EP1562963A1 - Nouveaux composes lipophiles et leurs utilisations - Google Patents

Nouveaux composes lipophiles et leurs utilisations

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Publication number
EP1562963A1
EP1562963A1 EP03786052A EP03786052A EP1562963A1 EP 1562963 A1 EP1562963 A1 EP 1562963A1 EP 03786052 A EP03786052 A EP 03786052A EP 03786052 A EP03786052 A EP 03786052A EP 1562963 A1 EP1562963 A1 EP 1562963A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound according
group
compound
iodide
carbon atoms
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03786052A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Hervé Des Abbayes
Jean-Jacques Yaouanc
Jean-Claude Clement
Karine Le Ny
Claude Ferec
Tristan Montier
Pascal Delepine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Regional et Universitaire de Brest
Univerdite de Bretagne Occidentale
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Regional et Universitaire de Brest
Univerdite de Bretagne Occidentale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Hospitalier Regional et Universitaire de Brest, Univerdite de Bretagne Occidentale filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1562963A1 publication Critical patent/EP1562963A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2454—Esteramides the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2458—Esteramides the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of aliphatic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
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    • C07F9/5407—Acyclic saturated phosphonium compounds
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    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
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    • C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
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    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
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    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6536—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and sulfur atoms with or without oxygen atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6539—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/72—Aliphatic compounds

Definitions

  • the present invention relates to new lipophilic compounds having an affinity for nucleic acids. These new compounds can be used as non-viral vectors to introduce a nucleic acid of interest into a chosen host cell or into a chosen host organism.
  • lipophilic compounds used in the prior art as non-viral vectors mention may be made of the halides of -1, 2-3-dioleyl trimethylammonium deoxyglycerol, commonly known as DOTAP, the -1, 2-3-dioleyl-trimethylammonium, commonly known as DOTMA , dimethylammonium ethyloxycarbonylcholesterol, commonly known as DC-chol.
  • DOTAP -1, 2-3-dioleyl trimethylammonium deoxyglycerol
  • DOTMA dimethylammonium ethyloxycarbonylcholesterol
  • Phosphonolipids have also been described, such as those described by
  • non-viral cationic lipophilic vectors have a reduced capacity for transfection of DNA into cells and have cytotoxic properties with respect to these cells.
  • Another objective sought is the obtaining of new non-viral vectors having an improved transfection capacity combined with a low cytotoxicity for the cells to be transfected.
  • the applicant has now synthesized new cationic lipophilic compounds, of the mono- or bis-phosphoramide type, and containing a cationic part of the “Onium” type, which have a high capacity for transfection of a nucleic acid into cells, greater than that known non-viral vectors, in particular known phosphonolipids.
  • the new lipophilic compounds according to the invention have reduced cytotoxicity properties, compared with the non-viral vector compounds described in the state of the art.
  • the subject of the invention is therefore new cationic lipophilic compounds, of the mono- or bisphosphoramide type, and containing a cationic part of the “Onium” type, which are described later in the detailed description of the invention.
  • the "Onium" part of the compounds cationic lipophiles of the invention can be an ammonium, a phosphonium or an arsonium, or an organic cation, such as the imidazolium, thiazolium or pyridinium cations.
  • the present invention also relates to lipid vesicles, unilamellar or multilamellar, comprising, or consisting mainly or almost exclusively of a lipophilic compound according to the invention, preferably in the form of a complex between said lipophilic compound and a nucleic acid of interest.
  • the invention also relates to a complex formed between a nucleic acid of interest and a lipophilic compound as defined above.
  • nucleic acid of interest into a host cell or a host organism, using a complex formed between said nucleic acid of interest and a lipophilic compound of the invention, where appropriate presented in the form of unilamellar or multilamellar lipophilic vesicles.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing, as active principle, at least one complex formed between a nucleic acid of interest and a lipophilic compound as defined above, optionally in combination with one or more physiologically compatible excipients.
  • FIGURE 1 illustrates the comparative results of in vitro transfection of cells of the K562 cell line with lipophilic compounds of the prior art and lipophilic compounds according to the invention or with a mixture of a lipophilic compound according to the invention with a lipophilic compound of the state of the prior art.
  • the transfection was carried out with DNA of interest encoding the marker protein luciferase.
  • parentheses are reported the mass ratios between the lipid compound (s) and the DNA.
  • the results of transfection efficiency correspond to the luciferase activity found in the different samples of cells transfected in culture, these results being expressed in TRLU units (Total Relative Light Units), as described in the section "Materials and Methods From Example 5.
  • FIGURE 2 illustrates the comparative results of in vitro transfection of cells of the Jurkat cell line with lipophilic compounds of the prior art and lipophilic compounds according to the invention or also with a mixture of a lipophilic compound according to the invention with a lipophilic compound of the state of the prior art.
  • the transfection was carried out with DNA of interest encoding the marker protein luciferase.
  • parentheses are reported the mass ratios between the lipid compound (s) and the DNA.
  • DC-CHOL means the commercial product (3 ⁇ - [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol.
  • the results of transfection efficiency correspond to the luciferase activity found in the different samples of cells transfected in culture, these results being expressed in TRLU units, as described in the section "Materials and Methods" of Example 5 .
  • FIGURE 3 illustrates the comparative results of in vitro transfection of cells of the Daudi cell line with lipophilic compounds of the prior art and lipophilic compounds according to the invention or with a mixture of a lipophilic compound according to the invention with a lipophilic compound of the state of the prior art.
  • the transfection has was carried out with a DNA of interest encoding the marker protein luciferase.
  • DC-CHOL means the commercial product (3 ⁇ - [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol.
  • FIGURE 4 illustrates the comparative results of in vitro transfection of mouse cardiomyocyte cells in primary culture with lipophilic compounds of the prior art and lipophilic compounds according to the invention or with a mixture of a lipophilic compound according to the invention with a lipophilic compound of the state of the prior art.
  • the transfection was carried out with DNA of interest encoding the marker protein luciferase.
  • the different compounds or mixtures of compounds used to form complexes with the DNA of interest before transfection of the cells used according to three distinct charge + / charge - ratios.
  • the composition tested contains twice as many positive charges (cationic lipophilic compound) as negative charges (provided by the DNA molecules).
  • DOPE dioleylphosphatidylethanolamine
  • DD DOPE + DOTAP
  • FIGURE 5 illustrates comparative cytotoxicity results between different lipophilic compounds of the invention, lipophilic compounds of the prior art and mixtures of lipophilic compounds of the invention with lipophilic compounds of the prior art.
  • FIGURE 6 illustrates the comparative results of in vivo transfection efficiency of a DNA coding for luciferase, between different lipophilic compounds of the invention, different lipophilic compounds of the prior art and mixtures between lipophilic compounds of the invention and lipophilic compounds of the prior art.
  • the applicant has synthesized new cationic lipophilic compounds, of the mono-phosphoramide or bis-phosphoramide type, and having a cationic part of the “Onium” type, combining a higher capacity for transfection of cells with a nucleic acid of interest and properties of reduced cytotoxicity, compared to previously known non-viral lipophilic vectors.
  • the subject of the invention is a cationic lipophilic compound of general formula (I) below:
  • R 1 and R ' 1 each represent, independently of one another, an alkyl chain, an alkenyl chain or a polyalkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms, with the polyalkenyl chain having from 2 to 4 double bonds;
  • R 2 is a hydrogen atom or an alkyl chain having from 1 to 4 carbon atoms;
  • R 3 is a group of the following formula (Ma): - (CH2) n- or (llb) following:
  • alkyl is meant according to the invention an aliphatic hydrocarbon group, which can be linear or branched.
  • the alkyl chain may be substituted, on one or more of the carbon atoms constituting it, by a group chosen from hydroxy, alkoxy and alkylthio groups.
  • a carbon atom of the hydrocarbon chain comprises at most a single substituent.
  • at most three carbon atoms of the hydrocarbon chain are substituted by at least one of the above groups.
  • alkenyl is meant according to the invention an alkyl group containing a carbon-carbon double bond, which can be located at any point of the hydrocarbon chain.
  • polyalkenyl is meant according to the invention an alkyl group containing from two to four carbon-carbon double bonds in the hydrocarbon chain, which can be located at any point of the hydrocarbon chain in relative “malonic” positions.
  • organic cation is meant according to the invention any organic chemical group contained in a lipophilic compound of the invention and positively charged in solution.
  • anion is meant according to the invention any organic or mineral molecule which is negatively charged in solution.
  • the applicant believes that the improved properties of the above lipophilic compounds allowing efficient transfection of a nucleic acid of interest, both in vitro and in vivo, are due to the brittleness of the covalent bond between the lipophilic part and the cationic part of these compounds, said bond being cleaved after the passage of the lipophilic compound through the cell membrane, which releases the cationic part which retains the binding properties to the polyanionic nucleic acid d of interest, and which can be transported to the nucleus of cells.
  • the free lipophilic part after cleavage, can be degraded under the action of various cellular enzymes, especially various enzymes found in the cytoplasm.
  • the applicant has in fact observed, by measuring the 1 H and 31 P NMR spectrum, that the bond between the phosphorus atom (P) and the nitrogen atom (N) of a cationic lipophilic compound of formula (I ) is rapidly hydrolyzed, in the absence of an enzyme, to a pH value of about 4-5, which is the pH found in the endosomes or intracytoploplasmic lysosomes of the cell.
  • the PN bond is completely hydrolyzed after an incubation of the compound of formula (I) for 6 hours at a pH of about 4-5, at a temperature of 20 ° C.
  • X " is an anion chosen from CF3CO2 " , CF3SO 3 " ,
  • the halogen is chosen from
  • a lipophilic compound as defined above is characterized in that group A is a five or six-membered heterocyclic aromatic ring comprising a heteroatom consisting of a nitrogen quaternary linked by a covalent bond to the group R 3 .
  • the heterocyclic aromatic ring comprises a second heteroatom chosen from S or N.
  • the second heteroatom is N, said second heteroatom is substituted by an alkyl chain of 1 to 4 carbon atoms.
  • group A is a thiazolium or an imidazolium, with the second nitrogen heteroatom optionally substituted by an alkyl chain of 1 to 4 carbon atoms.
  • Preferred compounds belonging to this first embodiment of the invention are the following: - ditetradecyl iodide 2- (1-methyl-1 H-imidazol-3-ium-3-yl) ethylamidophosphate [compound KLN27]; dioleyl iodide 2- (1-methyl-1H-imidazol-3-ium-3-yl) ethylamidophosphate [compound KLN28];
  • a lipophilic compound as defined above is characterized in that group A is a six-membered heterocyclic aromatic ring comprising a quaternary nitrogen heteroatom.
  • group A is a pyridinium ring.
  • the lipophilic compound of the invention is characterized in that group A is represented by the following formula (III):
  • R 13 represents an alkyl chain of 1 to 4 carbon atoms.
  • a preferred compound belonging to the second embodiment of a lipophilic compound according to the invention is the compound: - ditetradecyl iodide 2- (1-methyl-1 - / - pyridin-1-ium-4-yl) ethylamidophosphate [compound KLN38]
  • a lipophilic compound according to the invention is characterized in that group A is a cation of formula (IV) below:
  • R 4 and R 5 each represent, independently of one another, an alkyl chain having from 1 to 4 carbon atoms; and h) R 6 represents an alkyl chain having from 1 to 4 carbon atoms.
  • the compounds belonging to the third embodiment above and having a high level of capacity to transfect a nucleic acid in a target cell are preferably those for which the groups R 4 , R 5 and R 6 each represents a methyl group.
  • the group R 2 represents hydrogen, a methyl group or an ethyl group.
  • Z represents P or A s , and very preferably, Z represents As.
  • Preferred compounds belonging to the third embodiment of a lipophilic compound according to the invention are chosen from the following compounds: - iodide of 3 - [[bis (tetradecyloxy) phosphoryl] (methyl) amino] -NNN- trimethylpropanaminium [compound KLN5 ]; 3 - [[bis (oleyloxy) phosphoryl] (methyl) amino] -N.N.N-trimethylpropanaminium iodide [compound KLN6];
  • the cationic lipophilic compounds belonging to the first, second and third embodiments above are all compounds of the mono-phosphoramide type.
