CN102757277B - 一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业技术领域，公开了一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌。该制备方法将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，然后将发酵好的固体物料与腐殖酸、农用稀土、腐熟发酵后的禽畜粪便、硅钙镁肥料以及氨基酸肥料混匀即得水稻生物肥料。本发明利用诱变的枯草芽孢菌与鸡粪等腐熟发酵的有机质、腐植酸、硅钙镁肥料、农用稀土、氨基酸肥料等物质混合，形成复合水稻微生物肥料，能够提高水稻分蘖数、提前水稻分蘖期、增加水稻根重、加深水稻叶色、提高水温，促使水稻在冷胁迫下更好的生长。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌。
背景技术
黑土指有机物质平均含量在3%至10%之间，特别利于水稻、小麦、大豆、玉米等农作物生长的一种特殊土壤。由于黑土地分布在四季分明的寒温带，植被茂盛，冷热季节的更替，导致大量枯枝落叶腐化、分解，形成厚厚的、肥沃的黑土层，“寒地黑土”之称由此而得。目前，寒地黑土的物产已成为世界绿色有机食品最好品质的代表。
然而，寒地的低温寒害是农业生产中一种严重的自然灾害，涉及面广，包括粮食作物、蔬菜、果树以及其他许多经济作物，每年受此灾害造成的损失十分巨大。例如，水稻的冷胁迫是影响其高产优质低耗的重要限制因素，中国每年因寒害而损失的稻谷产量高达30-50亿千克。
市场上有很多的水稻专用肥料，但大多数为无机复混肥料或有机-无机复混肥料，即将氮磷钾按一定配比或将氮磷钾和有机质按一定配比进行生产的肥料，这些肥料只是提供水稻所需的氮磷钾养分，根本无法使水稻在低温环境下呈现良好的生长态势，如增加分蘖数、提前分蘖期、增加根重、加深叶色、提高水稻水温等。
中国专利申请号为200810137386.5的专利公开了“一种新型水稻专用微生物有机肥料的生产工艺”，其主要是通过改进吸附微生物的载体来提高微生物的活性，使微生物高效分解氮磷钾供水稻吸收，但是在冷胁迫下并不能利于水稻生长，也没有相关试验数据来证明。
中国专利申请号为201010595301.5的专利公开了“一种富硅富硒水稻专用微生物废料及其制备方法”，其主要是在生物肥料的基础上添加了中微量元素，使这种肥料在功效上有所提高，但也不能在冷胁迫下促使水稻呈现良好生长态势。
目前，市场上具有抗寒功效的水稻专用肥为水稻抗寒菌丝蛋白肥，申请号为200910072486.9，这种肥料是利用玉米浆、玉米淀粉与葡萄糖，接种青霉菌进行发酵，发酵分两次，共计8-13天，蛋白丝要进行烘干粉碎等工序，这就使这种肥料生产周期长，原料投入高，肥料的成本过高。虽然申请文件中说明能够提高水稻的抗寒能力，但是该肥料只含有氮磷钾养分，缺乏水稻生长过程中需求的其他有益物质，同时并未公开相关的试验数据，故无法证明其能够在冷胁迫下促使水稻呈现良好生长态势。此外，该肥料的菌丝蛋白为酸性，主要针对碱性土壤使用，适用范围受到限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌，使所述水稻生物肥料能够在冷胁迫下促使水稻呈现良好生长态势，如增加分蘖数、提前分蘖期、增加根重、加深叶色、提高水稻水温等，且缩短肥料生产周期。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种水稻生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料，所述固体物料由稻壳粉和花生壳粉中的任意一种、小麦麸皮、大豆饼粉、玉米粉、硫酸镁、硫酸锰组成的固体混合物以及与所述固体混合物总重相同的水混合而成；
步骤2、将发酵好的固体物料与腐殖酸、农用稀土、腐熟发酵后的禽畜粪便、硅钙镁肥料以及氨基酸肥料混合均匀即得水稻生物肥料。
其中，所述固体物料以重量份计，优选由35-45份稻壳粉或花生壳粉、45-55份小麦麸皮、4-6份大豆饼粉、4-6份玉米粉、0.04-0.06份硫酸镁和0.005-0.015份硫酸锰的固体混合物以及与所述固体混合物总重相同的水混合而成，更优选为由40份稻壳粉或花生壳粉、50份小麦麸皮、5份大豆饼粉、5份玉米粉、0.05份硫酸镁和0.01份硫酸锰的固体混合物以及与所述固体混合物总重相同的水混合而成。
作为优选，步骤2所述用于混合的各组分以重量份计为，发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土0.3份、腐熟发酵后的禽畜粪便30-75份、硅钙镁肥料5份、氨基酸肥料5份。
作为优选，步骤2还包括加入氮磷钾肥料进行混匀步骤，且步骤2所述用于混合的各组分以重量份计为，发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土0.3份、腐熟发酵后的禽畜粪便30-75份、硅钙镁肥料5份、氨基酸肥料5份、氮磷钾肥料不多于45份。所述氮磷钾肥料为市售，其中氮、磷、钾质量比优选为1:0.5-0.6:0.6-0.8。
