WO2002092558A1 - Derives lipidiques de polythiouree - Google Patents

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WO2002092558A1
WO2002092558A1 PCT/FR2002/001626 FR0201626W WO02092558A1 WO 2002092558 A1 WO2002092558 A1 WO 2002092558A1 FR 0201626 W FR0201626 W FR 0201626W WO 02092558 A1 WO02092558 A1 WO 02092558A1
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Jean Herscovici
Daniel Scherman
Isabelle Tranchant
Nathalie Mignet
Christian Girard
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Gencell S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to new compounds which allow the transfer of nucleic acids into cells. More specifically, these new compounds are lipid derivatives of polythiourea. They are useful for the in vitro, ex vivo or in vivo transfection of nucleic acids in different cell types.
  • nucleic acids into cells may be the transfer of nucleic acids into cells in vitro, for example for the production of recombinant proteins, or in the laboratory, for the study of the regulation of gene expression, the cloning of genes, or any other manipulation involving DNA. It can also involve the transfer of nucleic acids into cells in vivo, for example for the creation of transgenic animals, the production of vaccines, labeling studies or also therapeutic approaches. It may also involve the transfer of nucleic acids into cells ex vivo, in approaches to bone marrow transplants, immunotherapy or other methods involving the transfer of genes into cells taken from an organism, in particular view of their subsequent re-administration.
  • lipids comprising a quaternary ammonium group for example DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE
  • lipopolyamines such as for example DOGS, DC-Chol or else lipopolyamines disclosed in patent application WO 97/18185
  • lipids combining both a quaternary ammonium group and a polyamine such as DOSPA
  • lipids comprising various other cationic entities in particular amidinium groups (for example 1ADPDE, ADODE or the lipids of patent application WO 97/31935).
  • the object of the present invention is precisely to propose new transfecting compounds which are original in their polythiourea function and which are capable of being used effectively for the transfection in vitro, ex vivo or in vivo of nucleic acids.
  • These new compounds are particularly interesting because: - the absence of positive charges in their structure makes it possible to solve the numerous problems raised by the use of cationic vectors discussed above, - like cationic lipids, they are capable of complexing and compact nucleic acids and promote their transfection.
  • the present invention thus has as its first object transfecting compounds characterized in that they consist of a polythiourea part connected to a lipid via a spacer.
  • the subject of the present invention is transfecting compounds of general formula (I):
  • n is an integer chosen from 1, 2, 3, 4, 5 and 6,
  • R represents either a hydrogen atom or a group of general formula (II) as defined above, it being understood that when n is 1 and $ is 0, then at least one group R is of formula (II)
  • X in formulas (I) and (II), represents a linear or cyclic aliphatic group, saturated or unsaturated, and comprising 1 to 8 carbon atoms, a mercaptomethyl group (-CH SH), or else a chosen hydrophilic chain among the groups:
  • • and L represents: - either a group -N (RR 2 with R] and R 2 which represent, independently of one another, a hydrogen atom or else a fatty aliphatic chain, or else a group of formula - (CH) t -OZ with t representing an integer chosen from 11, 12, 13, 14 or 15 and Z represents a sugar, a polyol or a PEG, it being understood that at least one of Ri and of R is different from hydrogen,
  • R 3 which represents a steroid derivative.
  • the term “spacer” means any chemical group which makes it possible both to ensure the bond between the polythiourea part and the lipid part of the molecule, and to separate these two parts in order to attenuate any non-interaction. desired between them.
  • Preferred spacers can for example consist of one or more chemical functions chosen from alkyls having 1 to 6 carbon atoms, ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, glycerol, urea, thiourea, or even aromatic cycles.
  • the spacer Y can be chosen from the groups of formula:
  • i and j are integers chosen between 1 and 6 inclusive and W is a group chosen from the functions ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, glycerol, urea, thiourea, or even aromatic cycles,
  • fatty aliphatic chains means alkyl groups containing 10 to 22 carbon atoms, saturated or unsaturated and optionally containing one or more heteroatoms, provided that said fatty aliphatic chains have lipid properties.
  • these are linear or branched alkyl groups containing 10 to 22 carbon atoms and 1, 2 or 3 unsaturations.
  • said alkyl groups comprise 10, 12, 14, 16, 18, 20 or 22 carbon atoms. Mention may more particularly be made of the aliphatic groups - (CH 2 ) nCH 3 , - (CH 2 ) i 3 CH 3 , (CH 2 ) 15 CH 3 and - (CH 2 ) 17 CH 3 .
  • the term “sugar” means any molecule consisting of one or more saccharides.
  • sugars such as pyranoses and furanoses, for example glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, or even maltose, lactose, sucrose, sucrose, fucose, cellobiose, allose, laminarabiose, gentiobiose, sophorose, melibiose, etc.
  • the sugar or sugars are chosen from glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, lactose, sucrose and cellobiose.
  • sugars that is to say several sugars covalently coupled to each other, each sugar preferably being chosen from the list cited above.
  • suitable polysaccharides mention may be made of dextran, P ⁇ -amylose, amylopectin, fructans, mannans, xylans and arabinans.
  • Certain preferred sugars can also interact with cellular receptors, such as certain types of lectins.
  • polyol also means any linear, branched or cyclic hydrocarbon molecule comprising at least two hydroxy functions.
  • the polyols are chosen from the alcohols of general formula:
  • s is chosen from 2, 3, 4, 5 and 6.
  • the compounds of general formula (I) according to the invention contain a polyethylene glycol (PEG) group, this generally comprises between 2 and 120 units -OCH 2 CH 2 O-, and preferably between 2 and 80 units - OCH 2 CH 2 O-.
  • PEG polyethylene glycol
  • They may be simple PEGs, that is to say the end of the chain of which is terminated by a hydroxyl group, or else PEGs whose terminal group is chosen from alkyls, for example methyl.
  • the term “steroid derivatives” means polycyclic cholestane-type compounds.
  • These compounds may or may not be natural and are more preferably chosen from cholesterol, cholestanol, 3- ⁇ - 5-cyclo-5- -cholestan-6- ⁇ -ol, cholic acid, cholesteryl formiate, chotestanylformiate, 3 ⁇ , 5-cyclo-5 -cholestan-6 ⁇ -yl formate, cholesterylamine, 6- (1,5-dimethylhexyl) -3a, 5a-dimethylhexadecahydrocyclopenta [a] cyclopropa [2,3] - cyclopenta [1,2 -f] naphtha-len-10-ylamine, or cholestanylamine.
  • the transfecting compounds have the general formula (III):
  • Ri and R 2 represent, independently of one another , a hydrogen atom or a fatty aliphatic chain, it being understood that at least one of Ri and R 2 is different from hydrogen.
  • the transfecting compounds of the invention have the general formula (IV):
  • Ri and R 2 represent, independently of one another, a hydrogen atom or a fatty aliphatic chain, it being understood that at least one of Ri and R 2 is different from hydrogen. It is understood that the present invention also relates to the isomers of the products of general formula (I) when they exist, as well as their mixtures.
  • the amine of formula is first formed HN (Ri) R2.
  • Said amine can be obtained by condensation of a carboxylic acid and an amine, one containing the substituent Rj and the other the substituent R 2 to form the corresponding amide, followed by reduction of said amide thus obtained.
  • the formation of the amide is advantageously carried out by mixing the constituents and melting by heating at a temperature above the melting temperature of the substances involved, generally between 20 ° C. and 200 ° C., then elimination of the water produced by dehydration. middle; or more advantageously in the presence of a desiccant such as for example phosphorus pentoxide or any other substance capable of absorbing water.
  • a desiccant such as for example phosphorus pentoxide or any other substance capable of absorbing water.
  • the formation of this intermediate amide can also be done using a variant of this method or any other method of amide formation (such as for example peptide-type coupling) involving the carboxylic acids or their derivatives, conditions and reagents various [RC Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Editeurs] and well known to those skilled in the art.
  • the reduction of the amide previously obtained to the amine of formula HN (Ri) R 2 can be carried out for example by using a reducing agent such as double hydride of lithium and aluminum, or any other hydride or reducing agent effective in this case . It is then preferably carried out in a non-protic solvent (for example the tetrahydrofuran or ethers), at a temperature below the boiling point of the solvent and under a dry and / or inert atmosphere.
  • a non-protic solvent for example the tetrahydrofuran or ethers
  • the lipid part designated as HN (R 1 ) R 2 may be commercially available.
  • Ri and / or R 2 represents (s) a group of formula - (CH 2 ) t -OZ
  • the procedure is described above to form the alkyl part, then a simple coupling is carried out with a sugar, a polyol or a commercial PEG according to conventional techniques known to those skilled in the art.
  • lipid part L of the compounds of general formula (I) is represented by a group -OR 3 , this is preferably chosen from the products available on the market.
  • an amide bond is produced by N-acylation of the lipid part L in an appropriate solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, or any other ether, at a temperature below the boiling point of the solvent , and under a dry and / or inert atmosphere.
  • This reaction preferably takes place in the presence of an amino base such as NN-dimethylaminopyridine, or in the presence of this base mixed with non-nucleophilic amino bases such as triethylamine or alternatively ethyldiisopropylamine.
  • Pyridine can also be used, alone or in admixture with another base, diluted with one of the solvents mentioned or used itself as a solvent.
  • the third part of the synthesis of the compounds of general formula (I) consists in the successive introduction of the thiourea units. This will be carried out in a series of reactions which can be repeated as many times as necessary to obtain the desired polythiourea part. According to a preferred method, the procedure is as follows:
  • the first part of the motif in the form of a link -HN- (CHR) m - is grafted to the group YC (O) -L obtained in the previous step.
  • a coupling agent for example the hexafluorophosphorus of l-benzotriazolyloxytris (pyrrolidino) phosphonium (PyBOP ), l-benzotriazolyloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphorus (BOP), hexafluorophosphorus or O- tetrafluoroborate (1H-benzotriazol-l-yl) -N, N, N ', N'- tetramethyluronium (HBTU or TBTU) , dicyclohexylcarbodumide (DCC), 1-
  • This coupling is carried out in a suitable solvent, for example dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, or any other ether, at a temperature below the boiling point of the solvent, and under a dry and / or inert atmosphere.
  • a suitable solvent for example dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, or any other ether
  • the procedure is also carried out in the presence of a non-nucleophilic amino base, for example ethyldiisopropylamine, triethylamine or even triisopropylamine.
  • a SC ⁇ - (CHR) m - type sequence, or a precursor can be grafted, thus making it possible to continue the synthesis by a step such as that described above. after in C),
  • the reaction is advantageously carried out in a solvent such as, for example, tetrahydrofuran, or any other compatible ethereal solvent, at a temperature varying between that of the refrigerant mixtures and approximately 20 ° C. It also operates in the presence of an agent capable of promoting the reaction and / or trapping the hydrogen. sulfide released during the reaction, for example dicyclohexylcarbodumide (DCC).
  • a solvent such as, for example, tetrahydrofuran, or any other compatible ethereal solvent
  • the thiourea motif is formed from the isothiocyanate obtained in the preceding step so as to allow, if necessary, the introduction of another segment of formula - (CHR) m -.
  • a diamine of formula H 2 N- (CHR) m -NH 2 is reacted, in its neutral form or in the form of the acid salt, with the isothiocyanate obtained in the previous step.
  • This reaction is optionally carried out in the presence of a non-nucleophilic amino base, for example triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or alternatively 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU).
  • a non-nucleophilic amino base for example triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or alternatively 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU).
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene
  • the operation is preferably carried out in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, or any other compatible ether or solvent, at a temperature which may be between that of the refrigerant mixtures and the reflux temperature of the solvent.
  • steps B) and C) described above are repeated sequentially and in the required order, until the target structure is obtained, so as to introduce the desired pattern in n copies.
  • the procedure is analogous by introducing at the appropriate time the molecule (s) required to obtain a substitution R as described by formula (II).
  • the last step allowing the termination of the polythiourea type chain (s) consists in the introduction of the substituent X.
  • substituent X represents an alkyl
  • a suitable solvent for example dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, or any other compatible ether, at a temperature between the temperature of the cooling mixtures and the reflux temperature of the solvent.
  • each step of the preparation process can be followed, where appropriate, by steps of separation and purification of the compound obtained according to any method known to those skilled in the art.
  • the preferred compounds according to the present invention are 3- (2- "i 3- [2- (3- * i 2- [3- (dissetradécylcarbamoyl) propionylamino] ethyl r thiouréido) ethyl] thiouréido fethyl) -l-methylthiourée or DT-3TU, which includes three thioureas and corresponds to formula (I) in which X is a -CH3, m is equal to
  • R hydrogen
  • l 0,
  • L -N (Ri) R 2
  • Y NH-CO-CH 2 -CH 2 .
  • compositions comprising a transfecting compound according to the invention and a nucleic acid.
  • the respective amounts of each component can be easily adjusted by those skilled in the art depending on the transfecting compound used, the nucleic acid, and the desired applications (in particular the type of cells to be transfected).
  • nucleic acid is understood to mean both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid. They can be natural or artificial sequences, and in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (RRNA), hybrid sequences such as DNA / RNA chemoplasts or synthetic or semi-synthetic sequences, of modified or unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin.
  • They can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries. They can be chemically modified. In general, they contain at least 10, 20, 50 or 100 consecutive nucleotides, and preferably at least 200 consecutive nucleotides. Even more preferably, they contain at least 500 consecutive nucleotides.
  • deoxyribonucleic acids can be single or double stranded, as can short oligonucleotides or longer sequences.
  • the nucleic acids advantageously consist of plasmids, vectors, episomes, expression cassettes, etc.
  • deoxyribonucleic acids can carry an origin of prokaryotic or eukaryotic replication, whether or not functional in the target cell, one or more several marker genes, transcription or replication regulatory sequences, genes of therapeutic interest, antisense sequences modified or not, regions of binding to other cellular components, etc.
  • the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic interest under the control of regulatory sequences, for example one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • regulatory sequences for example one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • the term “gene of therapeutic interest” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can in particular be a protein or a peptide.
  • This protein product can be exogenous homologous or endogenous with respect to the target cell, that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology.
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous with respect to the target cell.
  • an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines and cytokines as well as their inhibitors or their antagonists: interleukins, interferons, TNF, interleukin antagonists 1, the soluble interleukin 1 or TNF ⁇ receptors, etc.
  • FR 92/03120 growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors (BDNF, CNTF, NGF, IGF , GMF, aFGF, bFGF, VEGF-B, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc.) apolipoproteins (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91 / 11947), the CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), the genes coding for factors involved in coagulation (Factors VII, VIII, IX), the genes involved in DNA repair, the g nes suicides (thymidine kinase, cytosine deaminase), genes for hemoglobin or other proteinace
  • the nucleic acid of therapeutic interest can also be an antisense gene or sequence or a DNA coding for a ribozyme-functional RNA, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of Cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic genes also include the sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).
  • the nucleic acid can also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response.
  • the invention allows the production of either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular for treating or preventing infections, for example viral or bacterial, or cancerous.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming viras", d other viruses or tumor-specific antigenic peptides (EP 259,212).
  • the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the gene of therapeutic interest and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ.
  • sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • promoters of the El A, MLP, CMV, RSV, etc. genes can be modified by adding activation, regulation sequences, etc. It can also be a promoter, inducible or repressible.
  • the nucleic acid can also comprise, in particular upstream of the gene of therapeutic interest, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the nucleic acid may also include a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
  • compositions according to the invention may also comprise one or more adjuvants capable of associating with the transfecting compound / nucleic acid complexes and of improving their transfecting power.
  • the The present invention therefore relates to compositions comprising a nucleic acid, a transfecting compound as defined above and at least one adjuvant capable of associating with the transfecting compound / nucleic acid complexes and of improving their transfecting power.
  • This type of adjuvant lipids, peptides, proteins or polymers for example
  • compositions of the invention may comprise, as an adjuvant, one or more neutral lipids, which in particular have the property of forming lipid aggregates.
  • lipid aggregate is a generic term that includes liposomes of all types (both unilamellar and multilamellar) as well as micelles or more amorphous aggregates.
  • the neutral lipids used in the context of the present invention are lipids with two fatty chains.
  • natural or synthetic lipids are used, zwitterionic or devoid of ionic charge under physiological conditions. They can be chosen more particularly from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), roleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), distearoyl, -palmitoyl, -mirystoylphosphatidylethanolamines as well as their N-methyl glycol derivatives, phosphatidyl glycols, such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelins) or alternatively asialogangliosides (such as in particular asialoGMl and GM2).
  • the lipid adjuvants used in the context of the present invention are chosen from DOPE, DOPC or cholesterol.
  • compositions of the invention comprise from 0.01 to 20 equivalents of adjuvant for one equivalent of nucleic acid in mol / mol and, more preferably, from 0.5 to 5 molar equivalents.
  • the adjuvants mentioned above making it possible to improve the transfecting power of the compositions according to the present invention in particular the peptides, proteins or certain polymers such as polyethylene glycol, can be conjugated to the transfecting compounds according to the invention , not just mixed. In this case, they are covalently linked either to the substituent X in the general formula (I), or to the end of the alkyl chain (s) R] and / or R 2 when these are fatty aliphatic chains. It is also advantageous to use as an adjuvant, polyethylene glycol covalently linked to cholesterol (chol-PEG).
  • chol-PEG polyethylene glycol covalently linked to cholesterol
  • the amount of transfectant, for example DT-3 TU used according to the present invention is such that the particles have sizes less than 500 nm.
  • the amount of transfectant, such as the DT-3TU used is at least 40 nmol of DT-3TU lipids / ⁇ g of DNA (see Examples 11, 13, and 14, below).
  • compositions according to the present invention further comprise a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid.
