WO2000032803A2 - Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs utilisations - Google Patents

Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs utilisations Download PDF

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WO2000032803A2
WO2000032803A2 PCT/FR1999/002995 FR9902995W WO0032803A2 WO 2000032803 A2 WO2000032803 A2 WO 2000032803A2 FR 9902995 W FR9902995 W FR 9902995W WO 0032803 A2 WO0032803 A2 WO 0032803A2
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amino
transfer agents
mmol
hydrophilic
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PCT/FR1999/002995
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Jean Herscovici
Hans Hofland
Christophe Jacopin
Daniel Scherman
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Aventis Pharma S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to new transfer agents, the compositions containing them and their uses for the in vitro, in vivo or ex vivo transfer of nucleic acids into cells.
  • nucleic acids into cells have become a basic technique with many biotechnological applications. It may be the transfer of nucleic acids into cells in vitro, for example for the production of recombinant proteins, or in the laboratory for the study of the regulation of gene expression, the cloning of genes or any other manipulation involving DNA. It can also involve the transfer of nucleic acids into cells in vivo, for example for the production of vaccines, labeling studies or also therapeutic approaches. It may also involve the transfer of genes into cells taken from an organism, with a view to their subsequent re-administration, for example for the creation of transgenic animals.
  • lipids comprising a quaternary ammonium group (for example DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE, etc.), lipopolyamines such as, for example, DOGS, DC-Chol or the disclosed lipopolyamines in patent application WO 97/18185, lipids combining both a quaternary ammonium group and a polyamine such as DOSPA, or alternatively lipids comprising various other cationic entities, in particular amidinium groups (for example ADPDE, ADODE or the lipids of patent application WO 97/31935).
  • the structural diversity of cationic lipids partly reflects the observation of the structure-activity relationship.
  • charge ratio means the ratio of the positive charges of the transfer agent to the negative charges of DNA. This ratio is often expressed in nmoles of transfer agent per ⁇ g of DNA.
  • transfecting agents developed by the applicant, and which are the subject of the present invention, propose to solve. Indeed, their particular structure forms a hydrophobic anchor linked on the one hand to a polycation which allows the formation of complexes with nucleic acids and on the other hand to at least one hydrophilic head which makes it possible to decrease the apparent overall charge density of these transfecting agents with respect to lipids or cationic polymers conventionally used in non-viral transfection.
  • the presence of at least one hydrophilic head creates a sort of “charge screen” by reducing the zeta potential of the complexes formed with the nucleic acid.
  • said complexes appear less cationic to the organism, with the beneficial consequences which result therefrom.
  • the transfecting agents according to the present invention are particularly advantageous from a physicochemical point of view since they are particularly stable when they are brought into contact with nucleic acids at low charge ratios.
  • a first object of the invention relates to new nucleic acid transfer agents which comprise a hydrophobic spacer linked chemically on the one hand to a polycation and on the other hand to at least one hydrophilic substituent.
  • the hydrophobic spacer has a dual function. On the one hand, it allows passage through cell membranes, and on the other hand, it makes the complexes formed with nucleic acids viable in biological medium. Indeed, the hydrophobic spacer creates a physical constraint on the complexes which makes it possible to protect the nucleic acids from the external environment. The hydrophobicity necessary for the complexes to be viable can be easily determined by a person skilled in the art, by application of ordinary research methods or by the usual method of trial and error. Finally, the presence of the hydrophilic substituent (s) makes it possible to reduce the zeta potential of the complexes formed, which causes said less cationic complexes to appear in the outside environment.
  • polycation is a linear or branched polycationic molecule capable of associating with nucleic acids.
  • association with nucleic acid means any type of bond, such as, for example, covalent bonds, electrostatic, ionic interactions, hydrogen bridges, etc.
  • the polycation is a linear or branched polyamine , each amino group being separated by one or more methylene groups.
  • the polyamine may also be substituted by other cationic functions, for example amidinium or guanidinium groups, cyclic guanidines, etc.
  • the polycation represents a polyamine of general formula (II) in which :
  • R - R ,, R 2 and R 3 represent independently of each other a hydrogen atom or a group (CH 2 ) q NR'R "with q an integer which can vary from 1 to 6, this independently between the different groups R réelleR, and R 3 , it being understood that at least one of R ,, R 2 and R 3 is different from a hydrogen atom,
  • R - R 'and R independently of one another represent a hydrogen atom or a group (CH 2 ) q NH 2 with q defined as above,
  • - m represents an integer between 1 and 6, and - n and p independently represent whole numbers between 0 and 6, with when n is greater than or equal to 2, m can take values and R 3 have different meanings within the general formula (II), and when n is equal to 0, at least one of the substituents R, and R 2 is different from a hydrogen atom.
  • polycations can also be chosen from spermine, spermidine, cadaverine, putrescine, hexamethylenetetramine (hexamine), methacrylamidopropyl-trimethylammonium chloride (AMBTAC), 3-acrylamido-3-methylbutyltrimethylammonium chloride ( AMBTAC), polyvinylamines, polyethyleneimines, or even ionenes.
  • the hydrophobic spacer can take very varied structures as long as it provides sufficient hydrophobicity to allow protection of the nucleic acids and passage through the membranes. This sufficient hydrophobicity can be determined by a person skilled in the art by applying research methods. ordinary.
  • the hydrophobic spacer consists of 2 or 3 linear fatty hydrocarbon chains (that is to say between 10 and 20 carbon atoms per chain, and preferably 12, 14, 15, 16, 17, or 18 carbon atoms per chain, each chain can be of different length).
  • the hydrophobic spacer consists of a very long linear fatty hydrocarbon chain, that is to say comprising between 20 and 50 carbon atoms, and preferably between 40 and 50 carbon atoms and even more preferably between 44 and 50 carbon atoms).
  • Suitable hydrophilic substituents are for example chosen from hydroxy, amino substituents, polyols, sugars, or also hydrophilic peptides.
  • Polyol is understood to mean any linear, branched or cyclic hydrocarbon molecules comprising at least two hydroxy functions.
  • glycerol ethylene glycol, propylene glycol, tetritols, pentitols, cyclic pentitols (or quercitols), hexitols such as mannitol, sorbitol, dulcitols, cyclic hexitols or inositols etc.
  • the transfer agents according to the invention comprise at least one hydrophilic substituent which is a sugar.
  • the term “sugar” means any molecule consisting of one or more saccharides. Mention may be made, by way of example, of sugars such as pyranoses and furanoses, for example glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, or even maltose, lactose, saccharose, sucrose, fucose, cellobiose, allose, laminarabiose, gentiobiose, sophorose, melibiose etc.
  • the sugar or sugars are chosen from glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, lactose , sucrose and cellobiose.
  • it can also be so-called "complex" sugars, that is to say several sugars covalently coupled to each other, each sugar preferably being chosen from the list cited above.
  • suitable polysaccharides mention may be made of dextran, ⁇ -amylose, amylopectin, fructans. mannans, xylans and arabinans.
  • Some sugars preferred can also interact with cellular receptors, such as certain types of lectins.
  • transfer agents according to the invention can be represented by the general formula (I):
  • - Z represents a hydrogen atom or a fluorine atom, the different Z being independent of each other, and - either x and y, independently of one another, represent integers between 10 and 22 inclusive, and X and Y, independently of one another, represent a hydrogen atom, an -OAlk group where Alk represents a straight or branched alkyl containing 1 to 4 carbon atoms, a hydroxy group, an amino group, a polyol, a sugar, a hydrophilic or non-hydrophilic peptide, or an oligonucleotide, it being understood that at least one of the substituents X and Y represents a hydrophilic group chosen from hydroxy, amino, polyols, sugars, or hydrophilic peptides,
  • x is equal to 0 or 1
  • y is an integer between 20 and 50
  • X is either a hydrogen atom or a group -OAlk where Alk represents a straight or branched alkyl containing 1 to 4 carbon atoms
  • Y is a hydrophilic group chosen from hydroxy, amino, polyols, sugars, or hydrophilic peptides.
  • polycation the polyols and the sugars of the general formula (I) are as defined above.
  • x and y are defined in the general formula (I) so as to take any value between 10 and 22 inclusive or between 20 and 50 inclusive depending on the case.
  • x and y independently of one another, are between 12 and 18 inclusive. More preferably, x and y are, independently of one another, 14, 15, 16, 17 or 18.
  • y is preferably between 30 and 50, or between 40 and 50. More preferably, it is between 44 and 50.
  • oligonucleotide means chains containing one or more nucleotides, deoxynucleotides, ribonucleotides and / or deoxyribonucleotides which are monomeric units which differ from one another by the presence of bases which can be chosen from adenine, guanine, cytosine, thymidine or uracil [see Lehninger Biochemistry, Flammarion Médecine Sciences, 2nd edition, p. 305-329]. Owing to their property in forming base pairs, oligonucleotides are widely used in molecular biology, for example as linkers or as probes.
  • the oligonucleotides can also be used in the form of conjugates, that is to say coupled to one or more other molecules having distinct properties.
  • conjugates that is to say coupled to one or more other molecules having distinct properties.
  • conjugates described in Bioconjugate Chemistry [John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: a Review oftheir Synthesis and properties, Vol. 1, No. 3, 1990, pp.
  • oligonucleotides can be obtained according to the conventional methods known to those skilled in the art, and it is also possible to synthesize oligonucleotides modified according to the methods described in Bioconjugate Chemistry, John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: a Review of their Synthesis and properties, Vol. 1, No. 3, 1990, pp. 165-187 or in Tetrahedron, Beaucage et al., 772nd Synthesis of Modified ⁇ Oligonucleotides by the Phosphoramiditeb Approach and Their Application, Vol. 49, No. 28, pp. 6123-6194, 1993.
