EP1218033A2 - Composes lipidiques cationiques et leur utilisation pour le transfert de substances d'interet therapeutique chargees negativement - Google Patents

Composes lipidiques cationiques et leur utilisation pour le transfert de substances d'interet therapeutique chargees negativement

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Publication number
EP1218033A2
EP1218033A2 EP00956608A EP00956608A EP1218033A2 EP 1218033 A2 EP1218033 A2 EP 1218033A2 EP 00956608 A EP00956608 A EP 00956608A EP 00956608 A EP00956608 A EP 00956608A EP 1218033 A2 EP1218033 A2 EP 1218033A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
radical
acid
general formula
cholanic
compound
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00956608A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Eliane Taillandier
Xuan An Cao
Robert Coudert
Régine NAEJUS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
Original Assignee
Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13 filed Critical Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
Publication of EP1218033A2 publication Critical patent/EP1218033A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C07J41/0061—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives one of the carbon atoms being part of an amide group

Definitions

  • the present invention relates to cationic lipid compounds. and their use for the transfer of substances of therapeutic interest negatively charged, and in particular of nucleic acids.
  • nucleic acids Apart from a few very specific cases, nucleic acids alone do not penetrate cells, organs or organisms, and therefore require the use of a vector. To date, various techniques have been described for the transfer of nucleic acids and in particular DNA, the most important and promising of which involve viral vectors or lipid vectors.
  • Viral vectors are effective but have certain risks, including pathogenicity, immunogenicity, transmission, recombination, replication, transformation etc ..; there is therefore a security problem in the use of these.
  • cationic lipids can, by their positive charges, easily form complexes with negatively charged nucleic acids and help them to cross the lipid cell barrier, also negatively charged; the nucleic acids can then pass into the nucleus. Efforts are being made to develop cationic lipids with a high level of transfection. N This is achieved if the lipid carrier form, with high efficiency, complex with the nucleic acid to be transported helps protect said nucleic enzymatic degradation extra and intracellular acid, and has a permissible cytotoxicity.
  • the cationic lipid formulations currently existing on the market have an average price of 1500 F / mg, and are marketed: * by Gibco (USA) under the names of:
  • Lipofectin whose basic lipid is “DOTMA” (N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -NNN-trimethylammonium chloride), - "Lipofectamine”. whose base lipid is - ⁇ DOSPA "(2,3-dioleyloxy-N- (2 (spermine carboxamido) ethyl) -NN-dimethyl-1-propanaminium) trifluoroacetate).
  • DOTMA N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -NNN-trimethylammonium chloride
  • Lipofectamine whose base lipid is - ⁇ DOSPA "(2,3-dioleyloxy-N- (2 (spermine carboxamido) ethyl) -NN-dimethyl-1-propanaminium) trifluoroacetate).
  • DMRIE 1.2-dimyristyloxypropyl-3-N.N-dimethyl hydroxy ammonium bromide
  • DAC 30 whose basic lipid is “DAC-Chol” (3- ⁇ - (- ( " NN “ -dimethylaminoethane) -carbamoyl) cholesterol).
  • Non-marketed products two main families of cationic lipids have been reported to date. All these compounds have a hydrophobic tail linked to an amine polar head bearing one or more nitrogen atoms positively charged. These families are distinguished by the hydrophobic part which can be a double alkyl chain or a cholesterol derivative. These compounds form complexes with nucleic acids (plasmids or oligonucleotides). Encouraging results on the level of transfection of cells in culture have been published [1-4a, 13, 14]. Among the monoamine cholesterol derivatives, the best known derivative is
  • DC-Chol corresponding to 3- ⁇ [N- (N '.N “ -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [3, 4a] and the" TC-Chol "corresponding to 3- ⁇ [N- (N', N ', N " - Trimethylaminoethane chloride) -carbamoyl] cholesterol [4b], the derivative marketed is "DAC-Chol", corresponding to 3- ⁇ [N- (N.N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5].
  • the medium used must be practically devoid of serum: for example, the maximum percentage of serum used n does not exceed 20% for formulation of DC-Chol in assays on A431 cells. and a formulation of DAC-Chol in tests on HepG2 and COS-1 cells.
  • the use of these vectors to deliver nucleic acids in tests in vivo intravenously is still problematic.
  • Another type of cationic amphiphile was synthesized by the attachment of polyamines on the polar sites of cholic acid [10].
  • transfection levels 6 to 10 times higher than that of lipofectin were obtained with molecules carrying a spermine, pentamine or hexamine group. These molecules differ from those of the present invention in that they do not contain a spacer arm between the polar sites and the hydrophobic part.
  • One object of the invention to provide cationic lipids capable of including transport negatively charged substances, especially nucleic acids, including in a medium containing a high concentration of serum, for the purpose of gene therapy. vaccination, biology, physiology, genetics and biotechnology.
  • One of the other aims of the invention is to provide cationic lipids having an improved transfecting power compared to the cationic lipids known to date.
  • One of the other aspects of the present invention is to provide simple methods of synthesis of cationic lipids, to synthesize cationic lipids of the invention on an industrial scale, while having high yields.
  • the present invention relates to the use of a monocationic lipid compound of general formula (I)
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group
  • X is iodine. and / or a dicationic lipid compound of general formula (II) R ' 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 (II) wherein R ⁇ represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid.
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents a hydrogen atom, an alkyl radical, and in particular a methyl (-CH 3 ) or an ethyl (-C 2 H ; ).
  • X represents a halogen atom such as iodine or chlorine.
  • a method of preparing a lipid monocationic compound of general formula (I) according to the invention is characterized in that a compound of general formula (IIIa)
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3cc-hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group
  • R -0 in which R represents the cholesteryl radical.
  • Z is chlorine or a group 0-CO-0-R 3 wherein R represents an alkyl radical and in particular methyl or ethyl, to the action of a compound of general formula (IV) H 2 N - (CH 2 ) n - N (R) 2 (IV) in which R represents a hydrogen atom, an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, n represents an integer equal to 2 or 3, to form the compound of general formula (V)
  • R 2 represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a derivative of cholanic acid in particular one selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group R, -0 in which R represents the cholesteryl radical, Z represents the group O-CO-0-R 3 in which R 3 represents an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, is prepared by subjecting the compound of general formula (VIII)
  • R ' represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of acid 3, 7, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic, 3 ⁇ .l2 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group R r O or R, -0-CO- (CH 2 ) 2 in which R represents the cholesteryl radical, Z 2 represents a halogen such as chlorine, to the action of a compound of general formula (VII )
  • R O - CO - CH 2 - CH 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an atom .
  • hydrogen X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • R 2 represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3 .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid , the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or the acid-3.7,12 t ⁇ oxo-5 ⁇ -cholanic acid.
  • R represents a hydrogen atom.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
  • a more particular subject of the present invention is the use of the monocation lipid compound of general formula I (A)
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents an ethyl radical
  • n represents an integer equal to 1, 2.
  • X represents an iodine atom, and or a monocationic lipid compound of the general formula I (B)
  • R 2 CO - NH - (CH 2 ) n - N ' (R),. X 'I (B) wherein R 2 represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a drift of the cholanic acid Especially one chosen from the group consisting of the radical of the acid 3 ⁇ , 7, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3.7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R is a methyl radical or ethyl, n is an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, and / or a lipid dicationic compound of general formula II (a) R, O - CO - N [CH 2 - CH 2 - N '.
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • a lipid dicationic compound of general formula II (B) R O - CO - CH 2 - CH - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • C wherein R, represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of the cholanic acid , in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R represents a methyl or ethyl radical.
  • n an integer equal to 2 or 3
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • the invention relates more particularly to the monocationic lipid compound as defined above, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
  • TAPC-Chol [N- (N ', N', N ' -triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol) represented by the general formula I (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to
  • X represents an iodine atom
  • Cholamide ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is 2 and X is iodine.
  • Trimethylaminopropane Cholamide (TAP-1)
  • Cholamide ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X is iodine.
  • Deoxycholamide represented by the general formula I (B) in which R 2 represents the radical of 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine ,
  • Deoxycholamide represents by the general formula I (B) in which R, represents the radical of 3cc acid, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic. R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine,
  • Lithocholamide ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine,
  • Lithocholamide ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine.
  • R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine.
  • R O - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X] 2 II (A) in which R represents the cholesteryl radical.
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical,
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
  • R O - CO - CH 2 - CH, - CO - N [CH, - CH, - N ⁇ (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical.
  • R represents an atom hydrogen, a methyl or ethyl radical.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of an acid derivative cholanic, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 -hydroxy-5 ⁇ - acid cholanic or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • the invention is more particularly the lipid dicationic compound as defined above, characterized in that it is selected from the group consisting of: - 3- ⁇ [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - carbamoyl] cholesterol (BAEC- Chol) represented by the general formula II (A), in which R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom.
  • the invention also relates to a composition characterized in that it contains a cationic lipid compound as defined above.
  • the invention relates to a composition characterized in that it is in the form of a cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, in which R represents the radical of a derivative of l cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid. and a solvent such as ethanol.
  • R represents the radical of a derivative of l cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid.
  • a solvent such as ethanol
  • the invention also relates to a composition characterized in that it is in the form of cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, wherein R, represents the radical cholesteryl.
  • R represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a derivative of cholanic acid in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ .l2 ⁇ - trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. acid 3 ⁇ .l2 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. acid 3 - hydroxy-S ⁇ -cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid. and a solvent such as methylene chloride for the preparation of liposomes.
  • the invention also provides a liposome characterized in that it contains a composition as defined above, and a lipid (or colipid) neutral, particularly ethanolamine, dioleoylphosphatidyl (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol. or a fragment of antibody), and / or a surfactant, in particular selected from the group consisting of Simulsol 59.
  • a lipid (or colipid) neutral particularly ethanolamine, dioleoylphosphatidyl (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol. or a fragment of antibody), and / or a surfactant, in particular selected from the group consisting of Simulsol 59.
  • the invention also relates to a complex characterized in that it comprises a cationic lipid compound as defined above, or a composition as defined above, and a negatively charged compound, in particular a nucleic acid (deoxyribonucleic acid. ribonucleic, gene, plasmid, ribozyme or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
  • a nucleic acid deoxyribonucleic acid. ribonucleic, gene, plasmid, ribozyme or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified
  • the invention also relates to a complex characterized in that it comprises a liposome as defined above, and a negatively charged compound such as a nucleic acid (deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, gene, plasmid, oligonucleotide or ribozyme, which can be covalently modified or not) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
  • a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active principle, a complex as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for any mode of administration, including parenterally, topically or by inhalation.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is further characterized in that the amount of complex is from 0.5 to 30 mg / kg body weight per unit dose.
  • Figures 1 to 4 show the synthesis diagrams of monocationic and dicationic lipid compounds according to the invention.
  • Figure 1 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TEAPC-Chol.