  • This targeting element can be an extracellular targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatic cells, hematopoietic cells, etc.). It can also be an intracellular targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain privileged cellular compartments (mitochondria, nucleus etc.).
  • the targeting element can be mixed with the transfecting compounds according to the invention and with the nucleic acids, and in this case the targeting element is preferably covalently linked to a fatty alkyl chain (at least 10 atoms of carbon) or to a polyethylene glycol. According to another alternative, the targeting element is covalently linked to the transfecting compound according to the invention, either at the level of the substituent X, or on the spacer Y, or even at the end of Ri and / or R 2 when those these represent fatty aliphatic chains. Finally, the targeting element can also be linked to the nucleic acid as was specified above.
  • sugars peptides, proteins, oligonucleotides, lipids, neuromediators, hormones, vitamins or their derivatives.
  • these are sugars, peptides, vitamins or proteins such as for example antibodies or antibody fragments, cell receptor ligands or fragments thereof, receptors or even fragments of receptors.
  • they may be ligands for growth factor receptors, cytokine receptors, cellular lectin receptors, folate receptors, or ligands with RGD sequence with an affinity for the receptors for protein adhesion like integrins.
  • the targeting element can also be a sugar making it possible to target lectins such as receptors for asialoglycoproteins or syalydes such as Sialyl Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • lectins such as receptors for asialoglycoproteins or syalydes such as Sialyl Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • a subject of the invention is also the use of the transfecting compounds as defined above for the transfer of nucleic acids into cells in vitro, in vivo or ex vivo. More specifically, the subject of the present invention is the use of the transfecting compounds according to the invention for the preparation of a medicament intended for treating diseases, in particular diseases which result from a deficiency in a protein or nucleic product.
  • the polynucleotide contained in said drug encodes said protein or nucleic product, or constitutes said nucleic product, capable of correcting said diseases in vivo or ex vivo.
  • compositions according to the invention can be formulated for topical, cutaneous, oral administration. , rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal, intraperitoneal, etc.
  • the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa).
  • nucleic acids used for the injection may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of nucleic acids used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the treatment sought.
  • the mode of administration it may be either a direct injection into the tissues, for example at the level of tumors, or an injection into the circulatory tract, or a treatment for cells in culture followed by their reimplantation in vivo, by injection or graft.
  • the tissues concerned in the context of the present invention are for example the muscles, the skin, the brain, the lungs, the liver, the spleen, the bone marrow, the thymus, the heart, the lymph, the blood, the bones, cartilage, pancreas, kidneys, bladder, stomach, intestines, testes, ovaries, rectum, nervous system, eyes, glands, connective tissue, etc.
  • Another object of the present invention relates to a method for transferring nucleic acids into cells, comprising the following steps:
  • the invention further relates to a method of treatment of the human or animal body comprising the following steps:
  • the contacting of the cells with the complex can be carried out by incubation of the cells with the said complex (for uses in vitro or ex vivo), or by injection of the complex into an organism (for uses in vivo).
  • the quantity of nucleic acid intended to be administered depends on very many factors such as for example the disease to be treated or to be prevented, the very nature of the nucleic acid, the strength of the promoter, the activity the product expressed by the nucleic acid, the physical condition of the individual or animal (weight, age, etc.), the method of administration and the type of formulation.
  • the incubation is preferably carried out in the presence of, for example, from 0.01 to 1000 ⁇ g of nucleic acid per 10 6 cells.
  • doses of nucleic acid ranging from 0.01 to 50 mg can for example be used. Administration can be done as a single dose or repeated at intervals.
  • compositions of the invention additionally contain one or more adjuvants as defined above
  • the adjuvant (s) are previously mixed with the transfecting compound according to the invention and / or with the nucleic acid.
  • the adjuvant (s) can be administered prior to the administration of the nucleolipid complexes.
  • the tissues can be subjected to a chemical or physical treatment intended to improve the transfection.
  • this can use electrical pulses as in the case of electrotransfer, or mechanical jibs as in the case of sodoporation.
  • the present invention thus provides a particularly advantageous method for the transfer of nucleic acids in vivo, in particular for the treatment of diseases, comprising the administration in vivo or in vitro of a nucleic acid coding for a protein or capable of being transcribed into a nucleic acid capable of correcting said disease, said nucleic acid being associated with a transfecting compound according to the invention under the conditions defined above.
  • the transfecting compounds of the invention are particularly useful for the transfer of nucleic acids into primary cells or into established lines. It can be fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic (lymphocytes, CD34, dendritics, etc.), epithelial etc., in differentiated or pluripotent form (precursors).
  • kits which comprise one or more transfecting compounds according to the invention and / or their mixtures.
  • Such kits can be in the form of a compartmentalized package so as to receive different containers such as, for example, ampoules or tubes.
  • Each of these containers comprises the various elements necessary for carrying out the transfection, individually or mixed: for example one or more transfecting compound (s) according to the invention, one or more nucleic acid (s), one or adjuvant (s), cells, etc.
  • the present invention also includes other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • the Applicant proposes, without limitation, an operating protocol as well as reaction intermediates which can be used to prepare the transfecting compounds according to the invention.
  • an operating protocol as well as reaction intermediates which can be used to prepare the transfecting compounds according to the invention.
  • reaction intermediates which can be used to prepare the transfecting compounds according to the invention.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • THF tetrahydrofuran
  • Figure 1 Evolution of the fluorescence rate (in%) as a function of the amount of EPC / DT-3TU mixture (in nmoles) per ⁇ g of nucleic acid and as a function of the amount of EPC alone (in nmoles) per ⁇ g of acid nucleic acid (control mixture).
  • Figure 2 Evolution of the fluorescence rate (in%) as a function of the amount of DPPC / DT-3TU mixture (in nmoles) per ⁇ g of nucleic acid and as a function of the amount of DPPC alone (in nmoles) per ⁇ g d nucleic acid (control mixture).
  • Figure 3 Agarose gel (0.8% / TBE) showing the compaction of the plasmid pXL3031 ( ⁇ g) as a function of the amount of EPC / DT-3TU liposome (in nmoles) used.
  • Figure 4 Zeta potential (in mV) corresponding to the surface potential of the DPPC / DT-3TU-DNA liposomes as a function of the amount of lipid (nmoles) per ⁇ g of nucleic acid.
  • Figure 5 Efficiency of in vitro transfection of HeLa cells by complexes formed between DNA and DT-3TU / DPPC liposomes (1: 2), with different lipid / DNA ratios in nmoles / ⁇ g, with or without serum.
  • the ordinate axis represents the expression of luciferase in RLU / ⁇ g of protein.
  • the abscissa axis indicates the amount of DT-3TU (in nmoles) per ⁇ g of DNA.
  • Figure 6 Protein level (absorbance) of HeLa cells not treated or treated with EPC + DT-3TU / DNA liposomes at different lipid / DNA ratios in nmoles / ⁇ g.
  • Figure 7 Schematic representation of the plasmid pXL3031.
  • Figure 8 Agarose gel (0.8% / TBE) showing the compaction of the plasmid pXL3031 ( ⁇ g) as a function of the amount of DT-3TU / DPPC nanoemulsion (in nmoles) used.
  • Figure 9 Agarose gel (0.8% / TBE) showing the compaction of the plasmid pXL3031 ( ⁇ g) as a function of the amount of DT-3TU / DPPC / Chol-PEG nanoemulsion (in nmoles) used.
  • Figure 10 Evolution of the percentage of DNA compacted as a function of the quantity of DT-4TU / DPPC mixture (in nmoles) per ⁇ g of nucleic acid in comparison with different quantities of the DT-3TU / DPPC mixture (in nmoles) per ⁇ g of acid nucleic.
  • Figure 11 Agarose gel (0.8% / TBE) showing the protection of the plasmid ⁇ XL3031 ( ⁇ g) by the mixture of DT-3TU / DPPC lipids against DNases.
  • the control DNA in the presence of DNases was deposited in well 2
  • the DNA in the presence of 30, 40 mnol of lipid / ⁇ g of DNA and 40nmol / ⁇ g + 6% chol-PEG treated with DNase were deposited in wells 3, 4 and 5 respectively.
  • Figure 12 Agarose gel (0.8% / TBE) showing the protection of the plasmid pXL3031 ( ⁇ g) by the mixture of lipids DT-3TU / DPPC vis-à-vis the serum.
  • Well 1 corresponds to DNA alone, wells 2 and 3 to DNA alone and in the presence of 40nmol / ⁇ g of DT-3TU / DPPC nanoemulsions in 150mM NaCl then in 20% serum (wells 4 and 5) and in 100% serum (wells 6 and 7).
  • Figure 13 Efficiency of in vivo transfection in muscle by complexes formed between DNA and DT-3TU / DPPC liposomes, at different lipid / DNA ratios in nmoles / ⁇ g with and without electrotransfer (e- / e +).
  • Figure 14 Biodistribution in vivo in mice of DT-3TU / DPPC / DOPE-Rh / DNA complexes after 30 min, 1 h and 6 h in blood, lungs and the RES system. This figure shows the stealth character of these particles: 50% of complexes were found after 30 minutes in the blood circulation.
  • reagents and catalysts such as triethylamine, trifluoroacetic acid,? -Toluene sulfonic acid, benzotriazol- 1 -yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), dicylclohexylcarbodiimide (DCC), carbon disulfide, tetradec di-tert-butyl dicarbonate, 4-dimethylaminopyridine, or even diisopropylethylamine are commercially available.
  • PyBOP benzotriazol- 1 -yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • DCC dicylclohexylcarbodiimide
  • carbon disulfide tetradec di-tert-butyl dicarbonate
  • 4-dimethylaminopyridine 4-dimethylaminopyridine
  • diisopropylethylamine are commercial
  • the nucleic acid used is the plasmid pXL3031 described in the publication Gene Therapy (1999) 6, pp. 1482-1488, which contains the read gene coding for luciferase under the control of the P / E CMV promoter of the cytomegalovirus.
  • This plasmid is shown in Figure 7. Its size is 3671 bp.
  • the plasmid solution used is diluted to 1.262 g / l in water for injection.
  • the protected diol (17) (0.05 g, 0.05 mmol) is dissolved in 1 ml of 1N HCL / THF solution (1/1) at r.t .; the mixture is stirred for 18 hours.
  • the crude is then extracted with dichloromethane (2x 5 ml).
  • the organic phases are collected and then neutralized with a solution of sodium hydrogen carbonate.
  • the aqueous phases are extracted with dichloromethane.
  • the organic phases are combined and then dried over mgnesium sulphate and then evaporated.
  • the crude is chromatographed on C8 reverse phase with a gradient of 100% water to 100% acetonitrile.
  • the product (18) is obtained with a yield of 49%.
  • the protected diol (19) (0.05 g,. 05 mmol) is dissolved in 1 ml of solution
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to associate with nucleic acids.
  • the nucleic acid is brought into contact with increasing amounts of DT-3TU
  • samples of 800 ⁇ l of nucleic acid complexes with a concentration of 0.01 ⁇ g / ml are prepared in a 150 mM sodium chloride solution with increasing amounts of DT-3TU (12).
  • the slit widths for excitation and emission are set to 5 nm.
  • the fluorescence value is recorded after adding 3 ⁇ l of ethidium bromide at 1 g / 1 per ml of DNA / lipid solution (at 0.01 mg of DNA / ml).
  • the curve including squares shows that adding an increasing amount of DT-3TU / EPC lipid mixture (0.75 to 20 nmol of DT-3 TU) compared to a fixed amount of acid nucleic acid (8 ⁇ g) induces a decrease in fluorescence linked to the reduction in the insertion of ethidium bromide between the base pairs of DNA.
  • This example thus illustrates the capacity of the DT-3TU lipid to associate with the nucleic acid.
  • the curve including squares shows that adding an increasing amount of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 to 20 nmol of DT-3TU) compared to an amount fixed nucleic acid (8 ⁇ g) induced a decrease in fluorescence when an identical amount of ethidium bromide is added to the different samples.
  • a control was carried out.
  • This example thus illustrates the capacity of the DT-3TU lipid to associate with the nucleic acid.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to compact the nucleic acids.
  • the gel shows the electrophoretic migration of AD ⁇ when it is not associated with lipids (well 1), then its difference in retention when it is associated with lipids.
  • Wells 2 to 6 represent AD ⁇ (0.01 g / 1) associated with increasing amounts of DT-3TU / EPC liposomes: 0.75 then 5 then 10 then 15 and finally 20 nmol of DT-3TU lipid.
  • the comparison between well 1 and the other wells indicates that the more the amount of DT-3TU lipid is increased, the more the AD ⁇ is retained on the gel so as to be totally retarded from 3 nmoles of DT-3TU / ⁇ g of DNA, complex aggregation area.
  • Wells 8 to 13 correspond respectively to DNA alone (0, lg / l, l ⁇ g for the gel), the lipoplexes formed at the concentration of 0.1 g / 1 of DNA with lipid / DNA ratios: 0.75 or 5 or 10 or 15 and finally 20 nmoles / ⁇ g of DNA. Similarly, it can be observed that at this concentration of DNA compatible with in vivo experiments, the DNA is compacted from the ratio of 5 nmol lipid / ⁇ g of DNA.
  • This example thus illustrates the capacity of the DT-3TU lipid to compact the nucleic acid.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to compact the nucleic acids while retaining a generally anionic, neutral, or very weakly cationic structure.
  • the nucleic acid is brought into contact with increasing amounts of DT-3TU / EPC lipid mixture by equivolumetric mixing of lipid solutions of different titers in the nucleic acid solutions.
  • the DT-3TU / EPC liposomes are added to the DNA in a zone ranging from 0.75 nmol to 20 nmol of lipids per ⁇ g of DNA.
  • the Zeta potential varies from -35 mV to +15 mV.
  • the negative part corresponds to what is shown in Figures 1, 2 and 3, namely that the Zeta potential is negative when the DNA is not fully compacted.
  • the more lipid is added the more the DNA is compacted and the more the Zeta potential approaches zero, the lipoplexes then have an almost zero surface potential.
  • the Zeta potential then becomes slightly positive towards 8 mnoles of lipid / ⁇ g of DNA.
  • the relativity of this measurement must take into account the comparison of the different samples during the same experiment. It is therefore important to note the evolution of the Zeta potential as a function of the increase in the amount of lipid up to a slightly positive value.
  • This example thus confirms the compaction of DNA by the transfecting compounds according to the present invention, in particular DT-3TU, and shows that the lipoplexes formed have a surface potential close to neutrality.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to transfect cells in vitro.
  • the cells are washed twice and incubated at 37 ° C with 500 ⁇ l of medium with serum (10% S VF v / v) or without serum.
  • the transfected cells are washed twice with 500 ⁇ l of PBS (phosphate buffer) and then lysed with 250 ⁇ l of reagent (Promega cell culture lysis reagent, from the Luciferase Assay System kit).
  • luciferase activity is measured by the emission of light in the presence of luciferin, coenzyme A and ATP for 10 seconds and related to 2000 treated cells.
  • the luciferase activity is thus expressed in Relative Light Unit (“RLU”: “Relative light unit”) and normalized with the protein concentration of the sample obtained by the use of a Pierce BCA kit (Rockford, IL, USA).
  • the purpose of this example is to illustrate the absence of toxicity of the transfecting compounds according to the invention.
  • the protein level is measured after transfection.
  • the transfection protocol is identical to that described for Example 8.
  • Protein level determination Briefly, the transfected cells are washed twice with 500 ⁇ l of PBS (phosphate buffer) then lysed with 250 ⁇ l of reagent (Promega cell culture lysis reagent, from the Luciférase Assay System kit).
  • PBS phosphate buffer
  • reagent Promega cell culture lysis reagent, from the Luciférase Assay System kit.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to associate with nucleic acids.
  • the capacity of the DT-3TU diol compound to compact AD ⁇ is shown by an agarose gel (0.8% agarose in TBE 1 ⁇ ) on which different AD scenery / DT-3TUdiol samples are deposited.
  • the gel is subjected to an electric current of one and a half hours at 70V and 40 mA in order to migrate the DNA by electrophoresis.
  • the bands are revealed with BET and by absorption under a UN lamp.
  • the gel shows the electrophoretic migration of DNA when it is not associated with lipids (well 1), then its difference in retention when it is associated with lipids.
  • Wells 2 to 5 represent the DNA (0.01 g / 1) associated with DT-3TU / DPPC nanoemulsions (60nmol DT-3TU / ⁇ g of DNA) containing or not calcium and ethanol.
  • Well 2 represents 60nmol / ⁇ g of DNA without Ca 2+ , without EtOH, in well 3 was added 2% EtOH, in well 4, 60eq Ca 2+ / PO " DNA, in well 5, 2% EtOH and 60eq of Ca + .
  • the comparison between well 1 and the other wells indicates that the various DT-3TU formulations studied delay the migration of DNA onto the gel, which was also obtained after dialysis of the Ca 2 constituents. + and EtOH.
  • This example thus illustrates the capacity of the DT-3TU lipid incorporated in different formulations to compact the nucleic acid.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to associate with nucleic acids.
  • the advantage of inserting cholesterol-PEG in DT-3TU / DPPC formulations comes from the possibility of reducing the particle size to an amount of lipid which would lead to aggregation without insertion of lipid-PEG.
  • the advantage is to optimize the quantities of transfectants injected in vivo. Indeed, the particle sizes required to have stealth objects vis-à-vis the serum proteins and thus an increased half-life time in the blood circulation should mainly be less than 500 nm. However, to obtain particle sizes of this order, it is necessary to use at least 40 nmol of DT-3TU lipid / ⁇ g of DNA.
  • the insertion of lipid-PEG into DT-3TU lipid formulations makes it possible to reduce the amount of DT-3TU necessary for DNA compaction and the formation of particles predominantly less than 500 nm.
