CN109554379B

CN109554379B - 一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因及其克隆方法和应用

Info

Publication number: CN109554379B
Application number: CN201811648598.XA
Authority: CN
Inventors: 王俊刚; 赵婷婷; 张树珍; 杨本鹏; 王文治; 冯翠莲; 沈林波; 冯小艳; 熊国如; 蔡文伟
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109554379A

Abstract

本发明提供了一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该ShHXK8基因编码的蛋白质及该基因的克隆方法和应用。本发明首次从甘蔗中克隆得到己糖激酶ShHXK8基因全长cDNA序列，通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞质，是一种胞质己糖激酶基因。ShHXK8在胞质中可能以糖酵解的方式参与己糖代谢，且在甘蔗成熟叶片和幼嫩茎节糖代谢途径中发挥重要作用，在高糖品种幼嫩茎节中高表达有利于糖分的快速利用，在成熟茎节中的低表达促进蔗糖积累，为进一步解释甘蔗中糖代谢调控机理提供一定的研究基础。

Description

一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因及其克隆方法和应用

技术领域

本发明生物技术领域，涉及一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因及其克隆方法和应用。

背景技术

甘蔗是重要的糖料及能源经济作物，其茎秆中储存大量蔗糖和纤维素，可用于生产糖和酒精。蔗糖是甘蔗光合作用产物和韧皮部运输的主要形式，且在茎秆薄壁细胞中大量积累。甘蔗中糖代谢及分配决定其产量和品质。蔗糖可以被蔗糖合成酶或转化酶分解成己糖，己糖进入糖酵解途径，为植物体生理活动提供能量和中间代谢产物，蔗糖与己糖间的分配调控甘蔗中蔗糖积累。己糖必须经过磷酸化才能进入糖代谢途径。葡萄糖必须被磷酸化成葡萄糖-6-磷酸才能被利用，萄糖-6-磷酸可以生成果糖-6-磷酸进入糖酵解、呼吸作用、糖异生等途径，还可以生成葡萄糖-1-磷酸、UDP-葡萄糖和ADP-葡萄糖，用于合成其它糖类物质。UDP-葡萄糖与果糖-6-磷酸用于合成蔗糖，与萄糖-6-磷酸用于合成海藻糖。

己糖激酶是催化己糖磷酸化的酶，根据底物特异性进行分类发现植物中存在两种己糖激酶，分别命名为己糖激酶(Hexokinase，HXKs)和果糖激酶(Fructokinase，FRKs)。果糖激酶特异磷酸化果糖，而己糖激酶可以磷酸化葡萄糖、果糖、甘露糖、葡糖胺。特异性磷酸化葡萄糖的己糖激酶命名为葡糖激酶，然而在植物中没发现葡萄糖激酶。因此在植物中葡萄糖被己糖激酶磷酸化，果糖可以被己糖激酶和果糖激酶磷酸化。植物体中己糖激酶和果糖激酶是有机物代谢起始的关键酶，催化不可逆反应，在植物糖代谢中起重要调节作用。马铃薯StFRK是植物中分离的第一个果糖激酶基因，并从拟南芥中分离出第一个己糖激酶基因AtHXK1。随后在不同植物中分离出HXK和FRK家族基因，番茄中分别发现4个HXK和4个FRK基因，拟南芥中发现3个HXK和3个HXL基因，水稻中发现10个HXK基因，进一步对这些基因功能进行研究，结果表明己糖激酶是一种双重功能的酶，不仅催化己糖磷酸化，而且参与糖感应和信号传导过程，在感应葡萄糖信号、调节光合基因表达、影响呼吸作用、氧胁迫、病原菌抗性等植物生长发育过程中起重要调节作用。

