CN111450132A - 一种仿生法提取人参皂苷的方法及其人参皂苷提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生法提取人参皂苷的方法及所得到的人参皂苷提取物。所述提取方法包括仿生提取溶剂的配制、人参皂苷的仿生提取和提取液的萃取步骤，其中，仿生提取溶剂为仿生胃液或仿生肠液；人参皂苷的仿生提取步骤：人参干燥、粉碎后利用配制的仿生提取溶剂提取，提取液经离心过滤，利用萃取溶剂萃取；提取液的萃取步骤：提取液与萃取溶剂混合后分离，挥干萃取液即得人参皂苷提取物。利用本发明的仿生提取方法，得到的人参皂苷提取物有效成分含量高，与传统有机溶剂提取方法相比，具有绿色环保、无毒无害、提取效率高的特点，且方法耗能低、耗时短、溶剂消耗量小、操作简便，具备很好的准确度、重复性和精密度，适用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及天然提取物提取技术领域，特别涉及采用仿生技术从人参中提取人参皂苷的方法以及所提取得到的人参皂苷提取物。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mayer)为五加科人参属多年生草本植物，主产于东亚地区，是我国传统的名贵中药，已有上千年的药用基础。人参适用于调节血压、恢复心脏功能、治疗神经衰弱及身体虚弱等症，也有抗过敏、抗肿瘤、降血糖等功效。人参中含有人参皂苷、多糖、挥发油、蛋白质、氨基酸等多种成分，其中人参皂苷是最主要的活性成分。
人参皂苷是一种固醇类化合物，三萜皂苷，主要存在于人参属药材中。根据皂苷元结构可分为四环三萜的达玛烷型和五环三萜的齐墩果酸型。达玛烷型又可分为原人参二醇型和原人参三醇型。其潜在具有包括抗癌、抗炎、免疫系统调节、抗高血压、抗糖尿病等作用。
现有从人参中提取人参皂苷的方法包括传统的浸渍法、煎煮法、回流提取法，及现行主流的超声辅助提取、微波辅助提取、固相萃取、压力流体萃取、超临界流体萃取等。但是大多数的提取方法均存在不足，例如：提取时间长、提取效率低、溶剂量较大等问题，导致上述方法目前还无法投入到工业生产当中，提取人参皂苷仍然是进一步研究其活性需要解决的主要问题。
发明内容
鉴于解决现有技术缺陷的目的，本发明一方面提出一种人参皂苷提取方法，利用仿生提取技术，得到的提取物有效成分含量高，具有绿色环保、无毒无害、提取效率高的特点，且方法耗能低、耗时短、溶剂消耗量小、操作简便，适用于工业生产；
另一方面提供一种依据所述方法制备得到的人参皂苷提取物，该提取物更容易被人体吸收利用，避免了无效成分的溶出以及高温导致的人参皂苷转化等问题。
为解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：一种仿生法提取人参皂苷的方法，包括仿生提取溶剂的配制、人参皂苷的仿生提取和提取液的萃取步骤。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生提取溶剂为仿生胃液和/或仿生肠液。仿生提取，是根据药物在人体内的代谢原理，在体外模拟人体的胃肠环境，通过人参的不同组分在模拟环境中的溶解度差异提取人参皂苷。由于提取溶液更接近于人体的胃肠环境，这种方法提取的人参皂苷更容易被人体吸收和利用。相对于传统的利用有机溶剂回流提取的方法，仿生提取方法避免了使用大量的有机溶剂，更绿色环保，并且能最大限度地提取可被人体吸收的皂苷类成分，避免了无效成分的溶出以及高温导致人参皂苷转化等问题，是一种更加高效、便捷的人参皂苷提取方法。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述仿生提取溶剂为胃液时，所述仿生胃液的配制方法为：将胃蛋白酶溶解于稀盐酸中，配制得到5-30mg/mL的仿生胃液用来提取1g人参粉末。根据胃蛋白酶在稀盐酸中的溶解度以及消耗单位质量胃蛋白酶可提取的人参皂苷含量，在此浓度范围下，胃蛋白酶可完全溶解于稀盐酸中。人参皂苷提取浓度随仿生胃液中胃蛋白酶的浓度增加而升高。当胃蛋白酶浓度高于30mg/mL时，单位质量胃蛋白酶提取1g人参粉末中的人参皂苷浓度增加不明显；当低于5mg/mL时，仿生胃液不能有效提取人参皂苷。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述胃蛋白酶为从哺乳动物的胃粘膜提取制得，比活力不低于1：3000。比活力不低于1：3000的胃蛋白酶廉价易得，配制的仿生胃液已可有效提取人参皂苷。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述仿生提取溶剂为肠液时，所述仿生肠液的配制方法为：配制磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钠调节pH值6.0-6.9，将胰酶加入到磷酸盐缓冲液中，配制得到5-20mg/mL的仿生肠液用来提取1g人参粉末。