EP1218033A2 - Cationic lipid compounds and use thereof for transferring negatively charged substances of therapeutic interest - Google Patents

Cationic lipid compounds and use thereof for transferring negatively charged substances of therapeutic interest

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Publication number
EP1218033A2
EP1218033A2 EP00956608A EP00956608A EP1218033A2 EP 1218033 A2 EP1218033 A2 EP 1218033A2 EP 00956608 A EP00956608 A EP 00956608A EP 00956608 A EP00956608 A EP 00956608A EP 1218033 A2 EP1218033 A2 EP 1218033A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
radical
acid
general formula
cholanic
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00956608A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Eliane Taillandier
Xuan An Cao
Robert Coudert
Régine NAEJUS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
Original Assignee
Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13 filed Critical Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
Publication of EP1218033A2 publication Critical patent/EP1218033A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C07J41/0061—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives one of the carbon atoms being part of an amide group

Definitions

  • the present invention relates to cationic lipid compounds. and their use for the transfer of substances of therapeutic interest negatively charged, and in particular of nucleic acids.
  • nucleic acids Apart from a few very specific cases, nucleic acids alone do not penetrate cells, organs or organisms, and therefore require the use of a vector. To date, various techniques have been described for the transfer of nucleic acids and in particular DNA, the most important and promising of which involve viral vectors or lipid vectors.
  • Viral vectors are effective but have certain risks, including pathogenicity, immunogenicity, transmission, recombination, replication, transformation etc ..; there is therefore a security problem in the use of these.
  • cationic lipids can, by their positive charges, easily form complexes with negatively charged nucleic acids and help them to cross the lipid cell barrier, also negatively charged; the nucleic acids can then pass into the nucleus. Efforts are being made to develop cationic lipids with a high level of transfection. N This is achieved if the lipid carrier form, with high efficiency, complex with the nucleic acid to be transported helps protect said nucleic enzymatic degradation extra and intracellular acid, and has a permissible cytotoxicity.
  • the cationic lipid formulations currently existing on the market have an average price of 1500 F / mg, and are marketed: * by Gibco (USA) under the names of:
  • Lipofectin whose basic lipid is “DOTMA” (N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -NNN-trimethylammonium chloride), - "Lipofectamine”. whose base lipid is - ⁇ DOSPA "(2,3-dioleyloxy-N- (2 (spermine carboxamido) ethyl) -NN-dimethyl-1-propanaminium) trifluoroacetate).
  • DOTMA N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -NNN-trimethylammonium chloride
  • Lipofectamine whose base lipid is - ⁇ DOSPA "(2,3-dioleyloxy-N- (2 (spermine carboxamido) ethyl) -NN-dimethyl-1-propanaminium) trifluoroacetate).
  • DMRIE 1.2-dimyristyloxypropyl-3-N.N-dimethyl hydroxy ammonium bromide
  • DAC 30 whose basic lipid is “DAC-Chol” (3- ⁇ - (- ( " NN “ -dimethylaminoethane) -carbamoyl) cholesterol).
  • Non-marketed products two main families of cationic lipids have been reported to date. All these compounds have a hydrophobic tail linked to an amine polar head bearing one or more nitrogen atoms positively charged. These families are distinguished by the hydrophobic part which can be a double alkyl chain or a cholesterol derivative. These compounds form complexes with nucleic acids (plasmids or oligonucleotides). Encouraging results on the level of transfection of cells in culture have been published [1-4a, 13, 14]. Among the monoamine cholesterol derivatives, the best known derivative is
  • DC-Chol corresponding to 3- ⁇ [N- (N '.N “ -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [3, 4a] and the" TC-Chol "corresponding to 3- ⁇ [N- (N', N ', N " - Trimethylaminoethane chloride) -carbamoyl] cholesterol [4b], the derivative marketed is "DAC-Chol", corresponding to 3- ⁇ [N- (N.N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5].
  • the medium used must be practically devoid of serum: for example, the maximum percentage of serum used n does not exceed 20% for formulation of DC-Chol in assays on A431 cells. and a formulation of DAC-Chol in tests on HepG2 and COS-1 cells.
  • the use of these vectors to deliver nucleic acids in tests in vivo intravenously is still problematic.
  • Another type of cationic amphiphile was synthesized by the attachment of polyamines on the polar sites of cholic acid [10].
  • transfection levels 6 to 10 times higher than that of lipofectin were obtained with molecules carrying a spermine, pentamine or hexamine group. These molecules differ from those of the present invention in that they do not contain a spacer arm between the polar sites and the hydrophobic part.
  • One object of the invention to provide cationic lipids capable of including transport negatively charged substances, especially nucleic acids, including in a medium containing a high concentration of serum, for the purpose of gene therapy. vaccination, biology, physiology, genetics and biotechnology.
  • One of the other aims of the invention is to provide cationic lipids having an improved transfecting power compared to the cationic lipids known to date.
  • One of the other aspects of the present invention is to provide simple methods of synthesis of cationic lipids, to synthesize cationic lipids of the invention on an industrial scale, while having high yields.
  • the present invention relates to the use of a monocationic lipid compound of general formula (I)
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group
  • X is iodine. and / or a dicationic lipid compound of general formula (II) R ' 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 (II) wherein R ⁇ represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid.
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents a hydrogen atom, an alkyl radical, and in particular a methyl (-CH 3 ) or an ethyl (-C 2 H ; ).
  • X represents a halogen atom such as iodine or chlorine.
  • a method of preparing a lipid monocationic compound of general formula (I) according to the invention is characterized in that a compound of general formula (IIIa)
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3cc-hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group
  • R -0 in which R represents the cholesteryl radical.
  • Z is chlorine or a group 0-CO-0-R 3 wherein R represents an alkyl radical and in particular methyl or ethyl, to the action of a compound of general formula (IV) H 2 N - (CH 2 ) n - N (R) 2 (IV) in which R represents a hydrogen atom, an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, n represents an integer equal to 2 or 3, to form the compound of general formula (V)
  • R 2 represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a derivative of cholanic acid in particular one selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group R, -0 in which R represents the cholesteryl radical, Z represents the group O-CO-0-R 3 in which R 3 represents an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, is prepared by subjecting the compound of general formula (VIII)
  • R ' represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of acid 3, 7, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic, 3 ⁇ .l2 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, or the group R r O or R, -0-CO- (CH 2 ) 2 in which R represents the cholesteryl radical, Z 2 represents a halogen such as chlorine, to the action of a compound of general formula (VII )
  • R O - CO - CH 2 - CH 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an atom .
  • hydrogen X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • R 2 represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3 .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid , the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or the acid-3.7,12 t ⁇ oxo-5 ⁇ -cholanic acid.
  • R represents a hydrogen atom.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
  • a more particular subject of the present invention is the use of the monocation lipid compound of general formula I (A)
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents an ethyl radical
  • n represents an integer equal to 1, 2.
  • X represents an iodine atom, and or a monocationic lipid compound of the general formula I (B)
  • R 2 CO - NH - (CH 2 ) n - N ' (R),. X 'I (B) wherein R 2 represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a drift of the cholanic acid Especially one chosen from the group consisting of the radical of the acid 3 ⁇ , 7, 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, the acid 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3.7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R is a methyl radical or ethyl, n is an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, and / or a lipid dicationic compound of general formula II (a) R, O - CO - N [CH 2 - CH 2 - N '.
  • R represents the cholesteryl radical
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • a lipid dicationic compound of general formula II (B) R O - CO - CH 2 - CH - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • C wherein R, represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of the cholanic acid , in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R represents a methyl or ethyl radical.
  • n an integer equal to 2 or 3
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • the invention relates more particularly to the monocationic lipid compound as defined above, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
  • TAPC-Chol [N- (N ', N', N ' -triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol) represented by the general formula I (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to
  • X represents an iodine atom
  • Cholamide ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is 2 and X is iodine.
  • Trimethylaminopropane Cholamide (TAP-1)
  • Cholamide ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3 ⁇ .7 ⁇ .l2 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X is iodine.
  • Deoxycholamide represented by the general formula I (B) in which R 2 represents the radical of 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine ,
  • Deoxycholamide represents by the general formula I (B) in which R, represents the radical of 3cc acid, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic. R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine,
  • Lithocholamide ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine,
  • Lithocholamide ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine.
  • R represents the radical of 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine.
  • R O - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X] 2 II (A) in which R represents the cholesteryl radical.
  • R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical,
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
  • R O - CO - CH 2 - CH, - CO - N [CH, - CH, - N ⁇ (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical.
  • R represents an atom hydrogen, a methyl or ethyl radical.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
  • R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of an acid derivative cholanic, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, 3 -hydroxy-5 ⁇ - acid cholanic or 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical.
  • X represents a halogen atom such as chlorine or iodine
  • the invention is more particularly the lipid dicationic compound as defined above, characterized in that it is selected from the group consisting of: - 3- ⁇ [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - carbamoyl] cholesterol (BAEC- Chol) represented by the general formula II (A), in which R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom.
  • the invention also relates to a composition characterized in that it contains a cationic lipid compound as defined above.
  • the invention relates to a composition characterized in that it is in the form of a cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, in which R represents the radical of a derivative of l cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid. and a solvent such as ethanol.
  • R represents the radical of a derivative of l cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the 3 ⁇ .7 ⁇ acid, 12 -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. 3, 12 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid, acid 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid.
  • a solvent such as ethanol
  • the invention also relates to a composition characterized in that it is in the form of cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, wherein R, represents the radical cholesteryl.
  • R represents the radical of abietic acid.
  • the radical of a derivative of cholanic acid in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3 ⁇ , 7 ⁇ .l2 ⁇ - trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. acid 3 ⁇ .l2 ⁇ -dihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid. acid 3 - hydroxy-S ⁇ -cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5 ⁇ -cholanic acid. and a solvent such as methylene chloride for the preparation of liposomes.
  • the invention also provides a liposome characterized in that it contains a composition as defined above, and a lipid (or colipid) neutral, particularly ethanolamine, dioleoylphosphatidyl (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol. or a fragment of antibody), and / or a surfactant, in particular selected from the group consisting of Simulsol 59.
  • a lipid (or colipid) neutral particularly ethanolamine, dioleoylphosphatidyl (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol. or a fragment of antibody), and / or a surfactant, in particular selected from the group consisting of Simulsol 59.
  • the invention also relates to a complex characterized in that it comprises a cationic lipid compound as defined above, or a composition as defined above, and a negatively charged compound, in particular a nucleic acid (deoxyribonucleic acid. ribonucleic, gene, plasmid, ribozyme or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
  • a nucleic acid deoxyribonucleic acid. ribonucleic, gene, plasmid, ribozyme or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified
  • the invention also relates to a complex characterized in that it comprises a liposome as defined above, and a negatively charged compound such as a nucleic acid (deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, gene, plasmid, oligonucleotide or ribozyme, which can be covalently modified or not) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
  • a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active principle, a complex as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for any mode of administration, including parenterally, topically or by inhalation.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is further characterized in that the amount of complex is from 0.5 to 30 mg / kg body weight per unit dose.
  • Figures 1 to 4 show the synthesis diagrams of monocationic and dicationic lipid compounds according to the invention.
  • Figure 1 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TEAPC-Chol.
  • the step (a) consists in adding to the starting product (1) (cholesteryl chloroformate), 2 equivalents of 3 -diethylamino-1 -propyl lamine and anhydrous ether at a temperature of 0 ° C. to obtain the carbamate of formula (2).
  • Step (b) comprises adding an excess of ethyl iodide on said carbamate (2) to obtain the compound number (3): the TEAPC-Chol of formula I (A).
  • FIG. 2 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAEC-Chol.
  • Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid.
  • Step (b) consists in adding 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride thus obtained to cholesteryl chloroformate (1), to obtain the numbered compound (2): BAEC-Chol corresponding to general formula II (A).
  • Figure 3 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAES-Chol.
  • Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid.
  • Step (b) consists in adding oxalyl chloride (COCl) 2 to cholesteryl hemisuccinate (1) in the presence of methylene chloride (CH 2 C1 2 ), to obtain the corresponding succinoyl chloride (2 ).
  • Step (c) consists in reacting the succinoyl chloride (2) on 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride, to obtain the numbered compound (3): BAES-Chol corresponding to general formula II (B) .
  • Figure 4 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TAP-Lithocholamide.
  • the step (a) comprises adding to the starting compound (1) (acid lithocholic still represented by R, COOH) of triethylamine in THF to give the intermediate compound (2) to which is added the compound C: H, -0-CO-Cl (step (b)) to obtain the mixed anhydride (3).
  • the step (c) comprises adding to the mixed anhydride (3), N, N-dimethylpropylene diamine to give tertiary amine (4).
  • Step (d) consists in taking the tertiary amine (4) obtained in step (c) above in tetrahydrofuran (THF) and the methyl iodide (ICH 3). to obtain the numbered compound (5): TAP-Lithocholamide corresponding to the general formula I (B).
  • Figures 5-1 1 are the results obtained when using in the form of liposomes with DOPE cationic lipid compounds according to the invention for the transfer of nucleic acids.
  • Figure 6 represents the levels of activity of ⁇ -galactosidase (10 RLU b "relative light unit” / mg) expressed respectively (from left to right) in the following cells: MCF-7, A549. 9L. U373MG and HUH7, said cells being transfected using liposome-Chol TEAPC according to the invention.
  • FIG. 7 represents the relative levels of transfection (%) in MCF-7 cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: lipofectamine.
  • DMRIE TEAPC-Chol according to the invention, transfectam, and cellfectine TC- Chol.
  • Figure 8 shows the transfection levels in CEM cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: Lipofectin.
  • TEAPC- Chol according to the invention and TAP-lithocholamide according to the invention.
  • the level of transfection is measured by the activity of ⁇ -galactosidase (10 3 RLU).
  • Figure 10 shows the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in .mu.M) cationic liposomes prepared from cationic lipids of the invention TEAPC-Chol (see curve with the black rectangle) and BAEC-Chol (see curve including the black circle), and from the known DC-Chol lipid (cf curve comprising the black triangle).
  • Figure 11 shows the transfection of relative levels (%) of tumor cells MCF7 by pCMV.beta-Chol liposomes BAEC-complexes according to the invention in the presence of fetal calf serum, depending on the molar charge ratio
  • X Lip (+) / nucleotide.
  • the white histogram represents 0% fetal calf serum (FCS).
  • the gray histogram represents 25% of SVF.
  • the hatched histogram represents 50% of SVF and the gridded histogram represents 10% of fetal calf serum.
  • the cationic lipid compounds according to the invention have many advantages that are especially illustrated in the examples given below.
  • Example 1 Monocation derivative of cholesterol (TEAPC-Chol).
  • R - O-CO - NH - (CH 2 ) 3 - N + (C, H 5 ) 3 , 1 " in which R, is the cholesteryl group
  • the lipid compounds of the prior art shown for comparison in this example are monoamino derivatives of cholesterol, namely the "DC-Chol”, corresponding to 3- ⁇ [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) - carbamoyl] cholesterol [3, 4a], and “DAC-Chol”, corresponding to 3- ⁇ [N- (N, N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5] and “TC-chol” corresponding to 3 - ⁇ [N- (N'.N ', N'
  • the TEAPC-Chol cationic lipid is in the form of an ion consisting of a quaternary ammonium carrying 3 ethyl groups. It is different from DC-chol which is a tertiary amine and from trimethylated TC-Chol. On the other hand, its spacer arm is 3 (CH 2 ) instead of 2 (CH 2 ).
  • DC-chol which is a tertiary amine and from trimethylated TC-Chol.
  • its spacer arm is 3 (CH 2 ) instead of 2 (CH 2 ).
  • the cationic lipid compound according to the invention can easily fix the negatively charged substances, unlike the neutral DC-Chol, which tends to push them because the lone pair on the nitrogen.
  • the TEAPC-Chol lipid according to the invention is different, compared to DAC-Chol (base lipid of "DAC30"), by the link arm ("linker”) and by the polar head.
  • the link arm of TEAPC-Chol is a secondary amide while that of DAC-Chol is a tertiary amide.
  • TEAPC-Chol lipid does not present a risk of the formation of degradation products, possibly toxic, specific to amines.
  • the polar head of the DAC-Chol lipid is a secondary amine hydrochloride.
  • c 'therefore is an acidic compound, unlike TEAPC-Chol is neutral and therefore more stable to the change of pH.
  • TEAPC-Chol is insensitive to the variation in pH in media whose pH is near neutral pH. This is the case for culture media and intracellular media. It is capable of protecting negatively charged and complexed entities against any degradation due to variations in pH.
  • TEAPC-Chol lipid is soluble in methylene chloride (CH, C1).
  • CH, C1 methylene chloride
  • TEAPC-Chol-based liposomes can therefore be prepared using CH, C1, which must be evaporated after the first stage of liposome preparation which consists in producing a thin film. Since the CH 2 C1 2 (bp. 40 ° C) is removed much more easily than the chloroform used until then (bp. 60 ° C), liposomes prepared from lipid TEAPC-Chol dissolved in CH 7 C1, show no toxicity due to the solvent.
  • the level of transfection in cells of MCF7 and 9L lines obtained with liposomes prepared from TEAPC-Chol is higher than that of TC-Chol.
  • TEAPC-Chol lipid gives liposomes of size between 1 10 to 180 nm. These liposomes are very stable over time, since these values only change by less than 5% after 1 year.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • oligonucleotide-liposome complexes formed penetrate into culture cells, adherent cells or cells in suspension.
  • the oligonucleotides are thus internalized in the cytoplasm or in the nucleus, depending on the sequence and the molecular structure chosen for the oligonucleotide.
  • the reaction is instantaneous and the yield is a function of the DOPE / Lip + ratio.
  • the 1: 1 formulation of DOPE / Lip-t- appears to be the best for several plasmids.
  • the liposome / plasmid complex enters cells in culture, adherent or in suspension, in 3-D culture in nodules and in solid tumors.
  • the level of expression of the reporter gene (luciferase or ⁇ -galactosidase) is high and, in the tests carried out on cells of the MCF7 line, higher than that of lipofectamine, DMRIE and TC-Chol.
  • the liposome-plasmid or liposome-oligonucleotide complexes are not very toxic for several cells up to a molar concentration of 100 ⁇ M in TEAPC-Chol cationic lipid.