  • an active lipophilic compound is obtained by covalently linking two compounds of the mono-phosphoramide type, the two monophosphoramide compounds being linked to each other by an alkyl chain of 1 to 4 atoms of carbon, which replaces the R 6 group of each of the two mono-phosphoramide compounds, resulting in a bis-phosphoramide compound which also forms part of the invention.
  • the subject of the invention is also a lipophilic compound of formula (I) as defined above, said compound being characterized in that group A is a cation of formula (IV) below:
  • R 7 and R 8 each represent, independently of one another, an alkyl chain of 1 to 4 carbon atoms, and m) R 9 represents a group of formula (VI) below:
  • R 10 represents - (CH 2 ) n- where n is an integer equal to 0, 1, 2, 3 or 4; o) R 11 represents H or an alkyl group of 1 to 4 carbon atoms; and p) R 12 and R ′ 12 each represent, independently of one another, an alkyl chain, an alkenyl chain or a polyalkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms, with the polyalkenyl chain having from 2 to 4 double connections;
  • the groups R 12 and R 12 are identical to the groups R 1 and R 1 , respectively.
  • the groups R 3 and R 10 are identical.
  • the groups the groups R 4 and R 5 are identical to the groups R 7 and R 8 , respectively.
  • a preferred bis-phosphoramide compound belonging to the fourth embodiment above is the following compound: diiodide of N 1 , N 4 -bis (3-
  • the groups R 4 , R 5 and R 6 are preferably identical.
  • the groups R 4 , R 5 , R 7 and R 8 are preferably identical.
  • the groups R 2 and R 11 are identical.
  • the lipid groups R 1 and R ' 1 and, for bis-phosphoramide compounds, also the lipid groups R 12 and R' 12 , each represent, independently of one another, an alkyl chain from 10 to 24 carbon atoms, an alkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms or a polyalkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms and having from 2 to 4 double bonds per chain.
  • the groups R 1 and R ′ 1 are identical.
  • the R 12 and R '12 are identical.
  • the groups R 1 , R ' 1 , R 12 and R' 12 are all identical.
  • At least one group among the groups R 1 , R ' 1 , R 12 and R' 12 , represents an alkyl chain of 10 to 24 carbon atoms
  • said alkyl chain is preferably chosen from chains of 14 to 20 atoms of carbon.
  • a preferred lipophilic group having an alkyl chain of 10 to 24 carbon atoms is the tetradecyl or myristyl group having 14 carbon atoms.
  • At least one group among the groups R 1 , R ' 1 , R 12 and R' 12 , represents an alkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms, said alkenyl chain is preferably chosen from chains of 14 to 20 atoms of carbon.
  • a preferred lipophilic group having an alkenyl chain of 18 carbon atoms and having an olefinic double bond is the oleyl group.
  • At least one group among the groups R 1 , R ' 1 , R 12 and R' 12 , represents a polyalkenyl chain
  • said polyalkenyl chain is preferably chosen from chains of 14 to 20 carbon atoms.
  • the polyalkenyl chain is chosen from the groups Ci8 : 2 and C ⁇ 8: 3, in which the first number represents the number of carbon atoms in the alkenyl chain and the second number represents the number of double bonds in the chain alkenyl.
  • the technical problem of the invention can be solved with groups R 1 , R ' 1 , R 12 and R' 12 , each group representing, independently of one another, an alkyl chain of 10 to 24 carbon atoms, an alkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms or a polyalkenyl chain of 10 to 24 carbon atoms and having 2 to 4 double bonds per chain, since these different alkyl, alkenyl or polyalkenyl chains are all sufficiently hydrophobic to allow a lipid compound of the invention to come into contact with the cell membrane, then to enter the cell by crossing the lipid bilayer of the cell membrane, then to reach the nucleus by passing through the membrane nuclear.
  • the compound of formula (I) is recovered as defined above by quaternizing the amine -N (R 4 R 5 ) of the compound of formula (VIII) above by an appropriate alkyl halide R 6 -X.
  • phase transfer agent such as benzyltriethylammonium chloride
  • a phosphite compound of formula (VII) as described above is reacted with a diamine of formula (VIII) as described above, under the same conditions, then reacting 2 equivalents of the compound obtained with an equivalent of an appropriate alkyl dihalide X - R 10 - X.
  • any other conventional synthesis method can be implemented by a person skilled in the art to prepare a lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compound according to the invention.
  • the cationic part of the lipophilic compound according to the invention carries the binding properties of said compound with the nucleic acid of interest, said nucleic acid being a polyanionic compound.
  • the lipid part of the lipophilic compound represented by the groups R 1 and R ' 1 and, for bisphosphoramide compounds, also by the groups R 12 and R' 12 , allows the lipophilic compound of the invention to bind to the cell membrane , to cross the lipid bilayer of the cell membrane then to reach the cytoplasm and / or the nucleus, at the level of which the nucleic acid of interest is transcribed, or even at the level of which the nucleic acid of interest s' hybrid with a target nucleic acid naturally present in the cell, either in the cytoplasm or in the nucleus.
  • nucleic acid for the purposes of the present description, the terms “nucleic acid”, polynucleotide ”and“ oligonucleotide ”include DNA, RNA molecules, DNA / RNA hybrid molecules of more than two nucleotides in length, either in the simple form strand or double strand.
  • any of the lipophilic compounds of the invention can be used as such, preferably in solution, to be complexed with a nucleic acid of interest, the introduction of which by transfection into a host cell is sought.
  • a lipophilic compound according to the invention is used in the form of lipid vesicles, which are then brought into contact with an acid nucleic acid of interest so as to form a complex between said nucleic acid and the lipid vesicles thus prepared.
  • the lipid vesicles are prepared using exclusively a lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compound of the invention.
  • the lipid vesicles can be prepared from a mixture of several lipophilic compounds of the invention, preferably at most four, and very preferably two distinct lipophilic compounds according to the invention. Part of the invention thus forms lipid vesicles comprising a lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compound chosen from the compounds defined above.
  • lipid vesicles essentially consisting of one or more lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compounds as defined above.
  • essentially means lipid vesicles comprising at least 90% by weight of one or a plurality of lipophilic compounds of the invention.
  • lipid vesicles consisting exclusively of one or more lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compounds as defined above.
  • the lipid vesicles are prepared by using a mixture of at least one lipophilic compound of the invention with at least one lipophilic compound not forming part of the invention, very preferably a lipophilic compound binding to a nucleic acid and usable as a non-viral vector of a nucleic acid of interest.
  • a lipophilic non-viral vector compound is for example a lipophilic compound of the state of the art, such as DOPE, DOTAP, DOTMA, or cholesterol.
  • Such lipid vesicles comprise at most four, and preferably at most two, distinct lipophilic compounds according to the invention.
  • lipid vesicles comprise at most four, and preferably at most two, distinct lipophilic compounds not forming part of the invention.
  • the lipid vesicles encompassed by the second preferred aspect of the fifth embodiment above respectively comprise a single lipophilic compound of the invention, in admixture with a single lipophilic compound not forming part of the invention .
  • the proportions of the various lipophilic compounds are variable.
  • a weight ratio of the compound of the invention is preferred: other lipophilic compound of between 10:: 1 to 1:: 2, preferably between 6:: 1 and 1:: 1, and most preferably between 4:: 1 and 1:: 1.
  • lipid vesicles comprising at least one lipophilic monophosphoramide or bisphosphoramide compound of the invention and at least one other lipophilic compound.
  • the lipid vesicles are in the form of unilamellar lipid vesicles, specifically small unilamellar vesicles.
  • the lipid vesicles are in the form of multilamellar lipid vesicles.
  • the lipid vesicles of the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art, for example by prior dissolution of the lipophilic compound (s) in a solvent, such as an aqueous medium, for example pyrogen-free distilled water or a physiologically compatible saline solution, then sonication of the solution thus obtained.
  • a solvent such as an aqueous medium, for example pyrogen-free distilled water or a physiologically compatible saline solution
  • the lipid vesicles of the invention can be stored for a long time, for example in frozen form in liquid nitrogen.
  • an extemporaneous preparation of these vesicles is preferred, at most a few hours, for example at most 4 hours, before they are brought into contact or incubation with a nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid of interest which must be introduced into a host cell encodes a protein or a peptide.
  • the protein can be any protein useful for carrying out a method of gene therapy, preferably somatic gene therapy, and includes, but is not limited to, cytokines, structural proteins, hormones, antigens, immunogens, receptors etc.
  • the nucleic acid of interest encodes a sense or antisense polynucleotide which hybridizes with a target nucleic acid encoding a protein whose inhibition of expression in a cell host is sought.
  • the nucleic acid of interest consists of a recombinant vector, preferably a recombinant expression vector, into which is inserted the nucleic acid of interest, the coding sequence of which is placed under the control regulatory sequences, in particular promoter or activator sequence (“enhancer”), necessary for the expression of said nucleic acid of interest in the transfected host cell.
  • a recombinant vector preferably a recombinant expression vector
  • the nucleic acid of interest linear or circular, single-stranded, or double-stranded, is firstly complexed with a lipophilic monosphoramide or bisphosphoramide compound of the invention, before being introduced, under the form of the complex, in the host cell.
  • the complexes are preferably formed by incubation of the nucleic acid with the lipid vesicles defined above.
  • the complexes can be formed by incubating the nucleic acid of interest with a lipophilic compound of the invention, or a mixture of several lipophilic compounds of the invention, the complexes thus formed being subsequently used for the transfection of host cells.
  • lipid vesicles unilamellar or multilamellar, are formed from the nucleic acid / lipophilic compound (s) complexes previously prepared, then the vesicles are used to transfect the host cells.
  • the complexes formed between nucleic acid molecules and molecules of lipophilic compounds comprise a weight ratio of nucleic acid / lipophilic compounds of between 0.5 and 100, advantageously between 1 and 10, and preferably between 2 and 5.
  • Another subject of the invention is the use of a lipophilic compound or of a lipid vesicle as defined above, for introducing, in vitro or in vivo, a nucleic acid into a host cell or into a host organism.
  • the invention also relates to a method for introducing, in vitro or in vivo, a nucleic acid into a host cell or a host organism, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing said nucleic acid into contact with a compound lipophilic or with a lipid vesicle as defined above, in order to obtain a complex between said nucleic acid, on the one hand, and said compound or said lipid vesicle, on the other hand; b) incubating the host cell with the complex formed in step a), or administering, preferably by injection, the complex formed in step a) to the host organism.
  • said host cell is a non-human mammalian cell or a human cell
  • the host organism is a man or a non-human mammal, although the application of the above method cannot be excluded in other higher organisms such as plants.
  • the invention also relates to a complex formed between a nucleic acid and a lipophilic phosphoramide or bisphosphoramide compound or a lipid vesicle as defined above.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising a complex formed between a nucleic acid and a lipophilic phosphoramide or bisphosphoramide compound or a lipid vesicle as defined above.
  • the complexes formed between a nucleic acid of interest and a lipophilic compound or a lipid vesicle of the invention can be administered by any suitable method allowing their introduction into the cells of a man or of an animal, such as by injection into interstitial tissue species (heart, muscle, skin, lung, liver, intestines, etc.).
  • the complexes are presented in the form of a composition also containing a physiologically compatible vehicle.
  • the composition containing these complexes is in a form suitable for administration by aerosol, for example for inhalation.
  • the quantity of DNA, RNA or DNA / RNA of interest for a dose injectable is advantageously between 0.005 mg / kg and 50 mg / kg of the weight of the man or animal to be treated.
  • the amount of nucleic acid ranges from 0.005 mg / kg to 20 mg / kg, and most preferably from 0.05 mg / kg to 5 mg / kg.
  • nucleic acid in a dose for injection, depending in particular on the pathology to be treated and the injection site.
  • the quantity of nucleic acid for an injectable dose is determined by a person skilled in the art.