  • peptide is intended to mean chains containing one or more amino acids linked together by bonds of peptide nature [Lehninger Biochimie, Flammarion Médecine Sciences, 2nd edition]. These can be the 20 "classic” amino acids, that is to say those commonly found in the composition of proteins (Alamine, Valine, Leucine, Isoleucine, Proline, Phenylalamine, Tryptophan, Methionine, Aspartic Acid, Glutamine, Lysine, Arginine, Histidine, Glycine, Serine, Threonine, Cysteine, Tyrosine, Asparagine, Glutamic Acid), or it can also be the so-called "rare” amino acids such as 4-hydroxyproline, desmosine, 5 -hydroxylysine, N-methyllysine, 3-methylhistidine, episodesmosine etc.
  • amino acids appearing in different cells or various tissues in free or combined form may also be the amino acids appearing in different cells or various tissues in free or combined form and which generally derive from ⁇ acids -aminated (for example ⁇ -alamine, ⁇ -aminobutyric acid, homocysteine, ornithine, canavanine, djenkalic acid, ⁇ -cyanoalamine etc.).
  • ⁇ acids -aminated for example ⁇ -alamine, ⁇ -aminobutyric acid, homocysteine, ornithine, canavanine, djenkalic acid, ⁇ -cyanoalamine etc.
  • Such peptides can for example allow targeting of certain cell types.
  • linear or cyclic peptide or pseudopeptide sequences comprising the Arg-Gly-Asp epitope (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) for recognition of the primary and / or secondary receptors for adhesion proteins of the integrin type.
  • the peptides according to the invention can also be substituted at the level of one or more of their functional groups, for example at the level of the ⁇ carboxyl, of the amino function in ⁇ and / or at the level of the functional groups of the side chain of each of the amino acids.
  • substitutions with saturated or unsaturated, linear, branched or cyclic aliphatic groups containing 1 to 24 carbon atoms such as for example cholesteryl, arachidonyl or retinoyl radicals, or alternatively mono- or polyaromatics such as, for example, substituted or unsubstituted benzyloxycarbonyl, benzylester or rhodaminyl derivatives.
  • cholesteryl arachidonyl or retinoyl radicals
  • mono- or polyaromatics such as, for example, substituted or unsubstituted benzyloxycarbonyl, benzylester or rhodaminyl derivatives.
  • hydrophilic substituent these are chosen from hydrophilic peptides, that is to say peptides consisting only of hydrophilic amino acids or those partially composed of hydrophilic amino acids and the composition makes them generally hydrophilic.
  • the Z groups all represent hydrogen atoms.
  • the transfer agents have the general formula (III):
  • x and y independently of one another, represent integers between 10 and 22 inclusive
  • X and Y independently of each other, represent a hydrogen atom or a sugar, being it being understood that at least one of the substituents X and Y represents a sugar, - either x is equal to 0 or 1, y is an integer between 20 and 50, X is a hydrogen atom and Y is a sugar.
  • the polycation, the sugars and x and y in the general formula (III) are as defined above for the general formula (I).
  • More particularly preferred transfer agents are of general formula (III) and x and y, independently of one another, represent integers between 10 and 22 inclusive, and one of X and Y represents an atom d hydrogen and the other a sugar.
  • the transfer agents according to the invention have the general formula (III) and x is equal to 0, y is an integer between 40 and 50, X represents a hydrogen atom, and Y is a sugar.
  • the present invention also relates to the isomers of the products of general formula (I) when they exist, as well as their mixtures, or their salts.
  • the compounds of the invention can be in the form of non-toxic and pharmaceutically acceptable salts.
  • non-toxic salts include the salts with mineral acids (for example hydrochloric, sulfuric, hydrobromic, phosphoric, nitric), with organic acids (acetic, propionic, succinic, maleic, hydroxymaleic, benzoic, fumaric, methanesulfonic or oxalic), with mineral bases (soda, potash, lithine, lime), or with organic bases (tertiary amines such as triethylamine, piperidine, benzylamine).
  • mineral acids for example hydrochloric, sulfuric, hydrobromic, phosphoric, nitric
  • organic acids acetic, propionic, succinic, maleic, hydroxymaleic, benzoic, fumaric, methanesulfonic or oxalic
  • mineral bases for example hydrochloric, sulfuric, hydrobromic, phosphoric, nitric
  • organic acids
  • An alkyl chain containing x carbon atoms (x being defined as above), comprising a hydroxy function and an ester function, is firstly prepared by opening a corresponding lactone.
  • the reaction is generally carried out in an alcohol, at basic pH and at a temperature between -10 ° C and room temperature.
  • the alcohol can be methanol or ethanol.
  • group X is fixed to the bifunctional alkyl chain obtained in the previous step.
  • X represents a sugar
  • condensation is carried out in a chlorinated solvent, such as, for example, dichloromethane or chloroform, and in the presence of a Lewis acid, at a temperature between -5 ° C. and 10 ° C.
  • Lewis acid can for example be chosen from tin chloride, iron chloride, p-toluene sulfonic acid (tsOH), trimethylsillyltrifluoromethane sulfonic (TMStf), boron trifluoride etherate etc. [Kazunobu Toshima et al., Recent Progress in O-glcosilation Methods and its Application to Natural Products Synthesis, Chem. Rev. 1993, Vol. 93, pp. 1503-1531].
  • X represents a hydrophilic peptide group or not
  • peptide coupling is carried out according to conventional methods (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed.
  • the reaction is generally carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 1 1.
  • a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 1 1.
  • the chloroform, dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, dichloromethane, toluene or benzene can be used as a solvent.
  • the non-nucleophilic bases used are preferably tertiary amines, calcium carbonate or sodium dicarbonate.
  • the bases used are tertiary amines such as, for example, triethylamine (TEA) or N-ethyldiisopropylamine.
  • TAA triethylamine
  • N-ethyldiisopropylamine a tertiary amine
  • the peptide coupling is carried out between 0 and 50 ° C, and preferably between 10 and 30 ° C.
  • X represents an —OAlk group
  • the alcohol function is alkylated according to the conventional methods known to a person skilled in the art or by analogous methods.
  • a diazo compound of formula can be reacted general Alk-N 2 optionally in the presence of a catalyst such as HBF 4 or silica gel.
  • a catalyst such as HBF 4 or silica gel.
  • We can also operate under the conditions of the Williamson Reaction which consists in reacting in basic medium a compound of general formula Alk-Hal where Hal represents a halogen atom such as chlorine, bromine or iodine, on the chain carrying an alcohol function.
  • X represents an oligonucleotide
  • it is coupled to the bifunctional chain according to the conventional methods known for covalently grafting an oligonucleotide.
  • said oligonucleotide can be grafted via a suitable linker.
  • ester function present on the bifunctional chain is hydrolyzed to an acid function according to known methods. For example, one can operate in a basic medium in an alcohol with a high boiling point, at a temperature between 50 ° C. and the reflux temperature of the reaction mixture.
  • the reaction is generally carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 11.
  • a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 11.
  • a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C.
  • suitable aprotic solvents for example, chloroform , dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, dichloromethane, toluene or benzene can be used as solvent.
  • the non-nucleophilic bases used are preferably tertiary amines, carbonate of calcium or sodium dicarbonate. Even more preferably, the bases used are tertiary amines such as, for example, triethylamine (TEA)
  • the peptide coupling is carried out between 0 and 50 ° C, and preferably between 10 and 30 ° C.
  • the group of general formula (IV) is either commercially available or it can be obtained by condensation of Y on the corresponding unsubstituted alkylamine according to a method analogous to that described previously in 2).
  • the amide obtained in the previous step is then reduced to an amine.
  • This is done according to conventional methods known to those skilled in the art.
  • an anhydrous organic solvent such as anhydrous tetrahydrofuran
  • LiAlH 4 lithium aluminum hydride
  • Other reducing agents which can be used are for example borane, borane in dimethylsulfide (BH 3 - SMe 2 ), sodium borohydride / titanium tetrachloride (NaBH 4 , TiCl 4 ), phosphorus oxide chloride on Zinc (POCl 3 / Zn), phosphorus pentasulfide (P 4 S 10 ) on Raney nickel, etc.
  • borane borane in dimethylsulfide
  • NaBH 4 , TiCl 4 sodium borohydride / titanium tetrachloride
  • P 4 S 10 phosphorus pentasulfide
  • the acid derivative corresponding to polycation R as defined above is coupled to the compound of general formula (IV) obtained in the previous step, according to conventional peptide coupling methods (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) or by any analogous method known to those skilled in the art.
  • the reaction is generally carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 11.
  • the non-nucleophilic bases used are preferably tertiary amines, calcium carbonate or sodium dicarbonate. Even more preferably, the bases used are tertiary amines such as, for example, triethylamine (TEA) or N-ethyldiisopropylamine.
  • TAA triethylamine
  • N-ethyldiisopropylamine the peptide coupling is carried out between 0 and 50 ° C, and preferably between 10 and 30 ° C.
  • the acid derivatives corresponding to the polycation are commercially available.
  • the transfecting agents according to the present invention can be prepared by operating as follows:
  • An alkyl chain containing x carbon atoms (x being defined as above), comprising a hydroxy function and an ester function, is firstly prepared by opening a corresponding lactone.
  • the reaction is generally carried out in an alcohol, at basic pH and at a temperature between -10 ° C and room temperature.
  • the alcohol can be methanol or ethanol.
  • the reaction is carried out at a temperature above the melting point of each product, with or without vacuum.
  • the reaction can also be carried out at reflux temperature in the presence of an alcoholic solvent.
  • the solvent can be methanol or ethanol.
  • reaction can also be carried out at reflux temperature of the mixture in the presence of an alcohol such as methanol as solvent.