  • the step (a) consists in adding to the starting product (1) (cholesteryl chloroformate), 2 equivalents of 3 -diethylamino-1 -propyl lamine and anhydrous ether at a temperature of 0 ° C. to obtain the carbamate of formula (2).
  • Step (b) comprises adding an excess of ethyl iodide on said carbamate (2) to obtain the compound number (3): the TEAPC-Chol of formula I (A).
  • FIG. 2 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAEC-Chol.
  • Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid.
  • Step (b) consists in adding 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride thus obtained to cholesteryl chloroformate (1), to obtain the numbered compound (2): BAEC-Chol corresponding to general formula II (A).
  • Figure 3 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAES-Chol.
  • Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid.
  • Step (b) consists in adding oxalyl chloride (COCl) 2 to cholesteryl hemisuccinate (1) in the presence of methylene chloride (CH 2 C1 2 ), to obtain the corresponding succinoyl chloride (2 ).
  • Step (c) consists in reacting the succinoyl chloride (2) on 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride, to obtain the numbered compound (3): BAES-Chol corresponding to general formula II (B) .
  • Figure 4 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TAP-Lithocholamide.
  • the step (a) comprises adding to the starting compound (1) (acid lithocholic still represented by R, COOH) of triethylamine in THF to give the intermediate compound (2) to which is added the compound C: H, -0-CO-Cl (step (b)) to obtain the mixed anhydride (3).
  • the step (c) comprises adding to the mixed anhydride (3), N, N-dimethylpropylene diamine to give tertiary amine (4).
  • Step (d) consists in taking the tertiary amine (4) obtained in step (c) above in tetrahydrofuran (THF) and the methyl iodide (ICH 3). to obtain the numbered compound (5): TAP-Lithocholamide corresponding to the general formula I (B).
  • Figures 5-1 1 are the results obtained when using in the form of liposomes with DOPE cationic lipid compounds according to the invention for the transfer of nucleic acids.
  • Figure 6 represents the levels of activity of ⁇ -galactosidase (10 RLU b "relative light unit” / mg) expressed respectively (from left to right) in the following cells: MCF-7, A549. 9L. U373MG and HUH7, said cells being transfected using liposome-Chol TEAPC according to the invention.
  • FIG. 7 represents the relative levels of transfection (%) in MCF-7 cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: lipofectamine.
  • DMRIE TEAPC-Chol according to the invention, transfectam, and cellfectine TC- Chol.
  • Figure 8 shows the transfection levels in CEM cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: Lipofectin.
  • TEAPC- Chol according to the invention and TAP-lithocholamide according to the invention.
  • the level of transfection is measured by the activity of ⁇ -galactosidase (10 3 RLU).
  • Figure 10 shows the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in .mu.M) cationic liposomes prepared from cationic lipids of the invention TEAPC-Chol (see curve with the black rectangle) and BAEC-Chol (see curve including the black circle), and from the known DC-Chol lipid (cf curve comprising the black triangle).
  • Figure 11 shows the transfection of relative levels (%) of tumor cells MCF7 by pCMV.beta-Chol liposomes BAEC-complexes according to the invention in the presence of fetal calf serum, depending on the molar charge ratio
  • X Lip (+) / nucleotide.
  • the white histogram represents 0% fetal calf serum (FCS).
  • the gray histogram represents 25% of SVF.
  • the hatched histogram represents 50% of SVF and the gridded histogram represents 10% of fetal calf serum.
  • the cationic lipid compounds according to the invention have many advantages that are especially illustrated in the examples given below.
  • Example 1 Monocation derivative of cholesterol (TEAPC-Chol).
  • R - O-CO - NH - (CH 2 ) 3 - N + (C, H 5 ) 3 , 1 " in which R, is the cholesteryl group
  • the lipid compounds of the prior art shown for comparison in this example are monoamino derivatives of cholesterol, namely the "DC-Chol”, corresponding to 3- ⁇ [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) - carbamoyl] cholesterol [3, 4a], and “DAC-Chol”, corresponding to 3- ⁇ [N- (N, N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5] and “TC-chol” corresponding to 3 - ⁇ [N- (N'.N ', N'
  • the TEAPC-Chol cationic lipid is in the form of an ion consisting of a quaternary ammonium carrying 3 ethyl groups. It is different from DC-chol which is a tertiary amine and from trimethylated TC-Chol. On the other hand, its spacer arm is 3 (CH 2 ) instead of 2 (CH 2 ).
  • DC-chol which is a tertiary amine and from trimethylated TC-Chol.
  • its spacer arm is 3 (CH 2 ) instead of 2 (CH 2 ).
  • the cationic lipid compound according to the invention can easily fix the negatively charged substances, unlike the neutral DC-Chol, which tends to push them because the lone pair on the nitrogen.
  • the TEAPC-Chol lipid according to the invention is different, compared to DAC-Chol (base lipid of "DAC30"), by the link arm ("linker”) and by the polar head.
  • the link arm of TEAPC-Chol is a secondary amide while that of DAC-Chol is a tertiary amide.
  • TEAPC-Chol lipid does not present a risk of the formation of degradation products, possibly toxic, specific to amines.
  • the polar head of the DAC-Chol lipid is a secondary amine hydrochloride.
  • c 'therefore is an acidic compound, unlike TEAPC-Chol is neutral and therefore more stable to the change of pH.
  • TEAPC-Chol is insensitive to the variation in pH in media whose pH is near neutral pH. This is the case for culture media and intracellular media. It is capable of protecting negatively charged and complexed entities against any degradation due to variations in pH.
  • TEAPC-Chol lipid is soluble in methylene chloride (CH, C1).
  • CH, C1 methylene chloride
  • TEAPC-Chol-based liposomes can therefore be prepared using CH, C1, which must be evaporated after the first stage of liposome preparation which consists in producing a thin film. Since the CH 2 C1 2 (bp. 40 ° C) is removed much more easily than the chloroform used until then (bp. 60 ° C), liposomes prepared from lipid TEAPC-Chol dissolved in CH 7 C1, show no toxicity due to the solvent.
  • the level of transfection in cells of MCF7 and 9L lines obtained with liposomes prepared from TEAPC-Chol is higher than that of TC-Chol.
  • TEAPC-Chol lipid gives liposomes of size between 1 10 to 180 nm. These liposomes are very stable over time, since these values only change by less than 5% after 1 year.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • oligonucleotide-liposome complexes formed penetrate into culture cells, adherent cells or cells in suspension.
  • the oligonucleotides are thus internalized in the cytoplasm or in the nucleus, depending on the sequence and the molecular structure chosen for the oligonucleotide.
  • the reaction is instantaneous and the yield is a function of the DOPE / Lip + ratio.
  • the 1: 1 formulation of DOPE / Lip-t- appears to be the best for several plasmids.
  • the liposome / plasmid complex enters cells in culture, adherent or in suspension, in 3-D culture in nodules and in solid tumors.
  • the level of expression of the reporter gene (luciferase or ⁇ -galactosidase) is high and, in the tests carried out on cells of the MCF7 line, higher than that of lipofectamine, DMRIE and TC-Chol.
  • the liposome-plasmid or liposome-oligonucleotide complexes are not very toxic for several cells up to a molar concentration of 100 ⁇ M in TEAPC-Chol cationic lipid.
  • Example 2 Dicationic derivatives of cholesterol (BAEC-Chol and BAES-Chol).
  • R O-CO-NtCH.-CH.-NH ⁇ . Cl " ]., In which R represents the cholesteryl group.
  • triaminocholesterol [8] is an entity that is not electrically charged.
  • the spacer is a biodegradable tertiary amide.
  • dicationic lipids according to the invention are products soluble in THF. which avoids the use of chlorinated solvents in the preparation of liposomes.
  • BAEC-Chol and BAES-Chol can be recrystallized from the THF-methanol mixture (50/50). avoiding the use of chromatographic techniques very heavy purification.
  • Example 3 Derivatives monocationic derivatives of cholanic acid (TAP- cholamide TAP-TAP-déoxvcholamide lithocholamide and TAP-mühydrocholamide..).
  • TAP-convergeoxycholamide TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide. are represented by the formula I (B): R, -CO-NH- (CH 2) 3 -N + (CHJ, s I ", wherein R, is a group derived from the cholanic acid
  • TAP-convergeoxycholamide TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide are listed below.
  • the link arm is a biodegradable amide.
  • the head is a quaternary ammonium.
  • Example 4 Synthesis of the TEAPC-Chol monocation lipid.
  • TEAPC-Chol was synthesized according to the diagram in Figure 1.
  • the new lipid was characterized by IR spectroscopy.
  • BAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98% purity). 3-diethylamino-1-propylamine
  • a solution of cholesteryl chloroformate (4.6 g; or 10 mmol in 60 cm 3 of anhydrous ether) is added dropwise to a solution of 3-diethylamino-1-propylamine (2.65 g; or 20 mmol in 50 cm 3 anhydrous ether) maintained at 0 ° C (ice bath).
  • the hydrochloride formed is removed by filtration and the solvent removed on a rotary evaporator.
  • the synthesis of quaternary ammonium iodide is carried out by reaction at reflux (12 hours) of ethyl iodide in large excess (40 mmol) on the residual carbamate dissolved in 50 cm 3 of tetrahydrofuran. After removal of the solvent and excess iodide.
  • BAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98%). diethylene triamine (99%). tetrahydrofuran (99 +%) are Aldrich products used without further purification. The other reagents are common laboratory chemicals.
  • the first step is to perform the synthesis of the dihydrochloride diethylene triamine of formula HN [CH, -CH, -NH, +, Cl "], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of hydrochloric acid (HCl) aqueous solution (IM).
  • HCl hydrochloric acid
  • IM aqueous solution
  • IR of group C 0 (KBr pellet) is at 1690.8 cm - 1 .
  • the first step consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride of formula HN [CH Stamm-CH 1 -NH 3 + , Cl " ], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of HCl in aqueous solution (IM) as described previously.
  • Example 7 Synthesis of the TAP monolithic lipid-lithocholamide.
  • the synthesis of TAP-lithocholamide was performed according to the diagram of Figure 4. A 9.5 g (2.5x10 "2 mol) of lithocholic acid (> 99%. Fluka) in 100 cm 3 of anhydrous THF (99.9%. Aldrich).
  • Example 8 Use of the TEAPC-Chol monocation derivative.
  • DOPE dioleolylphosphatidyl ethanolamine
  • the final cationic lipid concentration is 1 mg / ml, or 1.43 mM.
  • the mixture was vortexed for 2 minutes and sonicated for 30 minutes intermittently using a Bransonic sonicator model 1210. A clear solution is obtained.
  • the solution is centrifuged for 15 min with a speed of 12,000 g. The supernatant is removed and, if necessary, filtered through a Millipore filter.
