JPH11151090A - エチレン低感受性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 メロンにおけるエチレンレセプター遺伝子を
単離することを課題とする。また、本発明はエチレンレ
セプターの機能を抑制することによりエチレン低感受性
植物を作出することを課題とする。 【解決手段】 メロンのエチレンレセプターが最も強く
発現している組織を材料として選択するとともに、優れ
たプライマー設計に基づくPCRを行うことにより、メロ
ンのエチレンレセプター遺伝子を単離することに成功し
た。さらに、本発明者らは、単離したメロンのエチレン
レセプター遺伝子を導入することによりエチレン低感受
性植物を作出することに成功した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の成熟に関わ
るホルモンであるエチレンのレセプター、および該レセ
プターのエチレン低感受性植物作出のための利用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】メロンやトマトなどの農作物の成熟には
植物ホルモンの一種であるエチレンが深く関連してい
る。このため従来からエチレンの生合成を抑制すること
による、日持ちの良い農作物の作出が試みられてきた。
例えば、トマト（Oeller,P.W.,Min-Wong,L.,Taylor,L.
P.,Pike,D.A.,and Theologis,A.(1991) Science 254:43
7-439;Hamilton,A.J.,Lycett,G.W.,Grierson,D.(1990)
Nature 346:284-287）やメロン(Ayub,R.,Guis,M.,Amor,
M.B.,Gillot,L.,Roustan,J.P.,Latche,A.,Bouzayen,M.,
and Pech,J.C. (1996) Nature Biotechnology 14:862-
866)で生合成酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を用いた
エチレン生合成の抑制が行われてきた。

【０００３】一方、近年、植物細胞内にエチレンに対す
るレセプターが存在することが明らかとなった。このた
め日持ちの良い農作物の作出のための標的としてこのエ
チレンレセプターが注目を浴び、その遺伝子の単離が試
みられている。例えば、エチレン感受性がほとんどみら
れないシロイヌナズナetr1突然変異体の研究から、エチ
レン感受性に関わる遺伝子として、エチレンレセプター
遺伝子ETR1が単離された（Bleecker, A.B., Estelle,
M.A., Somerville, C. and Kende, H. (1988)Science 2
41:1086-1089、Chang, C., Kwok, S.F., Bleecker, A.
B. and Meyreowitz, E.M. (1993) Science 262: 539-5
44）。その推定アミノ酸配列から、ETR1タンパク質は、
N末端に3つの疎水性領域を持ち、細菌のヒスチジンキナ
ーゼに類似したドメインとレスポンスレギュレーターに
類似したドメインを持つことが判明した。4つの独立し
たetr1突然変異体から単離された変異遺伝子etr1-1、et
r1-2、etr1-3、etr1-4では、全てN末端の疎水性領域に1
アミノ酸置換が起きていた（Bleecker,A.B. and Schall
er, G.E. (1996) Plant Physiol. 111: 653-660）。
この変異は優性であり、シロイヌナズナ野生株へetr1-1
変異遺伝子を導入した形質転換体でもエチレン非感受性
を示した。最近、トマトやペチュニアにetr1-1変異遺伝
子を導入した場合も、同様にエチレン非感受性の形質転
換体が得られることが報告された（Wilkinson,J.Q., La
nahan, M.B., Clark, D.G., Bleecker, A.B., Chang,
C.,Meyerowitz,E.M. and Klee, H.J. (1997) Nature
Biotech. 15: 444-447）。

【０００４】ETR1の機能解析は酵母の実験系で行われた
（Schaller, G.E. and Bleecker,A.B. (1995) Science
270: 1809-1811）。まず正常なETR1遺伝子を酵母で発現
させると¹⁴C-エチレンと結合することから、ETR1がエチ
レン結合能を持つことが証明された。一方、疎水性領域
の1アミノ酸を置換した変異遺伝子や疎水性領域全てを
欠失させた遺伝子を導入した場合は結合しなかったこと
から、エチレン結合活性が疎水性領域にあることが示さ
れた。このことがETR1がエチレンレセプター遺伝子であ
るという強い証拠となった。

【０００５】ETR1に続いて、やはりエチレン非感受性の
トマトNr突然変異体から、ETR1と非常に高いホモロジー
を持つNR遺伝子が単離された（Lanahan,M.B., Yen, H.-
C.,Giovannoni, J.J. and Klee, H.J. (1994) Plant
Cell 6:521-530、Wilkinson, J.Q., Lanahan, M.B., Ye
n, H.-C., Giovannoni., J.J.and Klee,H.J. (1995)Sci
ence 270: 1807-1809）。またETR1をプローブとして、
シロイヌナズナERS、トマトeTAE1、Rumex palustris
（ギシギシ属）RP-ERS1が単離された（Hua, J.,Chang,
C., Sun, Q.and Meyerowitz, E.M. (1995) Science 26
9: 1712-1714、Zhou, D., Kalaitzis, P., Mattoo, A.
K. and Tucker, M.L. (1996) Plant Mol.Biol .30: 1
331-1338、Vriezen, W.H., van Rijn, C.P.E., Voesene
k, L.A.C.J. and Mariani, C. (1997) PlantJ. 11:1265
-1271）。これらのうちeTAE1は、ETR1と同様にN末端の
疎水性領域、ヒスチジンキナーゼドメイン、レスポンス
レギュレータードメインを保持していた。一方、ERSのN
R及びRP-ERS1は非常に類似した疎水性領域とヒスチジン
キナーゼドメインを保持していたが、レスポンスレギュ
レータードメインは保持していなかった。

【０００６】また、カーネーションやリンゴ、ゼラニウ
ムでETR1ホモログの単離が行われている（Verlinden,S.
and Woodson, W.R. (1996) Hort Science 31: 615、
Lee,S.A., Ross, G.S.,and Gardner, R.C. (1996) In A
SBMB/ASPP Conbined Conference Abs. Canberra. Lee e
t al. 1996、Clark, D.G., Dervinis, C., Nell, T.A.
and Barrett, J.E.(1997) Hort Science 32: 499）。日
本国内においては、カーネーション、ナシでの部分配列
の単離が園芸学会において報告されている（板井章浩,
田辺賢二, 田村文男 (1996) ニホンナシ果実のETR1ホモ
ローグcDNAのPCRクローニング. 園学雑65別2: 748-74
9、板井章浩, 田辺賢二, 田村文男 (1997) ニホンナシ
のエチレン受容体遺伝子のクローニングと構造解析.園
学雑66別1:564-565、渋谷健市, 吉岡俊人, 佐藤茂 (199
7) カーネーション花弁のエチレンレセプ ター遺伝子の
クローニングと解析.園学雑66別1: 430-431）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このように多くの農作
物において日持ち性の改良への試みがなされているが、
農作物の中でも特にメロンの果実は、エチレンによる追
熟が非常に迅速に起こるという特徴を有する。そして、
このことがメロンの流通過程における腐敗による損失
と、可食適期の短さにつながっている。このため、メロ
ンの日持ちを改善することは、生産者の利益率を上昇さ
せるとともに、メロンの市場での単価の低下につなが
り、消費者に対しても大きなメリットとなりうる。