  • Another alternative consists in coupling the compound of general formula (IV) directly with the lactone (in this case, the first step of opening the lactone is not carried out).
  • the group of general formula (IV) is either commercially available or it can be obtained by condensation of Y on the corresponding unsubstituted alkylamine according to a method analogous to that described above.
  • the acid derivative corresponding to polycation R as defined above is coupled to the compound of general formula (VI) obtained in the previous step, according to conventional peptide coupling methods (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) or by any analogous method known to those skilled in the art.
  • the reaction is generally carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents, at a temperature between 0 and 100 ° C., the pH being adjusted between 9 and 11.
  • chloroform dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, dichloromethane, toluene or benzene can be used as solvent.
  • the non-nucleophilic bases used are preferably tertiary amines, calcium carbonate or sodium dicarbonate. Even more preferably, the bases used are tertiary amines such as, for example, triethylamine (TEA) or N-ethyldiisopropylamine.
  • TAA triethylamine
  • N-ethyldiisopropylamine tertiary amines
  • the peptide coupling is carried out between 0 and 50 ° C, and preferably between 10 and 30 ° C.
  • the acid derivatives corresponding to the polycation are commercially available.
  • nucleic acid transfer agents As an illustrative example of advantageous nucleic acid transfer agents according to the invention, mention may be made of the following compounds:
  • compositions comprising a nucleic acid transfer agent as defined above, and a nucleic acid.
  • the respective amounts of each component can be easily adjusted by those skilled in the art depending on the transfer agent used, the nucleic acid, and the desired applications (in particular the type of cells to be transfected).
  • nucleic acid is understood to mean both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid. They may be natural or artificial sequences, and in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA
  • CDNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • tRNA transfer RNA
  • RRNA hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences, modified or unmodified oligonucleotides.
  • These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. They can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries. They can be chemically modified.
  • deoxyribonucleic acids can be single or double stranded as well as short oligonuleotides or longer sequences.
  • the nucleic acids advantageously consist of plasmids, vectors, episomes, expression cassettes, etc.
  • deoxyribonucleic acids can carry an origin of functional or non-functional replication in the target cell, one or more marker genes, transcription or replication regulatory sequences, genes of therapeutic interest, modified or unmodified antisense sequences, regions to other cellular components, etc.
  • the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic interest under the control of regulatory sequences, for example one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • regulatory sequences for example one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • the term “gene of therapeutic interest” is understood to mean any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can in particular be a protein or a peptide.
  • This protein product can be exogenous homologous or endogenous with respect to the target cell, that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology.
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, activity modified, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 92/03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc.
  • BDNF trophic factors
  • CNTF NGF
  • IGF IGF
  • GMF aFGF
  • bFGF thelial growth factor
  • NT3, NT5 HARP / pleiotrophin
  • apolipoproteins (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91/1 1947), the CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), genes coding for factors involved in coagulation (Factors VII, VIII, IX), genes involved in DNA repair, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), genes of hemoglobin or other protein transporters, enzymes of metabolism, catabolism etc.
  • the nucleic acid of therapeutic interest can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic genes also include the sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).
  • the nucleic acid can also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response.
  • the invention makes it possible to carry out either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming virus", d other viruses or tumor-specific antigenic peptides (EP 259,212).
  • the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the gene of therapeutic interest and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ.
  • sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • promoters of the E1A, MLP, CMV, RSV, etc. genes can be modified by adding activation, regulation sequences, etc. It can also be a promoter, inducible or repressible.
  • the nucleic acid can also comprise, in particular upstream of the gene of therapeutic interest, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the nucleic acid may also include a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
  • the compositions according to the invention may also comprise one or more adjuvants capable of associating with the transfer agent / nucleic acid complexes and of improving their transfecting power.
  • the present invention therefore relates to compositions comprising a nucleic acid, a nucleic acid transfer agent as defined above and at least one adjuvant capable of associating with the transfer agent complexes / nucleic acid and improve its transfecting power.
  • a nucleic acid transfer agent as defined above
  • at least one adjuvant capable of associating with the transfer agent complexes / nucleic acid and improve its transfecting power.
  • the presence of this type of adjuvant lipids, peptides or proteins for example
  • the compositions of the invention can comprise, as an adjuvant, one or more neutral lipids.
  • the neutral lipids used in the context of the present invention are lipids with two fatty chains.
  • natural or synthetic lipids are used, zwitterionic or devoid of ionic charge under physiological conditions. They can be chosen more particularly from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), distearoyl, - palmitoyl, -mirystoylphosphatidylethanolamines as well as their N-methylated derivatives, phosphatidyl glycols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelines) or also asialogangliosides (such as in particular asialoGMl and GM2).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • POPE oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine
  • lipids can be obtained either by synthesis or by extraction from organs (example: the brain) or eggs, by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • extraction of natural lipids can be carried out using organic solvents (see also
  • a compound intervening or not directly at the level of the condensation of said nucleic acid such as those described in patent application WO 96/25508.
  • the presence of such a compound, within a composition according to the invention, makes it possible to reduce the amount of transfecting agent, with the beneficial consequences which result therefrom from the toxicological point of view, without causing any damage to the activity. transfectant.
  • compound involved in the condensation of nucleic acid is meant to define a compacting compound, directly or indirectly, nucleic acid.
  • this compound can either act directly at the level of the nucleic acid to be transfected or intervene at the level of an annex compound which is directly involved in the condensation of this nucleic acid.
  • the precompacting agent can be any polycation, for example polylysine.
  • the agent involved in the condensation of the nucleic acid derives in whole or in part from a protamine, a histone, or a nucleoline and / or one of their derivatives.
  • Such an agent can also consist, in whole or in part, of peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units can vary between 2 and 10.
  • these units can be repeated continuously or not. Thus they can be separated by links of a biochemical nature, for example by one or more amino acids, or of a chemical nature.
  • compositions of the invention comprise from 0.01 to 20 equivalents of adjuvant for one equivalent of nucleic acid in mol / mol and, more preferably, from 0.5 to 5.
  • compositions according to the present invention further comprise a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid.
  • This targeting element can be an extracellular targeting element making it possible to direct the transfer of DNA to certain, cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatic cells, hematopoietic cells, etc.). It can also be a targeting element intracellular allowing to direct the transfer of the nucleic acid towards certain privileged cellular compartments (mitochondria, nucleus etc.).
  • the targeting element can be linked to the nucleic acid transfer agent according to the invention, or also to the nucleic acid as has been specified above. When the targeting element is linked to the nucleic acid transfer agent of general formula (I), the latter preferably constitutes one of the substituents X or Y.
  • sugars, peptides, proteins, oligonucleotides, lipids, neuromediators, hormones, vitamins or their derivatives there may be mentioned sugars, peptides or proteins such as antibodies or antibody fragments, ligands of cellular receptors or fragments thereof, receptors or fragments of receptors, etc.
  • they may be ligands for growth factor receptors, cytokine receptors, cell lectin receptors, or ligands with RGD sequence with an affinity for adhesion protein receptors such as integrins. Mention may also be made of the transferrin, HDL and LDL receptors, or the folate transporter.
  • the targeting element can also be a sugar making it possible to target lectins such as receptors for asialoglycoproteins or for syalydes such as sialyl Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • lectins such as receptors for asialoglycoproteins or for syalydes such as sialyl Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • the association of the targeting elements with the nucleolipid complexes can be carried out by any technique known to those skilled in the art, for example by coupling to a hydrophobic part or to a part which interacts with the nucleic acid of the transfer agent according to the invention, or to a group which interacts with the transfer agent according to the invention or with the nucleic acid.
  • the interactions in question can be, according to a preferred mode, of ionic or covalent nature.
  • a subject of the invention is also the use of the compounds as defined above for the transfer of polynucleotides (and more generally of polyanions) in cells in vitro, in vivo or ex vivo. More specifically, the subject of the present invention is the use of the compounds as defined above for the preparation of a medicament intended for treating diseases, in particular diseases which result from a deficiency in a protein or nucleic product.
  • the polynucleotide contained in said drug encodes said protein or nucleic product, or constitutes said nucleic product, capable of correcting said diseases in vivo or ex vivo.
  • compositions according to the invention can be formulated for topical, cutaneous, oral administration. , rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal, intraperitoneal, etc.
  • the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa).
  • nucleic acids used for the injection may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of nucleic acids used for the injection as well as the number of administrations can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the mode of administration used, of the pathology concerned, of the gene to be expressed, or else the duration of the treatment sought.
  • the mode of administration it may be either a direct injection into the tissues, for example at the level of tumors, or into the circulatory tract, or a treatment of cultured cells followed of their reimplantation in vivo, by injection or graft.
  • the tissues concerned in the context of the present invention are for example the muscles, the skin, the brain, the lungs, the liver, the spleen, the bone marrow, the thymus, the heart, the lymph, the blood, the bones, cartilage, pancreas, kidneys, bladder, stomach, intestines, testes, ovaries, rectum, nervous system, eyes, glands, connective tissue, etc.
  • Another object of the present invention relates to a method of treatment of the human or animal body comprising the following steps: (1) bringing the nucleic acid into contact with a transfer agent as defined above, to form a complex , and
  • the invention further relates to a method for transferring nucleic acids into cells, comprising the following steps:
  • the contacting of the cells with the complex can be carried out by incubation of the cells with the said complex (for uses in vitro or ex vivo), or by injection of the complex into an organism (for uses in vivo).
  • the incubation is preferably carried out in the presence of, for example, from 0.01 to 1000 ⁇ g of nucleic acid per 10 6 cells.
  • doses of nucleic acid ranging from 0.01 to 10 mg can for example be used.
  • compositions of the invention additionally contain one or more adjuvants as defined above
  • the adjuvant (s) are mixed beforehand with the transfer agent according to the invention and / or with the nucleic acid.