  • Oligonucleotides and plasmids are characterized in size by a dynamic light scattering device. The number distribution indicates a single mode with an average diameter of 104 nm. The same preparation protocol is applicable to BAEC-Chol.
  • Oligonucleotides and plasmids The oligonucleotides used, varying in length from 12 to 28 seas, are supplied in lyophilized form by Genosys (Great Britain) or Eurogentec (Belgium). In order to visualize their internalization. certain oligonucleotides are labeled with fluorescein in position 5 " .
  • the oligonucleotides are dissolved in sterile water at a concentration of 3 mM in nucleotide.
  • the plasmids used are plasmids pCMV- ⁇ carrying a reporter gene coding for ⁇ - galactosidase (Clonetech), or pGL2-luc carrying a reporter gene coding for luciferase (Proméga).
  • Tris-EDTA buffer ethylenediamine tetraacetic acid
  • the cells used are adherent cells of cancerous origin (MCF7, A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16), or cells in suspension (CEM, U937).
  • the cells are cultured according to standard conditions for each type.
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • adherent cells MF7. A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16
  • RPMI 1640 medium Roswell Park
  • a quantity of DNA (plasmid or oligonucleotide) of 1 ⁇ g and the chosen quantity of TEAPC-Chol cationic liposomes were separately diluted in 10 ⁇ L of sterile water and slightly vortexed and then mixed.
  • the mixture is diluted in 1 ml of OptiMEM medium (Gibco) without serum.
  • the cells are washed with the serum-free medium and then mixed in the OptiMEM is added to the cells.
  • the OptiMEM is removed, replaced by 1 ml of culture medium containing 10% of serum.
  • the cells continue to be incubated for the required time. In tests to test the transfection capacity in the presence of serum. 1 ml of medium containing serum desired content is used instead of OptiMEM.
  • the method for evaluating the level of transfection is to detect the ⁇ - galactosidase by the reagent AMPGD (3- (4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3.2'- tricyclo (3.3.1.1) decane) -4-yl) phenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Tropix).
  • AMPGD 4- (4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3.2'- tricyclo (3.3.1.1) decane) -4-yl) phenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Tropix).
  • the AMPGD at pH> 9. leads to adamantanone and flag methyl dentaloxybenzoate. the latter is in an excited state and emits fluorescence, which allows perform the measurement [15].
  • the ⁇ -galactosidase or luciferase activity is measured 48 hours after transfection using the Galactolight Plus detection kit (Tropix) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the cells are washed twice, in 1 ml of phosphate buffer solution (PBS) each time, then lysed with 200 ⁇ L of lysis buffer containing 1 mM of freshly prepared dithiotreiol.
  • the extracts are harvested and centrifuged at 12,000 g for 5 min.
  • the transfection rate can be further enhanced by using a plasmid condensing agent such as spermine. before complexing with TEAPC-Chol liposomes.
  • a plasmid condensing agent such as spermine.
  • SEPIC simulsol 989
  • PEG polyethylene glycol
  • G3AG2AG2AG2CG2AG2AG2A2GAG2A are mixed with liposomes 1: 1, according to various X charge ratios.
  • the mixtures are filtered through filters
  • Millipore whose mass limit is 30 kDa to pass only free oligonucleotides, not linked to liposomes.
  • FIG. 6 represents the activity levels of ⁇ -galactosidase expressed respectively in cells of MCF7, A549, 9L, U373MG and HUH7, transfected using the TEAPC-Chol / DOPE liposomes. The best results are observed for 9L cells.
  • FIG. 7 indicates that the TEAPC-Chol / DOPE liposomes have a level of transfection 2 to 3 times higher than that of lipofectamine.
  • TAP-lithocholamide liposomes have a transfecting power 30 times greater than that of lipofectin. e) Effect of the DOPE / Lip + ratio on the level of transfection of tumor cells
  • the viability of the cells is detected by the MTT test.
  • the MTT test consists of detecting viable cells using the MTT reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -
  • MTT reagent (1 mg / ml of DMEM medium containing serum) are added and the cells are again incubated. After 3 h. the reagent is removed, replaced with 100 ⁇ L of DMSO (dimethyl sulfoxide) for 20 min. Cells "viable" give a blue color whose optical density at the wavelength of 570 nm varies proportionally to the number thereof.
  • FIG. 10 represents the variations in the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in ⁇ M) of the cationic liposomes used, prepared from TEAPC-Chol. BAEC-Chol or DC-Chol. The percentage is calculated relative to the optical density obtained from the non-transfected cells.
  • Figure 11 shows the transfection levels of MCF7 tumor cells with BAEC-Chol / pCMV ⁇ liposome complexes in the presence of fetal calf serum.
  • a variation in the level of transfection is observed as a function of the ratio X.
  • EPAND R .. BOTTEGA R .. HUANG L. (1993). Method for delive ⁇ ng nucleic acids into cells. publication of international application WO 93/05162 [15] JALN V.J. & MAGRATH I.T. (1991), A chemiluminescent assay for quantification of ⁇ -galactosidase in the femtogram range, Anal. Biochem., 199, 119-124.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un composé lipidique monocationique répondant à la formule générale I(A): R1O-CO-NH-(CH2)n-N<+>(C2H5)3, I<-> dans laquelle R1 représente le radical cholestéryle, n représente un entier égal à 1, 2 ou 3 et notamment le 3- beta [N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol) et/ou d'un composé lipidique monocationique de formule générale I(B) R2-CO-NH-(CH2)n-N<+>(R)3,X<-> dans laquelle R2 représente notamment le radical de l'acide abiétique, ou le radical d'un dérivé de l'acide cholanique (cholique, déoxycholique, déhydrocholique, lithocholique), R représente notamment un radical méthyle ou éthyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente notamment un atome de chlore ou d'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R<1>O-CO-N[CH2-CH2-N<+>(R)3,X<->]2 et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(B) R1O-CO-CH2-CH2-CO-N[CH2-CH2-N<+>(R)3,X<->]2 et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II)(C) R2-co-N[CH2-CH2-N<+>(R)3,X<->]2; dans lesquelles R1 représente le radical cholestéryle, R2 représente notamment le radical de l'acide abiétique, ou le radical d'un dérivé de l'acide cholanique (cholique, déoxycholique, déhydrocholique, lithocholique, R représente notamment un atome d'hydrogène, un radical méthyle ou éthyle, X représente notamment un atome de chlore ou d'iode, pour la transfection d'organismes vivants <i>in vivo</i>, d'organes <i>in vivo</i>, de tumeurs <i>in vivo</i>, ou de cellules <i>in vitro</i> ou <i>ex vivo</i>.

Description

COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE TRANSFERT DE SUBSTANCES D'INTERET THERAPEUTIQUE CHARGEES NEGATIVEMENT
La présente invention a pour objet des composés lipidiques cationiques. et leur utilisation pour le transfert de substances d'intérêt thérapeutique chargées négativement, et notamment d'acides nucléiques.
Mis à part quelques cas très particuliers, les acides nucléiques seuls ne pénètrent pas dans les cellules, les organes ou les organismes, et nécessitent ainsi le recours à un vecteur. A ce jour, différentes techniques ont été décrites pour le transfert d'acides nucléiques et notamment d'ADN, dont les plus importantes et prometteuses font intervenir des vecteurs viraux ou des vecteurs lipidiques.
Les vecteurs viraux sont efficaces mais présentent certains risques, dont notamment la pathogénicité, l'immunogénicité, la transmission, la recombinaison, la réplication, la transformation etc .. ; il existe donc un problème de sécurité dans l'utilisation de ces derniers.
Les vecteurs lipidiques, en particulier les lipides cationiques connaissent un développement de plus en plus important. En effet, les lipides cationiques peuvent, par leurs charges positives, former facilement des complexes avec les acides nucléiques chargés négativement et les aider à franchir la barrière cellulaire lipidique, également chargée négativement ; les acides nucléiques pourront ensuite passer dans le noyau. Des efforts sont déployés pour développer des lipides cationiques ayant un niveau de transfection élevé. Ceci n'est réalisé que si le vecteur lipidique forme, avec un grand rendement, des complexes avec l'acide nucléique à transporter, aide à protéger ledit acide nucléique de la dégradation enzymatique extra et intracellulaire, et présente une cytotoxicité admissible.
Les formulations de lipides cationiques existants actuellement sur le marché ont un prix moyen de 1500 F/mg, et sont commercialisées : * par Gibco (USA) sous les noms de :
- « Lipofectine ». dont le lipide de base est le « DOTMA » (chlorure de N- (l-(2,3-dioléyloxy)propyl)-N.N.N-triméthylammonium), - « Lipofectamine ». dont le lipide de base est le -< DOSPA » (trifluoroacétate de 2.3-dioléyloxy-N-(2(spermine carboxamido)éthyl)-N.N-diméthyl-l- propanaminium).
- « DMRIE ». dont le lipide de base est le « DMRIE » (bromure de 1.2- dimyristyloxypropyl-3-N.N-diméthyl hydroxy ammonium).
* par Boehringer (Allemagne) sous le nom de « DOTAP ». dont le lipide de base est le « DOTAP » ( -(l -(2.3-dioléyloxy)propyl-N.N.N-triméthylammonium sulfate de methyle)), par Proméga (USA) sous le nom de « Transfectam ». dont le lipide de base est le « DOGS » (dioctadécylamidoglycyl spermine)
* par Eurogentec (Belgique) sous le nom de « DAC 30 ». dont le lipide de base est le « DAC-Chol » (3-β-( -("N.N"-diméthylaminoéthane )-carbamoyle ) cholestérol).
Concernant les produits non commercialisés, deux grandes familles de lipides cationiques ont été à ce jour rapportées. Tous ces composés possèdent une queue hydrophobe liée à une tête polaire aminée portant un ou plusieurs atomes d'azote chargés positivement. Ces familles se distinguent par la partie hydrophobe qui peut être une double chaîne alkyle ou un dérivé du cholestérol. Ces composés forment des complexes avec des acides nucléiques (plasmides ou oligonucléotides). Des résultats encourageants sur le niveau de transfection des cellules en culture ont été publiés [l-4a, 13, 14]. Parmi les dérivés du cholestérol monoaminés, le dérivé le plus connu est le
« DC-Chol ». correspondant au 3-β[N-(N' .N"-diméthylaminoéthane )-carbamoyle] cholestérol [3, 4a] et le « TC-Chol » correspondant au 3-β[N-(N',N',N"- Triméthylaminoethane chlorure)-carbamoyle]cholestérol [4b], le dérivé commercialisé est le « DAC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N.N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle ] cholestérol [5].
Par ailleurs, il semblerait que les composés ayant une tête polyaminée, telle que la dioctadécylamidoglycylspermine (« DOGS »), pourraient avoir une plus grande capacité à former des complexes avec les acides nucléiques [6, 7] que les composés présentant une seule fonction aminé dans leur tête polaire. Ces résultats ont entraîné la synthèse de toute une série de composés dérivés du cholestérol ayant une tête polaire de type polyamine (spermine, spermidine, guanidinium etc..) [8, 9].