植物中目前鉴定出的己糖激酶HXK多与线粒体活动密切相关，定位于线粒体膜，如AtHXK1和AtHXK2，OsHXK2,3,5,6,9等；也有的HXK定位于质体，如拟南芥AtHXK3、水稻OsHXK4，AtHXK1、OsHXK5、OsHXK6同时也定位于细胞核中，可能调控基因表达，另外还鉴定出一类定位于细胞质的己糖激酶如OsHXK7、SbHXK8。目前甘蔗中还没有HXK基因相关功能研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因，对其生物信息学进行分析，并进一步分析其在甘蔗不同组织中的表达模式以及其编码蛋白的亚细胞定位分析，为进一步解释甘蔗中糖代谢调控机理提供一定的研究基础

本发明的第一个方面是提供一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因编码的蛋白质。

本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从甘蔗叶片、和/或茎节组织中提取总RNA；(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；(3)设计ShHXK8基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，ShHXK8基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示；(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得ShHXK8基因片段。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因在筛选高糖或低糖热带种甘蔗品种中的应用。

在高糖热带种甘蔗的叶片和成熟茎节中ShHXK8基因的表达低于低糖热带种甘蔗，而在高糖热带种甘蔗的茎尖未成熟茎节中的ShHXK8的表达高于低糖热带种甘蔗。

本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因。

本发明的第十个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示。该引物对可用于ShHXK8基因全长序列扩增。

本发明首次从甘蔗中克隆得到己糖激酶ShHXK8基因全长cDNA序列，通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞质，是一种胞质己糖激酶基因。对其表达模式进行分析结果表明ShHXK8在甘蔗叶片和茎秆中均有表达，尤其在己糖含量较高的成熟叶片和幼嫩未成熟茎节表达量高；进一步对高糖和低糖热带种甘蔗中ShHXK8表达分析表明其在高糖热带种茎尖未成熟茎节中的表达量高于低糖热带种，在叶片和其它茎节中的表达低于低糖热带种。表明ShHXK8在胞质中可能以糖酵解的方式参与己糖代谢，且在甘蔗成熟叶片和幼嫩茎节糖代谢途径中发挥重要作用，在高糖品种幼嫩茎节中高表达有利于糖分的快速利用，在成熟茎节中的低表达促进蔗糖积累，为进一步解释甘蔗中糖代谢调控机理提供一定的研究基础。

附图说明

图1为甘蔗己糖激酶ShHXK8基因全长序列PCR扩增电泳图。

图2为甘蔗己糖激酶ShHXK8基因遗传进化树，其中，DoHXK8：Dichantheliumoligosanthes(OEL27011.1)；SbHXK8：高粱(XP_002455027.1)；ZmHXK1：玉米(NP_001130970.1)；SiHXK8：小米(XP_004968460.1)；VvHXK1：葡萄(>AEJ95926.1)；CoHXK：长蒴黄麻(>OMO66507.1)；AtHXK7：山羊草(XP_020152558.1)；AtHXK8：山羊草(XP_020173616.1)；OsHXK7：水稻(>AAZ93624.1)；GaHXK1：树棉(>KHG22031.1)。

图3为不同甘蔗种中ShHXK8基因表达分析结果。A：ROC22中ShHXK8的表达。B：28NG251(HS)和MUCK CHE(LS)中ShHXK8的表达。YL：未成熟叶；ML：成熟叶；J1：茎节1-2；J2：茎节4-5；J3：茎节7-8；J4：茎节10-11；J5：茎节12-13；J6：茎节15-16；J7：茎节18-19；J8：茎节23-24。

图4为甘蔗己糖激酶ShHXK8-GFP水稻原生质体亚细胞定位结果。A：ShHXK8-GFP融合载体NcoⅠ酶切鉴定；B：ShHXK8-GFP和GFP-1302空载体在水稻叶肉细胞原生质体中的亚细胞定位，由左至右分别为荧光场、明场、荧光明场融合图像。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

1材料与方法

1.1材料

本试验所用甘蔗品种ROC22、高糖热带种28NG251、低糖品种MUCK CHE，种植于海口中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地。