  • the invention also relates to a method for introducing in vivo a nucleic acid of interest into the cells of a host organism, said method comprising the following steps: a) a) bringing said nucleic acid into contact with a lipophilic compound or with a lipid vesicle as defined above in order to obtain a complex between said nucleic acid, on the one hand, and said compound or said lipid vesicle, on the other hand; b) administering the complexes formed in step a) to said host organism.
  • the host organism is preferably a human or a non-human mammal, although it can also be a plant.
  • the complexes formed between a nucleic acid of interest and a lipophilic compound or a lipid vesicle of the invention are present in a suitable liquid solution, such as sterile and pyrogen-free distilled water, in amounts of suitable complexes. .
  • a suitable liquid solution such as sterile and pyrogen-free distilled water
  • the solution can be used as it is, or also contain one or more stabilizing agents, such as Tween® (20, 40, 60 or 80), NaCl, or even DMPE-PEG 5000.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a complex formed between a nucleic acid of interest and a lipophilic compound or a lipid vesicle of the invention, where appropriate in combination with one or more physiologically compatible vehicles or excipients.
  • the organic layer was washed twice with 5 ml of water and then dried over magnesium sulfate.
  • the solvents were removed in vacuo.
  • the crude dioleylbromopropylphosphoramide was obtained in the form of an oil.
  • the final reaction yield was 80%.
  • EXAMPLE 5 Transfection in vitro of a nucleic acid of interest complexed with a lipophilic compound according to the invention.
  • the cell lines K562, Jurkat, Daudi and HeLa were used.
  • the cells were cultured in RPMI-1640 medium or in MEM culture medium supplemented with 10% fetal calf serum (SVF), 0.2 mM glutamine, 100 U / L of penicillin, 100 U / ml of streptomycin and 1% fungizone. All the cells were maintained in an atmosphere at 5% CO 2 at the temperature of 37 ° C.
  • the plasmid used is the plasmid pTG11033 encoding the luciferase protein under the control of the cytomegalovirus promoter (pCMV), developed by the company TRANSGENE (Strasbourg, France).
  • Each of the cationic phosphonolipids was prepared individually or in combination with the neutral lipid DOPE (sold by the company SIGMA CHEMICALS, Saint-Quentin Fallavier, France).
  • the phosphonolipids were formulated by mixing solutions of the different lipids in chloroform in glass tubes, then removing the chloroform by evaporation on a rotary evaporator, in order to obtain dry films of lipids.
  • Small unilamellar vesicles were prepared by sonicating the compounds for ten minutes in a sonicator device (sold by the company PROLABO, Paris, France).
  • a sonicator device sold by the company PROLABO, Paris, France.
  • the plasmid pTG11033 was first diluted in sterile, pyrogen-free distilled water, then added to the lipid solution.
  • the cationic phosphonolipid / DNA complexes were stored for 30 minutes at room temperature before being administered to animals, or used for in vitro transfections.
  • the first type of preparation 12.5 ⁇ g of cationic lipid compound was mixed with 4 ⁇ g of DNA (the plasmid pTG 11033).
  • the second type of preparation 25 ⁇ g of cationic lipid compound are mixed with 8 ⁇ g of DNA (the plasmid pTG 11033).
  • the complexes were formulated either (i) with a cationic lipid compound of the invention used alone or (ii) with a mixture of a lipid compound of the invention and DOPE (dioleylphosphatidyl ethanolamine).
  • Non-adherent cells (cell lines K562, Jurkat and Daudi) were cultured in 75 cm 2 culture plates. For the transfection tests, the cells were seeded in 24-well tissue culture plates, at a rate of 500,000 cells per well. For the adherent cell line (HeLa), the cells were seeded in 24-well tissue culture plates at the rate of 150,000 cells per well.
  • the cells were incubated in the tissue culture plates for 24 hours before the transfection step, then incubated overnight in a culture incubator in a humid atmosphere at 5% CO 2 , at a temperature of 37 ° C. .
  • the transfection of the cells was carried out according to the technique described by FELGNER et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84: 7413), with the following modifications:
  • the appropriate amounts of cationic lipids and of the plasmid vector PTG11033 were complexed in 100 ⁇ l of an OptiMEM solution (Ref. 31985-047, Gibco BRL / Life Technologies / Cergy- Pontoise, France) supplemented with L-glutamine, Sodium bicarbonate (2.4 g / l), HEPES buffer, sodium pyruvate, hypoxanthine, thymidine, growth factor and red phenol (1.1 mg / l).
  • the preparation is identical to that described in Section A.2 above.
  • 100 ⁇ l of the cationic phospholipid / DNA complex solution was added to each culture well.
  • the cells were added with 2 ml of the appropriate culture medium. After an additional 48 hour incubation at 37 ° C., the cells were tested for the expression of the gene coding for luciferase, using a chemiluminescent kit (sold by the company PROMEGA, Charbonippos, France). The tests were carried out according to the manufacturer's recommendations. The results are expressed in TRLU units (for “Total Relative
  • the relative cytotoxicity of the different cationic phosphonolipid / DNA complexes was determined as a representation of the number of living cells after the transfection experiment, measured using a chemiluminescent test, the CYTOLITE® test (marketed by the company PACKARD, France), according to the manufacturer's recommendations.
  • the cells were transfected as described in Section A.3 above.
  • the cells were seeded in the wells of a 24-well plate, at a rate of: - 500,000 cells per well for the non-adherent cell lines (K 562, Jurkat, Daudi); and
  • the cells were treated for transfection as described above and incubated for an additional 48 hours. After incubation, the cytotoxicity test was carried out according to the manufacturer's recommendations.
  • RLU Relative Light Units
  • the toxicity index represents the ratio between the number of living cells in the control cultures (without cationic lipid / DNA complex) and the number of living cells in the culture wells containing the transfected cells.
  • each preparation of lipid vector / DNA complexes described in section A.2. of the “Materials and methods” section above was used on each of the cell lines described in section A.1 of the “Materials and Methods” section above, at the same time, and under conditions identical to those described in section A.3 of the “Materials and Methods” section above.
  • FIGS. 1, 2, 3 and 4 show that the cationic lipid compounds of the invention, which contain a phosphoramide bond are more effective and less cytotoxic than the compounds of the prior art such as the compound EG 308 , and that commonly marketed transfection agents, such as DOTAP and PEI.
  • Cationic lipid / DNA complexes are produced at a charge ratio (+/-) of 4 and are administered to mice of the Swiss line six weeks old, by a single injection into the tail vein. Each animal received a volume of 200 ⁇ l of a solution of the lipid / DNA complex tested, corresponding to 50 ⁇ g of plasmid DNA coding for the luciferase protein. The animals were killed 24 hours after the injection and each organ of interest was frozen in liquid nitrogen, then stored at the temperature of -70 ° C.
  • the frozen tissues were ground with steel balls in a 2 ml Epperdorf type tube with a round bottom using a device of the Mill MM300 mixer type (sold by the company QIAGEN; reference: 0030120-094).
  • Protein extraction from each tissue was carried out by incubating the ground tissue in a PLB lysis buffer (Promega) then centrifugation at 10,000 g, 10 min at 4 ° C.
  • the luciferase activity was tested on the lysis supernatants using the chemiluminescence test "Luciferase Assay System” sold by the company PROMEGA.
  • the cationic lipid / plasmid DNA complexes were prepared as described in Example 5, with charge ratios (+/-) varying from 0 to 6.
  • the lipid / DNA complexes were administered to mice of the Swiss line. six weeks of age, by inhalation of 150 ⁇ l of the complex solution, using an aerosol device. The inhalation was carried out using the “Microsprayer” aerosol device (sold by the company PENN-CENTURY, Inc.), which allows atomization to be carried out directly in the trachea.
  • Each animal received a dose of 50 ⁇ g of plasmid DNA coding for the luciferase protein, in the form of the lipid / DNA complex.
  • the animals were sacrificed 72 hours after the injection.
  • the lungs were collected, then frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C. Protein extraction from frozen lungs and measurement of RLU units per mg protein were performed as described in section A.1 above.
  • the results are shown in FIG. 6.
  • the results of FIG. 6 show the advantage of the lipophilic transfection compounds according to the invention, compared with the lipophilic compounds of the state of the art or even with DNA alone.
  • Compounds with a C18: 1 hydrophobic chain are particularly effective at transfecting the lungs of mice, whether used alone or in combination with cholesterol.
  • the KLN20 compound is the most effective.

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Abstract

La présente invention a pour objet un composé lipophile cationique de formule générale (I) suivante: dans laquelle: a) R1 et R'1 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle, une chaîne alcényle ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone, avec la chaîne polyalcényle ayant de 2 à 4 double liaisons ; b) R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; et R3 est un groupe de formule (IIa) suivante : -(CH2)n- ou (IIb) suivante: -C(=NH)-NH-(CH2)n- dans laquelle : - n est un entier égal à 0, 1, 2, 3 ou 4 ; et d) A+ est un cation organique ; e) X- est un anion.

Description

Nouveaux composés lipophiles et leurs utilisations
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à de nouveaux composés lipophiles ayant une affinité avec les acides nucléiques. Ces nouveaux composés peuvent être utilisés en tant que vecteurs non-viraux pour introduire un acide nucléique d'intérêt dans une cellule hôte choisie ou dans un organisme hôte choisi.
ART ANTERIEUR
Dans les années récentes, de nombreux auteurs se sont intéressés au développement de vecteurs non-viraux destinés à transporter un ADN d'intérêt à travers la membrane cellulaire et jusqu'au noyau cellulaire, notamment dans le cadre de la mise au point de procédés de thérapie génique.
Dans la revue de A.D. MILLER intitulée « Cationic liposomes for gene therapy » (Angewandte Chem. Int., Ed. Engl., 1998, Vol. 37 : 1768-
1785), qui constitue une revue générale sur les lipides cationiques, on peut noter que la charge positive du cation est toujours portée par un atome d'azote.
Parmi les composés lipophiles utilisés dans l'état de la technique comme vecteurs non viraux, on peut citer les halogénures de -1 ,2 dioleyl-3 triméthylammonium deoxyglycerol, communément appelé DOTAP, le -1 ,2 dioleyl-3 triméthylammonium, communément appelé DOTMA, le diméthylammonium éthyloxycarbonylcholesterol, communément désigné DC-chol.
On a aussi décrit des phosphonolipides , tels que ceux décrits par
G. Le Bolc'h et al., (Tetrahedron Lett., 1995, 36, 6681) et V. Floch et al (Eur. J. Med. Chem., 1998, 33, 12.), des phosphonolipides sous la forme d'un sel du cation ammonium .(V. Floch et al., Eur. J. Med. Chem., 1998/, Vol. 33 : 923-934) ou sous la forme d'un sel du cation phosphonium ou arsonium (E. Guénin et al., Anew.Chem Int. Ed., 2000, Vol. 39(3); V. Floch et al., J. Med. Chem., 2000, Vol. 43 (24) : 4617- 4628).
Néanmoins, les vecteurs lipophiles cationiques non-viraux ont une capacité réduite de transfection d'ADN dans des cellules et possèdent des propriétés cytotoxiques vis-à-vis de ces cellules.
Il existe donc un besoin, dans l'état de la technique, pour des vecteurs non-viraux transportant plus efficacement un acide nucléique à travers la membrane cellulaire, jusqu'au noyau cellulaire, afin d'obtenir des rendements de transfection supérieurs à ceux observés avec les vecteurs non-viraux connus.
Un autre objectif recherché est l'obtention de nouveaux vecteurs non-viraux possédant une capacité de transfection améliorée combinée à une faible cytotoxicité pour les cellules à transfecter.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Le demandeur a désormais synthétisé de nouveaux composés lipophiles cationiques, de type mono- ou bis- phosphoramide, et contenant une partie cationique de type « Onium », qui possèdent une haute capacité de transfection d'un acide nucléique dans les cellules, supérieure à celle des vecteurs non-viraux connus, notamment des phosphonolipides connus. De plus, les nouveaux composés lipophiles selon l'invention possèdent des propriétés de cytotoxicité réduites, par rapport aux composés vecteurs non-viraux décrits dans l'état de la technique.