根据胰酶在磷酸盐缓冲溶液中的溶解度以及消耗单位质量胰酶可提取的人参皂苷含量，在此浓度范围下，胰酶可完全溶解于磷酸盐缓冲溶液中。人参皂苷提取浓度随仿生肠液中胰酶的浓度增加而升高，当胰酶浓度高于20mg/mL时，单位质量胰酶提取1g人参粉末中的人参皂苷浓度增加不明显；当低于5mg/mL时，仿生肠液不能有效提取人参皂苷。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述胰酶为从具备胰腺的哺乳动物的胰中提取的多种酶的混合物，主要含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。选择混合酶更适合模拟肠道环境，不宜选择其中某一种酶。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述人参皂苷的仿生提取步骤：人参经干燥、粉碎得人参粉后利用配制的仿生提取溶剂在常压下加热回流提取，提取液经离心过滤，利用萃取溶剂萃取。其中，粉末状的人参有利于与仿生提取溶剂充分接触，提高提取效率；常压加热回流提取方法对仪器设备要求简单，是常规的中药提取方法，使仿生提取方法具有广泛的适用性；加热温度低可以降低能耗并防止人参皂苷高温转化；离心过滤可快速将提取后的人参粉残渣与提取液分离(液体和固体分离)，得到提取液；萃取可将人参皂苷从提取液中分离，弃去仿生提取溶剂中的酶等杂质，纯化提取的人参皂苷。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述人参粉的质量与仿生提取溶液的体积比(g/mL)为1:8-1:35。增加提取溶液体积可以提高人参皂苷的提取浓度，但是过量使用有机溶剂会增加回收溶剂负担，易污染环境，在现有的范围内，所用溶剂可有效提取人参皂苷，并且易于回收。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述加热回流提取温度为25-45℃，提取时间为15-120分钟。本条件为最适提取温度及时间范围。升高温度有利于提高人参皂苷的提取浓度，缩短提取时间，但是容易导致人参皂苷的分解；低温有利于降低提取方法的能耗，但是会影响提取浓度，延长提取时间。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述离心分离提取液的转速为6000-10000rpm，离心时间为5-10分钟。提高转数可缩短离心时间，降低仿生提取方法的时间成本。降低转数可降低对离心设备的技术参数要求，但达到同样的分离效果需要延长离心时间，增加时间成本。在现有的条件范围内，常规的离心设备都可以达到快速分离人参皂苷的目的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述提取液的萃取步骤：提取液与萃取溶剂混合、分离后，挥干萃取液即得人参皂苷提取物。提取液中含有糖分、人参皂苷和仿生溶剂，利用人参皂苷可被有机溶剂从水相中萃取，糖分、胃蛋白酶和胰酶难溶于有机溶剂的性质将人参皂苷分离。萃取方法作为常用的分离方法，简单易操作，不需特殊设备。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述萃取溶剂为正丁醇或水饱和正丁醇溶液，萃取溶剂与提取液体积比为1：1-1：5，萃取次数为1-3次。由于提取液中含有较多的糖分，糖分易溶于极性溶剂而人参皂苷易溶于有机溶剂，故将提取液收集后加入水饱和正丁醇进行萃取，除去糖分的同时将提取到的人参皂苷萃取出来，保留在人参萃取液中。增加萃取溶剂与提取液体积比有利于提高萃取人参皂苷的浓度，但是浪费有机溶剂。选择相对较小的体积比并增加萃取次数能够更有效的提高萃取效率。
根据本发明的具体实施方案，本发明的仿生法提取人参皂苷的方法中，所述方法还包括对植物药材人参进行前处理：选择4年以上的种植人参或种植西洋参，烘干温度为35-50℃，粉碎粒度为40-100目。提高烘干温度可以缩短人参干燥的时间，但是过高的温度一方面提高能耗，一方面容易使人参皂苷分解；粉碎的粒度越高越有利于人参粉与提取溶剂的充分接触，但是过高的粒度对粉碎设备要求高，提高生产成本。
在本发明的一具体实施方案中，本发明提出的仿生法提取人参皂苷方法包括仿生提取溶剂的配制、人参皂苷的仿生提取和提取液的萃取步骤，具体操作如下：
(1)将新鲜人参洗净、烘干、粉碎得到人参粉，35-50℃烘干至恒重后，将烘干的人参用粉碎机粉碎，过40-100目分样筛。
(2)配制仿生提取溶剂。仿生提取溶剂是仿生胃液和/或仿生肠液中的一种，优选的为仿生胃液。
仿生胃液的配制方法如下：将胃蛋白酶溶解于稀盐酸中，得到5-30mg/mL的仿生胃液。其中，胃蛋白酶是从哺乳动物的胃黏膜中提取制得，比活力不低于1：3000。