  • the present invention thus provides a particularly advantageous method for the transfer of nucleic acids in vivo, in particular for the treatment of diseases, comprising the administration in vivo or in vitro of a nucleic acid coding for a protein or capable of being transcribed into a nucleic acid able to correct said disease, said nucleic acid being associated with a compound of general formula (I) under the conditions defined above.
  • the nucleic acid transfer agents of the invention are particularly useful for the transfer of nucleic acids into primary cells or into established lines. They can be fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic (lymphocytes, CD34, dendritics, etc.), epithelial etc., in differentiated or pluripotent forms (precursors).
  • the present invention also includes other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • the applicant proposes, without limitation, various operating protocols as well as reaction intermediates which may be used to prepare the transfer agents of general formula (I).
  • various operating protocols as well as reaction intermediates which may be used to prepare the transfer agents of general formula (I).
  • It is also for those skilled in the art to draw inspiration from the synthesis methods described in the various patent applications cited above for the synthesis of polycation R included in the general formula (I) (WO 96/17823, WO 97/18185 , WO 97/31935 etc.).
  • Figure 1 Schematic representation of the plasmid pXL2774 used in DNA transfer experiments in cells.
  • Figure 2 In vitro gene transfer activity in HeLa cells of the complexes formed from compound 2 according to the invention without co-lipid, or else in the presence of cholesterol and in the presence of DOPE as co-lipids.
  • the y-axis represents the expression of luciferase in pg / well.
  • the absentee axis indicates the transfecting agent / DNA ratio in nmol / ⁇ g of DNA.
  • Figure 3 In vivo gene transfer activity after direct injection into the anterior muscle of the mouse tibia of complexes formed from compound 2 according to the present invention in the presence of DOPE (1: 1).
  • the ordinate axis indicates the expression of luciferase in pg / muscle.
  • the absentee axis indicates the compound 2 / DNA ratio in nmoles / ⁇ g of DNA.
  • the starting polyamines such as spermidine, spermine, tris- (2-aminoethyl) amine, phenylenediamine, diaminoalkane etc.
  • the starting polyamines are commercially available or they can be synthesized by conventional methods (for example by cyanoethylation of commercially available amines to obtain branched amines)
  • Amberlite IR 120 is a commercial ion exchange resin (BDH catalog). • Dimethyl sulfoxide (DMSO), treated beforehand with potassium hydroxide, was distilled over calcium hydride and then stored on a 4 A molecular sieve.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • Tetrahydrofuran (THF) was distilled over sodium in the presence of benzophenone. • For reactions requiring anhydrous conditions, all glassware is flame dried under a stream of nitrogen.
  • the nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were recorded on a Brucker MSL 30 spectrometer at the frequency of 300 MHz for the proton and 75 MHz for the carbon. All chemical shifts are reported in ppm either relative to the frequency of tetramethylsilane (TMS), or relative to the solvent. The spectra were recorded using either the TMS or the residual solvent signal as an internal reference.
  • the multiplicity of signals is designated by the following abbreviations: s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet) and m (multiplet).
  • HPLC analyzes High Performance Liquid Chromatography
  • a Waters LC 4000 device equipped with a C4 type analytical column marketed by Applied Biosystem ("Brownlee Columns” in stainless steel 3 cm long and 0.46 cm diameter) and a "Waters 486" detector at 220 nm.
  • the stationary phase is 7 microns butyl aquapore, and the mobile phases are demineralized water (2500 cm 3 ) or acetonitrile (2500 cm 3 ) added with trifluoroacetic acid (2.5 cm 3 ).
  • the flow rate is 1 ml per minute.
  • Methyl 1-ol-pentadecanoate is obtained with a yield of 80%.
  • step c) 5.08 g of product obtained in step c) (9.34 mmol) in solution in 20 cm 3 of methanol are treated with 9.34 ml of 2N sodium methylate (18.68 mmol). When the reaction is complete, the reaction mixture is neutralized with Amberlite IR120, filtered and evaporated to dryness under vacuum.
  • H-6 1.27 (m, 14H, (CH 2 ) 25), 1.4-1.6 (m, 17H, OCH 2 ⁇ H 2 , H-17, H-14, H-17, H -37, H-40, H-41 and H-44), l, 46 (m, 36H, Boc), 2.8-2.9 (m, 6H, H-15, H-16 and H-35 ), 3.09-
  • step i) To a solution of the product obtained in previous step i) (0.072 g; 0.05 mmol), 10% palladium on carbon (0.032 g) is added in methanol. After one night, filter on glass paper and concentrate on a rotary evaporator. The product is then purified by HPLC on a preparative column of type C-4.
  • This example illustrates the preparation of complexes between a transfer agent according to the invention and a nucleic acid, their size having then been measured.
  • glycolipid used in this example and in the examples which follow is compound 2, in solution in chloroform, at a concentration of 10 mg / ml. In in some cases, a neutral co-lipid, cholesterol or DOPE, was previously mixed with compound 2.
  • the lipid solution is prepared as follows: a sample of the desired quantity is taken, the solvent is evaporated under a stream of argon and allowed to dry for 1 hour. Then, the lipid is rehydrated with a solution containing 5% dextrose and 10 mM sodium chloride overnight at 4 ° C. The next day, the lipid solutions are heated at 60 ° C for 5 minutes and then passed through ultrasound for 1 minute. The operation is repeated until the size of the lipid particles is stable.
  • the DNA used is the plasmid pXL3031 (FIG. 1) in solution in a mixture of 5% dextrose and 10 mM sodium chloride at a concentration of 0.5 mg / ml or 1.0 mg / ml.
  • This plasmid contains the read gene coding for luciferase under the control of the P / E CMV promoter of the cytomegalovirus. Its size is 3671 bp.
  • the diagram of this plasmid is shown in FIG. 1.
  • the plasmid pXL3031 was purified according to the methods described in patent application WO 97/35002.
  • the compound 2 / DNA complexes are prepared by rapidly mixing appropriate volumes of plasmid DNA solution and of compound 2 (according to the desired charge ratio), at room temperature.
  • the amount of transfecting agent varies between 0.25 nmol / ⁇ g of DNA and 12 nmol / ⁇ g of DNA.
  • the size of the complexes was analyzed by measuring the hydrodynamic diameter by dynamic light scattering (Dynamic Laser Light Scattering) using a Coulter N4Plus device.
  • the samples are diluted 20 times in a solution containing 5% dextrose and 20 mM sodium chloride to avoid multiple diffusions.
  • a ratio of 3 nmoles of lipid / ⁇ g of DNA the following results were obtained:
  • micellar solution indicates that compound 2 was used alone, that is to say without adding neutral co-lipid, and therefore it forms a micellar solution.
  • This table shows that the complexes obtained have a size of between 130 nm and 150 nm approximately, which is compatible with pharmaceutical use, in particular in injection.
  • Example 5 Behavior of the complexes formed from compound 2 at different charge ratios
  • This example illustrates the behavior of the transfer agent complexes according to the invention / nucleic acid when the charge ratio is varied.
  • the impact of adding a co-lipid is also illustrated.
  • phase A the DNA is not saturated with the transfer agent. Uncomplexed DNA remains, and the complexes are generally negatively charged and small. This stable phase is called "Phase A".
  • the fact that the DNA is not completely saturated with the transfer agent means that the DNA is not completely protected. DNA can therefore be subjected to degradation by nucleases. Furthermore, the complexes being generally negative, the passage of the cell membrane is difficult. For these reasons, the nucleolipid complexes of phase A are relatively inactive.
  • phase B Such a complex size is not suitable for use in injection, although this does not mean that the complexes are inactive in phase B: they are only in a formulation which is not suitable for their injection for a purpose. pharmaceutical.
  • phase C the complexes obtained are in a form such that DNA is very well protected against nucleases, and the generally positive charge of these complexes facilitates attachment to the cell membrane of an anionic nature and the passage of this membrane.
  • the complexes of phase C are therefore particularly suitable for use for the transfer of nucleic acids into cells.
  • zone B which is the zone of instability, is particularly small and is located at very low load ratios.
  • Zone C starts from 2 nmoles of lipid / ⁇ g of DNA when compound 2 is used in conjunction with a co-lipid (Cholesterol or DOPE), and from 3 nmoles of lipid / ⁇ g of DNA when the compound is used alone.
  • a co-lipid Cholesterol or DOPE
  • zone C began to form at charge ratios at least equal to 2 depending on the concentration of sodium chloride in the solution (see Figure 3 A in B. Pitard et al., PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997).
  • compound 2 is a particularly advantageous transfer agent because it is stable at low charge ratios, which makes it possible to form stable complexes with low amounts of glycolipids, with the beneficial consequences which ensue in terms of toxicity.
  • Example 6 Use of Compound 2 for the In Vitro Transfer of DNA This example illustrates the capacity of the transfer agents according to the invention to transfect DNA in cells in vitro, at different charge ratios, in the absence and in the presence of a neutral co-lipid (cholesterol or DOPE).
  • cholesterol cholesterol or DOPE
  • 24-well microplates are seeded with 60,000 HeLa cells per well, and are grown overnight. The number of cells after one night, and therefore at the time of transfection, is 100,000 cells per well.
  • Each well is brought into contact with the complexes formed with compound 2 and containing 1 ⁇ g of plasmid DNA in 0.5 ml of DMEM culture medium (Gibco / BRL without serum.
  • the cells are incubated at 37 ° C. for 5
  • the medium containing the complexes is then removed and replaced with a DMEM culture medium and 10% fetal calf serum.
  • the cells are again cultured for 24 hours.
  • the cells are lysed and tested in using a luciferase test kit (Promega) and a Dynex MLX luminometer.