  • Example 2 Dicationic derivatives of cholesterol (BAEC-Chol and BAES-Chol).
  • R O-CO-NtCH.-CH.-NH ⁇ . Cl " ]., In which R represents the cholesteryl group.
  • triaminocholesterol [8] is an entity that is not electrically charged.
  • the spacer is a biodegradable tertiary amide.
  • dicationic lipids according to the invention are products soluble in THF. which avoids the use of chlorinated solvents in the preparation of liposomes.
  • BAEC-Chol and BAES-Chol can be recrystallized from the THF-methanol mixture (50/50). avoiding the use of chromatographic techniques very heavy purification.
  • Example 3 Derivatives monocationic derivatives of cholanic acid (TAP- cholamide TAP-TAP-déoxvcholamide lithocholamide and TAP-mühydrocholamide..).
  • TAP-convergeoxycholamide TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide. are represented by the formula I (B): R, -CO-NH- (CH 2) 3 -N + (CHJ, s I ", wherein R, is a group derived from the cholanic acid
  • TAP-convergeoxycholamide TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide are listed below.
  • the link arm is a biodegradable amide.
  • the head is a quaternary ammonium.
  • Example 4 Synthesis of the TEAPC-Chol monocation lipid.
  • TEAPC-Chol was synthesized according to the diagram in Figure 1.
  • the new lipid was characterized by IR spectroscopy.
  • BAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98% purity). 3-diethylamino-1-propylamine
  • a solution of cholesteryl chloroformate (4.6 g; or 10 mmol in 60 cm 3 of anhydrous ether) is added dropwise to a solution of 3-diethylamino-1-propylamine (2.65 g; or 20 mmol in 50 cm 3 anhydrous ether) maintained at 0 ° C (ice bath).
  • the hydrochloride formed is removed by filtration and the solvent removed on a rotary evaporator.
  • the synthesis of quaternary ammonium iodide is carried out by reaction at reflux (12 hours) of ethyl iodide in large excess (40 mmol) on the residual carbamate dissolved in 50 cm 3 of tetrahydrofuran. After removal of the solvent and excess iodide.
  • BAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98%). diethylene triamine (99%). tetrahydrofuran (99 +%) are Aldrich products used without further purification. The other reagents are common laboratory chemicals.
  • the first step is to perform the synthesis of the dihydrochloride diethylene triamine of formula HN [CH, -CH, -NH, +, Cl "], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of hydrochloric acid (HCl) aqueous solution (IM).
  • HCl hydrochloric acid
  • IM aqueous solution
  • IR of group C 0 (KBr pellet) is at 1690.8 cm - 1 .
  • the first step consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride of formula HN [CH Stamm-CH 1 -NH 3 + , Cl " ], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of HCl in aqueous solution (IM) as described previously.
  • Example 7 Synthesis of the TAP monolithic lipid-lithocholamide.
  • the synthesis of TAP-lithocholamide was performed according to the diagram of Figure 4. A 9.5 g (2.5x10 "2 mol) of lithocholic acid (> 99%. Fluka) in 100 cm 3 of anhydrous THF (99.9%. Aldrich).
  • Example 8 Use of the TEAPC-Chol monocation derivative.
  • DOPE dioleolylphosphatidyl ethanolamine
  • the final cationic lipid concentration is 1 mg / ml, or 1.43 mM.
  • the mixture was vortexed for 2 minutes and sonicated for 30 minutes intermittently using a Bransonic sonicator model 1210. A clear solution is obtained.
  • the solution is centrifuged for 15 min with a speed of 12,000 g. The supernatant is removed and, if necessary, filtered through a Millipore filter.
  • Oligonucleotides and plasmids are characterized in size by a dynamic light scattering device. The number distribution indicates a single mode with an average diameter of 104 nm. The same preparation protocol is applicable to BAEC-Chol.
  • Oligonucleotides and plasmids The oligonucleotides used, varying in length from 12 to 28 seas, are supplied in lyophilized form by Genosys (Great Britain) or Eurogentec (Belgium). In order to visualize their internalization. certain oligonucleotides are labeled with fluorescein in position 5 " .
  • the oligonucleotides are dissolved in sterile water at a concentration of 3 mM in nucleotide.
  • the plasmids used are plasmids pCMV- ⁇ carrying a reporter gene coding for ⁇ - galactosidase (Clonetech), or pGL2-luc carrying a reporter gene coding for luciferase (Proméga).
  • Tris-EDTA buffer ethylenediamine tetraacetic acid
  • the cells used are adherent cells of cancerous origin (MCF7, A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16), or cells in suspension (CEM, U937).
  • the cells are cultured according to standard conditions for each type.
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • adherent cells MF7. A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16
  • RPMI 1640 medium Roswell Park
  • a quantity of DNA (plasmid or oligonucleotide) of 1 ⁇ g and the chosen quantity of TEAPC-Chol cationic liposomes were separately diluted in 10 ⁇ L of sterile water and slightly vortexed and then mixed.
  • the mixture is diluted in 1 ml of OptiMEM medium (Gibco) without serum.
  • the cells are washed with the serum-free medium and then mixed in the OptiMEM is added to the cells.
  • the OptiMEM is removed, replaced by 1 ml of culture medium containing 10% of serum.
  • the cells continue to be incubated for the required time. In tests to test the transfection capacity in the presence of serum. 1 ml of medium containing serum desired content is used instead of OptiMEM.
  • the method for evaluating the level of transfection is to detect the ⁇ - galactosidase by the reagent AMPGD (3- (4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3.2'- tricyclo (3.3.1.1) decane) -4-yl) phenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Tropix).
  • AMPGD 4- (4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3.2'- tricyclo (3.3.1.1) decane) -4-yl) phenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Tropix).
  • the AMPGD at pH> 9. leads to adamantanone and flag methyl dentaloxybenzoate. the latter is in an excited state and emits fluorescence, which allows perform the measurement [15].
  • the ⁇ -galactosidase or luciferase activity is measured 48 hours after transfection using the Galactolight Plus detection kit (Tropix) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the cells are washed twice, in 1 ml of phosphate buffer solution (PBS) each time, then lysed with 200 ⁇ L of lysis buffer containing 1 mM of freshly prepared dithiotreiol.
  • the extracts are harvested and centrifuged at 12,000 g for 5 min.
  • the transfection rate can be further enhanced by using a plasmid condensing agent such as spermine. before complexing with TEAPC-Chol liposomes.
  • a plasmid condensing agent such as spermine.
  • SEPIC simulsol 989
  • PEG polyethylene glycol
  • G3AG2AG2AG2CG2AG2AG2A2GAG2A are mixed with liposomes 1: 1, according to various X charge ratios.
  • the mixtures are filtered through filters
  • Millipore whose mass limit is 30 kDa to pass only free oligonucleotides, not linked to liposomes.
  • FIG. 6 represents the activity levels of ⁇ -galactosidase expressed respectively in cells of MCF7, A549, 9L, U373MG and HUH7, transfected using the TEAPC-Chol / DOPE liposomes. The best results are observed for 9L cells.
  • FIG. 7 indicates that the TEAPC-Chol / DOPE liposomes have a level of transfection 2 to 3 times higher than that of lipofectamine.
  • TAP-lithocholamide liposomes have a transfecting power 30 times greater than that of lipofectin. e) Effect of the DOPE / Lip + ratio on the level of transfection of tumor cells
  • the viability of the cells is detected by the MTT test.
  • the MTT test consists of detecting viable cells using the MTT reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -
  • MTT reagent (1 mg / ml of DMEM medium containing serum) are added and the cells are again incubated. After 3 h. the reagent is removed, replaced with 100 ⁇ L of DMSO (dimethyl sulfoxide) for 20 min. Cells "viable" give a blue color whose optical density at the wavelength of 570 nm varies proportionally to the number thereof.
  • FIG. 10 represents the variations in the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in ⁇ M) of the cationic liposomes used, prepared from TEAPC-Chol. BAEC-Chol or DC-Chol. The percentage is calculated relative to the optical density obtained from the non-transfected cells.
  • Figure 11 shows the transfection levels of MCF7 tumor cells with BAEC-Chol / pCMV ⁇ liposome complexes in the presence of fetal calf serum.
  • a variation in the level of transfection is observed as a function of the ratio X.
  • EPAND R .. BOTTEGA R .. HUANG L. (1993). Method for delive ⁇ ng nucleic acids into cells. publication of international application WO 93/05162 [15] JALN V.J. & MAGRATH I.T. (1991), A chemiluminescent assay for quantification of ⁇ -galactosidase in the femtogram range, Anal. Biochem., 199, 119-124.

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Abstract

The invention concerns the use of a monocationic lipid compound of general formula I(A): R1O-CO-NH-(CH2)n-N+(C2H5)3, I- wherein: R¿1? represents the cholesteryl radical; n represents an integer equal to 1, 2 or 3 and in particular 3-β[N-(N',N',N'-triethylaminopropane iodide)-carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol) and/or a monocationic lipid compound of general formula I(B): R2-CO-NH-(CH2)n-N?+(R)¿3,X- wherein: R¿2? represents in particular the abietic acid radical, or the radical of a derivative of cholanic (cholic, deoxycholic, dehydrocholic, lithocholic) acid; R represents in particular a methyl or ethyl radical; n represents an integer equal to 2 or 3; X represents in particular a chlorine or iodine atom; and/or a dicationic lipid compound of general formula II(A): R1O-CO-N[CH2- CH2-N?+(R)¿3,X-]2; and/or a dicationic lipid compound of general formula II(B): R1O-CO-CH2-CH2-CO-N[CH2-CH2-N+(R)3, X-]2; and/or a dicationic lipid compound of formula II(C): R2-CO-N[CH2-CH2-N+(R)3,X-]2 wherein R1 represents the cholesteryl radical; R2 represents in particular the abietic acid radical or the radical of a derivative of a cholanic (cholic, deoxycholic, dehydrocholic, lithocholic) acid; R represents in particular a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical; X represents in particular a chlorine or iodine atom. Said compounds are useful for transfecting living organisms in vivo, organs in vivo, tumours in vivo, or cells in vitro or ex vivo.

Description

COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE TRANSFERT DE SUBSTANCES D'INTERET THERAPEUTIQUE CHARGEES NEGATIVEMENTCATIONIC LIPID COMPOUNDS AND THEIR USE FOR TRANSFERRING NEGATIVELY CHARGED THERAPEUTIC SUBSTANCES
La présente invention a pour objet des composés lipidiques cationiques. et leur utilisation pour le transfert de substances d'intérêt thérapeutique chargées négativement, et notamment d'acides nucléiques.The present invention relates to cationic lipid compounds. and their use for the transfer of substances of therapeutic interest negatively charged, and in particular of nucleic acids.
Mis à part quelques cas très particuliers, les acides nucléiques seuls ne pénètrent pas dans les cellules, les organes ou les organismes, et nécessitent ainsi le recours à un vecteur. A ce jour, différentes techniques ont été décrites pour le transfert d'acides nucléiques et notamment d'ADN, dont les plus importantes et prometteuses font intervenir des vecteurs viraux ou des vecteurs lipidiques.Apart from a few very specific cases, nucleic acids alone do not penetrate cells, organs or organisms, and therefore require the use of a vector. To date, various techniques have been described for the transfer of nucleic acids and in particular DNA, the most important and promising of which involve viral vectors or lipid vectors.
Les vecteurs viraux sont efficaces mais présentent certains risques, dont notamment la pathogénicité, l'immunogénicité, la transmission, la recombinaison, la réplication, la transformation etc .. ; il existe donc un problème de sécurité dans l'utilisation de ces derniers.Viral vectors are effective but have certain risks, including pathogenicity, immunogenicity, transmission, recombination, replication, transformation etc ..; there is therefore a security problem in the use of these.
Les vecteurs lipidiques, en particulier les lipides cationiques connaissent un développement de plus en plus important. En effet, les lipides cationiques peuvent, par leurs charges positives, former facilement des complexes avec les acides nucléiques chargés négativement et les aider à franchir la barrière cellulaire lipidique, également chargée négativement ; les acides nucléiques pourront ensuite passer dans le noyau. Des efforts sont déployés pour développer des lipides cationiques ayant un niveau de transfection élevé. Ceci n'est réalisé que si le vecteur lipidique forme, avec un grand rendement, des complexes avec l'acide nucléique à transporter, aide à protéger ledit acide nucléique de la dégradation enzymatique extra et intracellulaire, et présente une cytotoxicité admissible.The lipid vectors, in particular the cationic lipids are experiencing an increasingly significant development. In fact, cationic lipids can, by their positive charges, easily form complexes with negatively charged nucleic acids and help them to cross the lipid cell barrier, also negatively charged; the nucleic acids can then pass into the nucleus. Efforts are being made to develop cationic lipids with a high level of transfection. N This is achieved if the lipid carrier form, with high efficiency, complex with the nucleic acid to be transported helps protect said nucleic enzymatic degradation extra and intracellular acid, and has a permissible cytotoxicity.
Les formulations de lipides cationiques existants actuellement sur le marché ont un prix moyen de 1500 F/mg, et sont commercialisées : * par Gibco (USA) sous les noms de :The cationic lipid formulations currently existing on the market have an average price of 1500 F / mg, and are marketed: * by Gibco (USA) under the names of:
- « Lipofectine ». dont le lipide de base est le « DOTMA » (chlorure de N- (l-(2,3-dioléyloxy)propyl)-N.N.N-triméthylammonium), - « Lipofectamine ». dont le lipide de base est le -< DOSPA » (trifluoroacétate de 2.3-dioléyloxy-N-(2(spermine carboxamido)éthyl)-N.N-diméthyl-l- propanaminium).- "Lipofectin". whose basic lipid is “DOTMA” (N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -NNN-trimethylammonium chloride), - "Lipofectamine". whose base lipid is - <DOSPA "(2,3-dioleyloxy-N- (2 (spermine carboxamido) ethyl) -NN-dimethyl-1-propanaminium) trifluoroacetate).
- « DMRIE ». dont le lipide de base est le « DMRIE » (bromure de 1.2- dimyristyloxypropyl-3-N.N-diméthyl hydroxy ammonium).- "DMRIE". whose basic lipid is “DMRIE” (1.2-dimyristyloxypropyl-3-N.N-dimethyl hydroxy ammonium bromide).
* par Boehringer (Allemagne) sous le nom de « DOTAP ». dont le lipide de base est le « DOTAP » ( -(l -(2.3-dioléyloxy)propyl-N.N.N-triméthylammonium sulfate de methyle)), par Proméga (USA) sous le nom de « Transfectam ». dont le lipide de base est le « DOGS » (dioctadécylamidoglycyl spermine)* by Boehringer (Germany) under the name of "DOTAP". whose basic lipid is "DOTAP" (- (l - (2.3-dioleyloxy) propyl-N.N.N-trimethylammonium methyl sulfate)), by Proméga (USA) under the name of "Transfectam". whose basic lipid is "DOGS" (dioctadecylamidoglycyl spermine)
* par Eurogentec (Belgique) sous le nom de « DAC 30 ». dont le lipide de base est le « DAC-Chol » (3-β-( -("N.N"-diméthylaminoéthane )-carbamoyle ) cholestérol).* by Eurogentec (Belgium) under the name of "DAC 30". whose basic lipid is "DAC-Chol" (3-β- (- ( " NN " -dimethylaminoethane) -carbamoyl) cholesterol).
Concernant les produits non commercialisés, deux grandes familles de lipides cationiques ont été à ce jour rapportées. Tous ces composés possèdent une queue hydrophobe liée à une tête polaire aminée portant un ou plusieurs atomes d'azote chargés positivement. Ces familles se distinguent par la partie hydrophobe qui peut être une double chaîne alkyle ou un dérivé du cholestérol. Ces composés forment des complexes avec des acides nucléiques (plasmides ou oligonucléotides). Des résultats encourageants sur le niveau de transfection des cellules en culture ont été publiés [l-4a, 13, 14]. Parmi les dérivés du cholestérol monoaminés, le dérivé le plus connu est leRegarding non-marketed products, two main families of cationic lipids have been reported to date. All these compounds have a hydrophobic tail linked to an amine polar head bearing one or more nitrogen atoms positively charged. These families are distinguished by the hydrophobic part which can be a double alkyl chain or a cholesterol derivative. These compounds form complexes with nucleic acids (plasmids or oligonucleotides). Encouraging results on the level of transfection of cells in culture have been published [1-4a, 13, 14]. Among the monoamine cholesterol derivatives, the best known derivative is
« DC-Chol ». correspondant au 3-β[N-(N' .N"-diméthylaminoéthane )-carbamoyle] cholestérol [3, 4a] et le « TC-Chol » correspondant au 3-β[N-(N',N',N"- Triméthylaminoethane chlorure)-carbamoyle]cholestérol [4b], le dérivé commercialisé est le « DAC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N.N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle ] cholestérol [5]."DC-Chol". corresponding to 3-β [N- (N '.N " -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [3, 4a] and the" TC-Chol "corresponding to 3-β [N- (N', N ', N " - Trimethylaminoethane chloride) -carbamoyl] cholesterol [4b], the derivative marketed is "DAC-Chol", corresponding to 3-β [N- (N.N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5].
Par ailleurs, il semblerait que les composés ayant une tête polyaminée, telle que la dioctadécylamidoglycylspermine (« DOGS »), pourraient avoir une plus grande capacité à former des complexes avec les acides nucléiques [6, 7] que les composés présentant une seule fonction aminé dans leur tête polaire. Ces résultats ont entraîné la synthèse de toute une série de composés dérivés du cholestérol ayant une tête polaire de type polyamine (spermine, spermidine, guanidinium etc..) [8, 9].On the other hand, it would appear that compounds having a polyamine head, such as dioctadecylamidoglycylspermine ("DOGS"), may have a greater capacity to form complexes with nucleic acids [6, 7] than compounds having a single amino function in their polar head. These results have led to the synthesis of a whole series of cholesterol-derived compounds having a polyamine-type polar head (spermine, spermidine, guanidinium, etc.) [8, 9].