L'invention a donc pour objet de nouveaux composés lipophiles cationiques, de type mono- ou bis- phosphoramides, et contenant une partie cationique de type « Onium », qui sont décrits plus loin dans la description détaillée de l'invention. La partie « Onium » des composés lipophiles cationiques de l'invention peut être un ammonium, un phosphonium ou un arsonium, ou encore un cation organique, tels que les cations imidazolium, thiazolium ou pyridinium.
La présente invention concerne aussi des vésicules lipidiques, unilamellaires ou multilamellaires, comprenant, ou constituées principalement ou presque exclusivement d'un composé lipophile selon l'invention, de préférence sous la forme d'un complexe entre ledit composé lipophile et un acide nucléique d'intérêt.
L'invention est également relative à un complexe formé entre un acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile tel que défini ci-dessus.
Elle concerne aussi des procédés pour introduire, in vitro ou in vivo, un acide nucléique d'intérêt dans une cellule hôte ou un organisme hôte, en utilisant un complexe formé entre ledit acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile de l'invention, le cas échéant présenté sous la forme de vésicules lipophiles unilamellaires ou multilamellaires.
L'invention a également trait à une composition pharmaceutique contenant, en tant que principe actif, au moins un complexe formé entre un acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile tel que défini ci- dessus, le cas échéant en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La FIGURE 1 illustre les résultats comparatifs de transfection in vitro de cellules de la lignée cellulaire K562 avec des composés lipophiles de l'art antérieur et des composés lipophiles selon l'invention ou encore avec un mélange d'un composé lipophile selon l'invention avec un composé lipophile de l'état de l'art antérieur. La transfection a été réalisée avec un ADN d'intérêt codant la protéine marqueur luciférase. En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules. Entre parenthèses sont rapportés les rapports de masse entre le(s) composé(s) lipidique(s) et l'ADN.
En ordonnées, les résultats d'efficacité de transfection correspondent à l'activité luciférase retrouvée dans les différents échantillons de cellules transfectées en culture, ces résultats étant exprimés en unités TRLU (Total Relative Light Units), comme décrit dans la partie « Matériels et Méthodes » de l'Exemple 5.
La FIGURE 2 illustre les résultats comparatifs de transfection in vitro de cellules de la lignée cellulaire Jurkat avec des composés lipophiles de l'art antérieur et des composés lipophiles selon l'invention ou encore avec un mélange d'un composé lipophile selon l'invention avec un composé lipophile de l'état de l'art antérieur. La transfection a été réalisée avec un ADN d'intérêt codant la protéine marqueur luciférase. En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules. Entre parenthèses sont rapportés les rapports de masse entre le(s) composé(s) lipidiques et l'ADN.
Sur la Figure, « DC-CHOL » signifie le produit commercial (le 3β- [N-(N',N'-diméthylaminoéthane)carbamoyl]cholestérol.
En ordonnées, les résultats d'efficacité de transfection correspondent à l'activité luciférase retrouvée dans les différents échantillons de cellules transfectées en culture, ces résultats étant exprimés en unités TRLU, comme décrit dans la partie « Matériels et Méthodes » de l'Exemple 5.
La FIGURE 3 illustre les résultats comparatifs de transfection in vitro de cellules de la lignée cellulaire Daudi avec des composés lipophiles de l'art antérieur et des composés lipophiles selon l'invention ou encore avec un mélange d'un composé lipophile selon l'invention avec un composé lipophile de l'état de l'art antérieur. La transfection a été réalisée avec un ADN d'intérêt codant la protéine marqueur luciférase.
En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules. Entre parenthèses sont rapportés les rapports de masse entre le(s) composé(s) lipidique(s) et l'ADN.
Sur la Figure, « DC-CHOL » signifie le produit commercial (le 3β- [N-(N',N'-diméthylaminoéthane)carbamoyl]cholestérol.
En ordonnées, les résultats d'efficacité de transfection correspondent à l'activité luciférase retrouvée dans les différents échantillons de cellules transfectées en culture, ces résultats étant exprimés en unités TRLU, comme décrit dans la partie « Matériels et
Méthodes » de l'Exemple 5.
La FIGURE 4 illustre les résultats comparatifs de transfection in vitro de cellules cardiomyocytes de souris en culture primaire avec des composés lipophiles de l'art antérieur et des composés lipophiles selon l'invention ou encore avec un mélange d'un composé lipophile selon l'invention avec un composé lipophile de l'état de l'art antérieur. La transfection a été réalisée avec un ADN d'intérêt codant la protéine marqueur luciférase.
En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules, utilisés selon trois rapports distincts charge +/charge -. Par exemple, au rapport 2, la composition testée contient deux fois plus de charges positives (composé cationique lipophile) que de charges négatives (apportées par les molécules d'ADN).
En ordonnées, les résultats d'efficacité de transfection correspondent à l'activité luciférase retrouvée dans les différents échantillons de cellules transfectées en culture, ces résultats étant exprimés en unités TRLU, comme décrit dans la partie « Matériels et
Méthodes » de l'Exemple 5. Sur la Figure 4, « D » signifie
DOPE(dioléylphosphatidyléthanolamine) et « DD » signifie DOPE + DOTAP.
La FIGURE 5 illustre des résultats comparatifs de cytotoxicité entre différents composés lipophiles de l'invention, des composés lipophiles de l'art antérieur et des mélanges de composés lipophiles de l'invention avec des composés lipophiles de l'art antérieur.
En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules. Entre parenthèses sont rapportés les rapports de masse entre le(s) composé(s) lipidique(s) et l'ADN.
En ordonnées, les résultats d'efficacité de transfection correspondent à l'activité luciférase retrouvée dans les différents échantillons de cellules transfectées en culture, ces résultats étant exprimés en unités TRLU, comme décrit dans la partie « Matériels et
Méthodes » de l'Exemple 5.
La FIGURE 6 illustre les résultats comparatifs d'efficacité de transfection in vivo d'un ADN codant la luciférase, entre différents composés lipophiles de l'invention, différents composés lipophiles de l'art antérieur et des mélanges entre des composés lipophiles de l'invention et des composés lipophiles de l'art antérieur.
En abscisse, les différents composés ou mélanges de composés utilisés pour former des complexes avec l'ADN d'intérêt avant transfection des cellules. Sur la Figure 6, « D » signifie DOPE et « Chol » signifie cholestérol.
En ordonnées, les résultats comparatifs d'efficacité de transcription sont visualisés selon la quantité de luciférase retrouvée dans les poumons des animaux sacrifiés, ces résultats étant exprimés en unités RLU, comme décrit dans la partie « Matériels et Méthodes » de l'Exemple 6. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le demandeur a synthétisé de nouveaux composés lipophiles cationiques, de type mono-phosphoramide ou bis-phosphoramide, et possédant une partie cationique de type « Onium », combinant une capacité supérieure de transfection des cellules par un acide nucléique d'intérêt et des propriétés de cytotoxicité réduites, par rapport aux vecteurs non-viraux lipophiles antérieurement connus.
L'invention a pour objet un composé lipophile cationique de formule générale (I) suivante :
dans laquelle : a) R1 et R'1 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle, une chaîne alcényle ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone, avec la chaîne polyalcényle ayant de 2 à 4 double liaisons ; b) R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; et
R3 est un groupe de formule (Ma) suivante : -(CH2)n- ou (llb) suivante :
-C(=NH)-NH-(CH2)n- dans laquelle :
- n est un entier égal à 0, 1 , 2, 3 ou 4 ; et d) A+ est un cation organique ; e) X" est un anion. Par «alkyle», on entend selon l'invention un groupe hydrocarboné aliphatique, qui peut être linéaire ou branché. La chaîne alkyle peut être substituée, sur un ou plusieurs des atomes de carbone la constituant, par un groupe choisi parmi les groupes hydroxy, alcoxy et alkylthio. Préférentiellement, un atome de carbone de la chaîne hydrocarbonée comprend au maximum un seul substituant. Préférentiellement, au maximum trois atomes de carbone de la chaîne hydrocarbonée sont substitués par au moins l'un des groupes ci-dessus.
Par « alcényle », on entend selon l'invention un groupe alkyle contenant une double liaison carbone-carbone, qui peut être localisée à un endroit quelconque de la chaîne hydrocarbonée.
Par « polyalcényle », on entend selon l'invention un groupe alkyle contenant de deux à quatre double liaisons carbone-carbone dans la chaîne hydrocarbonée, qui peuvent être localisées à un endroit quelconque de la chaîne hydrocarbonée en positions « maloniques » relatives.
Par « cation organique », on entend selon l'invention tout groupe chimique organique contenu dans un composé lipophile de l'invention et chargé positivement en solution. Par « anion », on entend selon l'invention toute molécule organique ou minérale qui est chargée négativement en solution.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les propriétés améliorées des composés lipophiles ci-dessus permettant une transfection efficace d'un acide nucléique d'intérêt, aussi bien in vitro qu'in vivo, sont dues à la fragilité de la liaison covalente entre la partie lipophile et la partie cationique de ces composés, ladite liaison étant clivée après le passage du composé lipophile à travers la membrane cellulaire, ce qui libère la partie cationique qui conserve les propriétés de liaison à l'acide nucléique polyanionique d'intérêt, et qui peut être transportée jusqu'au noyau des cellules. La partie lipophile libre, après le clivage, peut être dégradée sous l'action des diverses enzymes cellulaires, en particulier des diverses enzymes présentes dans le cytoplasme.
Le demandeur a en effet observé, par mesure du spectre RMN 1H et 31P, que la liaison entre l'atome de phosphore (P) et l'atome d'azote (N) d'un composé lipophile cationique de formule (I) est rapidement hydrolysée, en l'absence d'enzyme, à une valeur de pH à environ 4-5, ce qui est le pH retrouvé dans les endosomes ou les lysosomes intra- cytoplasmiques de la cellule. En particulier, en l'absence de toute enzyme, la liaison P-N est totalement hydrolysée après une incubation du composé de formule (I) pendant 6 heures à un pH d'environ 4-5, à la température de 20°C.
De préférence, X" est un anion choisi parmi CF3CO2", CF3SO3 ",
HS04", et un halogène. Préférentiellement, l'halogène est choisi parmi
CI', Bf et P. Selon un premier mode de réalisation préféré, un composé lipophile tel que défini ci -dessus est caractérisé en ce que le groupe A est un cycle aromatique hétérocyclique à cinq ou six chaînons comprenant un hétéroatome constitué d'un azote quaternaire lié par une liaison covalente au groupe R3. De préférence, le cycle aromatique hétérocyclique comprend un second hétéroatome choisi parmi S ou N. Préférentiellement, lorsque le second hétéroatome est N, ledit second hétéroatome est substitué par une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
Selon un aspect préféré de ce premier mode de réalisation d'un composé lipophile, le groupe A est un thiazolium ou un imidazolium, avec le second hétéroatome d'azote éventuellement substitué par une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
Des composés préférés appartenant à ce premier mode de réalisation de l'invention sont les suivants : - iodure de ditétradecyl 2-(1 -méthyl-1 H-imidazol-3-ium-3-yl) éthylamidophosphate [composé KLN27] ; iodure de dioleyl 2-(1-méthyl-1H-imidazol-3-ium-3-yl) éthylamidophosphate [composé KLN28] ;
- iodure de ditétradecyl 2-(1 ,3-thiazol-3-ium-3yl) éthylamidophosphate [composé KLN37] . - iodure de ditétradecyl 2-(1-méthyl-1 H-imidazol-3-ium-3- yl)propylamidophosphate [composé KLN16a].
Selon un second mode de réalisation préféré, un composé lipophile tel que défini ci-dessus est caractérisé en ce que le groupe A est un cycle aromatique hétérocyclique à six chaînons comprenant un hétéroatome d'azote quaternaire. Préférentiellement, le groupe A est un cycle pyridinium.