仿生肠液的配制方法如下：配制磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钠调节pH值6.0-6.9，将胰酶加入到磷酸盐缓冲液中，配制得到5-20mg/mL的仿生肠液。其中，胰酶是从具备胰腺的哺乳动物的胰中提取的多种酶的混合物，主要含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等。
(3)将人参粉加入到仿生提取溶液中，常压下加热回流提取，将提取液和人参粉离心分离，并用萃取溶剂进行萃取，挥干萃取液既得人参皂苷提取物。其中，人参粉的质量与仿生提取溶液的体积(g/mL)比为1：8-1：35，加热回流提取温度为25-45℃。提取时间为15-120分钟，离心分离提取液和人参粉的转速为6000-10000rpm，离心时间为5-10分钟,萃取溶剂为正丁醇或水饱和正丁醇溶液，萃取溶剂与提取液体积比为1：1-1：5，萃取次数为1-3次。
另一方面，本发明还提供了依据本发明所述仿生法提取人参皂苷的方法制备得到的人参皂苷提取物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的人参皂苷提取物，可以为浓缩提取液形式，也可以为浸膏或粉末形式等。经高效液相色谱-质谱分析，与超声提取方法相比，仿生方法提取的人参皂苷Re、Rd、Ro的相对含量更高。并且，在相同的提取时间内，仿生方法提取的人参皂苷浓度明显高于超声方法，即具有更高的提取效率。
相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：利用本发明的仿生提取方法，得到的人参皂苷提取物有效成分含量高，与传统有机溶剂提取方法相比，具有绿色环保、无毒无害、提取效率高的特点，且方法耗能低、耗时短、溶剂消耗量小、操作简便，具备很好的准确度、重复性和精密度，适用于工业生产。
附图说明
图1示出了实施例1中仿生胃液提取人参皂苷的高效液相色谱-质谱分析图。
图2示出了实施例1中仿生胃液提取和超声提取的人参皂苷含量图。
图3示出了实施例2中仿生肠液提取和超声提取的人参皂苷含量图。
图4示出了实施例3中仿生胃液的紫外吸收光谱图。
图5示出了实施例4中仿生肠液的紫外吸收光谱图。
图6示出了实施例5中MRM模式下仿生胃液提取的8种人参皂苷的总离子流图。
图7示出了实施例6中仿生胃液和仿生肠液提取的人参皂苷含量图。
图8示出了实施例6中不同体积仿生胃液提取的人参皂苷含量图。
图9示出了实施例6中不同提取时间提取的人参皂苷含量图。
图10示出了实施例6中不同提取温度提取的人参皂苷含量图。
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。除非另有说明，否则本发明中涉及的技术术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
实施例1
本实施例提供了一种应用胃蛋白酶仿生法提取人参皂苷的工艺主要按照如下操作进行：
将新鲜人参洗净、烘干、粉碎得到人参粉。选取4年以上的种植人参，用水清洗至表面没有污泥，利用鼓风干燥箱45℃烘干人参至恒重，将烘干的人参用粉碎机粉碎，过60目分样筛。在80mL去离子水中加入1.64mL，2.34mol/L稀盐酸溶液，称取1.000g胃蛋白酶粉末溶解于其中，用去离子水定容至100mL，得到10mg/mL的仿生胃液。其中，胃蛋白酶比活力不低于1：3000。取1g人参粉及15mL仿生胃液，37℃常压加热回流，提取60分钟，以8000rpm离心8分钟，分离提取液和人参粉。萃取溶剂与提取液体积比为1：1，萃取2次，合并萃取液，挥干既得人参皂苷提取物。以色谱甲醇复溶人参皂苷提取物，过孔径为0.22μmPTFE滤膜，用高效液相色谱-质谱分析，得到结果见图1。
本实施例的人参皂苷提取物为黄色浸膏，冻干后为白色粉末。
以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.65mg/g、5.83mg/g、2.98mg/g、5.35mg/g、2.35mg/g、3.30mg/g、2.95mg/g、3.90mg/g，与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高56.9％、38.2％、10.4％、50.7％、6.82％、17.9％、11.3％、52.9％。在相同的提取时间内，仿生方法提取率更高，并且避免了大量使用有机溶剂，结果见图2。
实施例2
本实施例提供了一种应用胰酶仿生法提取人参皂苷的工艺主要按照如下操作进行：
