CN107478753A - 一种人参总皂苷的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人参总皂苷的测定方法，主要包括如下步骤：(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇‑氨水的混合水溶液进行浸提得到浸提液；(B)将浸提液离心过滤，采用高效液相色谱进行定量分析，即可；其中，高效液相色谱采用的流动相为乙腈‑膦酸水溶液，膦酸的体积百分比为0.00025‑0.002％之间。本发明的人参总皂苷的测定方法，通过采用超高效液相色谱二极管阵列技术对上述主要人参皂苷进行定性定量研究，尤其对于酸性人参皂苷，采用本发明的测定方法可以提高其分离度，且具有良好峰型，专属性比较强，本发明适用于人参及其加工中人参皂苷的定性定量分析。

Description

一种人参总皂苷的测定方法

技术领域

本发明涉及人参根茎中人参总皂苷的测定领域，具体而言，涉及一种人参根茎中人参总皂苷的测定方法。

背景技术

人参(学名：Panax ginseng，又称为亚洲参，在中国东北土名“棒槌”)是具有肉质的根，可药用。人参属于五加科，主要生长在东北吉林长白山地区，特别是寒冷地区。人参是亚洲常见药材，北中美洲也普遍使用花旗参，许多草药铺和超市都能找到各式人参饮片及萃取物保健产品，用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。人参根部所含皂苷是其有效成分，中国长白山野参皂苷成分较高，但取得不易，价格高昂。

人参是五加科人参属植物，它与三七、西洋参等著名药用植物是近亲。属于多年生草本；主根肉质，圆柱形或纺锤形，须根细长；根状茎(芦头)短，上有茎痕(芦碗)和芽苞；茎单生，直立，先端渐尖，边缘有细尖锯齿，上面沿中脉疏被刚毛。伞形花序顶生，花小；花菩钟形，具5齿；花瓣5，淡黄绿色；.雄蕊5，花丝短，花药球形；子房下位，2室，花柱1，柱头2裂。浆果状核果扁球形或肾形，成熟时鲜红色；种子2个，扁圆形，黄白色。

人参中，主要活性成分为人参皂苷，具有调节中枢神经系统的作用，改善心血管及造血系统的作用，调节内分泌系统的作用，提高免疫力，抗疲劳，以及抗癌等诸多药理活性。

现有技术中，人参根茎中的总皂苷测定方法还是采用比较传统的紫外光谱或者化学试剂方法进行测定，但是这些方法不能实现人参总皂苷从定性到定量的完整检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人参根茎中人参总皂苷的测定方法，通过采用超高效液相色谱二极管阵列技术对上述主要人参皂苷进行定性定量研究，尤其对于酸性人参皂苷，采用本发明的测定方法可以提高其分离度，且具有良好峰型，并且该测定方法提取率高，专属性比较强，操作时间短，工序简单，操作简便，重复性好，填补了相关测定方法的技术空白，形成了比较标准的操作流程，所需的配套设备成本低，适于广泛推广应用，非常值得借鉴。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例提供了一种人参总皂苷的测定方法，主要包括如下步骤：

(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇-氨水的混合水溶液进行浸提得到浸提液；

(B)将浸提液离心过滤，采用高效液相色谱进行定量分析，即可；

其中，高效液相色谱采用的流动相为乙腈-膦酸水溶液，膦酸的体积百分比为0.00025-0.002％之间。

人参属于五加科人参属植物，它与三七、西洋参等著名药用植物是近亲。属于多年生草本；主根肉质，圆柱形或纺锤形，须根细长；根状茎(芦头)短，上有茎痕(芦碗)和芽苞；茎单生，直立，先端渐尖，边缘有细尖锯齿，上面沿中脉疏被刚毛。伞形花序顶生，花小；花菩钟形，具5齿；花瓣5，淡黄绿色；.雄蕊5，花丝短，花药球形；子房下位，2室，花柱1，柱头2裂。浆果状核果扁球形或肾形，成熟时鲜红色；种子2个，扁圆形，黄白色。