Selon un aspect préféré de ce second mode de réalisation, le composé lipophile de l'invention est caractérisé en ce que le groupe A est représenté par la formule (III) suivante :
dans laquelle R13 représente une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
Un composé préféré appartenant au second mode de réalisation d'un composé lipophile selon l'invention est le composé : - iodure de ditétradecyl 2-(1-methyl-1 -/-pyridin-1-ium-4-yl) éthylamidophosphate [composé KLN38]
Selon un troisième mode de réalisation préféré, un composé lipophile selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe A est un cation de formule (IV) suivante :
D6
dans laquelle : f) Z représente N, P ou As ; g) R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; et h) R6 représente une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone.
On a montré selon l'invention que les composés appartenant au troisième mode de réalisation ci-dessus et possédant un haut niveau de capacité à transfecter un acide nucléique dans une cellule cible sont préférentiellement ceux pour lesquels les groupes R4, R5 et R6 représentent chacun un groupe méthyle.
De préférence, le groupe R2 représente l'hydrogène, un groupe méthyle ou un groupe éthyle.
De préférence, le groupe R3 de formule (lia) [-(CH2)n-] ou (llb) [- C(=NH)-NH-(CH2)n-] est tel que n est un entier égal à 2, 3 ou 4. De préférence, Z représente P ou As, et de manière tout à fait préférée, Z représente As.
Des composés préférés appartenant au troisième mode de réalisation d'un composé lipophile selon l'invention sont choisis parmi les composés suivants : - iodure de 3-[[bis(tétradecyloxy)phosphoryl](méthyl)amino]-N.N.N- trimethylpropanaminium [composé KLN5] ; iodure de 3-[[bis(oleyloxy)phosphoryl](méthyl)amino]-N.N.N- trimethylpropanaminium [composé KLN6] ;
- iodure de 3-[[bis(tétradécyloxy)phosphoryl](éthyl)amino]-N.N.N- trimethylethanaminium [composé KLN13] ; iodure de 3-[[bis(oleyloxy)phosphoryl](ethyl)amino]-N.N.N- trimethylethanaminium [composé KLN14] ; iodure de ditétradecyl 2-(triméthylphosphonio) éthyl propylamidophosphate [composé KLN19] ; - iodure de dioléyl 3-(triméthylphosphonio) propylamidophosphate
[composé KLN20] ; - iodure de ditétradecyl 2-(triméthylarsonio) éthylamidophosphate [composé KLN29] ;
- iodure de dioleyl 2-(t methylarsonio) éthylamidophosphate [composé KLN30] ; - iodure de ditétradecyl 3-(triméthylarsonio) propylamidophosphate
[composé KLN31] ;
- iodure de dioleyl 3-(triméthylarsonio) propylamidophosphate [composé KLN32] ;
Les composés lipophiles cationiques appartenant aux premier, second et troisième modes de réalisation ci-dessus sont tous des composés du type mono-phosphoramide.
Selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, un composé lipophile actif est obtenu en liant de manière covalente deux composés du type mono-phosphoramide, les deux composés mono- phosphoramides étant liés entre eux par une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, qui remplace le groupe R6 de chacun des deux composés mono-phosphoramides, résultant en un composé bis- phosphoramide qui fait également partie de l'invention.
Ainsi, l'invention a encore pour objet un composé lipophile de formule (I) telle que définie ci-dessus, ledit composé étant caractérisé en ce que le groupe A est un cation de formule (IV) suivante :
(IV) dans laquelle : i) Z représente N, P ou As ; j) R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; k) R6 représente le groupe de formule (V) suivante : dans laquelle :
I) R7 et R8 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, et m) R9 représente un groupe de formule (VI) suivante :
dans laquelle : n) R10 représente -(CH2)n- où n est un entier égal à 0, 1 , 2, 3 ou 4 ; o) R11 représente H ou un groupe alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ; et p) R12 et R'12 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle, une chaîne alcényle ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone, avec la chaîne polyalcényle ayant de 2 à 4 double liaisons ; De préférence, selon ce quatrième mode de réalisation d'un composé lipophile selon l'invention, les groupes R12 et R 12 sont identiques aux groupes R1 et R 1, respectivement. Préférentiellement, les groupes R3 et R10 sont identiques.
De manière préférée, les groupes les groupes R4 et R5 sont identiques aux groupes R7 et R8, respectivement. Un composé préféré bis-phosphoramide appartenant au quatrième mode de réalisation ci-dessus est le composé suivant : diiodure de N1,N4-bis(3-
<{ [bis(tétradécyloxy)phosphoryl]amino}propyl)-N1, N1, N ,N4- tétraméthyl-1 ,4 butane diaminium [composé KLN39].
De manière générale, pour les composés lipophiles de formule (I) du type monophosphoramides selon l'invention, les groupes R4, R5 et R6 sont préférentiellement identiques.
De même, pour les composés lipophiles de formule (I) du type bis- phosphoramides tels que définis ci-dessus, les groupes R4, R5, R7 et R8 sont de préférence identiques.
Préférentiellement, pour les composés lipophiles bis- phosphoramides tels que définis ci-dessus, les groupes R2 et R11 sont identiques. Comme déjà mentionné précédemment, les groupes lipidiques R1 et R'1, et , pour les composés bis-phosphoramides, également les groupes lipidiques R12 et R'12, représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle de 10 à 24 atomes de carbone, une chaîne alcényle de 10 à 24 atomes de carbones ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone et possédant de 2 à 4 double liaisons par chaîne.
Selon un premier aspect, les groupes R1 et R'1 sont identiques. Selon un second aspect, les groupes R12 et R'12 sont identiques. Selon un troisième aspect, les groupes R1, R'1, R12 et R'12 sont tous identiques.
Lorsque au moins un groupe, parmi les groupes R1, R'1, R12 et R'12, représente une chaîne alkyle de 10 à 24 atomes de carbones, ladite chaîne alkyle est de préférence choisie parmi les chaînes de 14 à 20 atomes de carbone. Un groupe lipophile préféré possédant une chaîne alkyle de 10 à 24 atomes de carbone est le groupe tetradécyl ou myristyl, ayant 14 atomes de carbone.
Lorsque au moins un groupe, parmi les groupes R1, R'1, R12 et R'12, représente une chaîne alcényle de 10 à 24 atomes de carbone, ladite chaîne alcényle est de préférence choisie parmi les chaînes de 14 à 20 atomes de carbone.
Un groupe lipophile préféré possédant une chaîne alcényle de 18 atomes de carbone et possédant une double liaison oléfinique est le groupe oleyl.
Lorsque au moins un groupe, parmi les groupes R1, R'1, R12 et R'12, représente une chaîne polyalcényle, ladite chaîne polyalcényle est de préférence choisie parmi les chaînes de 14 à 20 atomes de carbone.
De préférence, la chaîne polyalcényle est choisie parmi les groupes Ci8:2 et Cι8 :3, dans lesquels le premier nombre représente le nombre d'atomes de carbone dans la chaîne alcényle et le second nombre représente le nombre de double liaisons dans la chaîne alcényle.
De manière générale, le problème technique de l'invention peut être résolu avec des groupes R1, R'1, R12 et R'12 , chaque groupe représentant, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle de 10 à 24 atomes de carbone, une chaîne alcényle de 10 à 24 atomes de carbones ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone et possédant de 2 à 4 double liaisons par chaîne, puisque ces différentes chaînes alkyle, alcényle ou polyalcényle sont toutes suffisamment hydrophobes pour permettre à un composé lipidique de l'invention d'entrer en contact avec la membrane cellulaire, puis de pénétrer dans la cellule en traversant la bi-couche lipidique de la membrane cellulaire, puis d'atteindre le noyau en passant à travers la membrane nucléaire.
La synthèse des différents modes de réalisation des composés lipophiles mono-phosphoramide est décrite en détail dans les Exemples. Par exemple, pour synthétiser un composé lipophile de formule (I), dans lequel le groupe A est un cation de formule (IV) avec le groupe R6 représentant une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, on fait réagir un composé phosphite de formule (VII) suivante :
une diamine de formule (VIII) suivante
R2
en présence d'un agent de transfert de phase approprié, tel que le chlorure de benzyltriéthylammonium, puis on récupère le composé de formule (I) tel que défini ci-dessus en quaternarisant l'aminé -N(R4R5) du composé de formule (VIII) ci-dessus par un halogénure d'alkyle R6-X approprié.
A titre illustratif, pour préparer un composé de formule (I) dans lequel le groupe A représente un cycle aromatique hétérocyclique à cinq chaînons comprenant un hétéroatome constitué d'un azote quaternaire lié par une liaison covalente au groupe R3, tel qu'un hétérocycle imidazole ou thiazole, le procédé de synthèse suivant est utilisé, exemplifié pour l'imidazole. a) On fait réagir un composé phosphite de formule (VII) suivante :
avec un composé aminé de formule (IX) suivante R2
^-R3 Br (|X) en présence d'un agent de transfert de phase approprié, tel que le chlorure de triéthyl benzylammonium , afin d'obtenir le composé intermédiaire de formule (X) suivante :
b) puis le composé de formule (X) ci-dessus est mis à réagir avec le N-méthyl imidazole, afin d'obtenir le composé de formule (XI) suivante :
Pour préparer un composé de formule (I) dans le lequel que le groupe A est un cycle aromatique hétérocyclique à six chaînons comprenant un hétéroatome d'azote quaternaire, tel que la pyridine, on procède selon le schéma réactionnel défini ci-dessus pour les composés dont le groupe A consiste en un cycle aromatique hétérocyclique à six chaînons et comprenant un atome d'azote quaternaire.
Pour préparer un composé lipophile du type bis-phosphoramide selon l'invention, on peut utiliser par exemple le procédé ci-dessous. On fait réagir un composé phosphite de formule (VII) tel que décrit ci-dessus avec une diamine de formule (VIII) telle que décrite ci-dessus, dans les mêmes conditions, puis on fait réaαir 2 équivalents du composé obtenu avec un équivalent d'un dihalogénure d'alkyle X - R10 - X approprié.
De manière générale, tout autre procédé de synthèse conventionnelle peut être mis en œuvre par l'homme du métier pour préparer un composé lipophile monophosphoramide ou bisphosphoramide selon l'invention.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que la partie cationique du composé lipophile selon l'invention porte les propriétés de liaison dudit composé à l'acide nucléique d'intérêt, ledit acide nucléique étant un composé polyanionique. La partie lipidique du composé lipophile, représentée par les groupes R1 et R'1 et, pour les composés bisphosphoramides, également par les groupes R12 et R'12, permet au composé lipophile de l'invention de se fixer sur la membrane cellulaire, de traverser bi-couche lipidique de la membrane cellulaire puis d'atteindre le cytoplasme et/ou le noyau, au niveau duquel l'acide nucléique d'intérêt est transcrit, ou encore au niveau duquel l'acide nucléique d'intérêt s'hybride avec un acide nucléique cible naturellement présent dans la cellule, soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau.
Aux fins de la présente description, les termes « acide nucléique », polynucléotide » et « oligonucléotide » englobent les molécules d 'ADN, d'ARN, les molécules hybrides ADN/ARN de plus de deux nucléotides de longueur, indifféremment sous la forme simple brin ou double brin.
Ainsi, n'importe lequel des composés lipophiles de l'invention peut être utilisé tel quel, de préférence en solution, pour être complexé avec un acide nucléique d'intérêt, dont l'introduction par transfection dans une cellule hôte est recherchée.
Selon un cinquième mode de réalisation préféré de l'invention, un composé lipophile selon l'invention est mis en œuvre sous la forme de vésicules lipidiques, qui sont ensuite mises en contact avec un acide nucléique d'intérêt de manière à former un complexe entre ledit acide nucléique et les vésicules lipidiques ainsi préparées.