Cependant, dans toutes ces expériences, le milieu utilisé doit être pratiquement dépourvu de sérum : à titre d'exemple, le pourcentage maximal de sérum utilisé n'excède pas 20% pour une formulation de DC-Chol dans des tests sur des cellules A431. et une formulation de DAC-Chol dans des tests sur des cellules HepG2 et COS-1. Ainsi, l'utilisation de ces vecteurs pour délivrer les acides nucléiques dans des essais in vivo par voie intraveineuse est encore problématique. Récemment, un autre type d'amphiphile cationique a été synthétisé par la fixation des polyamines sur les sites polaires de l'acide cholique [10]. Pour des cellules COS-7, des niveaux de transfection de 6 à 10 fois supérieurs à celui de la lipofectine ont été obtenus avec des molécules portant un groupement spermine, pentamine ou hexamine. Ces molécules diffèrent de celles de la présente invention car elles ne contiennent pas de bras espaceur entre les sites polaires et la partie hydrophobe.However, in all these experiments, the medium used must be practically devoid of serum: for example, the maximum percentage of serum used n does not exceed 20% for formulation of DC-Chol in assays on A431 cells. and a formulation of DAC-Chol in tests on HepG2 and COS-1 cells. Thus, the use of these vectors to deliver nucleic acids in tests in vivo intravenously is still problematic. Recently, another type of cationic amphiphile was synthesized by the attachment of polyamines on the polar sites of cholic acid [10]. For COS-7 cells, transfection levels 6 to 10 times higher than that of lipofectin were obtained with molecules carrying a spermine, pentamine or hexamine group. These molecules differ from those of the present invention in that they do not contain a spacer arm between the polar sites and the hydrophobic part.
L'un des buts de l'invention est de fournir des lipides cationiques capables de transporter notamment des substances chargées négativement, notamment des acides nucléiques, y compris dans un milieu contenant une concentration élevée en sérum, à des fins de thérapie génique. de vaccination, de biologie, de physiologie, de génétique et de biotechnologie. One object of the invention to provide cationic lipids capable of including transport negatively charged substances, especially nucleic acids, including in a medium containing a high concentration of serum, for the purpose of gene therapy. vaccination, biology, physiology, genetics and biotechnology.
L'un des autres buts de l'invention est de fournir des lipides cationiques ayant un pouvoir transfectant amélioré par rapport aux lipides cationiques connus à ce jour.One of the other aims of the invention is to provide cationic lipids having an improved transfecting power compared to the cationic lipids known to date.
L'un des autres aspects de la présente invention est de fournir des procédés de synthèse simples des lipides cationiques, de façon à synthétiser les lipides cationiques de l'invention à une échelle industrielle, tout en ayant des rendements élevés.One of the other aspects of the present invention is to provide simple methods of synthesis of cationic lipids, to synthesize cationic lipids of the invention on an industrial scale, while having high yields.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé lipidique monocationique de formule générale (I)The present invention relates to the use of a monocationic lipid compound of general formula (I)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " (I) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupeR 2 - CO - NH - (CH 2 ) n - N + (R) 3 , X " (I) in which R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid, 3, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, or the group
RrO dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un methyle (-CH3) ou un ethyle (-C2H5), n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, sauf lorsque R est R,-0 où on se limite à (-C2H5) pour R, n=l,2 ou 3 etR r O in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, an alkyl radical and in particular a methyl (-CH 3 ) or an ethyl (-C 2 H 5 ), n represents an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, except when R is R, -0 where we limit ourselves to (-C 2 H 5 ) for R, n = 1,2 or 3 and
X est l'iode. et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) R'2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 (II) dans laquelle R\ représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe R,-0 ou R,-0-CO-(CH2)2. dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, et notamment un methyle (-CH3) ou un ethyle (-C2H;). X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore. pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo. De même, l'invention a pour objet les composés lipidiques cationiques de formule générale (I) et (II) ci-dessus définis, ainsi que les procédés de préparation desdits composés.X is iodine. and / or a dicationic lipid compound of general formula (II) R ' 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 (II) wherein R \ represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanic acid. the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, or the group R, or -0 R, - 0-CO- (CH 2 ) 2 . in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, an alkyl radical, and in particular a methyl (-CH 3 ) or an ethyl (-C 2 H ; ). X represents a halogen atom such as iodine or chlorine. for transfection of live organisms in vivo, of organs in vivo, tumors in vivo, or to cells in vitro or ex vivo. Likewise, the subject of the invention is the cationic lipid compounds of general formula (I) and (II) above defined, as well as the processes for the preparation of said compounds.
A titre d'exemple, un procédé de préparation d'un compose lipidique monocationique de formule générale (I) selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illa)As an example, a method of preparing a lipid monocationic compound of general formula (I) according to the invention is characterized in that a compound of general formula (IIIa)
R2 - CO - Z, (Illa) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3cc-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupeR 2 - CO - Z, (Illa) in which R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid, 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3cc-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, or the group
R,-0 dans lequel R, représente le radical cholesteryle. Z, représente le chlore, ou le groupement 0-CO-0-R3 dans lequel R^ représente un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, à l'action d'un composé de formule générale (IV) H2N - (CH2)n - N (R)2 (IV) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, pour former le composé de formule générale (V)R, -0 in which R represents the cholesteryl radical. Z is chlorine or a group 0-CO-0-R 3 wherein R represents an alkyl radical and in particular methyl or ethyl, to the action of a compound of general formula (IV) H 2 N - (CH 2 ) n - N (R) 2 (IV) in which R represents a hydrogen atom, an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, n represents an integer equal to 2 or 3, to form the compound of general formula (V)
R2 - CO - HN - (CH2)n - N (R)2 (V) dans laquelle R2, R et n ont les significations mentionnées ci-dessus, que l'on soumet à l'action du composé de formule générale (VI)R 2 - CO - HN - (CH 2 ) n - N (R) 2 (V) in which R 2 , R and n have the meanings mentioned above, which are subjected to the action of the compound of formula general (VI)
R - X (VI) dans laquelle R a la signification mentionnée ci-dessus, et X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore. pour obtenir le composé lipidique monocationique de formule générale (I) :R - X (VI) wherein R has the meaning mentioned above, and X represents a halogen atom such as iodine or chlorine. to obtain the monocationic lipid compound of general formula (I):
R2 - CO - NH - ( CH2)π - N+ (R)3 . X " (I) dans laquelle R2 . R. X et n ont les significations mentionnées ci-dessus. Selon le procédé de préparation des composés de formule générale (I) ci-dessus décrit, on pourra plus particulièrement obtenir le composé de formule générale I(A) etR 2 - CO - NH - (CH 2 ) π - N + (R) 3 . X " (I) in which R 2. R. X and n have the meanings mentioned above. According to the process for the preparation of the compounds of general formula (I) described above, it is more particularly possible to obtain the compound of formula general I (A) and
KB) :KB):
R, -O - CO - NH - (CH2)n - " (R)3 . X " I (A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1. 2, 3, X représente un atome d'iode. R2-CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , χ - I (B)R, -O - CO - NH - (CH 2 ) n - " (R) 3. X " I (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to 1 2, 3, X represents an iodine atom. R 2 -CO - NH - (CH 2 ) n - N + (R) 3 , χ - I (B)
R2 le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment ceiui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12 -dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α- hydroxy β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,The R 2 radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, including ceiui selected from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanic acid. the acid 3α, 12-dihydroxy-5β-cholanic acid. 3α-hydroxy β-cholanic acid or 3.7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents a methyl or ethyl radical, n represents an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such than chlorine or iodine,
Le procédé de préparation dudit composé lipidique monocationique de formule générale (I) est encore caractérisé en ce que le composé de formule générale (Illa)The process for the preparation of said monocationic lipid compound of general formula (I) is further characterized in that the compound of general formula (Illa)
R2 - CO - Z, (Illa) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe R,-0 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, Z, représente le groupement O- CO-0-R3 dans lequel R3 représente un radical alkyle et notamment un methyle ou un ethyle, est préparé en soumettant le composé de formule générale (VIII)R 2 - CO - Z, (Illa) in which R 2 represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of cholanic acid. in particular one selected from the group consisting of the radical of the 3α.7α acid, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3,7.12-trioxo-5β-cholanic acid, or the group R, -0 in which R represents the cholesteryl radical, Z represents the group O-CO-0-R 3 in which R 3 represents an alkyl radical and in particular a methyl or an ethyl, is prepared by subjecting the compound of general formula (VIII)
R2 - CO - OH (VIII) dans laquelle R2 a la signification mentionnée ci-dessus, à l'action d'un composé de formule générale (IX)R 2 - CO - OH (VIII) in which R 2 has the meaning mentioned above, to the action of a compound of general formula (IX)
N(R4)3 (IX) dans laquelle R4 représente un radical alkyle et notamment un ethyle, pour obtenir le composé de formule générale (X)N (R 4 ) 3 (IX) in which R 4 represents an alkyl radical and in particular an ethyl, to obtain the compound of general formula (X)
R2 - CO - 0 - NH(R4)3 (X) dans laquelle R2. R4 ont les significations mentionnées ci-dessus, que l'on soumet à l'action du composé de formule générale (XI)R 2 - CO - 0 - NH (R 4 ) 3 (X) in which R 2 . R 4 have the meanings mentioned above, which are subjected to the action of the compound of general formula (XI)
R, - O - CO - X (XI) dans laquelle R3 a la signification mentionnée ci-dessus. X représente un atome de chlore, pour obtenir le composé de formule générale (IIIc)R, - O - CO - X (XI) in which R 3 has the meaning mentioned above. X represents a chlorine atom, to obtain the compound of general formula (IIIc)
R2 - CO - O - CO - O - R3 (IIIc) correspondant au composé de formule générale (Illa) dans laquelle Z, représente le groupement 0-CO-0-R3. Le procédé de préparation d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb)R 2 - CO - O - CO - O - R 3 (IIIc) corresponding to the compound of general formula (Illa) in which Z represents the group 0-CO-0-R 3 . The method for preparing a dicationic lipid compound of general formula (II) according to the invention is characterized in that a compound of general formula (IIIb)
R' ; - CO - Z2 (Illb) dans laquelle R'2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3 ,7 ,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, ou le groupe RrO ou R,-0-CO-(CH2)2 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, Z2 représente un halogène tel que le chlore, à l'action d'un composé de formule générale (VII)R ' ; - CO - Z 2 (Illb) in which R ' 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of acid 3, 7, 12α-trihydroxy-5β-cholanic, 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, or the group R r O or R, -0-CO- (CH 2 ) 2 in which R represents the cholesteryl radical, Z 2 represents a halogen such as chlorine, to the action of a compound of general formula (VII )
HN[CH2 - CH, - N (R).'. X ]2 (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle et notamment un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel l'iode ou le chlore, pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) R'2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , χ -]2 (II) dans laquelle R'2, R et X ont les significations mentionnées ci-dessus. Selon le procédé de préparation des composés de formule générale (II) ci-dessus décrits, on pourra plus particulièrement obtenir les composés lipidiques dicationiques de formules générales II(A), II(B) et II(C) : R, 0 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , χ -]2 II(A)HN [CH 2 - CH, - N (R). ' . X] 2 (VII) in which R represents a hydrogen atom, an alkyl radical and in particular a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as iodine or chlorine, to obtain the dicationic lipid compound of formula general (II) R ' 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , χ -] 2 (II) in which R' 2 , R and X have the meanings mentioned above. According to the process for the preparation of the compounds of general formula (II) described above, it is more particularly possible to obtain the dicationic lipid compounds of general formulas II (A), II (B) and II (C): R, 0 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , χ -] 2 II (A)
R, O - CO - CH2 - CH2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(B) dans lesquelles R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, R2 - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3 .7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-tπoxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.R, O - CO - CH 2 - CH 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an atom . hydrogen X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, R 2 - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3, X "] 2 II (C) wherein R 2 represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3 .7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid , the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or the acid-3.7,12 tπoxo-5β-cholanic acid. R represents a hydrogen atom. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation du composé lipidique monocationique de formule générale I(A)A more particular subject of the present invention is the use of the monocation lipid compound of general formula I (A)
R,-0 - CO - NH - (CH2)π - >T (R)3 , X ' I (A) dans laquelle R{ représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1, 2. 3, X représente un atome d'iode, et ou d'un composé lipidique monocationique de formule générale I(B)R, -0 - CO - NH - (CH 2 ) π -> T (R) 3 , X ' I (A) in which R { represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to 1, 2. 3, X represents an iodine atom, and or a monocationic lipid compound of the general formula I (B)
R2 - CO - NH - ( CH2)n - N' (R), . X " I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérive de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7 ,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH2 - CH2 - N' (R)3 . X "]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(B) R, O - CO - CH2 - CH, - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(C) R2 - CO - N[CH, - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode. pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo. Le composé de formule générale I(A) et les composés de formule générale I(B),R 2 - CO - NH - (CH 2 ) n - N ' (R),. X 'I (B) wherein R 2 represents the radical of abietic acid. The radical of a drift of the cholanic acid. Especially one chosen from the group consisting of the radical of the acid 3α, 7, 12α -trihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3.7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R is a methyl radical or ethyl, n is an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, and / or a lipid dicationic compound of general formula II (a) R, O - CO - N [CH 2 - CH 2 - N '. (R) 3 X'] 2 II (a) wherein R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, and / or a lipid dicationic compound of general formula II (B) R, O - CO - CH 2 - CH - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, and / or of a dicationic lipid compound of general formula II (C) R 2 - CO - N [CH, - CH, - N + (R) 3 , X " ] 2 II ( C) wherein R, represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid. acid 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanic acid. the 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3,7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine. for transfection of live organisms in vivo, of organs in vivo, tumors in vivo, or to cells in vitro or ex vivo. The compound of general formula I (A) and the compounds of general formula I (B),
II(A), II(B) et II(C), présentent un niveau de transfection amélioré par rapport aux composés lipidiques cationiques connus à ce jour. Pour déterminer le niveau de transfection, un gène rapporteur est utilisé. La protéine produit de ce gène est détectée par chimiolummescence. L'intensité est exprimée en unité relative (RLU) et rapportée à la quantité totale de protéines exprimées par les cellules transfectées.II (A), II (B) and II (C), show an improved transfection level compared to the cationic lipid compounds known to date. To determine the level of transfection, a reporter gene is used. The protein produced from this gene is detected by chemilummescence. The intensity is expressed as a relative unit (RLU) and based on the total amount of protein expressed by the transfected cells.
L'invention a également plus particulièrement pour objet le composé lipidique monocationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :The invention also more particularly relates to the monocationic lipid compound characterized in that it is selected from the group consisting of:
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(A) R, -O - CO - NH - (CH2)n - N^ (R)3 , X " I (A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à 1, 2, 3, X représente un atome d'iode,- the monogenic lipid compound of general formula I (A) R, -O - CO - NH - (CH 2 ) n - N ^ (R) 3 , X " I (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to 1, 2, 3, X represents an iodine atom,
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(B)- the monogenic lipid compound of general formula I (B)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle. n représente un nombre entier égal à 2 ou 3 , X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode. A ce titre, l'invention vise plus particulièrement le composé lipidique monocationique tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :R 2 - CO - NH - (CH 2) n - N + (R) 3 X 'I (B) wherein R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of the cholanic acid , in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid. 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents a methyl or ethyl radical. n represents an integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine As such, the invention relates more particularly to the monocationic lipid compound as defined above, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
- le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol) représenté par la formule générale I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, n représente un nombre entier égal à- 3-β [N- (N ', N', N ' -triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol) represented by the general formula I (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, n represents an integer equal to
2, X représente un atome d'iode,2, X represents an iodine atom,
- le composé N-(N\ N'. N'triméthylaminoéthane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode. - le composé N-(N'. N'. N'triméthylaminopropane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode,- The compound N- (N \ N '. N'trimethylaminoethane iodide) abietamide represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of abietic acid, R represents the methyl radical. n is 2 and X represents iodine. - the compound N- (. N. N N 'triméthylaminopropane iodide) abiétamide represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of abietic acid, R represents the methyl radical. n is equal to 3 and X represents iodine,
- le composé 3 .7 .l2α-trihydroxy-5β-[N-(N'.N',N"-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Cholamide (TAE-- Compound 3 .7 .l2α-trihydroxy-5β- [N- (N'.N ', N " -trimethylaminoethane iodide)] cholanamide. called" Trimethylaminoethane Cholamide (TAE-
Cholamide) ». représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode.Cholamide) ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical, n is 2 and X is iodine.
- le composé 3 ,7α.l2α-trihydroxy-5β-[N-(N',N',N"-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Cholamide (TAP-- Compound 3, 7α.l2α-trihydroxy-5β- [N- (N ', N', N " -trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. called" Trimethylaminopropane Cholamide (TAP-
Cholamide) ». représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode.Cholamide) ". represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X is iodine.
- le composé 3α,12 -dihydroxy-5β-[N-(N'.N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Déoxycholamide (TAE-- the compound 3α, 12 -dihydroxy-5β- [N- (N'.N'.N'-trimethylaminoethane iodide)] cholanamide. called “Trimethylaminoethane Deoxycholamide (TAE-
Déoxycholamide) » représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,Deoxycholamide) ”represented by the general formula I (B) in which R 2 represents the radical of 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine ,
- le composé 3α.l2α-dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déoxycholamide (TAP-- the compound 3α.l2α-dihydroxy-5β- [N- (N ', N', N'-trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. called “Trimethylaminopropane Deoxycholamide (TAP-
Déoxycholamide) », représente par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3cc,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode,Deoxycholamide) ”, represents by the general formula I (B) in which R, represents the radical of 3cc acid, 12α-dihydroxy-5β-cholanic. R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine,
- le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Lithocholamide (TAE-- the compound 3α-hydroxy-5β- [N- (N ', N', N ' -trimethylaminoethane iodide)] cholanamide, called “Trimethylaminoethane Lithocholamide (TAE-
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,Lithocholamide) ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3α-hydroxy-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine,
- le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminopropane Lithocholamide (TAP-- the compound 3α-hydroxy-5β- [N- (N ', N', N'-trimethylaminopropane iodide)] cholanamide, called “Trimethylaminopropane Lithocholamide (TAP-
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode. - le composé 3. 7, 12-trioxo-5β-[N-(N'.N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Déhydroxycholamide (TAE- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.Lithocholamide) ", represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3α-hydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine. - Compound 3. 7, 12-trioxo-5β- [N- (N'.N ', N'-trimethylaminoethane iodide)] cholanamide. referred to as "Triméthylaminoéthane Déhydroxycholamide (Tae Déhydrocholamide)" represented by the general formula I (B) wherein R 2 represents the radical of the acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 2 and X represents iodine.