1.2菌株与试剂

本试验所用大肠杆菌感受态菌株DH 5α购自北京全式金生物公司，pMD-19T克隆载体、LA taq酶、Real time PCR试剂购自Takara生物公司，RNA提取试剂盒购自Omega公司，cDNA第一链反转录试剂盒、T4连接酶、快速限制性内切酶购自Fermentas生物公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Axgen公司。

1.2方法

1.2.1甘蔗总RNA提取及cDNA第一链合成

分别称取甘蔗叶片、不同部位茎节的组织100mg在液氮中充分研磨成粉末，然后根据Omega植物RNA提取试剂盒步骤提取甘蔗组织中的总RNA，提取完成的总RNA置于-80℃保存备用，提取质量经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计吸光值进行纯度检测。cDNA合成按照Fermentas RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书步骤进行反转录，合成cDNA放于-20℃保存备用。

1.2.2甘蔗己糖激酶ShHXK8基因全长序列扩增及测序

以甘蔗转录组测序数据序列为基础，设计ShHXK8全长扩增引物(见表1)，以甘蔗叶片cDNA为模板进行ShHXK8全长序列扩增。PCR反应体系为：buffer 25ul，dNTP 4ul，引物P1/P2各1ul，cDNA 1ul，LA taq 0.6ul，ddH₂O 14.4ul。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃1min，58℃2min，72℃2min，35cycles；72℃15min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带使用试剂盒进行胶回收，并用TA克隆连入pMD-19T后转化DH 5α感受态细胞，对阳性菌落送上海生物工程生物公司进行测序。

1.2.3甘蔗己糖激酶ShHXK8基因生物信息学分析

测序获得的序列需进行核酸同源性分析、阅读框ORF分析、编码氨基酸序列分析及编码蛋白特性及遗传进化树分析。核酸同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，ORF分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，编码氨基酸序列同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，利用MEG 4.0软件进行进化树构建。

1.2.4甘蔗中ShHXK8表达分析

以Real time PCR技术分析八个月大甘蔗植株未成熟叶、成熟叶、1-3茎节、4-5茎节、9-10茎节、16-17茎节、19-20茎节中的ShHXK8表达模式。以甘蔗GADPH作为内参基因(Iskandar，2004)，ShHXK8和GADPH qPCR扩增引物见表1。qPCR反应体系为：2×SYBRPremixEx Taq^TM，10μL；引物P1/P2(4μmol/L)各2μL；50×ROX Reference Dye，0.4μL；cDNA，1μL；ddH₂O，6.6μL。反应程序为试剂盒推荐程序，设3个技术重复，3个生物学重复。结果以2^-ΔΔCt法计算相对定量值。

1.2.5甘蔗己糖激酶ShHXK8-GFP融合载体构建

设计ShHXK8阅读框扩增引物，下游引物去除终止子(表1)，并以含有ShHXK8全长序列的质粒为模板进行ORF序列扩增，PCR反应体系及程序同上，PCR扩增产物经电泳切胶回收。将pCAMBIA1302载体用NcoⅠ单酶切线性化后胶回收。将ShHXK8ORF片段与载体片段通过无缝克隆技术进行连接，形成ShHXK8-GFP融合表达载体，阳性克隆送测序以验证连接片段序列正确。

1.2.6甘蔗己糖激酶ShHXK8在水稻原生质体中的亚细胞定位

取7-15天大小的水稻幼苗茎叶，按照Yoo等2007方法进行原生质体提取及ShHXK8-GFP融合质粒的转化及瞬时表达，并用激光共聚焦显微镜观察定位结果。

表1引物序列设计及用途

2结果

2.1甘蔗总RNA纯度鉴定结果

本试验中不同甘蔗组织提取的RNA均经过琼脂糖凝胶电泳和吸光值检测。电泳结果显示所提总RNA 28S、18S条带完整清晰可见，没有明显降解，且A₂₆₀/A₂₈₀为1.8～1.9，表明所提总RNA质量好，可用于进一步的试验。

