CZ20011909A3 - Nová činidla pro přenos nukleových kyselin a farmaceutické prostředky, které je obsahují - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových transfekčních činidel, farmaceutických prostředků, které;je obsahují a jejich použití při in vivo, ex vivo a/nebo in vitro transfekci nukleových kyselin do buněk.

Dosavadní stav techniky *

S vývojem biotechnologie se účinná transfekce nukleových kyselin do buněk stává jednou ze základních technik mnoha biotechnologických aplikací. Může zahrnovat transfekci nukleových kyselin do buněk in vitro, například při přípravě rekombinantních proteinů nebo v laboratoři, při Studiu exprese genu, klonování genu nebo jakoukoli jinou manipulaci zahrnující DNA. Může také zahrnovat transfekci nukleových kyselin do buněk in vivo, například při výrobě vakcín, provádění studií se značkovanými molekulami nebo také provádění terapeutických přístupů. Může také zahrnovat: přenos genů do buněk získaných z organismů za účelem jejich následného zpětného podávání, například při vytváření transgenních živočichů.

V současné době je nej rozšířenějším způsobem přenosu genů do buněk použití virových vektorů. Protože však tento způsob není úplně bezpečný, bylo navrženo několik dalších způsobů založených na použití syntetických vektorů. Tyto syntetické vektory mají dvě hlavní funkce: komplexovat a spojit nukleovou kyselinu, která se má přenést, a vyvolat její pasážování přes plasmatřekou membránu a případně . přes dvě jaderné membrány.

·· · · · · · · · ···· ··· · · · • · ····· ··

Byly vyvinuty některé skupiny syntetických vektorů, jako jsou například polymery nebo biochemické vektory (obsahující kationtový protein asociovaný s buněčným receptorem), ale k významnému pokroku došlo zejména v nevirových transfekcích s vývojem lipofektantů a zejména kationtových lipidů. Tímto způsobem bylo dokázáno, že kationtové lipidy z důvodu svého celkového kladného náboje, interferují spontánně s DNA, která je celkově negativní, za vzniku nukleolipidových komplexů schopných fúzovat s membránami buněk a tak umožnit intracelulární uvolnění DNA.

Syntetizovány tedy byly různé typy kationtových lipidů: lipidy obsahující kvarterní amoniovou skupinu (například DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE, a tak dále), lipopolyaminy jako jsou například DOGS, DC-Chol nebo lipopolyaminy popsané v Mezinárodní patentové přihlášce WO 97/18185, lipidy, které obsahují jak kvarterní amoniovou skupinu, tak polyamin, jako je DOSPA, nebo lipidy obsahující různé jiné kationtové skupiny, zejména amidiniové skupiny (například ADPDE, ADODE nebo lipidy popsané v Mezinárodní patentové přihlášce WO 97/31935). Ve skutečnosti je strukturní rozmanitost kationtových lipidů odrazem pozorování souvislostí mezi strukturou a aktivitou.

Použití syntetických vektorů je však dosud v mnoha směrech problematické a jejich účinnosti je třeba zlepšit. Zejména by bylo z různých důvodů vhodné získat nekationtové nebo méně kationtové vektory:

- komplexy vznikající mezi nukleovou kyselinou a transfekčními činidly, protože jejich celkový kladný náboj vede k interakci s retikuloendoteliálním systémem, která vyvolá jejich eliminaci, ······· ···· • · · · · * · ·· · ··········· • · ···· ·· · ···· ··· ·<· ·· ·· ··· .

- protože celkový náboj vznikajících komplexů, plazmaproteinů, vede k adsorpci na jejich povrch a ztrátě transfekční síly, která z toho vyplývá,

- v souvislosti s lokální injekcí přítomnost značného celkového kladného náboje preventivně působí proti difúzi komplexů nukleové kyseliny z místa podávání, protože komplexy se adsorbují na extracelulární matrice. Komplexy již proto nemohou dosáhnout cílových buněk, což potom způsobí pokles účinnosti přenosu pokud jde o injektovane množství komplexů,

- a konečně, bylo zjištěno, že mnoho kationtových lipidů nebo polymerů účastnících se v doméně nevirové transfekce genů má zánětlivý účinek.

Dále, stabilní vznik syntetických vektorů s nízkými poměry nábojů, které byly dodnes vyvinuty, je obecně problematický nebo dokonce nemožný, a bylo zjištěno, že při nízkém poměru náboje je obvykle účinnost transferu nízká (Pitard a kol., PNAS USA, 94, str. 14412-14417, 1997). V dalším textu znamená termín „poměr náboje poměr kladných nábojů transfekčního činidla ku negativním nábojům DNA. Tento poměr se často vyjadřuje v nmol transfekčního činidla na gg DNA.

Toto jsou důvody, které vedou přihlašovatele k vývoji nových transfekčních činidel, která tvoří předmět předkládaného vynálezu. Přesněji, jejich konkrétní strukturní formy váží hydrofobní kotvu nejprve k polykationtu, což umožňuje vznik nukleových kyselina za druhé k nejméně jedné hydrofilní hlavě, což umožňuje snížit zdánlivou celkovou hustotu náboje těchto transfekčních činidel vzhledem ke kationtovým lipidům nebo polymerům, které se běžně používají při nevirové transfekci. Přítomnost nejméně jedné hydrofilní hlavy vytváří určitý druh „nábojové bariéry snížením žeta potenciálu komplexů vznikajících ·· · 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 s nukleovými kyselinami. Jmenované komplexy, jsou,tedy méně kationtové vzhledem k organismu, z čehož vyplývají výhodné vlastnosti. Kromě toho se ukázalo, že transfekční činidla podle předkládaného vynálezu jsou zvláště výhodná z fyzikálně chemického hlediska, protože jsou zvláště stabilní, když se uvedou do styku s nukleovými kyselinami při nízkých poměrech náboje.

Podstata vynálezu

První předmět podle předkládaného vynálezu se týká nových činidel pro transfekci nukleových kyselin, která obsahují hydrofobní můstek („spacer) chemicky vázaný za prvé k polykationtu a za druhé k nejméně jednomu hydrofilnímu substituentu.

Polykation umožňuje vznik komplexů s nukleovými kyselinami interakcí s aniontovými náboji nukleových kyselin. Hydrofobní můstek má dvojí funkci. Za prvé umožňuje průchod přes buněčnou membránu a za druhé umožňuje životaschopnost komplexů vznikajících s nukleovými kyselinami v biologickém médiu. Přesněji hydrofobní můstek vytváří fyzikální bariéru na komplexu, což umožňuje chránit nukleové kyseliny proti okolnímu médiu. Hydrofobičnost, nutnou pro životaschopnost komplexů, může snadno odborník v této oblasti určit za použití běžných výzkumných postupů nebo za použití způsobu pokusu a omylu, konečně, přítomnost hydrofilních substituentů umožňuje snížit zeta potenciál vznikajících komplexů, čímž dojde k tomu, že se tyto komplexy jeví méně kationtové vzhledem k venkovnímu médiu.

Pro účely předkládaného vynálezu je polykation lineární nebo rozvětvený, polykationtová molekula schopná asociace s nukleovými kyselinami. Pro účely podle vynálezu znamená termín „asociace s nukleovou kyselinou jakýkoli typ připojení, jako je například kovalentní vazba, elektrostatická nebo iontová interakce, vodíkový můstek a tak dále. S výhodou je polykation li• · · · neární nebo rozvětvený polyamin, kdy každá aminoskupina je oddělená jednou nebo více methylenovými skupinami. Popřípadě může být polyamin také substituovaný jinou kationtovou funkční skupinou, například amidiniovou skupinou nebo guanidiniovou skupinou, guanidiny a tak dále. Může to být zejména polykation definovaný v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/17823, WO 97/ 18185, WO 97/31935, WO 98/54130 nebo WO 99/51581 a obecněji v literatuře týkající se kationtových lipidových. struktur, která je odborníkům v této oblasti známá. Podle výhodného aspektu podle vynálezu je polykationtem polyamin obecného vzorce II:

(Π)

- R_1Z R₂ a R₃ jsou nezávisle na sobě atom vodíku a skupina (ΟΗ^^Ρ'Ε, kde q je celé číslo 1 až 6, je nezávislé pro různé skupiny R_lř R₂ a R₃, přičemž se rozumí, že nejméně jedna skupina R_lz R₂ a R₃ je jiný, než atom vodíku,

- R' a R jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina (0Η₂)ηΝΗ₂, kde q je definováno výše,

- m je celé číslo 1 až 6, a

-nap jsou nezávisle na sobě celá čísla 0 až 6, přičemž když n je větší nebo rovno 2, m může mít ve vzorci II různé hodnoty a R₃ různé významy a když n je rovno 0, nejméně jeden ze substituentů Rj a R₂ je jiný, než atom vodíku.

Polykation může být také vybrán ze skupiny, kterou tvoří spermin, spermidin, cadaverin, putrescin, hexamethylentetramin (he♦ · · · 9 9 9 · ·· • · · · · · · · · xamin), methakrylamidopropyltrimethylamoniumchlorid (AMBTAC), 3-akrylamido-3-methylbutyltrimethylamoniumchlorid (AMBTAC) , polyvinylaminy, polyethyleniminy, nebo ioňeny (odkazy: Bartoň a kol., Comprehensive Organic Chemistry, díl. 2, Vyd. Pergamon Press, str. 90; Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, druhé vydání, Vyd. Wiley Interscience, díl. 11, str. 489; Mahler a Cordes, Biological Chemistry, Harper International Edition, str. 124) .

Hydrofobní můstek může mít různé struktury, pokud poskytuje hydrofobičnost dostatečnou pro umožnění ochrany nukleových kyselin a průchod přes membrány.. Tuto dostatečnou hydrofobičnost může určit odborník pracující v této oblasti za použití obvyklých výzkumných postupů. Podle výhodného provedení podle předkládaného vynálezu obsahuje hydrofobní můstek dva nebo tři uhlovodíkové lineární mastně řetězce (tj. 10 až 20 atomů uhlíku na řetězec a s výhodou 12, 14, 15, 16, 17 nebo 18 atomů uhlíku na řetězec, kdy každý řetězec má popřípadě různou délku). Podle jiného provedení hydrofobní můstek obsahuje velmi dlouhý uhlovodíkový lineární mastný řetězec, tj. obsahuje 20 až 50 atomů uhlíku a s výhodou 40 až. 50 atomů uhlíku a ještě výhodněji 44 až 50 atomů uhlíku.

Hydrofilní substituenty, které jsou vhodné, jsou například vybrané z hydroxylových skupin nebo aminoskupin, polyolů, cukrů nebo hydrofilních peptidů. Termín „polyol znamená lineární, rozvětvený nebo cyklickou uhlovodíkovou molekulu obsahující nejméně dvě hydroxylove funkční Skupiny. Jako příklady je možné uvést glycerol, ethylenglykol, propylenglykol, tetritoly, pentitoly, cyklické pentitoly (nebo quercitoly), hexitoly, jako je mannitol, sorbitol, dulcitols, cyklické hexitoly nebo inositoly, a tak dále (Stanek a kol., The Monosaccharides Academie Press, str. 621-655 a s^r. 778-855) .

• · ·· ·· • · · · • · · · · ·

Podle výhodného provedení transf.ekční činidla podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jeden hydrofilní substituent, kterým je cukr. Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín „cukr jakoukoli molekulu obsahující jeden nebo více sacharidů. Jako příklady je možné uvést pyranózy a furanózy, například glukózu, mannózu, rhamnózu, galaktózu, fruktózu nebo maltózu, laktózu, sacharózu, fukózu, Cellobiózu, allózu, laminarabiózu, gentiobiózu, soforózu, melibiozu, a tak dále. S výhodou jsou cukry vybrány ze skupiny, kterou tvoří glukóza, mannóza, rhamnóza, galaktóza, fruktóza, laktóza, sacharóza a cellobióza. Kromě toho to mohou být také „komplexní cukry, tj . několik cukrů navzájem kovalentně vázaných, kdy každý cukr je s výhodou vybrán ze seznamu uvedeného výše. Mezi vhodné polysacharidy patří~například dextran,_; α-amylóza, amylopektin, fruktany, mannany, xylany a arabinany. Určité výhodné cukry mohou také interagovat s buněčnými receptory, jako jsou například určité typy lektinu.

Přesněji mají transferová činidla podle předkládaného vynálezu obecný vzorec I:

O

R (CZ,)_y—Y kde:

- R je polykation,

- Z je atom vodíku nebo atom fluoru, kdy různé skupiny Z jsou na sobě nezávislé a ·· · ·· ·· ·· · • · · · · · · · · ·« • · · · · · · · · · · ♦ ········· · • · · · · · ··· • · · · ··· · · · · ·· ···

- buď x a y jsou nezávisle na sobě celé číslo 10 až 22 včetně a X a Y jsou nezávisle na sobě atom vodíku, skupina -OAlk, 'kde Alk je přímá nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxylová skupina, aminoskupina, polyolová skupina, cukr, hydrofilní nebo nehydrofilní peptid nebo oligonukleotid, přičemž se rozumí, že nejméně jedna ze skupin X a Y je hydrofilní skupina vybraná z hydroxylové skupiny, aminoskupiny, polyolové skupiny, cukrů nebo hydrofilních peptidů,

- nebo x je rovno 0 nebo 1, y je celé číslo 20 a 50, X je buď atom vodíku nebo skupina -OAlk, kde Alk je přímá nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a Y je hydrofilní skupina vybraná z hydroxylové skupiny, aminoskupiny, polyolové skupiny, cukrů nebo hydrofilních peptidů.

Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín polykátion polyoly a cukry obecného vzorce I, který je definován výv se.

Termíny x a y jsou definovány pro obecný vzorec I tak, že aby měly jakoukoli hodnotu 10 až 22 včrtně nebo 20 až 50 včetně, v závislosti na okolnostech. S výhodou jsou y a y nezávisle na sobě 12 až 18 včrtně. Výhodněji‘ mají x a y nezávisle na sobě hodnotu 14, 15, 16, 17 nebo 18. Když x je rovno 0 nebo 1, potom y je s výhodou 3 0 až 50, nebo 4 0 až 50. Výhodněji je y 44 až 50.

Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín „oligonukleotid řetězec obsahující jeden nebo více nukleotidů, deoxynukleotidů, ribonukleotidů a/nebo deoxyribonukleotidů, které jsou monomerními jednotkami, které se navzájem liší přítomností bází, které mohou být vybrány z adeninu, guaninu, cytosinu, thymidinu nebo uracilu [viz. Lehninger Biochimie, Flammarion Medecine Sciences, druhé vydání, str. 305-329]. Protože mají • · · · ··· ···· ·········· • · ······· ···· ··· ·· φ· ·· ··· : .

oligonukleotidy schopnost tvořit pár báze, je velmi rozšířené jejich použití v molekulární biologii například jako můstků (připojení molekuly) nebo jako sond.

Dále se mohou oligonukleotidy použít ve formě konjugátů, tj . kondenzovaných do jedné nebo více jiných molekul, které mají různé vlastnosti. Jako příklad je možné uvést kondenzaci oligonukleotidu s reaktivní chemickou skupinou,,s fluorescenční nebo chemiluminiscenční skupinou nebo se skupinami schopnými zlepšit intermolekulární interakce, čímž se podpoří vstup do buněk. Tyto kojugáty, které jsou popsané v Bioconjugate Chemistry [John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: a Review of their Synthesis and properties, díl. 1, č. 3, 1990, str. 165-187]:, mají různá použití a výhody, jako je například schopnost zlepšit vstup komplexů do buněk, snížit stupeň degradace nukleázami, zvýšit stabilitu příslušného komplexu, sledovat osud oligonukleotidů v organismu, a tak dále. Když je (jsou) oligonukleotid(y) naroubován na transfekčním činidle podle předkládaného vynálezu, Umožňuje to získat jmenované transfekční činidlo s dalšími vlastnostmi (například nasměrování, značení a tak dále). .

Oligonukleotidy sé mohou získat pomocí běžných způsobů, které jsou odborníkům v této oblasti známé a je možné syntetizovat modifikované oligonukletidy podle způsobů popsaných v Bioconjugate Chemistry, John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: a Review of their Synthesis and properties, díl. 1, č. 3, 1990, str. 165-187 nebo v Tetrahedron, Beaucage a kol., The Synthesis of Modified Oligonucleotides by the Phosphoramiditeb Approach and Their Application, díl 49, č. 28, str. 6123-6194, 1993.

Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín „peptid řetězce obsahující jednu nebo více aminokyselin vázaných navzáχΜ-ί’ϋ·’⁵ ]»8F ''V V ' í 1<

• · • · 9	• • · •	9 9 9 9	9 9 9 9	9 9	9 9 9 9	• 9
9	9 9 9
•	•	9	•	9 9	•	9
• 9 9 ·	• · ·	9 9		99		9 ·	• 9

jem prostřednictvím vazeb peptiďové povahy [Lehninger Biochimie, Flammarion Medecine Sciencés, druhé vydání] . Může se jednat o 20 „běžných aminokyselin, tj . takových aminokyselin, které se obvykle vyskytují v proteinových prostředcích (alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tryptofan, methionin, aspartová kyselina, glutamin, lysin, arginin, histidin, glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamová kyselina) nebo se může jedna o _:„vzácné aminokyseliny, jako jsou například 4-hydroxyprolin, desmosin, 5-hydroxylysin, N-methyllysin, 3-methylhistidin, isodesmosin, a tak dále. Konečně to mohou být aminokyseliny, které se vyskytují v různých buňkách nebo různých tkáních ve volné nebo kombinované formě a které se odvozují obecně od α-aminokyselin (například β-alanin, γ-aminobutanová kyselina, homocystein, ornithin, canavaňin, djenkalová kyselina, β-kyanoalanin, a tak dále). 'Tyto peptidy mohou například umožňovat nasměrování na určitý typ buněk. V této souvislosti je možné uvést například RGD nebo NLS peptidy. Mohou to být také peptidové sekvence, které mají značkovací vlastnosti, tj . umožňují identifikaci například za použití analytických technik, jako je fluorescenční spektrometrie, infračervená spektrometrie, nukleární magnetická resonance (NMR) a tak dále. V tomto ohledu je možné uvést například lineární nebo cyklické, peptidové nebo pseudopeptidové sekvence obsahující Arg-Gly-Asp (Arginin-Glycin-Aspartovou kyselinu) rozlišovací epitop primárních a/nebo sekundárních receptorů adhezních proteinů integrinového typu.

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také substituovány, na jedné nebo více jejich funkčních.skupinách, například na a karboxylové skupině, na a aminové funkční skupině a/nebo na funkčních skupinách postranního řetězce každé aminokyseliny. Jako příklad je možné uvést substituci lineární, rozvětvenou nebo cyklickou, nasycenou nebo nenasycenou, alifatickou skupí-

li— ·*»=«:

« ’ « ”t nou obsahující 1 až 24 atomů uhlíku, jako je například cholesterylová skupina, arachidonylová skupina nebo retinoylová skupina, nebo mono- nebo polyaromatickými skupinami, jako je například substituovaná nebo substituovaná benzyloxykarbonylová skupina, benzylesterová skupina nebo rhodaminylové deriváty. Výhoda těchto substitucí spočívá v modifikaci chemických a popřípadě biologockých vlastností těchto peptidů, například za účelem jejich značení.

Když se uvedené peptidy použijí jako hydrofilní substituent, jsou vybrány z hydrofilních peptidů, tj . peptidů obsahujících pouze hydrofilní aminokyseliny nebo peptidů, které se částečně skládají z hydrofilních aminokyselin a jejich složení je činí celkově hydrofilními.

Podle výhodného provedení podle předkládaného vynálezu jsou všechny skupiny Z atom vodíku.

Podle zvláště výhodné aspektu podle předkládaného vynálezu mají transfekční činidla obecný vzorec III:

O

JI /(CH,)—^x

R. N ^X(CH,)— Y (III) kde:

- R je polykation, a

- bud' x a y jsou nezávisle na sobě celá čísla 10 až 22 včetně, a X a Y jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo cukr, přičemž se rozumí, že nejméně jeden ze substituentů X a Y je cukr, • · · • · ·· • · «« ·· ·· ♦ • · · · · · · • ···· · · · • ·· · · · · · • · ······ · ···· ··· ·· ·· ·· ···

- nebo χ je rovno 0 nebo 1, y je celé číslo 20 až 50, X je atom vodíku a Y je cukr.

Pro účely podle předkládaného vynálezu polykation, cykry a x a y v obecném vzorce III jsou stejné, jako bylo definováno výše pro obecný vzorec I.

Transfekční činidla, která jsou zvláště výhodná, mají obecný vzorec III a x a y jsou nezávisle na sobě celé číslo 10 až 22 včetně, a jedna ze skupin X a Y je atom vodíku a druhá je cukr. Podle další výhodné varianty má transfekční činidlo podle předkládaného vynálezu obecný vzorec III a x je rovno 0, y je celé číslo 40 až 50, X je atom vodíku a Y je cukr.

Rozumí se, že se předkládaný vynález také týká izomerů sloučenin obecného vzorce I, pokud existují, a také jejich směsí a jejich solí.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být zejména ve formě netoxických a farmaceuticky přijatelných solí. Tyto netoxické soli zahrnují soli s anorganickými kyselinami (například kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou a kyselinou dusičnou), s organickými kyselinami (kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou jantarovou, kyselinou maleinovou, kyselinou hydroxymaleinovou, kyselinou benzoovou, kyselinou fumarovou, kyselinou methansulfonovou nebo kyselinou šťavelovou) s anorganickými bázemi (hydroxidem sodným, hydroxidem draselným, hydroxidem lithným, hydroxidem vápenatým) nebo s organickými bázemi (terciárními aminy, jako je triethylamin, piperidin, benzylamin).

Podle předkládaného vynálezu se příprava sloučenin obecného vzorce I provádí za použití následujících kroků:

φφ φ φφ φφ φφ φ φφφφ φφφ φφφφ

Φ · Φ Φ ΦΦΦ · · Φ

Φ Φ ΦΦΦΦ··· •ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ φφ ΦΦΦ

1) Nejprve se připraví alkylový řetězec s x atomy uhlíku (x je defonováno výše), obsahující hydroxylovou funkční skupinu a esterovou funkční skupinu, pomocí otevření odpovídajícího laktonu. Reakce se obvykle provádí, v alkoholu, při bazickém pH, při teplotě mezi -10 °C až teplotou místnosti. Jako alkohol se může například použít methanol nebo ěthanol.

2) Potom se na difunkční alkylový řetězec získaný v předchozím kroku naváže skupina X. Pokud je X cukr, kondenzace se provádí v chlorovaném rozpouštědle, jako je například dichlormethan nebo chloroform a v přítomnostiLewisovy kyseliny, při teplotě -5 °C až 10 °C. Lewisovou kyselinou může být například chlorid cíničitý, chlorid železitý, p-toluensulfonová kyselina (tsOH), trimethylsillyltrifluormethansulfonová kyselina (TMStf), etherát fluoridu boritého, a tak dále [Kazunobu Toshima a kol., Recent Progress in O-glcosilation Methods and its Application to Natural Prodúcts Synthesis, Chem. Rev. 1993, díl 93, str. 1503-1531].

Když X je hydrófilní nebo nehydrofilní peptidová skupina, peptidová kondenzace se provádí podle obvyklých postupů (Bodánski M. , Principles and Practicěs of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) nebo za použití:podobných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé. Reakce se zejména obvykle provádí v přítomnosti nenukleofilní báze ve vhodných aprotických rozpouštědlech, při teplotě 0 až 100 °C, při pH upraveném na hodnotu 9 až 11. Jako rozpouštědlo se může použít například chloroform, dimethylformamid, methylpyrrolidon, acetonitril, dichloromethan, toluen nebo benzen. Jako nenukleofilní báze se mohou použít terciární aminy, uhličitan vápenatý nebo hydrogěnuhličitan sodný. Ještě výhodněji jsou použitými bázemi terciární aminy, jako je například triethylamin (TEA) nebo N-ethyl14 diisopropylamin. S výhodou se peptidová kondenzace provádí při teplotě 0 až 50 °C a výhodněji 1Ó až 30 °C.

Když je vhodné, aby X byla hydroxylová skupina, tento krok se neprovádí.

Když je X aminoskupina, reakce se provádí pomocí nukleofilní substituce podle běžných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé, které umožňují, aby se amin získal z alkoholu.

Když je X skupina -OAlk, alkylace alkoholové funkční skupiny se ¹ provádí podle běžných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé nebo podle podobných postupů. Například diazosloučenina obecného vzorce Alk-N₂ se může reagovat popřípadě v přítomnosti katalyzátoru, jako je HBF₄ nebo silikagel. Je možné pracovat za podmínek Williamsonovy reakce, která spočívá v reakci sloučeniny vzorce Alk-Hal, kde Hal je atom halogenu, jako je atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, v bazickém médiu, na řetězci nesoucím alkoholovou funkční skupinu.

Stejná reakce Williamsónova typu se může také použít, když je potřeba, aby X byla polyolová skupina.

Konečně, když X je oligonukleotid výše uvedená sloučenina se kondenzuje k difunkčnímu řetězci pomocí běžných postupů pro kovalentní roubování oligonukleotidu. Například se může jmenovaný oligonukleotid roubovat prostřednictvím vhodného můstku (připojovací molekuly).

3) Za třetí se esterová funkční skupina přítomná na difunkčním řetězci hydrolyzuje pomocí známých postupů na kyselinovou skupinu. Způsob se může například provádět v bazickém médiu v alkoholu o vysoké teplotě varu, při teplotě 50 °C až teplotě varu reakční směsi.

' Λ»_.

• · .·♦ · · ·· · · · • · · * ··· ···· • · · · · · · · · · • ·······« ···· ··· ·· ·· ·· «··

4) Potom se substituovaný nebo nesubstituovaný alkylaminový řetězec obecného vzorce IV:

’ H₂N- (CH₂)_y-Y (IV) kde y a Y jsou definovány výše, kondenzuje ke sloučenině získané v předcházejícím kroku podle běžného postupu pro kondenzaci peptidů (Bodanski Μ., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) nebo za použití jakéhokoli jiného postupu, který je odborníkům v této oblasti známý.

Reakce se zejména provádí v přítomnosti nenukleofilní báze ve vhodném aprotickém rozpouštědle, při teplotě 0 až 100 °C, pH se upraví na 9 až 11. Jako rozpouštědlo se může například použít chloroform, dimethylformamid, methylpyrrolidon, acetonitril, dichloromethan, toluen nebo benzen. Použitou nenukleofilní bází je s výhodou terciární amin, uhličitan vápenatý -nebo hydrogenuhličitan sodný. Ještě výhodněji jsou použitými bázemi terciární aminy, jako je například tríethylamine (TEA) nebo N-ethyldiisopropylamin· Peptidová kondenzace še s výhodou provádí při teplotě 0 až 50 °C, s výhodou 10 až 30 °C.

Skupina obecného vzorce IV je buď komerčně dostupná nebo se může získat kondenzací Y na odpovídající nesubstituovaný alkylamin podle postupu, který je podobný postupu popsanému výše v kroku 2) .

5) Amid získaný v předchozím kroku se potom redukuje na amin. Tento postup se provádí podle způsobů, které jsou odborníkům v této oblasti známé. Například se postup provádí v bezvodém organickém rozpouštědle, jako je nezvodá tetrahydrofuran, reakcí s lithiumaluminumhydridem LiAlH₄. Jinými redukčními činidly, která se mohou použít, jsou například boran, boran v dimethylsulfidu (BH₃SMe₂) , borohydrid sodný/chlorid titaničitý (NaBH₄,

TiCIJ , oxychlorid fosforečný na zinku (POCl₃/Zn) , pentasulfid fosforečný (P4S10) na Raneyově nikelu, a tak dále [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers lne., 1989]. Postup se může také provádět pomocí katalytické hydrogenace. S výhodou se redukce provádí reakcí lithiumaluminumhydridu . LiAlH₄, v bezvodém tetrahydrofuranu, při teplotě varu reakční směsi.

Získají se tak sloučeniny obecného vzorce V:

_z(CH₂)— x HN (V) ^X(CH,)— Y . y kde X, Y, x a y jsou definovány výše.

6) Nakonec se v posledním kroku se derivát kyseliny odpovídající polykationtu R, který je definovaný výše, kondenzuje ke sloučenině vzorce IV získané v předchozím kroku podle postupu, který je běžný při syntéze peptidů (Bodanski Μ. , Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) nebo za použití podobných způsobů, které jsou odborníkům v této oblasti známé.

Reakce se obvykle provádí v přítomnosti nenukleofilní báze, ve vhodném aprotickém rozpouštědle, při teplotě 0 až 100 °C, při pH 9 až 11. Mezi příklady rozpouštědel, která se mohou použít, patří chloroform, dimethylformamid, methylpyrrolidon, acetonitril, dichloromethan, toluen nebo benzen. Jako nenukleofilní báze se s výhodou použijí terciární aminy, uhličitan vápenatý nebo hydrogenuhličitan sodný. Ještě výhodněji se jako báze mohou použít terciární aminy, jako jsou například triethylamin (TEA) nebo N-ethyldiisopropylamin. S výhodou se kondenzace peptidu provádí při teplotě 0 až 50 °C, s výhodou 10 až 30 °C.

• 4 · · · · • · · 4 · · • · · · · · · • · · · · ·

Deriváty kyselin odpovídající polykationtu tupné.

Podle jiné varianty se trnasfekční činidla jsou komerčně dospodle předkládaného vynálezu mohou připravit podle následujícího postupu:

1) Za prvé se připraví alkylovy řetězec s x atomy uhlíku (x je definovaná výše)., obsahující hydroxylovou funkční skupinu a esterovou funkční skupinu, otevřením odpovídajícího laktonu. Reakce se obvykle provádí v alkoholu, při bazickém pH a při teplotě -10 °C až teplotě místnosti. Jako alkohol se může použít například methanol nebo ethanol.

2) Potom se substituovaný nebo nesubstituovaný alkylaminový řetězec obecného vzorce IV:

H₂N- (CH₂)_y-Y 5 (IV) kde y a Y jsou definovány výše pro obecný vzorce I, kondenzuje k tomuto difunkčnímu alkylovému řetězci. Reakce se provádí při teplotě vyšší, než jé je teplota tání každého produktu, popřípadě ve vakuu. Reakce se může také provádět při teplotě varu, v přítomnosti alkoholového rozpouštědla. Jako rozpouštědlo se ¹ může použít například methanol nebo ethanol. Způsob se provádí při teplotě 45 až 60 °C.

Reakce se může také provádět při teplotě varu reakční směsi, v přítomnosti alkoholu, jako je ‘methanol, jako rozpouštědla. Jiný alternativní postup zahrnuje kondenzaci sloučeniny obecného vzorce IV přímo s laktonem (v tomto případě se první krok otevření laktonu neprovádí).

Skupina obecného vzorce IV je buď _;komerčně dostupná nebo se může získat kondenzací Y na odpovídající nesubstituovaný alkylamin podle podobného postupu, jako je popsáno výše.

3) Difunkční dvouřetězcový amid získaný v předchozím kroku se potom redukuje na amin. Postup této reakce se provádí podle běžných způsobů. Způsob se například provádí v bezvodém organickém rozpouštědle, jako je bézvodý tetrahydrofuran, reakcí s lithiumaluminumhydridem (LiAlHj . Mohou se také použít jiná redukční činidla, mezi která patří například boran, hydrid boru dimethylsulfid (BH₃-SMe₂) , borohydrid sodný/chlorid titaničitý (NaBH₄, TiCl₄) , oxychloridfosforečný na zinku (POC1₃/ Zn) , pentasulfid fosforečný (P₄S₁₀) na Raneyóvě niklu, a tak dále. [Ri- 't chard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers lne., 1989]. Způsob se může také provádět pomocí katalytické hydrogenace.

S výhodou se redukce provádí ‘reakcí lithiumaluminumhydridu LíA1H₄, v bezvodém tetrahydrofuranu, za varu reakční směsi.

Takto se získá sloučenina obecného vzorce VI:

/(CH,)— OH

HN (VI) \CH,) — Y kde Y, x a y jsou definovány výše.

4) Potom se skupina X kondenzuje na amin obecného vzorce VI získaný v předchozím kroku. Kondenzace se provádí podle způsobů, které jsou podobné postupům popsaným výše v prvním syntetickém přístupu.