- le composé 3. 7, 12-trioxo-5β-[N-(N',N'.N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déhydroxycholamide (TAP- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle. n est égal à 3 et X représente l'iode.- Compound 3. 7, 12-trioxo-5β- [N- (N ', N'.N ' -trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. referred to as "Triméthylaminopropane Déhydroxycholamide (TAP- Déhydrocholamide)" represented by the general formula I (B) wherein R 2 represents the radical of the acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical. n is 3 and X represents iodine.
L'invention a également plus particulièrement pour objet le composé lipidique dicationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :The invention also more particularly relates to the dicationic lipid compound characterized in that it is selected from the group consisting of:
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(A)- the dicationic lipid compound of general formula II (A)
R, O - CO - N[CH2 - CH, - N+ (R)3 , X ]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,R, O - CO - N [CH 2 - CH, - N + (R) 3 , X] 2 II (A) in which R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(B)- the dicationic lipid compound of general formula II (B)
R, O - CO - CH2 - CH, - CO - N[CH, - CH, - Nτ (R)3 , X "]2 II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,R, O - CO - CH 2 - CH, - CO - N [CH, - CH, - N τ (R) 3 , X " ] 2 II (B) in which R represents the cholesteryl radical. R represents an atom hydrogen, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(C)- the dicationic lipid compound of general formula II (C)
R2 - CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X ]2 II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 -hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,R 2 - CO - N [CH, - CH 2 - N + (R) 3 , X] 2 II (C) in which R 2 represents the radical of abietic acid, the radical of an acid derivative cholanic, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid, 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3 -hydroxy-5β- acid cholanic or 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
A ce titre, l'invention vise plus particulièrement le composé lipidique dicationique tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : - le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-carbamoyle] cholestérol (BAEC- Chol) représenté par la formule générale II(A), dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore.As such, the invention is more particularly the lipid dicationic compound as defined above, characterized in that it is selected from the group consisting of: - 3-β [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - carbamoyl] cholesterol (BAEC- Chol) represented by the general formula II (A), in which R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom.
- le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-succinamide cholestérol (BAES- Chol) représenté par la formule générale II(B). dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore,- 3-β [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - succinamide cholesterol (BAES- Chol) represented by the general formula II (B). wherein R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom,
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-abiétamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, - le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α.7α,12 -trihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α.7α. l2 -trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.- the compound NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - abiétamide represented by the general formula II (C), wherein R, represents the radical of abietic acid, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom, - the compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α.7α, 12 -trihydroxy-5β- cholanamide represented by the general formula II (C), in which R, represents the radical of the acid 3α.7α . l2 -trihydroxy-5β-cholanic. R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom.
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α. l2α-dihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore,- the compound N.N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α. l2α-dihydroxy-5β- cholanamide represented by the general formula II (C), in which R represents the radical of acid 3, 12α-dihydroxy-5β-cholanic, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom ,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3α-hydroxy-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C). dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.- Compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α-hydroxy-5β-cholanamide represented by the general formula II (C). in which R represents the radical of 3α-hydroxy-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom.
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3,7,12-trioxo-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.- the compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3,7,12-trioxo-5β-cholanamide represented by the general formula II (C), in which R 2 represents the radical of the acid 3,7 , 12-trioxo-5β-cholanic, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom.
L'invention concerne également une composition caractérisée en ce qu'elle contient un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus.The invention also relates to a composition characterized in that it contains a cationic lipid compound as defined above.
A ce titre, l'invention concerne une composition caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, dans lequel R, représente le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α,12 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que l'éthanol.As such, the invention relates to a composition characterized in that it is in the form of a cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, in which R represents the radical of a derivative of l cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the 3α.7α acid, 12 -trihydroxy-5β-cholanic acid. 3, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. and a solvent such as ethanol.
L'invention concerne également une composition caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, dans lequel R, représente le radical cholesteryle. R, représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3 - hydroxy-Sβ-cholanique ou l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que le chlorure de méthylène pour la préparation de liposomes.The invention also relates to a composition characterized in that it is in the form of cationic lipid solution containing a cationic lipid compound as defined above, wherein R, represents the radical cholesteryl. R, represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α, 7α.l2α- trihydroxy-5β-cholanic acid. acid 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanic acid. acid 3 - hydroxy-Sβ-cholanic acid or acid 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid. and a solvent such as methylene chloride for the preparation of liposomes.
L'invention a également pour objet un liposome caractérisé en ce qu'il contient une composition telle que définie ci-dessus, et un lipide (ou colipide) neutre, notamment la dioléoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), et éventuellement un lipide conjugué (notamment à un polyéthylèneglycol. ou à un fragment d'anticorps), et/ou un tensioactif, notamment choisi dans le groupe constitué par le simulsol 59. le simulsolThe invention also provides a liposome characterized in that it contains a composition as defined above, and a lipid (or colipid) neutral, particularly ethanolamine, dioleoylphosphatidyl (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol. or a fragment of antibody), and / or a surfactant, in particular selected from the group consisting of Simulsol 59. Simulsol
165 ou le simulsol 989.165 or simulsol 989.
L'invention vise également un complexe caractérisé en ce qu'il comprend un composé lipidique cationique tel que défini ci-dessus, ou une composition telle que définie ci-dessus, et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique, gène, plasmide. ribozyme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.The invention also relates to a complex characterized in that it comprises a cationic lipid compound as defined above, or a composition as defined above, and a negatively charged compound, in particular a nucleic acid (deoxyribonucleic acid. ribonucleic, gene, plasmid, ribozyme or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
L'invention vise également un complexe caractérisé en ce qu'il comprend un liposome tel que défini ci-dessus, et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique, acide ribonucléique, gène, plasmide, ribozyme ou oligonucléotide, pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie. De même, l'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un complexe tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention convient pour un mode quelconque d'administration, notamment par voie parentérale, par voie topique ou par inhalation.The invention also relates to a complex characterized in that it comprises a liposome as defined above, and a negatively charged compound such as a nucleic acid (deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, gene, plasmid, oligonucleotide or ribozyme, which can be covalently modified or not) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology. Similarly, the invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active principle, a complex as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient. The pharmaceutical composition according to the invention is suitable for any mode of administration, including parenterally, topically or by inhalation.
La composition pharmaceutique selon l'invention est encore caractérisée en ce que la quantité de complexe varie de 0.5 à 30 mg/kg de poids corporel pour une dose unitaire.The pharmaceutical composition according to the invention is further characterized in that the amount of complex is from 0.5 to 30 mg / kg body weight per unit dose.
Description des figuresDescription of the figures
Les figures 1 à 4 représentent les schémas de synthèse de composés lipidiques monocationiques et dicationiques selon l'invention.Figures 1 to 4 show the synthesis diagrams of monocationic and dicationic lipid compounds according to the invention.
La Figure 1 représente le schéma de synthèse du lipide monocationique TEAPC- Chol. L'étape (a) consiste à additionner au produit de départ (1) (le chloroformate de cholesteryle), 2 équivalents de 3 -diéthylamino-1 -propy lamine et de l'éther anhydre à une température de 0°C. pour obtenir le carbamate de formule (2). L'étape (b) consiste à ajouter en excès de l'iodure d'éthyle sur ledit carbamate (2) pour obtenir le composé numéroté (3) : le TEAPC-Chol répondant à la formule I(A).Figure 1 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TEAPC-Chol. The step (a) consists in adding to the starting product (1) (cholesteryl chloroformate), 2 equivalents of 3 -diethylamino-1 -propyl lamine and anhydrous ether at a temperature of 0 ° C. to obtain the carbamate of formula (2). Step (b) comprises adding an excess of ethyl iodide on said carbamate (2) to obtain the compound number (3): the TEAPC-Chol of formula I (A).
La Figure 2 représente le schéma de synthèse du lipide dicationique BAEC-Chol. L'étape (a) consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine par réaction de la diéthylène triamine avec 2 équivalents d'acide chlorhydrique. L'étape (b) consiste à ajouter 2.25 équivalents du dichlorhydrate de diéthylène triamine ainsi obtenu au chloroformate de cholesteryle (1), pour obtenir le composé numéroté (2) : le BAEC- Chol répondant à la formule générale II(A).FIG. 2 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAEC-Chol. Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid. Step (b) consists in adding 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride thus obtained to cholesteryl chloroformate (1), to obtain the numbered compound (2): BAEC-Chol corresponding to general formula II (A).
La Figure 3 représente le schéma de synthèse du lipide dicationique BAES-Chol.Figure 3 represents the diagram of synthesis of the dicationic lipid BAES-Chol.
L'étape (a) consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine par réaction de la diéthylène triamine avec 2 équivalents d'acide chlorhydrique.Step (a) consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride by reaction of diethylene triamine with 2 equivalents of hydrochloric acid.
L'étape (b) consiste à ajouter du chlorure d'oxalyle (COCl)2 à de l'hémisuccinate de cholesteryle (1) en présence de chlorure de méthylène (CH2C12), pour obtenir le chlorure de succinoyle correspondant (2). L'étape (c) consiste à faire réagir le chlorure de succinoyle (2) sur 2,25 équivalents de dichlorhydrate de diéthylène triamine, pour obtenir le composé numéroté (3) : le BAES-Chol répondant à la formule générale II(B).Step (b) consists in adding oxalyl chloride (COCl) 2 to cholesteryl hemisuccinate (1) in the presence of methylene chloride (CH 2 C1 2 ), to obtain the corresponding succinoyl chloride (2 ). Step (c) consists in reacting the succinoyl chloride (2) on 2.25 equivalents of diethylene triamine dihydrochloride, to obtain the numbered compound (3): BAES-Chol corresponding to general formula II (B) .
La Figure 4 représente le schéma de synthèse du lipide monocationique TAP- Lithocholamide.Figure 4 shows the synthesis scheme of the monocationic lipid TAP-Lithocholamide.
L'étape (a) consiste à ajouter au composé de départ ( 1) (l'acide lithocholique encore représenté par R,COOH), de la triéthylamine dans du THF, pour obtenir le composé intermédiaire (2) auquel est ajouté le composé C:H,-0-CO-Cl (étape (b)) pour obtenir l'anhydride mixte (3). L'étape (c) consiste à ajouter à l'anhydride mixte (3), la N.N-diméthylpropylène diamine pour obtenir famine tertiaire (4). L'étape (d) consiste à reprendre l'aminé tertiaire (4) obtenue à l'étape (c) précédente dans du tétrahydrofuranne (THF) et de l'iodure de methyle (ICH3). pour obtenir le composé numéroté (5) : le TAP-Lithocholamide répondant à la formule générale I(B). The step (a) comprises adding to the starting compound (1) (acid lithocholic still represented by R, COOH) of triethylamine in THF to give the intermediate compound (2) to which is added the compound C: H, -0-CO-Cl (step (b)) to obtain the mixed anhydride (3). The step (c) comprises adding to the mixed anhydride (3), N, N-dimethylpropylene diamine to give tertiary amine (4). Step (d) consists in taking the tertiary amine (4) obtained in step (c) above in tetrahydrofuran (THF) and the methyl iodide (ICH 3). to obtain the numbered compound (5): TAP-Lithocholamide corresponding to the general formula I (B).
Les figures 5 à 1 1 représentent les résultats obtenus lors de l'utilisation sous forme de liposomes avec du DOPE des composes lipidiques cationiques selon l'invention pour le transfert d'acides nucléiques. La Figure 5 représente le pourcentage d'oligonucléotides non liés aux liposomes, en fonction du rapport molaire de charge X = Lip(+)/nucléotide.Figures 5-1 1 are the results obtained when using in the form of liposomes with DOPE cationic lipid compounds according to the invention for the transfer of nucleic acids. Figure 5 shows the percentage of unbound liposomes oligonucleotides, depending on the molar charge ratio X = Lip (+) / nucleotide.
La Figure 6 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase ( 10b RLU « relative light unit »/mg) exprimes respectivement (de gauche a droite ) dans des cellules suivantes : MCF7, A549. 9L. U373MG et HUH7, lesdites cellules étant transfectées à l'aide des liposomes de TEAPC-Chol selon l'invention.Figure 6 represents the levels of activity of β-galactosidase (10 RLU b "relative light unit" / mg) expressed respectively (from left to right) in the following cells: MCF-7, A549. 9L. U373MG and HUH7, said cells being transfected using liposome-Chol TEAPC according to the invention.
La Figure 7 représente les niveaux relatifs de transfection (%) dans des cellules MCF-7 obtenus respectivement (de gauche à droite) avec les liposomes suivants : lipofectamine. DMRIE, TEAPC-Chol selon l'invention, transfectam, cellfectine et TC- Chol. La Figure 8 représente les niveaux de transfection dans des cellules CEM obtenus respectivement (de gauche à droite) avec les liposomes suivants : Lipofectine. TEAPC- Chol selon l'invention et TAP-lithocholamide selon l'invention. Le niveau de transfection est mesuré par l'activité de β-galactosidase (103RLU).FIG. 7 represents the relative levels of transfection (%) in MCF-7 cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: lipofectamine. DMRIE, TEAPC-Chol according to the invention, transfectam, and cellfectine TC- Chol. Figure 8 shows the transfection levels in CEM cells obtained respectively (from left to right) with the following liposomes: Lipofectin. TEAPC- Chol according to the invention and TAP-lithocholamide according to the invention. The level of transfection is measured by the activity of β-galactosidase (10 3 RLU).
La Figure 9 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase (106 RLU/mg) exprimés dans les cellules B16 transfectées à l'aide des liposomes TEAPC-Chol selon l'invention en fonction du rapport r = DOPE/lipide cationique utilisé.FIG. 9 represents the activity levels of β-galactosidase (10 6 RLU / mg) expressed in the B16 cells transfected using the TEAPC-Chol liposomes according to the invention as a function of the ratio r = DOPE / cationic lipid used .
La Figure 10 représente le pourcentage de cellules MCF7 viables en fonction de la concentration (exprimée en μM) des liposomes cationiques préparés à partir des lipides cationiques selon l'invention TEAPC-Chol (cf courbe comportant le rectangle noir) et BAEC-Chol (cf courbe comportant le rond noir), et à partir du lipide DC-Chol connu (cf courbe comportant le triangle noir).Figure 10 shows the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in .mu.M) cationic liposomes prepared from cationic lipids of the invention TEAPC-Chol (see curve with the black rectangle) and BAEC-Chol (see curve including the black circle), and from the known DC-Chol lipid (cf curve comprising the black triangle).
La Figure 11 représente les niveaux relatifs de transfection (%) des cellules tumorales MCF7 par des complexes pCMVβ-liposomes BAEC-Chol selon l'invention, en présence du sérum de veau fœtal, en fonction du rapport molaire de charge X= Lip(+)/nucléotide. L'histogramme blanc représente 0% de sérum de veau fœtal (SVF). l'histogramme gris représente 25% de SVF. l'histogramme hachuré représente 50% de SVF et l'histogramme quadrillé représente 10% de sérum de veau fœtal.Figure 11 shows the transfection of relative levels (%) of tumor cells MCF7 by pCMV.beta-Chol liposomes BAEC-complexes according to the invention in the presence of fetal calf serum, depending on the molar charge ratio X = Lip (+) / nucleotide. The white histogram represents 0% fetal calf serum (FCS). the gray histogram represents 25% of SVF. the hatched histogram represents 50% of SVF and the gridded histogram represents 10% of fetal calf serum.
Les composés lipidiques cationiques selon l'invention présentent de nombreux avantages qui sont notamment illustrés dans les exemples donnés ci-dessous.The cationic lipid compounds according to the invention have many advantages that are especially illustrated in the examples given below.
Les exemples ci-dessous illustrent la présente invention et ne la limitent en aucune façon.The examples below illustrate the present invention and do not limit it in any way.
A. PROPRIETES DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES SELONA. PROPERTIES OF CATIONIC LIPID COMPOUNDS ACCORDING TO
L'INVENTIONTHE INVENTION
Exemple 1 : Dérivé monocationique du cholestérol (TEAPC-Chol).Example 1: Monocation derivative of cholesterol (TEAPC-Chol).
Le composé lipidique monocationique selon l'invention étudié dans cet exemple, est désigné par l'abréviation TEAPC-Chol, et correspond au 3-β[N-(N',N',N'- triéthylaminopropane iodurej-carbamoyle] cholestérol, de masse molaire M = 698,90 g/mol, représenté par la formule I(A) ci-dessous :The monocationic lipid compound according to the invention investigated in this example, is designated by the abbreviation TEAPC-Chol, and corresponds to the β-3 [N- (N ', N', N'triéthylaminopropane iodurej-carbamoyl] cholesterol, molar mass M = 698.90 g / mol, represented by the formula I (A) below:
R, - O-CO - NH - (CH2)3 - N+ (C,H5)3 , 1 " dans laquelle R, est le groupement cholesteryleR, - O-CO - NH - (CH 2 ) 3 - N + (C, H 5 ) 3 , 1 " in which R, is the cholesteryl group
Les composés lipidiques de l'art antérieur donnés à titre de comparaison dans cet exemple sont des dérivés monoaminés du cholestérol, à savoir le « DC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle] cholestérol [3, 4a], et le « DAC-Chol », correspondant au 3-β[N-(N,N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyle] cholestérol [5] et le « TC-chol » correspondant au 3-β[N-(N'.N',N'-The lipid compounds of the prior art shown for comparison in this example are monoamino derivatives of cholesterol, namely the "DC-Chol", corresponding to 3-β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) - carbamoyl] cholesterol [3, 4a], and “DAC-Chol”, corresponding to 3-β [N- (N, N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol [5] and “TC-chol” corresponding to 3 -β [N- (N'.N ', N'
Triméthylaminoéthane chlorurej-carbamoyle] cholestérol [4b].Trimethylaminoethane chloridej-carbamoyl] cholesterol [4b].
