞提取物的制备方法为：
a.取切除根冠的牡丹根尖，清洗，消毒；
b.将步骤a得到的牡丹根尖切成5mm*5mm大小，接种至固体培养基上培养20～30天，得形成层来源的牡丹干细胞；
c.将步骤b得到的形成层来源的牡丹干细胞转移至液态培养基中培养，得经培养后收集的牡丹干细胞；
d.将步骤c得到的牡丹干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养基使用步骤c所述的液态培养基，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，得混合培养液；
e.将步骤d得到的混合培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-75～-85℃超低温冰箱冷冻2～3h，取出解冻30～40min，重复3～5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，即得。
优选地，所述步骤b中的MS固体培养基的成分包含硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖、盐酸吡哆醇和琼脂，具体的培养基组分见表1，将牡丹的根尖接种至固体培养基后，所需的培养温度为25～29℃，pH值为6～6.5。
表1MS固体培养基组成分析
优选地，所述步骤c中液体培养基的成分包含硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖，与MS固体培养基的区别在于，不包含琼脂。
所述牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法为：
①摘取牡丹花瓣，清水洗净，沥干待用，得沥干后的牡丹花瓣；
②将步骤①所得沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为1g：4ml；
③将步骤②所得牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中，所述牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:5；
④将步骤③所得回流液过滤得到牡丹花提取液；
⑤将步骤④所得牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，其中，乙醇回收待用；
⑥向步骤⑤所得固体物质中加入蒸馏水，在60℃下加热溶解得到混合物，其中，所述固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:4；
⑦向步骤⑥所得混合物中加入正已烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述正己烷的体积比为1:1；
⑧将步骤⑦所得水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
⑨将步骤⑧所得浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40％的乙醇溶液和浓度为70％的乙醇溶液进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，得无色的浓缩物；
⑩将步骤⑨所得无色浓缩物用浓度为70％的乙醇溶液再次对进行大孔树脂柱层析直至下柱液洗脱至无色，收集洗脱液，将所述洗脱液合并，即得。
所述牡丹籽油提取物的制备方法为：
(1)筛选饱满的牡丹籽原料，经脱壳机脱壳，得牡丹籽仁；
(2)将步骤(1)所得牡丹籽仁用高速粉碎机粉碎，过40目筛，称重，加入有机溶剂，得混合物；
(3)将步骤(2)所得混合物放入超声提取器中进行超声提取，然后高速离心，取上清液，减压回收溶剂，称量油重，即得。
优选地，所述牡丹干细胞提取物由具有全能性的牡丹干细胞制得，牡丹干细胞提取物中含有黄酮、多酚物质，具有良好的抗氧化性，能延缓细胞衰老，其还含有细胞生长所需的营养成分和牡丹多糖等具有护肤、清除自由基的活性成分。
优选地，所述牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的有效成分含量>98％。牡丹提取物中的酪氨酸酶抑制剂提取物对酪氨酸酶的活性具有较好的抑制作用，可起到美白肌肤的效果。
优选地，所述牡丹籽油提取物为牡丹种子的提取物。牡丹籽油中含有大量的天然活性物质，成分包含肉豆蔻酸、棕桐油酸、硬脂酸、油酸、α-亚麻酸、花生酸和顺二十碳一烯酸。其中最为主要的成分为α-亚麻酸。α-亚麻酸是人类生命进化过程中最基本、最核心的物质，也是合成细胞膜的主要元素，可用于治疗口腔溃疡、鼻炎、关节炎、皮肤病等。
另外，本发明还提供了所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的制备方法，步骤如下：
S1将去离子水加热至85℃～90℃，分别加入增稠剂、乳化剂在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至42～47℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入防腐剂，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为5～8，真空条件下搅拌，降温至32℃～37℃，放置20h，进行分装，即得。
与现有技术相比，本发明提供的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的具有以下优势：
(1)本发明提供的含有牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品含多种天然的美白抗氧化因子易于被皮肤吸收，能够有效抑制酪氨酸酶活性，使皮肤白皙，且效果稳定，适用面广；
(2)本发明提供的含有牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品中的牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物和甘油四者在美白皮肤方面具有协同增效作用；
(3)本发明提供的含有牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，制备方法简单，效果稳定，制备过程环保、无污染。
具体实施方式