人参中，主要活性成分为人参皂苷，具有调节中枢神经系统的作用，改善心血管及造血系统的作用，调节内分泌系统的作用，提高免疫力，抗疲劳，以及抗癌等诸多药理活性。

现有技术中，人参根茎中的总皂苷测定方法还是采用比较传统的紫外光谱或者化学试剂方法进行测定，但是这些方法不能实现人参总皂苷从定性到定量的完整检测。

本发明为了解决以上技术问题，提供了一种适用于人参根茎中人参总皂苷的测定方法，摒弃了以往采用不能实现定性定量的传统测定方法，本发明的测定方法具有操作简单易行，重复性好、准确度高，操作时间短，工序简单，可广泛应用，填补了相关测定方法的技术空白，具有广泛推广价值，扩充了人参的药用价值的适用面，也更加利于人参的市场推广度，进而可创造一定的经济效益。

本发明具体的操作步骤(A)中，在采用高效液相色谱进行定性定量分析之前，先对人参的根茎进行烘干、粉碎，采用甲醇-氨水的混合水溶液进行浸提得到浸提液。

其中，烘干的温度最好控制在40-55℃，更优为45℃，一般烘干至重量无变化，即可以满足要求，在上述条件下可以将人参表面的水分完全蒸发干净，不会影响到后续的检测结果。

优选地，人参烘干后，粉碎的目粒度控制在60目以上，更优为70-100目，除此之外还可以为80目、90目、120目等。将人参粉碎研磨成粉状后在后续进行提取过程中更有利于人参总皂苷的浸提。

优选地，采用甲醇-氨水的混合水溶液作为溶剂对人参根茎进行浸提，每克的人参根茎添加甲醇-氨水的混合水溶液20-50ml，更优地为30-40ml，甲醇-氨水的混合水溶液中，氨水的体积百分比含量为0.01-8％之间，更优为3-6％之间。

为了使得人参在浸提过程中，能够充分与甲醇-氨水的混合水溶液混合均匀，先采用甲醇-氨水的混合水溶液进行浸泡4-12h，添加甲醇-氨水的混合水溶液后要进行相应的超声处理20-40min，超声功率控制在500w以上，频率控制在40kHz以上，更优地为超声功率控制在600-700w之间，频率控制在45-50kHz之间，适当的频率以及功率的限定，提取得到的浸提的纯度更高。

优选地，超声处理的时间控制在20-40min。

优选地，对人参的优质选择有利于后续提取步骤的顺利实施，在进行挑选时，人参最好选择5年以上生的新鲜参，无坑洞，无虫眼的人参根茎作为原材料。

优选地，人参的品种可以为生晒参，保鲜参，蜜制参，大力参，红参，活性参，糖参中的其中一种或几种。

浸提液最好以离心、过滤的方式进一步纯化，离心的转速最好控制在8000-12000rpm之间，更优为9000-10000rpm之间，离心的时间最好为5-20min之间，更优地为10min。

此外，过滤则采用滤膜进行过滤为宜，滤膜的孔径为0.22um以下比较好。

当然，最优的方式是采用0.22μm PTFE的滤膜进行过滤，以保证试样液的均一性，充分去除所含的杂质。

本发明通过对烘干、粉碎以及提取的到浸提液的步骤进行限定，使得整个提取步骤工序简单，生产周期短，并且通过试验条件的设计摸索出了一条最为适宜人参总皂苷的测定方法，将各个操作参数均控制在了比较适宜的范围内，操作方便，符合当代人参根茎中人参总皂苷测定方法的要求。

本发明的步骤(B)中，高效液相色谱分析的具体条件为：柱温35-40℃，检测波长200-210nm之间。其中，色谱柱最好选择ACQUITY UPLCBEH-C18(2.1×50mm，1.7μm)。

优选地，高效液相色谱分析过程中，柱温控制在35℃，检测波长控制在203nm，流速控制在0.3-0.5ml/min之间，更优地为0.5ml/min。

一般进样量为2μL，实际操作时分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪测定，用主峰保留时间定性，峰面积定量。

本发明的总皂苷为不多于9种人参皂苷，是指包括人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd在内的两种或两种以上的人参皂苷。

本发明的人参是指含有人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd两种或两种以上的人参。

相关的人参加工产品是指含有人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd两种或两种以上的利用人参加工成的人参产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的人参根茎中人参总皂苷的测定方法，通过采用超高效液相色谱二极管阵列技术对上述主要人参皂苷进行定性定量研究，尤其对于酸性人参皂苷，采用本发明的测定方法可以提高其分离度，且具有良好峰型，并且该测定方法提取率高，专属性比较强，操作时间短，工序简单，操作简便，重复性好，填补了相关测定方法的技术空白，形成了比较标准的操作流程，所需的配套设备成本低，适于广泛推广应用，非常值得借鉴；