Cependant, dans toutes ces expériences, le milieu utilisé doit être pratiquement dépourvu de sérum : à titre d'exemple, le pourcentage maximal de sérum utilisé n'excède pas 20% pour une formulation de DC-Chol dans des tests sur des cellules A431. et une formulation de DAC-Chol dans des tests sur des cellules HepG2 et COS-1. Ainsi, l'utilisation de ces vecteurs pour délivrer les acides nucléiques dans des essais in vivo par voie intraveineuse est encore problématique. Récemment, un autre type d'amphiphile cationique a été synthétisé par la fixation des polyamines sur les sites polaires de l'acide cholique [10]. Pour des cellules COS-7, des niveaux de transfection de 6 à 10 fois supérieurs à celui de la lipofectine ont été obtenus avec des molécules portant un groupement spermine, pentamine ou hexamine. Ces molécules diffèrent de celles de la présente invention car elles ne contiennent pas de bras espaceur entre les sites polaires et la partie hydrophobe.
L'un des buts de l'invention est de fournir des lipides cationiques capables de transporter notamment des substances chargées négativement, notamment des acides nucléiques, y compris dans un milieu contenant une concentration élevée en sérum, à des fins de thérapie génique. de vaccination, de biologie, de physiologie, de génétique et de biotechnologie.
L'un des autres buts de l'invention est de fournir des lipides cationiques ayant un pouvoir transfectant amélioré par rapport aux lipides cationiques connus à ce jour.
L'un des autres aspects de la présente invention est de fournir des procédés de synthèse simples des lipides cationiques, de façon à synthétiser les lipides cationiques de l'invention à une échelle industrielle, tout en ayant des rendements élevés.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé lipidique monocationique de formule générale (I)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " (I) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe
RrO dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un methyle (-CH3) ou un ethyle (-C2H5), n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, sauf lorsque R est R,-0 où on se limite à (-C2H5) pour R, n=l,2 ou 3 et
X est l'iode. et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) R'2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 (II) dans laquelle R\ représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe R,-0 ou R,-0-CO-(CH2)2. dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, et notamment un methyle (-CH3) ou un ethyle (-C2H;). X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore. pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo. De même, l'invention a pour objet les composés lipidiques cationiques de formule générale (I) et (II) ci-dessus définis, ainsi que les procédés de préparation desdits composés.
A titre d'exemple, un procédé de préparation d'un compose lipidique monocationique de formule générale (I) selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illa)
R2 - CO - Z, (Illa) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3cc-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe
R,-0 dans lequel R, représente le radical cholesteryle. Z, représente le chlore, ou le groupement 0-CO-0-R3 dans lequel R^ représente un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, à l'action d'un composé de formule générale (IV) H2N - (CH2)n - N (R)2 (IV) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, pour former le composé de formule générale (V)
R2 - CO - HN - (CH2)n - N (R)2 (V) dans laquelle R2, R et n ont les significations mentionnées ci-dessus, que l'on soumet à l'action du composé de formule générale (VI)
R - X (VI) dans laquelle R a la signification mentionnée ci-dessus, et X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore. pour obtenir le composé lipidique monocationique de formule générale (I) :
R2 - CO - NH - ( CH2)π - N+ (R)3 . X " (I) dans laquelle R2 . R. X et n ont les significations mentionnées ci-dessus. Selon le procédé de préparation des composés de formule générale (I) ci-dessus décrit, on pourra plus particulièrement obtenir le composé de formule générale I(A) et
KB) :
R, -O - CO - NH - (CH2)n - " (R)3 . X " I (A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1. 2, 3, X représente un atome d'iode. R2-CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , χ - I (B)
R2 le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment ceiui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12 -dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α- hydroxy β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
Le procédé de préparation dudit composé lipidique monocationique de formule générale (I) est encore caractérisé en ce que le composé de formule générale (Illa)
R2 - CO - Z, (Illa) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe R,-0 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, Z, représente le groupement O- CO-0-R3 dans lequel R3 représente un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, est préparé en soumettant le composé de formule générale (VIII)
R2 - CO - OH (VIII) dans laquelle R2 a la signification mentionnée ci-dessus, à l'action d'un composé de formule générale (IX)
N(R4)3 (IX) dans laquelle R4 représente un radical alkyle et notamment un ethyle, pour obtenir le composé de formule générale (X)
R2 - CO - 0 - NH(R4)3 (X) dans laquelle R2. R4 ont les significations mentionnées ci-dessus, que l'on soumet à l'action du composé de formule générale (XI)
R, - O - CO - X (XI) dans laquelle R3 a la signification mentionnée ci-dessus. X représente un atome de chlore, pour obtenir le composé de formule générale (IIIc)
R2 - CO - O - CO - O - R3 (IIIc) correspondant au composé de formule générale (Illa) dans laquelle Z, représente le groupement 0-CO-0-R3. Le procédé de préparation d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb)
R' ; - CO - Z2 (Illb) dans laquelle R'2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3 ,7 ,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe RrO ou R,-0-CO-(CH2)2 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, Z2 représente un halogène tel que le chlore, à l'action d'un composé de formule générale (VII)
HN[CH2 - CH, - N (R).'. X ]2 (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel l'iode ou le chlore, pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) R'2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , χ -]2 (II) dans laquelle R'2, R et X ont les significations mentionnées ci-dessus. Selon le procédé de préparation des composés de formule générale (II) ci-dessus décrits, on pourra plus particulièrement obtenir les composés lipidiques dicationiques de formules générales II(A), II(B) et II(C) : R, 0 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , χ -]2 II(A)
R, O - CO - CH2 - CH2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(B) dans lesquelles R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, R2 - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3 .7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-tπoxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation du composé lipidique monocationique de formule générale I(A)
R,-0 - CO - NH - (CH2)π - >T (R)3 , X ' I (A) dans laquelle R{ représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1, 2. 3, X représente un atome d'iode, et ou d'un composé lipidique monocationique de formule générale I(B)
R2 - CO - NH - ( CH2)n - N' (R), . X " I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérive de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7 ,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH2 - CH2 - N' (R)3 . X "]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(B) R, O - CO - CH2 - CH, - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(C) R2 - CO - N[CH, - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode. pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo. Le composé de formule générale I(A) et les composés de formule générale I(B),
II(A), II(B) et II(C), présentent un niveau de transfection amélioré par rapport aux composés lipidiques cationiques connus à ce jour. Pour déterminer le niveau de transfection, un gène rapporteur est utilisé. La protéine produit de ce gène est détectée par chimiolummescence. L'intensité est exprimée en unité relative (RLU) et rapportée à la quantité totale de protéines exprimées par les cellules transfectées.
L'invention a également plus particulièrement pour objet le composé lipidique monocationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(A) R, -O - CO - NH - (CH2)n - N^ (R)3 , X " I (A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1, 2, 3, X représente un atome d'iode,
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(B)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle. n représente un nombre entier égal à 2 ou 3 , X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode. A ce titre, l'invention vise plus particulièrement le composé lipidique monocationique tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol) représenté par la formule générale I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à
2, X représente un atome d'iode,
- le composé N-(N\ N'. N'triméthylaminoéthane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode. - le composé N-(N'. N'. N'triméthylaminopropane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode,
- le composé 3 .7 .l2α-trihydroxy-5β-[N-(N'.N',N"-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Cholamide (TAE-
Cholamide) ». représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode.
- le composé 3 ,7α.l2α-trihydroxy-5β-[N-(N',N',N"-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Cholamide (TAP-
Cholamide) ». représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode.
- le composé 3α,12 -dihydroxy-5β-[N-(N'.N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Déoxycholamide (TAE-
Déoxycholamide) » représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,
- le composé 3α.l2α-dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déoxycholamide (TAP-
Déoxycholamide) », représente par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3cc,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode,
- le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Lithocholamide (TAE-
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,
- le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminopropane Lithocholamide (TAP-
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode. - le composé 3. 7, 12-trioxo-5β-[N-(N'.N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Déhydroxycholamide (TAE- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.
- le composé 3. 7, 12-trioxo-5β-[N-(N',N'.N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déhydroxycholamide (TAP- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode.
L'invention a également plus particulièrement pour objet le composé lipidique dicationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(A)
R, O - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X ]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(B)
R, O - CO - CH2 - CH, - CO - N[CH, - CH, - Nτ (R)3 , X "]2 II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(C)
R2 - CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X ]2 II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 -hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
A ce titre, l'invention vise plus particulièrement le composé lipidique dicationique tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : - le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-carbamoyle] cholestérol (BAEC- Chol) représenté par la formule générale II(A), dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore.
- le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-succinamide cholestérol (BAES- Chol) représenté par la formule générale II(B). dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore,
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-abiétamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, - le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α.7α,12 -trihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α. l2 -trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α. l2α-dihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3α-hydroxy-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C). dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3,7,12-trioxo-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.
L'invention concerne également une composition caractérisée en ce qu'elle contient un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus.
A ce titre, l'invention concerne une composition caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, dans lequel R, représente le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α,12 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que l'éthanol.
L'invention concerne également une composition caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, dans lequel R, représente le radical cholesteryle. R, représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3 - hydroxy-Sβ-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que le chlorure de méthylène pour la préparation de liposomes.
L'invention a également pour objet un liposome caractérisé en ce qu'il contient une composition telle que définie ci-dessus, et un lipide (ou colipide) neutre, notamment la dioléoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), et éventuellement un lipide conjugué (notamment à un polyéthylèneglycol. ou à un fragment d'anticorps), et/ou un tensioactif, notamment choisi dans le groupe constitué par le simulsol 59. le simulsol
165 ou le simulsol 989.
L'invention vise également un complexe caractérisé en ce qu'il comprend un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, ou une composition telle que définie ci-dessus, et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique, gène, plasmide. ribozyme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.
L'invention vise également un complexe caractérisé en ce qu'il comprend un liposome tel que défini ci-dessus, et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique, acide ribonucléique, gène, plasmide, ribozyme ou oligonucléotide, pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie. De même, l'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un complexe tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention convient pour un mode quelconque d'administration, notamment par voie parentérale, par voie topique ou par inhalation.
La composition pharmaceutique selon l'invention est encore caractérisée en ce que la quantité de complexe varie de 0.5 à 30 mg/kg de poids corporel pour une dose unitaire.
Description des figures
Les figures 1 à 4 représentent les schémas de synthèse de composés lipidiques monocationiques et dicationiques selon l'invention.
La Figure 1 représente le schéma de synthèse du lipide monocationique TEAPC- Chol. L'étape (a) consiste à additionner au produit de départ (1) (le chloroformate de cholesteryle), 2 équivalents de 3 -diéthylamino-1 -propy lamine et de l'éther anhydre à une température de 0°C. pour obtenir le carbamate de formule (2). L'étape (b) consiste à ajouter en excès de l'iodure d'éthyle sur ledit carbamate (2) pour obtenir le composé numéroté (3) : le TEAPC-Chol répondant à la formule I(A).