5) Nakonec, v posledním kroku se derivát kyseliny odpovídající polykationtu R, který je definovaný výše, kondenzuje ke sloučenině obecného vzorce VI získané v předchozím kroku pomocí běžných postupů používaných při syntéze peptidů (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe- '*'.·· ♦ · · · · · · · • · ·· · · · · · «· ·········· ♦·········· • · ······· ······· ··«· ·· ··· 19

Verlag) nebo za použití jakéhokoli jiného podobného způsobu, který je odborníkům v této oblasti známý.

Reakce se zejména obecně provádí v přítomnosti nenukleofilní báze ve vhodném aprotickém rozpouštědle, při teplotě 0 až 100 °C, při pH 7 až 117 Jako rozpouštědlo se může použít například chloroform, dimethylformamid, methylpyrrolidon, acetonitril, dichloromethan, toluen nebo benzen, jako nenukleofilní báze se s výhodou používají terciární aminy, uhličitan vápenatý nebo hydrogenuhličitan sodný. Ještě výhodněji se jako báze použijí terciární aminy, jako je například triethylamin (TEA) nebo N-ethyldiisopropylamin. Peptidová kondenzace se s výhodou provádí při teplotě 0 až .50 °C, výhodněji 10 až 30 °C.

Deriváty kyselin odpovídající polykationtu jsou komerčně dostupné . í

Samozřejmě, pokud substituenty X, Y a/nebo polykationt mohou zasahovat do reakce, je výhodné je předem chránit vhodnými skupinami, které se mohou zavést a odstranit, aniž by došlo k ovlivnění zbytku molekuly. Tyto reakce se provádí pomocí běžných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé a zejména pomocí postupů popsaných v T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, druhé vydání, Wiley-Interscience, in McOMIE, Protective Groups in Órganic Chemistry, Plenům Press (1973), nebo v Philip J. Kocienski, Protecting Groups, Thieme.

Dále může po každém kroku přípravy, pokud je to vhodné, následovat izolace a čištění získaných sloučenin pomocí postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé.

Jako ilustrativní příklady výhodných činidel pro transfekci nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu je možné uvést následující sloučeniny:

• ·

ΝΉ,

OH (C₁₅h₃₀k

Sloučenina 2

Sloučenina

Další předmět podle předkládaného vynálezu se týká prostředků obsahujících činidlo pro přenos nukleových kyselin, definovaných výše a nukleové kyseliny. Příslušná množství každé složky mohou být snadno určena odborníkem pracujícím v této oblasti jako funkce použitého transfekčního činidla, nukleové kyseliny a požadované aplikace (zejména typu buněk, které se mají transfekovat).

Pro účely podle předkládaného vynálezu znamená termín „nukleová kyselina jak deoxyribonukleovou kyselinu, tak ribonukleovou kyselinu. Mohou to být přírodní nebo syntetické sekvence a zejména genomická DNA (gDNA), komplementární DNA (cDNA), mediátorová RNA (mRNA), transferová RNA (tRNA), ribosomální RNA (rRNA), hybridní sekvence nebo; polosyntetické sekvence nebo oligonukleotidy, které jsou modifikované nebo podobně. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, živočišného, rostlinného, bakteriálního nebo virového původu a podobně. Mohou se získat pomocí postupů, které jsou- odborníkům v této oblasti známé a zejména pomocí screeningu knihoven, modifikací chemickou syntézou nebo smíšenými postupy,, včetně chemických a enzymatických sekvencí získaných pomocí screeningu knihoven. Mohou se chemicky modifikovat.

Pokud jde o deoxyribonukleové kyseliny, mohou být jedno nebo dvoupramenné, a také to mohou být krátké oligonukleotidy nebo delší sekvence. Nukleové kyseliny mohou zahrnovat plasmidy, vektory, episomy, expresní kazety a podobně. Tyto deoxyribonukleové kyseliny mohou nést replikační počátek, který je funkční nebo jiný v cílové buňce, jeden nebo více markerových genů, sekvence pro regulaci transkripce nebo replikace, geny terapeutického významu, „antisense sekvence (sekvence s opačnou orientací), které jsou modifikované, regiony pro vazbu k jiným buněčný složkám, a tak dále.

Nukleové kyseliny s výhodou zahrnují jeden nebo více genů terapeutického významu pod kontrolou regulačních sekvencí, například jednoho nebo více promotérů a terminátorů transkripce, které jsou aktivní na cílových buňkách.

Pro účely podle předkládaného vynálezu se „genem terapeutického významu rozumí zejména gen kódující proteinový produkt, který má terapeutický účinek. Takto kódovaný proteinový produkt může být zejména protein nebo peptid. Tento proteinový produkt může být exogenní, homologní nebo endogenní vzhledem k cílové buňce, to znamená produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, pokud tato buňka nevykazuje onemocnění. V tomto případě umožňuje exprimace proteinu například překonat nedostatečnou exprimaci v buňce nebo exprimaci proteinu, který je neaktivní nebo slabě aktivní, protože je modifikovaný, nebo překonat nadbytečnou exprimaci tohoto proteinu. Gen terapeutického významu může také kódovat mutant buněčného proteinu, který má zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu a podobně. Proteinový produkt ·· · ·· ·· φφ φ

Φ · . Φ Φ · · · · φ ···

Φ Φ Φ Φ φ Φ Φ Φ φ ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ φ· φ· ΦΦ» může být také heterologní vzhledem k cílové buňce. V tomto případě může exprimovaný protein například doplňovat nebo poskytovat aktivitu, která je v buňce nedostatečná, čímž se umožní boj s onemocněním nebo se stimuluje imunitní odpověď.

Mezi terapeutickými produkty podle předkládaného vynálezu je možné uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, interleukiny, interferony, TNF a podobně (FR 92/03120), růstové faktory, neurotransmitéry nebo jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofní faktory (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 , NT5, HARP/pleiotrofin a podobně), apolipoproteiny (ApoAI, ApoAIV, ApoE a podobně, FR 93/05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 91/11947), CFTR protein spojený s cystickou fibrózou, nádorové expresní geny (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, a podobné, FR 93/Ó4745), geny kódující faktory zahrnuté při koagulaci (faktory VII, VIII, IX), geny zahrnuté při reparaci DNA, „sebevražedné'geny (thymidinkináza, cytosindeamináza), geny pro hemoglobin nebo jiné proteinové transportéry, metabolické enzymy, katabolické enzymy a podobně.

Nukleová kyselina terapeutického významu může být také „antisense gen nebo sekvence, jejichž exprimace v cílové buňce umožňuje kontrolu exprimace genů nebo transkripce buněčné mRNA. Tyto sekvence se mohou například přepisovat v cílové buňce na RNA komplementární s buněčnou mRNA a tak blokovat její translaci do proteinu, podle techniky popsané v patentu EP 140,308. Terapeutivké geny také zahrnují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně zničit cílové RNA (EP 321,201).

Jak je uvedeno výše, nukleová kyselina může také obsahovat jeden nebo více genů kódujících aňtigenní peptidy, schopné generovat imunitní odezvu u člověka nebo živočichů. V tomto konkrétním provedení předkládaný vynález umožňuje výrobu buď vakcín nebo imunoterapeutických léčiv podávaných člověku nebo ži• · · · ··· · · · · ·· ········ • ····· ··· ···· ··· ·* ·· ’* **· vočichům, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Může také zahrnovat zejména antigenní peptidy specifické pro Epstein Barrův virus, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185,573), pseudovzteklinové viry, „viry tvořící syncitie, jiné viry nebo antigenní peptidy specifické pro nádory (EP 259,212).

Nukleové kyseliny také s výhodou zahrnují sekvence umožňující exprimaci genu terapeutického významu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v požadované buňce nebo orgánu. Mohou to být sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za exprimaci uvažovaného genu, pokud jsou tyto sekvence, schopné fungovat v nakažené buňce. Mohou to být také sekvence jiného původu (zodpovědné za exprimaci jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Zejména to mohou být promotorové· sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence odvozené od genomu buňky, který se má infikovat. Podobně to mohou být promotorové sekvence odvozené od genomu viru. V této souvislosti je možné uvést například promotory E1A, MLP, CMV a RSV genů a podobně. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním aktivujících a regulačních sekvencí a podobně. Mohou; také obsahovat indukovatelné nebo potlačitelné promotory.

Dále může nukleová kyselina také obsahovat zejména „upstream genu terapeutického významu, signální sekvenci řídící terapeutický produkt syntetizovaný ve vyměšovacích drahách cílové buňky. Touto signální sekvencí může být přirozená signální sekvence terapeutického produktu, ale může to být také jakákoli jiná funkční signální sekvence nebo umělá signální sekvence. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt směrem k příslušné části buňky.

• · 9. · < · · · · · • · · · · · « · · * · ·······«·* · · ··· ···· *·······*·· ·· · ·· . . 24.

Prostředky mohou dále obsahovat jednu nebo více přísad, které se mohou kombinovat s komplexy přenosové činidlo/nukleová kyselina, a které zlepšují jeho transfekční účinnost. V jiném provedení se předkládaný vynález proto týká prostředků obsahujících nukleovou kyselinu, činidlo pro transfekci nukleových kyselin, jak bylo definováno výše, a jednu nebo více přísad schopných kombinace s komplexy transfekční činidlo/nukleová kyselina a zvyšujících jeho transfekční sílu. Přítomnost tohoto typu přísady (například lipidy, peptidy nebo proteiny) může výhodně umožňovat zlepšení transfekční síly sloučenin. V tomto ohledu mohou prostředky podle předkládaného vynálezu jako přísadu obsahovat jeden nebo více neutrálních lipidů.

Výhodněji jsou neutrálními lipidy používanými podle předkládaného vynálezu, lipidy obsahující dva mastné řetězce. Zvláště výhodně se použijí přírodní nebo syntetické lipidy, které jsou za fyziologických podmínek obojetnými ionty nebo nemají iontový náboj. Mohou se zejména vybrat ze skupiny, kterou tvoří dioleylfosfatidylethanolamin (DOPÉ), oleoylpalmitoylfosfatidyleťhanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl a -myristoylfosfatidylethanolaminy a také jejich deriváty, které jsou jednou až třikrát N-methylováné; fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (jako jsou zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (jako jsou například sfingomyeliny) nebo asialogangliosidy (jako jsou zejména asialoGMl a GM2).

Tyto různé lipidy se mohou připravit buď synteticky nebo pomocí extrakce z orgánů (například z mozku) nebo z vajec, pomocí běžných postupů, které jsou odborníkům v této oblasti známé. Zejména extrakce přírodních lipidů se může provádět pomocí organických rozpouštědel (viz. Lehninger, Biochemistry).

Nedávno přihlašovatelé demonstrovali, že je také zvláště výhodné použít jako přísadu sloučeniny přímo nebo jinak zahrnuté ·♦♦ ·· ·· · ? · o · · ♦ · ··· • · · · ··· · ·· • · ···· ··· ···· ··· ·· ·· ·· ··· při kondenzaci jmenované nukleové kyseliny, jako jsou ty, popsané v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/25508. Přítomnost těchto sloučenin v prostředku podle předkládaného vynálezu umožňuje snížit množství transfekční sloučeniny, což je zejména výhodné z toxikologičkého hlediska, bez jakéhokoli poškození vlivu na transfekční aktivitu. Výraz „sloučenina, která je zahrnutá při kondenzaci nukleové kyseliny znamená sloučeninu, která přímo nebo nepřímo tvoří nukleovou kyselinu. Přesněji může tato sloučenina buď působit přímo na úrovni nukleové kyseliny, která se má transfekovat, nebo může být zahrnuta na úrovni další sloučeniny, která je přímo zahrnuta při kondenzaci této nukleové kyseliny. S výhodou působí přímo na úrovni nukleové kyseliny. Tímto činidlem může být jakýkoli polykation, například polylysin. Podle výhodného provedení toto činidlo, které je zahrnuto při kondenzaci nukleové kyseliny, je odvozeno, úplně nebo částečně, od protaminu, od histonu nebo od nukleolinu a/nebo od jednoho z jejich derivátů. Toto činidlo se může také skládat, úplně nebo částečně, z peptidových jednotek (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA). Počet jednotek se může měnit od 2 do 10. Ve struktuře sloučeniny podle předkládaného vynálezu se tyto jednotky mohou opakovat nepřetržitě nebo přetržitě. Mohou být tedy odděleny pomocí můstků biochemické povahy, například jednou nebo více aminokyselinami, nebo chemické povahy.

S výhodou mohou kompozice podle předkládaného vynálezu obsahovat 0,01 až 20 ekvivalentů přísady na ekvivalent nukleové kyseliny v mol/mol a výhodněji 0,5 až 5.

Ve zvláště výhodném provedení prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují dále směrující’ složky, které umožňují orientovat přenos nukleové kyseliny. Tato směrující složka může být složkou pro extracelulární směrování, která umožňuje orientovat přenos DNA k určitým typům buněk nebo určitým požadovaným ¹

4	•	♦	··		• •4	• ·
4	•	ě ·	•	•	4	• ·	4 ·
	•	•	•	•	4 4 4	• ·
•		•	4	•	• 4	4 ·
• 4	4 4	4 4 4	4·		4 ·	• ·	• 4

tkáním (nádorové buňky, hepatitické buňky, hematopoietické buňky a podobně). Může to být také intracelulární směrující složka, která umožňuje orientovat přenos nukleové kyseliny směrem k výhodným částem buněk (mitochondriím, jádru a podobně). Směrující složka může být připojena k přenosovému činidlu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nebo také k nukleové kyselině, která je definovaná výše. Když je směrující složka vázána k činidlu pro transfekci nukleových kyselin, obecného vzorce I, tato složka s výhodou tvoří jeden ze substituentů X nebo Y.

Mezi směrující složky, které sé mohou použít podle předkládaného vynálezu, patří například^:cukry, peptidy, proteiny, oligonukleotidy, lipidy, neuromediátory, hormony, vitaminy nebo jejich deriváty. S výhodou jsou to cukry, peptidy nebo proteiny, jako jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, ligandy buněčných receptorů - nebo jejich fragmenty, receptory nebo fragmenty receptorů a podobně. Zejména to mohou být ligandy pro receptory růstových faktorů, receptory cytokinu, receptory buněčného lektinového typu nebo ligandy obsahující RGD sekvenci s afinitou k receptorům adhezních proteinů, jako jsou integriny. Mohou to být také receptory transferinu, HDL a LDL nebo přenašeč folátu. Směrující složkou může být také cukr, který umožňuje zasáhnout lectiny, jako·jsou receptory asialoglykoproteinů nebo sialydů, jako je sialyd Lewis X nebo fragment Fab protilátky nebo jednořetězcová protilátka (ScFv).

Kombinace směrujících složek s nukleolipidovými komplexy se může provést pomocí technik, které jsou odborníkům v této oblasti známé, například pomocí kondenzace k hydrofobní části nebo k části, která interaguje s nukleovou kyselinou přenosového činidla podle předkládaného vynálezu nebo ke skupině, která interaguje s přenosovým činidlem podle předkládaného vynále.»,,·♦ 9, 9 9 9 9 · · . 9

-· · 9 9 9'9 9 9 9 · · ·········· ··*······ ···· 999 99 99 99 999 ' 2 7 zu nebo s nukleovou kyselinou. Požadovaná interakce může mít s výhodou iontovou nebo kovalentní povahu.

Předmětem podle, předkládaného vynálezu je také použití sloučenin definovaných výše pro přenos polynukleotidů (a obecně polyaniontů) do buněk in vitro, in vivo nebo ex vivo. Přesněji je předmětem podle, předkládaného vynálezu použití sloučenin definovaných výše, pro přípravu léčiva určeného pro léčbu onemocnění, zejména onemocnění, která jsou následkem nedostatku proteinového produktu nebo produktu nukleové kyseliny. Polynukleotid obsažený ve jmenovaném léčivu kóduje jmenovaný proteinový produkt nebo produkt nukleové kyseliny, nebo tvoří jmenovaný produkt nukleové kyseliny, který je schpný léčit jmenované onemocnění in vivo nebo ex vivo.