【０００８】従来、トマトなどで用いられている、植物
自身のエチレン生合成系遺伝子の阻害による日持ち性の
改善は、果実自身の発生するエチレンによって引き起こ
される追熟を抑制することに対しては有効な手段といえ
る。しかしながら、エチレンは、全ての植物が生産する
普遍的な物質であり、例えば、輸送中などで、他の野菜
・果物類の生じるエチレンに対してはこのような改善は
全く効果がなく、特に可食期の短いメロンにとっては重
大な問題となりうる。そのため、メロンにおいては、エ
チレンの生合成をコントロールするよりも、エチレンの
感受性を抑えることが、より市場価値の高いものになる
と考えられる。メロンでは、他の植物と異なり、エチレ
ン感受性の失われた品種は存在しないため、メロンにお
いては、感受性を抑制するために遺伝子組み換えを利用
することが最も良い手段であるといえる。この際、既に
単離されているアラビドプシスやトマトのエチレンのレ
セプター遺伝子を用いることも考えられる。しかしなが
ら、メロン由来の遺伝子とは相同性が必ずしも高くない
と考えられ、メロンにおいてこれらの植物の遺伝子をア
ンチセンス遺伝子として利用した場合には、メロン由来
の遺伝子を利用した場合に比して、有効性は低いと考え
られる。

【０００９】また、エチレンの感受性の抑制方法とし
て、シロイヌナズナ、トマトのエチレン非感受性変異体
で確認されるような遺伝子の点変異を利用する方法が挙
げられるが、このような点変異を導入した遺伝子が、元
からある遺伝子と異なる（ヘテロである）場合、十分に
機能するかどうかについては疑わしい。このためメロン
の日持ち性の改良のためには、メロン自身の遺伝子を単
離し、これを利用する方法が最も確実かつ有効な手法で
あるといえる。そこで、本発明は、メロンのエチレンレ
セプター遺伝子を単離することを課題とする。また、本
発明はエチレンレセプターの機能を抑制することにより
エチレン低感受性植物を作出することを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記のようにメロンのエ
チレンレセプター遺伝子を単離することは、メロンの日
持ち性の改善のために非常に有用である。しかしなが
ら、エチレンレセプター遺伝子は植物間で必ずしも保存
性が高くないため、単純に他の植物の遺伝子を利用して
クローニングすることは困難である。このことはテキサ
スA&M大学の研究グループがトマトのエチレンレセプタ
ー遺伝子をプローブとして、RNAブロットハイブリダイ
ゼーションを行った結果、メロン果実からは、シグナル
を検出できなかったことから裏付けられる。このような
場合、現在では、転写産物よりポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を利用して該当する遺伝子の部分断片をクロー
ニングすることを行う。しかしながら、この方法は、PC
Rを行うために必要な該当遺伝子の部分塩基配列（プラ
イマー）の選定の仕方によってその結果が大きく左右さ
れる。さらに、遺伝子の単離の際には、いくつかの発育
ステージのメロンを材料とできることが必要であるが、
通常、栽培品種のメロンの種子を手に入れることは困難
であり、またメロンの栽培は難しく、高度な栽培技術を
要求される。このこともメロンのエチレンレセプター遺
伝子の単離を一層困難なものにしている。

【００１１】本発明者等は、このような状況の中で独自
のメロンの栽培技術を生かし、メロンのエチレンレセプ
ター遺伝子を単離すべく鋭意研究を行った結果、メロン
のエチレンレセプターが最も強く発現している組織を材
料として選択するとともに、優れたプライマー設計に基
づくポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことにより、
メロンのエチレンレセプター遺伝子を単離することに初
めて成功した。さらに、本発明者らは、単離したメロン
のエチレンレセプター遺伝子を導入することによりエチ
レン低感受性植物を作出することに成功した。

【００１２】即ち、本発明はメロンのエチレンレセプタ
ー、およびエチレンレセプターの機能が抑制されたエチ
レン低感受性植物に関し、より具体的には、（１） 配
列番号：１または配列番号：９に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質、（２） 配列番号：１または配列
番号：９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数
個のアミノ酸が 置換、欠失、若しくは付加したアミノ
酸配列を有し、エチレンとの結合活性を有するタンパク
質、（３） 配列番号：１または配列番号：９に記載の
アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置
換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、エチ
レンとの結合活性を有しないタンパク質、（４）
（１）または（２）に記載のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ、（５） （４）に記載のＤＮＡが挿入されたベク
ター、（６） （４）に記載のＤＮＡを発現可能に保持
する形質転換細胞、（７） （６）に記載の形質転換細
胞を培養する工程を含む、（１）または（２）に記載の
タンパク質の製造方法、（８） 配列番号：２または配
列番号：１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ若しくは
その一部に対するアンチセンスＤＮＡ、（９） （３）
に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、（１０）
（８）または（９）に記載のＤＮＡが挿入されたベクタ
ー、（１１） （８）または（９）に記載のＤＮＡを発
現可能に保持する形質転換植物細胞、（１２） （１
１）に記載の細胞を保持する植物体、（１３） メロン
植物体である、（１２）に記載の植物体、（１４） エ
チレンに対し低感受性である、請求項１２または１３に
記載の植物体、（１５） （１２）から（１４）のいず
れかに記載の植物体の繁殖媒体、（１６） （１）に記
載のタンパク質に結合する抗体、に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、メロン由来のエチレン
レセプタータンパク質に関する。本発明者らが単離した
メロン由来のエチレンレセプター「MEERS」のcDNAの塩
基配列を配列番号：２に、該cDNAがコードするタンパク
質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。配列番号：２
に記載のcDNAは2363bpの鎖長を有し、1914bpのオープン
リーディングフレームを含み、88bpの5'非翻訳領域、34
2bpの3'非翻訳領域、および19bpのpolyAを有する。該cD
NAのオープンリーディングフレームと、シロイヌナズナ
およびトマトのエチレン受容体遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームを比較すると、シロイヌナズナ「ERS」
及びトマト「NR」と約70%、シロイヌナズナ「ETR1」及
びトマト「eTAE1」 と約65%の塩基の一致を示す。ま
た、アミノ酸レベルにおいては、「ERS」と約75% 、他
の3つとは70〜71%の相同性を示す。

【００１４】エチレンレセプタータンパク質の構造の特
徴として、「ETR1」及び「eTAE1」においてはN末端の疎
水性領域、ヒスチジンキナーゼドメイン、レスポンスレ
ギュレータードメインを保持することが知られている。
一方、「ERS」 及び「NR」は疎水性領域とヒスチジンキ
ナーゼドメインを保持するが、レスポンスレギュレータ
ードメインを保持しない。本発明者等が単離した「MEER
S」cDNAクローンの推定アミノ酸配列（配列番号：１）
において、27〜44位が疎水性領域 I、49〜77位が 疎水
性領域 II、84〜116位が疎水性領域 III、328〜568位が
ヒスチジンキナーゼドメインの構造を示す。しかしなが
ら、レスポンスレギュレータードメインは見いだせな
い。「ETR1」の機能解析において、エチレン結合活性が
疎水性領域に存在することが示されているため（Schall
er, G. E., and Bleecker, A. B.(1995) Science 270:
1809-1811）、本発明者等の単離したメロンのエチレン
レセプタータンパク質「MEERS」も同様に疎水性領域が
エチレンとの結合において重要な役割を担っているもの
と考えられる。