将新鲜人参洗净、烘干、粉碎得到人参粉。选取4年以上的种植人参，用水清洗至表面没有污泥，利用鼓风干燥箱45℃烘干人参至恒重，将烘干的人参用粉碎机粉碎，过60目分样筛。称取0.680g磷酸二氢钾，超声溶解于50mL去离子水中，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至6.8。称取1.000g胰酶加入到配制好的磷酸盐缓冲溶液中，超声溶解后用去离子水定容至100mL，得到10mg/mL的仿生肠液。取1g人参粉及15mL仿生肠液，37℃常压加热回流，提取60分钟，以8000rpm离心8分钟，分离提取液和人参粉。萃取溶剂与提取液体积比为1：1，萃取2次，合并萃取液，挥干既得人参皂苷提取物。
本实施例的人参皂苷提取物为黄色浸膏，冻干后为白色粉末。
以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为3.76mg/g、4.36mg/g、2.84mg/g、3.89mg/g、2.36mg/g、2.82mg/g、2.80mg/g、3.19mg/g，与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高4.44％、3.32％、5.19％、9.58％、7.27％、0.71％、5.66％、25.1％。在相同的提取时间内，仿生方法提取率更高，并且避免了大量使用有机溶剂，结果见图3。
实施例3
本实施例提供了一种应用于人参皂苷仿生提取的人工胃液的配制方法：
在800mL去离子水中加入16.4mL，2.34mol/L稀盐酸溶液，称取10.00g胃蛋白酶粉末溶解于其中，用去离子水定容至1000mL，得到10mg/mL的仿生胃液，其紫外吸收光谱图见图4。
实施例4
本实施例提供了一种应用于人参皂苷仿生提取的人工肠液的配制方法：
准确称取6.80g磷酸二氢钾溶于500mL去离子水中。用0.1mol/L氢氧化钠溶液(称取4.00g NaOH，用适量去离子水溶解后定容至1000mL即得)调节pH值至6.8，加入10.00g胰酶，溶解后用去离子水定容至1000mL，得到10mg/mL人工肠液，其紫外吸收光谱图见图5。
实施例5
本实施例提供了一种应用于人参皂苷提取物分析的高效液相色谱-三重四极杆质谱的多反应监测模式(MRM)定量分析人参皂苷含量的方法：
配制8种人参皂苷混合标准品溶液。将人参皂苷提取物用色谱甲醇复溶后定容至5mL，然后和人参皂苷混合标准品溶液过0.22μm有机滤膜，进入高效液相色谱-三重四极杆质谱检测，其中，柱温：35℃，流速：0.20mL/min，进样量：2.00μL，流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱：0-5min(25.0％-30％B)，5-8min(30％-32％B)，8-9min(32％-36％B)，9-16min(36％-37％B)，16-16.8min(37％-48％B)，16.8-17.8min(48％-70％B)，17.8-18.8min(70％-90％B)，18.8-20.8min(90％-25％B)，20.8-25min(25％-25％B)，电喷雾离子源鞘气：241kPa，辅助气：3.30L/min，吹扫气：1.00L/min，离子传输管温度：325℃，喷雾电压：-3000V。8种人参皂苷在MRM模式下的离子对信息如表1所示。以混合标准品溶液的峰面积对人参皂苷浓度作图绘制8种人参皂苷的标准曲线，将待测样品中各组分峰面积代入标准曲线中计算各组分浓度。现有的色谱条件可以将提取的大部分人参皂苷分离，但是Re和Rg1、Rc和Ro的分离度较差。如图6所示，在MRM模式下Re和Rg1、Rc和Ro都可以被基线分离，提高了定量分析的准确度。
表1仿生提取人参皂苷MRM模式下8种人参皂苷的离子对信息
实施例6
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于仿生胃液的浓度不同，为8mg/mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.85mg/g、4.73mg/g、2.89mg/g、4.88mg/g、2.27mg/g、3.11mg/g、2.78mg/g、3.49mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高34.7％、12.1％、7.04％、37.5％、3.18％、11.1％、4.91％、36.9％。
实施例7
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于仿生胃液的浓度不同，为20mg/mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.61mg/g、5.79mg/g、2.97mg/g、5.43mg/g、2.28mg/g、3.16mg/g、3.04mg/g、4.02mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高55.8％、37.2％、10.0％、52.9％、3.64％、12.9％、14.7％、57.6％。
实施例8