为了更清楚的表达本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例而已。
实施例1一种牡丹干细胞提取物的制备方法
所述牡丹干细胞提取物的制备方法，具体步骤如下：
a.取切除根冠的牡丹根尖，清洗，消毒；
b.将步骤a得到的牡丹根尖切成5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖、盐酸吡哆醇和琼脂的MS固体培养基上，所述MS固体培养基的具体组成如表1所示，培养温度为25℃，pH值为6，培养20天，得形成层来源的牡丹干细胞；
c.将步骤b得到的形成层来源的牡丹干细胞转移至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖且不含琼脂的液态培养基中培养，得经培养后收集的牡丹干细胞；
d.将步骤c得到的牡丹干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养基使用步骤c所述的液态培养基，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水混合液，得混合培养液；
e.将步骤d得到的混合培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-75℃超低温冷冻2h，取出解冻30min，重复3次，最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，即得。
所述步骤b中液态培养基的具体组成与步骤b中所述MS固体培养基的组成类似，与MS固体培养基的区别在于，不含琼脂。
实施例2一种牡丹干细胞提取物的制备方法
所述牡丹干细胞提取物的制备方法，具体步骤如下：
a.取切除根冠的牡丹根尖，清洗，消毒；
b.将步骤a得到的牡丹根尖切成5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖、盐酸吡哆醇和琼脂的MS固体培养基上，所述MS固体培养基的具体组成如表1所示，培养温度为29℃，pH值为6.5，培养30天，得形成层来源的牡丹干细胞；
c.将步骤b得到的形成层来源的牡丹干细胞转移至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖且不含琼脂的液态培养基中培养，得经培养后收集的牡丹干细胞；
d.将步骤c得到的牡丹干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养基使用步骤c所述的液态培养基，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水混合液，得混合培养液；
e.将步骤d得到的混合培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-85℃超低温冷冻3h，取出解冻40min，重复5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，即得。
所述步骤b中液态培养基的具体组成与步骤b中所述MS固体培养基的组成类似，与MS固体培养基的区别在于，不含琼脂。
实施例3一种牡丹干细胞提取物的制备方法
所述牡丹干细胞提取物的制备方法，具体步骤如下：
a.取切除根冠的牡丹根尖，清洗，消毒；
b.将步骤a得到的牡丹根尖切成5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖、盐酸吡哆醇和琼脂的MS固体培养基上，所述MS固体培养基的具体组成如表1所示，培养温度为27℃，pH值为6.3，培养25天，得形成层来源的牡丹干细胞；
c.将步骤b得到的形成层来源的牡丹干细胞转移至含有硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖且不含琼脂的液态培养基中培养，得培养后收集的牡丹干细胞；
d.将步骤c得到的牡丹干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养基使用步骤c的液态培养基，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水混合液，得混合培养液；
e.将步骤d得到的混合培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃超低温冷冻2.5h，取出解冻35min，重复4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，即得。
所述步骤b中液态培养基的具体组成与步骤b中所述MS固体培养基的组成类似，与MS固体培养基的区别在于，不含琼脂。
实施例4一种牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法
所述牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法，具体步骤如下：
①摘取牡丹花瓣，清水洗净，沥干待用，得沥干后的牡丹花瓣；
②将步骤①所得沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为1g：4ml；
③将步骤②所得牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流,得到回流液，其中，所述牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:5；
④将步骤③所得回流液过滤得到牡丹花提取液；
⑤将步骤④所得牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，其中，乙醇回收待用；
⑥向步骤⑤所得固体物质中加入蒸馏水，在60℃下加热溶解得到混合物，其中，所述固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:4；
⑦向步骤⑥所得混合物中加入正已烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述正己烷的体积比为1:1；
⑧将步骤⑦所得水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
⑨将步骤⑧所得浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40％的乙醇溶液和浓度为70％的乙醇溶液进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，得无色的浓缩物；