【００１５】また、本発明者らは、「MEERS」と高い相
同性を有し、レスポンスレギュレータードメインを有す
るメロン由来のエチレンレセプター「MEETR1」を単離し
た。「MEETR1」cDNAの塩基配列を配列番号：１０に、推
定アミノ酸配列を配列番号：９に示す。「MEETR1」と
「MEERS」のORFを比較すると、核酸レベルで68.6%、ア
ミノ酸レベルで75.3%のホモロジーを示す。また、「MEE
TR1」は、「ETR1」の膜貫通ドメイン、ヒスチジンキナ
ーゼドメイン、レスポンスレギュレータードメインと、
それぞれアミノ酸レベルで96.7%、80.9%、68.3%のホモ
ロジーを示す。

【００１６】本発明のメロン由来のエチレンレセプター
タンパク質は、組み換えタンパク質として、また天然の
タンパク質として調製することが可能である。組み換え
タンパク質であれば、後述するように本発明のエチレン
レセプタータンパク質をコードするDNA（例えば、配列
番号：２もしくは配列番号：１０に記載のDNA）を適当
な発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該形質
転換体を培養することにより調製することが可能であ
る。一方、天然のタンパク質であれば、例えば、該組み
換えタンパク質に対する抗体を調製し、これを利用した
アフィニティークロマトグラフィーにより調製すること
が可能である。抗体はポリクローナル抗体であってもモ
ノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体は、例えば、文献「生物化学
実験法 15 免疫学実験入門 松橋直・成内秀雄・白井
美津子 著 学会出版センター、単クローン抗体実験マ
ニュアル 富山朔二・安東民衛 編 講談社」に従って
調製することが可能である。また、当業者であれば、公
知の方法を用いて天然型のエチレンレセプタータンパク
質（配列番号：１もしくは配列番号：９に記載のタンパ
ク質）中のアミノ酸を適宜置換など行って改変し、これ
と実質的に同等の機能を有する改変タンパク質を調製す
ることが可能である。このように天然型のエチレンレセ
プタータンパク質中のアミノ酸配列において1もしくは
数個のアミノ酸が置換、欠失、付加したアミノ酸配列を
有し、天然型のエチレンレセプタータンパク質と実質的
に同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパ
ク質に含まれる。このようなアミノ酸の改変を行う公知
の方法としては、例えば、Oligonucleotide directed D
ualAmber 法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gen
e 152: 271 275）や Kunkel法（Kunkel, T. A. (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488、Kunkel, T.A. e
t al. (1987) Methods in Enzymology 154: 367）など
が挙げられる。なお、本発明のエチレンレセプタータン
パク質とエチレンとの結合活性の検出は、例えば、Scha
llerとBleeckerの方法（Schaller, G. E., and Bleecke
r, A. B. (1995) Science 270: 1809-1811）に従って行
うことが可能である。

【００１７】本発明は、また、上記本発明のエチレンレ
セプタータンパク質をコードするDNAにも関する。本発
明のエチレンレセプタータンパク質をコードするDNA
は、cDNAでも、ゲノムDNAでもよく、また合成DNAであっ
てもよい。本発明のDNAは、本発明のエチレンレセプタ
ータンパク質を組み換えタンパク質として生産するため
に利用しうる。即ち、本発明のDNAを適当なベクターに
組み込んで宿主細胞に導入し、宿主細胞内で組み換えタ
ンパク質を発現させ、この形質転換体から組み換えタン
パク質を精製することにより、組み換えタンパク質を製
造することが可能である。組み換えタンパク質の製造に
用いられる宿主細胞としては、例えば、HB101株やJM109
株などの大腸菌、LRB520株などの酵母が挙げられる。ま
た、組み換えタンパク質の調製に用いる発現ベクターと
しては、上記宿主細胞に応じて適宜好適なベクターを選
択しうるが、例えば、大腸菌ではベクターpBluescript
II SK+やpGEX-2Tなど、酵母ではベクターpYcDE-2などが
用いられる。宿主細胞へのベクターの導入は、大腸菌で
は塩化カルシウム法（Mandel, M. and Higa, A. (1970)
J. Mol. Biol. 53: 159、Cohen, S. N., Chang, A. C.
Y. and Hsu, L. (1973)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6
9: 2110）やエレクトロポレーション法（Bottger, E.
C. (1988) Bio Techniques 6: 878-880）など、酵母で
は酢酸リチウム法やエレクトロポレーション法などの方
法を用いて行うことが可能である。なお、ベクターへの
DNAの挿入など一般的な遺伝子操作は、例えば、文献（S
ambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. eds.
(1989) Molecular Cloning: A laboratory manual. Sec
ond edition. Corld Spring Habor Laboratory,Corld S
pring Habor, New York.）に従って行うことができる。
得られた形質転換細胞は適当な条件下で培養して組み換
えタンパク質を発現させることができる。培養条件とし
ては、形質転換細胞により、温度、湿度、細胞密度、し
んとう速度、照射光量などが変動するが、好適な条件は
当業者であれば適宜選択することが可能である。例え
ば、形質転換細胞が酵母であれば、文献（Schaller, G.
E., Ladd, A. N., Lanahan, M. B., Spanbauer, J. M.
and Bleecker, A. B. (1995) J. Biol. Chem. 12526-1
2530.）に従って培養することが可能である。形質転換
体から の組み換えタンパク質の精製は、例えば、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーなど公知の方法を適
宜組み合わせて行うことが可能である。また、GST Gene
Fusion System (Pharmacia Biotech) 等のように標識
との融合タンパク質として発現させて精製する場合に
は、融合タンパク質実験系に推奨された方法に従って行
うことができる。

【００１８】また、本発明はエチレンに対する感受性を
低下させた植物体およびその繁殖媒体に関する。メロン
の追熟は、エチレンにより進行することが明らかとなっ
ており（J.M. Lyons, W.B. McGlasson, and H.L. Pratt
(1962) Plant Physiol. 37:31-36)、エチレンに対する
感受性を低下させることにより、メロンの日持ち性の改
良を行うことができる。今日、メロンなどの農作物は、
生産、流通、消費に至るまでの多くの過程で成熟、腐敗
による廃棄がなされており、その量は決して少ないとは
いえない。本発明による果実の日持ち性の改良により生
産された農作物の廃棄量を減少させることが可能であ
る。エチレンに対する感受性の低下したメロン植物体お
よびその繁殖媒体の作出の一つの態様は、アンチセンス
技術の利用である。即ち、本発明のエチレンレセプター
タンパク質をコードするDNAもしくはその一部に対する
アンチセンスDNAをメロン細胞内に導入し、該細胞から
植物体を再生する。再生した植物体から繁殖媒体、例え
ば、果実や種子を収穫する。これにより作出したメロン
植物体およびその繁殖媒体内では、本発明のエチレンレ
セプタータンパク質をコードするDNAの転写産物に対す
るアンチセンスRNAが発現しているため、エチレンレセ
プタータンパク質の発現が抑制されており、これにより
エチレンに対する感受性が低下する。