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于称取的仿生胃液体积不同，为10mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.23mg/g、4.78mg/g、2.13mg/g、3.98mg/g、1.96mg/g、2.68mg/g、2.18mg/g、3.36mg/g。与使用等体积的提取溶剂的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高48.5％、40.9％、9.25％、44.2％、7.29％、19.5％、15.2％、38.1％。
实施例9
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于称取的仿生胃液体积不同，为20mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.66mg/g、5.93mg/g、2.91mg/g、5.41mg/g、2.36mg/g、3.30mg/g、2.92、3.96mg/g。与使用等体积的提取溶剂的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高57.2％、40.5％、7.78％、42.4％、4.39％、15.3％、10.2％、45.3％。
实施例10
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于加热回流温度不同，为35℃。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.19mg/g、5.25mg/g、2.79mg/g、4.95mg/g、2.31mg/g、3.11mg/g、2.67mg/g、3.08mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高44.2％、24.4％、3.33％、3.94％、5.00％、11.1％、0.35％、20.8％。
实施例11
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于加热回流温度不同，为40℃。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.36mg/g、5.98mg/g、2.74mg/g、4.99mg/g、2.36mg/g、2.95mg/g、2.67mg/g、3.59mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高48.9％、41.7％、1.48％、40.6％、7.27％、5.36％、0.75％、40.8％。
实施例12
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于加热回流提取时间不同，为30分钟。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.38mg/g、5.36mg/g、2.76mg/g、4.98mg/g、2.59mg/g、3.01mg/g、2.65mg/g、3.52mg/g。与相同提取时间的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高35.4％、27.1％、2.22％、30.8％、13.7％、7.50％、1.62％、38.0％。
实施例13
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于加热回流提取时间不同，为90分钟。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.71mg/g、5.85mg/g、2.95mg/g、5.41mg/g、2.83mg/g、3.28mg/g、2.98mg/g、3.98mg/g。与相同提取时间的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高58.6％、38.6％、9.26％、52.4％、28.6％、17.1％、12.5％、56.1％。
实施例14
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于离心分离的转数和时间不同，分别为10000rpm和5分钟。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.64mg/g、5.81mg/g、2.87mg/g、5.38mg/g、2.35mg/g、3.32mg/g、2.95mg/g、3.86mg/g。与相同离心分离方法的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高56.7％、37.7％、8.63％、51.5％、6.82％、18.6％、11.3％、51.4％。