2.2甘蔗己糖激酶ShHXK8全长cDNA序列克隆

以蔗糖快速积累茎节cDNA为模板进行ShHXK8全长序列PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后发现在1500bp-2000bp之间存在一条特异的条带(见图1)，经胶回收连接转化测序后获得1845bp全长ShHXK8cDNA序列。

2.2甘蔗己糖激酶ShHXK8基因生物信息学分析

对ShHXK8基因cDNA序列进行同源比对发现，与高粱HXK8同源性达98％，与玉米HXK1同源性达80％。对1845bp ShHXK8全长序列进行分析发现，其中包含1560bp完整阅读框，编码519个氨基酸。利用ProtParam软件对编码氨基酸序列进行预测分析发现编码蛋白相对分子量55.75KD，理论等电点pI为5.19，富含亮氨酸(9.6％)、丙氨酸(11.0％)、甘氨酸(9.6％)、谷氨酸(8.5％)、缬氨酸(7.7％)、赖氨酸(7.1％)、天冬氨酸(6.7％)、丝氨酸(6.6％)等。不稳定系数31.11，是一种稳定蛋白。氨基酸同源序列比对发现ShHXK8编码蛋白与高粱HXK8和玉米HXK1同源性达到98％，属于hexokinase-2超家族，含有己糖激酶保守结构域。根据不同物种间己糖激酶遗传进化树聚类分析表明ShHXK8与高粱SbHXK8、ZmHXK1聚为一小类，与水稻、小米、山羊草等HXK7、HXK8聚为一大类(见图2)。

2.3甘蔗己糖激酶ShHXK8表达模式分析

对甘蔗品种ROC22植株不同组织中的ShHXK8表达模式进行分析发现，ShHXK8在叶片和不同部位茎节中均有不同程度的表达，特别是在成熟叶片和未成熟茎节中的相对表达量较高(见图3)。进一步对高糖和低糖热带种甘蔗不同组织中ShHXK8的表达进行分析发现，在高糖热带种叶片和成熟茎节中ShHXK8的表达低于低糖热带种，而在高糖热带种茎尖未成熟茎节中的ShHXK8的表达高于低糖热带种(见图3)。

2.4甘蔗己糖激酶ShHXK8亚细胞定位分析

采用无缝连接技术将去除终止子的ShHXK8编码序列连入没有起始密码子的GFP序列的N端，形成ShHXK8-GFP融合表达载体，经酶切与测序证实插入序列准确无误，没有发生移码(见图4A)。进一步将ShHXK8-GFP融合载体在水稻叶肉细胞原生质体中进行瞬时表达发现，含有GFP的空载体在细胞核、胞质、细胞膜中均有定位，而ShHXK8-GFP融合蛋白定位于细胞质中(见图4B)，证实ShHXK8是一种胞质蛋白。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因及其克隆方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1845