  • the gel shows the electrophoretic migration of DNA when it is not associated with lipids (well 1), then its difference in retention when it is associated with lipids.
  • Wells 2 to 5 represent DNA (0.01 g / l) associated with increasing amounts of DT-3TU / DPPC nanoemulsions containing or not containing cholesterol-
  • well 2 represents 20nmol / ⁇ g of DNA + 15% chol-PEG
  • well 3 comprises 20nmol / ⁇ g of DNA + 20% chol-PEG
  • well 4 represents 30nmol / ⁇ g of DNA + 15% chol-PEG
  • the well 5 represents 20nmol / ⁇ g of DNA + 20% chol-PEG.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to associate with nucleic acids. This can be easily demonstrated by an ethidium bromide fluorescence test: the absence of fluorescence indicates the absence of free nucleic acid, which means that the nucleic acid is compacted by the transfecting compound.
  • the nucleic acid is brought into contact with increasing amounts of DT-4TU, by equivolumetric mixing of lipid solutions of different titers in the nucleic acid solutions.
  • Samples of 800 ⁇ l of nucleic acid complexes with a concentration of 0.01 ⁇ g / ml are thus prepared in a 150 mM sodium chloride solution with increasing amounts of DT-4TU (15).
  • a control was carried out by placing the nucleic acid in the presence of increasing amounts of DT-3TU (12) to compare the complexion efficiencies of a lipid comprising 3 thioureas (see FIG. 2) compared to a lipid carrying 4 thioureas, by equivolumetric mixing of lipid solutions of different titers in nucleic acid solutions.
  • samples of 800 ⁇ l of nucleic acid complexes with a concentration of 0.01 ⁇ g / ml are prepared in a solution of 5% glucose with increasing amounts of DPPC.
  • Ethidium bromide fluorescence is measured using a FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), with excitation and emission wavelengths of 260 nm and 590 nm respectively. The slit widths for excitation and emission are set to 5 nm. The fluorescence value is recorded after adding 3 ⁇ l of ethidium bromide (lg / 1) per ml of DNA / lipid solution (0.01 g / 1 of DNA). The results are summarized in Figure 10.
  • the curve including squares shows that the addition of an increasing amount of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 to 30 nmol of DT-3TU) relative to a fixed amount of nucleic acid (8 ⁇ g) induced a decrease in fluorescence linked to the reduction in the insertion of ethidium bromide between the base pairs of DNA. This indicates that the association between the DT-3TU / DPPC liposomes and the DNA is strong enough to exclude ethidium bromide from the complexes. We were thus able to obtain 70%> of DNA compaction using 30 nmol of DT-3TU / DPPC lipids per ⁇ g of DNA.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to protect the nucleic acids from enzymatic hydrolysis including DNases.
  • DNA in the lipid complexes DT-3TU is is therefore not accessible to enzymatic hydrolysis, it is protected from the hydrolysis of DNases.
  • This example thus illustrates the capacity of the lipid DT-3TU to protect the nucleic acid from enzymatic hydrolysis.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to protect the nucleic acids from degradation in a serum medium.
  • the gel shows the electrophoretic migration of the control AD ⁇ (well 1), then its difference in retention when it has been treated, not complexed, in saline medium (150 mM
  • This example thus illustrates the capacity of the DT-3TU lipid to protect the nucleic acid from degradation in serum.
  • the purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to transfect biological tissues in vivo.
  • mice After euthanasia of the mice 96 hours post-injection, the muscles are removed and ground in 1 ml of lysis buffer. After centrifugation (10 min., 12000 rpm, 4 ° C), 10 ⁇ l of supernatant are removed and deposited in 96-well plates for reading the luciferase after addition of 50 ⁇ l of the luciferase substrate. The arbitrary level of luminescence is read in the supernatant using a luminometer (Wallac, Victor).
  • the values obtained are indicated in FIG. 13. They represent the levels of expression relative to the dose of lipid associated with the nucleic acid, 20 and 40 nmol of lipid DT-3TU / ⁇ g of DNA. The expression levels obtained are significant, and higher than the background brait represented by the muscle taken as control which corresponds to 5.10 4 . DNA complexed by different amounts of DT-3TU lipid is therefore capable of transfecting muscle tissue with a significant level of transfection.
  • This example illustrates the capacity of the transfecting compounds according to the invention to transfect tissues in vivo.
  • EXAMPLE 16 In Vivo Biodistribution of DT-3TU / DPPC / DNA Complexes The purpose of this example is to illustrate the capacity of the transfecting compounds according to the invention to circulate for a long time in circulation in vivo because of their neutral character.
  • the blood is drawn by intracardiac puncture on anesthetized mice. After euthanasia of the mice, the liver, spleen and lungs are immediately removed, weighed and homogenized in PBS (5 ⁇ l / mg of tissue). The lipids are extracted from 100 ⁇ l of blood and organ homogenates with 3 ml of a 1/1 mixture of chloroform and methanol by vigorous stirring for 30 min and then by centrifugation. The fluorescence is read in the supernatant using a FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), with excitation and emission wavelengths of 550 nm and 590 nm respectively. The slit widths for excitation and emission are set to 5 nm.
  • the values obtained are indicated in FIG. 14. They represent the percentage of the injected dose obtained in the blood, the lungs and the reticuloendothelial system (cumulative liver and spleen) 30 minutes, 1 h and 6 h after injection.
  • the measurement of fluorescence in the blood after 30 minutes represents 50% of the dose injected, which is much higher than what can be obtained with cationic type DNA surfactants.
  • After 1 hour, 17% of the injected dose could be found, which again represents a remarkable improvement compared to cationic complexes.
  • the neutral nature of these lipid / DNA complexes (very weakly zeta positive: FIG. 4) therefore has a real advantage for obtaining stealth particles with serum proteins. It should also limit their interactions with macrophages and kupffer cells of the spleen and liver, which may explain the amount of liposome found in 30 min and 1 h in the blood.
  • the amount of lipoplex found in the lung is low compared to that found in the case of cationic lipoplexes.
  • the neutrality of these liposomes should also decrease non-specific interactions with the negative endothelium of the lungs.
  • This example illustrates the capacity of the transfecting compounds according to the invention to be stealthy with respect to serum proteins.

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Abstract

La présente invention est relative à de nouveaux composés qui permettent le transfert d'acides nucléiques dans des cellules. Plus précisément, ces nouveaux composés sont des dérivés lipidiques de polythiourée. Ils sont utiles pour la transfection <i>in vitro, ex vivo</i> ou <i>in vivo</i> d'acides nucléiques dans différents types cellulaires.

Description

DERIVES LIPIDIQUES DE POLYTHIOURÉE
La présente invention est relative à de nouveaux composés qui permettent le transfert d'acides nucléiques dans des cellules. Plus précisément, ces nouveaux composés sont des dérivés lipidiques de polythiourée. Ils sont utiles pour la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'acides nucléiques dans différents types cellulaires.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une nécessité. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation impliquant l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des approches de greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure.
Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance intracellulaire de matériel génétique exogène. L'une d'entre elles, en particulier, repose sur l'emploi de vecteurs non-viraux qui constitue une alternative très avantageuse aux méthodes virales qui ne sont pas complètement dénuées de risques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales : complexer et compacter l'acide nucléique à transfecter, et promouvoir son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement à travers l'enveloppe nucléaire.
Plusieurs familles de vecteurs synthétiques ont ainsi été développées, comme par exemple les polymères ou encore les vecteurs biochimiques (constitués d'une protéine cationique associée à un ligand de récepteur cellulaire), mais un progrès important a surtout été accompli avec le développement des lipofectants, et plus particulièrement des lipides cationiques. Il a ainsi été mis en évidence que les lipides cationiques, du fait de leur charge globale positive, interféraient spontanément avec l'ADN globalement négatif, formant des complexes nucléolipidiques capables à la fois de protéger l'ADN vis-à-vis des nucléases et de se fixer sur les membranes cellulaires pour une libération intracellulaire de l'ADN.
Différentes sortes de lipides cationiques ont été synthétisées à ce jour : des lipides comportant un groupement ammonium quaternaire (par exemple le DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE...), des lipopolyamines comme par exemple le DOGS, le DC-Chol ou encore les lipopolyamines divulguées dans la demande de brevet WO 97/18185, des lipides associant à la fois un groupement ammonium quaternaire et une polyamine comme le DOSPA, ou encore des lipides comportant diverses autres entités cationiques, notamment des groupes amidinium (par exemple 1ADPDE, ADODE ou les lipides de la demande de brevet WO 97/31935).
Toutefois, l'emploi de ces lipides cationiques en tant qu'agent de transfection pose encore de nombreux problèmes, et leur efficacité reste à améliorer. Notamment, il a été observé que pour obtenir des complexes nucléolipidiques efficaces et stables, il est en général nécessaire que ces complexes soient fortement cationiques. Cependant, il serait souhaitable de pouvoir disposer de vecteurs qui ne soient pas cationiques de façon à former avec l'acide nucléique des particules globalement neutres ou négatives. En effet, il a été observé que les complexes globalement cationiques formés entre l'acide nucléique et les lipides cationiques ont tendance à être captés par le système réticulo-endothélial ce qui induit leur élimination. En outre, les protéines du plasma ont tendance à s'adsorber à leur surface du fait de la charge globale positive des complexes formés, et il en résulte une perte du pouvoir de transfection. De plus, dans un contexte d'injection locale, la présence d'une charge globale positive importante empêche la diffusion des complexes d'acides nucléiques en dehors du site d'administration, car les complexes s'adsorbent sur les matrices extracellulaires ; les complexes ne peuvent donc plus atteindre les cellules cibles, ce qui, par voie de conséquence, entraîne une diminution de l'efficacité de transfert par rapport à la quantité de complexes injectée. Enfin, il a également été constaté à de nombreuses reprises que les lipides cationiques ont un effet inflammatoire.
La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés transfectants, originaux de par leur fonction polythiourée, et qui sont susceptibles d'être utilisés efficacement pour la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'acides nucléiques. Ces nouveaux composés sont particulièrement intéressants car : - l'absence de charges positives dans leur structure permet de résoudre les nombreux problèmes soulevés par l'emploi de vecteurs cationiques discutés ci- avant, - tout comme les lipides cationiques, ils sont capables de complexer et compacter les acides nucléiques et de promouvoir leur transfection.
La présente invention a ainsi pour premier objet des composés transfectants caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'une partie polythiourée reliée à un lipide par l'intermédiaire d'un espaceur.
En particulier, la présente invention a pour objet des composés transfectants de formule générale (I) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle :
• £ est un entier choisi parmi 0 et 1
• n est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6,
• m est un entier choisi parmi 2, 3 et 4, m pouvant prendre des valeurs différentes au sein des différents groupements -[NH-CS-NH-(CH)ra]-, R' représente un groupe de formule générale (II)
Figure imgf000005_0001
dans laquelle q est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et p est un entier choisi parmi 2, 3 et 4, p pouvant prendre des valeurs différentes au sein des différents groupements -[(CH2)P-NH-CS-NH]-,
• R représente soit un atome d'hydrogène soit un groupe de formule générale (II) telle que définie ci-avant, étant entendu que lorsque n vaut 1 et $ vaut 0, alors au moins un groupe R est de formule (II)
• X, dans les formules (I) et (II), représente un groupe aliphatique linéaire ou cyclique, saturé ou insaturé, et comprenant 1 à 8 atomes de carbone, un groupe mercaptométhyle (-CH SH), ou bien une chaîne hydrophile choisie parmi les groupes :
-(CH2)x-(CHOH)u-H avec x un entier compris entre 0 et 10, et u un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, ou -(OCH2CH O)v-H avec v un entier choisi parmi 1 , 2 et 3, étant entendu que pas plus d'un substituant X, à la fois dans les formules (I) et (II), ne représente une chaîne hydrophile,
• Y représente un espaceur
• et L représente : - soit un groupement -N(R R2 avec R] et R2 qui représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, ou bien un groupe de formule -(CH )t-OZ avec t représentant un entier choisi parmi 11, 12, 13, 14 ou 15 et Z représente un sucre, un polyol ou un PEG, étant entendu que l'un au moins de Ri et de R est différent de l'hydrogène,
- soit un groupement -OR3, avec R3 qui représente un dérivé stéroïdien.
Selon la présente invention, on entend par « espaceur » tout groupe chimique permettant à la fois d'assurer la liaison entre la partie polythiourée et la partie lipidique de la molécule, et d'éloigner ces deux parties afin d'atténuer toute interaction non-désirée entre elles. Des espaceurs préférés peuvent par exemple être constitués d'une ou plusieurs fonctions chimiques choisies parmi les alkyles ayant 1 à 6 atomes de carbone, les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, le glycérol, l'urée, la thiourée, ou encore les cycles aromatiques. Par exemple, l' espaceur Y peut être choisi parmi les groupes de formule :
-NH-C(O)-CH2-CH2- ou : -(CH2-)i-W-(CH2)J- dans laquelle i et j sont des entiers choisis entre 1 et 6 inclus et W est un groupe choisi parmi les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, le glycérol, l'urée, la thiourée, ou encore les cycles aromatiques,
Au sens de la présente invention, on entend par « chaînes aliphatiques grasses » des groupes alkyle contenant 10 à 22 atomes de carbone, saturés ou insaturés et contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, pourvu que lesdites chaînes aliphatiques grasses présentent des propriétés lipidiques. De préférence, il s'agit de groupes alkyles linéaires ou ramifiés contenant 10 à 22 atomes de carbone et 1, 2 ou 3 insaturations. De préférence, lesdits groupes alkyles comprennent 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 atomes de carbone. On peut citer plus particulièrement les groupements aliphatiques -(CH2)nCH3, -(CH2)i3CH3, (CH2)15CH3 et -(CH2)17CH3.
On entend au sens de l'invention par "sucre", toute molécule constituée d'un ou plusieurs saccharides. On peut citer à titre d'exemple des sucres tels que les pyranoses et les furanoses, par exemple le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, ou encore le maltose, le lactose, le saccharose, le sucrose, le fucose, le cellobiose, l'allose, le laminarabiose, le gentiobiose, le sophorose, le mélibiose etc.. De préférence, le ou les sucres sont choisis parmi le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, le lactose, le saccharose et le cellobiose. De plus, il peut également s'agir de sucres dits « complexes », c'est-à-dire de plusieurs sucres couplés covalemment les uns aux autres, chaque sucre étant de préférence choisi dans la liste citée précédemment. A titre de polysaccharides convenables, on peut citer le dextran, Pα-amylose, l'amylopectine, les fructans, les mannans, les xylans et les arabinans. Certains sucres préférés peuvent en outre interagir avec des récepteurs cellulaires, comme par exemple certains types de lectines.
Selon l'invention, on entend également par « polyol » toute molécule hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique comprenant au moins deux fonctions hydroxy. On peut citer à titre d'exemple le glycérol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, les tétritols, les pentitols, les pentitols cycliques (ou quercitols), les hexitols comme le mannitol, le sorbitol, les dulcitols, les hexitols cycliques ou inositols etc...(Stanek et al., The Monosaccharides Académie Press, pp. 621-655 et pp. 778-855). Selon un aspect préféré, les polyols sont choisis parmi les alcools de formule générale :
Figure imgf000007_0001
pour lesquels s est choisi parmi 2, 3, 4, 5 et 6.
Lorsque les composés de formule générale (I) selon l'invention contiennent un groupe polyéthylène glycol (PEG), celui-ci comprend en général entre 2 et 120 motifs -OCH2CH2O-, et de préférence entre 2 et 80 motifs -OCH2CH2O-. Il peut s'agir de PEG simples, c'est-à-dire dont l'extrémité de la chaîne est terminée par un groupe hydroxyle, ou bien de PEG dont le groupe terminal est choisi parmi les alkyles, par exemple le méthyle. Au sens de la présente invention, on entend par « dérivés stéroïdiens » les composés polycycliques de type cholestane. Ces composés peuvent être naturels ou non et sont plus préférentiellement choisis parmi le cholestérol, le cholestanol, le 3-α- 5-cyclo-5- -cholestan-6-β-ol, l'acide cholique, le cholestérylformiate, le chotestanylformiate, le 3α,5-cyclo-5 -cholestan-6β-yl formiate, la cholestérylamine, la 6-(l,5-diméthylhexyl)-3a,5a-diméthylhexadécahydrocyclopenta[a]cyclopropa[2,3]- cyclopenta[l,2-f]naphta-lèn-10-ylamine, ou la cholestanylamine.
Selon une variante préférée de l'invention, les composés transfectants ont pour formule générale (III) :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle X, m, n, et Y sont tels que définis précédemment dans la formule générale (I), à l'exception de n qui est différent de 1, et Ri et R2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, étant entendu que l'un au moins de Ri et R2 est différent de l'hydrogène.
Encore plus préférentiellement, les composés transfectants de l'invention ont pour formule générale (IV) :
Figure imgf000008_0002
dans laquelle m, n, et Y sont tels que définis précédemment dans la formule générale (I), à l'exception de n qui est différent de 1, et Ri et R2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, étant entendu que l'un au moins de Ri et R2 est différent de l'hydrogène. Il est entendu que la présente invention concerne également les isomères des produits de formule générale (I) lorsqu'ils existent, ainsi que leurs mélanges.
La préparation des composés de formule générale (I) selon la présente invention s'effectue en mettant en oeuvre les étapes suivantes, dans l'ordre présenté ou selon toute autre variante connue et également adaptée, en utilisant les techniques de synthèse organique classique, en solution ou sur des supports solides, bien connues de l'homme du métier :
1) Obtention de la partie lipidique L
Lorsque la partie lipidique L des composés de formule générale (I) est représentée par un groupement -N(Rι)R2 avec Ri et/ou R2 qui représentent une chaîne aliphatique grasse, on forme tout d'abord l'aminé de formule HN(Ri)R2 . Ladite aminé peut être obtenue par condensation d'un acide carboxylique et d'une aminé contenant l'un le substituant Rj et l'autre le substituant R2 pour former l'amide correspondant, suivie de la réduction de dudit amide ainsi obtenu.