【００１９】アンチセンスDNAを導入したトランスジェ
ニックメロン植物体は、例えば、アグロバクテリウム法
により作出できる（江面浩、人見綾子、窪田満（1996)
アグロバクテリウムによるメロン形質転換効率に影響す
る諸要因. 育雑46別1:263)。具体的な方法の一例を示せ
ば、まずアンチセンスDNAを植物発現用ベクターであるpB
I121のGUS遺伝子の位置に組み込み、さらにこのアンチセ
ンスDNAを含むベクターをアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入す
る。メロン種子より胚を取り出し、1/2MSまたはMS培地
上に無菌播種し、2日間培養する。前培養した胚を分割
し、この断片に1〜2日間振とう培養したアグロバクテリ
ウムを接種する。この断片を、ベンジルアデニン(ベンジ
ルアミノプリン)0.5〜1.0mg/lを添加したMS培地上で2日
間共存培養する（この間にメロン細胞にベクターが導入
され）。共存培養したメロン組織断片は、抗生物質とし
てカナマイシン200mg/l、クラフォラン500mg/l、植物生長
調節物質として ベンジルアデニン(ベンジルアミノプリ
ン)0.5〜1.0mg/lを添加したMS培地上で培養する。以降、
メロン組織片を2週間毎に同様の培地に継代する。この間
にアンチセンスDNAが導入された細胞を選抜し、さらに
メロン植物体を不定芽経由で再生する。なお、メロンの
植物体再生法としては、上記の不定芽（Moreno,V.,Garc
ia-Sogo,M.,Granell,I.,Gracia-Sogo,B., and Roig,L.
A.(1985) Plant Cell Tiss. Org. Cult.5:139-146 ）経
由の方法の他に不定胚（Young,H.,Skirvin,R.M., and J
uvick,J.A. (1983) Cucurbit Genet. Coop. 6:56-57）
経由、苗条原基（永井輝行、野村幸雄、大澤勝次（198
9）園学雑別1：208ー209）経由の方法が報告されてお
り、これらを利用してのトランスジェニックメロン植物
体の作出が可能である（プロトプラスト培養による植物
体再生は、不定芽（山中寿子、天笠一美、吉田裕（199
0）植物組織培養 7：103ー107）または不定胚経由（野
村幸雄、古田秀雄、前田桝夫、真柄紘一（1993）育雑別
1：15）であり、前記の方法に含まれる）。また、メロ
ンのみならず、エチレンによって成熟が進行する他の農
作物の日持ち性の改良にメロンと同様の方法で利用する
ことも考えられる。他の農作物としては、例えば、バナ
ナ、トマト、アボガド、ナシ、リンゴ、モモ、キウイフ
ルーツ、ビワが挙げられるが、これらに制限されない。
これらの農作物に関してもアグロバクテリウム法により
アンチセンスDNAが導入さ れたトランスジェニック植物
を作出することが可能である。

【００２０】また、エチレンに対する感受性を低下させ
た植物体およびその繁殖媒体の作出の他の様態は、改変
したエチレンレセプター遺伝子を導入した形質転換植物
の作出である。シロイヌナズナの自然突然変異植物から
得られたエチレンレセプター遺伝子etr1-1の塩基配列
は、これに対応する非転換植物のレセプターETR1の疎水
性領域における65番システインの、チロシンへの置換を
示していた（Chang, C.,Kwok, S. F., Bleecker, A. B.
and Meyerowitz, E. M. (1993) Science 262,539 54
4）。Changらはまたこの研究において、このetr1-1遺伝
子をシロイヌナズナ非転換植物へ導入した結果、エチレ
ン不感受性の形質転換植物が得られたことを報告してい
る。一方で、ETR1遺伝子を導入して発現させた酵母はエ
チレンとの結合を示したが、etr1-1遺伝子を導入して発
現させた酵母はエチレンとの結合活性をもたなかったこ
とが示されている（Schaller G. E. and Bleecker, A.
B. (1993) Science 270: 1809 1811）。SchallerとBlee
ckerはまた、このetr1-1遺伝子を含む変異レセプター遺
伝子を用いた研究の結果から、レセプターの疎水性領域
がエチレンと結合する部分を含むという説を提案してい
る。即ち、エチレンとの結合に関与する疎水性領域のア
ミノ酸を置換してエチレン結合活性を欠失したレセプタ
ー遺伝子の導入により、エチレン不感受性の形質転換植
物が得られることが考えられる。疎水性領域に変異をも
つレセプターの遺伝子の導入により、エチレン不感受性
の形質転換植物を得たその他の例は、シロイヌナズナの
エチレンレセプターの一つであるERS（Hua, J., Chang,
C., Sun, Q. and Meyerowitz, E. M. (1995) Science
269: 1712-1714）や、トマトのエチレンレセプターNR
（Wilkinson, J. K., Lanahan, M. B., Yen, H., Gioca
nnori, J. J. and Klee, H.J. (1995) Science 270:180
7-1809）の研究において報告されている。ところで、ア
ラビドプシスのERS（Hua, J., Chang, C., Sun, Q. and
Meyerowitz, E. M.(1995) Science 269: 1712-1714）
の研究においては、ETR1に対応するetr1-1や、NRに対応
するNrのような自然突然変異遺伝子は、存在しないため
に利用できなかった。そのかわりにHuaらは、完全長のc
DNAを基にして、疎水性領域にアミノ酸置換をもつよう
な変異遺伝子ers-1を公知の分子遺伝学的技術で構築
し、非転換植物へ導入してエチレン不感受性の形質転換
植物の作出に成功している。

【００２１】エチレンレセプターを欠失するメロン品種
はこれまでに報告されていないため、これまでのところ
ERSと同様に、etr1-1やNrのような自然突然変異遺伝子
を利用できない。しかしながら、本発明のエチレンレセ
プター遺伝子を基に、例えば、Huaらによるers-1の構築
の方法（Hua, J., Chang, C., Sun, Q. and Meyerowit
z, E. M. (1995) Science 269:1712-1714）に従って、
疎水性領域のアミノ酸が置換され発現するタンパク質が
エチレンとの結合活性を欠失するような変異遺伝子を構
築することが可能である。さらに、この変異遺伝子をメ
ロンへ導入することにより、エチレン感受性が低下した
形質転換メロンを作出することが可能である。なお、ア
ミノ酸への変異の導入は、例えば、上記のOligonucleot
ide directed Dual Amber法（Hashimoto-Gotoh, T. et
al. (1995) Gene 152: 271 275）やKunkel法（Kunkel,
T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488、K
unkel, T. A. et al. (1987) Methods in Enzymology 1
54: 367）により行うことが可能である。