1) Comparaison entre TEAPC-Chol selon l'invention. DC-Chol, TC-Chol et DAC-Chol1) Comparison between TEAPC-Chol according to the invention. DC-Chol, TC-Chol and DAC-Chol
Les avantages quant à l'originalité chimique du TEAPC-Chol par rapport au DC- Chol et au DAC-Chol. sont énumérés ci-dessous.The advantages as to the chemical originality of TEAPC-Chol compared to DC-Chol and DAC-Chol. are listed below.
(a) Le lipide cationique TEAPC-Chol est sous forme d'un ion constitué par un ammonium quaternaire portant 3 groupements ethyle. Il est différent du DC-chol qui est une aminé tertiaire et du TC-Chol triméthylé. D'autre part, son bras espaceur est de 3 (CH2) au lieu de 2(CH2). Dans les publications de l'art antérieur [3. 4], une charge positive a été attribuée au DC-Chol qui a une structure chimique neutre ! Cette erreur a également été relevée par d'autres auteurs [1 1 , 12].(a) The TEAPC-Chol cationic lipid is in the form of an ion consisting of a quaternary ammonium carrying 3 ethyl groups. It is different from DC-chol which is a tertiary amine and from trimethylated TC-Chol. On the other hand, its spacer arm is 3 (CH 2 ) instead of 2 (CH 2 ). In the publications of the prior art [3. 4], a positive charge has been attributed to DC-Chol which has a neutral chemical structure! This error was also noted by other authors [January 1, 12].
Ainsi, le composé lipidique cationique selon l'invention peut aisément fixer les substances chargées négativement, contrairement au DC-Chol neutre qui a plutôt tendance à les repousser du fait du doublet libre sur l'azote.Thus, the cationic lipid compound according to the invention can easily fix the negatively charged substances, unlike the neutral DC-Chol, which tends to push them because the lone pair on the nitrogen.
(b) Le rendement obtenu par le procédé de synthèse selon l'invention, du TEAPC- Chol. est de 49% alors que celui obtenu pour le DC-Chol [3] n'est que de 21 ,8%.(b) The yield obtained by the synthesis process according to the invention, the TEAPC- Chol. is 49% while that obtained for the DC-Chol [3] n is only 21, 8%.
(c) Le lipide TEAPC-Chol selon l'invention est différent, par rapport au DAC- Chol (lipide de base du « DAC30 »), par le bras de liaison (« linker ») et par la tête polaire. Le bras de liaison de TEAPC-Chol est un amide secondaire alors que celui de DAC-Chol est un amide tertiaire. Le lipide TEAPC-Chol ne présente pas de risque de formation de produits de dégradation, éventuellement toxiques, propres aux aminés.(c) The TEAPC-Chol lipid according to the invention is different, compared to DAC-Chol (base lipid of "DAC30"), by the link arm ("linker") and by the polar head. The link arm of TEAPC-Chol is a secondary amide while that of DAC-Chol is a tertiary amide. TEAPC-Chol lipid does not present a risk of the formation of degradation products, possibly toxic, specific to amines.
(d) La tête polaire du lipide DAC-Chol est un chlorhydrate d'aminé secondaire. c'est donc un composé acide, contrairement au TEAPC-Chol qui est neutre et donc plus stable vis à vis de la variation du pH.(d) The polar head of the DAC-Chol lipid is a secondary amine hydrochloride. c 'therefore is an acidic compound, unlike TEAPC-Chol is neutral and therefore more stable to the change of pH.
(e) Du fait qu'il s'agit d'un ammonium quaternaire, TEAPC-Chol est peu sensible à la variation de pH dans des milieux dont le pH est voisin du pH neutre. C'est le cas des milieux de culture et des milieux intracellulaires. Il est de nature à protéger les entités chargées négativement et complexées, contre toutes dégradations dues aux variations de pH.(e) the fact that it is a quaternary ammonium, TEAPC-Chol is insensitive to the variation in pH in media whose pH is near neutral pH. This is the case for culture media and intracellular media. It is capable of protecting negatively charged and complexed entities against any degradation due to variations in pH.
(f) Dans la synthèse du lipide DAC-Chol, le produit N,N"- diméthyléthylènediamine utilisé est une molécule symétrique. Le rendement de la réaction donnant naissance à la molécule ayant une tête a iné ne peut pas dépasser 50%.(f) In the synthesis of the lipid DAC-Chol, the product N, N " - dimethylethylenediamine used is a symmetrical molecule. The yield of the reaction giving rise to the molecule having an inated head cannot exceed 50%.
(g) Le lipide TEAPC-Chol est soluble dans le chlorure de méthylène (CH,C1 ). Des liposomes à base de TEAPC-Chol peuvent donc être préparés en utilisant CH,C1, qui doit être évaporé après la première étape de préparation des liposomes qui consiste à produire un film mince. Etant donné que CH2C12 (Eb. 40°C) est éliminé beaucoup plus facilement que le chloroforme utilisé jusqu'alors (Eb. 60°C), les liposomes préparés à partir du lipide TEAPC-Chol dissous dans CH7C1, ne présentent pas de toxicité due au solvant. (h) Le niveau de transfection dans des cellules de lignées MCF7 et 9L obtenu avec des liposomes préparés à partir de TEAPC-Chol est supérieur à celui de TC-Chol.(g) The TEAPC-Chol lipid is soluble in methylene chloride (CH, C1). TEAPC-Chol-based liposomes can therefore be prepared using CH, C1, which must be evaporated after the first stage of liposome preparation which consists in producing a thin film. Since the CH 2 C1 2 (bp. 40 ° C) is removed much more easily than the chloroform used until then (bp. 60 ° C), liposomes prepared from lipid TEAPC-Chol dissolved in CH 7 C1, show no toxicity due to the solvent. (h) The level of transfection in cells of MCF7 and 9L lines obtained with liposomes prepared from TEAPC-Chol is higher than that of TC-Chol.
2) Comparaison entre TEAPC-Chol selon l'invention, lipofectamine. DMRIE. Les avantages quant à l'originalité des applications du TEAPC-Chol par rapport au DMRIE et à la lipofectamine sont énumérés ci-dessous.2) Comparison between TEAPC-Chol according to the invention, lipofectamine. DMRIE. The advantages for the originality of TEAPC-Chol applications compared to DMRIE and lipofectamine are listed below.
(a) En utilisant le dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) comme colipide ou lipide neutre dans un rapport molaire ou pondéral compris entre 0,5 et 3, le lipide TEAPC-Chol donne des liposomes de taille comprise entre 1 10 à 180 nm. Ces liposomes sont très stables dans le temps, puisque ces valeurs n'évoluent que de moins de 5% après 1 an.(a) By using dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) as colipid or neutral lipid in a molar or weight ratio of between 0.5 and 3, the TEAPC-Chol lipid gives liposomes of size between 1 10 to 180 nm. These liposomes are very stable over time, since these values only change by less than 5% after 1 year.
(b) Ces liposomes forment instantanément des complexes avec des acides nucléiques. Pour des oligonucléotides phosphodiesters de longueur 10 à 28 mers, sous réserve de prendre un rapport molaire de charge [lipide cationique (Lip+) / nucléotide] convenable, le rendement de complexation peut atteindre 100%.(b) These liposomes instantly form complexes with nucleic acids. For phosphodiester oligonucleotides of length 10 to 28 seas, subject to taking a suitable molar charge ratio [cationic lipid (Lip +) / nucleotide], the complexing yield can reach 100%.
(c) Les complexes oligonucléotides-liposomes formés pénètrent dans des cellules en culture, cellules adhérentes ou cellules en suspension. Les oligonucléotides sont ainsi intemalisés dans le cytoplasme ou dans le noyau, en fonction de la séquence et de la structure moléculaire choisies pour l' oligonucléotide. (d) Pour les plasmides, la réaction est instantanée et le rendement est fonction du rapport DOPE/Lip+. La formulation 1 : 1 de DOPE/Lip-t- paraît la meilleure pour plusieurs plasmides.(c) The oligonucleotide-liposome complexes formed penetrate into culture cells, adherent cells or cells in suspension. The oligonucleotides are thus internalized in the cytoplasm or in the nucleus, depending on the sequence and the molecular structure chosen for the oligonucleotide. (d) For the plasmids, the reaction is instantaneous and the yield is a function of the DOPE / Lip + ratio. The 1: 1 formulation of DOPE / Lip-t- appears to be the best for several plasmids.
(e) Le complexe liposome/plasmides pénètre dans des cellules en culture, adhérentes ou en suspension, en culture 3-D en nodules et dans des tumeurs solides. Le niveau d'expression du gène reporter (luciférase ou β-galactosidase) est élevé et, dans les tests effectués sur des cellules de la lignée MCF7, plus élevé que celui de la lipofectamine, du DMRIE et du TC-Chol.(e) The liposome / plasmid complex enters cells in culture, adherent or in suspension, in 3-D culture in nodules and in solid tumors. The level of expression of the reporter gene (luciferase or β-galactosidase) is high and, in the tests carried out on cells of the MCF7 line, higher than that of lipofectamine, DMRIE and TC-Chol.
(f) Les complexes liposomes-plasmides ou liposomes-oligonucléotides sont peu toxiques pour plusieurs cellules jusqu'à une concentration molaire de 100 μM en lipide cationique TEAPC-Chol.(f) The liposome-plasmid or liposome-oligonucleotide complexes are not very toxic for several cells up to a molar concentration of 100 μM in TEAPC-Chol cationic lipid.
Exemple 2 : Dérivés dicationiques du cholestérol (BAEC-Chol et BAES-Chol). Le compose dicationique désigné par l'abréviation BAEC-Chol, correspond au 3- β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate ))-carbamoyle] cholestérol, de masse molaire M= 588.74 g/mol. représenté par la formule générale II(A) ci-dessous :Example 2: Dicationic derivatives of cholesterol (BAEC-Chol and BAES-Chol). The compound dicationic designated by the BAEC-Chol abbreviation corresponds to β 3- [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - carbamoyl] cholesterol, molar mass M = 588.74 g / mol. represented by the general formula II (A) below:
R O-CO-NtCH.-CH.-NH ~ . Cl"]., dans laquelle R, représente le groupement cholesteryle.R O-CO-NtCH.-CH.-NH ~ . Cl " ]., In which R represents the cholesteryl group.
Le composé dicationique désigné par l'abréviation BAES-Chol. correspond au 3-β [N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate ))-succinamide] cholestérol, de masse molaire M= 644.81 g/mol. représenté par la formule générale II(B)dans laquelle R, représente le groupement cholesteryle : R,-0-CO-(CH rCO-N[CH1-CH,-NH5 ~ , Cl"], . Les avantages quant à l'originalité des lipides dicationiques BAEC-Chol etThe dicationic compound denoted by the abbreviation BAES-Chol. corresponds to 3-β [NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - succinamide] cholesterol, of molar mass M = 644.81 g / mol. represented by the general formula II (B) in which R represents the cholesteryl group: R, -0-CO- (CH rCO-N [CH 1 -CH, -NH 5 ~ , Cl "],. originality dicationic lipid-Chol and BAEC
BAES-Chol sont énumérés ci-dessous.BAES-Chol are listed below.
(a) Avec une tète possédant 2 atomes d'azote charges positivement, le pouvoir de formation de complexes avec des acides nucléiques est accentué par rapport à une tête monocationique. (b) Les groupements chargés sont des chlorhydrates d'aminés primaires.(a) With a head having two nitrogen atoms positively charged, the complexing power with nucleic acids is increased relative to a monocationic head. (b) charged groups are hydrochlorides of primary amines.
Il faut rappeler que le triaminocholestérol [8] est une entité non chargée électriquement.It should be remembered that triaminocholesterol [8] is an entity that is not electrically charged.
(c) L'espaceur est un amide tertiaire biodégradable.(c) The spacer is a biodegradable tertiary amide.
(d) Les lipides dicationiques selon l'invention sont des produits solubles dans le THF. ce qui évite l'utilisation des solvants chlorés dans la préparation des liposomes.(d) dicationic lipids according to the invention are products soluble in THF. which avoids the use of chlorinated solvents in the preparation of liposomes.
(e) Le BAEC-Chol et le BAES-Chol sont recristallisables dans le mélange THF- méthanol (50/50). évitant ainsi l'utilisation des techniques chromatographiques de purification très lourdes.(e) BAEC-Chol and BAES-Chol can be recrystallized from the THF-methanol mixture (50/50). avoiding the use of chromatographic techniques very heavy purification.
(f) La synthèse du BAEC-Chol se déroule en une seule étape très rapide après l'élaboration du dichlorhydrate de diéthylène triamine, sans avoir recours au blocage des fonctions -NH2- Le rendement de la synthèse est élevé (77%).(f) The synthesis of BAEC-Chol takes place in a single very rapid step after the preparation of diethylene triamine dihydrochloride, without resorting to blocking of the functions -NH2- The yield of the synthesis is high (77%).
Ainsi, par rapport à la synthèse en plusieurs étapes du produit de l'art antérieur [8] qui est une aminé, la synthèse de BAEC-Chol en une seule étape constitue une amélioration fondamentale.Thus, compared to the multistage synthesis of the product of the prior art [8] which is an amine, the synthesis of BAEC-Chol in a single stage constitutes a fundamental improvement.
Exemple 3 : Dérivés monocationiques des dérivés de l'acide cholanique (TAP- cholamide. TAP-déoxvcholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide). Les composés monocationiques désignés par les abréviations TAP -cholamide.Example 3 Derivatives monocationic derivatives of cholanic acid (TAP- cholamide TAP-TAP-déoxvcholamide lithocholamide and TAP-déhydrocholamide..). The monocationic compounds designated by the abbreviations TAP -cholamide.
TAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide. sont représentés par la formule I(B) suivante : R,-CO-NH-(CH2)3-N+(CHJ, s I" , dans laquelle R, est un groupement dérivé de l'acide cholaniqueTAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide. are represented by the formula I (B): R, -CO-NH- (CH 2) 3 -N + (CHJ, s I ", wherein R, is a group derived from the cholanic acid
Les avantages quant à l'originalité des lipides monocationiques TAP-cholamide,The advantages for the originality of lipids monocationic TAP-cholamide,
TAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide et TAP-déhydrocholamide sont énumérés ci-dessous.TAP-déoxycholamide. TAP-lithocholamide and TAP-dehydrocholamide are listed below.
(a) Le bras de liaison est un amide biodégradable.(a) The link arm is a biodegradable amide.
(b) La tête est un ammonium quaternaire.(b) The head is a quaternary ammonium.
B. PROCEDE DE PREPARATION DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUES SELON L'INVENTIONB. PROCESS FOR THE PREPARATION OF CATIONIC LIPID COMPOUNDS ACCORDING TO THE INVENTION
Exemple 4 : Synthèse du lipide monocationique TEAPC-Chol.Example 4: Synthesis of the TEAPC-Chol monocation lipid.
TEAPC-Chol a été synthétisé suivant le schéma de la Figure 1. Le nouveau lipide a été caractérisé par spectroscopie IR.TEAPC-Chol was synthesized according to the diagram in Figure 1. The new lipid was characterized by IR spectroscopy.
La synthèse du BAEC-Chol a été effectuée selon une nouvelle méthode décrite dans le schéma de la figure 2. Le chloroformate de cholesteryle (pureté 98%). la 3-diéthylamino-l -propylamineBAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98% purity). 3-diethylamino-1-propylamine
(99+%>). le tétrahydrofuranne anhydre (99.9%) et l'iodure d'éthyle (99%) sont des produits commercialisés par Aldrich. utilisés sans autre purification.(99% +>). anhydrous tetrahydrofuran (99.9%) and ethyl iodide (99%) are products sold by Aldrich. used without further purification.
Une solution de chloroformate de cholesteryle (4,6g ; soit lOmmol dans 60 cm3 d'éther anhydre) est ajoutée goutte à goutte dans une solution de 3-diéthylamino-l- propylamine (2,65g ; soit 20 mmol dans 50 cm3 d'éther anhydre) maintenue à 0°C (bain de glace). Le chlorhydrate formé est éliminé par filtration et le solvant enlevé à l'évaporateur rotatif. La synthèse de l'iodure d'ammonium quaternaire est effectuée par réaction au reflux (12 heures) d' iodure d'éthyle en large excès (40 mmol) sur le carbamate résiduel solubilisé dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne. Après élimination du solvant et de l'excès d' iodure. la recristallisation dans le méthanol absolu donne 3,4g, soit un rendement de 49%. de poudre de couleur jaune paille correspondant au sel cationique pur TEAPC-chol. Exemple 5 : Synthèse du lipide dicationique BAEC-Chol.A solution of cholesteryl chloroformate (4.6 g; or 10 mmol in 60 cm 3 of anhydrous ether) is added dropwise to a solution of 3-diethylamino-1-propylamine (2.65 g; or 20 mmol in 50 cm 3 anhydrous ether) maintained at 0 ° C (ice bath). The hydrochloride formed is removed by filtration and the solvent removed on a rotary evaporator. The synthesis of quaternary ammonium iodide is carried out by reaction at reflux (12 hours) of ethyl iodide in large excess (40 mmol) on the residual carbamate dissolved in 50 cm 3 of tetrahydrofuran. After removal of the solvent and excess iodide. recrystallization from absolute methanol gives 3.4 g, ie a yield of 49%. of straw-yellow powder corresponding to the pure cationic salt TEAPC-chol. Example 5: Synthesis of the dicationic lipid BAEC-Chol.
La synthèse du BAEC-Chol a été effectuée selon une nouvelle méthode décrite dans le schéma de la Figure 2. Le chloroformate de cholesteryle (98%). la diéthylène triamine (99%). le tétrahydrofuranne (99+%) sont des produits Aldrich utilisés sans autre purification. Les autres réactifs sont des produits chimiques courants de laboratoire.BAEC-Chol was synthesized using a new method described in the diagram in Figure 2. Cholesteryl chloroformate (98%). diethylene triamine (99%). tetrahydrofuran (99 +%) are Aldrich products used without further purification. The other reagents are common laboratory chemicals.