实施例15
实验方法同实施例1，与实施例1的区别在于萃取溶剂与提取液体积比和萃取次数不同，分别1:2和1次。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.02mg/g、5.36mg/g、2.75mg/g、5.01mg/g、2.41mg/g、3.28mg/g、2.73mg/g、3.28mg/g。与相同萃取方法的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高39.4％、27.0％、1.85％、41.1％、9.55％、17.1％、3.02％、28.6％。
实施例16
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于分样筛的目数不同，为40目。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为3.66mg/g、4.47mg/g、2.94mg/g、3.80mg/g、2.19mg/g、2.77mg/g、2.75mg/g、2.97mg/g。与提取相同粒度人参粉末的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高1.67％、5.92％、8.89％、7.04％、0.45％、1.18％、3.77％、16.5％。
实施例17
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于仿生肠液的浓度不同，为8mg/mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为3.72mg/g、4.27mg/g、2.79mg/g、3.74mg/g、2.22mg/g、2.81mg/g、2.75mg/g、2.57mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高2.56％、1.18％、3.33％、5.35％、0.91％、0.91％、3.77％、12.5％。
实施例18
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于仿生肠液的浓度不同，为20mg/mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.77mg/g、4.98mg/g、2.88mg/g、5.08mg/g、2.47mg/g、2.91mg/g、2.77mg/g、3.49mg/g。与超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高32.5％、18.0％、6.67％、43.1％、12.3％、3.93％、4.53％、36.9％。
实施例19
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于仿生肠液的体积不同，为5mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为2.47mg/g、2.54mg/g、1.59mg/g、2.62mg/g、1.02mg/g、1.58mg/g、1.43mg/g、1.77mg/g。与使用等体积的提取溶剂的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高3.72％、5.43％、6.17％、4.91％、4.97％、0.83％、8.62％、12.7％。
实施例20
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于仿生肠液的体积不同，为20mL。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.67mg/g、4.81mg/g、3.06mg/g、4.95mg/g、2.30mg/g、2.88mg/g、2.86mg/g、3.52mg/g。与使用等体积的提取溶剂的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高29.7％、14.0％、13.3％、39.4％、4.55％、0.71％、2.86％、7.92％、38.0％。
实施例21
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于仿生提取的时间不同，为120分钟。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.88mg/g、5.04mg/g、2.95mg/g、4.89mg/g、2.51mg/g、2.98mg/g、2.97mg/g、3.48mg/g。与相同提取时间的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高35.6％、19.4％、9.26％、37.8％、14.1％、6.43％、12.1％、36.5％。