⑩将步骤⑨所得无色浓缩物用浓度为70％的乙醇溶液再次进行大孔树脂柱层析直至下柱液洗脱至无色，收集洗脱液，将所述洗脱液合并，即得。
实施例5一种牡丹籽油提取物的制备方法
所述牡丹籽油提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)筛选饱满的牡丹籽原料，经脱壳机脱壳，得牡丹籽仁；
(2)将步骤(1)所得牡丹籽仁用高速粉碎机粉碎，过40目筛，称重，加入有机溶剂，得混合物；
(3)将步骤(2)所得混合物放入超声提取器中进行超声提取，然后高速离心，取上清液，减压回收溶剂，称量油重，即得。
实施例6一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.05％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物0.5％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物5％、甘油1％、甘油单硬脂酸酯3％、卡波姆1.0％、羟苯丙酯0.1％、丁二醇1.5％、去离子水87.85％。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至85℃，分别加入甘油单硬脂酸酯、卡波姆在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至42℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入羟苯丙酯，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为5，真空条件下搅拌，降温至32℃，放置20h，进行分装，即得。
实施例7一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例2所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.3％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物10％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物15％、甘油10％、月桂醇硫酸酯钠5％、丙烯酸酯1.2％、双(羟甲基)咪唑烷基脲0.3％、丁二醇2％、去离子水56.2％。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至90℃，分别加入月桂醇硫酸酯钠、丙烯酸酯在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至47℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入双(羟甲基)咪唑烷基脲，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为7，真空条件下搅拌，降温至37℃，放置20h，进行分装，即得。
实施例8一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例3所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.1％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物2％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物6％、甘油2％、十二烷基硫酸钠4％、黄原胶1.1％、羟苯甲酯0.2％、丁二醇1.7％、去离子水82.9％。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至87℃，分别加入十二烷基硫酸钠、黄原胶在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至45℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入羟苯甲酯，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为6，真空条件下搅拌，降温至35℃，放置20h，进行分装，即得。
实施例9一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.25％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物6％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物13％、甘油6％、乳化剂4％、增稠剂1.2％、防腐剂0.5％、丁二醇1.8％、去离子水67.25％；所述乳化剂为由甘油单硬脂酸酯和月桂醇硫酸酯钠按质量比为3：1的混合物，所述增稠剂为由卡波姆和丙烯酸酯按质量比为1：1组成的混合物，所述防腐剂为由羟苯甲酯和羟苯丙酯按质量比为2：1组成的混合物。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至86℃，分别加入乳化剂、增稠剂在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至44℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入防腐剂，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为5，真空条件下搅拌，降温至33℃，放置20h，进行分装，即得。