La première étape consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine de formule HN[CH,-CH,-NH,+, Cl"], par réaction de la diéthylène triamine avec deux équivalents d'acide chlorhydrique (HCl) en solution aqueuse (IM). La formation de ce dichlorhydrate est possible par cette méthode, car le pKa des deux fonctions NH, de la diéthylène triamine est de 10. tandis que celui de son NH n'est que de 3.7. Il faut noter que ce résultat, qui constitue un blocage très simple des deux NH,. n'est pas applicable à des aminés telles que la spermine ou la spermidine largement utilisées dans la synthèse de lipides cationiques. puisque toutes leurs fonctions aminés primaires et secondaires sont dosées à un seul point équivalent. Le recours à un système de blocage de type BOC avec BOC-Spermine ou BOC-Spermidine est alors indispensable [8, 9. 17]. Le dichlorhydrate de diéthylènetriamine est obtenu avec un rendement de 77% après deux recristallisations dans le mélange éthanol-méthanol (50/50). et son point de fusion est de 176°C.The first step is to perform the synthesis of the dihydrochloride diethylene triamine of formula HN [CH, -CH, -NH, +, Cl "], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of hydrochloric acid (HCl) aqueous solution (IM). the formation of this dihydrochloride is possible by this method because the pK a of the two NH functions, from diethylenetriamine is 10 while that of the NH 's only 3.7. note that this result , which provides a very simple locking of the two NH ,. is not applicable to amines such as spermine or spermidine widely used in the synthesis of cationic lipids. since all their primary functions and secondary amino are dosed at one point It is therefore essential to use a blocking system of the BOC type with BOC-Spermine or BOC-Spermidine [8, 9, 17]. Diethylenetriamine dihydrochloride is obtained with a yield of 77% after two recrystallizations in the ethanol-methanol mixture (50/50). and its melting point is 176 ° C.
Le dichlorhydrate en léger excès (2.25 équivalents) est mis dans un creuset en porcelaine et fondu sur plaque électrique. Le chloroformate (5mmol. 1 éq.. F = 125°C) est ajouté par petites portions. Le mélange pâteux est remué à l'agitateur jusqu'à la fin du dégagement de HCl. Après refroidissement, le solide jaune paille obtenu est concassé puis repris 2 heures au reflux avec 50 cm3 de tétrahydrofuranne (THF). Le dichlorhydrate en excès et le trichlorhydrate de diéthylène triamine formé, insolubles dans le THF. sont enlevés par filtration. Après concentration du filtrat à environ 5 cm3, l'addition de CH,OH absolu relargue le BAEC-Chol. qui après filtration est repris successivement par une nouvelle portion de THF puis d'alcool. On recueille finalement 1.51 g (rendement 52%) de BAEC-Chol dont le point de fusion est de 21 1 °C. La bandeThe slight excess dihydrochloride (2.25 equivalents) is placed in a porcelain crucible and melted on an electric plate. The chloroformate (5mmol. 1 eq. F = 125 ° C) is added in small portions. The pasty mixture was stirred at the stirring until the end of the HCl evolution. After cooling, the straw-yellow solid obtained is crushed and then taken up for 2 hours at reflux with 50 cm 3 of tetrahydrofuran (THF). Excess dihydrochloride and diethylene triamine trihydrochloride formed, insoluble in THF. are removed by filtration. After concentrating the filtrate to approximately 5 cm 3 , the addition of absolute CH, OH releases BAEC-Chol. which after filtration is taken up successively by a new portion of THF and alcohol. Finally collected 1.51 g (yield 52%) of BAEC-Chol whose melting point is 21 1 ° C. The band
IR du groupement C=0 (pastille KBr) est à 1690.8 cm- 1.IR of group C = 0 (KBr pellet) is at 1690.8 cm - 1 .
L'utilisation du dichlorhydrate de diéthylène triamine constitue une nouvelle méthode de svnthèse du BAEC-Chol. Exemple 6 : Synthèse du lipide dicationique BAES-Chol. The use of diethylene triamine dihydrochloride is a new method of Synthesis of BAEC-Chol. Example 6: Synthesis of the dicationic lipid BAES-Chol.
La synthèse du BAES-Chol a été effectuée selon le schéma de la Figure 3. L'hémisuccinate de cholesteryle (98%) est un produit commercialisé par Lancaster ; le chlorure d'oxalyle (99%), la diéthylène triamine (99%), le tétrahydrofuranne (THF)Synthesis BAES-Chol was carried out according to the scheme of Figure 3. The cholesteryl hemisuccinate (98%) is a product commercially available from Lancaster; the oxalyl chloride (99%), diethylene triamine (99%), tetrahydrofuran (THF)
(99+%) sont des produits commercialisés par Aldrich, tous utilisés sans autre purification. Les autres réactifs sont des produits chimiques courants de laboratoire.(99 +%) are products marketed by Aldrich, all used without further purification. The other reagents are common laboratory chemicals.
La première étape consiste à effectuer la synthèse du dichlorhydrate de diéthylène triamine de formule HN[CH„-CH1-NH3 +, Cl"], par réaction de la diéthylène triamine avec deux équivalents de HCl en solution aqueuse (IM) comme décrit précédemment.The first step consists in carrying out the synthesis of diethylene triamine dihydrochloride of formula HN [CH „-CH 1 -NH 3 + , Cl " ], by reaction of diethylene triamine with two equivalents of HCl in aqueous solution (IM) as described previously.
Dans une deuxième étape. 10"2 mol d'hémisuccinate de cholesteryle dans 50 cmJ de CH,C1, à température ambiante et sous agitation pendant 20 heures, sont traités parIn a second step. 10 "2 mol of cholesteryl hemisuccinate in 50 cm J of CH, C1, at room temperature and with stirring for 20 hours, are treated with
3x10"2 mol de chlorure d'oxalyle. Ceci conduit au chlorure de succinoyle correspondant avec un rendement de 96%, après élimination du chlorure de méthylène puis de (COCl)2 en excès sous vide.3x10 "2 mol of oxalyl chloride. This leads to succinoyl chloride corresponding with a yield of 96%, after removal of methylene chloride followed by (COCl) 2 in excess under vacuum.
Le dichlorhydrate en léger excès (2,25 équivalents) est mis dans un creuset en porcelaine et fondu sur plaque électrique. Le chlorure de succinoyle (1 éq.) est ajouté par petites portions. Le mélange pâteux est remué à l'agitateur jusqu'à la fin du dégagement de HCl. Après refroidissement, le solide jaune paille obtenu est concassé puis repris 2 heures au reflux avec 50 cm3 de THF. Le dichlorhydrate en excès et le trichlorhydrate de diéthylène triamine formé, insolubles dans THF, sont enlevés par filtration. Après concentration du filtrat à environ 5 cm3, l'addition de CH3OH absolu relargue le BAES-Chol qui, après filtration est repris successivement par une nouvelle portion de THF puis d'alcool. On recueille finalement 0,70 g (rendement 55%) deThe slight excess dihydrochloride (2.25 equivalents) is placed in a porcelain crucible and melted on an electric plate. The succinoyl chloride (1 eq.) Is added in small portions. The pasty mixture was stirred at the stirring until the end of the HCl evolution. After cooling, the straw yellow solid obtained is crushed and then taken up for 2 hours at reflux with 50 cm 3 of THF. The excess dihydrochloride and the diethylene triamine trihydrochloride formed, insoluble in THF, are removed by filtration. After concentrating the filtrate to approximately 5 cm 3 , the addition of absolute CH3OH releases BAES-Chol which, after filtration, is taken up successively with a new portion of THF and then of alcohol. Finally, 0.70 g (55% yield) of
BAEC-Chol à partir initialement de 1 g de chlorure de succinoyle. La bande IR du groupement C=0 (pastille KBr) est à 1651,8 cm"' pour la fonction amide et à 1734,1 cm" • pour la fonction ester.BAEC-Chol from initially 1 g of succinoyl chloride. The IR band of the group C = 0 (KBr pellet) is 1651.8 cm "" for the amide function and 1734.1 cm " • for the ester function.
Exemple 7 : Synthèse du lipide monocationique TAP-lithocholamide. La synthèse du TAP-lithocholamide a été effectuée selon le schéma de la Figure 4. A 9.5 g (2,5x10"2 mol) d'acide lithocholique (> 99%. Fluka) dans 100 cm3 de THF anhydre (99.9%. Aldrich). on ajoute goutte à goutte à la température du laboratoire, 2,55 g de triéthylamine (994-%, Aldrich) dans 20 cm3 de THF. puis 2.72 g de chloroformate d'éthyle (>98%, Fluka). Le chlorhydrate de triéthylamine est séparé de la solution éthérée d'anhydride mixte par filtration. Après addition de 2.55 g de N.N- diméthylpropylène diamine (99+%. Aldrich) dans le filtrat précédent, le mélange est mis 24 heures sous agitation mécanique, à température ambiante. Après refroidissement (0 °C), on isole par filtration le lipide sous sa forme aminé tertiaire. Le solide obtenu est repris dans 100 cm3 de THF et 10.5 g (7.5x10"2 mol) de ICH. (99.5 %, Aldrich), et maintenu pendant 3 heures à 50 °C. On recueille finalement 13.7 g (91%) de TAP- lithocholamide. L'analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fouπer (IRTF) en phase solide avec KBr donne (-CO-N) à 1658,9 cm"1 et (-NH- ) à 3378 cm"1.Example 7: Synthesis of the TAP monolithic lipid-lithocholamide. The synthesis of TAP-lithocholamide was performed according to the diagram of Figure 4. A 9.5 g (2.5x10 "2 mol) of lithocholic acid (> 99%. Fluka) in 100 cm 3 of anhydrous THF (99.9%. Aldrich). 2.55 g of triethylamine (99 4 -%, Aldrich) in 20 cm 3 of THF are added dropwise at laboratory temperature, then 2.72 g of ethyl chloroformate (> 98%, Fluka) The triethylamine hydrochloride is separated from the ethereal solution of mixed anhydride by filtration After adding 2.55 g of NN-dimethylpropylene diamine (99 +%. Aldrich) in the preceding filtrate, the mixture is placed under mechanical stirring for 24 hours, at room temperature After cooling (0 ° C), the lipid is isolated by filtration in its tertiary amine form The solid obtained is taken up in 100 cm 3 of THF and 10.5 g (7.5 × 10 −2 mol) of ICH. (99.5%, Aldrich), and kept for 3 hours at 50 ° C. Finally collected 13.7 g (91%) of TAP-lithocholamide. Analysis by infrared spectroscopy Fouπer transform (FTIR) in solid phase with KBr gives (-CO-N) at 1658.9 cm "1 and (-NH-) to 3378 cm" 1.
C. UTILISATION DES COMPOSES LIPIDIQUES CATIONIQUESC. USE OF CATIONIC LIPID COMPOUNDS
SELON L'INVENTION POUR LE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES.ACCORDING TO THE INVENTION FOR THE TRANSFER OF NUCLEIC ACIDS.
Exemple 8 : Utilisation du dérivé monocationique TEAPC-Chol.Example 8: Use of the TEAPC-Chol monocation derivative.
Les essais de transfection décrits selon ce qui suit sont effectués avec le TEAPC-The transfection tests described according to the following are carried out with TEAPC-
Chol préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 1. a) Préparation des liposomes :Chol prepared according to protocol described in Example 1. a) Preparation of liposomes:
Un mélange de lipide cationique TEAPC-Chol et de lipide (ou colipide) neutre : la dioléolylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), dans un rapport pondéral 1 : 1 , est dissous dans le chloroforme, puis évaporé sous vide à l'évaporateur rotatif. Le film mince obtenu est séché pendant encore au moins 5 heures avant d'être réhydraté par de l'eau stérile. Le chlorure de méthylène peut être utilisé à la place du chloroforme.A mixture of TEAPC-Chol cationic lipid and neutral lipid (or colipid): dioleolylphosphatidyl ethanolamine (DOPE), in a 1: 1 weight ratio, is dissolved in chloroform, then evaporated in vacuo on a rotary evaporator. The thin film obtained is dried for at least another 5 hours before being rehydrated with sterile water. Methylene chloride can be used in place of chloroform.
La concentration finale en lipide cationique est de 1 mg/mL, soit 1.43 mM.The final cationic lipid concentration is 1 mg / ml, or 1.43 mM.
Le mélange est soumis à un vortex pendant 2 minutes puis soniqué pendant 30 minutes de façon intermittente à l'aide d'un sonificateur Bransonic modèle 1210. Une solution claire est obtenue. La solution est centrifugée pendant 15 mn avec une vitesse de 12000 g. Le surnageant est prélevé et, si nécessaire, filtré sur un filtre Millipore deThe mixture was vortexed for 2 minutes and sonicated for 30 minutes intermittently using a Bransonic sonicator model 1210. A clear solution is obtained. The solution is centrifuged for 15 min with a speed of 12,000 g. The supernatant is removed and, if necessary, filtered through a Millipore filter.
0.22 μm de diamètre de pore et le filtrat est stocké à 4°C. Les liposomes sont caractérisés en taille par un appareil de diffusion dynamique de la lumière. La distribution en nombre indique un mode unique avec un diamètre moyen de 104 nm. Le même protocole de préparation est applicable au BAEC-Chol. b) Oligonucléotides et plasmides : Les oligonucléotides utilisés, de longueur variable de 12 à 28 mers, sont fournis sous forme lyophilisée par Genosys (Grande Bretagne) ou Eurogentec (Belgique). Afin de visualiser leur internalisation. certains oligonucléotides sont marqués par de la fluorescéine en position 5". Les oligonucléotides sont dissous dans de l'eau stérile à la concentration de 3 mM en nucléotide. Les plasmides utilisés sont des plasmides pCMV-β portant un gène reporter codant pour la β-galactosidase (Clonetech), ou pGL2-luc portant un gène reporter codant pour la luciférase (Proméga). Les plasmides ont été amplifiés suivant le protocole standard. Ils sont stockés dans un tampon Tris-EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique), pH = 8 à la concentration 1 mg/mL. c) Cultures cellulaires :0.22 μm pore diameter and the filtrate is stored at 4 ° C. Liposomes are characterized in size by a dynamic light scattering device. The number distribution indicates a single mode with an average diameter of 104 nm. The same preparation protocol is applicable to BAEC-Chol. b) Oligonucleotides and plasmids: The oligonucleotides used, varying in length from 12 to 28 seas, are supplied in lyophilized form by Genosys (Great Britain) or Eurogentec (Belgium). In order to visualize their internalization. certain oligonucleotides are labeled with fluorescein in position 5 " . The oligonucleotides are dissolved in sterile water at a concentration of 3 mM in nucleotide. The plasmids used are plasmids pCMV-β carrying a reporter gene coding for β- galactosidase (Clonetech), or pGL2-luc carrying a reporter gene coding for luciferase (Proméga). The plasmids were amplified according to the standard protocol. They are stored in a Tris-EDTA buffer (ethylenediamine tetraacetic acid), pH = 8 to the concentration 1 mg / mL. c) Cell cultures:
Les cellules utilisées sont des cellules adhérentes, d'origine cancéreuse (MCF7, A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16), ou des cellules en suspension (CEM, U937). Les cellules sont cultivées suivant les conditions standards pour chaque type. Le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) est utilisé pour les cellules adhérentes (MCF7. A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16) et le milieu RPMI 1640 (Roswell ParkThe cells used are adherent cells of cancerous origin (MCF7, A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16), or cells in suspension (CEM, U937). The cells are cultured according to standard conditions for each type. DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is used for adherent cells (MCF7. A549, U373MG, 9L, Hs294T, B16) and RPMI 1640 medium (Roswell Park
Mémorial Institute) pour les cellules en suspension CEM et U937. Les milieux contiennent 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et des antibiotiques pénicilline- streptomycine. d) Protocole de transfection in vitro : Pour les cellules adhérentes, la veille du jour de transfection, les cellules sont ensemencées (5x10^ cellules par puits dans des plaques Falcon à 6 puits ou 5 10^ cellules par puits d'une lame Labtek (Nunc) à 4 puits). Ainsi le jour de transfection les cellules sont confluentes à 60-70%.Memorial Institute) for CEM and U937 suspended cells. The media contain 10% fetal calf serum (FCS) and penicillin-streptomycin antibiotics. d) In vitro transfection protocol: For adherent cells, the day before the transfection day, the cells are seeded (5 × 10 ^ cells per well in 6-well Falcon plates or 5 × 10 ^ cells per well of a Labtek slide ( Nunc) with 4 wells). Thus the day of transfection the cells are confluent at 60-70%.
Une quantité d'ADN (plasmide ou oligonucléotide) de lμg et la quantité choisie de liposomes cationiques TEAPC-Chol ont été séparément diluées dans 10 μL d'eau stérile et légèrement vortexées puis mélangées.A quantity of DNA (plasmid or oligonucleotide) of 1 μg and the chosen quantity of TEAPC-Chol cationic liposomes were separately diluted in 10 μL of sterile water and slightly vortexed and then mixed.
Après 15 minutes, le mélange est dilué dans 1 mL de milieu OptiMEM (Gibco) sans sérum. Les cellules sont lavées avec le milieu sans sérum puis le mélange dans l'OptiMEM est ajouté aux cellules. Après 6 heures d'incubation à 37°C. dans une atmosphère contenant 5% de Cθ2, l'OptiMEM est retiré, remplacé par 1 mL de milieu de culture contenant 10% de sérum. Les cellules continuent à être incubées pendant le temps voulu. Dans les essais pour tester la capacité de transfection en présence de sérum. 1 mL de milieu contenant la teneur désiré en sérum est utilisé à la place d'OptiMEM.After 15 minutes, the mixture is diluted in 1 ml of OptiMEM medium (Gibco) without serum. The cells are washed with the serum-free medium and then mixed in the OptiMEM is added to the cells. After 6 hours incubation at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% of Cθ2, the OptiMEM is removed, replaced by 1 ml of culture medium containing 10% of serum. The cells continue to be incubated for the required time. In tests to test the transfection capacity in the presence of serum. 1 ml of medium containing serum desired content is used instead of OptiMEM.