【００２２】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。

【００２３】

【実施例】[実施例１] メロンエチレンレセプター遺伝
子（MEERS）の単離 （１）植物材料の育成 メロン実生はエチレンに対する三重反応を示すことか
ら、本発明者等はメロンの実生がエチレンレセプター遺
伝子を発現していると考え、RT-PCRの材料として選択し
た。メロン実生は、MS寒天培地に無菌播種し、25℃暗所
で育成した。また、cDNAライブラリーの作製には、交配
後55日目に収穫し、さらに7日間室温に置いたメロン果
実を用いた。収穫直後の果実は追熟が不完全でエチレン
発生量が非常に少ないが、収穫後の日数の経過に伴って
追熟が進み、エチレン発生量も増大する。果実のエチレ
ン発生量が最大に達するのは収穫後2週間目である。収
穫後1週間目の果実では、エチレン発生量が増加してい
る途中で、最大値の約半分の値を示す。そこでこの時期
には、大量に発生するエチレンを受容するためにエチレ
ンレセプター遺伝子の発現量も増大していると予想し、
この時期の果実をcDNAライブラリーの作製に用いた。果
実収穫に用いたメロンは温室で育成した。

【００２４】（２） 全RNAの抽出及びpoly(A)+RNAの単
離 Ozekiら (Ozeki,Y.,Matsui,K.,Sakuta,M.,Matsuoka,M.,
Ohashi,Y.,Kano-Murakami,Y.,Yamamoto,N. and Tanaka,
Y.(1990) Physiol.Plant.80:379-387) の用いたSDS-フ
ェノール法に従って全RNAを抽出した。poly(A)+RNA、mR
NA Purification Kit (Pharmacia Biotech社) を用いて
精製した。単離したpoly(A)+RNAは、エタ ノール沈殿ま
たは滅菌水に溶解した状態で、-80℃に保存した。

【００２５】（３） RT-PCR法によるメロンエチレンレ
セプターcDNA断片（pKY1.3）のクローニング シロイヌナズナとトマトのエチレンレセプター遺伝子の
情報をもとに、PCRプライマー168F（5'-CCGGAATTCGCAGT
TTGG(TA)GC(TC)TTTAT-3'／配列番号：３）と1205R（5'-
CGCGGATCCCATCTTC(AGCT)A(GA)(TC)CTAGAAA-3'／配列番
号：４）を作製した。168Fは疎水性領域 II の内部、ま
た1205R はヒスチジンキナーゼドメイン内部にある、塩
基レベルで非常に高い類似性を示す領域（18塩基中14塩
基が既知のエチレンレセプター遺伝子全てで一致する領
域）に対応しており、植物一般について用いることが出
来ると考えられる。5'側には、サブクローニングがしや
すいように、それぞれ EcoR I(GAATTC)とBamH I(GGATC
C)の認識配列を付加した。これらのプライマーを用い、
播種後10日目のメロン実生から抽出したpoly(A)+RNA0.8
μgを鋳型として、RT-PCRを行った。逆転写反応は、M-M
LV Reverse Transcriptase RNase H Minus (TOYOBO社)
を用い、37℃で1時間行った。次に、AmpliTaq (Perkin
Elmar社)、GeneAmp PCR systems 9600 (Perkin Elmar
社)を用いて、94℃で2分間熱変性後、94℃で30秒、50℃
で30秒、72℃で2分の条件でPCRを40サイクル行い、4℃
で保存した。アガロースゲル電気泳動後、増幅された約
1kbのcDNA断片をGeneClean II Kit (BIO 101)を用いて
精製し、もう一度上記の条件でPCRを行った 。再度、増
幅された約1kbのcDNA断片(pKY1.3) をGene Clean II Ki
tで回収し、TA Cloning Kit(Invitrogen社) を用いてク
ローニングした。次にクローニングしたpKY1.3の塩基配
列を決定した。ABIPRISM Dye Primer Cycle Sequencing
Ready Reaction Kits with AmpliTaq DNA polymerase,
FS (Perkin Elmer社) を用いてDNAを蛍光ラベルし、37
3A DNA sequencer(Perkin Elmar社) を使って塩基配列
の決定を行った。その結果、pKY1.3はシロイヌナズナET
R1と塩基レベルで72%のホモロジーをもっていた。そこ
で、pKY1.3はメロンETR1ホモログのcDNA断片であると判
断し、次にこのcDNA断片をプローブとしてcDNAライブラ
リーのスクリーニングを行った。

【００２６】（４） メロンエチレンレセプターcDNA
（MEERS）のクローニング RT-PCR法によりクローニングされたpKY1.3をプローブと
して、追熟中のメロン果実から作製したcDNAライブラリ
ー(2.9×10⁵pfu) のスクリーニングを行った。追熟中の
メロン果実では、実施例１で記したように、増大しつつ
あるエチレンを受容するために、エチレンレセプター遺
伝子の発現量が増加していることが予想された。そこで
この時期の果実をcDNAライブラリーの作製に用いた。cD
NA合成は、メロン果実poly(A)+RNA 2μgを鋳型とし、cD
NA synthesis module(Amersham社)を用いて行った。た
だし1st strand cDNA合成には、キット中の逆転写酵素
(AMV)の代わりに、M-MLV Reverse Transcriptase RNase
H Minus (TOYOBO社) を用い、37℃で1時間反応させ
た。合成したcDNAと660ngのEcoRI/NotIAdaptor (Pharma
cia Biotech社) を混合し、T4 DNA Ligase (Nippon Gen
e社) を用いて16℃で1晩ライゲーションし、cDNA断片の
両端にアダプターを付加した。その後、SizeSep400 Spu
n Columns (Pharmacia Biotech社)で、数百塩基対以下
の短いDNA断片と未反応のアダプターを除いた。分画後
のcDNAはT4 Polynucleotide Kinase (Nippon Gene社)
でリン酸化し、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行
い、最後に10μlの滅菌水に溶解した。アームライゲー
ションにはLambdagt10/EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit
(Stratagene) を用いた。1μgのLambdagt10 armsと5μ
lのcDNA溶液を混合し、T4 DNA Ligase (Nippon Gene社)
を用いて16℃で1晩ライゲーション反応を行った。エタ
ノール沈殿により、DNAを回収し、真空乾燥後、4.5μl
のTEに穏やかに溶解した。次にGigapackII Gold Packag
ing Extract (Stratagene社) を用いて、in vitro pack
agingを行った。作製したcDNAライブラリー(2.9×10⁵ p
fu)を1次スクリーニングした結果、12個のポジティブプ
ラークが得られ、2次スクリーニングにより5種類のシン
グルプラークが得られた。これら5種類のプラークから
ダイレクトPCRによりインサートDNAを増幅して、TAクロ
ーニング(TA Cloning Kit; Invitrogen社)を行い、部分
塩基配列を決定した。その結果、このうち4つが同じcDN
A由来でシロイヌナズナETR1やERSと高いホモロジーを示
した。また、これらの塩基配列はpKY1.3と一致した。一
番長かったクローンNo.6のインサートDNAをEcoR I及びN
ot Iで切り出して、pBluescript II SK+ベクター (Stra
tagene社) にクローニングし、全塩基配列を決定した。
決定した塩基配列を配列番号：２に、推定アミノ酸配列
を配列番号：１に示す。