步骤1所述发酵的时间一般为2-3天，优选地，步骤1所述发酵的pH值为7.0-7.2。
枯草芽孢杆菌不但具有促进增根、生根、壮根和提高蓄能和地温等功能，另外诱导植物抗性也是枯草芽孢杆菌生防作用的重要机制之一。其产生的过氧化氢酶及其它酵素和酶等外分泌物对水稻生长均表现出不同程度的促进作用。本发明对野生型的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）进行诱变及驯化，使其活性更强，相同条件下数量也更多，产生各种它外分泌物的能力与量也得到提升，其中过氧化氢酶及其的能力相应增加，这些物质具有增加水稻植株的鲜重与干重，提高水稻叶绿素的含量，提高其保护酶活性，并通过提高水稻对外界环境的适应性，提高其抗寒等抗逆性，促进其更好地生长。
本发明以市售野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，用含有稀土混合物的营养液在30℃、120r/min下培养12小时，然后选取强壮的菌株重复前述的培养步骤3-5次，而后选取强壮的菌株进行普通培养，当菌数达到107个/毫升，于500W的微波下处理30-45s，最终筛选得到一株诱变枯草芽孢杆菌，编号为HY01。其中，所述营养液以重量份计，由100份牛肉浸汁、1份蛋白胨、0.5份氯化钠、0.15份稀土混合物组成（氯化钆：硝酸铈重量比为2:1），pH7.2-7.4。
本发明将上述筛选出的菌株HY01按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型枯草芽孢杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株HY01与野生型枯草芽孢杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为枯草芽孢杆菌。
本发明所述枯草芽孢杆菌HY01已于2012年6月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6190。
经过试验证明，枯草芽孢杆菌HY01过氧化氢酶等酶活性从原来的5800U/L提高到11500U/L，并且HY01具有了适应更加恶劣环境的能力，其在溶液中受氮抑制浓度从6%提高到10％，各种活性和能力的提升能够使HY01更好地协调多种营养成分为水稻所利用，促使水稻在冷胁迫下呈现良好生长态势。
此外，为了配合枯草芽孢杆菌HY01的高活性，本发明将其与腐殖酸、农用稀土、腐熟发酵后的禽畜粪便、硅钙镁肥料、氨基酸肥料以及氮磷钾肥料混合，全面满足水稻所需养分并在枯草芽孢杆菌HY01的作用下增加水稻应对冷胁迫的能力。
腐植酸和作为有机质的禽畜粪便不但可以提高肥料的利用率，而且可以提高水稻的各种抗逆性。另外，在水田施用，由于腐植酸和有机肥料的颜色较深，使水田中水的颜色变深，可以更多的吸收日光，使水温有一定的提升，可以增加水稻的出苗率、促进水稻及稻苗色变深，根系发达，增加水稻的有效分蘖，促进水稻的根系增长，使根系发达，从而增加水稻产量。本领域公知，禽畜粪便在使用前一般都需要进行腐熟发酵，以便产生有效肥分和腐殖质等物质，本发明可以采用本领域常规腐熟发酵方法来获得腐熟发酵后的禽畜粪便，作为优选本发明所述腐熟发酵后的禽畜粪便由以下方法获得：
以质量百分比计，将由70%的禽畜粪便、20%的草料或秸秆粉以及10%糠麸混匀而成的发酵物料进行腐熟发酵4-6天即得，腐熟发酵期间保持发酵物料水分含量在50-65%、发酵物料高度在0.5-1.2米、发酵物料温度不高于70℃。
其中，所述禽畜粪便可以为牛粪、鸡粪、鸭粪、猪粪、鹿粪等常用禽畜粪便，可以选用一种或两种以上。
农用稀土可由市售获得，为稀土元素的氧化物或硝酸盐等，本发明优选REO≥40%的农用稀土。稀土元素对水稻生长形态、光合生理、养分吸收、产量及其构成因素具有一定促进作用。施用可有效促进水稻分蘖的发生、提高水稻根冠比以及水稻剑叶与倒2叶的叶绿素含量和叶片的光合速率。此外，稀土还可以利于秸秆中氮、磷元素向籽粒的转移和籽粒中钾元素在作物生长后期向秸秆的返流。
硅钙镁肥料是作物生长所必须的中量元素，补充水稻生长所需养分，促进水稻根系发育、促进光合作用产物运输与合理分配、提高氮磷钾养分利用率、提高作物抗逆性等，而氨基酸肥料能够补充有机氮的来源，同时将水稻所需的中量元素和微量元素（钙、镁、铁、锰、锌、铜、钼、硼、硒等）携带到植物体内，提高植物对各种养分的利用率，利于水稻提升自身抗寒能力。所述硅钙镁肥料和氨基酸肥料均可市售获得，作为优选，硅钙镁肥料优选为SiO2≥20%、CaO≥20%、MgO≥10%的硅钙镁肥料，更优选为SiO2≥25%、CaO≥30%、MgO≥10%的硅钙镁肥料；氨基酸肥料优选为N≥16%、有效氨基酸≥10%的氨基酸肥料，如长春大成集团的氨基酸有机质肥料。
本发明还提供一种由本发明所述制备方法制备的水稻生物肥料，在与市售水稻抗寒菌丝蛋白肥、不含HY01菌株的对照肥以及市售水稻无机肥的对比试验中，本发明所述水稻生物肥能够提高水稻分蘖数、提前水稻分蘖期、增加水稻根重、加深水稻叶色、提高水稻水温。
此外，本发明还提供一种保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌（即本发明诱变和驯化出的HY01菌株）及其在制备水稻生物肥料中的应用。