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

ctccgttcat ctccataccg acatgactca gattcttgat ttcctcctcg ggggttgggg 60

ccatggcggc agcggcgctg gcaatggcag agcaggtggt gtccgacctc cgagcgaagt 120

gcgagacgcc gccgtcgatg ctgcgcgagg tggcggcgga gatggctcgc gagatggggg 180

cgggactgga gaaggaaggc gggagcaggg tcaagatgct cctctcctac gtcgataagc 240

tccccacagg gggagaggag ggattattct atggattgga cctaggagga acgaatttcc 300

gcgtcttgaa agtggaactg ggtgggaatg agaagcatgt cgtggaccgt gactccagag 360

aagtcggtat tcctccacat ttgatgtcag ggaaatcctc ggagcttttt ggttccattg 420

cttctgaatt ggccaagttt gttaatgatg aggagaagtg cactaacatt tcgaatggaa 480

agaagagaga actagggttc acattttcat tcccagtgaa gcagcattct gttgcttccg 540

gtacgcttgt caagtggaca aaggcatttt ccattaatga tgctgtaggt gaagatgtgg 600

tggctgaact gcaaacagct atggggaagc aaggtctgga catgcatgta gctgcattga 660

ttaatgatgc tgttgggact ctggctggag caaggtacta cgacaaagat gttgtcgctg 720

gtgtaatatt tggcactggc acaaatgcag catatgttga gaaggcaaat gctattccaa 780

aatggaaggg tgagctgccc aattcaggag acatggtcat caacatggaa tggggtaact 840

tctgctcagt tcatctcccc atcactgaat atgatcagga attagataag gagagcttaa 900

atccaggaga gcagatttac gagaagttaa catcaggaat gtatttgggt gaaattgtaa 960

ggagggtgct ccttaaaata tcattgcagt ctgcgatttt tggcaatatt gaccacacta 1020

agctcgaaac cccgttcctt ctgcggaccc cacatatttc tgcaatgcac catgatgaaa 1080

caccagatct gaagattgtg gctgaaaaac tggaagaaag cctagagatt acaggcgcat 1140

ccttagaggc tcgaaaattg gtggttgaaa tttgtgacat tgtggcaaca agagctgccc 1200

ggctggctgc tgcagggctt gcagggatcc tcatgaagct cggcagagat tgcagtgtca 1260

agggtcaacg atcagtcatc gccatcgatg gaggattgtt cgagcactac accaaattcc 1320

gccaatgctt ggagaccaca ctgggtgagc tgctaggaga tgaggtgtct aaggcggtgg 1380

ccgtcaagca tgcagatgac ggttcaggaa taggtgctgc cctgattgca gcttcacaat 1440

ctcagtacaa aaatgactta gtggccgtca agcatgcaga tgacgagcac gcagatgacg 1500

gttcaagagt caagcatgaa gatgcagatg acaagcatga aaatgacggt aaaggagtca 1560

agcatgcaga tgacggttca gaaataggtg ctgccctgat tgcagcctcg caatctcagt 1620

agagaaatgt cctcgaaatc tcagaagaga aatttcgagt gatatagtag tatctgccat 1680

gggtgcttac catagatgta ggaaagatta gctagcaagt agctataatg tctttccaac 1740

atcttaacag tccggcatct gcagttaaca tgctagagct ggatgcaacc tataaccaaa 1800

acgaggcttg gcagctggat gcaatctgta accaaaacaa ggctt 1845

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

ctccgttcat ctccataccg aca 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

aagccttgtt ttggttacag attgc 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

tccagagaag tcggtatt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

gccaattcag aagcaatg 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

cacggccact ggaagca 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

tcctcagggt tcctgatgcc 20

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

agatctacta gtggtaccat ggcggcagcg gcgct 35

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

tcaccatgga tccggtaccc tgagattgcg aggctgcaat cag 43

<210> 10

<211> 519

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 10

Met Ala Ala Ala Ala Leu Ala Met Ala Glu Gln Val Val Ser Asp Leu

1 5 10 15

Arg Ala Lys Cys Glu Thr Pro Pro Ser Met Leu Arg Glu Val Ala Ala

20 25 30

Glu Met Ala Arg Glu Met Gly Ala Gly Leu Glu Lys Glu Gly Gly Ser

35 40 45

Arg Val Lys Met Leu Leu Ser Tyr Val Asp Lys Leu Pro Thr Gly Gly

50 55 60

Glu Glu Gly Leu Phe Tyr Gly Leu Asp Leu Gly Gly Thr Asn Phe Arg

65 70 75 80

Val Leu Lys Val Glu Leu Gly Gly Asn Glu Lys His Val Val Asp Arg

85 90 95

Asp Ser Arg Glu Val Gly Ile Pro Pro His Leu Met Ser Gly Lys Ser

100 105 110

Ser Glu Leu Phe Gly Ser Ile Ala Ser Glu Leu Ala Lys Phe Val Asn

115 120 125

Asp Glu Glu Lys Cys Thr Asn Ile Ser Asn Gly Lys Lys Arg Glu Leu

130 135 140

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Val Lys Gln His Ser Val Ala Ser Gly