实施例10一种含牡丹干细胞提取物的美白修复和护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例2所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.18％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物4％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物8％、甘油4％、乳化剂4％、增稠剂1.1％、防腐剂0.2％、丁二醇1.9％、去离子水76.62％；所述乳化剂为由月桂醇硫酸酯钠和十二烷基硫酸钠按质量比为2：1组成的混合物；所述增稠剂为由丙烯酸酯：黄原胶按质量比为3：1组成的混合物；所述防腐剂为由羟苯丙酯：双(羟甲基)咪唑烷基脲按质量比为2：1组成的混合物。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至87℃，分别加入乳化剂、增稠剂在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至43℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入防腐剂，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为6，真空条件下搅拌，降温至34℃，放置20h，进行分装，即得。
实施例11一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品
所述含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：如实施例3所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.2％、如实施例4所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的制备方法制得的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物5％、如实施例5所述的牡丹籽油提取物的制备方法制得的牡丹籽油提取物9％、甘油5％、乳化剂5％、增稠剂1.2％、防腐剂0.1％、丁二醇1.7％、去离子水72.8％；所述乳化剂为由甘油单硬脂酸酯、月桂醇硫酸酯钠和十二烷基硫酸钠按质量比为3：2：1组成的混合物；所述增稠剂为由卡波姆、丙烯酸酯和黄原胶按质量比为3：3：1组成的混合物；所述防腐剂为由羟苯甲酯、羟苯丙酯和双(羟甲基)咪唑烷基脲质量比为1：2：1组成的混合物。
该美白修复护肤品的制备方法为：
S1将去离子水加热至88℃，分别加入乳化剂、增稠剂在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至45℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入防腐剂，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为7，真空条件下搅拌，降温至35℃，放置20h，进行分装，即得。
对比例1一种护肤品
所述护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物5％、甘油5％、乳化剂5％、增稠剂1.2％、防腐剂0.1％、丁二醇1.7％、去离子水82.0％；所述乳化剂为由甘油单硬脂酸酯、月桂醇硫酸酯钠和十二烷基硫酸钠按质量比为3：2：1组成的混合物；所述增稠剂为由卡波姆、丙烯酸酯和黄原胶按质量比为3：3：1组成的混合物；所述防腐剂为由羟苯甲酯、羟苯丙酯和双(羟甲基)咪唑烷基脲按质量比为1：2：1组成的混合物。
该护肤品的制备方法与实施例11所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的制备方法类似。
对比例2一种护肤品
所述护肤品，由以下组分及其重量百分数组成：牡丹籽油提取物9％、甘油5％、乳化剂5％、增稠剂1.2％、防腐剂0.1％、丁二醇1.7％、去离子水78.0％；所述乳化剂为由甘油单硬脂酸酯、月桂醇硫酸酯钠和十二烷基硫酸钠按质量比为3：2：1组成的混合物；所述增稠剂为由卡波姆、丙烯酸酯和黄原胶按质量比为3：3：1组成的混合物；所述防腐剂为由羟苯甲酯、羟苯丙酯和双(羟甲基)咪唑烷基脲按质量比为1：2：1组成的混合物。
该护肤品的制备方法与实施例11所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的制备方法类似。
本发明中，实施例11为最佳实施例，所有的对比例均是在实施例11的基础上进行修改的，对比例与实施例11的区别见表2。
表2对比例与最佳实施例的区别
试验例一、刺激性试验
1.试验样品；实施例6-11制得的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及对比例1-2的护肤品。
2.试验对象：年龄在18～30岁的80名志愿者，随机分成8组，每组10人，分别试用试验样品。受试者要求：皮肤健康、无皮肤病史，且皮肤色差不明显。
3.试验方法：受试者早晚使用清水洗手，每天在手上涂抹试验样品，同时不涂抹其他护肤品、化妆品，受试者的活动范围、食物等均做相同处理，1周后，观察受试者的具体情况。
4.试验结果：涂抹实施例6～11及对比例1～2的受试者手上均未出现红肿等情况，与使用测试产品之前无明显变化，说明本试验所有试验样品均不会使人产生过敏反应。
试验例二、美白修复功效检测试验
1.试验样品：实施例6-11制得的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及对比例1-2的护肤品及市售美白效果较好的护肤品-相宜本草精华乳。
2.试验对象：年龄在18-30岁的90名志愿者，随机分成9组，每组10人，分别试用试验样品。受试者要求：皮肤健康，无皮肤病史，且皮肤色差不明显。
3.试验方法：受试者早晚使用清水洁面后，将试验样品均匀的涂抹到脸上，避开眼睛跟嘴部，轻柔按摩至皮肤完全吸收，连续使用2个月，试验期间不得使用其他护肤品，试验开始前及结束后分别记录人体皮肤白皙程度，将人皮肤的美白程度划分为0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％及100％。
人面部皮肤变白程度＝测试后的美白度-测试前的美白度
同时，将实施例6～11、对比例1～2及相宜本草精华乳的试验样品稀释成5％的样品液：在各个试管中分别加入磷酸缓冲液(pH＝6.8，浓度为0.1mol/L)、样品液、酪氨酸溶液，置于37℃水浴10min，加入酪氨酸酶，再于37℃的条件下反应10min，然后利用分光光度计测量每个样品在475nm的吸光值，每个样品测量3次，求其平均值。
试验体系设计见表3，其中，D1为空白对照，D2用于空白调零，E1为样品管，E2用于样品调零，其中，样品为实施例6～11、对比例1～2及市售相宜本草精华乳。
酪氨酸酶抑制率＝(A空白对照/A样品)/A空白对照×100％