实施例22
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于离心分离的转数和时间不同，分别为10000rpm和5分钟。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.65mg/g、5.08mg/g、2.79mg/g、4.98mg/g、2.28mg/g、2.83mg/g、2.77mg/g、3.45mg/g。与相同离心分离方法的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高25.1％、24.4％、5.33％、42.3％、6.64％、1.04％、4.22％、18.3％。
实施例23
实验方法同实施例2，与实施例2的区别在于萃取溶剂与提取液体积比和萃取次数不同，分别为1：3和3次。以高效液相色谱-质谱测定本实施例通过仿生法提取的人参皂苷，结果是：人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.79mg/g、5.22mg/g、2.77mg/g、5.10mg/g、2.32mg/g、2.87mg/g、2.80mg/g、3.29mg/g。与相同萃取方法的超声提取方法相比，提取的人参皂苷得率分别提高32.1％、24.7％、2.72％、40.7％、5.56％、2.51％、4.66％、27.5％。
实施例24
本实施例提供了一种仿生提取人参皂苷方法优化：
(1)仿生提取溶剂的筛选
在实施例1和实施例2的实验条件下，即相同的提取时间、仿生提取溶剂浓度、仿生提取溶剂体积、提取温度、人参质量、离心分离方法、萃取方法，仿生胃液和仿生肠液提取的8种人参皂苷含量。仿生胃液提取人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为5.65mg/g、5.83mg/g、2.98mg/g、5.35mg/g、2.35mg/g、3.30mg/g、2.95mg/g、3.90mg/g，仿生肠液提取的人参皂苷Re、Rg1、20(S)-Rf、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rd的含量分别为4.73mg/g、5.10mg/g、2.81mg/g、4.92mg/g、2.19mg/g、2.63mg/g、2.76mg/g、3.34mg/g。如图7所示，仿生胃液提取的8种人参皂苷含量均高于仿生肠液，仿生胃液的提取效率高于仿生肠液，优选仿生胃液。
(2)仿生提取溶剂体积的优化
在实施例1的实验条件下，溶剂体积分别为10mL、15mL、20mL、25mL、35mL的仿生胃液提取的8种人参皂苷的含量。如图8所示，提取的8种人参皂苷含量随提取溶剂体积的升高而增加。在高于15mL时，提取的人参皂苷含量趋于稳定，优选仿生胃液提取1g人参粉末的体积是15mL。
(3)仿生提取时间的优化
在实施例1的实验条件下，提取时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟时仿生胃液提取的8种人参皂苷含量。如图9所示，提取的8种人参皂苷含量随提取时间的增加而升高。在超过60分钟时，提取的人参皂苷含量不再明显增加，优选仿生胃液提取人参皂苷的时间是60分钟。
(4)仿生提取温度的优化
在实施例1的实验条件下，提取温度分别为25℃、30℃、37℃、40℃时仿生胃液提取的8种人参皂苷含量。结果如图10所示，理论最适温度37℃和40℃提取的8种人参皂苷含量相近，均高于25℃和30℃提取的人参皂苷含量，仿生胃液在室温即可以提取人参皂苷，优选仿生胃液提取人参皂苷的最适温度是37℃。
优选仿生提取条件为：15mL仿生胃液37℃提取1g人参粉末60分钟。
实施例7
本实施例提供了一种仿生提取人参皂苷的方法学验证实验：
(1)准确度
以加样回收率表示仿生提取方法的准确度。加样回收率(Re)计算公式如下：
Re＝(Co-Cs)/Ca×100％
式中Co为人参粉中人参皂苷的含量，Cs为加入人参粉中的人参皂苷标准品的含量，Ca为测得的加样后人参皂苷含量。按照实施例1的实验方法，分别得到仿生胃液提取人参粉中加样80.0％、100％、120％三个浓度级别的人参皂苷标准品的Re和相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示。8种人参皂苷在三个浓度级别的回收率为82.9-115.3％，RSD小于4.88％，仿生胃液提取方法具有良好的准确度。
表2仿生提取人参皂苷准确度和重复性的方法学验证
(2)重复性