La formation de l'amide est avantageusement effectuée par mélange des constituants et fusion par chauffage à une température supérieure à la température de fusion des substances impliquées, en général entre 20°C et 200°C, puis élimination de l'eau produite par déshydratation du milieu; ou plus avantageusement en présence d'un agent dessicant tel que par exemple le pentoxyde de phosphore ou toute autre substance pouvant absorber l'eau. La formation de cet amide intermédiaire peut également se faire en employant une variante de cette méthode ou toute autre méthode de formation d'amide (tel que par exemple le couplage de type peptidique) impliquant les acides carboxyliques ou leurs dérivés, des conditions et des réactifs variés [R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Editeurs] et bien connues de l'homme de l'art.
La réduction de l'amide précédemment obtenu en aminé de formule HN(Ri)R2 peut être effectuée par exemple en utilisant un réducteur tel que l'hydrure double de lithium et d'aluminium, ou tout autre hydrure ou réducteur efficace dans ce cas. On opère alors de préférence dans un solvant non protique (par exemple le tétrahydrofurane ou encore les éthers), à température inférieure à la température d'ébullition du solvant et sous atmosphère sèche et/ou inerte.
Selon une autre variante, la partie lipidique désignée comme HN(R1)R2 peut être disponible commercialement.
Lorsque Ri et/ou R2 représente(nt) un groupe de formule -(CH2)t-OZ, on procède comme décrit ci-avant pour former la partie alkyle, puis on effectue un simple couplage avec un sucre, un polyol ou un PEG commercial selon les techniques classiques connues de l'homme du métier.
Lorsque la partie lipidique L des composés de formule générale (I) est représentée par un groupement -OR3, celle-ci est de préférence choisie parmi les produits disponibles dans le commerce.
2) Greffage de l'espaceur Y
L' espaceur Y est ensuite fixé à la partie lipidique L obtenue à l'étape précédente selon les techniques classiques connue de l'homme de l'art. Selon une variante préférée, une liaison amide est réalisée par N-acylation de la partie lipidique L dans un solvant approprié tel que le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou tout autre éther, à température inférieure à la température d'ébullition du solvant, et sous atmosphère sèche et/ou inerte. Cette réaction se déroule de préférence en présence d'une base aminée comme la NN- diméthylaminopyridine, ou en présence de cette base mélangée avec des bases aminées non-nucléophiles comme la triéthylamine ou encore l'éthyldiisopropylamine. La pyridine peut également être employée, seule ou en mélange avec une autre base, diluée par un des solvants cités ou utilisée elle-même comme solvant.
3 Formation de la chaîne polythiourée
La troisième partie de la synthèse des composés de formule générale (I) consiste en l'introduction successive des motifs thiourées. Celle-ci sera réalisée en une suite de réactions pouvant être répétées autant de fois que nécessaire pour obtenir la partie polythiourée désirée. Selon une méthode préférée, on opère de la façon suivante :
A) On greffe tout d'abord au groupement Y-C(O)-L obtenu à l'étape précédente, la première partie du motif sous la forme d'un chaînon -HN-(CHR)m-. Pour cela, on opère avantageusement à partir d'un chaînon diaminé de formule H2N- (CHR)m-NH2 en présence d'un agent de couplage, par exemple l'hexafluorophosphore de l-benzotriazolyloxytris(pyrrolidino)phosphonium (PyBOP), l'hexafluorophosphore de l-benzotriazolyloxytris(diméthylamino)phosphonium (BOP), les hexafluorophosphore ou tétrafluoroborate de O-(lH-benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'- tétraméthyluronium (HBTU ou TBTU), le dicyclohexylcarbodumide (DCC), le chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), ou encore l'iodure de l-(3-triméthylammoniopropyl)-3-éthylcarbodiimide, supportées ou non. Ce couplage est effectué dans un solvant convenable, par exemple le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou tout autre éther, à température inférieure à la température d'ébullition du solvant, et sous atmosphère sèche et/ou inerte. On procède également en présence d'une base aminée non nucléophile, par exemple l'éthyldiisopropylamine, la triéthylamine ou encore la triisopropylamine. Si la nature de la partie lipidique et de l' espaceur est compatible, une séquence de type SCΝ-(CHR)m-, ou un précurseur, peut être greffée, permettant ainsi de poursuivre la synthèse par une étape telle que celle décrite ci-après en C),
B) Le produit obtenu à l'étape précédente est ensuite transformé, selon une technique préférée, en isothiocyanate par traitement par du sulfure de carbone (CS ), ou par tout autre réactif connu de l'homme du métier pour obtenir une telle fonctionnalité [H. Ulrich, Chemistry and Technology of Isocyanates, Wiley (1996). The Chemistry ofCyanates and their Thio Derivatives, S. Patai Ed., Wiley (1977). S. Ozaki, Récent Advances in Isocyanate Chemistry, Chem. Rev. 72, 457 (1972).]. La réaction est avantageusement effectuée dans un solvant tel que par exemple le tétrahydrofurane, ou tout autre solvant éthéré compatible, à une température variant entre celle des mélanges réfrigérants et environ 20°C. On opère également en présence d'un agent capable de promouvoir la réaction et/ou de piéger l'hydrogène sulfuré libéré an cours de la réaction, par exemple le dicyclohexylcarbodumide (DCC).
C) Puis on forme le motif thiourée à partir de Pisothiocyanate obtenu à l'étape précédente de façon à permettre le cas échéant l'introduction d'un autre segment de formule -(CHR)m-. Avantageusement, une diamine de formule H2N-(CHR)m-NH2 , éventuellement protégée, est mise à réagir, sous sa forme neutre ou sous forme de sel d'acide, avec l'isothiocyanate obtenu à l'étape précédente. Cette réaction est effectuée éventuellement en présence d'une base aminée non-nucléophile, par exemple la triéthylamine, l'éthyldiisopropylamine, la triisopropylamine ou encore le 1,8- diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU). On opère de préférence dans un solvant convenant tel que le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou tout autre éther ou solvant compatible, à une température qui peut se situer entre celle des mélanges réfrigérants et la température de reflux du solvant.
Puis on répète séquentiellement et dans l'ordre requis les étapes B) et C) décrites ci-avant, jusqu'à obtention de la structure visée, de manière à introduire le motif désiré en n exemplaires. Pour obtenir des structures branchées, on procède de façon analogue en introduisant au moment opportun la ou les molécule(s) requise (s) pour obtenir une substitution R telle que décrite par la formule (II).
4) Terminaison de la partie polythiourée par introduction du substituant X
La dernière étape permettant la terminaison de la ou des chaîne(s) de type polythiourée consiste en l'introduction du substituant X. Pour cela, on utilise les méthodes classiques de greffage connues de l'homme de l'art choisies en fonction de la nature du substituant X. Par exemple, lorsque X représente un alkyle, on opère en faisant réagir un alkylisothiocyanate, en présence lorsque cela est nécessaire, d'une base aminée non-nucléophile comme par exemple la triéthylamine, l'éthyldiisopropylamine, la triisopropylamine ou encore le 1,8- diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU). La réaction est conduite dans un solvant convenable, par exemple le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou tout autre éther compatible, à une température se situant entre la température des mélanges réfrigérants et la température de reflux du solvant.
Naturellement, lorsque les différents substituants peuvent interférer avec la réaction, il est préférable de les protéger préalablement avec des radicaux compatibles et pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au reste de la molécule. On opère pour cela selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier, et notamment selon les méthodes décrites dans T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, dans McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plénum Press, ou dans P. J. Kocienski, Protecting Groups, Thieme.
Par ailleurs, chaque étape du procédé de préparation peut être suivie, le cas échéant, des étapes de séparation et de purification du composé obtenu selon toute méthode connue de l'homme du métier.
Les composés préférés selon la présente invention sont le 3-(2-"i 3-[2-(3-*i 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl r thiouréido)éthyl] thiouréido féthyl)-l-méthylthiourée ou DT-3TU, qui comprend trois thiourées et répond à la formule (I) dans laquelle laquelle X est un -CH3, m est égal à
2, n est égal 3, R est un hydrogène, l est égal à 0, L = -N(Ri)R2 où Rj= R2 = C14H29, et Y = NH-CO-CH2-CH2.
- le 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl]propionylamino}- éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-thiouréido}-éthyl)-l- méthylthiourée ou DT-4TU qui contient quatre groupements thiourées et répond à la formule générale (I), dans laquelle X est un -CH3, m est égal à 2, n est égal 4, R est un hydrogène, t est égal à 0, L = -N(Rι)R2 où Rι= R2 = C14H29 , et Y = NH-CO-CH2- CH2.
- Le composé 2-(3-'J 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl f>- thiouréido)éthyl] -propane- 1,2-diol ou DT-2TU diol répond à la formule générale (I) dans laquelle X = — ζ
HO OH m = 2; R = H; n= 2; i = 0; L = -N(Rι)R2 où
Figure imgf000014_0001
NH-CO-CH2- CH2.
. Le composé 2-(3-{2-[3 2-{3-β-(3-(ditét^ tbiouιéido}-é^yl 1rιiouréido]-^fhyl}-thiouréido)-éthyl]-propane-l,2-diol ou DT-3TU diol répond à la formule (I) dans laquelle X =
m = 2; R = H; n= 3; -β = 0;
L = -N(Ri)R2 où
Figure imgf000014_0002
R2 = C14H29, et Y = NH-CO-CH2-CH2.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un composé transfectant selon l'invention et un acide nucléique. Les quantités respectives de chaque composant peuvent être ajustées aisément par l'homme du métier en fonction du composé transfectant utilisé, de l'acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides telles que des chiméroplastes ADN/ARN ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc.. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement. En général, ils contiennent au moins 10, 20, 50 ou 100 nucléotides consécutifs, et de préférence au moins 200 nucléotides consécutifs. Encore plus préférentiellement, ils contiennent au moins 500 nucléotides consécutifs.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin, de même que des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes d'expression, etc.. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de réplication procaryote ou eucaryote fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc..
De préférence, l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou plusieurs promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc.. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines et cytokines ainsi que leurs inhibiteurs ou leurs antagonistes : interleukines, interférons, TNF, les antagonistes de l'interleukine 1, les récepteurs solubles de l'interleukine 1 ou du TNFα, etc.. (FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF-B, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc..) les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme, catabolisme etc...
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens ou un ADN codant pour un ARN à fonction de ribozyme, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment pour traiter ou prévenir des infections, par exemples virales ou bactériennes, ou des états cancéreux. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming viras", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes composé transfectant/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un acide nucléique, un composé transfectant tel que défini ci-avant et au moins un adjuvant capable de s'associer aux complexes composé transfectant/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides, protéines ou polymères par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés. Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre à titre d'adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres, qui possèdent notamment la propriété de former des agrégats lipidiques. Le terme « agrégat lipidique » est un terme générique qui inclus les liposomes de tous types (à la fois unilamellaires et multilamellaires) ainsi que les micelles ou encore des agrégats plus amorphes.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), roléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl, -palmitoyl, -mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2). De façon avantageuse, les adjuvants lipidiques utilisés dans le cadre de la présente invention sont choisis parmi DOPE, DOPC ou le cholestérol.
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (par exemple le cerveau) ou d'œufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry). Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20 équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acide nucléique en mol/mol et, plus préférentiellement, de 0,5 à 5 équivalents molaires.
Selon une autre alternative, les adjuvants cités ci-avant permettant d'améliorer le pouvoir transfectant des compositions selon la présente invention, notamment les peptides, les protéines ou certains polymères tels que le polyéthylène glycol, peuvent être conjugués aux composés transfectants selon l'invention, et non pas simplement mélangés. Dans ce cas, ils sont covalemment liés soit au substituant X dans la formule générale (I), soit à l'extrémité de la (des) chaîne(s) alkyle(s) R] et/ou R2 lorsque celles-ci sont des chaînes aliphatiques grasses. Il est également avantageux d'utiliser en tant qu'adjuvant, le polyéthylène glycol lié de manière covalente au cholestérol (chol-PEG). En effet, lorsque ce dernier est conjugué aux composés transfectants selon la présente invention, il permet d'obtenir des particules de tailles réduites, et ainsi d'éviter leur aggrégation et d'augmenter le temps de demi-vie des particules dans la circulation sanguine. La quantité de transfectant par exemple DT- 3 TU utilisé selon la présente invention est telle que les particules ont des tailles inférieures à 500nm. De préférence, la quantité de transfectant, tel que le DT-3TU utilisé est d'au moins 40nmol de lipides DT-3TU/μg d'ADN (voir Exemples 11, 13, et 14, ci-après).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions selon la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoïétiques...). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau etc.). L'élément de ciblage peut être mélangé aux composés transfectants selon l'invention et aux acides nucléiques, et dans ce cas l'élément de ciblage est de préférence lié covalemment à une chaîne alkyle grasse (au moins 10 atomes de carbone) ou à un polyéthylène glycol. Selon une autre alternative, l'élément de ciblage est lié covalemment au composé transfectant selon l'invention, soit au niveau du substituant X, soit sur l'espaceur Y, soit encore à l'extrémité de Ri et/ou R2 lorsque ceux-ci représentent des chaînes aliphatiques grasses. Enfin, l'élément de ciblage peut également être lié à l'acide nucléique comme cela a été précisé précédemment.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les lipides, les neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés. Préférentiellement, il s'agit de sucres, de peptides, de vitamines ou de protéines tels que par exemple des anticorps ou des fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou encore des fragments de récepteurs. Par exemple, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de type lectines cellulaires, de récepteurs au folate, ou de ligands à séquence RGD avec une affinité pour les récepteurs de protéines d'adhésion comme les intégrines. On peut également citer les récepteurs de la transferrine, des HDL et des LDL, ou le transporteur du folate. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des lectines tels que les récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux syalydés tel que le Sialyl Lewis X, ou encore un fragment Fab d'anticorps, ou un anticorps simple chaîne (ScFv).
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés transfectants tels que définis ci-avant pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro, in vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'utilisation des composés transfectants selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une déficience en un produit protéique ou nucléique. Le polynucléotide contenu dans ledit médicament code ledit produit protéique ou nucléique, ou constitue ledit produit nucléique, apte à corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo. Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acides nucléiques utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, soit d'une injection dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le cœur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes, les tissus conjonctifs, etc.
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant selon la présente invention, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1). L'invention concerne en outre une méthode de traitement du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant selon la présente invention, pour former un complexe, et (2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec le complexe formé en (1).
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo). D'une manière générale, la quantité d'acide nucléique destinée à être administrée dépend de très nombreux facteurs tels que par exemple la maladie à traiter ou à prévenir, la nature même de l'acide nucléique, la force du promoteur, l'activité biologique du produit exprimé par l'acide nucléique, de la condition physique de l'individu ou de l'animal (poids, âge ...), du mode d'administration et du type de formulation. En général, l'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 μg d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 50 mg peuvent par exemple être utilisées. L'administration peut être effectuée en dose unique ou répétée par intervalle.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés au composé transfectant selon l'invention et/ou à l'acide nucléique. Alternativement, le ou les adjuvants peuvent être administrés préalablement à 'administration des complexes nucléolipidiques.
Selon une autre alternative avantageuse, les tissus peuvent être soumis à un traitement chimique ou bien physique destiné à améliorer la transfection. Dans le cas du traitement physique, celui-ci peut utiliser des impulsions électriques comme dans le cas de l' électrotransfert, ou bien des foces mécaniques comme dans le cas de la sodoporation. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques in vivo, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à un composé transfectant selon l'invention dans les conditions définies ci-avant.
Les composés transfectants de l'invention sont particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. Il peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoïétiques (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc.), épithéliales etc., sous forme différenciée ou pluripotente (précurseurs).
Un autre objet de la présente invention concerne également les kits de transfection qui comprennent un ou plusieurs composés transfectants selon l'invention et/ou leurs mélanges. De tels kits peuvent se présenter sous forme d'un emballage compartimenté de façon à recevoir différents récipients tels que par exemple des ampoules ou des tubes. Chacun de ces récipients comprend les différents éléments nécessaires pour effectuer la transfection, individuellement ou mélangés : par exemple un ou des composé(s) transfectant(s) selon l'invention, un ou des acide(s) nucléique(s), un ou des adjuvant(s), des cellules, etc..
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Notamment, la demanderesse propose à titre non-limitatif un protocole opératoire ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis en oeuvre pour préparer les composés transfectant selon l'invention. Bien entendu, il est à la portée de l'homme du métier de s'inspirer de ce protocole ou produits intermédiaires pour mettre au point des procédés analogues en vue de conduire à ces mêmes composés.
ABBREVIATIONS UTILISEES BET : bromure d'éthidium DCC : dicyclohexylcarbodumide DPPC : 1 ,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DTTU : 3-(2-<! 3-[2-(3-<i 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl hio- uréido)éthyl]thiouréido ("éthyl)- 1 -méthylthiourée.
Dans le cas où la molécule de DTTU comporte 3 thiourées, elle sera désignée DT- 3 TU, 4 thiourées DT-4TU, et ainsi de suite. EPC : L-α-phosphatidylcholine 95% (oeuf)
PyBOP : hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium TBE : tris-borate-EDTA
TFA : acide trifluoroacétique THF : tétrahydrofurane
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 ; Evolution du taux de fluorescence (en %) en fonction de la quantité de mélange EPC/DT-3TU (en nmoles) par μg d'acide nucléique et en fonction de la quantité d'EPC seul (en nmoles) par μg d'acide nucléique (mélange témoin).