4.试验结果：统计受试者变白程度及各护肤品对酪氨酸酶抑制强度，具体结果见表4。
表3酪氨酸酶抑制试验体系加样表
试剂 D1/mL D2/mL E1/mL E2/mL
样品 0 0 1 1
磷酸缓冲液 2 2.5 1 1.5
酪氨酸溶液 1 1 1 1
酪氨酸酶溶液 0.5 0 0.5 0
表4受试者美白效果及酪氨酸酶抑制率测定结果
由表4可知，2个月后，涂抹实施例6～11制得的护肤品的志愿者，美白效果显著，且实施例6～11制得的样品酪氨酸酶抑制率均在80％以上。其中，美白效果最明显的是实施例11制得的美白修复护肤品，同时，实施例11制得的样品酪氨酸酶抑制率高达94％，故实施例11为本发明的最佳实施例。而对比例中，受试者美白效果不明显，酪氨酸酶抑制率低，说明牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物及牡丹籽油提取物具有协同作用，单独使用美白效果不佳。同时，实施例6～11制得的美白修复护肤品的美白效果还显著高于相宜本草精华乳的美白效果，这说明本发明获得的美白修复护肤品美白效果比市售护肤品好。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种牡丹干细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.取切除根冠的牡丹根尖，清洗，消毒；
b.将步骤a得到的牡丹根尖切成5mm*5mm大小，接种至MS固体培养基上培养20～30天，得形成层来源的牡丹干细胞；
c.将步骤b得到的形成层来源的牡丹干细胞转移至液态培养基中培养，得经培养后收集的牡丹干细胞；
d.将步骤c得到的牡丹干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养基使用步骤c所述的液态培养基，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，得混合培养液；
e.将步骤d得到的混合培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-75～-85℃超低温冰箱冷冻2～3h，取出解冻30～40min，重复3～5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，即得。
2.如权利要求1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤b中的MS固体培养基的成分包含硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖、盐酸吡哆醇和琼脂，将牡丹的根尖接种至固体培养基后，所需的培养温度为25～29℃，pH值为6～6.5。
3.如权利要求1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤c中液体培养基的成分包含硫酸锌、硼酸、甘氨酸、蔗糖，与MS固体培养基的区别在于，不包含琼脂。
4.一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，其特征在于，包括以下组分及其重量百分数：如权利要求1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.05％～0.3％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物0.5％～10％、牡丹籽油提取物5％～15％、甘油1％～10％、乳化剂3％～5％、增稠剂1.0％～1.2％、防腐剂0.1％～0.3％、丁二醇1.5％～2.0％、去离子水56.2％～87.85％。
5.如权利要求4所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，其特征在于，包括以下组分及其重量百分数：如权利要求1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.15％～0.25％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物3％～6％、牡丹籽油提取物8％～10％、甘油4％～6％、乳化剂3.5％～4.5％、增稠剂1.0％～1.2％、防腐剂0.15％～0.25％、丁二醇1.6％～1.8％、去离子水70.0％～78.6％。
6.如权利要求5所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，其特征在于，由以下组分及其重量百分数组成：如权利要求1所述的牡丹干细胞提取物的制备方法制得的牡丹干细胞提取物0.2％、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物5％、牡丹籽油提取物9％、甘油5％、乳化剂4.0％、增稠剂1.1％、防腐剂0.2％、丁二醇1.7％、去离子水72.8％。
7.如权利要求4所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，其特征在于，所述的牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物的有效成分含量>98％，所述的牡丹籽油提取物为牡丹种子的提取物。
8.如权利要求4所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品，其特征在于，所述增稠剂为卡波姆、丙烯酸酯、黄原胶中的一种或几种；所述的防腐剂为羟苯甲酯、羟苯丙酯、羟甲基咪唑烷基脲中的一种或几种；所述的乳化剂为甘油单硬脂酸酯、月桂醇硫酸酯钠、十二烷基硫酸钠中的一种或几种。
9.如权利要求4～8任一项所述的含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1将去离子水加热至85℃～90℃，分别加入增稠剂、乳化剂在2000r/min下离心至混合均匀，得混合物I；
S2将步骤S1所得的混合物I降温至42～47℃，并依次加入牡丹干细胞提取物、牡丹酪氨酸酶抑制剂提取物、牡丹籽油提取物、甘油及丁二醇，在真空下混合搅拌均匀，最后加入防腐剂，搅拌至混合均匀，得混合物II；
S3将步骤S2所得混合物II过250目筛，调节pH值为5～8，真空条件下搅拌，降温至32℃～37℃，放置20h，进行分装，即得。
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