Pro použití in vivo, například pro léčbu nebo studium regulace genů nebo pro přípravu zvířecích modelů patologických stavů, se mohou prostředky .podle předkládaného vynálezu upravit pro podávání místním, kožním, orálním,·rektálním, vaginálním, parenterálním, intranásálhím, nitrožilním, nitrosvalovým, podkožním, nitroočním, třansdermálním, intratracheálním nebo intraperitoneálním způsobem a podobně. Prostředky podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují vehikulum, které je farmaceuticky přijatelné pro injekční prostředky, zejména pro přímé injekční podávání do požadovaného orgánu nebo pro podávání místním způsobem (na pokožku a/nébo na sliznici). Mohou to být zejména isotonické sterilní roztoky nebo suché, zejména sušené za zmrazení, prostředky, které se před podáváním v závislosti na způsobu podávání, zředí sterilizovanou vodou nebo fyziologickým roztokem solanky,, čímž vzniknou roztoky vhodné pro injekční podávání. Dávky nukleové kyseliny používané pro injekční prostředky a také počet podávání, se mohou upravit podle různých parametrů a zejména podle způsobu podávání, příslušného

• • •	• ·	• •	• ·	• •	·· • ···	·· ♦
• •	• •	• ·
	•	•		•	• ·	•	•
• ·	• · ·		• ·		··		··	• ·

onemocnění, genu, který se má exprimovat, nebo na požadovaném trvání léčby. Pokud jde o způsob podávání, může se použít buď přímé injekční podávání do tkáně, například na'“ úrovni nádorů nebo do oběhového systému nebo léčení buněk při kultivaci před jejich zpětnou implantací in vivo, pomoci injekce nebo transplantace. Odpovídající tkáně nebo oběhový systém podle předkládaného vynálezu, jsou například svaly, kůže, mozek, plíce, játra, slezina, kostní dřeň, brzlík, srdce, míza, krev, kosti, chrupavky, slinivka břišní, ledviny, měchýř, žaludek, střevo, varlata, vaječníky, konečník, nervový systém, oči, žlázy, poj ivové tkáně a podobně.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu léčby člověka nebo živočicha, který zahrnuje následújící kroky:

(1) uvedení nukleové kyseliny do styku s tranfekcním činidlem definovaným výše za vzniku komplexu a (2) uvedení buněk do styku s komplexem vzniklým v (1).

Předkládaný vynález se také týká) způsobu transfekce nukleových kyselin do buněk, který zahrnuje následující kroky:

(1) uvedení nukleové kyseliny do styku s tranfekcním činidlem definovaným výše za vzniku komplexu a (2) uvedení buněk do styku s komplexem vzniklým v (1).

Buňky se mohou uvést do kontaktu s komplexem pomocí inkubace buněk s jmenovaným komplexem (při použití in vitro nebo ex vivo) nebo pomocí injektování komplexu do organismu (pro použití in vivo) . Inkubace se s výhodou provádí v přítomnosti například 0,01 až 1000 pg nukleové' kyseliny na 10⁶ buněk. Při in vivo podávání se může použít dávka nukleové kyseliny 0,01 až 10 mg.

' · · · · · · ·« · · • · · · · · · ···« • · · · · · · · ·· • · ··«· · ·· ··♦· ··· ·· ·· ·· ···

V případě, že prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují dále jednu nebo více přísad, které jsou definovány výše, se přísada(y) smísí předem s třansfekčním činidlem podle předkládaného vynálezu a/nebo s nukleovou kyselinou.

Předkládaný vynález tedy poskytuje zvláště výhodný způsob přenosu nukleových kyselin in vivo (zejména při léčení onemocnění), zahrnující in vivo nebo in vítro podávání nukleové kyseliny kódující protein nebo která se může přepsat do nukleové kyseliny schopné upravit onemocnění, kdy se jmenovaná nukleová kyselina kombinuje se sloučeninou obecného vzorce I za podmínek definovaných výše.

Činidla pro přenos nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu se mohou použít zejména pro přenos nukleových kyselin do primárních buněk nebo do daných kmenů. Mohou to být buňky fibroblastů, svalové buňky, nervové buňky (neurony, astrocyty, buňky glií), jaterní buňky, buňky hematopoietického kmene (lymfocyty, CD34, dendritické buňky a podobně), buňky epitelu a podobně, v diferencované nebo pluripotentní formě (prekurzory).

Kromě výše uvedených rysů předkládaný vynález zahrnuje také další charakteristiky a výhody,. které se ozřejmí pomocí příkladů a obrázků, které následují, a které je možné považovat za ilustrativní příklady podle předkládaného vynálezu, které v žádném ohledu neomezují jeho rozsah. Aniž by došlo k omezení rozsahu předkládaného vynálezu,, popisují se různé pracovní postupy a také reakční meziprodukty, které se mohou použít pro přípravu transfekčních činidel obecného vzorce I. Je samozřejmé, že odborník pracující v této oblasti může využít tyto postupy nebo meziprodukty v postupech, které jsou podobné popsaným postupů, za získání stejných sloučenin. Je také možné, aby odborník pracující v této oblasti použil syntetické postupy popsané v různých patentových přihláškách uvedených výše, jako

• ·. ·		··	··	99
• · · ·	•	•	9	9	9	9 9
_ · ·	•	•	9 99	9	9
•' ·	4»	•	9 9	9	•
···· · · ·		··.	9 9	99		9 9

základu pro syntézu polykationtu R obsaženého v obecném vzorci I (WO 96/17823; WO 97/18185, WO 97/31935 a tak dále.

Popis obrázků na výkresech .

Obrázek 1: Schématické znázornění plasmidu pXL2774 použitého v příkladech pro transfekci DNA do buněk.

Obrázek 2: Aktivita transfekce genu in vitro u buněk HeLa komplexů tvořených sloučeninou 2 podle předkládaného vynálezu bez kolipidu (pomocného lipidu) nebo v přítomnosti cholesterolu a v přítomnosti DOPE jako kolipidu (pomocného lipidu). Osa „y uvádí expresi luciferázy v pg/jamka. Osa „x uvádí poměr transfekční činidlo/DNA v nmol^g DNA.

Obrázek 3: Aktivita komplexů tvořených sloučeninou 2 podle předkládaného vynálezu v přítomnosti DOPE (1:1) při transfekci genu in vivo po přímé injekci myši do předního holenního svalu. Osa „y uvádí expresi luciferasy v pg/švál. Osa „x uvádí poměr sloučenina 2/DNA v nmol^g DNA.

Příklady provedení vynálezu

A V Materiály a způsoby

a) Materiály

- výchozí polyaminy jako spermidin, spermin, tris-(2-aminoethyl)amin, fenylendiamin, diaminoalkany atd. jsou- komerčně dostupné nebo je lze syntetizovat běžnými metodami (například kyanoethylací komerčně dostupných aminů za získání větvených aminů)

- řada sloučenin, jako napříklád triethylamin, benzotriazol1-yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP) , ben- ·· 4 44 44 444

4-44 444 4 4 4 4

4 444 4 44 4 4 «44 44 444 4 4

4 444 4 444 ··♦· 444 . 44 44 ··444 zylchlorformát, 11-bromundekanol atd. jsou také komerční produkty

- amberlit IR 120 je komerční iontově výměnná pryskyřice (BDH katalog)

- dimethylsulfoxid (DMSO) předem zpracovaný s hydroxidem draselným se destiluje z hydridu vápenatého a pak skladuje nad molekulárními síty 4 A

- dichlormethan se destiluje z oxidu fosforečného a pak skladuje nad molekulárními síty 4 Á ,

- tetrahydrofuran (THF) se destiluje ze sodíku v přítomnosti benzofenonu.

- pro reakce vyžadující bezvodé podmínky se veškeré sklo žíhá a nechá chladnout v atmosféře dusíku.

b) Způsoby

Spektroskopické analýzy

Spektra nukleární magnetické rezonance (NMR) se měří na spektrometru Brucker MSL 30 při.frekvenci 300 MHz pro protony a 75 MHz pro atomy uhlíků. Všechny chemické posuny jsou uvedeny v ppm, bud' vhledem k frekvenci, tetramethylsilanu (TMS) nebo rozpouštědla. Spektra se měří za použití buď TMS nebo zbytkového signálu rozpouštědla jako vnitřního standardu. Multiplicita signálů je označena následovně-: s (singlet) , d (dublet) , t (triplet), q (kvadruplet) a m (multiplet).

Chromatografické techniky ?

- kinetika reakcí se monitoruje pomocí chromatografie na tenké vrstvě (TLC), stacionární fází je silikagel obsahující fluores32

9'9 ·	9Λ	··	• 9 9
• 9 9 9	0	•	9	9	9	9 9
< 9	0	•	• · 9	9	9
♦ i • · · · · · «	o • ·	•	• · 9·	• • 9	9	9 9

cenění indikátor (Měrek Silicagel 60 F254). Chromatogramy se vyvíjejí postřikem alkoholovým roztokem anisaldehydu

- všechny, kolonové chromatógrafie se provádí za použití tlaku stlačeného vzduchu a silikagelu 60 jako; stacionární fáze (0,050,02 mm); mobilní fáze, se liší podle typu syntézy (středhětlaká chromatografie)

- HPLC (vysokotlaká kapalinová chromatografie) analýzy se provádí na přístroji Waters LC 4000 opatřeném analytickou kolonou typu C4 od firmy Applied Biosystem (nerezová ocel, „Brownlee Column, délka 3 cm, průměr 0,46 cm) a detektorem „Waters 486 s vlnovou délkou 220 nm; stacionární fáze je 7 μπι butylaquapore; mobilní fáze je demineralizovaná voda (2500 cm³) nebo acetonitril (2500 cm³) doplněný trifluoročtovou kyselinou (2,5 cm³) ; průtok je 1 ml/min.

B\ Syntéza transfekčních činidel

Příklad 1

Syntéza (3 - [4 - (3-aminopropyl-amino)butylamino]methylenkarbamoyl)-15-pentadekanyl-16-oktadecyl-α-D-mannopyrannosidu (sloučenina 1)

a) Syntéza 3-[4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-butoxykarbonylamino)butyl-t-butoxykarbonylamino]octové kyseliny (FRM 375)

K roztoku 5 g spérminu (24,96 mmol) ve 125 ml methanolu se přidá 0,548 g natriumkyanoborohydridu (NaBH₃CN; 8,74 mmol). Roztok se intenzívně míchá a pak se během 100 minut za použití tlakově nastavitelné přikapávací nálevky přidá roztok 2,34 g glyoxylové kyseliny (25,46 mmol) v 80 ml methanolu. Směs se nechá stát přes noc a pak se přidá roztok 3,86 ml triethylaminu (27,71 mmol) a 27,67 g di-t-butyldikarbonátu (129,79 «« o ·· o ·· · · & · ··

O * ·· ·· mmol) ·· •· •· •· •♦ «· v 55 ml tetrahydrof uranu.. Směs se nechá stát přes noc, pak se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se převede do 63 ml ethylacetátu. Roztok se promyje roztokem hydrogensíranu draselného a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se vysuší bezvodým síranem horečnatým a zahustí. Získaný produkt se chromatograficky čistí na silikagelu (CH₂Cl₂/MeOH 9:1). Výtěžek je 30 %.

^τΗ NMR (CDCIJ : δ (ppm) 1,42 (s, 36H, C(CH₃)₃), 1,45 (m, 4H, CH₂) , 1,60 (m, 4H, CH₂) , 3,04-3,33 (m, 12H, CH₂) , 3,91 (s, 2H, NCH₂COO) .

b) Syntéza methyl-15-hydroxypentadekanoátu

K roztoku 10 g pentadekalaktonu (41,60 mmol) v 41,60 cm³ methanolu se při teplotě 0. °C přidá 6,66 cm³ 2N roztoku methoxidu sodného (13,31 mmol).

Po 9 hodinách se přidá 9,24 cm³ octové kyseliny a směs se nechá reagovat 15 minut. Roztok se pak odpaří do sucha ve vakuu, zbytek se převede do dichlormethanu a směs se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se vysuší bezvodým síranem horečnatým a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu; mobilní fáze směs 6:4 hexan/ethylacetát. Získá se methyl-1-ol-pentadekanoát s výtěžkem 80 %.

H NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,26 (m, 12H, (CH₂)₁₀), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 a H-13), .2,30 (t, 2H, J=7,60 Hz, H-14), 3,64 (t, 1H, J=5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H-16).

c) Syntéza methylpentadekanoátu 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-Dmannopyranosidu

'4 0		*4	0« '	•e	Φ
• ·	··	e ·	A	0	•	00
•		0 ·	0··	o	•	•
4	•	co ·	• c	• ·	'·	•
•	•	o o	4 . 0	o	4	o
4000	·«·	co	• 4	*·	···

K roztoku 8,72 g pentaacetylovaílé mannósy (22,47 mmol) v 56 cm³ dichlormethanu se během 30 minut při teplotě 0 °C přidá 5,26 cm³ chloridu cíničitého (44,94 mmol). Pak se přidá 7,34 g dříve v kroku a) získaného methyl-1-ol-pentadekanoátu (26,96 mmol). Po 2 hodinách se reakční směs zředí ethyletherem a nalije do roztoku hydrogenfosforečnanu sodného (NaHPOj . Vodná fáze se extrahuje diethyletherem a organická fáze se důkladně promyje roztokem uhličitanu sodného, nasyceným roztokem chloridu sodného a pak vysuší bezvodým síranem horečnatým. Zbytek po odpaření se chromatograficky čistí na sílikagelu, mobilní fáze směs 7:3 heptan/ethylacetát. Výtěžek je 53 %.

^lH NMR (CDC1₃) : δ (ppm) 1,26 (nť, 20H, (CH₂)₁₀) , 1,59 (m,4H,

OCH₂CH₂ a H-13), 2,01, 2,05, 2,12 a 2,17 (S, 3H, OCOCH₃) ,2,29 (t, 2H, J= 7,62 Hz, H-14) , 3,40 (m, 1H, J= 7,89 Hz, OCH_aCH₂),

3,66 (m, 1H, J= 7,89 Hz, OCH^CH,) , 3,67 (s, 3H, COOCH₃) ,4,05 (ddd, 1H, J= 9,56 Hz a 5,57 Hz, H-5), 4,1 (dd, 1H, j= 5,57 Hz a 12,32 Hz, H-6a) , 4,29 (dd, 1H, J= 5,57 Hz a 12,32 Hz, H-6b), 4,8 (d, 1H, J= 1,85 Hz, H-l), 5,23 (dd, 1H, J= 1,85 Hz a 3,23 Hz, H-2), 5,27 (dd, 1H, J= 9,97 Hz a 9,56 Hz, H-4), 5,35 (dd, 1H, J= 9,97 Hz a 3,23 Hz, H-3).

d) Syntéza methylpentadekanoátu α-D-mannopyranosidu '

Ve 12 cm³ methanolu se rozpustí 3,63 g produktu z předešlého kroku (6,01 mmol) a přidají se 3. cm³ 2N roztoku methoxidu sodného (6,01 mmol). Po dokončení reakce se směs neutralizuje amberlitem IR120 (1 hmotnostní ekvivalent/objem), filtruje a od-

paří do	sucha ve	vakuu.
3H NMR	(CDC13) :	δ (ppm) 1,28	(m, 20H, (CH2)10),	1,59	(m, 4H,
OCH2CH2	a H-13),	2,34 (t, 2H,	J= 7,62 Hz, H-14) ,	3,41.	(m, 1H,

J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,74 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_feCH₂) , 3,67 (s, 3H, CH₃OCO) , 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 a H-6) ,

4,75 (d, 1H J= 1,82 Hz, H-l).

e) Syntéza methylpentadekanoátu 2,3,4,6-tetra-O-benzyl-a-Dmannopyranosidu

Ve 20 cm³ dimethylformamidu (DMF) se rozpustí · 2 g (4,56 mmol) produktu získaného v předešlém kroku d) a postupně se přidá 4,54 g jodidu draselného (27,36 mmol), 1,09 g 60% hydridu sodného (27,36 mmol) a 3,25 cm³ benzylbřomidu (27,36 mmol). Po 12 hodinách se přidá 18,24 cm³ nasyceného roztoku chloridu amonného a směs se nechá reagovat 10 minut. Pak se zředí vodou a organická fáze se extrahuje ethylacetátem. Tato organická fáze se pak promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a nakonec vysuší bezvodým síranem horečnatým. Pak se směs promyje ještě nasyceným roztokem thiosíranu sodného za účelem odstranění iontů jódu. Směs se odpaří ve vakuu a výsledný olej se chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze směs 9:1 heptan/ethylacetát. Získá se produkt s výtěžkem 60 %.