【００２７】その結果、cDNAクローンNo.6は2363bpの長
さで、1914bpのオープンリーディングフレームを完全に
含み、88bpの5'非翻訳領域と342bpの3'非翻訳領域、19b
pのpolyAを含んでいた。このcDNAのオープンリーディン
グフレームと、シロイヌナズナとトマトのエチレン受容
体遺伝子のオープンリーディングフレームを比較したと
ころ、シロイヌナズナERS及びトマトNRと約70%、シロイ
ヌナズナETR1及びトマトeTAE1と約65%の塩基が一致して
おり、このcDNAクローンがメロンのエチレン受容体遺伝
子であると推定された。また、アミノ酸レベルでは、ER
Sと約75%、他の3つとは70〜71%の相同性がみられた。エ
チレンレセプタータンパク質の構造の特徴として、ETR1
及びeTAE1はN末端の疎水性領域、ヒスチジンキナーゼド
メイン、レスポンスレギュレータードメインを持つ。一
方、ERS及びNRは疎水性領域とヒスチジンキナーゼドメ
インを持つが、レスポンスレギュレータードメインを持
たない。単離したcDNAクローンの推定アミノ酸配列には
レスポンスレギュレータードメインが見いだせなかった
ことから、ERSタイプであると考えられたので、このcDN
Aクローンを「MEERS」と名付けた。「MEERS」はメロン
において初めて単離されたエチレン受容体遺伝子であ
る。

【００２８】［実施例２］ 「MEERS」に対するアンチ
センス遺伝子（169-587AS）の調製、および該遺伝子の
導入によるエチレン低感受性植物の作出 「MEERS」のcDNA断片pKY1.3のDNA配列をもとに、PCRプ
ライマー169XF（5'-CGAGCTCGCAGTTTGGTGCCTTTATTGT-3'
／配列番号：５）、587XR（5'-GCTCTAGAGCGCATGCGAAAGC
TGTAGACT-3'／配列番号：６）を作製した。5'側には、
サブクローニングしやすいように、それぞれSacI（GAGC
TC）とXbaI（TCTAGA）の認識配列を付加した。これらの
プライマーを用い、pKY1.3 DNAを鋳型として、PCRを行
った。PCRは、AmpliTaq（Perkin Elmer社）、GeneAmp P
CR system 9600（Perkin Elmar社）を用いて、94℃で２
分間熱変性後、94℃で１分、55℃で１分、72℃で１分の
条件でPCRを30サイクル行い、72℃で２分間加熱後、４
℃で保存した。この結果、増幅された約0.4kbのDNA断片
（169-587AS）をTA Cloning Kit（Invitrogen社）を用
いてクローニングした。次にクローニングした169 587A
Sの塩基配列を決定した。ABIPRISM Dye Primer Cycle S
equencing Ready Reaction Kits with AmpliTaq DNA po
lymerase, FS (Perkin Elmer社)を用いてDNAを蛍光ラベ
ルし、373A DNA sequencer (Perkin Elmer社) を使って
塩基配列の決定を行った。その結果、169-587ASは塩基
レベルで、シロイヌナズナETR1と74.4％、シロイヌナズ
ナERSと75.5％のホモロジーを有していた。XbaIおよびS
acIで切断した169-597ASは、XbaIとSacIで切断してGUS
遺伝子を切り出したpBI121(Clontech社)にクローニング
した。クローニングの結果得られたプラスミド（pBI169
587AS）は、アグロバクテリウム ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58へ形質転換し、
さらにバキューム インフィルトレーション法（N. Bech
told, J. Ellis, andG. Pelletier. C.R. Acad. Sci. P
aris, Life Sciences 316, 1194 1199, 1993）によりシ
ロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）コロンビアへ形
質転換した。形質転換したシロイヌナズナT1世代種子
は、70％エタノールで５分、１％アンチホルミンで15分
表面殺菌した後、カナマイシン50mg/Lを含むGM培地へ播
種した。播種種子は４℃に１週間置いた後、20℃に移し
て発芽させた（光照射 16 時間／日）。カナマイシン耐
性を示すT1世代の芽生えの184個体を人工栽培土へ移植
して栽培し、そのT2世代種子を採集した。

【００２９】形質転換植物のT2系統には、挿入遺伝子を
持たない、挿入遺伝子をヘテロで保持する、挿入遺伝子
をホモで保持する３種類の遺伝子型が含まれる。そのた
め、エチレンレセプターアンチセンス遺伝子の効果があ
るとすれば、T2植物のなかにエチレン低感受性を示す個
体が出現することが期待された。そこで、採集したT2世
代種子の157系統を用いて、おのおのの形質転換系統の
エチレン感受性を調査した。T2世代種子と、原系統であ
るコロンビア非形質転換体種子、エチレン非感受性突然
変異体etr1-1種子を、各系統から25粒種子／プレートと
なるよう、1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシリッ
クアシッド（エチレンの前駆体であり、植物細胞内の酵
素の作用によりエチレンが生じる。以下、「ACC」と称
する）無添加培地とACC添加培地に播種し、４℃に６日
間置いた。この後各プレートを20℃、６日間暗黒下に移
し、種子を発芽させた。発芽した芽生えの胚軸の長さを
ACC無添加培地とACC添加培地で比較した。ACC無添加培
地における芽生えの代表的な胚軸の長さを１として、AC
C添加培地で生育した芽生えの胚軸の相対的な長さを各
個体について調査した。

【００３０】ACC添加培地における非形質転換体のすべ
ての芽生えの胚軸の長さは、ACC無添加培地における芽
生えの1/2以下となった。また、ACC添加培地におけるエ
チレン非感受性変異体の96％の芽生えの胚軸の長さは、
ACC無添加培地における芽生えの長さの1/2よりも長くな
った。そこで、ACC無添加培地における芽生えの胚軸の
長さの1/2を基準として、より長い胚軸を持つ芽生えを
エチレン低感受性、より短い胚軸を持つ芽生えをエチレ
ン感受性個体とみなし、T2世代の157系統の芽生えをス
クリーニングした。

【００３１】供試した157系統のT2植物の芽生えのう
ち，93系統のすべての芽生えがエチレン感受性を示し
た。一方で64系統の芽生えには少なくとも１個体のエチ
レン低感受性個体が出現した（図１）。この64個の各系
統におけるエチレン低感受性個体の出現頻度は、4％か
ら88％と様々であった。また、そのうちの１系統（系統
20）にはエチレン感受性が著しく低下した個体が含まれ
ていた。使用したT2植物の芽生えにおいて、エチレン感
受性が低下したと思われる個体が、いくつかの系統で出
現した。このことは、アンチセンス遺伝子を用いてエチ
レン低感受性形質転換体が作出できることを示唆する。

【００３２】[実施例３] メロンエチレンレセプター遺
伝子（MEETR1）の単離 （１） 植物材料の育成 メロンはガラス温室で育成し、cDNAライブラリーの作製
に用いた果実は交配後64日目に収穫した。

【００３３】（２） 全RNAの抽出及びpoly(A)+RNAの単
離 Ozekiら（Ozeki, Y. et al., (1990) Physiol. Plant.
80: 379-387）の用いたSDS-フェノール法に従って全RNA
を抽出した。poly(A)+RNAは、mRNA Purification Kit
(Pharmacia Biotech)を用いて精製した。単離したpoly
(A)+RNAは、エタノール沈殿または滅菌水に溶解した状
態で、-80℃に保存した。