Le même protocole est utilisé pour les transfections témoins utilisant le DC-Chol synthétisé suivant la méthode de Gao et Huang (1991) [3] . Concernant les transfections utilisant la lipofectine. la lipofectamine. DMRIE et DAC-chol. les complexes sont obtenus selon le protocole recommandé par le fabricant. e) Evaluation du niveau de transfection :The same protocol is used for the control transfections using DC-Chol synthesized according to the method of Gao and Huang (1991) [3]. Regarding transfections using lipofectin. lipofectamine. DMRIE and DAC-chol. the complexes are obtained according to the protocol recommended by the manufacturer. e) Evaluation of the level of transfection:
La méthode d'évaluation du niveau de transfection consiste à détecter la β- galactosidase par le réactif AMPGD (3-(4-méthoxyspiro( 1.2-dioxetane-3.2'- tricyclo(3.3.1.1)décane)-4-yl)phényl-β-D-galactopyranoside (Tropix). En présence de β- galactosidase, l'AMPGD à pH > 9. conduit à l'adamantanone et à fanion methyl métaoxybenzoate. Ce dernier est dans un état excité et émet une fluorescence, ce qui permet d'effectuer la mesure [15].The method for evaluating the level of transfection is to detect the β- galactosidase by the reagent AMPGD (3- (4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3.2'- tricyclo (3.3.1.1) decane) -4-yl) phenyl- β-D-galactopyranoside (Tropix). in the presence of β- galactosidase, the AMPGD at pH> 9. leads to adamantanone and flag methyl métaoxybenzoate. the latter is in an excited state and emits fluorescence, which allows perform the measurement [15].
L'activité de β-galactosidase ou de luciférase est mesurée 48 heures après transfection en utilisant la trousse de détection Galactolight Plus (Tropix) suivant le protocole recommandé par le fabricant. Les cellules sont lavées 2 fois, dans 1 mL de solution de tampon phosphate (PBS) à chaque fois, puis lysées par 200 μL de tampon lyse contenant 1 mM de dithiotreiol fraîchement préparé. Les extraits sont récoltés, centrifugés à 12000 g pendant 5 mn.The β-galactosidase or luciferase activity is measured 48 hours after transfection using the Galactolight Plus detection kit (Tropix) according to the protocol recommended by the manufacturer. The cells are washed twice, in 1 ml of phosphate buffer solution (PBS) each time, then lysed with 200 μL of lysis buffer containing 1 mM of freshly prepared dithiotreiol. The extracts are harvested and centrifuged at 12,000 g for 5 min.
Un aliquot (20 μL) du surnageant est dilué dans 200 μL de réactif Galacton (à base d'AMPGD) et laissé à la température ambiante. Après 1 heure, l'accélérateur est ajouté et la chimioluminescence est immédiatement mesurée par un luminomètre BCLAn aliquot (20 μL) of the supernatant is diluted in 200 μL of Galacton reagent (based on AMPGD) and left at room temperature. After 1 hour, the accelerator is added and the chemiluminescence is immediately measured by a BCL luminometer
(Gouteyron, France) en mode d'intégration de 10 secondes. Les intensités sont exprimées en RLU (relative light unit).(Gouteyron, France) in 10-second integration mode. The intensities are expressed in RLU (relative light unit).
La concentration en protéine totale est mesurée en utilisant la trousse Bio-Rad à cet effet. Les résultats d'activité sont exprimés par des valeurs normalisées RLU/mg rapportées à 1 mg de protéine totale. f) Observation de l'internalisation des oligonucléotides : L'internalisation des oligonucléotides est observée en utilisant la microscopie optique. Pour cela, après les durées d'incubation de 24h. 48h ou 72h, les cellules transfectées dans des puits de la lame Labtek (Nunc), sont lavées 2 fois au PBS, fixées avec du paraformaldéhyde (4%) pendant 15 mn et montées avec du Mowiol (Calbiochem). g) Possibilité de renforcement de la transfection :The total protein concentration is measured using the Bio-Rad kit for this purpose. The results of activity are expressed as normalized values RLU / mg relative to 1 mg of total protein. f) Observation of internalization of oligonucleotides: Internalization of the oligonucleotides is observed using optical microscopy. For this, after the incubation times of 24 hours. 48h or 72h, the cells transfected into wells of the Labtek slide (Nunc), are washed twice with PBS, fixed with paraformaldehyde (4%) for 15 min and mounted with Mowiol (Calbiochem). g) Possibility of strengthening transfection:
Le taux de transfection peut être encore renforcé en utilisant un agent condensant le plasmide tel que la spermine. avant la complexation avec des liposomes TEAPC- Chol. D'autre part, dans la formulation des liposomes on peut ajouter un tensioactif tel que le simulsol 59, le simulsol 165 ou le simulsol 989 (SEPIC), ou un lipide conjugué avec un polyéthylèneglycol (PEG) ou avec un groupement tel qu'un fragment d'anticorps permettant d'orienter les liposomes vers des récepteurs spécifiques.The transfection rate can be further enhanced by using a plasmid condensing agent such as spermine. before complexing with TEAPC-Chol liposomes. On the other hand, in the formulation of liposomes it is possible to add a surfactant such as simulsol 59, simulsol 165 or simulsol 989 (SEPIC), or a lipid conjugated with a polyethylene glycol (PEG) or with a group such as antibody fragment which directs the liposomes to specific receptors.
Exemple 9 : RésultatsExample 9: Results
a) Rendement de complexation liposomes TEAPC-Chol/oligonucléotides.a) TEAPC-Chol liposome / oligonucleotide complexation yield.
Les aliquots de 8μg de l' oligonucléotide 28 mersThe 8 μg aliquots of the 28 seas oligonucleotide
G3AG2AG2AG2CG2AG2AG2A2GAG2A sont mélangés avec les liposomes 1 : 1, suivant des rapports de charge X variés. Les mélanges sont filtrés à travers des filtresG3AG2AG2AG2CG2AG2AG2A2GAG2A are mixed with liposomes 1: 1, according to various X charge ratios. The mixtures are filtered through filters
Millipore dont la masse limite est 30 kDa pour ne faire passer que des oligonucléotides libres, non liés aux liposomes. Les oligonucléotides sont dosés par spectroscopie UV et le pourcentage d'oligonucléotides non liés (rapporté à ceux non mélangés aux liposomes) est représenté en fonction de X (Figure 5). A partir de la valeur de X = 2, il n'y a pratiquement pas d'oligonucléotides non liés. Ceci permet de déterminer le rapport optimal de complexation pour lequel tous les oligonucléotides sont liés. b) Niveau de transfection de différentes lignées de cellules par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ.Millipore whose mass limit is 30 kDa to pass only free oligonucleotides, not linked to liposomes. The oligonucleotides are assayed by UV spectroscopy and the percentage of unbound oligonucleotides (relative to those not mixed with the liposomes) is represented as a function of X (Figure 5). From the value of X = 2, there are practically no unbound oligonucleotides. This makes it possible to determine the optimal complexation ratio for which all the oligonucleotides are linked. b) Level of transfection of different cell lines with TEAPC-Chol / pCMVβ complexes.
La Figure 6 représente les niveaux d'activité de β-galactosidase exprimés respectivement dans des cellules de MCF7, A549, 9L, U373MG et HUH7, transfectées à l'aide des liposomes TEAPC-Chol/DOPE. Les meilleurs résultats sont observés pour les cellules 9L. c) Comparaison du niveau de transfection des cellules MCF7 par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ, avec ceux obtenus à partir de la lipofectamine. du DMRIE, du transfectam et du TC-Chol.FIG. 6 represents the activity levels of β-galactosidase expressed respectively in cells of MCF7, A549, 9L, U373MG and HUH7, transfected using the TEAPC-Chol / DOPE liposomes. The best results are observed for 9L cells. c) Comparison of the level of transfection of MCF7 cells by TEAPC-Chol / pCMVβ complexes, with those obtained from lipofectamine. DMRIE, transfectam and TC-Chol.
Dans la Figure 7. les niveaux de transfection dans des cellules MCF-7 obtenus avec des liposomes TEAPC-Chol/DOPE sont comparés avec ceux des vecteurs connus.In Figure 7. the transfection levels in MCF-7 cells obtained with TEAPC-Chol / DOPE liposomes are compared with those of known vectors.
La figure 7 indique que les liposomes TEAPC-Chol/DOPE ont un niveau de transfection de 2 à 3 fois supérieur à celui de la lipofectamine. du DMRIE et du TC- Chol. d) Comparaison du niveau de transfection des cellules CEM par des complexes TAP-lithocholamide-Chol/pCMVβ avec ceux obtenus à partir de la lipofectine.FIG. 7 indicates that the TEAPC-Chol / DOPE liposomes have a level of transfection 2 to 3 times higher than that of lipofectamine. DMRIE and TC-Chol. d) Comparison of the level of transfection of CEM cells by TAP-lithocholamide-Chol / pCMVβ complexes with those obtained from lipofectin.
Dans la Figure 8. les niveaux de transfection dans des cellules CEM obtenus avec des liposomes TAP-lithocholamide sont comparés avec ceux de la lipofectine.In Figure 8. the transfection levels in CEM cells obtained with TAP-lithocholamide liposomes are compared with those of lipofectin.
On voit que les liposomes TAP-lithocholamide ont un pouvoir transfectant 30 fois supérieur à celui de la lipofectine. e) Effet du rapport DOPE/Lip+ sur le niveau de transfection des cellules tumoralesIt can be seen that the TAP-lithocholamide liposomes have a transfecting power 30 times greater than that of lipofectin. e) Effect of the DOPE / Lip + ratio on the level of transfection of tumor cells
MCF7 par des complexes TEAPC-Chol/pCMVβ.MCF7 by TEAPC-Chol / pCMVβ complexes.
La teneur du lipide neutre dioléolylphosphatidyléfhanolamine dans la formulation des liposomes TEAPC-Chol. représentée par le rapport r = DOPE/Lip+ affecte leur niveau de transfection cellulaire. Il semble que ceci dépende du type de cellules. Dans le cas des cellules B16 représentées dans la Figure 9. on observe le niveau le plus élevé pour le rapport r = 1. f) Comparaison de la cytotoxicité des liposomes TEAPC-Chol. BAEC-Chol et de celle du DC-Chol.The content of the neutral lipid dioleolylphosphatidylefhanolamine in the formulation of TEAPC-Chol liposomes. represented by the ratio r = DOPE / Lip + affects their level of cell transfection. This seems to depend on the type of cells. In the case of the B16 cells represented in FIG. 9., the highest level is observed for the ratio r = 1. f) Comparison of the cytotoxicity of the TEAPC-Chol liposomes. BAEC-Chol and that of DC-Chol.
La viabilité des cellules est détectée par le test MTT. Le test MTT consiste à détecter les cellules viables en utilisant le réactif MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-The viability of the cells is detected by the MTT test. The MTT test consists of detecting viable cells using the MTT reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -
2.5-diphényl tétrazolium bromide (Sigma). Pour les cellules vivantes, les déhydrogénases des mitochondries réagissent avec le MTT et le réduisent en formazan qui est un produit bleu dont la quantité peut être déterminée par des mesures d'absorption à 570 nm [16]. Les cellules MCF7 déposées la veille de la transfection dans les puits d'une plaque Falcon de 96 puits (5x104 cellules par puits) sont transfectées par les complexes formés en mélangeant 1 μg d'oligonucléotides et des quantités variables de liposomes TEAPC-Chol ou BAEC-Chol selon l'invention, suivant le protocole décrit plus haut. Apres 48 h d incubation à 37°C. les cellules sont lavées deux fois au PBS. ensuite 100 μL de réactif MTT (lmg/mL de milieu DMEM contenant du sérum) sont ajoutés puis les cellules sont à nouveau incubées. Après 3 h. le réactif est enlevé, remplacé par 100 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde) pendant 20 mn. Les cellules «viables» donnent une coloration bleue dont la densité optique à la longueur d'onde 570 nm varie proportionnellement au nombre de celles-ci.2.5-diphenyl tetrazolium bromide (Sigma). For living cells, dehydrogenases in the mitochondria react with MTT and reduce it to formazan which is a blue product, the quantity of which can be determined by absorption measurements at 570 nm [16]. MCF7 cells plated the day before transfection in the wells of a Falcon 96 well plate (5x10 4 cells per well) were transfected with the complexes formed by mixing 1 .mu.g of oligonucleotides and variable quantities of TEAPC-Chol liposomes or BAEC-Chol according to the invention, following the protocol described above. After 48 hours incubation at 37 ° C. the cells are washed twice with PBS. then 100 μL of MTT reagent (1 mg / ml of DMEM medium containing serum) are added and the cells are again incubated. After 3 h. the reagent is removed, replaced with 100 μL of DMSO (dimethyl sulfoxide) for 20 min. Cells "viable" give a blue color whose optical density at the wavelength of 570 nm varies proportionally to the number thereof.
La Figure 10 représente les variations du pourcentage de cellules MCF7 viables en fonction de la concentration (exprimée en μM) des liposomes cationiques utilisés, préparés à partir de TEAPC-Chol. de BAEC-Chol ou de DC-Chol. Le pourcentage est calculé par rapport à la densité optique obtenue à partir des cellules non transfectées.FIG. 10 represents the variations in the percentage of viable MCF7 cells as a function of the concentration (expressed in μM) of the cationic liposomes used, prepared from TEAPC-Chol. BAEC-Chol or DC-Chol. The percentage is calculated relative to the optical density obtained from the non-transfected cells.
Les courbes de cette figure montrent clairement que les liposomes cationiques TEAPC-Chol et BAEC-Chol sont nettement moins toxiques que le DC-Chol. lui même moins cytotoxique que la lipofectine [3]. g) Niveau de transfection des cellules tumorales MCF7 par des complexes BAEC- pCMVβ en présence du sérum.The curves in this figure clearly show that the cationic liposomes TEAPC-Chol and BAEC-Chol are clearly less toxic than DC-Chol. itself less cytotoxic than lipofectin [3]. g) Level of transfection of MCF7 tumor cells with BAEC-pCMVβ complexes in the presence of serum.
La Figure 11 représente les niveaux de transfection des cellules tumorales MCF7 par des complexes liposomes BAEC-Chol/pCMVβ en présence de sérum de veau fœtal. Les niveaux sont normalisés à celui obtenu avec le rapport molaire de charge (Lip(+)/nucléotide) X= 2 en absence de sérum. On observe une variation du niveau de transfection en fonction du rapport X. Ainsi, en l'absence de sérum, le maximum est observé pour X = 1 alors que pour 50% de sérum, le maximum est observé pour X = 4. En faisant varier le rapport X. on peut transfecter ces cellules en présence de teneurs variables en sérum. Figure 11 shows the transfection levels of MCF7 tumor cells with BAEC-Chol / pCMVβ liposome complexes in the presence of fetal calf serum. The levels are normalized to that obtained with the molar charge ratio (Lip (+) / nucleotide) X = 2 in the absence of serum. A variation in the level of transfection is observed as a function of the ratio X. Thus, in the absence of serum, the maximum is observed for X = 1 whereas for 50% of serum, the maximum is observed for X = 4. By doing vary the X ratio. these cells can be transfected in the presence of varying serum contents.
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[16] LAPPALAINEN K.. URTI A., JAASKELALNEN L. SYRJANEN K. et SYRJANEN S. (1994). Cationic liposomes mediated delivery of antisense oligonucléotides targeted to HPV 16E7 mRNA in CaSki cells. Antiviral Res., 23. 119-[16] LAPPALAINEN K .. URTI A., JAASKELALNEN L. SYRJANEN K. and SYRJANEN S. (1994). Cationic liposomes mediated delivery of antisense oligonucleotides targeted to HPV 16E7 mRNA in CaSki cells. Antiviral Res., 23. 119-
130.130.
[17] KEIL 0.. RESZKA R.. GROTH D. (1998), Novel cationic amphiphilic lipids for liposomal gène transfer, publication de demande internationale WO 98/05678. [17] KEIL 0 .. RESZKA R .. GROTH D. (1998), Novel cationic amphiphilic lipids for liposomal gene transfer, international application publication WO 98/05678.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un composé lipidique monocationique répondant à la formule générale I(A) :1. Use of a lipid monocationic compound of the general formula I (A):
R,O - CO - NH - ( CH,)Π - N" (C,H; , . Γ i(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. n représente un entier égal à 1 , 2 ou 3 et notamment le 3-β[N-(N' .N".N"-triéthylaminopropane iodure )-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol )R, O - CO - NH - (CH,) Π - N " (C, H ; ,. Γ i (A) in which R represents the cholesteryl radical. N represents an integer equal to 1, 2 or 3 and in particular 3-β [N- (N ' .N " .N " -triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol)
et/ou d'un compose lipidique monocationique de formule générale I(B) :and / or a monocationic lipid compound of general formula I (B):
R, - CO - NH - ( OU, - (R), . X • I (B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.R - CO - NH - (OR, - (R) X • I (B) wherein R 2 represents the radical of a derivative of cholanic acid in particular one chosen. Abietic acid radical d. '. from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanic. the 3α.l2α-dihydroxy-5β-cholanic acid. the 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents a methyl or ethyl radical, n represents an integer of 2 or 3. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH, - CH, - N' (R), . X "], II(A)and / or a lipid dicationic compound of general formula II (A) R, O - CO - N [CH, - CH, - N (R). X " ], II (A)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un radical ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,in which R represents the cholesteryl radical. R represents an ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(B)and / or a dicationic lipid compound of general formula II (B)
R, O - CO - CH, - CH, - CO - N[CH, - CH, - N* (R)3 , X "]2 II(B)R, O - CO - CH, - CH, - CO - N [CH, - CH, - N * (R) 3 , X " ] 2 II (B)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
et/ou d'un composé lipidique dicationique de formule générale II(C) R, - CO - N[CH, - CH, - N* (R), . X "]: II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α. l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,and / or a lipid dicationic compound of general formula II (C) R - CO - N [CH, - CH, - N * (R). X " ] : II (C) wherein R, represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of the cholanic acid. in particular that chosen from the group consisting of the radical of acid 3α, 7α. l2 -trihydroxy-5β-cholanic. the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
pour la transfection d'organismes vivants in vivo, d'organes in vivo, de tumeurs in vivo, ou de cellules in vitro ou ex vivo.for transfection of live organisms in vivo, in vivo organs, tumors in vivo, or to cells in vitro or ex vivo.