Figure 2 : Evolution du taux de fluorescence (en %) en fonction de la quantité de mélange DPPC/DT-3TU (en nmoles) par μg d'acide nucléique et en fonction de la quantité de DPPC seul (en nmoles) par μg d'acide nucléique (mélange témoin).
Figure 3 : Gel d'agarose (0,8 %/TBE) montrant la compaction du plasmide pXL3031 (μg) en fonction de la quantité de liposome EPC/DT-3TU (en nmoles) utilisée.
Figure 4: Potentiel Zêta (en mV) correspondant au potentiel de surface des liposomes DPPC/DT-3TU-ADN en fonction de la quantité de lipide (nmoles) par μg d'acide nucléique.
Figure 5 : Efficacité de transfection in vitro de cellules HeLa par des complexes formés entre l'ADN et des liposomes DT-3TU/DPPC (1:2), à différents rapports lipide/ADN en nmoles/μg, avec ou sans sérum. L'axe des ordonnées représente l'expression de la luciférase en RLU/μg de protéine. L'axe des abscisses indique la quantité de DT-3TU (en nmoles) par μg d'ADN.
Figure 6 : Niveau de protéines (en absorbance) de cellules HeLa non traitées ou traitées avec des liposomes EPC+DT-3TU/ADN à différents rapports lipide/ ADN en nmoles/μg.
Figure 7: Représentation schématique du plasmide pXL3031.
Figure 8: Gel d'agarose (0,8 % / TBE) montrant la compaction du plasmide pXL3031 (μg) en fonction de la quantité de nanoémulsion DT-3TU/DPPC (en nmoles) utilisée. Figure 9: Gel d'agarose (0,8 % / TBE) montrant la compaction du plasmide pXL3031 (μg) en fonction de la quantité de nanoémulsion DT-3TU/DPPC /Chol- PEG (en nmoles) utilisée.
Figure 10 ; Evolution du pourcentage d'ADN compacté en fonction de la quantité de mélange DT-4TU/DPPC (en nmoles) par μg d'acide nucléique en comparaison avec différentes quantités du mélange DT-3TU/DPPC (en nmoles) par μg d'acide nucléique.
Figure 11 : Gel d'agarose (0,8 % / TBE) montrant la protection du plasmide ρXL3031 (μg) par le mélange de lipides DT-3TU/DPPC vis-à-vis de DNases. L'ADN témoin en présence de DNases a été déposé dans le puits 2, l'ADN en présence de 30, 40 mnol de lipide/μg d'ADN et 40nmol/μg + 6% chol-PEG traités par la DNase ont été déposés dans les puits 3, 4 et 5 respectivement.
Figure 12 : Gel d'agarose (0,8 % / TBE) montrant la protection du plasmide pXL3031 (μg) par le mélange de lipides DT-3TU/DPPC vis-à-vis du sérum. Le puits 1 correspond à l'ADN seul, les puits 2, et 3 à l'ADN seul et en présence de 40nmol/μg de nanoémulsions de DT-3TU/DPPC dans 150mM NaCl puis dans 20%serum (puits 4 et 5) et dans 100% sérum (puits 6 et 7). Figure 13 : Efficacité de transfection in vivo dans le muscle par des complexes formés entre l'ADN et des liposomes DT-3TU/DPPC, à différents rapports lipide/ADN en nmoles/μg avec et sans électrotransfert (e-/e+).
Figure 14 : Biodistribution in vivo chez la souris de complexes DT- 3TU/DPPC/DOPE-Rh/ADN au bout de 30min, lh et 6h dans le sang, les poumons et le système RES. Cette figure montre le caractère furtif de ces particules : 50% de complexes ont été retrouvés après 30 minutes dans la circulation sanguine.
EXEMPLES
Les réactifs et catalyseurs usuels tels que la triéthylamine, l'acide trifluoroacétique, l'acide ?-toluène sulfonique, l'hexafluorophosphate de benzotriazol- 1 -yloxytripyrrolidinophosphonium (PyBOP), dicylclohexylcarbodiimide (DCC), le disulfure de carbone, la tétradécylamine, le di-tert-butyl dicarbonate, la 4- diméthylaminopyridine, ou encore la diisopropyléthylamine sont disponibles commercialement.
Les spectres de Résonance Magnétique Nucléaire du Proton (RMN [H) ont été enregistrés sur des spectromètres Bruker 300, 400 et 600 MHz. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et les multiplicités par les abréviations usuelles.
Dans toute la suite, l'acide nucléique utilisé est le plasmide pXL3031 décrit dans la publication Gène Therapy (1999) 6, pp. 1482-1488, qui contient le gène lue codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus.
Ce plasmide est représenté à la figure 7. Sa taille est de 3671 bp. La solution de plasmide utilisée est dilué à 1,262 g/1 dans de l'eau pour préparation injectable.
EXEMPLE 1 : Synthèse de la DT-3TU Le 3-(2-<j 3-[2-(3-' 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl l>thio- uréido)éthyl] thiouréido ^éthyl)-l-méthylthiourée ou DT-3TU est selon la formule générale (I), dans laquelle: X = -CH3; m — 2; R = H; n= 3;
-β = 0; Y = NH-CO-CH2-CH2, et
L = -N(Ri)R2 où Rι= R2 = C14H29.
a) Synthèse de la ditétradécylamide (1)
Dans un ballon équipé d'un agitateur magnétique relié à un ballon récepteur contenant un agent desséchant (P2O5), sont mélangés 131,6 mmol d'acide tétradécanoïque (30 g) et 140,8 mmol de tétradécy lamine (30 g). Le mélange réactionnel est alors chauffé pendant 4 heures à 170°C sous pression réduite (50 mm Hg). Le brut est ensuite solubilisé dans du THF (700 ml ; chauffer légèrement pour aider à solubiliser) puis on ajoute 4 équivalents de résine Amberlyst-15 (8 g) pour fixer l'excès d'aminé. Après 20 minutes d'agitation, la solution est filtrée puis le filtrat est concentré pour obtenir 55,11 g d'un solide blanc (rendement : 99 %).
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,5 Hz, -CH3), 1,25 (m, 42 H, -CH2-), 1,47 (m, 2H, CO-CH2-CH2), 1,60 (m, 2H, N-CH2-CH2), 2,15 (t, 2H, J=7,5 Hz, CO- CH2), 3,23 (dt, 2H, J=7 Hz, N-CH2), 5,50 (s, 1H, NH). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,09 (C14+C'i3), 22,71 (C13+C'12), 25,90 (C2), 26,99( C3), 29,69 (-CH2-), 31,96 (C12+C'ii), 36,97 (C'i), 39,56 (Ci), 160 (CO).
b) Synthèse de la ditétradécylamine (2)
Dans un ballon équipé d'un réfrigérant et d'un tube desséchant, on dissout 47 mmol de ditétradécylamide (20 g) dans 700 ml de THF anhydre, sous azote. On refroidit le mélange à 0°C puis on ajoute 89 mmol d'hydrare de lithium aluminium LiAlH4 (3,4 g). Après addition, le mélange est ensuite chauffé au reflux pendant 5 heures sous une agitation vigoureuse. La réaction terminée, le mélange est refroidi à 0°C pour réaliser l'hydrolyse par addition successive de 3,4 ml d'eau, 6,8 ml d'hydroxyde de sodium 2N et 3,4 ml d'eau. Après une heure d'agitation à température ambiante, le brut réactionnel est filtré sur Bϋchner et le filtrat est concentré. Le produit obtenu est ensuite purifié sur 1,5 équivalents de résine A- 15 (15 g) dans 300 ml de THF, sous agitation pendant 30 minutes. La résine est filtrée pour être remise en solution dans 300 ml de THF avec ajout de 2 équivalents de triéthylamine (19,2 ml). Après 30 minutes d'agitation, la solution est filtrée et le filtrat est concentré pour obtenir 17,72 g d'un solide blanc (rendement : 92 %).
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,87 (t, 6H, J=6,5 Hz, -CH3), 1,25 (m, 44 H, -CH2-), 1,46 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,58 (t, 4H, J=7 Hz, N-CH2).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,06 (Ci4), 22,69 (C13), 27,48 (C3), 28,29 (C2), 29,69 (C4-C11), 31,96 (C12), 50,15 (Ci).
c) Synthèse de l'acide N,N-ditétradécyIsuccinamique (3)
Dans un ballon sont ajoutés successivement dans 125 ml de dichlorométhane, 12,65 mmol d'anhydride succinique (1,266 g), 12,65 mmol de 4-diméthyl- aminopyridine (1,546 g) et 10,75 mmol de ditétradécylamine (4,407 g). Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures à température ambiante. La réaction achevée, on effectue une extraction avec du dichlorométhane et de l'acide chlorhydrique (IN). Puis la phase organique est lavée avec de la saumure et séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée pour obtenir 4,21 g de produit (3) (rendement : 66 %).
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,85 (t, 6H, J=6,3 Hz, -CH3), 1,23 (m, 44 H, -CH2-), 1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,64 (s, 4H, CO-CH2-CH2-CO), 3,22 (m, 4H, N-CH2). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,08 (C14), 22,69 (C13), 27,74 (C3), 28,10 (CO-CH2- CH2-CO), 28,92 (C2), 29,67 (C4-Cπ), 30,07 (CO-CH2-CH2-CO), 31,95 (C12), 46,21 et 47,98 (d), 4171,46 (CO-NH(C14H29)2), 173,14 (NH-CO).
d) Synthèse de l'ester fert-butylique de l'acide 2-aminoéthylcarbamique (4)
On ajoute goutte à goutte 18,6 mmol de dicarbonate de di-tert-butyle (4 g) à 102,83 mmol d'éthylène diamine (6,17 g) en solution dans du chloroforme (20 ml), sous azote. Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 18 heures à température ambiante. Une fois la réaction achevée, la solution est concentrée. L'huile résultante dissoute dans du dichlorométhane est lavée avec une solution aqueuse saturée en carbonate de sodium. Puis la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée. Le produit brut est purifié par chromatographie éclair (dichlorométhane / méthanol 9 :1). On obtient ainsi 2,38 g de produit (4) (rendement : 80 %).
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,40 (s, 9H, (CH3)3), 1,52 (s, 2H, NH2), 2,59 (t, 2H, J=5,9 Hz, N-CH2), 3,12 (q, 2H, 4J=5,4 Hz, NHBoc-CH2), 5,1 (s, 1H, NHBoc) 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 28,15 (CH3)3, 41,67 (CH2-NHBoc), 43,46 (CH2-NH2), 78,31 (C-(CH3)3, 156,21 (C=O).
e) Synthèse de l'ester fert-butylique de l'acide 2-[3-(ditétradécyIcarbamoyl)- propionylamino]éthylcarbamique (5)
On ajoute successivement 8,84 mmol de PyBOP (4,601 g), 9,72 mmol de l'aminé (4) obtenue à l'étape précédente (1,558 g) et 24,31 mmol de diisopropyléthylamme (4,24 ml) à une solution de 8,84 mmol de l'acide (3) obtenu précédemment (4,5 g) dans 88 ml de dichlorométhane. La solution est alors agitée pendant 4 heures à température ambiante. En fin de réaction, le mélange réactionnel est filtré puis le produit est purifié par chromatographie éclair (heptane/acétate d'éthyle 5 :5 puis heptane/acétate d'éthyle 2 :8). On obtient ainsi 3,79 g de l'ester (5) (rendement : 66 %).
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,87 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,25 (m, 44H, -CH2-), 1,43 (s, 9H, (CH3)3) 1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,56 (t, 2H, J= 6, 7 Hz, CH23), 2,69 (t, 2H, J= 6,2 Hz, CH24), 3,28 (m, 4H, N-CH2), 3,3 (m, 4H, CH21+ CH22). 13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 14,07 (C"14), 22,56 (C"13), 26,99 ((CH3)3), 27,73 (C"3), 28,29 (C2), 28,59 (C"2), 29,27 (C"4-C"„), 29,55 (C3), 31,41 (C"12), 39,85 (C2), 40,39 (d), 46,21 et 47,98 (C"ι), 78,77 (C(TV)-Boc), 156,33 (CO-Boc), 171,46 (CO-NH(C14H29)2), 173,14 (d).
f) Synthèse du 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyIamine (6) À 2,44 mmol de l'ester (5) obtenu à l'étape précédente (1,59 g) est ajouté 12,2 mmol de TFA distillé (0,94 ml). Au bout de deux heures, la réaction est totale. Le produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à froid. Le rendement est quantitatif.
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,91 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,29 (m, 44 H, -CH2-), 1,51 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,59 (t, 2H, J= 6, 7 Hz, H'3), 2,71 (t, 2H, J= 6,2 Hz, H'3), 3,29 (m, 4H, N-CH2), 3,31 (m, 4H, Hi, H2).
13C RMN (CDCI3) : : δ (ppm) 14,00 (C"14), 22,67 (C\3), 27,35 (C''3), 27,95 (C2), 28,53 (C2), 29,65 (C"4-C"„), 30,70 (C3), 31,94 (C"12), 37,83 (C2), 40,08 (C2), 47,85 et 49,42 (C"!), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,26 (d).
g) Synthèse du ((l,l-diméthyléthoxycarbonyl)amino)éthylisothiocyanate (7)
Dans un ballon, on ajoute successivement 43,69 mmol de DCC (9,015 g), 297,9 mmol de disulfure de carbone (17,9 ml) dans 27,5 ml de THF. Le mélange est refroidi à -7°C avec un bain de glace et de chlorure d'ammonium NH4C1 (4/1). On ajoute ensuite goutte à goutte 43,69 mmol l'aminé (4) précédemment obtenue (7 g) dissout dans 20,5 ml de THF anhydre, pendant 30 minutes. On laisse le mélange revenir à température ambiante et on laisse agiter pendant 21 heures. Après évaporation, on additionne du diéthyl éther pour précipiter la dicyclohexylurée formée. La solution est filtrée, le filtrat est concentré puis purifié par chromatographie éclair (heptane/acétate d'éthyle 80 : 20) pour obtenir 6,357 g de produit (7) souhaité (rendement : 72 %).
H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,38 (s, 9H, (CH3)3), 3,31 (q, 2H, 4J= 5,8 Hz, NHBoc- CH2), 3,59 (t, 2H, J= 5,6 Hz, S=C=N-CH2), 5,16 (s, 1H, NHBoc) 13C RMN (CDCI3) : : δ (ppm) 28,54 ((CH3)3), 41,03 (CH2-NHBoc), 45,53 (CH2- N=C=S), 79,71 (C-(CH3)3, 132,72 (C=S), 156,21 (C=O).
h) Synthèse de l'ester tert-butylique de l'acide 2-(3-"{ 2-[3-(ditétradécyl- carbamoyl)propionylamino]éthyl |'thiouréido)éthyl carbamique (8) À 2,44 mmol de l'aminé (6) précédemment obtenue (1,62 g) on ajoute directement 9,76 mmol de triéthylamine (1,36 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 24,4 ml de dichlorométhane et 2,92 mmol de l'isothiocyanate (7) obtenu à l'étape précédente (0,59 g). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par chromatographie éclair (acétate d'éthyle/heptane 6 :4 puis 100 % d'acétate d'éthyle). On obtient ainsi 1,343 g de l'ester (8) souhaité (rendement : 73 %).
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,67 (t, 6H, J=6,4 Hz, -CH3), 1,05 (m, 44 H, -CH2-), 1,26 (s, 9H, CH3)3), 1,35 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,31 (m, 2H, H3'3), 2,49 (m, 2H, H3'3), 3,06 (m, 4H, N-CH2), 3,11 (m, 4H, Hi, H"2), 3,47 (m, 4H, H2, H"ι), 7,14 (2H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 13,95 (C4'14), 22,57 (C4'13), 26,92 ((CH3)3), 27,07 (4'C3), 27,78 (C3'2), 28,39 (C4'2), 28,82 (C3'3), 29,55 (C4'4-C4'l l), 31,83 (C4'12), 39,45 (C"2), 43,63 (C2 et C" , 46,39 et 48,16 (C4'i), 79,24 (C(IV)-Boc), 156,53 (CO-Boc), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,71 (C3' , 182,97 (C=S).
i) Synthèse de la 2-(3- 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl r- thiouréido)éthyl aminé (9)
À 1,98 mmol du produit (8) obtenu à l'étape précédente (1,5 g) est ajouté 9,86 mmol de TFA distillé (0,76 ml). Au bout de 3 heures, la réaction est totale. Le produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à froid. Le rendement est quantitatif.
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,67 (t, 6H, J=6,4 Hz, -CH3), 1,05 (m, 44 H, -CH2-), 1,26 (s, 9H, CH3)3), 1,31 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,31 (m, 2H, H3'3), 2,49 (m, 2H, H3'3), 3,06 (m, 4H, N-CH2), 3,11 (m, 4H, Hi, H"2), 3,44 (m, 4H, H2, H"ι), 7,10, (2H, H thiourée).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 13,85 (C4'14), 22,49 (C4'13), 27,01 (C4'3), 27,72 (C3'2), 28,29 (C4'2), 28,79 (C3'3), 29,49 (C4'4-C4'π), 31,77 (C4'12), 39,42 (C"2), 43,75 (C2 et C"i), 46,29 et 48,09 (C4'i), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,71 (C3'i), 182,97 (C=S). j) Synthèse de l'ester fert-butylique de l'acide 2-\ 3-[2-(3-<{ 2-[3-(ditétradécyl- carbamoyl)propionylamino]éthyl }'thiouréido)éthyl]thiouréido J'éthyl carbamique (10)
À 1,98 mmol de l'aminé (9) obtenue à l'étape précédente (1,47 g) on ajoute directement 7,92 mmol de la triéthylamine (1,1 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 19,8 ml de dichlorométhane et 2,38 mmol de l'isothiocyanate (7) précédemment obtenu (0,461 g) et on laisse réagir à température ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par chromatographie éclair (acétate d'éthyle/heptane 6 :4 puis acétate d'éthyle/méthanol 98 :2). On obtient 1,136 g du produit (10) souhaité (rendement : 67 %).