Selon un premier aspect préféré, les vésicules lipidiques sont préparées en utilisant exclusivement un composé lipophile monophosphoramide ou bisphosphoramide de l'invention. Selon ce premier aspect, les vésicules lipidiques peuvent être préparées à partir d'un mélange de plusieurs composés lipophiles de l'invention, de préférence au maximum quatre, et de manière tout à fait préférée deux composés lipophiles distincts selon l'invention. Font ainsi partie de l'invention des vésicules lipidiques comprenant un composé lipophile monophosphoramide ou bisphosphoramide choisi parmi les composés définis ci-dessus.
Font également partie de l'invention des vésicules lipidiques constituées essentiellement d'un ou de plusieurs composés lipophiles monophosphoramide ou bisphosphoramide tels que définis ci-dessus. Par « essentiellement », ont entend des vésicules lipidiques comprenant au moins 90% en poids d'un ou d'une pluralité de composés lipophiles de l'invention.
Font également partie de l'invention des vésicules lipidiques constituées exclusivement d'un ou de plusieurs composés lipophiles monophosphoramide ou bisphosphoramide tels que définis ci-dessus.
Selon un second aspect préféré, les vésicules lipidiques sont préparées en utilisant un mélange d'au moins un composé lipophile de l'invention avec au moins un composé lipophile ne faisant pas partie de l'invention, de manière tout à fait préférée un composé lipophile se liant à un acide nucléique et utilisable comme vecteur non-viral d'un acide nucléique d'intérêt. Un tel composé lipophile vecteur non-viral est par exemple un composé lipophile de l'état de la technique, tels que la DOPE, le DOTAP, le DOTMA, ou le cholestérol. De telles vésicules lipidiques comprennent au maximum quatre, et préférentiellement au maximum deux, composés lipophiles distincts selon l'invention. De même, de telles vésicules lipidiques comprennent au maximum quatre, et préférentiellement au maximum deux, composés lipophiles distincts ne faisant pas partie de l'invention. De manière tout à fait préférée, les vésicules lipidiques englobées par le second aspect préféré du cinquième mode de réalisation ci-dessus comprennent respectivement un seul composé lipophile de l'invention, en mélange avec un seul composé lipophile ne faisant pas partie de l'invention. Dans ces vésicules, les proportions des différents composés lipophiles sont variables. Lorsque les vésicules comprennent un composé lipophile de l'invention et un composé lipophile ne faisant pas partie de l'invention, on préfère un rapport en poids composé de l'invention: :autre composé lipophile compris entre 10: :1 à 1 : :2, avantageusement entre 6: :1 et 1 : :1 , et de manière tout à fait préférée entre 4: :1 et 1 : :1.
Selon ce second aspect préféré du cinquième mode de réalisation ci-dessus, font également partie de l'invention des vésicules lipidiques comprenant au moins un composé lipophile monophosphoramide ou bisphosphoramide de l'invention et au moins un autre composé lipophile.
Selon un troisième aspect du cinquième mode de réalisation ci- dessus, les vésicules lipidiques se présentent sous la forme de vésicules lipidiques unilamellaires, spécifiquement de petites vésicules unilamellaires.
Selon un quatrième aspect, les vésicules lipidiques se présentent sous la forme de vésicules lipidiques multilamellaires.
Les vésicules lipidiques de l'invention peuvent être préparées par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par dissolution préalable du ou des composé(s) lipophile(s) dans un solvant, tel qu'un milieu aqueux, par exemple de l'eau distillée apyrogène ou une solution saline physiologiquement compatible, puis sonication de la solution ainsi obtenue. Une fois préparées, les vésicules lipidiques de l'invention peuvent être conservées à long terme, par exemple sous forme congelée dans l'azote liquide. Toutefois, on préfère une préparation extemporanée de ces vésicules, au maximum quelques heures, par exemple au maximum 4 heures, avent leur mise en contact ou incubation avec un acide nucléique d'intérêt. Selon un sixième mode de réalisation préféré de l'invention, l'acide nucléique d'intérêt qui doit être introduit dans une cellule hôte code une protéine ou un peptide. La protéine peut être n'importe quelle protéine utile pour la réalisation d'un procédé de thérapie génique, de préférence de thérapie génique somatique, et englobe, sans y être limitée, les cytokines, les protéines de structures, les hormones, les antigènes, les immunogènes, les récepteurs etc.
Selon un second aspect préféré du sixième mode de réalisation ci- dessus, l'acide nucléique d'intérêt code un polynucléotide sens ou antisens qui s'hybride avec un acide nucléique cible codant une protéine dont l'inhibition de l'expression dans une cellule hôte est recherchée.
Selon encore un autre aspect préféré, l'acide nucléique d'intérêt consiste en un vecteur recombinant, de préférence un vecteur d'expression recombinant, dans lequel est inséré l'acide nucléique d'intérêt, dont la séquence codante est placée sous le contrôle de séquences régulatrices, notamment promoteur ou séquence activatrice (« enhancer »), nécessaires à l'expression dudit acide nucléique d'intérêt dans la cellule hôte transfectée.
Selon l'invention, l'acide nucléique d'intérêt, linéaire ou circulaire, simple brin, ou double brin, est tout d'abord complexé avec un composé lipophile monosphoramide ou bisphosphoramide de l'invention, avant d'être introduit, sous la forme du complexe, dans la cellule hôte.
Comme décrit précédemment, les complexes sont préférentiellement formés par incubation de l'acide nucléique avec les vésicules lipidiques définies ci-dessus. Toutefois, dans certains cas, les complexes peuvent être formés en incubant l'acide nucléique d'intérêt avec un composés lipophile de l'invention, ou un mélange de plusieurs composés lipophiles de l'invention, les complexes ainsi formés étant ultérieurement utilisés pour la transfection des cellules hôtes. Selon une alternative, des vésicules lipidiques, unilamellaires ou multilamellaires, sont formées à partir des complexes acide nucléique/composé(s) lipophile(s) préalablement préparés, puis les vésicules sont utilisées pour transfecter les cellules hôtes.
De préférence, les complexes formés entre des molécules d'acide nucléique et des molécules de composés lipophiles comprennent un rapport en poids acide nucléique/composés lipophiles compris entre 0,5 et 100, avantageusement entre 1 et 10, et préférentiellement entre 2 et 5.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un composé lipophile ou d'une vésicule lipidique tels que définis ci-dessus, pour introduire, in vitro ou in vivo, un acide nucléique dans une cellule hôte ou dans un organisme hôte.
L'invention concerne aussi un procédé pour introduire, in vitro ou in vivo, un acide nucléique dans une cellule hôte ou un organisme hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit acide nucléique avec un composé lipophile ou avec une vésicule lipidique tels que définis ci-dessus, afin d'obtenir un complexe entre ledit acide nucléique, dune part, et ledit composé ou ladite vésicule lipidique, d'autre part ; b) incuber la cellule hôte avec le complexe formé à l'étape a), ou administrer, de préférence par injection, le complexe formé à l'étape a) à l'organisme hôte.
Préférentiellement, ladite cellule hôte est une cellule de mammifère non humain ou une cellule humaine
Préférentiellement, l'organisme hôte est un homme ou un mammifère non humain, bien que l'on ne puisse exclure l'application du procédé ci- dessus chez d'autres organismes supérieurs comme les plantes. L'invention est également relative à un complexe formé entre un acide nucléique et un composé lipophile phosphoramide ou bisphosphoramide ou une vésicule lipidique tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne aussi une composition comprenant un complexe formé entre un acide nucléique et un composé lipophile phosphoramide ou bisphosphoramide ou une vésicule lipidique tels que définis ci-dessus.
Comme cela a déjà été mentionné précédemment, les complexes formés entre un acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile ou une vésicule lipidique de l'invention peuvent être administrés par toute méthode appropriée permettant leur introduction dans les cellules d'un homme ou d'un animal, tel que par injection dans les espèces interstitiels des tissus (cœur, muscle, peau, poumon, foie, intestins, etc.). De préférence, les complexes sont présentés sous la forme d'une composition contenant également un véhicule physiologiquement compatible.
Dans une forme de réalisation particulière d'administration des complexes selon l'invention, la composition contenant ces complexes se présente sous une forme adaptée à une administration par aérosol, par exemple pour inhalation. Pour l'injection d'un entre un composé lipophile ou d'une vésicule lipidique de l'invention et un acide nucléique d'intérêt, la quantité d'ADN, d'ARN ou d'ADN/ARN d'intérêt pour une dose injectable est avantageusement comprise entre 0,005 mg/kg et 50 mg/kg de poids de l'homme ou l'animal à traiter. De préférence, la quantité d'acide nucléique varie de 0,005 mg/kg à 20 mg/kg, et de manière tout à fait préférée de 0,05 mg/kg à 5 mg/kg.
Bien entendu, l'homme du métier est en mesure d'adapter la quantité d'acide nucléique dans une dose pour injection, en fonction notamment de la pathologie à traiter et du site d'injection. La quantité d'acide nucléique pour une dose injectable est déterminée par l'homme du métier. L'invention a également pour objet un procédé pour introduire in vivo un acide nucléique d'intérêt dans les cellules d'un organisme hôte, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) a) mettre en contact ledit acide nucléique avec un composé lipophile ou avec une vésicule lipidique tels que définis ci-dessus afin d'obtenir un complexe entre ledit acide nucléique, dune part, et ledit composé ou ladite vésicule lipidique, d'autre part ; b) administrer les complexes formés à l'étape a) audit organisme hôte.
Comme déjà mentionné, l'organisme hôte est préférentiellement un homme ou un mammifère non humain, bien qu'il puisse aussi s'agir d'une plante.
En général, les complexes formés entre un acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile ou une vésicule lipidique de l'invention sont présents dans une solution liquide appropriée, telle que de l'eau distillée stérile et apyrogène, en des quantités de complexes appropriées. La solution peut être utilisée telle quelle, ou encore contenir également un ou plusieurs agents stabilisants, tels que le Tween® (20, 40, 60 ou 80), du NaCI, ou encore du DMPE-PEG 5000.
La présente invention est encore relative à une composition pharmaceutique comprenant un complexe formé entre un acide nucléique d'intérêt et un composé lipophile ou une vésicule lipidique de l'invention, le cas échéant en association avec un ou plusieurs véhicules ou excipients physiologiquement compatibles.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES
De manière générale, la structure de chacun des nouveaux composés décrits dans les exemples suivants a été vérifiée par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 1H, 13C et 31P. EXEMPLE 1 : Synthèse du iodure de 3-rrbis(tétradécyloxy) phosphoryl(methyl)amino1-N,N,N-triméthylpropanaminium (KLN5).
Une solution de 2,37 g (5 mmoles) de ditétradécylphosphite, 0,581 g (5 mmoles) de N.N.N' triméthyl-1 ,3 propanediamine et 70 mg de chlorure de triéthylbenzylammonium dans 3 ml de dichlorométhane ont été ajoutés à un mélange biphasique constitué de 3 ml de dichlorométhane, 3 ml de tétrachlorure de carbone et 4 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 20%, en maintenant la température de la réaction entre 0°C et 5°C.
Après agitation pendant une heure de ce mélange à une température comprise entre 0 et 5°C, le mélange est agité pendant une durée de 1 heure à température ambiante.
Puis, la phase organique est lavée deux fois avec 5 ml d'eau, puis séchée sur du sulfate de magnésium. Les solvants sont éliminés.
La structure du produit final est vérifiée par spectroscopie RMN 1H et 31P. Puis, l'aminé tertiaire intermédiaire est dissoute dans 5 ml de dichlorométhane , auquel est ajouté 0,4 ml d'iodure de méthyle, qui est trois fois en excès par rapport à l'intermédiaire d'aminé tertiaire. Après agitation pendant une nuit à la température ambiante, le solvant a été éliminé et le composé iodure de 3-
[[bis(tétradécyloxy)phosphoryl (méthyl)amino]-N,N,N- triméthylpropanaminium (KLN5) est précipité à partir du diéthyléther, puis séché sous vide, jusqu'à l'obtention d'une poudre blanche. Le rendement final de la réaction est de 85%.
EXEMPLE 2 : Synthèse du iodure de dioléyl 3- (triméthylphosphonio)propylamidophosphate (KLN20).