【００３４】（３） プローブの調製 シロイヌナズナエチレンレセプター遺伝子ETR1のレスポ
ンスレギュレーター領域を増幅するために、PCRプライ
マーE1844F（5'-TGGATGAGAACGGGGTAAGTAGAAT-3'／配列
番号：７）とE2130R（5'-TAGTGATACGGGTTTGAGCAACACA-
3'／配列番号：８）を設計した。進士秀明博士（通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所）から譲与され
たシロイヌナズナETR1を鋳型として、これらのプライマ
ーでPCRを行った。PCRは、AmpliTaq (Perkin Elmar
社)、GeneAmp PCR systems 9600 (Perkin Elmar社)を用
い、95℃で9分、「94℃で30秒、60℃で1分」を40サイク
ル、72℃で15分、4℃の条件で行った。アガロースゲル
電気泳動後、増幅された約300bpのcDNA断片（RR）をGen
e Clean II Kit (BIO 101)を用いて精製し、メロン果実
のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプロー
ブの鋳型とした。また、当研究室で単離したメロンMEER
Sの疎水性領域（XE0.4）を制限酵素EcoR IとXhoIで切り
出して、上記と同様にゲル回収して精製し、プローブの
鋳型とした。プローブの³²PラベルはMegaprime DNA lab
ellingsystem (Amersham社) を用いて行った。

【００３５】（４） メロンエチレンレセプターcDNA
（MEETR1）のクローニング RRとXE0.4をプローブとして、追熟中のメロン果実から
作製したcDNAライブラリー (2.9×10⁵ pfu) のスクリー
ニングを行った。cDNA合成は、メロン果実poly(A)+RNA
2μgを鋳型とし、cDNA synthesis module (Amersham社)
を用いて行った。ただし、1st strand cDNA合成には、
キット中の逆転写酵素 (AMV) の代わりに、M-MLV Rever
se Transcriptase RNase H Minus(TOYOBO社)を用い、37
℃で1時間反応させた。合成したcDNAと660ngのEcoRI/No
tI Adaptor(Pharmacia Biotech社)を混合し、T4 DNA Li
gase (Nippon Gene社) を用いて16℃で1晩ライゲーショ
ンし、cDNA断片の両端にアダプターを付加した。その
後、SizeSep 400 Spun Columns(Pharmacia Biotech社)
で、数百塩基対以下の短いDNA断片と未反応のアダプタ
ーを除いた。分画後のcDNAはT4 Polynucleotide Kinase
(Nippon Gene社)でリン酸化し、フェノール抽出及びエ
タノール沈殿を行い、最後に10μlの滅菌水に溶解し
た。アームライゲーションにはLambda gt10/EcoRI/CIAP
-Treated VectorKit(Stratagene社)を用いた。1μgのLa
mbda gt10 armsと5μlのcDNA溶液を混合し、T4 DNA Lig
ase(Nippon Gene社)を用いて16℃で1晩ライゲーション
反応を行った。エタノール沈殿により、DNAを回収し、
真空乾燥後、4.5μlのTEに穏やかに溶解した。次に、Gi
gapack II Gold Packaging Extract (Stratagene社)を
用いて、in vitro packagingを行った。

【００３６】一次スクリーニングでは、83個のプラーク
でRRとXE0.4のどちらのプローブでもシグナルが得られ
た。このうち16系統を用いてRRプローブで二次スクリー
ニングを行い、13系統でポジティブプラークが得られ
た。このうち2クローンをpBS II SK+ (Stratagene社)
にサブクローニングし、物理的地図の作製、塩基配列の
決定・比較などを行った。塩基配列の決定は、ABI PRIS
M Dye Primer Cycle Sequencing Ready ReactionKits w
ith AmpliTaq DNA polymerase, FS(Perkin Elmer社)を
用いてDNAを蛍光ラベルし、373A DNA sequencer(Perkin
Elmar社)を用いて行った。その結果、サブクローニン
グした2クローンはどちらも同一のcDNA由来であり、ETR
1に類似していた。そこでORFを完全に含むcDNAクローン
を「MEETR1」と名付けた。「MEETR1」cDNAの塩基配列を
配列番号：１０に、推定アミノ酸配列を配列番号：９に
示す。「MEETR1」は、ETR1の膜貫通領域、ヒスチジンキ
ナーゼ領域、レスポンスレギュレーター領域と、それぞ
れアミノ酸レベルで96.7%、80.9%、68.3%のホモロジー
を示した。また「MEETR1」と「MEERS」のORFを比較した
ところ、核酸レベルで68.6%、アミノ酸レベルで75.3%の
ホモロジーを示した。

【００３７】

【発明の効果】本発明によりメロンのエチレンレセプタ
ー、およびエチレンレセプターの機能が抑制されたエチ
レン低感受性植物が提供された。これにより効果的な農
作物の日持ち性の改良を行うことが可能となった。農作
物の日持ち性の改良は、生産、流通、消費に至るまでの
多くの過程で生産された農作物の廃棄量の減少などに有
効である。