由以上技术方案可知，本发明利用诱变的枯草芽孢菌与鸡粪等腐熟发酵处理的有机质、腐植酸、硅钙镁肥料、农用稀土、氨基酸肥料等物质混合，形成一种复合水稻微生物肥料，其在一定程度上能够提高水稻分蘖数、提前水稻分蘖期、增加水稻根重、加深水稻叶色、提高水稻水温，促使水稻在冷胁迫下更好的生长。
生物保藏信息说明
分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis于2012年6月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6190。
具体实施方式：
本发明公开了一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述枯草芽孢杆菌HY01的筛选
以市售野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，用含有稀土混合物的营养液在30℃、120r/min下培养12小时，然后选取强壮的菌株重复前述的培养步骤3-5次，而后选取强壮的菌株进行普通培养，当菌数达到107个/毫升，于500W的微波下处理30-45s，筛选最为强壮的菌株，命名为HY01。其中，所述营养液以重量份计，由100份牛肉浸汁、1份蛋白胨、0.5份氯化钠、0.15份稀土混合物组成（氯化钆：硝酸铈重量比为2:1），pH7.2-7.4。
将上述筛选出的菌株HY01按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型枯草芽孢杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株HY01与野生型枯草芽孢杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为枯草芽孢杆菌。
实施例2：禽畜粪便的腐熟发酵
禽畜粪便：牛粪、鹿粪、猪粪、鸡粪；
以质量百分比计，将70%的禽畜粪便、20%的草料或秸秆粉、10%糠麸混匀放置发酵槽，混匀物料高度在0.5-1.2米，发酵物料温度升到60℃时，开始翻堆，控制温度不超过70℃，翻堆次数视发酵物料温度而定，发酵过程一般4-6天完成，发酵好的物料蓬松状、呈黑褐色，略带香味或泥土味。
实施例3：制备本发明所述水稻生物肥料
固体物料成分：40份稻壳粉、50份小麦麸皮、5份大豆饼粉、5份玉米粉、0.05份硫酸镁和0.01份硫酸锰，料水比为1∶1，隧道式微波灭菌，用氢氧化钙等碱性物质调节pH值为7.0-7.2；
将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料；
取发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土（REO≥40%）0.3份、实施例2的禽畜粪便50份、硅钙镁肥料（SiO2≥25%、CaO≥30%、MgO≥10%）5份、氨基酸肥料（N≥16%、有效氨基酸≥10%）5份、氮磷钾肥料20份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。
实施例4：制备本发明所述水稻生物肥料
固体物料成分：35份稻壳粉、55份小麦麸皮、4份大豆饼粉、6份玉米粉、0.04份硫酸镁和0.015份硫酸锰，料水比为1∶1，隧道式微波灭菌，用氢氧化钙等碱性物质调节pH值为7.0-7.2；
将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料；
取发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土（REO≥40%）0.3份、实施例2的禽畜粪便30份、硅钙镁肥料（SiO2≥25%、CaO≥30%、MgO≥10%）5份、氨基酸肥料（N≥16%、有效氨基酸≥10%）5份、氮磷钾肥料45份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。
实施例5：制备本发明所述水稻生物肥料
固体物料成分：45份花生壳粉、45份小麦麸皮、6份大豆饼粉、4份玉米粉、0.06份硫酸镁和0.005份硫酸锰，料水比为1:1，隧道式微波灭菌，用氢氧化钙等碱性物质调节pH值为7.0-7.2；
将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料；
取发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土（REO≥40%）0.3份、实施例2的禽畜粪便75份、硅钙镁肥料（SiO2≥20%、CaO≥20%、MgO≥10%）5份、氨基酸肥料5份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。
实施例6：制备本发明所述水稻生物肥料
固体物料成分：40份花生壳粉、50份小麦麸皮、5份大豆饼粉、5份玉米粉、0.05份硫酸镁和0.01份硫酸锰，料水比为1∶1，隧道式微波灭菌，用氢氧化钙等碱性物质调节pH值为7.0-7.2；