La Figure 2 représente le schéma de synthèse du lipide dicationique BAEC-Chol. L'étape (a) consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine par réaction de la diéthylène triamine avec 2 équivalents d'acide chlorhydrique. L'étape (b) consiste à ajouter 2.25 équivalents du dichlorhydrate de diéthylène triamine ainsi obtenu au chloroformate de cholesteryle (1), pour obtenir le composé numéroté (2) : le BAEC- Chol répondant à la formule générale II(A).
La Figure 3 représente le schéma de synthèse du lipide dicationique BAES-Chol.
L'étape (a) consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine par réaction de la diéthylène triamine avec 2 équivalents d'acide chlorhydrique.
L'étape (b) consiste à ajouter du chlorure d'oxalyle (COCl)2 à de l'hémisuccinate de cholesteryle (1) en présence de chlorure de méthylène (CH2C12), pour obtenir le chlorure de succinoyle correspondant (2). L'étape (c) consiste à faire réagir le chlorure de succinoyle (2) sur 2,25 équivalents de dichlorhydrate de diéthylène triamine, pour obtenir le composé numéroté (3) : le BAES-Chol répondant à la formule générale II(B).
La Figure 4 représente le schéma de synthèse du lipide monocationique TAP- Lithocholamide.
L'étape (a) consiste à ajouter au composé de départ ( 1) (l'acide lithocholique encore représenté par R,COOH), de la triéthylamine dans du THF, pour obtenir le composé intermédiaire (2) auquel est ajouté le composé C:H,-0-CO-Cl (étape (b)) pour obtenir l'anhydride mixte (3). L'étape (c) consiste à ajouter à l'anhydride mixte (3), la N.N-diméthylpropylène diamine pour obtenir famine tertiaire (4). L'étape (d) consiste à reprendre l'aminé tertiaire (4) obtenue à l'étape (c) précédente dans du tétrahydrofuranne (THF) et de l'iodure de methyle (ICH3). pour obtenir le composé numéroté (5) : le TAP-Lithocholamide répondant à la formule générale I(B).
Les figures 5 à 1 1 représentent les résultats obtenus lors de l'utilisation sous forme de liposomes avec du DOPE des composes lipidiques cationiques selon l'invention pour le transfert d'acides nucléiques. La Figure 5 représente le pourcentage d'oligonucléotides non liés aux liposomes, en fonction du rapport molaire de charge X = Lip(+)/nucléotide.
La Figure 6 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase ( 10b RLU « relative light unit »/mg) exprimes respectivement (de gauche a droite ) dans des cellules suivantes : MCF7, A549. 9L. U373MG et HUH7, lesdites cellules étant transfectées à l'aide des liposomes de TEAPC-Chol selon l'invention.
La Figure 7 représente les niveaux relatifs de transfection (%) dans des cellules MCF-7 obtenus respectivement (de gauche à droite) avec les liposomes suivants : lipofectamine. DMRIE, TEAPC-Chol selon l'invention, transfectam, cellfectine et TC- Chol. La Figure 8 représente les niveaux de transfection dans des cellules CEM obtenus respectivement (de gauche à droite) avec les liposomes suivants : Lipofectine. TEAPC- Chol selon l'invention et TAP-lithocholamide selon l'invention. Le niveau de transfection est mesuré par l'activité de β-galactosidase (103RLU).
La Figure 9 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase (106 RLU/mg) exprimés dans les cellules B16 transfectées à l'aide des liposomes TEAPC-Chol selon l'invention en fonction du rapport r = DOPE/lipide cationique utilisé.
La Figure 10 représente le pourcentage de cellules MCF7 viables en fonction de la concentration (exprimée en μM) des liposomes cationiques préparés à partir des lipides cationiques selon l'invention TEAPC-Chol (cf courbe comportant le rectangle noir) et BAEC-Chol (cf courbe comportant le rond noir), et à partir du lipide DC-Chol connu (cf courbe comportant le triangle noir).
La Figure 11 représente les niveaux relatifs de transfection (%) des cellules tumorales MCF7 par des complexes pCMVβ-liposomes BAEC-Chol selon l'invention, en présence du sérum de veau fœtal, en fonction du rapport molaire de charge X= Lip(+)/nucléotide. L'histogramme blanc représente 0% de sérum de veau fœtal (SVF). l'histogramme gris représente 25% de SVF. l'histogramme hachuré représente 50% de SVF et l'histogramme quadrillé représente 10% de sérum de veau fœtal.
Les composés lipidiques cationiques selon l'invention présentent de nombreux avantages qui sont notamment illustrés dans les exemples donnés ci-dessous.
Les exemples ci-dessous illustrent la présente invention et ne la limitent en aucune façon.
A. PROPRIETES DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES SELON
L'INVENTION
Exemple 1 : Dérivé monocationique du cholestérol (TEAPC-Chol).
Le composé lipidique monocationique selon l'invention étudié dans cet exemple, est désigné par l'abréviation TEAPC-Chol, et correspond au 3-β[N-(N',N',N'- triéthylaminopropane iodurej-carbamoyle] cholestérol, de masse molaire M = 698,90 g/mol, représenté par la formule I(A) ci-dessous :
R, - O-CO - NH - (CH2)3 - N+ (C,H5)3 , 1 " dans laquelle R, est le groupement cholesteryle
Les composés lipidiques de l'art antérieur donnés à titre de comparaison dans cet exemple sont des dérivés monoaminés du cholestérol, à savoir le « DC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle] cholestérol [3, 4a], et le « DAC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N,N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle] cholestérol [5] et le « TC-chol » correspondant au 3-β[N-(N'.N',N'-
Triméthylaminoéthane chlorurej-carbamoyle] cholestérol [4b].
1) Comparaison entre TEAPC-Chol selon l'invention. DC-Chol, TC-Chol et DAC-Chol
Les avantages quant à l'originalité chimique du TEAPC-Chol par rapport au DC- Chol et au DAC-Chol. sont énumérés ci-dessous.
(a) Le lipide cationique TEAPC-Chol est sous forme d'un ion constitué par un ammonium quaternaire portant 3 groupements ethyle. Il est différent du DC-chol qui est une aminé tertiaire et du TC-Chol triméthylé. D'autre part, son bras espaceur est de 3 (CH2) au lieu de 2(CH2). Dans les publications de l'art antérieur [3. 4], une charge positive a été attribuée au DC-Chol qui a une structure chimique neutre ! Cette erreur a également été relevée par d'autres auteurs [1 1 , 12].
Ainsi, le composé lipidique cationique selon l'invention peut aisément fixer les substances chargées négativement, contrairement au DC-Chol neutre qui a plutôt tendance à les repousser du fait du doublet libre sur l'azote.
(b) Le rendement obtenu par le procédé de synthèse selon l'invention, du TEAPC- Chol. est de 49% alors que celui obtenu pour le DC-Chol [3] n'est que de 21 ,8%.
(c) Le lipide TEAPC-Chol selon l'invention est différent, par rapport au DAC- Chol (lipide de base du « DAC30 »), par le bras de liaison (« linker ») et par la tête polaire. Le bras de liaison de TEAPC-Chol est un amide secondaire alors que celui de DAC-Chol est un amide tertiaire. Le lipide TEAPC-Chol ne présente pas de risque de formation de produits de dégradation, éventuellement toxiques, propres aux aminés.
(d) La tête polaire du lipide DAC-Chol est un chlorhydrate d'aminé secondaire. c'est donc un composé acide, contrairement au TEAPC-Chol qui est neutre et donc plus stable vis à vis de la variation du pH.
(e) Du fait qu'il s'agit d'un ammonium quaternaire, TEAPC-Chol est peu sensible à la variation de pH dans des milieux dont le pH est voisin du pH neutre. C'est le cas des milieux de culture et des milieux intracellulaires. Il est de nature à protéger les entités chargées négativement et complexées, contre toutes dégradations dues aux variations de pH.
(f) Dans la synthèse du lipide DAC-Chol, le produit N,N"- diméthyléthylènediamine utilisé est une molécule symétrique. Le rendement de la réaction donnant naissance à la molécule ayant une tête a iné ne peut pas dépasser 50%.
(g) Le lipide TEAPC-Chol est soluble dans le chlorure de méthylène (CH,C1 ). Des liposomes à base de TEAPC-Chol peuvent donc être préparés en utilisant CH,C1, qui doit être évaporé après la première étape de préparation des liposomes qui consiste à produire un film mince. Etant donné que CH2C12 (Eb. 40°C) est éliminé beaucoup plus facilement que le chloroforme utilisé jusqu'alors (Eb. 60°C), les liposomes préparés à partir du lipide TEAPC-Chol dissous dans CH7C1, ne présentent pas de toxicité due au solvant. (h) Le niveau de transfection dans des cellules de lignées MCF7 et 9L obtenu avec des liposomes préparés à partir de TEAPC-Chol est supérieur à celui de TC-Chol.
2) Comparaison entre TEAPC-Chol selon l'invention, lipofectamine. DMRIE. Les avantages quant à l'originalité des applications du TEAPC-Chol par rapport au DMRIE et à la lipofectamine sont énumérés ci-dessous.
(a) En utilisant le dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) comme colipide ou lipide neutre dans un rapport molaire ou pondéral compris entre 0,5 et 3, le lipide TEAPC-Chol donne des liposomes de taille comprise entre 1 10 à 180 nm. Ces liposomes sont très stables dans le temps, puisque ces valeurs n'évoluent que de moins de 5% après 1 an.
(b) Ces liposomes forment instantanément des complexes avec des acides nucléiques. Pour des oligonucléotides phosphodiesters de longueur 10 à 28 mers, sous réserve de prendre un rapport molaire de charge [lipide cationique (Lip+) / nucléotide] convenable, le rendement de complexation peut atteindre 100%.
(c) Les complexes oligonucléotides-liposomes formés pénètrent dans des cellules en culture, cellules adhérentes ou cellules en suspension. Les oligonucléotides sont ainsi intemalisés dans le cytoplasme ou dans le noyau, en fonction de la séquence et de la structure moléculaire choisies pour l' oligonucléotide. (d) Pour les plasmides, la réaction est instantanée et le rendement est fonction du rapport DOPE/Lip+. La formulation 1 : 1 de DOPE/Lip-t- paraît la meilleure pour plusieurs plasmides.
(e) Le complexe liposome/plasmides pénètre dans des cellules en culture, adhérentes ou en suspension, en culture 3-D en nodules et dans des tumeurs solides. Le niveau d'expression du gène reporter (luciférase ou β-galactosidase) est élevé et, dans les tests effectués sur des cellules de la lignée MCF7, plus élevé que celui de la lipofectamine, du DMRIE et du TC-Chol.