(2)本发明通过对烘干、粉碎以及提取的到浸提液的步骤进行限定，使得整个提取步骤工序简单，生产周期短，并且通过试验条件的设计摸索出了一条最为适宜人参总皂苷的测定方法，将各个操作参数均控制在了比较适宜的范围内，操作方便，符合当代人参根茎中人参皂苷提取方法的要求。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

保鲜参的根茎中人参总皂苷的具体测定方法按照如下步骤进行：

1)试剂与材料：自制保鲜参；人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd，色谱级乙腈，甲醇(美国fisher公司)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，其它试剂均为分析纯；

2)仪器：美国Waters ACQUITY超高效液相色谱，光电二极管矩阵检测器，CPA225D电子天平(德国SARTORIUS AG公司)，KQ－500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HC-2514高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；

3)对照品溶液与供试品溶液：精密称取对照品人参皂苷适量与10ml容量瓶内，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；

精密称取保鲜参1g，置于100ml三角瓶内，加入甲醇-氨水的混合水溶液溶液20ml，称定重量后浸泡12h，次日于超声处理20min，超声功率为500w，超声频率为40kHz，后静置冷却混匀后取1mL置于1.5mL离心管内，8000rpm，离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测；

4)高效液相色谱条件：色谱柱Waters BEH C18(2.1*50mm，1.7um)，流动相为乙腈-(0.00025％磷酸，v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1，流速：0.5mL/min，柱温：35℃，检测波长：203nm，进样体积：2uL，具体洗脱条件如下：

表1人参及其加工产品中人参皂苷梯度洗脱条件

Time	0	3	4	4.5	5	6.5	7.5	9.5	11	11.5	14
												乙腈(％)	17	19	21	24	28	28	30	36	40	95	95

后续将各对照品溶液按一定比例混合后，配制成7个不同浓度的对照品溶液，进样体积2uL，按色谱条件进行测定后，以对照品溶液的质量浓度X(μg/mL)对峰面积Y进行线性回归，按照药典中规定以信噪比(S/N＝3)时相应各对照品的浓度作为检测限，以信噪比(S/N＝10)时相应各对照品的浓度为定量限，检测结果见表2；

表2人参皂苷的回归方程，线性范围，检测线及定量限(μg/mL)

人参皂苷	线性方程	R2	线性范围	检测线	定量限
						Rg1	Y＝1338098.8717X-306.7618	0.9998	2.96-296	0.85	2.96
Re	Y＝1232448.4679X-1551.5234	0.9998	3.54-354	1.18	3.54
						Rf	Y＝1418504.7123X-392.2370	0.9998	2.18-218	0.73	2.18
Ro	Y＝1178635.0645X+341.7092	0.9996	2.34-234	0.78	2.34
						Rb1	Y＝953276X-2079.4	0.9994	4.34-434	1.24	4.34
Rc	Y＝998258X-1636	0.9995	4.46-446	1.27	4.46
						Rb2	Y＝994273X+392.38	0.9997	3.49-349	1.16	3.49
Rb3	Y＝872685X-106.65	1.0000	1.66-166	0.66	1.66
						Rd	Y＝1064249.825X-818.6575	0.9998	3.86-386	1.11	3.86

精密度：取同一浓度对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，进样体积2μL。测定对照品的色谱峰面积并进行积分，按照表2中线性方程计算各对照品浓度及RSD值，结果表明各对照品日内精密度RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。

重复性：取同一批供试品，精密称取1g，按上述3)的方法平行制备6份供试品溶液，并按上述4)色谱条件检测，进样体积2μL。测定9种人参皂苷的色谱峰面积并进行积分，按照表2中线性方程计算平行供试品溶液中9种人参皂苷RSD值，结果表明RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。

稳定性：取同一供试品溶液，分别于制备后0h、4h、8h、12h、24h检测，进样体积2μL。测定9种人参皂苷的色谱峰面积并进行积分，经计算RSD均小于5％，表明该供试品溶液在24h内稳定性良好。

回收率：精密称取同批次已测定含量保鲜参供试品6份，每份0.5g，按各人参皂苷含量1:1的比例加入对照品混合溶液各1ml，按上述方法制备供试品溶液，并按上述色谱方法测定，计算加样回收率及RSD值，经计算9种人参皂苷的加样回收率均在90％-110％范围内，RSD值均小于3，表明该方法准确度良好，结果见表3；