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,74 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,12 (m, 44 H, -CH2-), 1,30 (s, 9H, CH3)3), 1,45 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,41 (m, 2H, H5'2), 2,58 (m, 2H, H5'2), 3,12 (m, 4H, N-CH2), 3,25 (m, 4H, Hi, H4'2), 3,56 (m, 8H, H2, H"ι, H"2, H4' , 7,14 (4H, H thiourée).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,06 (C6'ι4), 22,57 (C6' 13), 27,11 (C6' 3), 26,93 ((CH3)3), 27,79 (C5'2), 28,38 (C6' 2), 28,81 (C5'3), 29,56 (C6' 4-C6 π), 31,83 (C6'ι2), 39,55 (C4'2), 43,66 (C2, C"ι, C"2, C4'0, 46,49 et 48,23 (C6 ), 79,28 (C(IV)-Boc), 156,61 (CO- Boc), 171,96 (CO-NH(C14H29)2), 173,72 (C5'0, 182,93 (C≈S).
k) Synthèse de la 2-\ 3-[2-(3-*i 2-[3-(ditétradécylcarbamoyι)propionylamino]- éthyl|,thiouréido)éthyI]thiouréido éthyl aminé (11)
À 1,15 mmol du produit (10) obtenu à l'étape précédente (1 g) est ajouté 5,84 mmol de TFA distillé (0,45 ml). Au bout de 3 heures, la réaction est totale. Le produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à froid. Le rendement est quantitatif.
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,85 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,25 (m, 40 H, -CH2-), 1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 1,52 (m, 4H, N-CH2-CH2-CH2), 2,65 (m, 2H, H5'2), 2,77 (m, 2H, H5'3), 3,26 (m, 4H, N-CH2), 3,43 (m, 4H, Hl5 H4'2), 3,85 (m, 8H, H2, H"l5 H"2, H4'0, 7,44 (4H, H thiourée). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,05 (C6 4), 22,68 (C6' 13), 27,05 (C6' 3), 27,58 (C5'2), 28,71 (C6' 2), 29,36 (C5'3), 29,67 (C6' 4-C6 π), 31,94 (C6' 12), 40,49 (C5' , 43,49 (C en α de C=S), 47,40 et 49,07 (C6' , 172,16 (CO-NH(C14H29)2), 174,00 (NH-CO), 182,73 (OS).
1) Synthèse de la DT-3TU (12)
À 0,28 mmol de l'aminé (11) obtenue à l'étape précédente (0,24 g) on ajoute directement 1,12 mmol de triéthylamine (0,16 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 2,8 ml de dichlorométhane et 0,34 mmol de méthylisothiocyanate (0,024 g) et on laisse réagir à température ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) sur une colonne C4 avec le gradient suivant : initialement un mélange eau/méthanol 95 :5 jusqu'à 100 % de méthanol. Le produit obtenu est à nouveau purifié sur une petite colonne de silice (acétate d'éthyle/heptane 80 :20 puis 100 % d'acétate d'éthyle). On obtient ainsi 118 mg de DTTU (rendement : 51 %).
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,86 (t, 6H, J=6, 7Bz, -CH3), 1,24 (m, 40 H, -CH2-), 1,44 (m, 4H, N-CH2-CH2), 1,54 (m, 4H, N- CH2-CH2-CH2), 2,52 (m, 2H, H6'2), 2,67 (m, 2H, H6'2), 3,05 (m, 3H, -CH3 terminal), 3,21 (m, 4H, N-CH2), 3,32 (m, 2H, H5'2), 3,75 (m, 10H, H'i, H'2, H3'ι, H3'2, H5'0, 7,14 (6H, H thiourée). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,09 (C7'14), 22,69 (C7'13), 27,24 (C7'3), 27,89 (C6'2), 28,87 (C7'2), 29,38 (C6'3), 29,67 (C7'4-C7'π), 31,26 (CH3 terminal), 31,94 (C7'12), 39,71 (C5'2), 43,63 (d, C2, C3'ι, C3'2, C5'0, 46,67 et 48,40 (C7'0, 172,16 (CO- NH(C14H29)2), 174,00 (C6'0, 182,73 (C=S).
EXEMPLE 2 : Synthèse de la DT-4TU
Le DT-4TU ou du 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl] propionylamino}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-thiouréido}- éthyl )-l-méthylthiourée. Le DT-4TU est selon la formule générale (I), dans laquelle: X = -CH3; m = 2; R = H; n= 4; = 0; Y = NH-CO-CH2-CH2; et L = -N(R0R2 où Rλ= R2 = C14H2 .
Pour synthétiser la DT-4TU, on procédera de même à partir de l'aminé (11). a) Synthèse de l'ester ^-butyKque de l'acide 2-(3-{2-[3^{3-[2^3-(ditélradécyl- carf)amoyI)propionyIamino)-éthy^ carbamique (13)
Figure imgf000034_0001
A l'aminé (11) (0,8 g, ,92 mmol) , on ajoute de la triéthylamine (0,643 ml, 4,6 mmol) et on laisse agiter pendant 15 min. Ensuite on ajoute le CH2C12 (9,2mL). On additionne ensuite l' isothiocyanate (7) (0,224 g, 1,104 mmol) et on laisse réagir à t.a. en agitant pendant 20h. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par chromatographie (acétate d'éthyle/heptane 8:2 puis acétate d'éthyle/méthanol 90 : 10) ; On obtient 252 mg du produit souhaité (rendement : 46%).
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,86 (t, 6H, J=6 Hz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,42 (s, 9H, CH3)3), 1,45 (m, 4H, H-2'), 2,55 (m, 2H, H-2), 2,69 (m, 2H, H-3), 3,22 (m, 4H, H-l'), 3,31 (m, 4H, H-5 et H-15), 3,74 (m, 12H, H-6, H-8, H-9, H-l l, H- 12, H- 14), 7,31 (6H, H thiourée). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,66 (C-13'), 27,21 (C-3'), 27,88 (C-2), 28,50 ((CH3)3), 28,87 (C-2'), 29,64 (C-4'-C-l l')5 31,27 (C-3), 31,92 (C-12'), 39,639 (C-5), 40,44 (C-13), 43,73 (C-6, C-8, C-9, C-l l, C-12, C-14), 46,64 et 48,38 (C-l'), 79,10 (C-17), 156,63 (C-16), 172,35 (C-l), 174,04 (C-4), 182,65 (C-7, C-10, C-13).
b) Synthèse de la 2-(3-{2-[3-(2-{3-[2-(3-(ditétradécyl-carbamoyl) propionylamino)-éthyl]-thiouréido}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)- éthyl aminé (14)
Figure imgf000035_0001
À l'aminé boc (13) obtenu à l'étape précédente (0,22 g, 0,23 mmol) est ajouté du TFA distillé (0,142 ml, 1,84 mmol). Au bout de 6 heures, la réaction est totale. Le produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à froid et mis au dessicateur sur pastilles de soude pour la nuit. Le rendement est quantitatif.
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,74 (t, 6H, J=6,6 Hz, H-14'), 1,12 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,45 (m, 4H, H-2'), 2,41 (m, 2H, H-2), 2,58 (m, 2H, H-3), 3,12 (m, 4H, H-l'), 3,25 (m, 4H, H-5 et H-l 5), 3,56 (m, 12H, H-6, H-8, H-9, H-l l, H- 12, H-14), 7,14 (6H, H thiourée). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,57 (C-13'), 27,11 (C-3'), 27,79 (C-2), 28,38 (C-2'), 28,81 (C-4'-C-l l'), 29,56 (C-3), 31,83 (C-12'), 39,55 (C-5, C-9), 43,66 (C-6, C-8, C-9, C-l l, C-12, C-14), 46,49 et 48,23 (C-l'), 171,96 (C-l), 173,72 (C-4), 182,93 (C-7, C-10, C-13).
c) Synthèse de la 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl] propionylamino}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-thiouréido}- éthyl )-l-méthylthiourée (DT-4TU) (15)
Figure imgf000035_0002
À 0,23 mmol de l'aminé (14) obtenue à l'étape précédente (0,224 g) on ajoute directement 1,38 mmol de triéthylamine (0,19 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 2,3 ml de dichlorométhane et 0,46 mmol de méthylisothiocyanate (0,034 g) et on laisse réagir à température ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par chromatographie éclair (100 % acétate d'éthyle puis acétate d'éthyle/méthanol 95 :5). On obtient ainsi 109 mg de DT4TU (rendement : 51 %).
XH RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,45 1,45 (m, 4H, H-2'), 1,58 (m, 4H, H-3'), 2,57 (m, 2H, H-2), 2,73 (m, 2H, H- 3), 3,03 (m, 3H, H-17), 3,23 (m, 4H, H-l'), 3,31 (m, 2H, H-5), 3,73 (m, 14H, H-6, H- 8, H-9, H-l l, H-12, H-14, H-15), 7,14 (8H, H thiourée). 13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,09 (C-14'), 22,69 (C-13'), 27,24 (C-3'), 27,89 (C-2), 28,87 (C-2'), 29,38 (C-3), 29,67 (C-4'-C-l l'), 31,26 (C-17), 31,94 (C-12'), 39,71 (C-5), 43,63 (C-6, C-8, C-9, C-11, C-12, C-14, C-15), 46,67 et 48,40 (C-l'), 172,16 (C-l), 174,00 (C-4), 182,73 (C-7, C-10, C-13, C-16).
EXEMPLE 3: Synthèse de la DT-2TU diol
Le composé 2-(3-<! 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl r- thiouréido)éthyl] -propane- 1,2-diol ou DT-2TU répond à la formule générale (I) dans laquelle X = / —^~
HO OH
m = 2;
R = H; n= 2;
1 = 0;
Y = NH-CO-CH2-CH2; et L = -N(R1)R2 où R1= R2 = C14H29.
a) Synthèse du 4-isothiocyanatométhyl-2,2-diméthyl~[l,3] dioxalane (16)
Figure imgf000037_0001
Dans un ballon, on ajoute successivement le DCC (3,146 g, 15,25 mmol), le disulfure de carbone (6,253 ml, 104,005 mmol) dans du THF (9,6075 mL). Le mélange est refroidit à -7°C avec un bain de glace/NH4Cl (4/1). On ajoute ensuite le 2,2- diméthyl-l,2-dioxalane-4-methanamine (2 g, 15,25 mmol) dissout dans du THF anhydre (7,1675 mL) goutte à goutte pendant 30 minutes. On laisse le mélange revenir à température ambiante et on laisse agiter pendant 21 H. Après évaporation, on additionne du diethyl éther. On filtre, on évapore et le mélange est chromatographie.
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,33 et 1,44 (s, 3H, H-5, H-6), 3,57 (dd, IH, J = 4,8 Hz, J = 14,4 Hz, H-l),3,69 (dd, IH, J = 4,9 Hz, J = 14,4 Hz, H-l'), 3,80 (dd, IH, J = 5,4 Hz et J = 8,7 Hz, H-3), 4,09 (dd, IH, J = 6,3 Hz, et J = 8,7 Hz, H-3), 4,28 (m, IH, H- 2).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 25,17, 26,77 (C-5, C-6), 47,49 (C-l), 66,55 (C-3), 73,70 (C-2), 110,29 (C-4), 132,76 ( =C=S).
b) Synthèse de la 2-(3-<J 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino] éthyl hiouréido)éthyI-4-ylméthyl-2,2-diméthyl-[l,3]dioxalane (17)
Figure imgf000037_0002
À 0,19 mmol de l'aminé (9) obtenue à l'étape précédente (0,146 g) on ajoute directement 0,95 mmol de diisopropyléthylamme (0,165 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 1,9 ml de dichlorométhane et 0,209 mmol de l'isothiocyanate (16) (0,027 g) et on laisse réagir à température ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié sur cartouche en phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le produit (17) est obtenu avec un rendement de 49%. πH RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=(5,3Hz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,34 et 1,43 (s, 3H, H- 15, H- 16), 1,48 (m, 4H, H-2'), 1,56 (m, 4H, H-3'), 2,52 (m, 2H, H-2), 2,68 (m, 2H, H-3), 3,23 (m, 4H, H-l'), 3,37 (m, 2H, H-5), 3,73 (m, 8H, H-6, H-8, H-9, H-l l), 4,05 ( m, 2H, H-13), 4,33 (m, IH, H-12), 7,14 (4H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'),27,00 et 27,17 (C-15, C-16), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-ll'), 31,25 (C-17), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9), 44,53 (C-11), 46,73 et 47,13(C-1'), 66,87 (C-136), 74,62 (C-12), 109,05 (C-14), 172,21 (C-l), 174,14 (C- 4), 183,32 (C-7, C-10, C-13, C-16).
c) Synthèse de la [2-(3-^ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino] éthyl f- thiouréido)éthyl]-propane-l,2-diol (DT-2TUdiol) (18)
Figure imgf000038_0001
On dissout le diol protégé (17) (0,05 g, ,05 mmol) dans 1 mL de solution HCL 1N/THF (1/1) à t.a; le mélange est agité pendant 18h. le brut est ensuite extrait avec par du dichlorométhane ( 2x 5 ml). Les phases organiques sont rassemnlées puis neutraliées par une solution d' hydrogénicarbonate de sodium. Les phases aqueuses sont extraites par du dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées puis séchées sur sulfate de mgnésium puis évaporéées. Le brut est chromatographie sur phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le produit (18) est obtenu avec un rendement de 49%.
UH RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Ηz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,43 (m, 4H, H-2'), 1,59 (m, 4H, H-3'), 1,79 (s, 2H, OH), 2,50 (m, 2H, H-2), 2,70 (m, 2H, H-3), 3,24 (m, 4H, H-l'), 3,39 (m, 2H, H-5), 3,72 (m, 6H, H-6, H-8, H- 9), 3,9 (m, 2H, H-l l), 4,22 ( m, 2H, H-13), 4,58 (m, IH, H-12), 7,14 (4H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-l l'), 31,25 (C-l 7), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9), 45,86 (C-11), 46,73 et 47,13 (C-l'), 63,54 (C-13), 70,97 (C-12), 172,21 (C-l), 174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10).
EXEMPLE 4: Synthèse de la DT-3TU diol Le composé 2-(3-{2-[3-(2-{3-[2^3-(dilétiH^ éxhyl)-t oιxιéido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-propane-l,2-diol ou DT-3TU diol répond à la formule (I) dans laquelle X = , — < ~
HO OH m = 2; R = H; n= 3;
£ = 0;
Y = NH-CO-CH2-CH2; et
L = -N(Rι)R2 où Rι= R2 = C14H29.
Pour synthétiser la DT-3TU diol , on procédera de même à partir de l'aminé (11). a) Synthèse de la 2^3-{2-[3-(2-{3-[2-(3-(d ιmléc^ é^yIj-thiouréido}-éthyI)-tiriouréido]-émyl}-thiouréido)-éthyl-4-ylméthyl-2,2 [l,3]dioxalane (19)
Figure imgf000039_0001
À 0,19 mmol de l'aminé (11) obtenue à l'étape précédente (0,165 g) on ajoute directement 0,95 mmol de diisopropyléthylamme (0,165 ml) et on laisse agiter pendant 15 minutes. On additionne ensuite 1,9 ml de dichlorométhane et 0,209 mmol de l'isothiocyanate (16) (0,027 g) et on laisse réagir à température ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié sur cartouche en phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le produit (19) est obtenu avec un rendement de 49%.
1H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Uz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,34 et 1,43 (s, 3H, H-18, H-19), 1,48 (m, 4H, H-2'), 1,56 (m, 4H, H-3'), 2,52 (m, 2H, H-2), 2,68 (m, 2H, H-3), 3,23 (m, 4H, H-l'), 3,37 (m, 2H, H-5), 3,73 (m, 12H, H-6, H-8, H-9, H-l l, H-12, H-14), 4,05 ( m, 2H, H-16), 4,33 (m, IH, H-15), 7,14 (6H, H thiourée). 13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'),27,00 et 27,17 (C-l 8, C-19), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-l l'), 31,25 (C-17), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9, C-11), 44,53 (C-14), 46,73 et 47,13(C-1'), 66,87 (C-16), 74,62 (C-15), 109,05 (C-17), 172,21 (C-l), 174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10, C-13, C-16).
b) Synthèse de la 2-{3-{2-[3^{3-[2 3-(ditéιrad&^^ é^yI]-tMouréidoî-é^hyl tMouréido]-émyl}-thiouréido)-éthyI]-propane-l,2-diol (DT- 3Tudiol) (20)
Figure imgf000040_0001
On dissout le diol protégé (19) (0,05 g, ,05 mmol) dans 1 mL de solution
HCL 1N/THF (1/1) à t.a; le mélange est agité pendant 18h. le brut est ensuite extrait avec par du dichlorométhane ( 2x 5 ml). Les phases organiques sont rassemnlées puis neutraliées par une solution d' hydrogénicarbonate de sodium. Les phases aqueuses sont extraites par du dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées puis séchées sur sulfate de mgnésium puis évaporéées. Le brut est chromatographie sur phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le produit (20) est obtenu avec un rendement de 55%.