^XH NMR (CDClj) : δ (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH₂)₁₀), 1,49 (m, 2H, OCH₂CH₂) , 1,59 (m, 2H, H-13), 2,31 (t, 2H, J=± 7,62 Hz, H-14) , 3,34 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,63 (m, 1H, J= 6,71 Hz,

OCH_hCH₂) , 3,67 (s, 3H, CH₃OCO) , 3,75 (m, 1H, J= 8,97 Hz a 6,21

Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH₂Phe) , 3,90 (dd, 1H J= 6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6a) , 3 ,·97 (dd, 1H, J= 6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6b) , 4,07 (s,..2H, CH₂Phe), 4,52 (dd, J= 2,91 Hz a: 7,83 Hz, H-3),

4,57 (s, 2H, ČH₂Phe) , 4,63 (s, 2H, CH₂Phe) , 4,69 (dd, 1H, J=

2,52 Hz a 2,91 Hz, H-2), 4,74 (1H, J= 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd,

1H, J= 7,83 Hz a 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H, Phe).

• ·

f) Syntéza pentadekanové kyseliny 2,3,4,6-tetra-O-benzyl-a-Dmannopyranosidu

K roztoku 0,50 g (0,73 mmol) produktu získaného v předešlém kroku e) v 7 cm³ methanolu se přidá 4,68 cm³ 25% roztoku hydroxidu sodného. Reakční směs se zahřívá 30 minut k varu. Směs se pak neutralizuje při nízké teplotě 5% roztokem chlorovodíkové kyseliny. Organická fáze .extrahuje ethylacetátem a odpaří do sucha ve vakuu. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze směs 4:6 heptan/ethylacetát. Produkt se získá s výtěžkem 62 %.

*H NMR (CDC13)	: 5	(ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2).1O	), 1,49 (m, 2H,
OCH2£H2) , 1,5 9	(m,	2H,	H-13) , 2,34 (t, 2H, J=	7,62 Hz, H-14),
3,34 (m, 1H,	J= 6	,71	Hz, OCHaCH2) , 3,63 (m,	1H, J= 6,71 Hz,
OCHbCH2) , 3,75	(m,	1H,	J= 8,97 Hz a 6,21. Hz, H-	5), 3,78 (s, 2H,
CH2Phe) , 3,90	(dd,	1H,	J= 6,21 Hz a J= 11,82	Hz, H-6a), 3,97

(dd, 1H, J= 6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6b), 4,07	(s, 2H,	CH2Phe) ,
4,52	(dd, J= 2,91 Hz a 7,83 Hz, H-3), 4,57	(s, 2H,	CH2Phe) ,
4,63	(s, 2H, CH2Phe), 4,69 (dd, 1H, J= 2,52 Hz	a 2,91	Hz, H-2),
4,74	(1H, J= 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, 1H, J= 7,	83 Hz a	8,97 Hz,
H-4) ,	7,35 (m, 20H, Phe).

g) Syntéza N-oktadecyl-15-karbamoylpentadekanyl-2,3,4,6-tetra-

O-benzyl-a-D-mannopyranosidu

Do roztoku 0,29 g (0,37 mmol) produktu získaného v předešlém kroku f) v 5 cm³ chloroformu se postupně přidá 0,23 .g BOP (0,52 mmol),

0,21 cm³ diisopropylethylaminu (1,48 mmol)

0,12 g oktadecylaminu (0,44 mmol). Po ukončení reakce se směs zředí dichlormethanem a promyje vódou. Pak se vysuší bezvodým síranem horečnatým a odpaří do sucha ve vakuu. Zbytek se chro matograficky (střednětlaká chromatografie) čistí na silikagelu,

-rr®··

mobilní fáze směs 6:4 heptan/ethylacetát. Produkt se získá s výtěžkem 98 %.

^XH NMR (CDClj) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m,

50H,	(CH2) 25), 1,47 (m, 4H, OCH2CH2 a H-17), 1,58	(m, 2H, H-13),
2,13	(t,	2H,	J= 7,92 Hz,	H-14) , 3,23 (m, 2H,	H-	-16), 3,34 (m,
1H,	J= 6,	, 71	Hz, OCHaCH2) ,	3,63 (m, 1H, J= 6,	71	Hz, OCHfcCH2) ,
3,75	(m,	1H,	J= 8;, 97 Hz a	6,21 Hz, H-5), 3,78	(s	, 2H, CH2Phe) ,
3,90	(dd,	1H,	J= 6,21 Hz a	J= 11,82 Hz, H-6a),	3,	97 (dd, 1H, J=

6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6b) , 4,07 (s, 2H, CH₂Phe) , 4,52 (dd, J= 2,91 Hz a 7,83 Hz, H-3), 4,57' (s, 2H, CH₂Phe) , 4,63 (s, 2H, CH₂Phe), 4,69 (dd, 1H, J= 2,52 Hz a 2,91 Hz, H-2), 4,74 (1H, J= 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, 1H, J= 7,83 Hz a 8,97 Hz, H-4), 5,37 (pás, 1H, HNCO), 7,35 (m, 20H, Phe).

h) Syntéza 15-oktadecylaminopentadekanyl-2,3,4,6-.tetra-Oben zy 1 - oc - D - mannopy r ano s i du

K roztoku 0,77 g (0,75 mmol) produktu získaného v předešlém kroku g) v 15 cm³ bezvodého tetrahydrof uranu (THF) se přidá 0,056 g lithiumaluminumhydridu (LiAlH₄; 1,50 mmol). Směs se 10 hodin zahřívá k varu· Reakční směs se pak ochladí v ledové lázni a přidá se 56 μΐ vody a pak po 10 minutách 112 μΐ 2N roztoku hydroxidu sodného a pak po dalších 10 minutách dalších 56 μΐ vody. Směs se filtruje a odpaří do sucha ve vakuu. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze směs 9:2:0,5 dichlormethan/methanol/28% amoniak. Produkt se získá s výtěžkem 86 %.

3H NMR (CDC13) :

δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz,. H-33), 1,27 (m,

50H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 9H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17 a NH) ,

2,57 (t, 4H, J= 7,92 Hz, H-15 a H-16), 3,34 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,63 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCHbCH₂) , 3,75 (m, 1H, J=

8,97 Hz a 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH₂Phe), 3,90 (dd, 1H, J=

6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6a)

3,97 (dd, • ·

1H, J= 6,21 Hz a J=

11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH₂Phe) , 4,52 (dd, J= 2,91 Hz a

7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH₂Phe), 4,63 (s, 2H, CH₂Phe) , 4,69 (dd, 1H, J= 2,52 Hz a 2,91 Hz, H-2), 4,74 (1H, J= 2,52 Hz, H1) , 4,85 (dd, 1H, j= 7,83 Hz a 8,97 Hz, H-4) , 7,35 (m, 20H,

Phe) .

i) Syntéza (3-[4-(3-t-butoxykarbonylamino-propyl-t-butoxykarbonylamino) -butyl-t-butoxykarbonylamino],methylenkarbamoyl) 15-pentadekanyl-16-oktadecyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-a-D-mannoΐ pyranosidu

K roztoku 0,63 g (0,61 mmol) produktu získaného dříve v kroku

h) v 10 cm³ chloroformu se postupně přidá 0,38 g BOP (0,85 mmol), 0,425 cm³ diisopropylethylaminu (2,44 mmol) a 0,48 g 3-[4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-butoxykarbonylamino)butyl-t-butoxykarbonylamino]octové kyseliny (FRM 375) (0,73 mmol) získané v kroku a). Po 4 hodinách se směs zředí dichlormethanem a promyje vodou. Pak se vysuší bezvodým síranem horečnatým a odpaří do sucha ve vakuu. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze směs 6:4 heptan/ethylacetát. Produkt se získá s výtěžkem 80 %.

^XH NMR (CDC1₃) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33) , 1,27 (m, 50H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 17H, 0CH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 a H-44), 1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 a H-35), 3,09-3,33 (m, Í2H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 a H-45) , 3,34 (m, 1H, j= 6,71 Hz. ‘ OCH_aCH₂) . 3,63 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3,75 (m, 1H, .J= 8,97 Hz a 6,21 Hz, H-5) , 3,78 (s,

2H, CH₂Phe) , 3,90 (dd, 1H, J= 6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6a) ,

3,97 (dd, 1H, J= 6,21 Hz a J= 11,82 Hz, H-6b) , 4,07 (s, 2H,

CH₂Phe) , 4,52 (dd, J= 2,91 Hz a 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H,

CH₂Phe) , 4,63 (s, 2H, CH₂Phe) , 4,69 (dd, 1H, J= 2,52 Hz a 2,91

.·	. 3 9	· ·· ·· ·· · ···· ··· · · ·· • · ·.···· ♦ · · • · · · ·· ··· · ·
Hz, H-2), 4,74	(1H, J=	2,52 Hz, H-l),	4,85 (dd, 1H, J= 7,83 Hz
a 8,97 Hz, H-4)	, 7,35	(m, 18H, Phe).

j) Syntéza (3-(4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-butoxykarbonylamino) butyl-t-butoxykarbonylamino]methylenkarbamoyl)-

15-pent adekany1-16 -okt adecy1-a-D-mannopyranosi du

0,027 g 10% paladia na uhlí se přidá k 0,63 g (0,38 mmol) produktu získaného v předchozím· kroku i) v 5 cm³ methanolu. Roztok se míchá ve vodíkové atmosféře při teplotě místnosti. Po ¥

hodinách se filtruje a potom se odpaří do sucha ve vakuu. Reakce je kvantitativní.

‘H NMR (CD₃OD): (ppm) 0,88 (t, 3H, j= 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m,

50H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37,

H-40, H-41 a H-44)/ 1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15,

H-16	a H-35), 3,	09-3,33	(m,	12H,	Ή-36, H-3.8,	H-39, H-42, H-	-43 a
H-45)	i , 3,34 (m,	1H, J=	6,71	Hz,	OCHaCH2) , 3,5	-3,82 (m, 6H,	H-2,
H-3,	H-4, H-5 a	H-6) ,	3,63	(m,	1H, J= 6,71	Hz,.. OCHbCH2) ,	4,72
(1H,	J= 2,52 Hz,	H-l) .

k) Syntéza (3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]-methylenkarbamoyl) -15-pentadekanyl-16-oktadecyl-oc-D-mannopyranosidu (sloučenina 1)

21,50 cm³ destilovaného tetrahydrofuranu (TFA);se přidá k 0,37 g (0,28 mmol) produktu získanéhó v předchozím kroku j) . Po 1 hodině se reakční směs odpaří při nízké teplotě a suší se za zmrazení. Stupeň čistoty produktu rozpuštěného v methanolu se ověří pomocí HPLC tak, jak je popsáno v části „Materiály a způsoby .

³H NMR (CD₃OD): 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,27. (m, 14H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 a H-44), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 a H-35), 2,92 (m, 2H, • · · · ··· « · ··· · ·· • ·· ··· ·· • · · · · ·· ·· ·· ·· ···

Η-45), 2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3,34 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3,H-4,

H-5 a H-6) , 3,63 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 4,72 (1H, J=

2,02 Hz, H-l) .

Příklad 2

Syntéza (3- [4- (3-aminopropylainino) -butylartino]methylenkarbamoyl)-15-pentadekanyl-16-oktadecyl-6-deoxy-a-L-mannopyranosidu (sloučenina 2)

a) Syntéza 3-[4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-butoxykarbonylamino)butyl-t-butoxykarbonyl-amino]octové kyseliny (FRM 375)

0,548 g (8,74 mmol) kyanoborhydridu sodného (NaBH₃CN) se přidá k roztoku 5 g (24,96 mmol) spermiím v 125 ml methanolu. Roztok se potom intenzivně míchá. Během 100 minut se potom pomočí tlakově nastavitelné přikapávací nálevky přidá roztok 2,34 g (25,46 mmol) glyoxylové kyseliny v 80 'ml methanolu. Po jedné noci se ke směsi přidá 3,86 ml (27,71 mmolj triethylaminu a 27,67 g (129,79 mmol) diterc.butyldikarbonátu rozpuštěného v 55 ml tetrahydrofuranu. Po jedné noci se směs odpaří na rotační odparce a potom se převede do 63 ml ethylacetatu, potom se promyje hydrogensÍránem draselným a solankou. Směs se potom suší nad síranem horečnatým a odpaří se. Získaný produkt se čistí pomocí chromatografie (CH₂Cl₂/MeOH 9:1). Výtěžek je 30 %.

³H NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,42 (š, 36H, C(CH₃)₃) , 1,45 (m, 4H, CH₂) , 1,60 (m, 4H, CH₂) , 3,04-3,33 (m, 12H, CH₂) , 3,91 (s, 2H, NCH₂COO) .

b) Syntéza methyl-15-hydroxypentadekanoátu

6,66 cm³ (13,31 mmol) 2N methylátu sodného Se při 0 °C přidá k 10 g (41,60 mmol) pentadekalaktonu v 41,60 cm³ methanolu. Po 9

• · · φ φ φφφ • φ φ · • φ φ φ • β φ · hodinách se přidá 9,24 ml kyseliny octové a nechá se reagovat 15 minut. Roztok se potom odpaří ve vakuu do sucha, zbytek se převede do dichlormethanu a směs se promyje hydrogenuhličitanem sodným. Získaná organická fáze se suší pomocí síranu horečnatého a rozpouštědlo se odpaří na rotační odparce. Zbytek se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí 6:4 hexan/ethylacetát. Získá se methyl-1-ol-pentaděkanoát ve výtěžku 80 %.

^lH.NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,26 (m, 12H, (CH₂)₁₀)„ 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 a H-13), 2,30 (t, 2H, J= 7,60 Hz, H-14), 3,64 (t, 1H, J= 5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H-16).

c) Syntéza methyl-pentadekanoátu 2,3,4-tri-0-acetyl-6-deoxy-aL-mannopyranosidu

2,49 cm³ (21,30 mmol) chloridu cíničitého se během 30 minut při 0 °C přidá k 3,55 g 10,65 mmol tetracetylované rhamnózy v 27 cm³ dichlormethanu. Potom se přidá 3,48 g (12,78 mmol) dříve připraveného methyl-l-ol-pentadekanoátu. Po 2 hodinách se reakční směs zředí ethyletherem a nalije se do roztoku fosforečnanu sodného (Na₂P0₄). Vodná fáze se extrahuje diethyletherem a organická fáze se postupně promyje roztokem uhličitanu sodného a solankou a potom se suší pomocí síranu horečnatého. Po odpaření do sucha ve vakuu se produkt čistí pomocí střednětlaké chromatografie za eluce směsí 7:3 heptan/ethylacetát. Získá se produkt ve výtěžku 60 %.

³H NMR (CDClj) : (ppm) 1,20 (d, 3Ή, J= 6,45 Hz, H-6), 1,26 (m,

20H, (CH₂)₁₀), 1,59 (m, 4H, OCH₂CH₂ a H-13), 1,98, 2,04 a 2,16 (s, 3H, OCOCH₃) , 2,29 (t, 2H, J= 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,66 (m., 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3,67 (s, 3H, COOCH₃) , 3,88 (m, 1H, J= 6,45 Hz a 9,97 Hz, H-5), 4,70 (d, 1H, J= 1,72 Hz, H-l), 5,06 (dd, 1H, J= 9,97 Hz a 9,97 Hz, • 4JF“' • « ·.· . ·’ · • ···

J= 3,52 Hz i

* ·· (dd, 1H, J= 1,72 Hz a 3,52

HZ, H-2) , 5,30 (dd, 1H, a 9,97 Hz, H-3) .

d) Syntéza methylpentadekanoátu a-deoxy-L-6-mannopyranosidu

5,08 g (9,34 rhmol) produktu získaného v kroku c) selrozpustí v 20 cm³ methanolu a reaguje se s 9,34 ml (18,68 mmol) 2N roztoku methoxidu sodného. Když je reakce dokončená, reakční směs se neutralizuje Amberlitem IR120, filtruje a odpaří do sucha ve vakuu.