145 150 155 160

Thr Leu Val Lys Trp Thr Lys Ala Phe Ser Ile Asn Asp Ala Val Gly

165 170 175

Glu Asp Val Val Ala Glu Leu Gln Thr Ala Met Gly Lys Gln Gly Leu

180 185 190

Asp Met His Val Ala Ala Leu Ile Asn Asp Ala Val Gly Thr Leu Ala

195 200 205

Gly Ala Arg Tyr Tyr Asp Lys Asp Val Val Ala Gly Val Ile Phe Gly

210 215 220

Thr Gly Thr Asn Ala Ala Tyr Val Glu Lys Ala Asn Ala Ile Pro Lys

225 230 235 240

Trp Lys Gly Glu Leu Pro Asn Ser Gly Asp Met Val Ile Asn Met Glu

245 250 255

Trp Gly Asn Phe Cys Ser Val His Leu Pro Ile Thr Glu Tyr Asp Gln

260 265 270

Glu Leu Asp Lys Glu Ser Leu Asn Pro Gly Glu Gln Ile Tyr Glu Lys

275 280 285

Leu Thr Ser Gly Met Tyr Leu Gly Glu Ile Val Arg Arg Val Leu Leu

290 295 300

Lys Ile Ser Leu Gln Ser Ala Ile Phe Gly Asn Ile Asp His Thr Lys

305 310 315 320

Leu Glu Thr Pro Phe Leu Leu Arg Thr Pro His Ile Ser Ala Met His

325 330 335

His Asp Glu Thr Pro Asp Leu Lys Ile Val Ala Glu Lys Leu Glu Glu

340 345 350

Ser Leu Glu Ile Thr Gly Ala Ser Leu Glu Ala Arg Lys Leu Val Val

355 360 365

Glu Ile Cys Asp Ile Val Ala Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala

370 375 380

Gly Leu Ala Gly Ile Leu Met Lys Leu Gly Arg Asp Cys Ser Val Lys

385 390 395 400

Gly Gln Arg Ser Val Ile Ala Ile Asp Gly Gly Leu Phe Glu His Tyr

405 410 415

Thr Lys Phe Arg Gln Cys Leu Glu Thr Thr Leu Gly Glu Leu Leu Gly

420 425 430

Asp Glu Val Ser Lys Ala Val Ala Val Lys His Ala Asp Asp Gly Ser

435 440 445

Gly Ile Gly Ala Ala Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser Gln Tyr Lys Asn

450 455 460

Asp Leu Val Ala Val Lys His Ala Asp Asp Glu His Ala Asp Asp Gly

465 470 475 480

Ser Arg Val Lys His Glu Asp Ala Asp Asp Lys His Glu Asn Asp Gly

485 490 495

Lys Gly Val Lys His Ala Asp Asp Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu

500 505 510

Ile Ala Ala Ser Gln Ser Gln

515

Claims

1.一种甘蔗己糖激酶ShHXK8基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种蛋白质，其特征在于，其为权利要求1所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因编码的蛋白质。

3.一种权利要求1所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从甘蔗叶片、和/或茎节组织中提取总RNA；

(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

(3)设计ShHXK8基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，ShHXK8基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得ShHXK8基因片段。

4.如权利要求1所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因在筛选高糖或低糖热带种甘蔗品种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在高糖热带种甘蔗的叶片和成熟茎节中ShHXK8基因的表达低于低糖热带种甘蔗，而在高糖热带种甘蔗的茎尖未成熟茎节中的ShHXK8的表达高于低糖热带种甘蔗。

6.一种表达载体，其含有权利要求1所述的甘蔗己糖激酶ShHXK8基因。

7.一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。