1H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 6H, J=c5,3Hz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H- 11'), 1,43 (m, 4H, H-2'), 1,59 (m, 4H, H-3'), 1,79 (s, 2H, OH), 2,50 (m, 2H, H-2), 2,70 (m, 2H, H-3), 3,24 (m, 4H, H-l'), 3,39 (m, 2H, H-5), 3,72 (m, 10H, H-6, H-8, H-9, H-l l, H-12), 3,9 (m, 2H, H-14), 4,22 ( m, 2H, H-16), 4,58 (m, IH, H-15), 7,14 (6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : δ (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-l l'), 31,25 (C-17), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9, C-11), 44,53 (C-14), 46,73 et 47,13(C-1'), 63,54 (C-16), 70,97 (C-15), 109,05 (C-17), 172,21 (C-l), 174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10, C-13, C-16).
EXEMPLE 5 : Compaction de l'acide nucléique en présence de DT-3TU (12)
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de fluorescence au bromure d'éthidium : l'absence de fluorescence témoigne de l'absence d'acide nucléique libre ce qui signifie que l'acide nucléique est compacté par le composé transfectant.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de DT-3TU
(12), par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 μl de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 μg/ml dans une solution de chlorure de sodium à 150 mM avec des quantités croissantes de DT-3TU (12).
De la même façon, un contrôle a été réalisé en mettant l'acide nucléique en présence de quantités croissantes d'EPC (voir Figure 1) ou de DPPC (voir Figure 2), par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 μl de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 μg/ml dans une solution de chlorure de sodium à 150 mM avec des quantités croissantes d'EPC ou de DPPC (Figures 1 et 2 respectivement) . La fluorescence au bromure d'éthidium est mesurée au fil du temps (mesure à 20°C) en utilisant un FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 260 nm et 590 nm respectivement. Les largeurs de fentes pour l'excitation et l'émission sont réglées à 5 nm. La valeur de fluorescence est enregistrée après ajout de 3 μl de bromure d'éthidium à 1 g/1 par ml de solution ADN/lipide (à 0,01 mg d'ADN/ml).
Les résultats sont résumés dans les Figures 1 et 2.
Dans la Figure 1, la courbe incluant des carrés montre que l'ajout d'une quantité croissante de mélange lipidique DT-3TU / EPC (0,75 à 20 nmoles de DT- 3 TU) par rapport à une quantité fixée d'acide nucléique (8 μg) induit une diminution de la fluorescence liée à la réduction de l'insertion du bromure d'éthidium entre les paires de base de l'ADN. Ceci indique que l'association entre les liposomes DT- 3TU/EPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir jusqu'à 90 % d'exclusion de fluorescence soit 90 % d'association ADN-lipides DT-3TU/EPC. Afin de montrer le rôle actif du lipide DT-3TU dans cette association lipides/ ADN, un contrôle a été réalisé. Il consiste à observer l'interaction entre le lipide EPC et l'ADN, ceci est représenté par la courbe contenant des losanges. Lorsque l'EPC est mise en contact avec de l'ADN dans des conditions identiques à celles utilisées pour l'étude des complexes DT- 3TU/EPC-ADN, seule une faible diminution de fluorescence est observée (environ 5%), qui peut être attribuée à l'augmentation de la turbidité du mélange. Ce contrôle reflète donc l'absence d'association de l'EPC seule avec l'ADN dans les conditions expérimentales pré-citées.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à s'associer à l'acide nucléique.
De la même façon, dans la Figure 2, la courbe incluant des carrés montre que l'ajout d'une quantité croissante de mélange lipidique DT-3TU / DPPC (0,75 à 20 nmoles de DT-3TU) par rapport à une quantité fixée d'acide nucléique (8 μg) induit une diminution de la fluorescence lorsqu'une quantité identique de bromure d'éthidium est ajoutée aux différents échantillons. Ceci indique que l'association entre les liposomes DT-3TU/DPPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir jusqu'à 90 % d'exclusion de fluorescence soit 90 % d'association ADN-DT-3TU/DPPC. Afin de montrer le rôle actif du lipide DT-3TU dans cette association lipides/ ADN, un contrôle a été réalisé. Il consiste à observer l'interaction entre le lipide DPPC et l'ADN, ceci est représenté par la courbe contenant des losanges. Lorsque la DPPC est mise en contact avec de l'ADN dans des conditions identiques à celles utilisées pour l'étude des complexes DT-3TU/DPPC-ADN, seule une faible diminution de fluorescence est observée (environ 5%). Ce contrôle reflète donc l'absence d'association de la DPPC seule avec l'ADN dans les conditions expérimentales précitées.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à s'associer avec l'acide nucléique.
EXEMPLE 6 : Compaction de l'ADN par des complexes DT-3TU EPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à compacter les acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas sujet à un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE IN) ont été déposés différents échantillons ADN/DT-3TU comportant des quantités croissantes de lipide
DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 70 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN. Les résultats sont représentés dans la Figure 3.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADΝ lorsqu'il n'est pas associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est associé aux lipides. Les puits 2 à 6 représentent l'ADΝ (0,01 g/1) associé à des quantités croissantes de liposomes DT-3TU/EPC : 0,75 puis 5 puis 10 puis 15 et enfin 20 nmoles de lipide DT-3TU. La comparaison entre le puits 1 et les autres puits indique que plus on augmente la quantité de lipide DT-3TU, plus l'ADΝ est retenu sur gel pour être totalement retardé à partir de 3 nmoles de DT-3TU/μg d'ADN, zone d'agrégation des complexes. Les puits 8 à 13 correspondent respectivement à l'ADN seul (0,lg/l,lμg pour le gel), les lipoplexes formés à la concentration de 0,1 g/1 d'ADN aux rapports lipide/ADN : 0,75 ou 5 ou 10 ou 15 et enfin 20 nmoles/μg d'ADN. De la même façon, on peut observer qu'à cette concentration d'ADN compatible avec des expériences in vivo, l'ADN est compacté dès le rapport 5 nmoles lipide/μg d'ADN.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à compacter l'acide nucléique.
EXEMPLE 7 : Mesure du potentiel Zêta des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à compacter les acides nucléiques tout en conservant une structure globalement anionique, neutre, ou très faiblement cationique.
Ceci peut être démontré par une mesure de potentiel Zêta : la mesure donnée en mV témoigne de la charge de surface de la particule relative à la mobilité électrophorétique de l'échantillon.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de mélange lipidique DT-3TU/EPC par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 2 ml de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01g /l dans une solution de chlorure de sodium à 20 mM avec des quantités croissantes de DT-3TU.
La mesure de potentiel Zêta (mV) est réalisée en utilisant un zetasizer 3000 Hsa (Malvern). La valeur du potentiel est réalisée 3 fois de suite sur 2 ml d'échantillon DT-3TU/EPC-ADN. Les résultats sont résumés dans la figure 4.
Les liposomes DT-3TU/EPC sont ajoutés à l'ADN dans une zone allant de 0,75 nmoles à 20 nmoles de lipides par μg d'ADN. Dans cette zone de variation de la quantité de lipide, le potentiel Zêta varie de -35 mV à +15 mV. La partie négative correspond à ce qui est montré dans les Figures 1, 2 et 3, à savoir que le potentiel Zêta est négatif lorsque l'ADN n'est pas totalement compacté. Plus on ajoute de lipide, plus l'ADN est compacté et plus le potentiel Zêta se rapproche de zéro, les lipoplexes présentent alors un potentiel de surface quasiment nul. Le potentiel Zêta devient ensuite légèrement positif vers 8 mnoles de lipide/μg d'ADN. La relativité de cette mesure doit tenir compte de la comparaison des différents échantillons au cours d'une même expérience. Il est ainsi important de noter l'évolution du potentiel Zêta en fonction de l'augmentation de la quantité de lipide jusqu'à une valeur faiblement positive.
Cet exemple confirme ainsi la compaction de l'ADN par les composés transfectants selon la présente invention, notamment le DT-3TU, et montre que les lipoplexes formés présentent un potentiel de surface proche de la neutralité.
EXEMPLE 8 : Transfection in vitro des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à transfecter des cellules in vitro.
Cette étude a été menée pour des lipoplexes comprenant différentes quantités de DT-3TU : 1,5 ou 5 ou 10 ou 15 ou 20 nmoles de DT-3TU / μg d'ADN. Chacune de ces conditions a été testée avec et sans sérum de veau fœtal (« + Sérum » ou « — Sérum ») Culture des cellules : des cellules HeLa (American type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA) dérivées d'un carcinome d'epithélium cervical humain, sont mises en culture en présence d'un milieu de type MEM (« minimum essential médium ») avec addition de 2 mM de L-glutamine, 50 unités/ml de pénicilline, et 50 unités/ml de streptomycine. Le milieu et les additifs proviemient de Gibco/BRL life Technologies (Gaithersburg, MD,USA). Les cellules sont cultivées en flacons à 37°C et à 5 % de dioxyde de carbone en incubateur.
Transfection : un jour avant la transfection, les cellules HeLa sont transférées dans des plaques 24 puits avec un nombre de cellules de 30000 à 50000 par puits. Ces dilutions représentent approximativement 80% de confluence après 24 heures.
Pour la transfection, les cellules sont lavées deux fois et incubées à 37°C avec 500 μl de milieu avec sérum (10 % S VF v/v ) ou sans sérum.
50 μl de complexes contenant 0,5 μg d'ADN plasmidique sont ajoutés dans chaque puit (les complexes sont préparés au moins 30 minutes avant l'ajout dans les puits). Après deux heures à 37°C les plaques sans sérum sont complémentés avec 10 % (v/v) de SVF (« Sérum de Veau Fœtal »).
L'ensemble des plaques est placé 24 heures à 37°C et à 5 % de dioxyde de carbone.
Détermination de l'activité luciférase : Brièvement, les cellules transfectées sont lavées deux fois avec 500 μl de PBS (tampon phosphate) puis lysées avec 250 μl de réactif (Promega cell culture lysis reagent, du kit Luciférase Assay System).
Un aliquote de 10 μl de surnageant du lysat centrifugé (12000 x g) 5 minutes à 4°C est mesuré au luminomètre Wallac Victor2 (1420 Multilabel coûter). L'activité luciférase est dosée par l'émission de lumière en présence de luciférine, de coenzyme A et d'ATP pendant 10 secondes et rapportée à 2000 cellules traitées. L'activité luciférase est ainsi exprimée en Unité de Lumière Relative (« RLU » : « Relative light unit ») et normalisée avec la concentration de protéines de l'échantillon obtenue par l'utilisation d'un kit Pierce BCA (Rockford, IL, USA).
Les résultats résumés dans la Figure 5 montrent une efficacité de transfection optimale pour les lipoplexes comprenant 5 ou 10 nmoles de DT-3TU par μg d'ADN. La présence de sérum induit une faible inhibition de la transfection dans tous les cas.
EXEMPLE 9 : détermination de la toxicité des lipoplexes DT-3TU/ADN vis-à-vis des cellules
Le but de cet exemple est d'illustrer l'absence de toxicité des composés transfectants selon l'invention.
Le niveau de protéine est mesuré après transfection. Le protocole de transfection est identique à celui décrit pour l'exemple 8.
Détermination du niveau de protéine : Brièvement, les cellules transfectées sont lavées deux fois avec 500 μl de PBS (tampon phosphate) puis lysées avec 250 μl de réactif (Promega cell culture lysis reagent, du kit Luciférase Assay System).
Un aliquote de 50 μl de surnageant du lysat centrifugé (12000 x g) 5 minutes à 4°C est transféré dans un tube en présence de 50 μl d'iodoacétamide 0,1 M, d'acide chlorhydrique tris 0,1 M à pH 8,2 et laissé 1 heure à 37°C. 20 μl des solutions précédentes sont déposés dans une plaque de 96 puits et 200 μl de réactif « BCA protein assay » (Pierce, Montluson, France) sont ajoutés. La plaque est alors centrifugée à 2500 tours/min. puis incubée à 37°C pendant 30 minutes. En parallèle, une gamme d'albumine de sérum bovin (BSA) est réalisée afin de corréler la valeur d'absorbance obtenue pour les échantillons à une quantité de protéine présente dans l'échantillon.
Les résultats résumés dans la Figure 6 montrent un niveau de protéine similaire quelle que soit la condition utilisée, les lipoplexes comprenant 0,75 ou 5 ou
10 ou 15 ou 20 nmoles de DT-3TU par μg d'ADN. La présence de lipide DT-3TU n'altère donc pas la cellule et aucune toxicité n'a été observée dans les conditions utilisées. Cet exemple illustre donc un des avantages majeurs des composés transfectants selon l'invention, à savoir leur très faible toxicité probablement liée à l'absence de charges positives dans leur structure.
EXEMPLE 10 : Compaction de l'acide nucléique par des nanoémulsions de DT- 3TU /DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium (BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas sujet à un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE IN) sont déposés différents échantillons ADN/DT-3TU comportant différentes formulations de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel est soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN. Les résultats sont représentés dans la figure 8.
De la même façon, la capacité du composé DT-3TU diol à compacter l'ADΝ est montrée par un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1Ν) sur lequel sont déposés différents échantillons ADΝ/DT-3TUdiol comportant différentes formulations de lipide DT-3TUdiol par rapport à l'ADN. Le gel est soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes sont révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN.. Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN lorsqu'il n'est pas associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est associé aux lipides. Les puits 2 à 5 représentent l'ADN (0,01 g/1) associé à des nanoémulsions de DT-3TU/DPPC (60nmol DT-3TU/μg d'ADN) contenant ou pas du calcium et de l'éthanol. Le puits 2 représente 60nmol/μg d'ADN sans Ca2+, sans EtOH, dans le puits 3 a été ajouté 2% EtOH, dans le puits 4, 60eq Ca2+/ PO" ADN, dans le puits 5, 2% EtOH et 60eq de Ca +. La comparaison entre le puits 1 et les autres puits indique que les différentes formulations de DT-3TU étudiées retardent la migration de l'ADN sur le gel, ce qui a également été obtenu après dialyse des constituants Ca2+ et EtOH.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU incorporé dans différentes formulations à compacter l'acide nucléique.
EXEMPLE 11 : Compaction de l'acide nucléique par des complexes stabilisés de DT-3TU /DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas sujet à un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE IN) ont été déposés différents échantillons ADN/DT-3TU/DPPC et ADN/DT-3TUdiol/DPPC comportant des quantités croissantes de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN associées ou pas à du cholestérol-PEG. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et demie à
70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN. Les résultats sont représentés dans la Figure 9.
L'avantage de l'insertion de cholestérol-PEG dans les formulations DT- 3TU/DPPC provient de la possibilité de réduire la taille des particules à une quantité de lipide qui conduirait à une aggrégation sans insertion de lipide-PEG. L'intérêt est d'optimiser les quantités de transfectants injectés in vivo. En effet, les tailles des particules requises pour avoir des objets furtifs vis-à-vis des protéines sériques et ainsi un temps de demi-vie augmenté dans la circulation sanguine devraient être majoritairement inférieures à 500nm. Or pour obtenir des tailles de particules de cet ordre, il est nécessaire d'utiliser au moins 40nmol de lipide DT-3TU/μg d'ADN. L'insertion de lipide-PEG dans les formulations de lipide DT-3TU permet de réduire la quantité de DT-3TU nécessaire à une compaction de l'ADN et à la formation de particules majoritairement inférieures à 500 nm.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN lorsqu'il n'est pas associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est associé aux lipides. Les puits 2 à 5 représentent l'ADN (0,01 g/1) associé à des quantités croissantes de nanoémulsions de DT-3TU/DPPC contenant ou pas du cholesterol-
PEG (20 motifs ethylène glycol) comme agent de stabilisation des particules. Le puits
2 représente 20nmol/μg d'ADN + 15% chol-PEG, le puits 3 comporte 20nmol/μg d'ADN +20% chol-PEG, le puits 4 représente 30nmol/μg d'ADN +15% chol-PEG et le puits 5 représente 20nmol/μg d'ADN +20% chol-PEG. La comparaison entre le puits 1 et les autres puits indique que les différentes formulations de DT-3TU étudiées retardent la migration de l'ADN sur le gel, indiquant la possibilité d'incorporer à ces formulations des polymères de polyéthylène glycol sans libérer l'ADN des complexes, donc sans les déstabiliser.
EXEMPLE 12 : Compaction de l'acide nucléique en présence de DT-4TU (15)
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques. Ceci peut être aisément démontré par un test de fluorescence au bromure d'éthidium : l'absence de fluorescence témoigne de l'absence d'acide nucléique libre ce qui signifie que l'acide nucléique est compacté par le composé transfectant.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de DT-4TU, par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 μl de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 μg/ml dans une solution de chlorure de sodium à 150 mM avec des quantités croissantes de DT-4TU (15).
De la même façon, un contrôle a été réalisé en mettant l'acide nucléique en présence de quantités croissantes de DT-3TU (12) pour comparer les efficacités de complexion d'un lipide comportant 3 thiourées (voir Figure 2) par rapport à un lipide portant 4 thiourées, par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 μl de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 μg/ml dans une solution de 5% glucose avec des quantités croissantes de DPPC.
La fluorescence au bromure d'éthidium est mesurée en utilisant un FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 260 nm et 590 nm respectivement. Les largeurs de fentes pour l'excitation et l'émission sont réglées à 5 nm. La valeur de fluorescence est enregistrée après ajout de 3 μl de bromure d'éthidium (lg/1) par ml de solution ADN/lipide (0,01 g/1 d'ADN). Les résultats sont résumés dans la Figure 10.