^XH NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,20 (d, 3H, J= 6,45 Hz, H-6) , 1,26 (m,

20H, (CH₂)₁₀), 1,59 (m, 4H, OCH₂CH₂ a H-13) , 2,29 (t, 2Ή, J= 7,62

Hz, H-14) , 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3,66 (m, 1H, J=

6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3,67 (s, 3H, CH₃OCO) , 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H3, H-4 a H-5), 4,70 (d, 1H, J= 1,72 Hz, H-l).

e) Syntéza methylpentadekanoátu 2,3,4-tri-0-benzyl-6-deoxy-aL-mannopyranosidu

3,32 g (20,00 mmol) jodidu draselného, 0,80 g (20,00 mmol) 60% hydridu sodného a 2,38 cm³ (20,00 mmol) benzylbromidu se postupně přidá k 2,09 g (5,00 mmol) produktu získaného v předchozím kroku d) v 3 0 cm³ bezvodého dimethylformamidu (DMF) . Po 12 hodinách se přidá 20 ml nasyceného roztoku chloridu amonného a směs se nechá reagovat 10 minut. Směs se potom zředí vodou a organická fáze se extrahuje ethylacetátem. Tato organická fáze se potom promyje vodou a’ solankou a nakonec se suší nad síranem hořečnatým.

Dále se směs promyje nasyceným roztokem thiosíranu sodného, aby se odstranily jodidové ionty. Směs se odpaří ve vakuu do sucha a získaný olej se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí

9:1 heptan/ethylacetát. Získá sé produkt ve výtěžku 60 %.

999 • · · · · • ·· • 9 99 ··

9999999

³H NMR (CDC1.) : (ppm) 1,28 (m, 20H,. (CH₂) ₁₀) , 1,33 (d, 3H, J=

6,21 Hz, H-6), 1,59 (m, 4H, OCH₂CH₂ a H-13), 2,31 (t, 2H, J= 7,62 Hz, H-14), 3,40 (tn, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,61 (dd, 1H, J= 8,96 Hz a 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz,

OCH_bCH₂) , 3,67 (s, 3H, CH₃OCO) , 3,68 (m, 1H, J= 9,5 Hz a 6,21

Hz, H-5), 3,75 (dd, 1H, J= 2,01 Hz a 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd,

J= 3,02 Hz a 8,96 Hz, H-3) , 4,64 (s, 6H, . CH₂Phe) , 4,73 (1H, J=

2,01 Hz, H-l), 7,35 (m, 15H, Phe).

f) Syntéza 2,3,4-tri-O-benzyl-6-deoxy-a-L-mannopyranosidu pentadekanové kyseliny

4,68 ml 25% hydroxidu sodného se přidá k 0,50 g (0,73 mmol) roztoku produktu získaného v předchozím kroku e) v 7 cm³ methanolu. Reakční směs se zahřívá 30 .minut k varu pod zpětným chladičem. Směs se potom neutralizuje při nízké teplotě 5% roztokem kyseliny chlorovodíkové. Organická fáze se extrahuje ethylacetátem a odpaří se ve vakuu do sucha. Zbytek se čistí pomocí chromátografie za eluce směsí 4:6 heptan/ethylacetát. Získá se produkt ve výtěžku 72 %.

³H NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH₂)₁₀), 1,33 (d, 3H, J=

6,21 Hz, H-6), 1,59 (m, 4H, OCH₂CH₂ a H-13), 2,34 (t, 2H, J= 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,61 (dd, 1H, J= 8,96 Hz a 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3,68 ; (m, 1H, J= 9,5 Hz a 6,21 Hz, H-5), 3,75 (dd, 1H, J= 2,01 HZ a 3,02 Hz, H-2), 3.,88 (dd, J= 3,02 Hz a 8,96 Hz, H3), 4,64 (s, 6H, CH₂Phéj , 4,73 (1H, J= 2,01 Hz, H-l), 7,35 (m,20H, Phe).

• · ··

g) Syntéza N-oktadecyl-15-karbamoylpeiítadekanyl-2,3,4-tri-O benzyl-6-deoxy-a-Li-mannopyranosidu

0,69 g (1,56 mmol) BOP, 0,72 cm³ (4,16 mmol) diisopropylethylaminu a 0,34 g (1,25 mmol) okťadecylaminu se přidá postupně k roztoku 0,70 g (1,04 mmol) produktu získaného v předchozím kroku f) v 13 cm³ chloroformu. Když je reakce dokončená, směs se zředí dichlormethanem,· promyje se vodou, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se do sucha ve vakuu. Zbytek se čistí pomocí střednětlaké chromatografie za eluce směsí 6:4 heptan/ ethylacetát. Získá se produkt ve výtěžku 84 %.

³H NMR (CDG1₃) : (ppm) 0,88 (t, 3H,' J= 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH₂) ₂₅), 1,33 (d, 3H, J= 6,21 Hz, H-6) , 1,47 (m, 4H, OCH₂CH₂ a H-17) , 1,58 (m, 2H, H-13), 2,13 (t, 2H, J= 7,92 Hz, H-14), 3,23 (m, 2H, H-16) , 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) ,

3,61 (dd, 1H, J= 8,96 Hz a 9,5 Hz,	H-4), 3,66	(m, 1H, J= 6,71
Hz, OCHbCH2) , 3,68 (m,	1H,	J= 9,	5 HZ	a 6,21	Hz,	H-5) , 3,75 (dd,
1H, J= 2,01 Hz a 3,02	Hz,	H-2) ,	3,88	(dd, J=	= 3,	02 Hz a 8,96 Hz,

H-3) , 4,64 (s, 6H, CH₂Phe) , 4,73 (1H, J= 2,01 Hz, H-1) , 5,37 (pás, 1H, HNCO), 7,35 (m, 15H, Phe).

h) Syntéza 15-oktadecylaminopentadekanyl 2,3,4-tri-O-benzyl-6deoxy-a-L-mannopyranosid

0,065 g (1,72 mmol) lithiumaluminumhydridu AlLiH₄ se přidá k 0,81 g (0,86 mmol) produktu získaného v předchozím kroku g) v 15 cm³ bezvodého tetrahydrofuranu (THF) a směs se zahřívá 10 hodin k varu pod zpětným chladičem. Reakční směs se potom ochladí v ledové lázni a přidá se 65 μΐ vody, potom po 10 minutách 130 μΐ 2N roztoku hydroxidu sodného a po dalších 10 minutách dalších 65 μΐ vody. Směs se filtruje a odpaří ve vakuu do sucha. Zbytek se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí i

9:2: 0,5 dichlormethan/methanol/28% amoniak. Získá se produkt ve výtěžku 93 %.

^τΗ NMR (CDC1₃) : (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m,

50H, (CH₂) ₂₅), 1,33 (d, 3H, J= 6,21 Hz, H-6) , 1,4-1,6 (m, 9H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17 a NH) , 2,57 (t, 4H, J= 7,92 Hz, H-15 a H-16), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,61 (dd, 1H, J=

8,96 Hz a 9,5 Hz, H-4) , 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz, QCH_bCH₂), 3,68 (m, 1H, J= 9,5 Hz a 6,21 Hz, H-5), 3,75 (dd, 1H, J= 2,01 Hz a 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J= 3,02 Hz a 8,96 Hz, H-3) , 4,64 (s,

6H, CH₂Phe), 4,73 (1H, J= 2„01 Hz, H-l), 7,35 (m, 15H, Phe).

i) Syntéza (3-[4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-bútoxykarbonylamino)butyl-t-butoxykarbonylamino]methýlenkarbamoyl)-15-pentadekanyl - 16-okťadecyl - 2,3,4 - tri-O-benzyl -6-deoxy-oc-L-mannopyranosidu

0,53 g (1,20 mmol) BOP, 0,30 cm³ (1,72 mmol) diisopropylethylaminu a 0,62 g (0,95 mmol) FŘM, 375 získaného v kroku a) se postupně přidá k roztoku 0,78 g (0,86 mmol) produktu získaného v předchozím kroku h) rozpuštěného v 7 cm³ chloroformu. Po 4 hodinách se směs zředí dichlormethanem, promyje se vodou, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se do sucha ve vakuu. Získaný produkt se čistí pomocí velmi rychlé chromatografie („flash) za eluce směsí 6:4 heptan/ethylacetát. Získá se produkt ve výtěžku 72 %.

^XH NMR (CDC1₃) : (ppm) 0,88 (t, 3H, j= 6,36 Hz, H-33) , 1,2.7 (m,

50H, (CH₂) ₂₅), 1,33 (d, 3H, J= 6,21 HZ, H-6), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 a H-44), 1,46 (m, 36H, Boc) , 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 a H-35) , 3,09-3,33 (m,

12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 a H-45), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,65 (s, 2H, CH₂Phe) , 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz,

				4 6'	• · 4 4·	• • 4 4*	• · · · ·· ··	• · · ·· 441
OCHbCH2) ,	3,68	(m,	1H,	J= 9,5 Hz a	6,21 Hz,	H-5)	, 3,99	(S, 2H,
CH2Phe) ,	4,02	(dd,	1H,	J= 8,96 a	9,5 Hz, 1	H-4) ,	4,32	(s, 2H,
CH2Phe) ,	4,57	(dd,	1H,	J= 2,01 Hz a	3,02 HZ,	H-2)	, 4,73	(1H, J=

2,01 Hz, H-l), 4,82 (dd, J= 3,02 Hz a 8,25 Hz, H-3) , 7,35 (m,

18H, Phe).

j) Syntéza (3-[4-(3-t-butoxykarbonylaminopropyl-t-butoxykarbonylamino)butyl-t-butoxykarbonylamino]methylenkarbamoyl)-15pentadekany1-16-oktadecy1-6-deoxy-a-L-mannopyřanosidu

0,034 g 10% paladia na uhlí se přidá 0,74 g (0,48 mmol) produktu získaného v předchozím kroku i) rozpuštěného v 10 cm³ methanolu. Roztok se míchá ve pod tlakem vodíku při teplotě místnosti. Po 4 hodinách se filtruje a potom odpaří do sucha ve vakuu. Reakce je kvantitativní.

^XH NMR (CD₃OD) : (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J= 6,45 Hz, H-6) , 1,27 (m, 14H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 a H-44), 1,46 (m,

36H, Boc) , 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 a H-35) , 3,09-3,33 (tn,

12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 a H-45), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_aCH₂) , 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz, ÓČHbCHj , 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 a H-5), 4,73 (1H, J= 2,01 Hz, H-l).

k) Syntéza (3 -[4 -(3-aminopropylamino)butylamino]-methylenkarbamoy1)-15-pent adekany1-16-okt adecy1- 6-deoxy-a-L-mannopyranos i du (sloučenina 2) cm³ destilovaného tetrahydrofuranu (ŤHF) se přidá k 0,40 g (0,31 mmol) produktu získaného v předchozím kroku j) . Po 1 hodině se reakční směs odpaří do sucha ve vakuu při nízké teplotě a potom se suší za zmrazení. Stupeň čistoty produktu rozpuštěného v methanolu se ověří pomocí HPLC.

·· ·*·· ♦ • · · · ··· • · ··· · ·· • · ·· · · · ·· • · · · · ·· ·· ·· ·· ·♦<

'47 ¹H NMR (CD₃OD) : (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J= 6,45 Hz,. H-6'), 1,27 (m, 14H, (CH₂)₂₅), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH₂CH₂, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 a H-44), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15‘, H-16 a H-35), 2,92 (m, 2H, H-45) , 2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3,40 (m, 1H, J= 6,71 Hz,

OCH_aCH₂) , 3,66 (m, 1H, J= 6,71 Hz, OCH_bCH₂) , 3, .6-3,9 (m, 4H, H-

2, H-3, H-4 a H-5), 4,73 (1H, J= 2,01 Hz, H-l).

Příklad 3

Syntéza 1 - [- (3 - [4 - (3-aminopropylamino) -butylaminopropylamino ] methyl enkarbamoyl)-15-pentadekanyl-16-oktadekanyl 6-deoxy~P~Lgalaktopyranosidu (sloučenina 3)

a) Syntéza {3-[4-(3-benzyloxykarbonylaminopropyl-benzyloxykarbonylamino)butylbenzyloxykarbonylamino]-propylamino}octové kyseliny

Roztok 1,10 g (17,47 mmol) kyanoborhydridu sodného (NaBH₃CN) se přidá k roztoku 10 g (49,91 mmol) sperminu v 200 ml methanolu.

Za použití přikapávací nálevky s vyrovnáváčem tlaku se·během 10 minut přikape roztok 4,59 g (49,91 mmol) glyoxylové kyseliny v

120 ml methanolu.

Po jedné noci se reakční směs umístí do ledové lázně a postupně se v po deseti dílech přidá 34 ml 2N roz toku hydroxidu sodného a 14,25 ml (99,82 mmol) benžylchloro formiátu. Směs se potom intenzivně míchá za udržování lázně na teplotě 5 až 10 °C. Po 2 hodinách při teplotě místnosti se Směs extrahuje etherem a neutralizuje se 5N roztokem kyseliny chlorovodíkové. Organická fáze se suší nad síranem horečnatým a odpaří se na rotační odparce. Získaný produkt se čistí pomocí chromatografie (100% CH₂C1₂, potom 9:1 CH₂Cl₂/MeOH) . Výtěžek je o, Ό ·

	ΦΦ « • · · • Φ Φ · · φ φ ΦΦΦΦ φφφ 48	·* ·« ·« * « » · · · ··
Φ φ • φ φ φ « φ	ΦΦΦ φ φ · ΦΦΦΦ* · ΦΦ*·· •· ΦΦ ΦΦΦ
XH NMR (CDClj)	: (ppm) 1,28 (t,_ 4Η, CH2) , 1,60	(τη,	4Η, CH2) ,
3,04-3,33 (m,	12Η, CH2) , 3,49 (s, 2Η, NCH.COO) ,	5,	07 (s, 8Η,
CH2) , 7,27 (m,	20H, Phe).

b) Syntéza methyl-1.5-hydróxypentadekanoátu g (41,6 mmol) Pentadekalaktonu se rozpustí .v 41,6 ml methanolu a reaguje se při 0 °C s 6,656 ml (13,31 mmol 2N roztoku methoxidu sodného. Po 9 hodinách se přidá 9,24 ml kyseliny octové a nechá se reagovat 15 minut. Roztok se potom odpaří a získaný olej se rozpustí v dichlormethanu a promyje se hydrogenuhličitaném sodným. Po slití se organická fáze suší nad síranem hořečnatým a odpaří se. Zbytek se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí 6:4 hexan/ethylacetát (AcÓEt) za získání methyl-15-hydroxypentadekanoátu ve výtěžku 80 %.

^XH NMR (CDC1₃) : (ppm) 1,29 (m, 20H, (CH₂)₁₀), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 a H-13), 2,30 (t, 2H, J=7,60 Hz, H-14), 3,64 (t, 1H, J= 5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H-16).

c) Syntéza N-oktadecyl-15-hydroxypentadekanamidu g (36,85 mmol) methyl-15-hydróxypentadekanoátu získaného v předchozím kroku b) a 19,86 g (73,70 mmol) oktadecylaminu se taví ve vakuu při 150 °C. Po 24 hodinách se směs ochladí a zředí dichlormethaném. Získaná sraženina se filtruje přes Bůchnerovu nálevku. Získaná pevná látka se potom rekrystalizuje v methanolu za získání N-oktadecyl-15-hydroxypentadekanamidu ve výtěžku 100 %.

^XH NMR (CDC1₃) : (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m,

54H, (CH₂)₂₇), 1,4-1,6 (m, 6H, H-2, H-13 a H-17) , 2,30 (t, 2H,

J= 7,60 Hz, H-14), 3,25 (m, 2H, H-16), 3,64 (t, 2H, J= 5,84 Hz,

H-l), 5,39 (pás NHCO).

		9· » 9 · ··	9· >· · • · 9 * · ··
		• 9 • · ·	9 99 9 99 » ·
		• 9 • 999 990	*·· 99 99 ··
		49'
13C NMR (CDClj)	: (ppm) 14,48	(C-33), 25,3 a 26,3	(C-2 a C-13) ,
29,72 ((CH2)27))	,36,7 a 34,8	(C-14 a C-16), 63,6	(C-l), 174,31

(CO) .

d) Syntéza 15-oktadecylaminopentadekanolu

2,98 g (78,44 mmol) lithiumaluminumhydridu LiAlH₄ se přidá k roztoku 20 g (39,22 mmol) N-oktadecyl-15-hydroxypentadekanamidu získaného v předchozím kroku c) v 250 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Reakce se provádí 10 hodin za varu pod zpětným chladičem. Po ochlazení reakční směsi se postupně přidá 2,98 ml vody a 2,98 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Po. 10 minutách se znovu přidá 2,98 ml vody. Vznikající sraženina se filtruje přes Bůchnerovu nálevku a filtrát se zahustí na rotační odparce a získá se 15-oktadecylaminopentadekanol.