  • Example 7 Use of Compound 2 for the In Vivo Transfer of DNA This example illustrates the capacity of the transfer agents according to the invention to transfect DNA in cells in vivo.
  • each mouse received 30 ⁇ l of formulation containing 15 ⁇ g of plasmid DNA in the anterior tibia muscle.
  • the tissues are recovered 7 days after the injection, they are frozen and stored at -80 ° C while waiting to carry out the luciferase activity tests.
  • each mouse received 200 ⁇ l of formulation containing 50 ⁇ g of plasmid DNA.
  • the tissues are recovered 24 hours after the injection, then are frozen and stored in the same way as above.
  • FIG. 3 illustrates the activity of the complexes formed with compound 2 for gene transfer in vivo intramuscularly.
  • any transfer agent as defined in the present invention can be used to promote the transfer of DNA into cells of any type of tissue.

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux agents de transfert, les compositions les contenant et leurs utilisations pour le transfert in vitro, in vivo ou ex vivo d'acides nucléiques dans les cellules. Plus précisément, la présente invention concerne des nouveaux agents de transfert d'acides nucléiques qui comprennent un espaceur hydrophobe lié chimiquement d'une part à un polycation et d'autre part à au moins un substituant hydrophile.

Description

NOUVEAUX AGENTS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention se rapporte à de nouveaux agents de transfert, les compositions les contenant et leurs utilisations pour le transfert in vitro, in vivo ou ex vivo d'acides nucléiques dans les cellules.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une technique de base avec de nombreuses applications biotechnologiques. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro , par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire pour l'étude de la régulation de l'expression des gènes, le clonage de gènes ou tout autre manipulation impliquant l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vivo, par exemple pour la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure, par exemple pour la création d'animaux transgéniques.
Actuellement, le moyen le plus répandu pour transférer des gènes dans des cellules est l'utilisation de vecteurs viraux. Mais ceux-ci n'étant pas complètement dénués de risques, plusieurs autres méthodes basées sur l'emploi de vecteurs synthétiques ont été proposées. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales : complexer et compacter l'acide nucléique à transfecter, et promouvoir son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement à travers les deux membranes nucléaires.
Plusieurs familles de vecteurs synthétiques ont été développées, comme par exemple les polymères ou encore les vecteurs biochimiques (constitués d'une protéine cationique associée à un récepteur cellulaire), mais un progrès important a surtout été accompli en transfection non-virale avec le développement des lipofectants, et plus particulièrement des lipides cationiques. Il a ainsi été mis en évidence que les lipides cationiques, du fait de leur charge globale positive, interféraient spontanément avec l'ADN globalement négatif, formant des complexes nucléolipidiques capables de fusionner avec les membranes cellulaires, et permettaient ainsi la libération intracellulaire de l'ADN.
Différentes sortes de lipides cationiques ont ainsi été synthétisés : des lipides comportant un groupement ammonium quaternaire (par exemple le DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE...), des lipopolyamines comme par exemple le DOGS, le DC-Chol ou encore les lipopolyamines divulguées dans la demande de brevet WO 97/18185, des lipides associant à la fois un groupement ammonium quaternaire et une polyamine comme le DOSPA, ou encore des lipides comportant diverses autres entités cationiques, notamment des groupes amidinium (par exemple l'ADPDE, ADODE ou les lipides de la demande de brevet WO 97/31935). En fait, la diversité structurelle des lipides cationiques reflète en partie l'observation de la relation structure-activité.
Toutefois, l'emploi de ces vecteurs synthétiques pose encore de nombreuses difficultés, et leur efficacité reste à améliorer. Notamment, il serait souhaitable de pouvoir disposer de vecteurs non-cationiques ou moins cationiques , et ce pour différentes raisons :
- les complexes formés entre l'acide nucléique et les agents de transfert, du fait de leur charge globale positive, ont tendance à être captés par le système réticuloendothélial ce qui induit leur élimination,
- du fait de la charge globale positive des complexes formés, les protéines du plasma ont tendance à s'adsorber à leur surface, et il en résulte une perte du pouvoir de transfection, - dans un contexte d'injection locale, la présence d'une charge globale positive importante empêche la diffusion des complexes d'acides nucléiques en dehors du site d'administration , car les complexes s'adsorbent sur les matrices extracellulaires. Les complexes ne peuvent donc plus atteindre les cellules cibles, ce qui, par voie de conséquence, entraîne une diminution de l'efficacité de transfert par rapport à la quantité de complexes injectée,
- et enfin, de nombreux acteurs du domaine de la transfection non-virale de gènes ont signalés que les lipides ou polymères cationiques ont un effet inflammatoire.
Par ailleurs, la formulation stable des vecteurs synthétique développés jusqu'à aujourd'hui à de faibles rapports de charges est en général difficile, voire impossible, et il a été constaté en outre qu'à faible rapport de charges, l'efficacité de transfert est souvent faible (Pitard et al., PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997). Dans toute la suite, "rapport de charge" signifie le rapport des charges positives de l'agent de transfert sur les charges négatives de l'ADN. Ce rapport est souvent exprimé en nmoles d'agent de transfert par μg d'ADN.
Ce sont ces problèmes que les nouveaux agents transfectants mis au point par la demanderesse, et qui font l'objet de la présente invention, se proposent de résoudre. En effet, leur structure particulière forme une ancre hydrophobe liée d'une part à un polycation qui permet la formation de complexes avec les acides nucléiques et d'autre part à au moins une tête hydrophile qui permet de diminuer la densité de charge globale apparente de ces agents transfectants par rapport aux lipides ou aux polymères cationiques classiquement utilisés en transfection non-virale. La présence d'au moins une tête hydrophile crée une sorte d'« écran de charges » par diminution du potentiel zêta des complexes formés avec l'acide nucléique. Ainsi, lesdits complexes apparaissent moins cationiques à l'organisme, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent. De plus, il a été montré que les agents transfectants selon la présente invention sont particulièrement avantageux d'un point de vue physico-chimique car ils sont particulièrement stables lorsqu'ils sont mis en contact avec des acides nucléiques à de faibles rapports de charge.
Ainsi, un premier objet de l'invention concerne de nouveaux agents de transfert d'acides nucléiques qui comprennent un espaceur hydrophobe lié chimiquement d'une part à un polycation et d'autre part à au moins un substituant hydrophile.
Le polycation permet de former des complexes avec les acides nucléiques par interractions avec les charges anioniques des acides nucléiques. L'espaceur hydrophobe a une double fonction. Il permet d'une part le passage à travers les membranes cellulaires, et d'autre part, il rend les complexes formés avec les acides nucléiques viables en milieu biologique. En effet, l'espaceur hydrophobe crée une contrainte physique sur les complexes qui permet de protéger les acides nucléiques du milieu extérieur. L'hydrophobicité nécessaire pour que les complexes soient viables peut être aisément déterminée par l'homme du métier, par application des méthodes de recherche ordinaires ou par la méthode habituelle des tâtonnements. Enfin, la présence du ou des substituants hydrophiles permet de diminuer le potentiel zêta des complexes formés, ce qui fait apparaître lesdits complexes moins cationiques au milieu extérieur.
Au sens de l'invention, le polycation est une molécule linéaire ou ramifiée polycationique susceptible de s'associer avec les acides nucléiques. On entend au sens de l'invention par association avec l'acide nucléique, tout type de liaisons comme par exemple les liaisons covalentes, les interractions électrostatiques, ioniques, les ponts hydrogène etc.. De préférence, le polycation est une polyamine linéaire ou ramifiée, chaque groupe amino étant séparé par un ou plusieurs groupes méthylène. Eventuellement, la polyamine peut en outre être substituée par d'autres fonctions cationiques, par exemple des groupes amidinium ou guanidinium, des guanidines cycliques etc.. Il peut s'agir notamment d'un polycation tel que défini dans les demandes de brevet WO 96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935, WO 98/54130 ou encore WO 99/51581, et plus généralement dans toute la littérature concernant des structures de lipides cationiques connue de l'homme du métier. Selon un aspect préféré de l'invention, le polycation représente une polyamine de formule générale (II)
Figure imgf000007_0001
dans laquelle :
- R,, R2 et R3 représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement (CH2)qNR'R" avec q un nombre entier pouvant varier de 1 à 6, ceci de manière indépendante entre les différents groupements R„ R, et R3, étant entendu que l'un au moins de R,, R2 et R3 est différent d'un atome d'hydrogène,
- R' et R" représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement (CH2)qNH2 avec q défini comme précédemment,
- m représente un nombre entier compris entre 1 et 6, et - n et p représentent indépendamment l'un de l'autre des nombres entiers compris entre 0 et 6, avec lorsque n est supérieur ou égal à 2, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale (II), et lorsque n est égal à 0, l'un au moins des substituants R, et R2 est différent d'un atome d'hydrogène. D'autres polycations possibles peuvent être également choisis parmi la spermine, la spermidine, la cadavérine, la putrescine, l'hexamethylènetétramine (hexamine), le chlorure de méthacrylamidopropyl-triméthylammonium (AMBTAC), le chlorure de 3-acrylamido-3-méthylbutyltriméthylammonium (AMBTAC), les polyvinylamines, les polyéthylèneimines, ou encore les ionènes. (références : Barton et al., Comprehensive Organic Chemistrv, Vol. 2, Ed. Pergamon Press, p. 90 ; Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering, 2nd Edition, Ed. Wiley Interscience, Vol. 1 1, p. 489 ; Mahler and Cordes, Biological Chemistrv, Harper International Edition, p. 124.)