(f) Les complexes liposomes-plasmides ou liposomes-oligonucléotides sont peu toxiques pour plusieurs cellules jusqu'à une concentration molaire de 100 μM en lipide cationique TEAPC-Chol.
Exemple 2 : Dérivés dicationiques du cholestérol (BAEC-Chol et BAES-Chol). Le compose dicationique désigné par l'abréviation BAEC-Chol, correspond au 3- β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate ))-carbamoyle] cholestérol, de masse molaire M= 588.74 g/mol. représenté par la formule générale II(A) ci-dessous :
R O-CO-NtCH.-CH.-NH ~ . Cl"]., dans laquelle R, représente le groupement cholesteryle.
Le composé dicationique désigné par l'abréviation BAES-Chol. correspond au 3-β [N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate ))-succinamide] cholestérol, de masse molaire M= 644.81 g/mol. représenté par la formule générale II(B)dans laquelle R, représente le groupement cholesteryle : R,-0-CO-(CH rCO-N[CH1-CH,-NH5 ~ , Cl"], . Les avantages quant à l'originalité des lipides dicationiques BAEC-Chol et
BAES-Chol sont énumérés ci-dessous.
(a) Avec une tète possédant 2 atomes d'azote charges positivement, le pouvoir de formation de complexes avec des acides nucléiques est accentué par rapport à une tête monocationique. (b) Les groupements chargés sont des chlorhydrates d'aminés primaires.
Il faut rappeler que le triaminocholestérol [8] est une entité non chargée électriquement.
(c) L'espaceur est un amide tertiaire biodégradable.
(d) Les lipides dicationiques selon l'invention sont des produits solubles dans le THF. ce qui évite l'utilisation des solvants chlorés dans la préparation des liposomes.
(e) Le BAEC-Chol et le BAES-Chol sont recristallisables dans le mélange THF- méthanol (50/50). évitant ainsi l'utilisation des techniques chromatographiques de purification très lourdes.
(f) La synthèse du BAEC-Chol se déroule en une seule étape très rapide après l'élaboration du dichlorhydrate de diéthylène triamine, sans avoir recours au blocage des fonctions -NH2- Le rendement de la synthèse est élevé (77%).
Ainsi, par rapport à la synthèse en plusieurs étapes du produit de l'art antérieur [8] qui est une aminé, la synthèse de BAEC-Chol en une seule étape constitue une amélioration fondamentale.
Exemple 3 : Dérivés monocationiques des dérivés de l'acide cholanique (TAP- cholamide. TAP-déoxvcholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide). Les composés monocationiques désignés par les abréviations TAP -cholamide.
TAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide. sont représentés par la formule I(B) suivante : R,-CO-NH-(CH2)3-N+(CHJ, s I" , dans laquelle R, est un groupement dérivé de l'acide cholanique
Les avantages quant à l'originalité des lipides monocationiques TAP-cholamide,
TAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide sont énumérés ci-dessous.
(a) Le bras de liaison est un amide biodégradable.
(b) La tête est un ammonium quaternaire.
B. PROCEDE DE PREPARATION DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES SELON L'INVENTION
Exemple 4 : Synthèse du lipide monocationique TEAPC-Chol.
TEAPC-Chol a été synthétisé suivant le schéma de la Figure 1. Le nouveau lipide a été caractérisé par spectroscopie IR.
La synthèse du BAEC-Chol a été effectuée selon une nouvelle méthode décrite dans le schéma de la figure 2. Le chloroformate de cholesteryle (pureté 98%). la 3-diéthylamino-l -propylamine
(99+%>). le tétrahydrofuranne anhydre (99.9%) et l'iodure d'éthyle (99%) sont des produits commercialisés par Aldrich. utilisés sans autre purification.
Une solution de chloroformate de cholesteryle (4,6g ; soit lOmmol dans 60 cm3 d'éther anhydre) est ajoutée goutte à goutte dans une solution de 3-diéthylamino-l- propylamine (2,65g ; soit 20 mmol dans 50 cm3 d'éther anhydre) maintenue à 0°C (bain de glace). Le chlorhydrate formé est éliminé par filtration et le solvant enlevé à l'évaporateur rotatif. La synthèse de l'iodure d'ammonium quaternaire est effectuée par réaction au reflux (12 heures) d' iodure d'éthyle en large excès (40 mmol) sur le carbamate résiduel solubilisé dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne. Après élimination du solvant et de l'excès d' iodure. la recristallisation dans le méthanol absolu donne 3,4g, soit un rendement de 49%. de poudre de couleur jaune paille correspondant au sel cationique pur TEAPC-chol. Exemple 5 : Synthèse du lipide dicationique BAEC-Chol.
La synthèse du BAEC-Chol a été effectuée selon une nouvelle méthode décrite dans le schéma de la Figure 2. Le chloroformate de cholesteryle (98%). la diéthylène triamine (99%). le tétrahydrofuranne (99+%) sont des produits Aldrich utilisés sans autre purification. Les autres réactifs sont des produits chimiques courants de laboratoire.
La première étape consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine de formule HN[CH,-CH,-NH,+, Cl"], par réaction de la diéthylène triamine avec deux équivalents d'acide chlorhydrique (HCl) en solution aqueuse (IM). La formation de ce dichlorhydrate est possible par cette méthode, car le pKa des deux fonctions NH, de la diéthylène triamine est de 10. tandis que celui de son NH n'est que de 3.7. Il faut noter que ce résultat, qui constitue un blocage très simple des deux NH,. n'est pas applicable à des aminés telles que la spermine ou la spermidine largement utilisées dans la synthèse de lipides cationiques. puisque toutes leurs fonctions aminés primaires et secondaires sont dosées à un seul point équivalent. Le recours à un système de blocage de type BOC avec BOC-Spermine ou BOC-Spermidine est alors indispensable [8, 9. 17]. Le dichlorhydrate de diéthylènetriamine est obtenu avec un rendement de 77% après deux recristallisations dans le mélange éthanol-méthanol (50/50). et son point de fusion est de 176°C.
Le dichlorhydrate en léger excès (2.25 équivalents) est mis dans un creuset en porcelaine et fondu sur plaque électrique. Le chloroformate (5mmol. 1 éq.. F = 125°C) est ajouté par petites portions. Le mélange pâteux est remué à l'agitateur jusqu'à la fin du dégagement de HCl. Après refroidissement, le solide jaune paille obtenu est concassé puis repris 2 heures au reflux avec 50 cm3 de tétrahydrofuranne (THF). Le dichlorhydrate en excès et le trichlorhydrate de diéthylène triamine formé, insolubles dans le THF. sont enlevés par filtration. Après concentration du filtrat à environ 5 cm3, l'addition de CH,OH absolu relargue le BAEC-Chol. qui après filtration est repris successivement par une nouvelle portion de THF puis d'alcool. On recueille finalement 1.51 g (rendement 52%) de BAEC-Chol dont le point de fusion est de 21 1 °C. La bande
IR du groupement C=0 (pastille KBr) est à 1690.8 cm- 1.
L'utilisation du dichlorhydrate de diéthylène triamine constitue une nouvelle méthode de svnthèse du BAEC-Chol. Exemple 6 : Synthèse du lipide dicationique BAES-Chol.
La synthèse du BAES-Chol a été effectuée selon le schéma de la Figure 3. L'hémisuccinate de cholesteryle (98%) est un produit commercialisé par Lancaster ; le chlorure d'oxalyle (99%), la diéthylène triamine (99%), le tétrahydrofuranne (THF)
(99+%) sont des produits commercialisés par Aldrich, tous utilisés sans autre purification. Les autres réactifs sont des produits chimiques courants de laboratoire.
La première étape consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine de formule HN[CH„-CH1-NH3 +, Cl"], par réaction de la diéthylène triamine avec deux équivalents de HCl en solution aqueuse (IM) comme décrit précédemment.
Dans une deuxième étape. 10"2 mol d'hémisuccinate de cholesteryle dans 50 cmJ de CH,C1, à température ambiante et sous agitation pendant 20 heures, sont traités par
3x10"2 mol de chlorure d'oxalyle. Ceci conduit au chlorure de succinoyle correspondant avec un rendement de 96%, après élimination du chlorure de méthylène puis de (COCl)2 en excès sous vide.
Le dichlorhydrate en léger excès (2,25 équivalents) est mis dans un creuset en porcelaine et fondu sur plaque électrique. Le chlorure de succinoyle (1 éq.) est ajouté par petites portions. Le mélange pâteux est remué à l'agitateur jusqu'à la fin du dégagement de HCl. Après refroidissement, le solide jaune paille obtenu est concassé puis repris 2 heures au reflux avec 50 cm3 de THF. Le dichlorhydrate en excès et le trichlorhydrate de diéthylène triamine formé, insolubles dans THF, sont enlevés par filtration. Après concentration du filtrat à environ 5 cm3, l'addition de CH3OH absolu relargue le BAES-Chol qui, après filtration est repris successivement par une nouvelle portion de THF puis d'alcool. On recueille finalement 0,70 g (rendement 55%) de
BAEC-Chol à partir initialement de 1 g de chlorure de succinoyle. La bande IR du groupement C=0 (pastille KBr) est à 1651,8 cm"' pour la fonction amide et à 1734,1 cm" • pour la fonction ester.
Exemple 7 : Synthèse du lipide monocationique TAP-lithocholamide. La synthèse du TAP-lithocholamide a été effectuée selon le schéma de la Figure 4. A 9.5 g (2,5x10"2 mol) d'acide lithocholique (> 99%. Fluka) dans 100 cm3 de THF anhydre (99.9%. Aldrich). on ajoute goutte à goutte à la température du laboratoire, 2,55 g de triéthylamine (994-%, Aldrich) dans 20 cm3 de THF. puis 2.72 g de chloroformate d'éthyle (>98%, Fluka). Le chlorhydrate de triéthylamine est séparé de la solution éthérée d'anhydride mixte par filtration. Après addition de 2.55 g de N.N- diméthylpropylène diamine (99+%. Aldrich) dans le filtrat précédent, le mélange est mis 24 heures sous agitation mécanique, à température ambiante. Après refroidissement (0 °C), on isole par filtration le lipide sous sa forme aminé tertiaire. Le solide obtenu est repris dans 100 cm3 de THF et 10.5 g (7.5x10"2 mol) de ICH. (99.5 %, Aldrich), et maintenu pendant 3 heures à 50 °C. On recueille finalement 13.7 g (91%) de TAP- lithocholamide. L'analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fouπer (IRTF) en phase solide avec KBr donne (-CO-N) à 1658,9 cm"1 et (-NH- ) à 3378 cm"1.
C. UTILISATION DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES
SELON L'INVENTION POUR LE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES.
Exemple 8 : Utilisation du dérivé monocationique TEAPC-Chol.