2. Les composés lipidiques monocationiques répondant à la formule générale I(A) :2. Monocidal lipid compounds corresponding to the general formula I (A):
R, O - CO - NH - (CH2)n - N* (C2H5)3 , L I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, n représente un entier égal à 1, 2 ou 3 et notamment le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol)R, O - CO - NH - (CH 2 ) n - N * (C 2 H 5 ) 3 , LI (A) in which R represents the cholesteryl radical, n represents an integer equal to 1, 2 or 3 and in particular 3-β [N- (N ', N', N'-triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol)
- le composé lipidique monocationique de formule générale I(B)- the monogenic lipid compound of general formula I (B)
R2 - CO - NH - (CH2)n - N+ (R)3 , X " I (B)R 2 - CO - NH - (CH 2 ) n - N + (R) 3 , X " I (B)
dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente un radical methyle ou ethyle, n représente un nombre entier égal à 2 ou 3, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.wherein R 2 represents the radical of the abietic acid, the radical of a derivative of cholanic acid, notably selected from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid , 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3.7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents a methyl or ethyl radical, n represents a number integer equal to 2 or 3, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
3. Composé lipidique monocatiomque selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :3. monocatiomic lipid compound according to claim 2, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
- le 3-β[N-(N',N',N'-triéthylaminopropane iodure)-carbamoyle] cholestérol (TEAPC-Chol) répondant à la formule I(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, - le composé N-(N\ N', N' -triméthylaminoéthane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.- 3-β [N- (N ', N', N'-triethylaminopropane iodide) -carbamoyl] cholesterol (TEAPC-Chol) corresponding to formula I (A) in which R represents the cholesteryl radical, - the compound N- (N \ N ', N' iodide -triméthylaminoéthane) abiétamide represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of abietic acid, R represents the methyl radical. n is 2 and X is iodine.
- le composé N-(N". N'. N' -triméthylaminopropane iodure) abiétamide représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.-. The compound N- (. '. N' N "N -triméthylaminopropane iodide) abiétamide represented by the general formula I (B) wherein R 2 represents the radical of abietic acid R represents the methyl radical, n is to 3 and X is iodine.
- le composé 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-[N-(N',N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminoéthane Cholamide (TAE- Cholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,- the compound 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β- [N- (N ', N'.N ' -trimethylaminoethane iodide)] cholanamide. called “Trimethylaminoethane Cholamide (TAE- Cholamide)”, represented by the general formula I (B) in which R represents the radical of 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine,
- le composé 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-[N-('N".N'.N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminopropane Cholamide (TAP- Cholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,7α,12 -trihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode,- the compound 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β- [N- ( ' N " .N ' .N ' -trimethylaminopropane iodide)] cholanamide, called" Trimethylaminopropane Cholamide (TAP- Cholamide) ", represented by the general formula I (B) wherein R 2 represents the radical of the acid 3α, 7α, 12 -trihydroxy-5β-cholanic acid, R is methyl, n is 3 and X is iodine,
- le composé 3α,12 -dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Déoxycholamide (TAE- Déoxycholamide) » représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle. n est égal à 2 et X représente l'iode.- the compound 3α, 12 -dihydroxy-5β- [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethane iodide)] cholanamide, called “Trimethylaminoethane Deoxycholamide (TAE- Deoxycholamide)” represented by the general formula I (B) in wherein R, represents the radical of the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical. n is 2 and X is iodine.
- le composé 3α,12α-dihydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déoxycholamide (TAP- Déoxycholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode, le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N'.N'.N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Lithocholamide (TAE-- the compound 3α, 12α-dihydroxy-5β- [N- (N ', N', N'-trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. referred to as "Triméthylaminopropane Déoxycholamide (TAP- Déoxycholamide)" represented by the general formula I (B) wherein R 2 represents the radical of the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine, the compound 3α-hydroxy-5β- [N- (N'.N'.N'-trimethylaminoethane iodide)] cholanamide, called “Trimethylaminoethane Lithocholamide ( Tae
Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode. - le composé 3α-hydroxy-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Lithocholamide (TAP- Lithocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.Lithocholamide) "represented by the general formula I (B) wherein R, represents the radical of the acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine. - the compound 3α-hydroxy-5β- [N- (N ', N', N ' -trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. called “Trimethylaminopropane Lithocholamide (TAP- Lithocholamide)”, represented by the general formula I (B) in which R 2 represents the radical of 3α-hydroxy-5β-cholanic acid. R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine.
- le composé 3, 7, 12-trioxo-5β-[N-(N',N',N'-triméthylaminoéthane iodure)] cholanamide, dénommé « Triméthylaminoéthane Déhydroxycholamide (TAE- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 2 et X représente l'iode,- the compound 3, 7, 12-trioxo-5β- [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethane iodide)] cholanamide, called “Trimethylaminoethane Dehydroxycholamide (TAE- Dehydrocholamide)”, represented by the general formula I ( B) in which R represents the radical of 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 2 and X represents iodine,
- le compose 3. 7. 12-trioxo-5β-[N-(N".N".N"-triméthylaminopropane iodure)] cholanamide. dénommé « Triméthylaminopropane Déhydroxycholamide (TAP- Déhydrocholamide) », représenté par la formule générale I(B) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle, n est égal à 3 et X représente l'iode.- Compound 3. 7. 12-trioxo-5β- [N- (N " .N " .N " -trimethylaminopropane iodide)] cholanamide. called" Trimethylaminopropane Dehydroxycholamide (TAP- Dehydrocholamide) ", represented by the general formula I ( B) in which R 2 represents the radical of 3,7,12-trioxo-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical, n is equal to 3 and X represents iodine.
4. Composé lipidique dicationique caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :4. Dicationic lipid compound characterized in that it is chosen from the group consisting of:
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(A) R, O - CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X "], II(A)- the dicationic lipid compound of general formula II (A) R, O - CO - N [CH, - CH 2 - N + (R) 3 , X " ], II (A)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(B)- the dicationic lipid compound of general formula II (B)
R, O - CO - CH2 - CH2 - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(B)R, O - CO - CH 2 - CH 2 - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 II (B)
dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode,in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine,
- le composé lipidique dicationique de formule générale II(C)- the dicationic lipid compound of general formula II (C)
R2 - CO - N[CH, - CH, - N+ (R)3 , X "]2 II(C) dans laquelle R, représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7 .l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.R 2 - CO - N [CH, - CH, - N + (R) 3 , X " ] 2 II (C) wherein R, represents the radical of abietic acid. the radical of a derivative of the cholanic acid. in particular one selected from the group consisting of the radical of the acid 3α.7 .l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid. the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
5. Composé lipidique dicationique selon la revendication 4. caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :5. Dicationic lipid compound according to claim 4. characterized in that it is chosen from the group consisting of:
- le 3-β[N-.N-(Bis(triéthylaminoéthane iodure))-carbamoyle] cholestérol (BTEC- Chol) représente par la formule générale II(A). dans laquelle R, représente le radical cholesteryle . R représente un radical ethyle et X un atome d'iode.- 3-β [N-.N- (Bis (triethylaminoethane iodide)) - carbamoyl] cholesterol (BTEC-Chol) represents by the general formula II (A). in which R represents the cholesteryl radical. R represents an ethyl radical and X an iodine atom.
- le 3-β[N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-succinamide cholestérol (BAES- Chol) représenté par la formule générale II(B), dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore,- 3-β [N.N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - succinamide cholesterol (BAES- Chol) represented by the general formula II (B), in which R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-abiétamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, obtenu via le dichlorhydrate de diéthylène triamine,- the compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - abietamide represented by the general formula II (C), in which R 2 represents the radical of abietic acid, R represents the methyl radical and X represents an atom of chlorine, obtained via diethylene triamine dihydrochloride,
- le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α,7α,12α-trihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique. R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore, - le composé N.N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))- 3α,12α-dihydroxy-5β- cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore,- the compound NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β- cholanamide represented by the general formula II (C), in which R, represents the radical of the acid 3α, 7α, 12α -trihydroxy-5β-cholanic. R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom, - the compound NN- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α, 12α-dihydroxy-5β- cholanamide represented by the general formula II (C), in which R represents the radical of 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom,
- le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3α-hydroxy-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R, représente le radical de l'acide- the compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3α-hydroxy-5β-cholanamide represented by the general formula II (C), in which R represents the radical of the acid
3α-hydroxy-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore. - le composé N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-3,7,12-trioxo-5β-cholanamide représenté par la formule générale II(C), dans laquelle R2 représente le radical de l'acide 3,7,12-trioxo-5β-cholanique, R représente le radical methyle et X représente un atome de chlore.3α-hydroxy-5β-cholanic, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom. - the compound N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - 3,7,12-trioxo-5β-cholanamide represented by the general formula II (C), in which R 2 represents the radical of the acid 3,7 , 12-trioxo-5β-cholanic, R represents the methyl radical and X represents a chlorine atom.
6. Procédé de préparation d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) :6. A method for preparing a dicationic lipid compound of general formula (II):
R'2- CO - N[CH, - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 (II) dans laquelle R', représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 5α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7,12-trioxo-5β-cholanique. ou le groupeR ' 2 - CO - N [CH, - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 (II) in which R' represents the radical of abietic acid, the radical of a derivative of l cholanic acid, in particular that chosen from the group consisting of the radical of 3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholanic acid, 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, 5α-hydroxy- acid 5β-cholanic or 3.7,12-trioxo-5β-cholanic acid. Or the group
R,0 ou R,-0-CO-(CH2)2 dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb) :R, 0 or R, -0-CO- (CH 2 ) 2 in which R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as chlorine or iodine, characterized in that a compound of general formula (Illb) is subjected:
R'2-CO-Z2 (Illb) dans laquelle R'2 a la signification mentionnée ci-dessus, Z2 représente un halogène tel que le chlore, à l'action d'un composé de formule générale (VII)R ' 2 -CO-Z 2 (Illb) in which R' 2 has the meaning mentioned above, Z 2 represents a halogen such as chlorine, to the action of a compound of general formula (VII)
HN[CH2 - CH2 - N (R) , X"]2 (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle, X représente un atome d'halogène tel que l'iode ou le chlore,HN [CH 2 - CH 2 - N (R), X " ] 2 (VII) in which R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical, X represents a halogen atom such as iodine or chlorine,
pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) tel que défini ci-dessus, et notamment les composés lipidiques dicationiques de formules générales II(A), II(B) et II(C) ci-après :to obtain the dicationic lipid compound of general formula (II) as defined above, and in particular the dicationic lipid compounds of general formulas II (A), II (B) and II (C) below:
R, O - CO - N[CH2 - CH2 - N+ (R)3 , X "]2 II(A) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle, R représente un radical ethyle, X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode, R, O - CO - CH, - CH, - CO - N[CH, - CH, - N^ (R)3 . X "], II(B) dans laquelle R, représente le radical cholesteryle. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.R, O - CO - N [CH 2 - CH 2 - N + (R) 3 , X " ] 2 II (A) in which R represents the cholesteryl radical, R represents an ethyl radical, X represents an atom of halogen such as chlorine or iodine, R, O - CO - CH, - CH, - CO - N [CH, - CH, - N ^ (R) 3 . X "], II (B) wherein R represents the cholesteryl radical. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
R, - CO - N[CH2 - CH, - N" (R)3 . X '], II(C) dans laquelle R2 représente le radical de l'acide abietique. le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique. R représente un atome d'hydrogène, un radical methyle ou ethyle. X représente un atome d'halogène tel que le chlore ou l'iode.R - CO - N [CH 2 - CH, - N "(R) 3 X '.] II (C) wherein R 2 represents the radical of abietic acid radical of a derivative of the. cholanic acid. especially one chosen from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic. the acid 3α, 12α-dihydroxy-5β-cholanic acid, the acid 3α-hydroxy-5β -cholanique or 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid. R represents a hydrogen atom, a methyl or ethyl radical. X represents a halogen atom such as chlorine or iodine.
7. Procédé de préparation selon la revendication 6 d'un composé lipidique dicationique de formule générale (II) dans laquelle R", représente le groupe R,-0 et R, représente le radical cholesteryle, R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore, à savoir le 3 β[N,N-(Bis(aminoéthane chlorhydrate))-carbamoyle] cholestérol (BAEC-Chol), caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale (Illb) : R",-CO-Z, (Illb) dans laquelle R', représente le groupe R,0 et R, représente le radical cholesteryle, Z, représente un atome de chlore. à l'action d'un composé de formule générale (VII) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène et X représente un atome de chlore, à savoir le dichlorhydrate de diéthylènetriamine :7. A process according to claim 6 for a dicationic lipid compound of general formula (II) in which R ″ represents the group R, -0 and R represents the cholesteryl radical, R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom, namely the 3 β [N, N- (Bis (aminoethane hydrochloride)) - carbamoyl] cholesterol (BAEC-Chol), characterized in that a compound of general formula is subjected (IIIb): R " , -CO-Z, (Illb) in which R 'represents the group R, 0 and R, represents the cholesteryl radical, Z, represents a chlorine atom. to the action of a compound of general formula (VII) wherein R represents a hydrogen atom and X represents a chlorine atom, namely the dihydrochloride of diethylenetriamine:
HN[CH, - CH, - NHf . CY]2 (VII)HN [CH, - CH, - NHf. CY] 2 (VII)
pour obtenir le composé lipidique dicationique de formule générale (II) : R'2 - CO - N[CH, - CH2 - NH3 +. Cl"]2 (II) dans laquelle R", représente le groupe R,-0 et R, représente le radical cholesteryle. to obtain the dicationic lipid compound of general formula (II): R ' 2 - CO - N [CH, - CH 2 - NH 3 + . Cl " ] 2 (II) in which R " represents the group R, -0 and R, represents the cholesteryl radical.
8. Composition caractérisée en ce qu'elle contient un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5.8. A composition characterized in that it contains a cationic lipid compound according to any one of claims 2 to 5.
9. Composition selon la revendication 8. caractérisée en ce qu'elle présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 dans lequel R, représente le radical d'un dérivé de l'acide cholanique. notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanique. l'acide 3α.l2 -dihydroxy-5β- cholanique. l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3.7.12-trioxo-5β-cholanique, et un solvant tel que l'éthanol.9. A composition according to claim 8. characterized in that it has the form of cationic lipid solution containing a cationic lipid compound according to any one of claims 2 to 5 wherein R represents the radical of a derivative of cholanic acid. in particular one selected from the group consisting of the radical of the acid 3α.7α.l2 -trihydroxy-5β-cholanic acid. acid 3α.l2 -dihydroxy-5β- cholanic. acid 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or acid 3.7.12-trioxo-5β-cholanic acid and a solvent such as ethanol.
10. Composition selon la revendication 8. caractérisée en ce qu'elle présente sous forme de solution de lipide cationique contenant un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 dans lequel R, représente le radical cholesteryle, R, représente le radical de l'acide abietique, le radical d'un dérivé de l'acide cholanique, notamment celui choisi dans le groupe constitué par le radical de l'acide 3α,7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3 ,12α-dihydroxy-5β-cholanique, l'acide 3α-hydroxy-5β-cholanique ou l'acide 3,7.12-trioxo-5β-cholanique. et un solvant tel que le chlorure de méthylène pour la préparation de liposomes.10. A composition according to claim 8. characterized in that it has the form of cationic lipid solution containing a cationic lipid compound according to any one of claims 2 to 5 wherein R represents the cholesteryl radical, R, represents abietic acid radical, the radical of a cholanic acid derivative, in particular that selected from the group consisting of the radical of 3α, 7α.l2α-trihydroxy-5β-cholanic acid, acid 3, 12α-dihydroxy-5β-cholanic, 3α-hydroxy-5β-cholanic acid or 3,7.12-trioxo-5β-cholanic acid. and a solvent such as methylene chloride for the preparation of liposomes.
1 1. Liposome caractérisé en ce qu'il contient une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, et un lipide (ou colipide) neutre, notamment la dioléoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE), et éventuellement un lipide conjugué (notamment à un polyéthylèneglycol, ou à un fragment d'anticorps), et/ou un tensioactif, notamment choisi dans le groupe constitué par le simulsol 59, le simulsol1 1. A liposome characterized in that it contains a composition according to any one of claims 8 to 10, and a lipid (or colipid) Neutral, including dioleoylphosphatidyl ethanolamine (DOPE), and optionally a conjugated lipid (including a polyethylene glycol, or to an antibody fragment), and / or a surfactant, in particular chosen from the group consisting of simulsol 59, simulsol
165 ou le simulsol 989.165 or simulsol 989.
12. Complexe caractérisé en ce qu'il comprend un composé lipidique cationique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique. gène, plasmide, ribozvme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.12. Complex characterized in that it comprises a cationic lipid compound according to any one of claims 2 to 5 or a composition according to any one of claims 8 to 10 and a negatively charged compound such as a nucleic acid ( deoxyribonucleic, ribonucleic acid, gene, plasmid, ribozm or oligonucleotide, which may or may not be covalently modified) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
13. Complexe caractérisé en ce qu'il comprend un liposome selon la revendication 11 , et un composé chargé négativement, notamment un acide nucléique (acide désoxyribonucléique. acide ribonucléique. gène, plasmide, ribozyme ou oligonucléotide. pouvant être modifiés de façon covalente ou non) ayant des effets thérapeutiques ou de vaccination, ou des applications en génétique ou en biotechnologie.13. Complex characterized in that it comprises a liposome as claimed in claim 11 and a negatively charged compound such as a nucleic acid (deoxyribonucleic acid. Ribonucleic acid. Gene, plasmid, or ribozyme oligonucleotide. May be modified covalently or non ) having therapeutic or vaccination effects, or applications in genetics or biotechnology.
14. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un complexe selon la revendication 12 ou la revendication 13. en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.14. Pharmaceutical composition characterized in that it comprises as active ingredient a complex according to claim 12 or claim 13 in association with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle convient pour un mode quelconque d'administration, notamment par voie parentérale. par voie topique ou par inhalation.15. Pharmaceutical composition according to claim 14, characterized in that it is suitable for any mode of administration, in particular parenterally. topically or by inhalation.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisée en ce que la quantité de complexe varie de 0,5 à 30 mg/kg de poids corporel pour une dose unitaire. 16. Pharmaceutical composition according to claim 14 or claim 15, characterized in that the amount of complex varies from 0.5 to 30 mg / kg of body weight for a unit dose.
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