将人参粉末平均分为三份，按照实施例1的实验方法提取人参皂苷，分别计算从三份人参粉末中提取的8种人参皂苷的含量，以每种人参皂苷含量的RSD表示仿生胃液提取方法的重复性，结果如表2所示，RSD小于5.34％，仿生胃液提取方法具有良好的重复性。
(3)精密度
将人参粉末平均分为9份，按照实施例1的实验方法提取人参皂苷，每日连续提取3份，分析提取的8种人参皂苷浓度，以每种人参皂苷含量的RSD表示仿生胃液提取方法的日内精密度。连续提取3天，分析每天提取的8种人参皂苷浓度，以每种人参皂苷含量的RSD表示仿生胃液提取方法的日间精密度。
(4)线性
配制每种人参皂苷浓度为20，50，100，200，300，500、800μg/mL的8种人参皂苷混合标准品溶液。按照实施例5的实验方法，建立8种人参皂苷的标准曲线和回归系数，结果如表3所示。在20-800μg/mL的浓度范围内，8种人参皂苷标准曲线的回归系数大于0.995，具有良好的线性，可以准确计算人参皂苷的含量。
表3仿生提取人参皂苷线性和精密度的方法学验证结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述方法包括仿生提取溶剂的配制、人参皂苷的仿生提取和提取液的萃取步骤。
2.根据权利要求1所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述仿生提取溶剂为仿生胃液或仿生肠液。
3.根据权利要求2所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述仿生提取溶剂为仿生胃液，所述仿生胃液的配制方法为：将胃蛋白酶溶解于稀盐酸中，配制得到5-30mg/mL的仿生胃液。
4.根据权利要求3所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述胃蛋白酶为从哺乳动物的胃粘膜提取制得，比活力不低于1：3000。
5.根据权利要求2所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述仿生提取溶剂为仿生肠液，所述仿生肠液的配制方法为：配制磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钠调节pH值6.0-6.9，将胰酶加入到磷酸盐缓冲液中，配制得到5-20mg/mL的仿生肠液。
6.根据权利要求5所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述胰酶为从具备胰腺的哺乳动物的胰中提取的多种酶的混合物，主要含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。
7.根据权利要求1所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述人参皂苷的仿生提取步骤：人参经干燥、粉碎得人参粉后利用配制的仿生提取溶剂提取，提取液经离心过滤，利用萃取溶剂萃取。
8.根据权利要求7所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述人参皂苷的仿生提取方法为常压下加热回流提取，将提取液与人参粉离心分离后进行萃取。
9.根据权利要求7所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述人参粉的质量与仿生提取溶液的体积比(g/mL)为1:8-1:35。
10.根据权利要求8所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述加热回流提取温度为25-45℃，提取时间为15-120分钟。
11.根据权利要求7或8所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述离心分离提取液的转速为6000-10000rpm，离心时间为5-10分钟。
12.根据权利要求1所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述提取液的萃取步骤：提取液与萃取溶剂混合，分离后挥干萃取液得到人参皂苷提取物。
13.根据权利要求12所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述萃取溶剂为正丁醇或水饱和正丁醇溶液，萃取溶剂与提取液体积比为1：1-1：5，萃取次数为1-3次。
14.根据权利要求1所述的仿生法提取人参皂苷的方法，其特征在于，所述方法还包括对植物药材人参进行前处理：选择4年以上的种植人参或种植西洋参，烘干温度为35-50℃，粉碎粒度为40-100目。
15.人参皂苷提取物，根据权利要求1-14任意一项方法制备得到。
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