Les essais de transfection décrits selon ce qui suit sont effectués avec le TEAPC-
Chol préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 1. a) Préparation des liposomes :
Un mélange de lipide cationique TEAPC-Chol et de lipide (ou colipide) neutre : la dioléolylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), dans un rapport pondéral 1 : 1 , est dissous dans le chloroforme, puis évaporé sous vide à l'évaporateur rotatif. Le film mince obtenu est séché pendant encore au moins 5 heures avant d'être réhydraté par de l'eau stérile. Le chlorure de méthylène peut être utilisé à la place du chloroforme.
La concentration finale en lipide cationique est de 1 mg/mL, soit 1.43 mM.
Le mélange est soumis à un vortex pendant 2 minutes puis soniqué pendant 30 minutes de façon intermittente à l'aide d'un sonificateur Bransonic modèle 1210. Une solution claire est obtenue. La solution est centrifugée pendant 15 mn avec une vitesse de 12000 g. Le surnageant est prélevé et, si nécessaire, filtré sur un filtre Millipore de
0.22 μm de diamètre de pore et le filtrat est stocké à 4°C. Les liposomes sont caractérisés en taille par un appareil de diffusion dynamique de la lumière. La distribution en nombre indique un mode unique avec un diamètre moyen de 104 nm. Le même protocole de préparation est applicable au BAEC-Chol. b) Oligonucléotides et plasmides : Les oligonucléotides utilisés, de longueur variable de 12 à 28 mers, sont fournis sous forme lyophilisée par Genosys (Grande Bretagne) ou Eurogentec (Belgique). Afin de visualiser leur internalisation. certains oligonucléotides sont marqués par de la fluorescéine en position 5". Les oligonucléotides sont dissous dans de l'eau stérile à la concentration de 3 mM en nucléotide. Les plasmides utilisés sont des plasmides pCMV-β portant un gène reporter codant pour la β-galactosidase (Clonetech), ou pGL2-luc portant un gène reporter codant pour la luciférase (Proméga). Les plasmides ont été amplifiés suivant le protocole standard. Ils sont stockés dans un tampon Tris-EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique), pH = 8 à la concentration 1 mg/mL. c) Cultures cellulaires :
Les cellules utilisées sont des cellules adhérentes, d'origine cancéreuse (MCF7, A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16), ou des cellules en suspension (CEM, U937). Les cellules sont cultivées suivant les conditions standards pour chaque type. Le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) est utilisé pour les cellules adhérentes (MCF7. A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16) et le milieu RPMI 1640 (Roswell Park
Mémorial Institute) pour les cellules en suspension CEM et U937. Les milieux contiennent 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et des antibiotiques pénicilline- streptomycine. d) Protocole de transfection in vitro : Pour les cellules adhérentes, la veille du jour de transfection, les cellules sont ensemencées (5x10^ cellules par puits dans des plaques Falcon à 6 puits ou 5 10^ cellules par puits d'une lame Labtek (Nunc) à 4 puits). Ainsi le jour de transfection les cellules sont confluentes à 60-70%.
Une quantité d'ADN (plasmide ou oligonucléotide) de lμg et la quantité choisie de liposomes cationiques TEAPC-Chol ont été séparément diluées dans 10 μL d'eau stérile et légèrement vortexées puis mélangées.
Après 15 minutes, le mélange est dilué dans 1 mL de milieu OptiMEM (Gibco) sans sérum. Les cellules sont lavées avec le milieu sans sérum puis le mélange dans l'OptiMEM est ajouté aux cellules. Après 6 heures d'incubation à 37°C. dans une atmosphère contenant 5% de Cθ2, l'OptiMEM est retiré, remplacé par 1 mL de milieu de culture contenant 10% de sérum. Les cellules continuent à être incubées pendant le temps voulu. Dans les essais pour tester la capacité de transfection en présence de sérum. 1 mL de milieu contenant la teneur désiré en sérum est utilisé à la place d'OptiMEM.
Le même protocole est utilisé pour les transfections témoins utilisant le DC-Chol synthétisé suivant la méthode de Gao et Huang (1991) [3] . Concernant les transfections utilisant la lipofectine. la lipofectamine. DMRIE et DAC-chol. les complexes sont obtenus selon le protocole recommandé par le fabricant. e) Evaluation du niveau de transfection :
La méthode d'évaluation du niveau de transfection consiste à détecter la β- galactosidase par le réactif AMPGD (3-(4-méthoxyspiro( 1.2-dioxetane-3.2'- tricyclo(3.3.1.1)décane)-4-yl)phényl-β-D-galactopyranoside (Tropix). En présence de β- galactosidase, l'AMPGD à pH > 9. conduit à l'adamantanone et à fanion methyl métaoxybenzoate. Ce dernier est dans un état excité et émet une fluorescence, ce qui permet d'effectuer la mesure [15].
L'activité de β-galactosidase ou de luciférase est mesurée 48 heures après transfection en utilisant la trousse de détection Galactolight Plus (Tropix) suivant le protocole recommandé par le fabricant. Les cellules sont lavées 2 fois, dans 1 mL de solution de tampon phosphate (PBS) à chaque fois, puis lysées par 200 μL de tampon lyse contenant 1 mM de dithiotreiol fraîchement préparé. Les extraits sont récoltés, centrifugés à 12000 g pendant 5 mn.
Un aliquot (20 μL) du surnageant est dilué dans 200 μL de réactif Galacton (à base d'AMPGD) et laissé à la température ambiante. Après 1 heure, l'accélérateur est ajouté et la chimioluminescence est immédiatement mesurée par un luminomètre BCL
(Gouteyron, France) en mode d'intégration de 10 secondes. Les intensités sont exprimées en RLU (relative light unit).
La concentration en protéine totale est mesurée en utilisant la trousse Bio-Rad à cet effet. Les résultats d'activité sont exprimés par des valeurs normalisées RLU/mg rapportées à 1 mg de protéine totale. f) Observation de l'internalisation des oligonucléotides : L'internalisation des oligonucléotides est observée en utilisant la microscopie optique. Pour cela, après les durées d'incubation de 24h. 48h ou 72h, les cellules transfectées dans des puits de la lame Labtek (Nunc), sont lavées 2 fois au PBS, fixées avec du paraformaldéhyde (4%) pendant 15 mn et montées avec du Mowiol (Calbiochem). g) Possibilité de renforcement de la transfection :
Le taux de transfection peut être encore renforcé en utilisant un agent condensant le plasmide tel que la spermine. avant la complexation avec des liposomes TEAPC- Chol. D'autre part, dans la formulation des liposomes on peut ajouter un tensioactif tel que le simulsol 59, le simulsol 165 ou le simulsol 989 (SEPIC), ou un lipide conjugué avec un polyéthylèneglycol (PEG) ou avec un groupement tel qu'un fragment d'anticorps permettant d'orienter les liposomes vers des récepteurs spécifiques.
Exemple 9 : Résultats
a) Rendement de complexation liposomes TEAPC-Chol/oligonucléotides.
Les aliquots de 8μg de l' oligonucléotide 28 mers
G3AG2AG2AG2CG2AG2AG2A2GAG2A sont mélangés avec les liposomes 1 : 1, suivant des rapports de charge X variés. Les mélanges sont filtrés à travers des filtres
Millipore dont la masse limite est 30 kDa pour ne faire passer que des oligonucléotides libres, non liés aux liposomes. Les oligonucléotides sont dosés par spectroscopie UV et le pourcentage d'oligonucléotides non liés (rapporté à ceux non mélangés aux liposomes) est représenté en fonction de X (Figure 5). A partir de la valeur de X = 2, il n'y a pratiquement pas d'oligonucléotides non liés. Ceci permet de déterminer le rapport optimal de complexation pour lequel tous les oligonucléotides sont liés. b) Niveau de transfection de différentes lignées de cellules par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ.
La Figure 6 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase exprimés respectivement dans des cellules de MCF7, A549, 9L, U373MG et HUH7, transfectées à l'aide des liposomes TEAPC-Chol/DOPE. Les meilleurs résultats sont observés pour les cellules 9L. c) Comparaison du niveau de transfection des cellules MCF7 par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ, avec ceux obtenus à partir de la lipofectamine. du DMRIE, du transfectam et du TC-Chol.
Dans la Figure 7. les niveaux de transfection dans des cellules MCF-7 obtenus avec des liposomes TEAPC-Chol/DOPE sont comparés avec ceux des vecteurs connus.
La figure 7 indique que les liposomes TEAPC-Chol/DOPE ont un niveau de transfection de 2 à 3 fois supérieur à celui de la lipofectamine. du DMRIE et du TC- Chol. d) Comparaison du niveau de transfection des cellules CEM par des complexes TAP-lithocholamide-Chol/pCMVβ avec ceux obtenus à partir de la lipofectine.
Dans la Figure 8. les niveaux de transfection dans des cellules CEM obtenus avec des liposomes TAP-lithocholamide sont comparés avec ceux de la lipofectine.
On voit que les liposomes TAP-lithocholamide ont un pouvoir transfectant 30 fois supérieur à celui de la lipofectine. e) Effet du rapport DOPE/Lip+ sur le niveau de transfection des cellules tumorales
MCF7 par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ.
La teneur du lipide neutre dioléolylphosphatidyléfhanolamine dans la formulation des liposomes TEAPC-Chol. représentée par le rapport r = DOPE/Lip+ affecte leur niveau de transfection cellulaire. Il semble que ceci dépende du type de cellules. Dans le cas des cellules B16 représentées dans la Figure 9. on observe le niveau le plus élevé pour le rapport r = 1. f) Comparaison de la cytotoxicité des liposomes TEAPC-Chol. BAEC-Chol et de celle du DC-Chol.
La viabilité des cellules est détectée par le test MTT. Le test MTT consiste à détecter les cellules viables en utilisant le réactif MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-
2.5-diphényl tétrazolium bromide (Sigma). Pour les cellules vivantes, les déhydrogénases des mitochondries réagissent avec le MTT et le réduisent en formazan qui est un produit bleu dont la quantité peut être déterminée par des mesures d'absorption à 570 nm [16]. Les cellules MCF7 déposées la veille de la transfection dans les puits d'une plaque Falcon de 96 puits (5x104 cellules par puits) sont transfectées par les complexes formés en mélangeant 1 μg d'oligonucléotides et des quantités variables de liposomes TEAPC-Chol ou BAEC-Chol selon l'invention, suivant le protocole décrit plus haut. Apres 48 h d incubation à 37°C. les cellules sont lavées deux fois au PBS. ensuite 100 μL de réactif MTT (lmg/mL de milieu DMEM contenant du sérum) sont ajoutés puis les cellules sont à nouveau incubées. Après 3 h. le réactif est enlevé, remplacé par 100 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde) pendant 20 mn. Les cellules «viables» donnent une coloration bleue dont la densité optique à la longueur d'onde 570 nm varie proportionnellement au nombre de celles-ci.