Une solution constituée de 2,91 g (5 mmoles) de dioleylphosphite,
1 ,095 g (5 mmoles) d' hydrobromure de bromopropylamine et 15 mg de chlorure de benzyltriéthylammonium dans le dichlorométhane (3 ml) est ajoutée lentement à un système biphasique constitué de tétrachlorure de carbone (3 ml), de dichlorométhane (3 ml) et 4 ml d'une solution aqueuse à 20% d'hydroxyde de sodium, en maintenant la température de la réaction entre 0°C et 5°C.
L'agitation est poursuivie pendant une heure à une température comprise entre 0°C et 5°C, puis l'agitation est poursuivie pendant une durée additionnelle d'une heure à la température ambiante.
La couche organique a été lavée deux fois avec 5 ml d'eau puis séchée sur du sulfate de magnésium.
Les solvants ont été éliminés sous vide. Le dioléylbromopropylphosphoramide brut a été obtenu sous la forme d'une huile. Le rendement final de la réaction a été de 80%.
A 1 g (1 ,4 mmole) du bromophosphoramide obtenu ci-dessus, dissous dans 5 ml de tétrahydrofurane (THF), on a ajouté 3 ml d'une solution 1 ,0 M de triméthylphosphine dans le THF, sous une atmosphère d'azote.
Le mélange réactionnel a été agité pendant une semaine sous atmosphère d'azote à température ambiante. Puis le solvant a été éliminé sous vide et le phosphonium brut a été cristallisé deux fois à partir d'acétate d'éthyle . On a obtenu du iodure de dioleyl 3-(triméthylphosphonio)propylamidophosphate (KLN20) dont la pureté, supérieure à 99%, a été contrôlée à la fois par RMN 1H, 13C et 31 P et par chromatographie sur couche mince (CCM) (éluant CHCIa/MeOH 9 :1 ; Rf = 0,21).
Le rendement final de la réaction a été de 60%.
EXEMPLE 3 : Synthèse du iodure de ditétradecyl 2-(1-méthyl-1H- imidazol-3-ium-3-yl.éthylamidophosphate (KLN 27). A une solution de ditétradécylphosphite (2,37 g, 5 mmoles), d'hydrobromure de 3-bromopropylamine (1 ,946 g, 5 mmoles) et environ 70 mg de chlorure de triéthylbenzylammonium dans 6 ml de dichlorométhane et de 3 ml de tétrachlorure de carbone, on a ajouté 4 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 20%, tout en maintenant à la température de la réaction entre 0°C et 5°C.
Après agitation pendant une heure à la température de 0°C à 5°C, on a poursuivi l'agitation pendant une heure à la température ambiante.
Comme dans l'exemple 1 , la réaction conduit à la synthèse de l'intermédiaire bromophosphoramide de formule
(C14H290)2P(0)NHCH2CH2Br.
L'intermédiaire bromophosphoramide ci-dessus a été mélangé avec deux équivalents de N-méthyl imidazole. Ce mélange a été chauffé à la température de 40°C-50°C sous agitation pendant trois jours. Puis, après refroidissement, le mélange réactionnel a été dilué dans 15 ml de dichlorométhane et l'excès d'imidazole a été éliminé par traitement avec une résine d'acide sulfonique (DOWEX 50W x 8, 1 meq
H+/g).
Puis on a éliminé le solvant sous vide afin d'obtenir le phosphoramide du iodure de ditétradecyl 2-(1-méthyl-1 H-imidazol-3-ium-3- yl)éthylamidophosphate (KLN 27), avec une pureté > 99% déterminée selon les mêmes méthodes que dans l'exemple 2.
Le rendement final de la réaction a été de 84%.
EXEMPLE 4 : Synthèse de l'iodure de 5-imino-N,N.N-trimethyl- 7(tetradecyloxy,-8-oxa-4,6-diaza-7-phosphadocosan-1 -aminium 7- oxyde (KLN 67) :
A 4,74 g (10 mmoles) de ditétradécylphosphite, on ajoute 1 ,85 g
(10 mmoles) de bromhydrate de 2-éthyl-2-thiopseudourée, 1 ,93 mL (20 mmoles) de tétrachlorure de carbone et 3,48 mL (20 mmoles) de diisopropyléthylamine en maintenant la température entre 0 et 5°C. On garde sous agitation à cette température pendant une heure, puis laisse revenir à température ambiante durant une autre heure. On ajoute ensuite 1 ,1 g (15 mmoles) de N,N-dimethylethylènediamine et 20 mL de toluène, et porte au reflux durant 24 heures. Le toluène et les excès d'aminés sont éliminés sous vide. Après précipitation à froid dans un peu d'ether diéthylique et lavages dans ce même solvant, on obtient 4 g de I' aminophosphoguanidine (Ci4H290)2P(0)NH-C(=NH)-NH-CH2-CH2- N(CH3)2 que l'on solubilise dans 50 mL de dichlorométhane auxquels on ajoute 4,26 g (30 mmoles) d'iodométhane. Après 24 heures d'agitation à température ambiante, le solvant et l'excès d'iodométhane sont évaporés sous vide. Le résidu est précipité dans un peu d'ether diéthylique froid puis séché sous vide. On obtient 4,93 g (65% de rendement) de KLN 67, de formule (Cι4H29θ)2P(0)NH-C(=NH)-NH-CH2-CH2-N+(CH3)3 1" sous la forme d'une poudre blanche dont la pureté est contrôlée par les méthodes décrites dans les exemples précédents.
EXEMPLE 5: Transfection in vitro d'un acide nucléique d'intérêt complexé avec un composé lipophile selon l'invention. A. MATERIEL ET METHODES. A.1 Lignées cellulaires et plasmides
Pour les expériences in vitro, on a utilisé les lignées cellulaires K562, Jurkat, Daudi et HeLa.
Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 ou dans un milieu de culture MEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 0,2 mM de glutamine, 100 U/L de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine et 1 % de fungizone. Toutes les cellules ont été maintenues dans une atmosphère à 5% de C02 à la température de 37°C. Le plasmide utilisé est le plasmide pTG11033 codant la protéine luciférase sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus (pCMV), développé par la Société TRANSGENE (Strasbourg, France).
A.2 Préparation des complexes phosphonolipides cationiques/ADN
Chacun des phosphonolipides cationiques a été préparé isolément ou en combinaison avec le lipide neutre DOPE (commercialisé par la Société SIGMA CHEMICALS, Saint-Quentin Fallavier, France). Les phosphonolipides ont été formulés en mélangeant des solutions des différents lipides dans le chloroforme dans des tubes de verre, puis en éliminant le chloroforme par évaporation sur un dispositif évaporateur rotatif, afin d'obtenir des films secs de lipides.
On a ensuite ajouté de l'eau distillée stérile et apyrogène dans les tubes de verre, avant de sceller les tubes, lesquels sont ensuite placés à la température de 4°C pendant une nuit.
Des petites vésicules unilamellaires (suv) ont été préparées en soniquant les composés pendant dix minutes dans un dispositif sonicateur (commercialisé par la Société PROLABO, Paris, France). Pour préparer les complexes de phosphonolipides cationiques/ADN, le plasmide pTG11033 a tout d'abord été dilué dans de l'eau distillée stérile et apyrogène, puis ajouté à la solution de lipides. Les complexes phosphonolipides cationiques/ADN ont été conservés pendant 30 minutes à la température ambiante avant d'être administrés aux animaux, ou utilisés pour les transfections in vitro.
Deux types de préparation ont été réalisés. Pour le premier type de préparation, on a mélangé 12,5 μg de composé lipidique cationique avec 4 μg d'ADN (le plasmide pTG 11033). Pour le second type de préparation, on a mélange 25 μg de composé lipidique cationique avec 8 μg d'ADN (le plasmide pTG 11033). De plus, les complexes ont été formulés soit (i) avec un composé lipidique cationique de l'invention utilisé seul soit (ii) avec un mélange d'un composé lipidique de l'invention et le DOPE (dioléylphosphatidyl éthanolamine).
A. 3. Transfection in vitro et test mettant en œuyre un gène marqueur.
L'activité de transfection in vitro des complexes phosphonolipides cationiques/ADN a été testée en utilisant les lignées cellulaires K562, Jurkat, Daudi et Hela.
Les cellules non adhérentes (lignées cellulaires K562, Jurkat et Daudi) ont été cultivées dans des plaques de culture de 75 cm2. Pour les tests de transfection, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture de tissu de 24 puits, à raison de 500 000 cellules par puits. Pour la lignée de cellules adhérentes (HeLa), les cellules ont été ensemencées dans des plaques pour culture de tissu de 24 puits à raison de 150 000 cellules par puits.
Les cellules ont été incubées dans les plaques de culture de tissu pendant 24 heures avant l'étape de transfection , puis incubées pendant une nuit dans un incubateur de culture dans une atmosphère humide à 5% de C02, à la température de 37°C.
La transfection des cellules a été réalisée selon la technique décrite par FELGNER et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol.84 : 7413), avec les modifications suivantes : Les quantités appropriées de lipides cationiques et du vecteur plasmidique PTG11033 ont été complexées dans 100 μl d'une solution OptiMEM (Réf. 31985-047, Gibco BRL/Life Technologies/Cergy- Pontoise, France) additionnée de L-glutamine, Bicarbonate de sodium (2,4 g/l), Tampon HEPES, pyruvate de sodium, hypoxanthine, thymidine, facteur de croissance et rouge de phénol (1 ,1 mg/l). La préparation est identique à celle décrite dans la Section A.2 ci-dessus. 100 μl de la solution de complexes phospholipides cationiques/ADN a été ajoutée dans chaque puits de culture.
Après une durée de 2,5 heures à 37°C, les cellules ont été additionnées avec 2 ml du milieu de culture approprié. Après une incubation additionnelle de 48 heures à 37°C, les cellules ont été testées pour l'expression du gène codant la luciférase, en utilisant un kit chimioluminescent (commercialisé par la Société PROMEGA, Charbonnières, France). Les tests ont été réalisés selon les recommandations du fabriquant. Les résultats sont exprimés en unités TRLU (pour « Total Relative
Light Units »), pour une moyenne de 8 puits de culture identiques.
A.4. Détermination de la toxicité cellulaire
La cytotoxicité relative des différents complexes phosphonolipides cationiques/ADN a été déterminée comme une représentation du nombre de cellules vivantes après l'expérience de transfection, mesurée en utilisant un test chimioluminescent, le test CYTOLITE® (commercialisé par la Société PACKARD, France), selon les recommandations du fabriquant.
La transfection des cellules a été réalisée comme cela est décrit dans la Section A.3 ci-dessus.
Le jour de la transfection, les cellules ont été ensemencées dans les puits d'une plaque de 24 puits, à raison de : - 500 000 cellules par puits pour les lignées de cellules non adhérentes (K 562, Jurkat, Daudi) ; et
- 150 000 cellules par puits pour les lignées de cellules adhérentes (HeLa, CFPAC, cellules en culture primaire).
Les cellules ont été traitées pour la transfection comme décrit ci- dessus et incubées pendant une durée additionnelle de 48 heures. Après incubation, on a réalisé le test de cytotoxicité selon les recommandations du fabriquant.
La quantité d'unité de lumière relative (RLU pour « Relative light units ») formée est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Les cellules non transfectées ont été utilisées comme témoin.
Les résultats finals ont été exprimés selon un indice de toxicité
L'indice de toxicité représente le rapport entre le nombre de cellules vivantes dans les cultures témoins (sans complexe lipides cationiques/ADN) et le nombre de cellules vivantes dans les puits de culture contenant les cellules transfectées.
L'analyse de toxicité du composé iodure de 3-
[[bis(tétradécyloxy)phosphoryl(méthyl)amino]-N,N,N- triméthylpropanaminium [composé KLN 5] montre qu'il n'existe aucune différence entre les cultures de cellules témoins et les cultures de cellules transfectées et qu'ainsi la transfection ne présente aucune toxicité. L'indice de toxicité augmente avec les propriétés de cytotoxicité du lipide cationique testé.