^TH NMR (CDClj : (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,96 Hz, H-33) , 1,26 (m,

54H, (CH₂ ) ₂₇), 1,43-1,59 (m, 7H, H-2, H-14, H-17 a pás NH) , 1,51,6 (m, 4H, H-2 a H-13), 2,60 (t, 4H, Js 6,50 Hz, H-15 a H-16), 3,64 (t, 2H, J= 5,84 Hz, H-l).

¹³C NMR (CDC1₃) : (ppm) 14,48 (C-33), 25,3 a 26,3 (C-2 a C-14) ,

29,72 ((CH₂)₂₇)), 51,7 (C-15 a C-16) , 63,6 (C-l).

e) Syntéza N-[benzyloxykarbonyl]-15-oktadecylaminopentadekanolu

7,89 ml (55,26 mmol) benzylchloroformiátu se přidá po kapkách k roztoku 13,71 g (27,63 mmol) 15-oktadecylaminopentadekanolu získaného v předchozím kroku d) a 7,7 ml (55,26 mmol) triethylaminu ve 150 ml suchého dichlormethanu ochlazenému na 0 °C. Po 10 minutách se ověří pH reakční. směsi. Reakční směs se potom nechá přes noc při teplotě místnosti. Roztok se potom promyje vodou, suší se nad síranem hořečnatým a odpaří se. Reakční směs se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí 6:4 heptan/AcOEt.

··· · · · · ··· • · <» · ·· · ··· ······· ··· ········· ·· • ···· ···· ···· «>·· ·· ·· ·· ···

Získá se N-[benzylóxykarbonyl]-15-oktadecyl-aminopentadekanol ve výtěžku 70 %.

^XH NMR (CDC1₃) : (ppm) 0,88 . (t, 3H, J= 6,96 Hz, H-33) , 1,26 (m,

54H, (CH₂ ) ₂₇), 1,43-1,59 (m, 6H, H-2, H-14, H-17), 3,20-3,22 (m, 4H, H-15 a H-16) , 3,64 (t, 2H, J= 5,84 Hz, H-l) , 5,12 (s, 2H, OCH₂Phe) , 7,34 (m, 5H, Phe).

¹³C NMR (CDC1₃) : (ppm) 14,48 (C-33), 25,8, 26,9 a 31,94 (C-2, C14 a C-17) , 29,72 ((CH₂)₂₇)), 47,26-48,04 (C-15 a C-16), 63,08 (C-l), 66,79 (OCH₂) , 128,40 (Phe) .

f) Syntéza 15-[N-(benzyloxykarbonyl)oktadecyl-amino]pentadekanyl 2,3, 4-tri-0-acetyl-6-deoxy-β-L·-galaktopyranosidu

1,5 g (4,52 mmol) tetraacetylované fukózy se 30 minut reaguje s 0,634 ml (5,42 mmol) Chloridu cíničitého v 50 ml suchého acetonitrilu. Potom se přidá 3,132 g (4,97 mmol) N-[benzyloxykarbonyl] -15-oktadecylaminopentadekanolu získaného v předchozím kroku e) . Po 5 hodinách se reakční¹ směs extrahuje a získaný produkt se čistí pomocí chromatografie za eluce směsí 6:4 heptan/ ethylacetát. Výtěžek je 69 %.

3H NMR: (ppm) 0,8 7	(t,	3H, J= 6,96	Hz, H-33), 1,2 (d, 3H,	J=
6,51 Hz, H-6), 1,25	(m,	54H, (CH2)27)	, 1,52 (m, 6H, OCH2CH2, H	-14
a H-17), 1,95, 2,05 a	‘i 2,15 (s, 3H,	OCOCH3) , 3,14-3,25 (m,	4H,
H-15 a H-16)., 3,44	(m,	1H , OCHaCH2) ,	3,63 (m, 1H, OCHbCH2) , 3	,79
(m, 1H, H-5) , 4,41	(d,	1H, J= 7,98	Hz, H-l) , 4,99 (dd, 1H,	J=
3,52 Hz a 10,46 Hz,	, H-	3), 5,09 (s,	2H, OCH2Phe) , 5,16 (dd,	1H,
J= 7,98 Hz a 10,46	Hz,	H-2), 5,23 (dd, J= 3,52 Hz a 3,31 Hz,	H-
4), 7,32 (m, 5H, Phe).
13C NMR (CDC13) :	(ppm) 14,68 (C	-33) , 17,31 (C-2) , .20	,75

(CH₃COO) , 27,29 (C-6) , 2 9,72 ( (CH₂) ₂₇) ) , 25,89 - 31,98 (OCH₂CH₂, C-

14, C-17), 47,25-48,04 (C-15 a C-16), 66,91 (CH₂Phe) , 69,63 (OCH₂CH₂) , 69,45 (C-2

70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3),

96,25 (C-l) , 128,43 (Phe), 156,21 a 171,30. (CO).

g) Syntéza 15-oktadecyl-aminopentadekanyl 2,3,4-tri-O-acetyl-6deoxy-p-L-galaktopyranosidu

0,5 g 10% Paladia na uhlí se ve vodíkové atmosféře přidá k roztoku 2,72 g (4,23 mmol) 15-[N-(benzyloxykarbonyl)oktadecylamino] pentadekanyl 2,3, 4-^ί-0-3θείγ1-6-άθθχγ-β-1₁-^1'3^οργ^ηο3ίdu získaného v předchozím'kroku f). Reakce je kvantitativní.

H NMR: (ppm) 0,87 (t, 3H, J= 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J=

6,51 Hz, H-6), 1,25 (m, 54H, (CH₂) ₂₇)’, 1,52 (m, 6H, OCH₂CH₂, H-14 a H-17) , 1,88-1,93 (pás NH), 1,95, 2,05 a 2,15 (s, 3H, OCOCHJ , 2,64 (m, 4H, H-15 a H-16) , 3,46: (m, 1H, OCH_aCH₂) , 3,63 (m, 1H,

OCH_bCH₂) , 3,79 (m, 1H, H-5), 4,41 (d, 1H, J= 7,98 Hz, H-l) ,

4,99 (dd, 1H, J= 3,52 Hz a 10,46 Hz, H-3) , 5,16 (dd, 1H, J= 7,98 Hz a 10,46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J= 3,52 Hz a 3,31 Hz, H-4).

¹³C NMR (CDC1₃) : (ppm) 14,68 ' (C-33), 17,31 (C-2), 20,75 (CH₃COO), 27,29 (C-6) , 29,72 ((CH₂) ₂₇)), 25,89-31,98 (OCH₂CH₂, C14, C-17) , 47,75-48,04 (C-15 a C-16), 69,63 (OCH₂CH₂) , 69,45 (C-2), 70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3), 96,25 (C-l),

171,30 (CO) .

h) Syntéza (3 -[4 -(3-aminopropylamino)butylamino-propylbenzyloxykarbonylamino]methylenkarbamoyl)-15-pentadekanyl-16-oktadekanyl 2,3,4-tri-0-acetyl-6-deoxy^-L-galaktopyranosidu \ · .

0,491 ml (2,82 mmol) Diisoprópylěthylaminu, 0,457 g (1,03 mmol)

BOP a 0,748 g (0,94 mmol) {3- [4-(3-benzyloxykarbonylaminopropylbenzyloxykarbonylamino)butylbenzyloxykarbonylamino]propylamino}octové kyseliny získané v kroku aj se postupně přidá k roztoku 0,60 g (0,94 mmol) sloučeniny získané v předchozím kroku g) v 15 ml chloroformu. Získaný olej se čistí pomocí chromá52 tografie za eluce směsí 4:6 heptan/ethylacetát. Získá se (3-[4(3-aminopropylamino)butylaminopropylbenzyloxykarbonylamino]methyl enkarbamoyl) -15-pentadekanyl-16-oktadekanyl ' 2,3,4-tri-Oacetyl-6-deoxy-P-L-gálaktopyranosid ve výtěžku 45 %.

A NMR: (ppm) 0,87 (t, 3H, J= 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J=

6,51 Hz, H-6), 1,24 (m, 54H, (CH₂ ) ₂₇), 1,39-1,67 (m,15H,

OCH₂CH₂, H-14, H-17, NH, CH₂) , 1,95, 2,05 a 2,15 (s.,3H,

OCOCH₃) , 3,05-3,35 (m, 18H, H-15, H-16 a CH₂N), 3,43 (m/ 1H, OCH_aCH₂) , 3,67 (m, 1H, J= 6,74 Hz, OCH_bCH₂) , 3,79 (m, 1H,. H-5),

s	4,41 (d, 1H, J=	7,98	Hz,	H-l), 4,	99	(dd, 1H, J=	3,52	Hz a	10,46
	Hz, H-3) , 5,05	(s,	8H,	CH2Phe) ,	5,	16 (dd, ,1H	, J=	7,98	Hz a
	10,46 Hz, H-2),	5,23	(dd,	J= 3,52	Hz	a 3,31 Hz,	H-4)	, 5,47	(pás
	CONH, 1H), 7,32	(m,	2 0H,	Phe) .

¹³C NMR (CDC1₃) : (ppm) 14,84 (C-33) , 20,75 (CH₃COO) , 27,29(C6'), 29,72 ((ČH₂ ) ₂₇)), 25,89 - 31,98 (OCH₂CH₂, C-14, C-17 a CH₂) ,

37,87-46,87 (C-15, C-16 a C-N) , 66,84 (CH₂Phe ) , 68,63 (OCH₂CH₂) , 69,45 (C-2), 70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3), 96,25(ΟΙ), 128,31 (Phe), 157,01 á 171,30 (CO).

i) Syntéza 1-[-(3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino-propylbenzyloxykarbonylamino]methylenkarbamoyl)-15-pentadekanyl-16oktadekanyl-6-deoxy-P-L-galaktopyranosid ml nasyceného methanolického roztoku amoniaku se přidá ke 3

ml methanoluckého	roztoku obsahujícího	0,60	g (0,94 mmol)
produktu získaného	v předchozím kroku h)	.. Po 1	hodině se směs
odpaří.
3H NMR: (ppm)	0,87	(t, 3H, J= 6,96 Hz,	H-33) ,	1,2 (d, 2H, J=
6,51 Hz, H-6)	, 1	,24 (m, 54H, (CH2)27)	, 1,39	-1,67 (m, 15H,
OCH2CH2, H-14,	H-17	, NH, CH2) , 3,05-3,35	(m, 18H, H-15, H-16 a
CH2N) , 3,4-3,7	(m,	6H, OCH2CH2, H-3, H-4	/ H-5,	H-2), 4,73 (d,

i

CH₂Phe), 5,47 (pás CONH,

1H), 7,32 (m, 20H, Phe).

j) Syntéza 1-[-(3 -[4-(3-aminopropylamino)butyl-amino-propylamino j methylenkarbamoyl) -15-pentadekanyl-16-oktadekanyl- 6-deoxyβ-L-galaktopyranosid (sloučenina 3)

0,032

10% Palladia na uhlí v methanolu se přidá k roztoku

0,072 (0,05 mmol) produktu získaného v předchozím kroku

Směs se míchá přes noc, potom se filtruje přes papír se skelnými vlákny a odpaří se na rotační odparce.

Produkt se potom čistí pomocí HPLC na preparativní koloně typu

6,51 Hz, H-6)

OCH₂CH₂, H-14,

CH₂N) , 3,4-3,7

J= 6,96 Hz, H-33), 1,.2

54H, (CH₂)₂₇),

2,92-3,19 (m, (m, 6H, OCH₂CH₂,

H-3, H-4, (d, 2H,

J=

1,39-1,67 ;(m, 15H,

18H, . H-Í5, H-16 a

H-5, H-2), 4,73 (d,

1H, J= 7,98 Hz, H-l).

C\ Použití transfekčních činidel podle předkládaného vynálezu

Příklad 4

Příprava komplexů transfekční činidlo/nukleová kyselina se sloučeninou 2 a měření jejich velikosti

Tento příklad ilustruje přípravu komplexů mezi transfekčním činidlem podle předkládaného vynálezu a nukleovou kyselinou, u kterých se potom měří jejich velikost.

Glykolipidem použitým v tomto příkladu a v příkladech, které následují, je sloučenina 2, rozpuštěná v chloroformu při koncentraci 10 mg/ml. V některých případech se nejprve smísí se sloučeninou 2 neutrální kolipid, cholesterol nebo DOPE.

« 99 ·· «··

9·· · · 9 9 · · ·

9 9 9 9 9 9999

9 9999999

9999 999 99 99 99999

Roztok lipidu se připraví následujícím způsobem: odebere se vzorek požadovaného množství, rozpouštědlo se odpaří v proudu argonu a nechá se 1 hodinu sušit. Lipid se potom rehydratuje roztokem obsahujícím 5 % dextrózy a 10 mM chloridu sodného přes noc při 4 °C. Následující den se roztoky lipidu zahřívají 5 minut na 60 °C a potom se zpracovávají 5 minut ultrazvukem. Operace se opakuje, dokud není velikost částic lipidu stabilní.

Použitou DNA je plasmid pXL3031 (obr. 1) rozpuštěný ve směsi 5 % dextrózy a 10 mM chloridu sodného při koncentraci 0,5 mg/ml nebo 1,0 mg/ml. Tento plasmid obsahuje luc gen kódující luciferázu pod kontrolou promotéru P/E CMV cytomegaloviru. Diagram tohoto plasmidu je uveden na obrázku 1. Plasmid pXL3031 se čistí podle způsobu popsaného v Mezinárodní patentové přihlášce WO 97/35002.

Komplexy sloučenina 2/DNA se připraví-rychlým smísením vhodných objemů roztoku plasmidu DNA a sloučeniny 2 (podle požadovaného poměru náboje), při teplotě místnosti. Množství transfekčního činidla se pohybuje mezi 0,25 nmol^g DNA až 12 nmol^g DNA.

Velikost komplexu se analyzuje měřením hydrodynamického průměru dynamického rozptylu laserového světla za použití zařízení N4Plus. Vzorky se zředí dvacetkrát v roztoku obsahujícím 5 % dextrózy a 20 mM chloridu sodného, aby se zabránilo mnohočetnému rozptylu.

Při poměru 3. nmol lipid/gg DNA se získají následující výsledky:

	Velikost v nm
Micely	13 0 nm
Prostředek s cholesterolem	153 nm
Prostředek s DOPE	13 7 nm

Termín „micely znamená, že sloučenina 2 se použije samotná, tj . bez přidání neutrálního kolipidu a proto tvoří micelární roztok.

·········· ··········· ········· ···· ··· ·· ·· ·· ··· . 55

Tato tabulka ukazuje, že získané komplexy mají velikost asi 130 nm až 150 nm, což je kompatibilní s farmaceutickým použitím, zejména v injekcích.

Příklad 5

Chování komplexů tvořených sloučeninou 2 při různých poměrech náboje

Tento příklad ilustruje chování komplexu transfekčního činidla podle předkládaného vynálezu/nukleové kyseliny, když se mění poměr náboje. Ilustruje se také vliv přidání kolipidu (cholesterol nebo DOPE).

Když se zvyšuje poměr náboje transfekčního činidla/DNA, obvykle se rozliší 3 fyzikálně chemické fáze,. (B. Pitard a kol., Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer, PNAS, díl 94, str. 14412-14417, 1997). Tyto tři fáze určují terapeutický potenciál transfekčního činidla.

Při nízkém poměru náboje není DNA nasycená transfekčním činidlem. Stále zůstává nekomplexovaná DNA a komplexy jsou celkově záporně nabité a mají malou velikost. Tato fáze, která je stabilní, se nazývá „fáze A.

Skutečnost, že DNA není úplně nasycená transfekčním činidlem, znamená, že DNA není úplně chráněná. DNA může proto podlehnout degradaci nukleázami. Dále, protože jsou komplexy celkově negativní, je obtížný přechod přes buněčnou membránu. 2 těchto důvodů jsou nukleolipidové komplexy fáze A relativně neaktivní.