La Figure 10 représente les variations du pourcentage de cellules MCF7 viables en fonction de la concentration (exprimée en μM) des liposomes cationiques utilisés, préparés à partir de TEAPC-Chol. de BAEC-Chol ou de DC-Chol. Le pourcentage est calculé par rapport à la densité optique obtenue à partir des cellules non transfectées.
Les courbes de cette figure montrent clairement que les liposomes cationiques TEAPC-Chol et BAEC-Chol sont nettement moins toxiques que le DC-Chol. lui même moins cytotoxique que la lipofectine [3]. g) Niveau de transfection des cellules tumorales MCF7 par des complexes BAEC- pCMVβ en présence du sérum.
La Figure 11 représente les niveaux de transfection des cellules tumorales MCF7 par des complexes liposomes BAEC-Chol/pCMVβ en présence de sérum de veau fœtal. Les niveaux sont normalisés à celui obtenu avec le rapport molaire de charge (Lip(+)/nucléotide) X= 2 en absence de sérum. On observe une variation du niveau de transfection en fonction du rapport X. Ainsi, en l'absence de sérum, le maximum est observé pour X = 1 alors que pour 50% de sérum, le maximum est observé pour X = 4. En faisant varier le rapport X. on peut transfecter ces cellules en présence de teneurs variables en sérum.
REFERENCES
[1] FELGNER P.L.. GADEK Th.R., HOLM M., ROMAN R., CHAN H.W., WENZ M.. NORTHROP J.P., RINGOLD G.M. et DANIELSEN M. (1987) Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procédure. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84 : 7413-7417.
[2] FELGNER J.H.. KUMAR R., SRIDHAR C.N., WHEELER C.J., TSAI Y.J., BORDER R., RAMSEY P., MARTIN M., FELGNER P. (1994). Enhanced gène delivery and mechanism studies with a novel séries of cationic lipid formulations. J. Biol. Chem.. 269, 1550-2561.
[3] GAO X. et HUANG L. (1991) A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Comm., 179. 280-285.
[4] a) LEE R.J. et HUANG L. (1997). Lipidic vector Systems for gène transfer. Critical Review in «The. Drug Car. Systems», 14, 173-206. b) HUANG L. (1998), Emulsion formulations for hydrophilic active agents, publication de demande internationale WO 98/05678.
[5] RESZKA R., (1996). New cholestérol derivative for liposomal gène transfer. publication de demande internationale WO 96/20208.
[6] BEHR J.P., DEMENEIX B., LOEFFLERJ.P. et PEREZ-MUTUL J. (1989) Efficient gène transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine- coated DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 6982-6986.
[7] SCHWARTZ B., BENOIST C, ABDALLAH B., SCHERMAN D., BEHR J.P., DEMENEIX, B. (1995). Lipospermine-based gène transfer into the newborn mouse brain is optimized by a low lipospermine/DNA charge ratio. Human Gène Therapy, 6, 1515-1524.
[8] SULLIVAN S., MENG X.Y. (1997). Cationic polymer/lipid nucleic acid delivery vehicles. publication de demande internationale WO 97/45069.
[9] VIGNERON J.P., OUDDRHIRI N., FAUQUET M., VERGELY L., BRADLEY J.C., BASSEVILLE M., LEHN P., LEHN J.M. (1996). Guanidinium- cholestérol cationic lipids : efficient vectors for the transfection of eukaryotic cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 93. 9682-9686. [10] WALKER S.. SOFIA M.J., KAKARLA R.. KOGAN N.A.. WIERICHS L., LONGLEY C.B.. BRUCKER K.. AXELROD H.R.. MIDHA S.. BABU S.. KAHNE D. (1996). Cationic facial amphiphiles : a promising class of transfection agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. 1585-1590. [11] WYSE J.. WARNER C. (1996), Cationic lipid acid sait of 3 Beta (N-(N'.N'- dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholestérol, publication de demande internationale WO 96/40067. p.2.
[12] MILLER A.D.. COOPER R., ETHERIDGE C.J. (1997), Polycationic sterol derivatives as transfection agents, publication de demande internationale WO 97/45442. [13] FARHOOD H.. BOTTEGA R., EPAND R.M. et HUANG L. (1992) Effect of cationic cholestérol derivatives on gène transfer and protein kinase C activity.
Biochim. Biophys. Λcta. 1111. 239-246.
[14] EPAND R.. BOTTEGA R.. HUANG L., (1993). Method for deliveπng nucleic acids into cells. publication de demande internationale WO 93/05162 [15] JALN V.J. et MAGRATH I.T. (1991), A chemiluminescent assay for quantification of β-galactosidase in the femtogram range, Anal. Biochem., 199, 119- 124.
[16] LAPPALAINEN K.. URTI A., JAASKELALNEN L. SYRJANEN K. et SYRJANEN S. (1994). Cationic liposomes mediated delivery of antisense oligonucléotides targeted to HPV 16E7 mRNA in CaSki cells. Antiviral Res., 23. 119-
130.
[17] KEIL 0.. RESZKA R.. GROTH D. (1998), Novel cationic amphiphilic lipids for liposomal gène transfer, publication de demande internationale WO 98/05678.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un composé lipidique monocationique répondant à la formule générale I(A) :
R,O - CO - NH - ( CH,)Π - N" (C,H; , . Γ i(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. n représente un entier égal à 1 , 2 ou 3 et notamment le 3-β[N-(N' .N".N"-triéthylaminopropane iodure )-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol )
et/ou d'un compose lipidique monocationique de formule générale I(B) :
R, - CO - NH - ( OU, - (R), . X • I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH, - CH, - N' (R), . X "], II(A)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un radical ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(B)
R, O - CO - CH, - CH, - CO - N[CH, - CH, - N* (R)3 , X "]2 II(B)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(C) R, - CO - N[CH, - CH, - N* (R), . X "]: II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α. l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo.
2. Les composés lipidiques monocationiques répondant à la formule générale I(A) :
R, O - CO - NH - (CH2)n - N* (C2H5)3 , L I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, n représente un entier égal à 1, 2 ou 3 et notamment le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol)
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(B)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " I (B)
dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
3. Composé lipidique monocatiomque selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol) répondant à la formule I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, - le composé N-(N\ N', N' -triméthylaminoéthane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.
- le composé N-(N". N'. N' -triméthylaminopropane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.
- le composé 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-[N-(N',N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Cholamide (TAE- Cholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,
- le composé 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-[N-('N".N'.N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminopropane Cholamide (TAP- Cholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,7α,12 -trihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode,
- le composé 3α,12 -dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Déoxycholamide (TAE- Déoxycholamide) » représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.
- le composé 3α,12α-dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déoxycholamide (TAP- Déoxycholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode, le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N'.N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Lithocholamide (TAE-
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode. - le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Lithocholamide (TAP- Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.
- le composé 3, 7, 12-trioxo-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Déhydroxycholamide (TAE- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,
- le compose 3. 7. 12-trioxo-5β-[N-(N".N".N"-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déhydroxycholamide (TAP- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.
4. Composé lipidique dicationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X "], II(A)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(B)
R, O - CO - CH2 - CH2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(B)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(C)
R2 - CO - N[CH, - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7 .l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
5. Composé lipidique dicationique selon la revendication 4. caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- le 3-β[N-.N-(Bis(triéthylaminoéthane iodure))-carbamoyle] cholestérol (BTEC- Chol) représente par la formule générale II(A). dans laquelle R, représente le radical cholesteryle . R représente un radical ethyle et X un atome d'iode.
- le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-succinamide cholestérol (BAES- Chol) représenté par la formule générale II(B), dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-abiétamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, obtenu via le dichlorhydrate de diéthylène triamine,
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α,7α,12α-trihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, - le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α,12α-dihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3α-hydroxy-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide
3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore. - le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3,7,12-trioxo-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.
6. Procédé de préparation d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) :
R'2- CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 (II) dans laquelle R', représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 5α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique. ou le groupe
R,0 ou R,-0-CO-(CH2)2 dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb) :
R'2-CO-Z2 (Illb) dans laquelle R'2 a la signification mentionnée ci-dessus, Z2 représente un halogène tel que le chlore, à l'action d'un composé de formule générale (VII)
HN[CH2 - CH2 - N (R) , X"]2 (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore,
pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) tel que défini ci-dessus, et notamment les composés lipidiques dicationiques de formules générales II(A), II(B) et II(C) ci-après :
R, O - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, R, O - CO - CH, - CH, - CO - N[CH, - CH, - N^ (R)3 . X "], II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
R, - CO - N[CH2 - CH, - N" (R)3 . X '], II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.
7. Procédé de préparation selon la revendication 6 d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) dans laquelle R", représente le groupe R,-0 et R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore, à savoir le 3 β[N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-carbamoyle] cholestérol (BAEC-Chol), caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb) : R",-CO-Z, (Illb) dans laquelle R', représente le groupe R,0 et R, représente le radical cholesteryle, Z, représente un atome de chlore. à l'action d'un composé de formule générale (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore, à savoir le dichlorhydrate de diéthylènetriamine :
HN[CH, - CH, - NHf . CY]2 (VII)
pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) : R'2 - CO - N[CH, - CH2 - NH3 +. Cl"]2 (II) dans laquelle R", représente le groupe R,-0 et R, représente le radical cholesteryle.
8. Composition caractérisée en ce qu'elle contient un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5.
9. Composition selon la revendication 8. caractérisée en ce qu'elle présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 dans lequel R, représente le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2 -dihydroxy-5β- cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique, et un solvant tel que l'éthanol.
10. Composition selon la revendication 8. caractérisée en ce qu'elle présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que le chlorure de méthylène pour la préparation de liposomes.
1 1. Liposome caractérisé en ce qu'il contient une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, et un lipide (ou colipide) neutre, notamment la dioléoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), et éventuellement un lipide conjugué (notamment à un polyéthylèneglycol, ou à un fragment d'anticorps), et/ou un tensioactif, notamment choisi dans le groupe constitué par le simulsol 59, le simulsol
165 ou le simulsol 989.
12. Complexe caractérisé en ce qu'il comprend un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique. gène, plasmide, ribozvme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.
13. Complexe caractérisé en ce qu'il comprend un liposome selon la revendication 11 , et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique. gène, plasmide, ribozyme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.
14. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un complexe selon la revendication 12 ou la revendication 13. en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle convient pour un mode quelconque d'administration, notamment par voie parentérale. par voie topique ou par inhalation.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisée en ce que la quantité de complexe varie de 0,5 à 30 mg/kg de poids corporel pour une dose unitaire.
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US6610321B2 (en) * 1996-07-03 2003-08-26 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
DE19631189A1 (de) * 1996-08-02 1998-02-05 Max Delbrueck Centrum Neuartige kationische Amphiphile für den liposomalen Gentransfer

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