L'espaceur hydrophobe peut prendre des structures très variées du moment qu'il apporte une hydrophobicité suffisante pour permettre la protection des acides nucléiques et le passage à travers les membranes. Cette hydrophobicité suffisante peut être déterminée par l'homme du métier en appliquant des méthodes de recherche ordinaires. Selon une variante préférée de l'invention, l'espaceur hydrophobe est constitué de 2 ou 3 chaînes grasses linéaires hydrocarbonées (c'est-à-dire entre 10 et 20 atomes de carbone par chaîne, et de préférence 12, 14, 15, 16, 17, ou 18 atomes de carbone par chaîne, chaque chaîne pouvant être de longueur différente). Selon une autre variante, l'espaceur hydrophobe est constitué d'une très longue chaîne grasse linéaire hydrocarbonée, c'est-à-dire comprenant entre 20 et 50 atomes de carbone, et de préférence entre 40 et 50 atomes de carbone et encore plus préférentiellement entre 44 et 50 atomes de carbone).
Des substituants hydrophiles convenables sont par exemple choisis parmi les substituants hydroxy, amino, les polyols, les sucres, ou encore les peptides hydrophiles. On entend par polyol toute molécules hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique comprenant au moins deux fonctions hydroxy. On peut citer à titre d'exemple le glycérol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, les tétritols, les pentitols, les pentitols cycliques (ou quercitols), les hexitols comme le mannitol, le sorbitol, les dulcitols, les hexitols cycliques ou inositols etc..(Stanek et al., The Monosaccharidess Académie Press, pp. 621-655 et pp. 778-855).
Selon une variante avantageuse, les agents de transfert selon l'invention comprennent au moins un substituant hydrophile qui est un sucre. On entend au sens de l'invention par "sucre", toute molécule constituée d'un ou plusieurs saccharides. On peut citer à titre d'exemple des sucres tels que les pyranoses et les furanoses, par exemple le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, ou encore le maltose, le lactose, le saccharose, le sucrose, le fucose, le cellobiose, l'allose, le laminarabiose, le gentiobiose, le sophorose, le mélibiose etc.. De préférence, le ou les sucres sont choisis parmi le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, le lactose, le saccharose et le cellobiose. De plus, il peut également s'agir de sucres dits "complexes", c'est-à-dire de plusieurs sucres couplés covalemment les uns aux autres, chaque sucre étant de préférence choisi dans la liste citée précédemment. A titre de polysaccharides convenables, on peut citer le dextran, l'α-amylose, l'amylopectine, les fructans. les mannans, les xylans et les arabinans. Certains sucres préférés peuvent en outre interagir avec des récepteurs cellulaires, comme par exemple certains types de lectines.
Plus particulièrement, les agents de transfert selon l'invention peuvent être représentés par la formule générale (I) :
Figure imgf000009_0001
pour laquelle :
- R représente un polycation,
- Z représente un atome d'hydrogène ou un atome de fluor, les différents Z étant indépendant les uns des autres, et - soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un groupement -OAlk où Alk représente un alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxy, un groupement amino, un polyol, un sucre, un peptide hydrophile ou non-hydrophile, ou un oligonucléotide, étant entendu que l'un au moins des substituants X et Y représente un groupe hydrophile choisi parmi les hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou les peptides hydrophiles,
- soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et 50, X est soit un atome d'hydrogène soit un groupement -OAlk où Alk représente un alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone, et Y est un groupe hydrophile choisi parmi les hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou les peptides hydrophiles.
Au sens de l'invention, le polycation, les polyols et les sucres de la formule générale (I) sont tels que définis précédemment.
Les termes x et y sont définis dans la formule générale (I) de façon à prendre toute valeur comprise entre 10 et 22 inclus ou entre 20 et 50 inclus selon les cas. De préférence, x et y, indépendamment l'un de l'autre, sont compris entre 12 et 18 inclus. Plus préférentiellement, x et y valent, indépendamment l'un de l'autre, 14, 15, 16, 17 ou 18. Lorsque x est égal à 0 ou 1, alors y est compris de préférence entre 30 et 50, ou entre 40 et 50. Plus préférentiellement, y est compris entre 44 et 50.
On entend au sens de l'invention par "oligonucléotide" des chaînes contenant un ou plusieurs nucléotides, désoxynucléotides, ribonucléotides et/ou désoxyribonucléotides qui sont des unités monomériques se différenciant les unes des autres par la présence de bases qui peuvent être choisies parmi l'adénine, la guanine, la cytosine, la thymidine ou l'uracile [voir Lehninger Biochimie, Flammarion Médecine Sciences, 2nde édition, p. 305-329]. Du fait de leur propriété à former des paires de base, les oligonucléotides sont largement utilisés en biologie moléculaire, par exemple comme linkers (molécule de liaison) ou comme sondes. Par ailleurs, les oligonucléotides peuvent aussi être utilisés sous forme de conjugués, c'est-à-dire couplés à une ou plusieurs autres molécules ayant des propriétés distinctes. A titre d'exemple, on peut citer le couplage d'un oligonucléotide avec un groupe chimique réactif, avec des groupes fluorescents ou chimioluminescents, ou encore avec des groupes susceptibles de favoriser les interractions intermoléculaires de façon à promouvoir l'entrée dans les cellules. De tels conjugués, décrits dans Bioconjugate Chemistry [John Goodchild, Conjugates of Oligonucléotides and Modified Oligonucléotides : a Review oftheir Synthesis and properties, Vol. 1, N°3, 1990, pp. 165-187], possèdent de nombreuses utilisations et avantages comme par exemple la capacité d'améliorer l'entrée de complexes dans les cellules, de diminuer le taux de dégradation par les nucléases, d'augmenter la stabilité du complexe concerné, de suivre le devenir des oligonucléotides dans un organisme etc.. Ainsi, le ou les oligonucléotides, lorsqu'ils sont greffés sur les agents de transfert selon la présente invention, permettent d'apporter une propriété supplémentaire aux dits agents de transfert (par exemple des propriétés de ciblage, de marquage etc.). Les oligonucléotides peuvent être obtenus selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier, et il est également possible de synthétiser des oligonucléotides modifiés selon les méthodes décrites dans Bioconjugate Chemistry, John Goodchild, Conjugates of Oligonucléotides and Modified Oligonucléotides : a Review of their Synthesis and properties, Vol. 1, N°3, 1990, pp. 165-187 ou dans Tetrahedron, Beaucage et al., 772e Synthesis of Modifiée} Oligonucléotides by the Phosphoramiditeb Approach and Their Application, Vol. 49, N° 28, pp. 6123-6194, 1993.
On entend au sens de l'invention par "peptide" des chaînes contenant un ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons de nature peptidique [Lehninger Biochimie, Flammarion Médecine Sciences, 2nde édition]. Il peut s'agir des 20 acides aminés "classiques", c'est-à-dire ceux trouvés couramment dans la composition des protéines (Alamine, Valine, Leucine, Isoleucine, Proline, Phenylalamine, Tryptophane, Méthionine, Acide Aspartique, Glutamine, Lysine, Arginine, Histidine, Glycine, Serine, Thréonine, Cystéine, Tyrosine, Asparagine, Acide Glutamique), ou bien il peut aussi s'agir des acides aminés dits "rares" comme par exemple la 4- hydroxyproline, la desmosine, la 5-hydroxylysine, la N-méthyllysine, la 3- méthylhistidine, l'isodesmosine etc.. Enfin, il peut également s'agir des acides aminés apparaissant dans différentes cellules ou divers tissus sous forme libre ou combinée et qui dérivent en général des acides α-aminés (par exemple la β-alamine, l'acide γ- aminobutyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la canavanine, l'acide djenkalique, la β- cyanoalamine etc.). De tels peptides peuvent par exemple permettre le ciblage de certains types cellulaires. Dans ce contexte, on peut par exemple citer les peptides RGD ou NLS. Il peut également s'agir séquences peptidiques ayant des propriétés de marquage, c'est-à-dire permettant l'identification, par exemple par des techniques d'analyse comme la spectrométrie de fluorescence, la spectrométrie infrarouge, la résonance magnétique nucléaire (RMN) etc. On peut par exemple citer à ce titre les séquences peptidiques ou pseudopeptidiques linaires ou cycliques comportant l'épitope Arg-Gly-Asp (Arginine-Glycine-Acide Aspartique) de reconnaissance des récepteurs primaires et/ou secondaires des protéines d'adhésion du type intégrines. Les peptides selon l'invention peuvent en outre être substitués au niveau de un ou plusieurs de leurs groupes fonctionnels, par exemple au niveau du carboxyle en α, de la fonction aminé en α et/ou au niveau des groupes fonctionnels de la chaîne latérale de chacun des acides aminés. A titre d'exemple, on peut citer les substitutions par des groupements aliphatiques saturés ou insaturés, linéaires, ramifiés ou cycliques contenant 1 à 24 atomes de carbone, tels que par exemple des radicaux cholestéryle, arachidonyle ou rétinoyle, ou encore des groupements mono- ou polyaromatiques tels que par exemple des dérivés benzyloxycarbonyle, benzylester ou rhodaminyle substitués ou non. L'intérêt de telles substitutions s'inscrit dans le cadre de modification des propriétés chimiques et éventuellement biologiques desdits peptides, par exemple afin de les marquer. Lorsque lesdits peptides sont utilisés à titre de substituant hydrophile, ceux-ci sont choisis parmi les peptides hydrophiles, c'est-à-dire les peptides constitués uniquement d'acides aminés hydrophiles ou encore ceux composés partiellement d'acides aminés hydrophiles et dont la composition les rend globalement hydrophiles.
Selon une variante préférée de l'invention, les groupes Z représentent tous des atomes d'hydrogène.