【００３８】

【配列表】

（１）出願人氏名又は名称：茨城県 （２）発明の名称：エチレン低感受性植物 （３）整理番号：ＩＮＳ−９０１ＤＰ１ （４）出願番号： （５）出願日： （６）優先権の基となった出願をした国名及び出願の番
号：日本国 平成９年特許願第２５１２２２号 （７）優先日： １９９７年９月１７日 （８）配列の数：１０ 配列番号 : 1 配列の長さ : 637 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Met Glu Ser Cys Asp Cys Ile 1 5 Asp Ala Gln Trp Pro Pro Asp Glu Leu Leu Val Lys Tyr Gln Tyr Ile 10 15 20 Ser Asp Val Leu Ile Ala Leu Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu 25 30 35 40 Ile Tyr Phe Val Gln Lys Ser Ala Phe Phe Pro Tyr Arg Trp Val Leu 45 50 55 Met Gln Phe Gly Ala Phe Ile Val Leu Cys Gly Ala Thr His Phe Ile 60 65 70 Asn Leu Trp Thr Phe Ser Met His Ser Lys Ala Val Ala Val Val Met 75 80 85 Thr Val Ala Lys Val Ala Cys Ala Ile Val Ser Cys Ala Thr Ala Leu 90 95 100 Met Leu Val His Ile Ile Pro Asp Leu Leu Ser Val Lys Thr Arg Glu 105 110 115 120 Leu Ile Leu Lys Asn Lys Ala Glu Gln Leu Asp Arg Glu Met Gly Leu 125 130 135 Ile Leu Thr Gln Glu Glu Thr Gly Arg His Val Arg Met Leu Thr His 140 145 150 Glu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Arg Asp Thr Ile Leu Lys Thr Thr Leu 155 160 165 Val Glu Leu Gly Lys Thr Leu Gly Leu Glu Glu Cys Ala Leu Trp Met 170 175 180 Pro Ser Arg Asn Gly Leu Ser Leu Gln Leu Ser His Ala Leu Asn Tyr 185 190 195 200 Gln Ile Pro Val Gly Thr Asn Ile Pro Ile Asn Leu Pro Val Val Asn 205 210 215 Asp Val Phe Asn Ser Asn Arg Ala Ile Cys Val Pro Tyr Thr Cys Gln 220 225 230 Leu Ala Arg Val Arg Thr Pro Val Gly Gly Arg Tyr Leu Pro Pro Glu 235 240 245 Val Val Ala Val Arg Val Pro Leu Leu Asn Leu Ser Asn Phe Gln Met 250 255 260 Asn Asn Trp Pro Asp Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Ala Ile Met Val Leu 265 270 275 280 Ile Leu Pro Thr Asp Ser Ala Arg Lys Trp Arg Asp His Glu Leu Glu 285 290 295 Leu Val Asp Val Val Ala Asp Gln Val Ala Val Ala Leu Ser His Ala 300 305 310 Ala Ile Leu Glu Glu Ser Met Arg Ala Arg Asp Gln Leu Val Asp Gln 315 320 325 Asn Val Ala Leu Asp Leu Ala Arg Arg Glu Ala Glu Thr Ala Ile His 330 335 340 Ala Arg Asn Asp Phe Leu Ala Val Met Asn His Glu Met Arg Thr Pro 345 350 355 360 Met His Ala Ile Ile Ala Leu Ser Ser Leu Leu Leu Glu Thr Glu Leu 365 370 375 Thr Pro Glu Gln Arg Val Met Ile Glu Thr Ile Leu Lys Ser Ser Asn 380 385 390 Leu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Asp Val Leu Asp Leu Ser Arg Leu Glu 395 400 405 Asp Gly Ser Leu Val Leu Asp Met Gly Ser Phe Asn Leu His Ala Ile 410 415 420 Phe Lys Glu Ala Leu Asp Leu Ile Lys Pro Ile Ala Ser Val Lys Lys 425 430 435 440 Leu Ser Met Ala Leu Ile Leu Ala Ser Asp Leu Pro Ile Cys Ala Val 445 450 455 Gly Asp Glu Lys Arg Leu Met Gln Ile Ile Leu Asn Ile Val Gly Asn 460 465 470 Gly Val Lys Phe Thr Lys Glu Gly His Val Ser Ile Ile Ala Ser Ile 475 480 485 Ala Lys Leu Asp Ser Leu Arg Asp Trp Arg Pro Thr Glu Phe Tyr Pro 490 495 500 Met Gln Ser Asp Gly Gln Phe Tyr Leu Arg Val Gln Val Lys Asp Ser 505 510 515 520 Gly Cys Gly Ile Pro Pro Gln Asp Ile Pro His Leu Phe Thr Arg Phe 525 530 535 Thr Gln Leu Gln Thr Arg Ser Asn Lys Thr Asn Ser Gly Val Gly Leu 540 545 550 Gly Leu Ala Leu Cys Lys Arg Phe Ile Asn Leu Met Gly Gly His Ile 555 560 565 Trp Ile Glu Ser Glu Gly Pro Asp Lys Gly Thr Thr Ala Met Phe Ile 570 575 580 Val Lys Leu Gly Ile Cys Asn Ala Asn Pro Asn Asp Leu Ser Val Lys 585 590 595 600 Gln Val Ala Pro Ile Val 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ACT ACA GTG GGA CCA AGA AAC TCT GGT GGC AGT GGT 1808 Lys Phe Ala Gln Thr Thr Val Gly Pro Arg Asn Ser Gly Gly Ser Gly 535 540 545 CTT GGG CTT GCA ATT TGT AAA AGG TTT GTG AAT CTT ATG GAA GGA CAT 1856 Leu Gly Leu Ala Ile Cys Lys Arg Phe Val Asn Leu Met Glu Gly His 550 555 560 ATA TGG CTT GAA AGT GAA GGT CTT GGA AAG GGA TGC ACG GCC ACT TTT 1904 Ile Trp Leu Glu Ser Glu Gly Leu Gly Lys Gly Cys Thr Ala Thr Phe 565 570 575 580 ATT GTA AAA CTT GGA ATT GCC GAT CAA TCA AAT GAA TCA AAG CTT CCC 1952 Ile Val Lys Leu Gly Ile Ala Asp Gln Ser Asn Glu Ser Lys Leu Pro 585 590 595 TAT ACA TCA AAA ATT CAT GAA AAC AGC ATC CAT ACA AGT TTT CCT GGA 2000 Tyr Thr Ser Lys Ile His Glu Asn Ser Ile His Thr Ser Phe Pro Gly 600 605 610 CTC AAA GTC CTT GTT ATG GAC GAT AAT GGA GTT AGT CGG TCA GTG ACG 2048 Leu Lys Val Leu Val Met Asp Asp Asn Gly Val Ser Arg Ser Val Thr 615 620 625 AAA GGA CTT CTT GTA CAT CTT GGA TGC GAA GTA ACA ACA GCA GGC TCA 2096 Lys Gly Leu Leu Val His Leu Gly Cys Glu Val Thr Thr Ala Gly Ser 630 635 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CCAATTTCCA GGTTTCTAAC 2504 AAACCTGGTT TACCACTTTG TACTAGATAC CCAGATAGGA ATAGGAGAAA GAGGTGTGTA 2564 AAAACGTTTT GATGAGTTCC TTGAAACAAA GTTAGATGTC ATTCTGTTAC TTTGCTAATT 2624 TATTTTTTCT TTTTAATAGA GAATGTTAAA TATTTTCTTC AAAAAAAAAA AAAAAGTCGT 2684 GACTGGGAAA AC 2696

【図面の簡単な説明】

【図１】「MEERS」アンチセンス遺伝子を導入したシロ
イヌナズナ形質転換系統（Ｔ₂）におけるエチレン低感
受性個体の出現頻度を示す図である。ACC無添加培地で
発芽した芽生えの胚軸長を対照として、ACC添加培地で
発芽した芽生えの胚軸長が対照の3/4より大きいものを
黒で、1/2から3/4のものをドットで、1/2未満のものを
白で示した。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/48 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 東 克己 茨城県西茨城郡岩間町安居3165番地の１ 茨城県農業総合センター生物工学研究所内 (72)発明者 窪田 満 茨城県西茨城郡岩間町安居3165番地の１ 茨城県農業総合センター生物工学研究所内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１または配列番号：９に記載
   のアミノ酸配列からなるタンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号：１または配列番号：９に記
   載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
   が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、
   エチレンとの結合活性を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 配列番号：１または配列番号：９に記載
   のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が
   置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、エ
   チレンとの結合活性を有しないタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載のタンパク質を
   コードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡが挿入されたベ
   クター。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡを発現可能に保
   持する形質転換細胞。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の形質転換細胞を培養す
   る工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の
   製造方法。
8. 【請求項８】 配列番号：２または配列番号：１０に記
   載の塩基配列からなるＤＮＡ若しくはその一部に対する
   アンチセンスＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項３に記載のタンパク質をコードす
   るＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項８または９に記載のＤＮＡが挿
    入されたベクター。
11. 【請求項１１】 請求項８または９に記載のＤＮＡを発
    現可能に保持する形質転換植物細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の細胞を保持する植
    物体。
13. 【請求項１３】 メロン植物体である、請求項１２に記
    載の植物体。
14. 【請求項１４】 エチレンに対し低感受性である、請求
    項１２または１３に記載の植物体。
15. 【請求項１５】 請求項１２から１４のいずれかに記載
    の植物体の繁殖媒体。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のタンパク質に結合す
    る抗体。