Při středním poměru náboje je DNA úplně nasycená transfekčním činidlem a komplexy jsou celkově neutrální nebo slabě kladné. Tato fáze je nestabilní, protože repulze iontů jsou minimální a • · ·· · · · · β · · • · ·♦····· ···· ··· ·· ·· ·· ··· může se vyskytnout jev shlukování (agregace). Velikost částic je nad hranicí detekce pomocí dynamického rozptylu laserového světla (daleko vyšší, než 3 μπι) . Tato nestabilní fáze se nazývá „fáze B. Tato velikost komplexu není vhodná pro použití v injekcích, ačkoli to neznamená, že komplexy ve fázi B jsou neaktivní: jsou pouze V prostředku, který není vhodný pro injektování pro farmaceutické účely.

Při vysokém poměru náboje je DNA supernasycená transfekčním činidlem a komplexy jsou celkově pozitivní. Protože dochází mezi kladnými náboji k silné repulzí, je tato fáze stabilní. Označuje se termínem „fáze C. Narozdíl od (fáze A jsou získané komplexy v takové formě, že DNA je velmi dobře chráněná proti nukleázám a celkový kladný náboj těchto komplexů usnadňuje připojení k buněčné membráně, která má aniontovou povahu, a přechod přes tuto membránu. Komplexy fáze C jsou proto zvláště vhodné pro použití pro transfekci nukleových kyselin do buněk.

Tyto 3 zóny A, B a C se také zlepší se sloučeninami 2 podle předkládaného vynálezu jako transfekčními činidly:

Poměr náboje

0,25

0,5

0,75

1

1,5

2

3

4

6

8

10

12

Micely

A

A

B

B

B

B

C

C

C

C

C

C

+Cholesterol

A

A

B

B

B

C

C

C

C

C

C

C

+DOPE

A

A

B

B

B

C

G

C

C

C

C

C

Jak je uvedeno v tabulce výše, zóna B, která je nestabilní zónou, je zvláště malá a vykazuje velmi nízké poměry náboje.

Zóna C začíná od 2 nmol lipid/^g DNA, když se sloučenina 2 použije společně s kolipidem (cholesterol nebo DOPE) a od 3 nmol lipid/^g DNA, když se sloučenina 2 použije^ samotná. Jak je «······ »······ · ·······* ···♦····· • · · · · · · ···· · · · ·· · ·

- ; 57 uvedeno výše, je to zóna, která je zvláště výhodná pro farmaceutické použití.

Pro srovnání bylo zjištěno s jedním z kationtových lipidů popsaných v Mezinárodní patentové přihlášce WO 97/18185, že zóna C začíná vznikat při poměru náboje nejméně 2, v závislosti na koncentraci chloridu sodného v roztoku (viz. obr. 3A v B. Pitard a kol., PNAS USA, 94, str.14412-14417, 1997)..

Sloučenina 2 je tedy zvláště výhodným transfekčním činidlem, protože je stabilní při nízkém poměru náboje, což umožňuje vznik stabilních komplexů s malým množstvím glykolipidů, což má ten výhodný důsledek z toxikologického hlediska.

Příklad 6

Použití sloučeniny 2 pro in vitro přenos DNA

Tento příklad ilustruje schopnost transfekčních činidel podle předkládaného vynálezu přenášet DNA do buněk in vitro, při různých poměrech náboje, v přítomnosti nebo nepřítomnosti neutrálního kolipidu (cholesterol nebo DOPE).

24jamkové mikrotitrační destičky'se naplní 60 000 buněk-HeLa na jamku a kultivují se přes noc. Počet buněk po jedné noci, a ; tedy v době transfekce, je 100 000 buněk na jamku.

á- Každá jamka se uvede do styku s komplexy tvořenými sloučeninou a kontaktuje se 1 μg plasmidu DNA v 0,5 ml kultivačního média DMEM (Gibco/BRL) bez séra. Buňky se inkubují 5 hodin při 37 °C. Médium obsahující komplexy se odstraní a nahradí se kultivačním médiem DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum. Potom se buňky znovu 24 hodin kultivují. Nakonec se buňky lyžují a testují se za použití lucifetážové testovací sady (Promega) a luminometru Dynex MLX.

4 · 4 4 4

4444 4 ·

Získané výsledky jsou uvedené na histogramu na obrázku 2. Účinnost transfekce je vyjádřena exprimaci luciferázy v pg/jamka. Je třeba poznamenat, že maximální transfekce pg/jamka.

je přibližně 500

Závěrem tento, příklad jasně ukazuje, že sloučeninu 2 podle předkládaného vynálezu pro schopných vyvolat přenos je možné použít přípravu komplexů

DNA do buněk in vitro.

Příklad 7

Použití sloučeniny 2 pro in vivo přenos DNA

Tento příklad ilustruje předkládaného vynálezu transfekovat schopnost transfekčních činidel podle

DNA do buněk in vivo.

In vivo přenos genu se provádí na myších Balb/C pomocí intratracheálního, nitrožilního a nitrosvalového podávání.

V případě nitrosvalové injekce každá myš dostane 30 μΐ prostředku obsahujícího 15 μg plasmidu DNA do předního svalu holeně. Tkáně se vyjmou 7 dní po injekci a zmrazí se a skladují při -80 °C, když se čeká na provedení testu aktivity luciferázy.

V případě nitrožilních injekcí každá myš dostane 200 μΐ prostředku obsahujícího 50 ^g plasmidu DNA. Tkáně se vyjmou 24 hodin po injekci a skladují se stejným způsobem, jako bylo uvedeno výše.

Obrázek 3 ilustruje aktivitu komplexů tvořených sloučeninou 2, pro in vivo přenos genu pomocí nitrosvalové injekce. Tyto výsledky jasně ukazují, že vznik komplexů se sloučeninou 2 podle předkládaného vynálezu a DNA umožňuje zvýšit přenos jmenované

DNA do buněk in vivo. '

	.....
	·· ♦ i·· · ·’· • ·	·· ♦· • · · • · ···	44 · • 4 4 4 • 44
	• 4 . '· · · · · · ·	• · · 4 . • 4 ··	• · · 4 · 4 4 4
59

Podobně je možné použít jakékoli transfekcní činidlo definované podle vynálezu pro zvýšení přenosu DNA do buněk tkání jaké typu.

Claims (27)

1. Činidla pro přenos můstek chemicky vázaný méně jednomu hydrofilnímu substituentu.

nukleových zaprvé k polýkationtu a za druhé k nejkyselin obsahující hydrofobní

2. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 1, kde jmenovaný hydrofobní můstek obsahuje 2 nebo 3: uhlovodíkové lineární mastné řetězce obsahující 10 až 20 atomů uhlíku na řetězec, kdy každý řetězec je popřípadě jinak dlouhý, nebo jmenovaný hydrofobní můstek obsahuje velmi dlouhý uhlovodíkový lineární mastný řetězec obsahující 20 áž 50 atomů uhlíku.

3. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 1, kde hydrofilní substituent(y) je (jsou) vybrán(y) ze skupiny, kterou tvoří hydroxylové nebo amino substituenty, polyoly, cukry nebo hydrofilní peptidy.

4. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 1 nebo 3, kde nejméně jeden hydrofilní substituent je cukr.

5. Činidla pro přenos obecného vzorce I: nukleových kyselin podle nároku 1 o /(CZj)—X N ^X(CZ,)—Y (I) kde: - R je polykation, - Z je atom vodíku nebo atom fluoru, kdy různé skupiny Z j sou

na sobě nezávislé a ··«····099

0 · · ι» 9 9 9 9 ·· 9 • '· 9 O 9 99· 9 99 • 9*999 ♦···9 • « 9-9 9 9 · ·· **** 99· ·· ·· ®··*·

- buď x a y jsou nezávisle na sobě celé číslo 10 až 22 včetně a X a Y jsou nezávisle na sobě atom vodíku, skupina -OAlk, kde Alk je přímá nebo,rozvětvená alkylové Skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxylová skupina, aminoskupina, polyolová skupina, cukr, hydrofilní nebo nehydrófilní peptid nebo oligonukleotid, přičemž se rozumí, že nejméně jedna ze skupin X a Y je hydrofilní skupina vybraná z hydroxylové skupiny, aminoskupiny, polyolové skupiny, cukrů nebo hydrofilních peptidů,

- nebo x je rovno 0 nebo 1, y je celé číslo 20 až 50, X je buď atom vodíku nebo skupina -OAlk, kde Alk je přímá nebo rozvětvená alkylové skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a Y je hydrofilní skupina vybraná z hydroxylové skupiny, aminoskupiny, polyolové skupiny, cukrů nebo hydrofilních peptidů, pokud je to vhodné, v izomerní formě, a také jejich směsi nebo jejich soli, pokud mohou existovat.

6. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároků 1 až 5 obecného vzorce III:

O

Jl· /(CH,)—x

R ~'N ; . <^ΙΠ>

^X(CH,)— Y kde:

- R je polykation, a

- buď x a y jsou nezávisle na sobě celá čísla 10 až 22 včetně, a X a Y jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo cukr, přičemž se rozumí, že nejméně jeden ze substituentů X a Y je cukr,

- nebo x je rovno 0 nebo 1, y je celé číslo 20 áž 50, X je atom vodíku a Y je cukr, ·· Φ·

Φ Φ ·

Φ · Φ Φ Φ • Φ Φ Φ

Φ Φ Φ nebo pokud je to vhodné, v izomerní formě, á také jejich směsi jejich soli, pokud mohou existovat.

7. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku . 6, . kde x a ý jsou nezávisle na sobe celá čísla 10 až 22 včetně a jedna ze skupin X a Y je atom vodíku a druhá je cukr.

8. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle jednoho z nároků 1 a 5 až 7, kde jmenovaný polykation je lineární.nebo rozvětvený polyamin, kdy každá aminoskupina je oddělená jednou nebo více methylenovými skupinami.

9. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 8, kde jmenovaný polykation má obecný vzorec II:

N (Π) kde

- R_x, R₂ a R₃ jsou nezávisle ná sobě atom, vodíku a skupina (CH₂)qNR'R, kde q je celé číslo 1 až 6, je nezávislé pro. různé skupiny R_x, R₂ a R₃, přičemž se rozumí, že nejméně jedna skupina R_1Z R₂ a R₃ je jiná, než atom vodíku,

- R' a R jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo skupina (CH₂)qNH₂, kde q je definováno výše,

- m je celé číslo 1 až 6, a

-nap jsou nezávisle na sobě celá čísla 0 až 6, přičemž když n je větší nebo rovno 2, m může mít ve vzorci II různé hodnoty a R₃ různé významy a když n je rovno 0, nejméně jeden ze substituentů R₃ a R₂ je jiný, než atom vodíku.

·· <4 ···· o · ·<» « · ·· • Φ o······ • 4 · O 4 4 4 4 44 • · O·· ·44

0444 4*4 44 444·

10. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle jednoho z nároků 1 a 5 až 7, kde jmenovaný; polykat ion je 'vybraný ze skupiny, kterou tvoří spermin, spermidin, cadaverin, putrescin, hexamethylentetramin (hexamin), methakrylamídopropyltrimethylamoniumchlorid (AMBTAC), 3-akrylamido-3-methylbutyltrimethylamoniumchlorid (AMBTAC), polyvinylaminy, polyethyleniminy nebo ioneny.

11. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle jednoho z nároků 3 až 7, kde cukr(y) je (jsou) molekula nebo molekuly mono-, oligo- nebo polysacharidu.

12. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 11, kde

jmenovaný cukr(y) je (jsou) vybrán(y) ze skupiny, kterou tvoří glukóza, mannóza, rhamnóza, galaktóza, fruktóza, maltóza, lak- tóza, sacharóza, fukóza, cellobióza, allóza, laminarabióza,

gentiobióza, soforóza, melibióza, dextran, oc-amylóza, amylopektin, fruktany, mannany, xylany a arabinany.

13. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 5, kde jmenovaným oligonukleotidem je jakýkoli řetězec obsahující jeden nebo více nukleotidů, deoxynukleotidů, ribonukleotidů a/nebo deoxyribonukleotidů, popřípadě kondenzovaných k jedné nebo více molekulám, které mají odlišné vlastnosti.

14. Činidla pro přenos nukleových kyselin podle nároku 5, kde jmenovaným peptidem je jakýkoli řetězec obsahující jednu nebo více aminokyselin vázaných navzájem prostřednictvím vazeb peptidové povahy, popřípadě substituovaných jednou nebo více alifatickými skupinami, které mohou být nasycené nebo nenasycené a lineární, rozvětvené nebo cyklické.

-: ·-· «β.

·· « · • <»

9'1 ·

Ο · 9

9 · · • · • 9 ··

15. Přenosové činidlo podle nároku 1 vzorce:

\ činidlo podle nároku 1 vzorce:

NH, činidlo podle nároku 1 vzorce:

H ,N

NH-,

18. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo pro přenos nukleových kyselin podle kteréhokoli z nároků 1 až 17 a nukleovou kyselinu.

19. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina.

20. Kompozice podle nároku 18 nebo 19, vyznačuj ící se t í m , že jmenovaná nukleová kyselina obsahuje jeden nebo více genů terapeutického významu _:pod kontrolou regulačních sekvencí .

,·< V * γυχ*' ₍ ^; ·· Λ ·· ···« · ···<· ο · ····· • <· ο · ··· · ·· • · · ο ······· • I» 0 · · · · ··

999· 999 99 99 99···

21. Kompozice podle nároků 18 až 20, vyznačující se t í m , že jmenovaná nukleová kyselina je antisense sekvence nebo gen.

22 . Kompozice podle nároku 18, v y z n a č u j ,í c í s e t í m , že také obsahuje jednu nebo více přísad. 23 . Kompozice podle nároku 22, . v y z n a č u j í c í s e t í m , že přísadou je jeden nebo více neutrálních lipidů • 24 . Kompozice podle nároku 23 , v y z n ač u j ící s e t í m , že neutrálními lipidy j sou lipidy obsahuj ící dva mastné

řetězce. .

25. Kompozice podle nároků 23 a 24, Vyznačující se tím, že neutrálními lipidy jsou přírodní nebo syntetické lipidy, které jsou za fyziologických podmínek obijetnými ionty nebo nemají iontový náboj, vybrané například ze .skupiny, kterou tvoří dioleylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -myristoylfosfatidylethanolaminy a také jejich deriváty, které jsou jednou až třikrát N-methylováné; fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (jako jsou zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (jako jsou například sfingomyeliny) nebo asialogangliosidy (jako jsou Zejména asialoGMl a GM2) .

26. Kompozice podle nároku 22, vyznačující -se tím, že jmenovanou přísadou jé sloučenina, která je zahrnuta přímo nebo nepřímo při kondenzaci nukleové kyseliny.

27. Kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že jmenovaná přísada je odvozena, úplně nebo částečně, od protaminu, od histonu nebo od nukleolinu a/nebo od jednoho z jejich derivátů nebo se skládá, úplně nebo částečně, z pep- • <1 • · * · · ·

I» l>

tidových jednotek (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA) , kdy se počet jednotek pohybuje' mezi 2 až 10 a jednotky se popřípadě opakují nepřetržitě nebo přetržitě.

28. Kompozice podle nároků 18 až 27, vyznačuj ící se tím, že obsahuje vehikulum, které je farmaceuticky přijatelné pro injekční prostředky.

29. Kompozice podle nároků 18 až 27, vyznačuj í c í se tím, že obsahuje vehikulum, které je farmaceuticky přijatelné pro aplikaci na kůži a/nebo sliznici.

30. Použití přenosového činidla, definovaného podle nároků 1 až 17, pro přípravu léčiva určeného pro léčení onemocnění.

31. Způsob léčení člověka nebo živočicha, vyznačuj ící se t í m , že zahrnuje následující kroky:

'b (1) uvedení nukleové kyseliny dó styku s transfekčním činidlem definovaným podle nároků 1 až 17 za vzniku komplexu a (2) uvedení buněk člověka nebo živočicha do styku s komplexem vzniklým v (1) .

32. Způsob přenosu nukleových kyselin do buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(1) uvedení nukleové kyseliny do styku s definovaným transfekč ním činidlem za vzniku komplexu a (2) uvedení buněk do styku s komplexem vzniklým v (1).

33. Způsob přenosu nukleových kyselin do buněk podle nároků 31 nebo 32, vyznačující se tím, že jmenované transfekční činidlo a/nebo jmenovaná nukleová kyselina se předem smísí s jednou nebo více přísadami definovanými podle nároků 22 až 27.