Selon un aspect plus particulièrement avantageux de l'invention, les agents de transfert sont de formule générale (III) :
Figure imgf000012_0001
pour laquelle : - R représente un polycation, et
- soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène ou un sucre, étant entendu que l'un au moins des substituants X et Y représente un sucre, - soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et 50, X est un atome d'hydrogène et Y est un sucre. Au sens de l'invention, le polycation, les sucres et x et y dans la formule générale (III) sont tels que définis précédemment pour la formule générale (I).
Des agents de transfert plus particulièrement préférés sont de formule générale (III) et x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et l'un de X et Y représente un atome d'hydrogène et l'autre un sucre. Selon une autre variante avantageuse, les agents de transfert selon l'invention sont de formule générale (III) et x est égal à 0, y est un entier compris entre 40 et 50, X représente un atome d'hydrogène, et Y est un sucre.
Il est entendu que la présente invention concerne également les isomères des produits de formule générale (I) lorsqu'ils existent, ainsi que leurs mélanges, ou leurs sels.
Notamment, les composés de l'invention peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (par exemple l'acide chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique), avec les acides organiques (acide acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique), avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux), ou avec les bases organiques (aminés tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine).
Selon l'invention, la préparation des produits de formule générale (I) s'effectue en mettant en oeuvre les étapes suivantes :
1) On prépare dans un premier temps une chaîne alkyle à x atomes de carbone (x étant défini comme précédemment), comportant une fonction hydroxy et une fonction ester, par ouverture d'une lactone correspondante. La réaction s'effectue généralement dans un alcool, à pH basique et à une température comprise entre -10°C et la température ambiante. A titre d'exemple, l'alcool peut être le méthanol ou l'éthanol. 2) Puis, on fixe le groupe X sur la chaîne alkyle bifonctionnelle obtenue à l'étape précédente. Lorsque X représente un sucre, on effectue une condensation dans un solvant chloré, comme par exemple le dichlorométhane ou le chloroforme, et en présence d'un acide de Lewis, à température comprise entre -5°C et 10°C. L'acide de Lewis peut par exemple être choisi parmi le chlorure d'étain, le chlorure de fer, l'acide p-toluène sulfonique (tsOH), le triméthylsillyltrifluorométhane sulfonique (TMStf), le trifluorure de bore étherate etc.[Kazunobu Toshima et al., Récent Progress in O- glcosilation Methods and its Application to Natural Products Synthesis, Chem. Rev. 1993, Vol. 93, pp. 1503-1531]. Lorsque X représente un groupe peptidique hydrophile ou non, on effectue un couplage peptidique selon les méthodes classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise entre 0 et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 1 1. A titre d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non-nucléophiles employées sont préférentiellement des aminés tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des aminés tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué entre 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C.
Lorsque l'on souhaite que X représente un groupe hydroxy, cette étape n'est pas effectuée. Lorsque X représente un groupe amino, la réaction est effectuée par substitution nucléophile selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier qui permettent d'obtenir une aminé à partir d'un alcool.
Lorsque X représente un groupe -OAlk, on effectue une alkylation de la fonction alcool selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier ou selon des méthodes analogues. Par exemple, on peut faire réagir un composé diazo de formule générale Alk-N2 éventuellement en présence d'un catalyseur tel que HBF4 ou du gel de silice. On peu également opérer dans les conditions de la Réaction de Williamson qui consiste à faire réagir en milieu basique un composé de formule générale Alk-Hal où Hal représente un atome d'halogène tel que le chlore, le brome ou l'iode, sur la chaîne portant une fonction alcool.
La même réaction de type Williamson peut également être mise en œuvre lorsqu'on souhaite que X représente un polyol.
Enfin, lorsque X représente un oligonucléotide, celui-ci est couplé à la chaîne bifonctionnelle selon les méthodes classiques connues pour greffer covalemment un oligonucléotide. Par exemple, ledit oligonucléotide peut être greffé par l'intermédiaire d'un linker (molécule de liaison) convenable.
3) Dans un troisième temps, la fonction ester présente sur la chaîne bifonctionnelle est hydrolysée en fonction acide selon les méthodes connues. Par exemple, on peut opérer en milieu basique dans un alcool à haut point d'ébullition, à température comprise entre 50°C et la température de reflux du mélange réactionnel.
4) Puis, une chaîne alkylamine substituée ou non de formule générale (IV) :
H2N-(CH2)y-Y (IV)
dans laquelle y et Y sont définis comme précédemment, est couplée au composé obtenu à l'étape précédente, selon les méthodes de couplage peptidique classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier.
Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non- nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise entre 0 et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non- nucléophiles employées sont préférentiellement des aminés tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des aminés tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué entre 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C. Le groupe de formule générale (IV) est soit disponible dans le commerce, soit il peut être obtenu par condensation de Y sur l'alky lamine non-substituée correspondante selon une méthode analogue à celle décrite précédemment en 2).
5) L'amide obtenue à l'étape précédente est ensuite réduite en aminé. On opère pour cela selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. Par exemple, on opère dans un solvant organique anhydre comme le tétrahydrofuranne anhydre, par action d'hydrure de lithium aluminium LiAlH4. D'autres agents réducteurs pouvant être utilisés sont par exemple le borane, le borane dans le diméthylsulfure (BH3- SMe2), le borohydrure de sodium/tétrachlorure de titane (NaBH4, TiCl4), le chlorure d'oxyde de phosphore sur Zinc (POCl3/Zn), le pentasulfure de phosphore (P4S10) sur nickel de Raney, etc. [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc., 1989]. On peut également opérer par hydrogénation catalytique. Avantageusement, la réduction est effectuée par action d'hydrure de lithium aluminium LiAlH4, dans du tétrahydrofuranne anhydre, à température de reflux du mélange. On obtient ainsi un composé de formule générale (V) :
Figure imgf000016_0001
pour laquelle X, Y, x et y sont définis comme précédemment.
6) Enfin, dans une dernière étape, le dérivé acide correspondant au polycation R tel que défini précédemment, est couplé au composé de formule générale (IV) obtenu à l'étape précédente, selon les méthodes de couplage peptidique classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non- nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise entre 0 et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non- nucléophiles employées sont préférentiellement des aminés tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des aminés tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué entre 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C.
Les dérivés acides correspondant au polycation sont disponibles commercialement.
Selon une autre variante, les agents transfectants selon la présente invention peuvent être préparés en opérant de la façon suivante :
1) On prépare dans un premier temps une chaîne alkyle à x atomes de carbone (x étant défini comme précédemment), comportant une fonction hydroxy et une fonction ester, par ouverture d'une lactone correspondante. La réaction s'effectue généralement dans un alcool, à pH basique et à une température comprise entre -10°C et la température ambiante. A titre d'exemple, l'alcool peut être le méthanol ou l'éthanol.
2) Puis, on effectue sur cette chaîne alkyle bifonctionnelle le couplage d'une chaîne alkylamine substituée ou non de formule générale (IV) :
H2N-(CH2)y-Y (IV)
dans laquelle y et Y sont définis comme précédemment dans la formule générale (I).
La réaction s'effectue à une température supérieure au point de fusion de chaque produit, avec ou sans vide. La réaction peut également être mise en œuvre à la température de reflux en présence d'un solvant alcoolique. A titre d'exemple, le solvant peut être le méthanol ou l'éthanol. On opère par exemple à température comprise entre 45°C et 60°C.
La réaction peut également être menée à température de reflux du mélange en présence d'un alcool tel que le méthanol à titre de solvant. Une autre alternative consiste à effectuer le couplage du composé de formule générale (IV) directement avec la lactone (dans ce cas, la première étape d'ouverture de la lactone n'est pas effectuée).
Le groupe de formule générale (IV) est soit disponible dans le commerce, soit il peut être obtenu par condensation de Y sur l'alkylamine non-substituée correspondante selon une méthode analogue à celle décrite ci-avant.
3) l'amide bicaténaire bifonctionnelle obtenue est ensuite réduite en aminé. On opère pour cela selon des méthodes classiques. Par exemple, on opère dans un solvant organique anhydre comme le tétrahydrofuranne anhydre, par action d'hydrure de lithium et d'aluminium (LiAlH4). D'autre agents réducteurs qui peuvent être utilisés sont par exemple le borane, le diméthyle de sulfure d'hydrure de bore (BH3-SMe2), le borohydrure de sodium/tétrachlorure de titane (NaBH4, TiCl4), le chlorure d'oxyde de phosphore sur Zinc (POCl3/Zn), le pentasulfure de phosphore (P4S10) sur nickel de Raney, etc.. [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc., 1989]. On peut également opérer par hydrogénation catalytique. Avantageusement, la réduction est effectuée par action d'hydrure de lithium aluminium LiAlH4, dans du tétrahydrofuranne anhydre, à température de reflux du mélange. On obtient ainsi un composé de formule générale (VI) :
Figure imgf000018_0001
pour laquelle Y, x et y sont définis comme précédemment. 4) Puis, on condense le groupe X sur l'aminé de formule générale (VI) obtenue à l'étape précédente. La condensation est effectuée selon des méthodes analogues à celles décrites précédemment pour la première voie de synthèse.
5) Enfin, dans une dernière étape, le dérivé acide correspondant au polycation R tel que défini précédemment, est couplé au composé de formule générale (VI) obtenu à l'étape précédente, selon les méthodes de couplage peptidique classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non- nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise entre 0 et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non- nucléophiles employées sont préférentiellement des aminés tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des aminés tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué entre 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C. Les dérivés acides correspondant au polycation sont disponibles commercialement.