表3人参皂苷的加样回收率

	Rg1	Re	Rf	Ro	Rb1	Rc	Rb2	Rb3	Rd
										实测mg	4.23	3.91	1.10	4.12	11.14	5.40	5.41	1.73	3.36
已知mg	2.26	1.96	0.57	2.05	6.13	2.81	2.88	0.51	1.69
										加入mg	2.14	2.00	0.56	2.00	5.27	2.52	2.63	0.56	1.42
回收率％	92.20	97.24	94.42	103.42	95.13	102.65	96.25	104.39	107.80
										RSD％	1.16	0.90	0.69	0.40	0.66	0.85	0.77	0.36	1.01

实施例2

生晒参的根茎中人参总皂苷的具体测定方法按照如下步骤进行：

1)试剂与材料：自制生晒参(5年以上的新鲜参，无坑洞，无虫眼，粉碎成60目以上的粉状，45℃烘干处理)；人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd，色谱级乙腈，甲醇(美国fisher公司)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，其它试剂均为分析纯；

2)仪器：美国Waters ACQUITY超高效液相色谱，光电二极管矩阵检测器，CPA225D电子天平(德国SARTORIUS AG公司)，KQ－500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HC-2514高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；

3)对照品溶液与供试品溶液：精密称取对照品人参皂苷适量与10ml容量瓶内，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；

精密称取生晒参1g，置于100ml三角瓶内，加入甲醇-氨水的混合水溶液溶液50ml(氨水的体积百分比含量为8％)，称定重量后浸泡4h，超声处理40min，超声功率为600w，超声频率为45kHz，后静置冷却混匀后取1mL置于1.5mL离心管内，9000rpm，离心20min，取上清液过0.22um滤膜，待测；

4)高效液相色谱条件：色谱柱Waters BEH C18(2.1*50mm，1.7um)，流动相为乙腈-(0.0025％磷酸，v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1，流速：0.5mL/min，柱温：35℃，检测波长：203nm，进样体积：2uL，后续洗脱条件以及后续测试步骤与实施例1一致。

实施例3

蜜制参的根茎中人参总皂苷的具体测定方法按照如下步骤进行：

1)试剂与材料：自制蜜制参(5年以上的新鲜参，无坑洞，无虫眼，粉碎成70目以上的粉状，40℃烘干处理)；人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd，色谱级乙腈，甲醇(美国fisher公司)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，其它试剂均为分析纯；

2)仪器：美国Waters ACQUITY超高效液相色谱，光电二极管矩阵检测器，CPA225D电子天平(德国SARTORIUS AG公司)，KQ－500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HC-2514高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；

3)对照品溶液与供试品溶液：精密称取对照品人参皂苷适量与10ml容量瓶内，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；

精密称取蜜制参1g，置于100ml三角瓶内，加入甲醇-氨水的混合水溶液溶液30ml(氨水的体积百分比含量为3％)，称定重量后浸泡4h，超声处理30min，超声功率为600w，超声频率为50kHz，后静置冷却混匀后取1mL置于1.5mL离心管内，10000rpm，离心10min，取上清液过0.22um滤膜，待测；

4)高效液相色谱条件：色谱柱Waters BEH C18(2.1*50mm，1.7um)，流动相为乙腈-(0.00025％磷酸，v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1，流速：0.5mL/min，柱温：38℃，检测波长：210nm，进样体积：2uL，后续洗脱条件以及后续测试步骤与实施例1一致。

实施例4

大力参的根茎中人参总皂苷的具体测定方法按照如下步骤进行：

1)试剂与材料：自制大力参(5年以上的新鲜参，无坑洞，无虫眼，粉碎成100目的粉状，55℃烘干处理)；人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2，Rb3，Rd，色谱级乙腈，甲醇(美国fisher公司)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，其它试剂均为分析纯；

2)仪器：美国Waters ACQUITY超高效液相色谱，光电二极管矩阵检测器，CPA225D电子天平(德国SARTORIUS AG公司)，KQ－500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HC-2514高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；

3)对照品溶液与供试品溶液：精密称取对照品人参皂苷适量与10ml容量瓶内，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；