将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料；
取发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土（REO≥40%）0.3份、实施例2的禽畜粪便60份、硅钙镁肥料（SiO2≥20%、CaO≥20%、MgO≥10%）5份、氨基酸肥料（N≥16%、有效氨基酸≥10%）5份、氮磷钾肥料10份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。
实施例7：水稻生长对比试验
委托长春金育农业科技研究所进行水稻生长对比试验，选用肥料分别为本发明实施例3-6肥料、未添加枯草芽孢杆菌的对照肥料（按照实施例3各组分制备，区别在于不添加枯草芽孢杆菌，直接用固体物料混合造粒）、市售水稻无机肥料以及市售水稻抗寒菌丝蛋白肥，各种肥料处于相同的冷胁迫温度（水温设置为16℃左右，一般水温16-20度，分蘖缓慢，低于16度，停止分蘖）下，种植环境一致，施肥量一致，结果见表1。
表1水稻生长对比试验结果
| 分蘖数 | 分蘖期 | 根干重 | 叶色 | 水温 | |
| 实施例3 | 11.2 | 6月11日 | 1.25克 | 深绿 | 20.1℃ |
| 实施例4 | 11.0 | 6月11日 | 1.24克 | 深绿 | 20.1℃ |
| 实施例5 | 11.0 | 6月11日 | 1.24克 | 深绿 | 20.2℃ |
| 实施例6 | 11.1 | 6月11日 | 1.23克 | 深绿 | 20.1℃ |
| 对照肥料 | 10.8 | 6月12日 | 1.19克 | 绿 | 19.9℃ |
| 无机肥料 | 10.2 | 6月13日 | 1.11克 | 绿 | 18.5℃ |
| 抗寒菌丝蛋白肥 | 11.0 | 6月11日 | 1.22克 | 深绿 | 20.1℃ |
| 空白对照 | 9.3 | 6月14日 | 1.05克 | 浅绿 | 18.5℃ |
由表1可知，本发明所述水稻生物肥能够提高水稻分蘖数、提前水稻分蘖期、增加水稻根重、加深水稻叶色、提高水稻水温，优于对照肥料和无机肥料，略好于抗寒菌丝蛋白肥，能够在低温胁迫下更好地促进水稻生长。
此外，本发明所述水稻生物肥生产周期较短，为6-9天，且成本较低，应用范围广泛。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种水稻生物肥料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将固体物料用隧道式微波灭菌，并用氢氧化钙调节pH值为7.0-7.2，将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×1010个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60%、杂菌率小于20%，得到发酵好的固体物料，所述固体物料由稻壳粉和花生壳粉中的任意一种、小麦麸皮、大豆饼粉、玉米粉、硫酸镁、硫酸锰组成的固体混合物以及与所述固体混合物总重相同的水混合而成；
步骤2、将发酵好的固体物料与腐殖酸、农用稀土、腐熟发酵后的禽畜粪便、硅钙镁肥料以及氨基酸肥料混合均匀即得水稻生物肥料。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2所述混合的各组分以重量份计为，发酵好的固体物料5份、腐殖酸7.7份、农用稀土0.3份、腐熟发酵后的禽畜粪便30-75份、硅钙镁肥料5份、氨基酸肥料5份。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2还包括加入氮磷钾肥料进行混匀步骤。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述固体物料以重量份计，由35-45份稻壳粉或花生壳粉、45-55份小麦麸皮、4-6份大豆饼粉、4-6份玉米粉、0.04-0.06份硫酸镁和0.005-0.015份硫酸锰的固体混合物以及与所述固体混合物总重相同的水混合而成。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述农用稀土的REO≥40%。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述腐熟发酵后的禽畜粪便由以下方法获得：
以质量百分比计，将由70%的禽畜粪便、20%的草料或秸秆粉以及10%糠麸混匀而成的发酵物料进行腐熟发酵4-7天即得，腐熟发酵期间保持发酵物料水分含量在50-65%、发酵物料高度在0.5-1.2米、发酵物料温度不高于70℃。
7.权利要求1-6任意一项所述制备方法制备的水稻生物肥料。
8.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.6190。
9.保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌在制备水稻生物肥料中的应用。
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