B. RESULTATS Dans cet exemple, on a comparé les propriétés de toxicité à des complexes phosphonolipides cationiques/ADN de l'invention avec la cytotoxicité de complexes de vecteurs lipidiques/ADN connus dans l'état de la technique, respectivement les composés EG 308, le DOTAP et le PEI (polyéthyléneimine), dont les formules sont représentées ci -dessous.
DOTAP -[CH2-CH2-NH]n- PEI
Pour une évaluation comparative stricte de l'efficacité des phosphonolipides cationiques de l'invention, par rapport aux composés connus dans l'état de la technique, chaque préparation de complexes vecteurs lipidiques/ADN décrit dans la section A.2. de la partie « Matériel et méthodes » ci-dessus a été utilisée sur chacune des lignées cellulaires décrites dans la section A.1 de la partie « Matériel et Méthodes » ci-dessus, au même moment, et dans des conditions identiques à celles décrites dans la section A.3 de la partie « Matériel et Méthodes » ci-dessus.
Les résultats présentés dans les figures 1 , 2 , 3 et 4 montrent que les composés lipidiques cationiques de l'invention, qui contiennent une liaison du type phosphoramide sont plus efficaces et moins cytotoxiques que les composés de l'art antérieur comme le composé EG 308, et que les agents de transfection couramment commercialisés, comme le DOTAP et le PEI.
EXEMPLE 6 : Etude de la capacité de transfection in vivo des complexes phosphonolipides cationiques ADN de l'invention.
A. MATERIEL ET METHODES
A.1 Transfection in vivo par injection intraveineuse
Des complexes lipides cationiques/ADN sont réalisés à un rapport de charge (+/-) de 4 et sont administrés à des souris de la lignée Swiss âgées de six semaines, par une injection unique dans la veine caudale. Chaque animal a reçu un volume de 200 μl d'une solution du complexe lipides/ADN testé, correspondant à 50 μg d'ADN plasmidique codant la protéine luciférase. Les animaux ont été tués 24 heures après l'injection et chaque organe d'intérêt a été congelé dans de l'azote liquide, puis conservé à la température de -70°C.
Les tissus congelés ont été broyés avec des billes d'acier dans un tube de type Epperdorf de 2 ml à fond rond en utilisant un dispositif du type mixeur Mill MM300 (commercialisé par la Société QIAGEN ; référence : 0030120-094).
L'extraction des protéines à partir de chaque tissu a été réalisée en incubant les tissus broyés dans un tampon de lyse PLB (Promega) puis centrifugation à 10000g, 10 mn à 4°C.
L'activité luciférase a été testée sur les surnageants de lyse en utilisant le test de chimioluminescence « Luciférase Assay System » commercialisé par la Société PROMEGA.
Les résultats ont été exprimés en unités de lumière relative (RLU pour « Relative Light Unit »).
En parallèle, on a mesuré la concentration en protéines totales, en utilisant le kit « Coomassie Plus Reagent Assay Kit » (commercialisé par la Société Pierce). Les valeurs de RLU ont été normalisées en exprimant les résultats par mg de protéines totales.
A.2. Transfection in vivo par aérosol.
Les complexes de lipides cationiques/ADN plasmidique ont été préparés comme décrits à l'exemple 5, avec des rapports de charges (+/- ) variant de 0 à 6. Les complexes lipides/ADN ont été administrés à des souris de la lignée Swiss âgées de six semaines, par inhalation de 150 μl de la solution de complexes, à l'aide d'un dispositif aérosol. L'inhalation a été réalisée en utilisant le dispositif aérosol « Microsprayer » (commercialisé par la Société PENN-CENTURY, Inc.), qui permet de réaliser l'atomisation directement dans la trachée. Chaque animal a reçu une dose de 50 μg d'ADN plasmidique codant la protéine luciférase, sous la forme du complexe lipide/ADN.
Les animaux ont été sacrifiés 72 heures après l'injection. Les poumons ont été collectés, puis congelés dans de l'azote liquide et conservés à la température de -70°C. L'extraction des protéines à partir des poumons congelés et la mesure des unités RLU par mg de protéines ont été réalisées comme cela est décrit dans la section A.1 ci-dessus.
B. RESULTATS On a réalisé une étude comparative de différents lipides cationiques en faisant varier la partie de liaison (Groupe R3)entre le domaine hydrophobe et le domaine hydrophile, chez la souris. Chaque lipide a été évalué de manière isolée, ou en mélange avec le composé DOPE ou le cholestérol, utilisés comme co-lipides, comme décrit dans la partie « Matériel et Méthodes ».
Les résultats sont représentés sur la figure 6. Les résultats de la figure 6 montrent l'intérêt des composés lipophiles de transfection selon l'invention, comparés aux composés lipophiles de l'état de la technique ou encore à l'ADN seul. Les composés possédant une chaîne hydrophobe C18 :1 sont particulièrement efficaces pour transfecter les poumons des souris, qu'ils soient utilisés seuls ou en combinaison avec le cholestérol. Le composé KLN20 s'avère le plus efficace.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé lipophile cationique de formule générale (I) suivante
dans laquelle : a) R1 et R'1 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle, une chaîne alcényle ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone, avec la chaîne polyalcényle ayant de 2 à 4 double liaisons ; b) R2 est un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; et c) R3 est un groupe de formule (lia) suivante : -(CH2)n- ou (llb) suivante : -C(=NH)-NH-(CH2)n- dans laquelle :
- n est un entier égal à 0, 1 , 2, 3 ou 4 ; et d) A+ est un cation organique ; e) X" est un anion.
2. Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que X- représente un anion choisi parmi CF3C02 ', CF3SO3", HS04", et un halogène.
3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'halogène est choisi parmi CI", Br" et I".
4. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupe A est un cycle aromatique hétérocyclique à cinq chaînons comprenant un hétéroatome constitué d'un azote quaternaire lié par une liaison covalente au groupe R3.
5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le cycle aromatique hétérocyclique comprend un second hétéroatome choisi parmi S ou N.
6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lorsque le second hétéroatome est N, l'hétéroatome soit substitué par une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
7. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le groupe A est un thiazolium ou un imidazolium, avec le second hétéroatome d'azote éventuellement substitué par une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
8. Composé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les composés suivants : iodure de ditétradecyl 2-(1 -methyl-1 H-imidazol-3-ium-3-yl) éthylamidophosphate iodure de dioleyl 2-(1 -methyl-1 H-imidazol-3-ium-3-yl) éthylamidophosphate - iodure de ditétradecyl 2-(1 ,3-thiazol-3-ium-3-yl) éthylamidophosphate iodure de ditétracétyl 2-(1-méthyl-1 H-imidazol-3-ium-3- yl)propylamidophosphate.
9. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupe A est un cycle aromatique hétérocyclique à six chaînons comprenant un hétéroatome d'azote quaternaire.
10. Composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le groupe A est un cycle pyridinium.
11. Composé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le groupe A est représenté par la formule (III) suivante :
dans laquelle R13 représente une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.
12. Composé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il s'agit du composé suivant : iodure de ditétradecyl 2-(1 -méthyl-1 H-ρyridin-1-ium-4-yl) éthylamidophosphate.
13. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupe A est un cation de formule (IV) suivante :
dans laquelle : f) Z représente N, P ou As ; g) R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; h) R6 représente une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone.
14. Composé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le groupe R2 représente l'hydrogène, un groupe méthyle ou un groupe éthyle.
15. Composé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que le groupe R3 de formule (lia) [-(CH2)n-] ou (llb) [-C(=NH)-NH-(CH2)n-] est tel que n est un entier égal à 2, 3 ou 4.
16. Composé selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les composés suivants : - iodure de 3-[[bis(tetradecyloxy)phosphoryl](methyl)amino]-N.N.N- trimethylpropanaminium; iodure de 3-[[bis(oleyloxy)phosphoryl](méthyl)amino]-N.N.N- trimethylpropanaminium;
- iodure de 3-[[bis(tetradecyloxy)phosphoryl](ethyl)amino]-N.N.N- trimethylethanaminium; iodure de 3-[[bis(oleyloxy)phosphoryl](ethyl)amino]-N.N.N- trimethylethanaminium; iodure de ditétradecyl 2-(triméthylphosphonio) éthyl propylamidophosphate; - iodure de dioleyl 3-(triméthylphosphonio) propylamidophosphate;
- iodure de ditétradecyl 2-(trimethylarsonio) éthylamidophosphate;
- iodure de dioleyl 2-(trimethylarsonio) éthylamidophosphate;
- iodure de ditétradecyl 3-(triméthylarsonio) propylamidophosphate;
- iodure de dioleyl 3-(triméthylarsonio) propylamidophosphate;
17. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le groupe A est un cation de formule (IV) suivante :
dans laquelle : i) Z représente N, P ou As ; j) R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone ; k) R6 représente le groupe de formule (V) suivante :
dans laquelle :
I) R7 et R8 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, et m) R9 représente un groupe de formule (VI) suivante :
dans laquelle : n) R10 représente -(CH2)n- où n est un entier égal à 0, 1 , 2, 3 ou
4 ; o) R11 représente H ou un groupe alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ; et p) R12 et R'12 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne alkyle, une chaîne alcényle ou une chaîne polyalcényle de 10 à 24 atomes de carbone, avec la chaîne polyalcényle ayant de 2 à 4 double liaisons ;
18. Composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les groupes R12 et R 12 sont identiques aux groupes R1 et R 1, respectivement.
19. Composé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que les groupes R3 et R10 sont identiques.
20. Composé selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que les groupes les groupes R4 et R5 sont identiques aux groupes R7 et R8, respectivement.
21. Composé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il s'agit du composé suivant : diiodure de N1, N4-bis(3-<| [bis(tétradécyloxy)phosphoryl]amino}propyl)- N1, N1, N ,N4-tétraméthyl-1 ,4 butane diaminium .
22. Composé selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que les groupes R1 et R'1 sont choisis parmi :
- le groupe tetradécyl ; - le groupe oleyl ; et
- les groupes polyalcényle C18:2 et Cιβ:3, dans lesquels le premier nombre représente le nombre d'atomes de carbone dans la chaîne alcényle et le second nombre représente le nombre de double liaisons dans la chaîne alcényle.
23. Composé selon l'une des revendications 17 à 21 , caractérisé en ce que les groupes R12 et R'12 sont choisis parmi :
- le groupe tetradécyl ;
- le groupe oleyl ; et - les groupes polyalcényle C18:2 et C18.3, dans lesquels le premier nombre représente le nombre d'atomes de carbone dans la chaîne alcényle et le second nombre représente le nombre de double liaisons dans la chaîne alcényle.
24. Vésicule lipidique comprenant un composé selon l'une des revendications 1 à 23.
25. Vésicule lipidique constituée essentiellement d'un composé selon l'une des revendications 1 à 23.
26. Vésicule lipidique comprenant au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 23 et au moins un autre composé lipophile.
27. Vésicule lipidique selon l'une des revendications 24 à 26, consistant en une vésicule unilamellaire.
28. Vésicule lipidique selon l'une des revendications 24 à 26, consistant en une vésicule multilamellaire.
29. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 23 ou d'une vésicule lipidique selon l'une des revendications 24 à 28, pour introduire in vitro un acide nucléique dans une cellule hôte.
30. Procédé pour introduire in vitro un acide nucléique dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :* a) mettre en contact ledit acide nucléique avec un composé selon l'une des revendications 1 à 23 ou avec une vésicule lipidique selon l'une des revendications 24 à 28 afin d'obtenir un complexe entre ledit acide nucléique, dune part, et ledit composé ou ladite vésicule lipidique, d'autre part ; b) incuber la cellule hôte avec le complexe formé à l'étape a).
31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que ladite cellule hôte est une cellule de mammifère non humain ou une cellule humaine.
32. Complexe formé entre un acide nucléique et un composé selon l'une des revendications 1 à 23 ou une vésicule lipidique selon l'une des revendications 24 à 28.
33. Composition comprenant un complexe selon la revendication 32.
34. Composition pharmaceutique comprenant un complexe selon la revendication 32.
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