精密称取大力参1g，置于100ml三角瓶内，加入甲醇-氨水的混合水溶液溶液30ml(氨水的体积百分比含量为3％)，称定重量后浸泡4h，超声处理40min，超声功率为550w，超声频率为40kHz，后静置冷却混匀后取1mL置于1.5mL离心管内，12000rpm，离心8min，取上清液过0.22um滤膜，待测；

4)高效液相色谱条件：色谱柱Waters BEH C18(2.1*50mm，1.7um)，流动相为乙腈-(0.0008％磷酸，v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1，流速：0.4mL/min，柱温：35℃，检测波长：203nm，进样体积：2uL，后续洗脱条件以及后续测试步骤与实施例1一致。

实验例1

将其他人参品种也采用实施例1-4的方法进行人参皂苷的测定，最后样品测定：取保鲜参，蜜制参，大力参，红参，活性参，糖参样品各1g，每组取3份，根据表2中的线性方程计算人参皂苷含量，结果见表4；

表4各类人参及其加工产品中人参皂含量(mg/g)

保鲜参

蜜制参

大力参

红参

生晒参

活性参

糖参

Rg1

3.00±0.029

0.12±0.005

3.35±0.014

4.13±0.009

4.52±0.036

4.53±0.030

0.76±0.003

Re

2.67±0.029

0.08±0.002

3.61±0.016

3.33±0.014

3.93±0.027

3.33±0.022

0.65±0.004

Rf

0.81±0.004

0.15±0.005

0.93±0.004

1.32±0.005

1.14±0.005

1.13±0.012

0.26±0.001

Ro

2.21±0.018

1.00±0.021

2.82±0.022

2.95±0.010

4.10±0.012

3.27±0.018

1.31±0.008

Rb1

7.69±0.064

0.68±0.014

8.57±0.035

9.79±0.019

12.26±0.058

11.28±0.048

2.39±0.017

Rc

3.74±0.034

0.23±0.004

4.43±0.025

4.58±0.005

5.63±0.029

5.11±0.019

1.26±0.010

Rb2

3.93±0.033

0.29±0.004

4.22±0.024

4.53±0.002

5.76±0.032

5.49±0.033

1.28±0.007

Rb3

0.99±0.010

0.08±0.006

0.76±0.012

0.84±0.011

1.02±0.009

0.93±0.014

0.21±0.001

Rd

3.04±0.018

0.41±0.008

3.29±0.010

3.34±0.016

3.37±0.017

2.84±0.018

0.68±0.007

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种人参总皂苷的测定方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇-氨水的混合水溶液进行浸提得到浸提液；

(B)将浸提液离心过滤，采用高效液相色谱进行定量分析，即可；

其中，高效液相色谱采用的流动相为乙腈-膦酸水溶液，膦酸的体积百分比为0.00025-0.002％之间。

2.根据权利要求1所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(A)中，粉碎的目粒度控制在60目以上，更优为70-100目；

优选地，烘干的温度为40-55℃，更优为45℃。

3.根据权利要求1所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液中氨水的体积百分比含量为0.01-8％之间，更优为3-6％之间。

4.根据权利要求1所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(A)中，每克的人参根茎添加甲醇-氨水的混合水溶液20-50ml，更优地为30-40ml。

5.根据权利要求1所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(A)中，浸提过程中，先浸泡4-12h，然后超声处理20-40min；

优选地，超声功率控制在500w以上；

优选地，超声的频率控制在40kHz以上，更优为45-50kHz之间；

优选地，超声处理的时间控制在20-40min。

6.根据权利要求1所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(A)中，人参为5年以上生的新鲜参，无坑洞，无虫眼；

优选地，所述人参为生晒参，保鲜参，蜜制参，大力参，红参，活性参，糖参中的其中一种或几种。

7.根据权利要求1-6任一项所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(B)中，离心的转速控制在8000-12000rpm之间，更优为9000-10000rpm之间；

优选地，离心的时间为5-20min，优选为10min。

8.根据权利要求1-6任一项所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(B)中，过滤采用滤膜，滤膜的孔径为0.22um以下。

9.根据权利要求1-6任一项所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(B)中，柱温35-40℃，检测波长200-210nm之间；

优选地，柱温控制在35℃，检测波长控制在203nm；

优选地，流速控制在0.3-0.5ml/min之间，更优地为0.5ml/min。

10.根据权利要求1-6任一项所述的人参总皂苷的测定方法，其特征在于，所述步骤(B)中，高效液相色谱分析的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH-C18。