La courbe incluant des carrés montre que l'ajout d'une quantité croissante de mélange lipidique DT-3TU / DPPC (0,75 à 30 nmoles de DT-3TU) par rapport à une quantité fixée d'acide nucléique (8 μg) induit une diminution de la fluorescence liée à la réduction de l'insertion du bromure d'éthidium entre les paires de bases de l'ADN. Ceci indique que l'association entre les liposomes DT-3TU/DPPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir 70%> de compaction de l'ADN en utilisant 30nmol de lipides DT- 3TU/DPPC par μg d'ADN. Le rôle actif du lipide DT-3TU dans cette association lipides/ADN a été montré dans les figures 1 et 2. De la même façon des quantités croissantes de mélange lipidique DT-4TU/DPPC (0,75 à 30 nmoles de DT-3TU) ont été ajoutées à une quantité fixée d'acide nucléique (8 μg). Cette association induit une diminution de la fluorescence liée à la réduction de l'insertion du bromure d'éthidium entre les paires de bases de l'ADN. Ceci indique que l'association entre les liposomes DT-4TU/DPPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir 60% de compaction de l'ADN pour 30nmoles de lipide/μg d'ADN (cercles, figure 10), ce qui est comparable avec l'efficacité de complexion de la DT-3TU dans les mêmes conditions. Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-4TU à s'associer à l'acide nucléique.
EXEMPLE 13 : Protection de l'ADN vis-à-vis des DNAses par des complexes DT-3TU DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à protéger les acides nucléiques des hydrolyses enzymatiques dont les DNases.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium (BET) : l'ADN libre ou complexé avec le lipide est traité par une quantité appropriée de DNase. L'ADN, extrait du milieu de digestion enzymatique, est déposé sur gel et son intégrité est vérifiée par comparaison de sa migration avec celle de l'acide nucléique non traité.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE IN) ont été déposés différents échantillons d'ADN extrait qui a préalablement été traité par 2.10"4 M de DNase (Sigma). Le traitement de la DNase a été réalisé sur l'ADN libre et sur l'ADN complexé avec des quantités croissantes de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 70 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN.. Les résultats sont représentés dans la Figure 11. Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN non traité par la DNase (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il a été traité par la DNase. Le puits 2 représente la même quantité d'ADN (3μg) traitée par 2.10"4 M de DNase. Suite à ce traitement (2.10"4 M DNase, 30min. 37°C), la bande correspondant à l'ADN n'est pas révélée ce qui indique une dégradation de l'ADN. L'acide nucléique, complexé par 30 et 40 mnol de lipide DT-3TU par μg d'ADN et par 40 nmol de lipide DT-3TU + 6% Chol-PEG a été traité avec 2.10"4 M de DNase. Après extraction de l'ADN par un mélange phénol/chloroforme et précipitation de ce dernier, l'acide nucléique a été déposé sur ce gel dans les puits 3, 4 et 5 respectivement. L'ADN migre de façon comparable à l'ADN non traité à la DNase ce qui indique que l'ADN est intègre, il n'a pas été dégradé par le traitement à la DNase, il a donc été protégé par le lipide DT-3TU. L'ADN dans les complexes de lipide DT-3TU n'est donc pas accessible à l'hydrolyse enzymatique, il est protégé de l'hydrolyse des DNases. Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à protéger l'acide nucléique de l'hydrolyse enzymatique.
EXEMPLE 14 : Protection de l'ADN vis-à-vis du sérum par des complexes DT- 3TU/DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à protéger les acides nucléiques des dégradations dans un milieu sérique.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium (BET) : l'ADN libre ou complexé avec le lipide est incubé dans différentes proportions de sérum à 37°C. L'ADN, extrait du milieu sérique, est déposé sur gel et son intégrité est vérifiée par comparaison de sa migration avec celle de l'acide nucléique non traité. Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE IN) ont été déposés différents échantillons d'ADN extrait qui a préalablement été incubé dans 150mM NaCl, 20% sérum et 100%) sérum. Les traitements salin et sérique ont été réalisés sur l'ADN libre et sur l'ADN complexé avec des quantités croissantes de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe UN.. Les résultats sont représentés dans la figure 12.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADΝ témoin (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il a été traité, non complexé, en milieu salin (150mM
ΝaCl) (puits 2), lorsqu'il est complexé par 40 nmol de lipide DT-3TU/μg d'ADN
(puits 3). La migration de l'ADN extrait du milieu salin est comparable pour les 2 puits indiquant que l'ADN reste intègre dans ces conditions. Les puits suivants montrent dans le même ordre l'ADN (puits 4 et 6) et l'ADN + 40nmol de lipide DT- 3 TU (puits 5 et 7) dans deux conditions sériques différentes : 20% sérum pour les puits 4 et 5 et 100%) sérum pour les puits 6 et 7. Lorsque l'ADN est libre, il est totalement dégradé dans les deux conditions de sérum étudiées au bout de 30 minutes à 37°C (puits 4 et 6). En revanche, la complexion de l'ADN avec les nanoémulsions constituées de DT-3TU/DPPC conduit à la protection de l'acide nucléique puisque la bande de migration correspondante à l'ADN est révélée (puits 5 et 7). L'ADN dans les complexes de lipide DT-3TU est donc protégé de la dégradation en milieu sérique par rapport à l'ADN nu.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à protéger l'acide nucléique de la dégradation dans le sérum.
EXEMPLE 15: Transfection in vivo des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à transfecter des tissus biologiques in vivo.
Ceci peut être démontré par injection intramusculaire de complexes d'ADN codant pour la luciférase. Les prélèvements des muscles sont alors effectués 96h après l'injection et le niveau de l'expression de la luciférase est mesuré en utilisant un luminomètre ( allac).
Des complexes comportant des quantités croissantes de lipide DT-3TU par μg d'ADN ont été injectés dans les deux muscles tibial cranial de souris, auxquels ont été appliqués ou non des pulsations électriques (Bureau, M et al, BBA 2000, 1474(3):353-9).
Des complexes comportant des quantités croissantes 40 et 60 nmol de lipide DT-3TU par μg d'ADN sont injectés sous un volume de 30 μL à raison de 3μg d'ADN par animal dans les deux muscles tibial cranial de souris C57bl/6 anesthésiées avec un mélange de Kétamin/Xylazine. Cette injection a été suivie ou non de l'application de pulsations électriques transcutanées appliquées par l'intermédiaire d'électrodes situées de part et d'autre du muscle (Bureau, M et al, BBA 2000, 1474(3): 353-9).
Après euthanasie des souris 96h post-injection, les muscles sont prélevés et broyés dans 1ml de tampon de lyse. Après centrifugation (10min., 12000tr/min, 4°C), lOμl de surnageant sont prélevés et déposés dans des plaques 96 puits pour lecture de la luciférase après ajout de 50μl de substrat luciférase. Le niveau arbitraire de luminescence est lu dans le surnageant en utilisant un luminomètre (Wallac, Victor).
Les valeurs obtenues sont indiquées dans la figure 13. Elles représentent les niveaux d'expression relatif à la dose de lipide associée à l'acide nucléique, 20 et 40 nmol de lipide DT-3TU/μg d'ADN. Les niveaux d'expression obtenus sont significatifs, et supérieurs au brait de fond représentés par le muscle pris comme contrôle qui correspond à 5.104. L'ADN complexé par des quantités différentes de lipide DT-3TU est donc capable de transfecter les tissus musculaires avec un niveau de transfection significatif.
Cet exemple illustre la capacité des composés transfectants selon l'invention à transfecter des tissus in vivo.
EXEMPLE 16: Biodistribution in vivo des complexes DT-3TU/DPPC/ADN Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants selon l'invention à circuler longuement dans la circulation in vivo en raison de leur caractère neutre.
Ceci peut être démontré par injection de complexes d'ADN contenant un lipide fluorescent dans la circulation sanguine de souris. Des prélèvements sanguins sont alors effectués à différents temps après l'injection et le niveau de fluorescence dans la circulation est mesuré en utilisant un FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex).
Des complexes comportant 40 nmol de lipide DT-3TU par μg d'ADN, 1 équivalent molaire de lipide DPPC/DT-3TU et 0.7% de lipide-rhodamine par rapport aux lipides totaux ont été injectés sous un volume de 200 μl à raison de 11 μg d'ADN par animal dans la veine caudale de souris C57bl/6 anesthésiées avec un mélange de
Kétamin/Xylazine.
A 30 minutes, lh et 6h post-injection, le sang est prélevé par ponction intracardiaque sur souris anesthésiée. Après euthanasie des souris, le foie, la rate et les poumons sont immédiatement prélevés, pesés et homogénéisés dans du PBS (5 μl/mg de tissu). Les lipides sont extraits à partir de 100 μl de sang et des homogénats des organes avec 3 ml d'un mélange 1/1 de chloroforme et méthanol par agitation vigoureuse pendant 30 min puis par centrifugation. La fluorescence est lue dans le surnageant en utilisant un FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 550 nm et 590 nm respectivement. Les largeurs de fentes pour l'excitation et l'émission sont réglées à 5 nm.
Les valeurs obtenues sont indiquées dans la figure 14. Elles représentent le pourcentage de la dose injectée obtenu dans le sang, les poumons et le système réticulo-endothélial (foie et rate cumulés) 30 minutes, 1 h et 6h après injection. La mesure de fluorescence dans le sang après 30 minutes représente 50% de la dose injectée ce qui est largement supérieur à ce qui peut être obtenu avec des surfactants de l'ADN de type cationique. Après lh, 17% de la dose injectée a pu être retrouvée ce qui là encore représente une remarquable amélioration par rapport à des complexes cationiques. Le caractère neutre de ces complexes lipide/ ADN (zêta très faiblement positif : figure 4) présente donc un réel avantage pour obtenir des particules furtives aux protéines sériques. Il devrait également limiter leurs interactions avec les macrophages et les cellules de kupffer de la rate et du foie ce qui peut expliquer la quantité de liposome retrouvée à 30 min et 1 h dans le sang.
La quantité de lipoplexe retrouvé dans le poumon est faible comparativement à celle qu'on retrouve dans le cas des lipoplexes cationiques. La neutralité de ces liposomes devrait également diminuer les interactions non spécifiques avec Pendothélium négatif des poumons.
Cet exemple illustre la capacité des composés transfectants selon l'invention à être furtifs vis-à-vis des protéines sériques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Les composés transfectants de formule générale
Figure imgf000058_0001
dans laquelle :
• -β est un entier choisi parmi 0 et 1
• n est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6,
• m est un entier choisi parmi 2, 3 et 4, m pouvant prendre des valeurs différentes au sein des différents groupements -[NH-CS-NH-(CH)m]-,
• R' représente un groupe de formule générale (II) :
Figure imgf000058_0002
dans laquelle q est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et p est un entier choisi parmi 2, 3 et 4, p pouvant prendre des valeurs différentes au sein des différents groupements -[(CH2)P-NH-CS-NH]-,
• R représente soit un atome d'hydrogène soit un groupe de formule générale (II) telle que définie ci-avant, étant entendu que lorsque n vaut 1 et £ vaut 0, alors au moins un groupe R est de formule (II),
• X, dans les formules (I) et (II), représente un groupe aliphatique linéaire ou cyclique, saturé ou insaturé, et comprenant 1 à 8 atomes de carbone, un groupe mercaptométhyle (-CH2SH), ou bien une chaîne hydrophile choisie parmi les groupes :
-(CH2)X -(CHOH)u-H avec x est un entier choisi entre 0 et 10, et u un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, ou bien -(OCH2CH2O)v-H avec v un entier choisi parmi 1 , 2 et 3, étant entendu que pas plus d'un substituant X, à la fois dans les formules (I) et (II), ne représente une chaîne hydrophile,
• Y représente un espaceur
• et L représente : - soit un groupement --N(Rι)R2 avec Ri et R2 qui représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, ou bien un groupe de formule -(CH2)t-OZ avec t représentant un entier choisi parmi 11, 12, 13, 14 ou 15 et Z représente un sucre, un polyol ou un PEG, étant entexidu que l'un au moins de Ri et de R2 est différent de l'hydrogène, soit un groupement -OR3, avec R qui représente un dérivé stéroïdien,
le cas échéant sous leurs formes isomères ou leurs mélanges.
2. Les composés transfectants selon la revendication 1 de formule générale :
Figure imgf000059_0001
dans laquelle X, m, n, et Y sont tels que définis dans la revendication 1, à l'exception de n qui est différent de 1, et Ri et R2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, étant entendu que l'un au moins de Ri et R2 est différent de l'hydrogène, le cas échéant sous leurs formes isomères ou leurs mélanges.
3. Les composés transfectants selon la revendication 1 ou 2 de formule générale :
Figure imgf000060_0001
dans laquelle m, n, et Y sont tels que définis dans la revendication 1, à l'exception de n qui est différent de 1, et Ri et R2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse, étant entendu que l'un au moins de Ri et R2 est différent de l'hydrogène, le cas échéant sous leurs formes isomères ou leurs mélanges.
4. Les composés transfectants selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que ledit espaceur comprend une ou plusieurs fonctions chimiques choisies parmi les alkyles ayant 1 à 6 atomes de carbone, les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, le glycérol, l'urée, la thiourée, ou les cycles aromatiques.
5. Les composés transfectants selon la revendication 4 caractérisés en ce que ledit espaceur est choisi parmi les groupes de formule : -NH-C(O)-CH2-CH2- ou : -(CH2-)rW-(CH2)j- dans laquelle i et j sont des entiers choisis entre 1 et 6 inclus et W est un groupe choisi parmi les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine, carbamate, thiocarbamate, le glycérol, l'urée, la thiourée, ou encore les cycles aromatiques.
6. Les composés transfectants selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que la ou les chaînes aliphatiques grasses sont choisies parmi les groupes alkyle contenant 10 à 22 atomes de carbone et éventuellement une ou plusieurs insaturations.
7. Les composés transfectants selon la revendication 6 caractérisés en ce que la ou les chaînes aliphatiques grasses sont choisies parmi les groupements aliphatiques -
(CH2)„CH3, -(CH2)13CH3, -(CH2)15CH3, et -(CH2)17CH3.
8. Les composés transfectants selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que ledit dérivé stéroïdien est xin composé polycyclique de type cholestane.
9. Les composés transfectants selon la revendication 8 caractérisés en ce que ledit dérivé stéroïdien est choisi parmi le cholestérol, le cholestanol, le 3-α-5-cyclo-5-α- cholestan-6-β-ol, l'acide cholique, le cholestérylformiate, le chotestanylformiate, le 3α,5-cyclo-5α-cholestan-6β-yl formiate, la cholestérylamine, la 6-(l,5- diméthylhexyl)-3a,5a-diméthylhexadécahydrocyclopenta[a]cyclopropa[2,3]-cyclo- penta[l,2-f]naphta-lèn-10-ylamine, ou la cholestanylamine.
10. Les composés transfectants selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que ledit sucre est choisi parmi les molécules constituées d'un ou plusieurs saccharides.
11. Les composés transfectants selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que ledit polyol est choisi parmi les molécules hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique comprenant au moins deux fonctions hydroxy.
12. Compositions caractérisées en ce qu'elles comprennent un composé transfectant selon l'une des revendications 1 à 11, et un acide nucléique.
13. Compositions selon la revendication 12 caractérisées en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique ou bien un acide ribonucléique.
14. Compositions selon la revendication 12 ou 13 caractérisées en ce que ledit acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation.
15. Compositions selon les revendications 12 à 14 caractérisées en ce que ledit acide nucléique est un gène ou une séquence antisens ou bien un ADN codant pour un ARN à fonction de ribozyme.
16. Compositions selon l'une des revendications 12 à 15 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un ou plusieurs adjuvants.
17. Compositions selon la revendication 16 caractérisées en ce que ledit adjuvant est choisi parmi les lipides, les peptides, les protéines ou les polymères.
18. Compositions selon la revendication 17 caractérisées en ce que ledit polymère est le polyéthylène glycol.
19. Compositions selon la revendication 17, caractérisées en ce que ledit polymère est le polyéthylène glycol lié de manière covalente au cholestérol.
20. Compositions selon la revendication 17 caractérisées en ce que ledit adjuvant est choisi parmi les lipides neutres.
21. Compositions selon la revendication 20 caractérisées en ce que ledit lipide neutre est choisi parmi les lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.
22. Compositions selon la revendication 21 caractérisées en ce que ledit lipide neutre est choisi parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoylpalmitoyl- phosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
23. Compositions selon l'une des revendications 12 à 22 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un élément de ciblage extracellulaire ou intracellulaire.
24. Compositions selon la revendication 23 caractérisées en ce que ledit élément de ciblage est choisi parmi les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les lipides, les neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés.
25. Compositions selon la revendication 23 caractérisées en ce que ledit élément de ciblage est lié covalemment à une chaîne alkyle grasse contenant au moins 10 atomes de carbone ou à un polyéthylène glycol.
26. Compositions selon la revendication 23 caractérisées en ce que ledit élément de ciblage est lié covalemment soit au composé transfectant selon l'une des revendications 1 à 11, soit à l'acide nucléique.
27. Compositions selon l'une des revendications 12 à 26 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
28. Compositions selon l'une des revendications 12 à 26 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une administration sur la peau et/ou les muqueuses.
29. Utilisation d'un composé transfectant selon l'une des revendications 1 à 11 pour le transfert d'acides nucléiques.
30. Utilisation d'un composé transfectant selon l'une des revendications 1 à 11 pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies.
31. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant tel que défini dans les revendications 1 à 11, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
32. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules selon la revendication 31 caractérisée en ce que ledit agent de transfert et/ou ledit acide nucléique sont préalablement mélangés à un ou plusieurs adjuvant(s) et/ou à un élément de ciblage tels que définis dans les revendications 16 à 26.
33. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules selon la revendication 31 caractérisée en ce que un ou plusieurs adjuvants tels que définis aux revendications 16 à 22 sont préalablement administrés aux cellules.
34. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules selon l'une des revendications 31 à 33 caractérisée en ce que les cellules sont en outre soumises à un traitement chimique ou physique.
35. Kits de transfection caractérisés en ce qu'ils comprennent un ou plusieurs composés transfectants selon les revendications 1 à 11 et/ou leurs mélanges.
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