Naturellement, lorsque les substituants de X, Y et/ou du polycation peuvent interférer avec la réaction, il est préférable de les protéger préalablement avec des radicaux compatibles et pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au reste de la molécule. On opère pour cela selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier, et notamment selon les méthodes décrites dans T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, Wiley-Interscience, dans McOMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plénum Press (1973), ou dans Philip J Kocienski, Protecting Groups, Thieme. Par ailleurs, chaque étape du procédé de préparation peut être suivie, le cas échéant, des étapes de séparation et de purification du composé obtenu selon les méthodes connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple illustratif d'agents de transfert d'acides nucléiques avantageux selon l'invention, on peut citer les composés suivants :
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OH
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un agent de transfert d'acides nucléiques tel que défini ci-avant, et un acide nucléique. Les quantités respectives de chaque composant peut être ajusté aisément par l'homme du métier en fonction de l'agent de transfert utilisé, de l'acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire
(ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique
(ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc.. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes d'expression, etc. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.
De préférence, l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou plusieurs promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit proteique ayant un effet thérapeutique. Le produit proteique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit proteique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit proteique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc.) les apolipoproteines (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/1 1947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme, catabolisme etc.
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc.. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule. Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes agent de transfert/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un acide nucléique, un agent de transfert d'acides nucléiques tel que défini ci-avant et au moins un adjuvant capable de s'associer aux complexes agent de transfert/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés. Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre à titre d'adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl, - palmitoyl, -mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyelines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également
Lehninger, Biochemistry).
Plus récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non directement au niveau de la condensation dudit acide nucléique, tels que ceux décrits dans la demande de brevet WO 96/25508. La présence d'un tel composé, au sein d'une composition selon l'invention, permet de diminuer la quantité d'agent transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante. Par composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un composé compactant, directement ou non, l'acide nucléique. Plus précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'acide nucléique à transfecter soit intervenir au niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au niveau de l'acide nucléique. Notamment, l'agent précompactant peut être tout polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation préféré, l'agent intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique dérive en tout ou partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une nucléoline et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel agent peut également être constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature biochimique, par exemple par un ou plusieurs acides aminés, ou de nature chimique.
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20 équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acide nucléique en mol/mol et, plus préférentiellement, de 0,5 à 5.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions selon la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'ADN vers certains, types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques...). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau etc.). L'élément de ciblage peut être lié à l'agent de transfert d'acides nucléiques selon l'invention, ou également à l'acide nucléique comme cela a été précisé précédemment. Lorsque l'élément de ciblage est lié à l'agent de transfert d'acides nucléiques de formule générale (I), celui-ci constitue de préférence l'un des substituants X ou Y.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les lipides, les neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés. Préférentiellement, il s'agit de sucres, de peptides ou de protéines tels que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou des fragments de récepteurs, etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de type lectines cellulaires, ou de ligands à séquence RGD avec une affinité pour les récepteurs de protéines d'adhésion comme les intégrines. On peut également citer les récepteurs de la transferrine, des HDL et des LDL, ou le transporteur du folate. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des lectines tels que les récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux syalydés tel que le sialyl Lewis X, ou encore un fragment Fab d'anticorps, ou un anticorps simple chaîne (ScFv).
L'association des éléments de ciblage aux complexes nucléolipidiques peut être effectuée par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par couplage à une partie hydrophobe ou à une partie qui interagit avec l'acide nucléique de l'agent de transfert selon l'invention, ou encore à un groupement qui interagit avec l'agent de transfert selon l'invention ou avec l'acide nucléique. Les interactions en question peuvent être, selon un mode préféré, de nature ionique ou covalente.
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés tels que définis ci-avant pour le transfert de polynucléotides (et plus généralement de polyanions) dans les cellules in vitro, in vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'utilisation des composés tels que définis ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une déficience en un produit proteique ou nucléique. Le polynucléotide contenu dans ledit médicament code ledit produit proteique ou nucléique, ou constitue ledit produit nucléique, apte à corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo.
Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acides nucléiques utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, ou dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes, les tissus conjonctifs, etc.
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes : (1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini ci- avant, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec le complexe formé en (l).
L'invention concerne en outre une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini ci- avant, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 μg d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à l'agent de transfert selon l'invention et/ou à l'acide nucléique.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques in vivo, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à un composé de formule générale (I) dans les conditions définies ci-avant.
Les agents de transfert d'acides nucléiques de l'invention sont particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. Il peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc.), épitheliales etc., sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Notamment, la demanderesse propose à titre non-limitatif divers protocoles opératoires ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis en oeuvre pour préparer les agents de transfert de formule générale (I). Bien entendu, il est à la portée de l'homme du métier de s'inspirer de ces protocoles ou produits intermédiaires pour mettre au point des procédés analogues en vue de conduire à ces mêmes composés. Il appartient également à l'homme du métier de s'inspirer des procédés de synthèse décrits dans les différentes demandes de brevet précédemment citée pour la synthèse du polycation R compris dans la formule générale (I) (WO 96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935 etc.).
FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique du plasmide pXL2774 utilisé dans les expériences de transfert d'ADN dans les cellules.
Figure 2 : Activité de transfert de gène in vitro dans des cellules HeLa des complexes formés à partir du composé 2 selon l'invention sans co-lipide, ou bien en présence de cholestérol et en présence de DOPE comme co-lipides. L'axe des ordonnées représente l'expression de la luciférase en pg/puit. L'axe des absisses indique le rapport agent transfectant/ADN en nmole/μg d'ADN.
Figure 3 : Activité de transfert de gène in vivo après injection directe dans le muscle antérieur du tibias de souris de complexes formés à partir du composé 2 selon la présente invention en présence de DOPE (1 : 1). L'axe des ordonnées indique l'expression de la luciférase en pg/muscle. L'axe des absisses indique le rapport composé 2/ ADN en nmoles/μg d'ADN.
EXEMPLES
A \ MATÉRIEL ET MÉTHODES a) Matériel
• Les polyamines de départ, comme la spermidine, la spermine, le tris-(2- aminoéthyle)amine, la phénylènediamine, les diaminoalcane etc., sont disponibles commercialement ou elles peuvent être synthétisée par des méthodes classiques (par exemple par cyanoéthylation d'aminés disponibles dans le commerce pour obtenir des aminés branchées)
• de nombreux composés comme par exemple la triéthylamine, l'hexafluorophosphate de benzotriazol-l-yloxytris(diméthyIamino)phosphonium (BOP), le chloro formate de benzyle, le 1 1 -bromoundécanol, etc. sont également des produits commerciaux.
• L'amberlite IR 120 est une résine échangeuse d'ions commerciale (catalogue BDH). • Le diméthylsulfoxyde (DMSO), traité préalablement à l'hydroxyde de potassium, a été distillé sur hydrure de calcium puis stocké sur tamis moléculaire 4 Â.
• Le dichlorométhane a été distillé sur le pentoxyde de phosphore puis stocké sur tamis moléculaire 4 Â.
• Le tétrahydrofuranne (THF) a été distillé sur sodium en présence de benzophénone. • Pour les réactions nécessitant des conditions anhydre, toute la verrerie est séchée à la flamme sous courant d'azote.
b) Méthodes - Analyses spectroscopiques
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur un spectromètre Brucker MSL 30 à la fréquence de 300 MHz pour le proton et 75 MHz pour le carbone. Tous les déplacements chimiques sont reportés en ppm soit par rapport à la fréquence du tétraméthylsilane (TMS), soit par rapport au solvant. Les spectres ont été enregistrés en utilisant soit le TMS soit le signal résiduel du solvant comme référence interne. La multiplicité des signaux est désignée par les abréviations suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet) et m (multiplet).
- Techniques de chromatographie « La cinétique des réactions a été suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) avec un gel de silice contenant un indicateur fluorescent (Merck Slilicagel 60 F254) comme support. Les chromatogrammes ont été révélés par pulvérisation d'une solution alcoolique d'anisaldéhyde.
• Toutes les chromatographies sur colonne ont été réalisées sous pression d'air comprimé avec du silicagel 60 comme phase stationnaire (0,05-0,02 mm). La phase mobile employée diffère selon le type de synthèse (chromatographie moyenne pression).
• Les analyses CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) sont réalisées sur un appareil Waters LC 4000 équipé d'une colonne analytique de type C4 commercialisée par Applied Biosystem ("Brownlee Columns" en acier inoxydable de 3 cm de longueur et 0,46 cm de diamètre) et d'un détecteur "Waters 486" à 220 nm. La phase stationnaire est de l'aquapore butyl 7 microns, et les phases mobiles sont l'eau déminéralisée (2500 cm3) ou l'acétonitrile (2500 cm3) additionné d'acide trifluoroacétique (2,5 cm3). Le débit est de 1 ml par minute.
B \ SYNTHÈSE DES AGENTS DE TRANSFECTION Exemple 1 : synthèse de l'α-D-mannopyrannoside de (3-[4-(3-amino-propyI- amino)-butyl-aminol-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécyle (Composé 1)
a) Synthèse de l'acide 3-[4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino-propyl-tert- butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl-amino] acétique (FRM375)
A une solution de spermine (5 g ; 24,96 mmoles) dans du méthanol (125 ml), on ajoute du cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN (0,548 g ; 8,74 mmoles). La solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une ampoule isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (2,34 g ; 25,46 mmoles) dans du méthanol (80 ml). Après une nuit, on ajoute au mélange de la triéthylamine (3,86 ml ; 27,71 mmoles) et du di-tert-butyl dicarbonate (27,67 g ; 129,79 mmoles) solubilisé dans du tétrahydrofuranne (55 ml). Après une nuit, on concentre à l'évaporateur rotatif puis on reprend par de l'acétate d'éthyle (63 ml) et on effectue un lavage à l'hydrogénosulfate de potassium et à la saumure. Puis on sèche sur sulfate de magnésium et on concentre. Le produit obtenu est purifiée par chromatographie (CH2Cl2/MeOH 9 : 1). Le rendement est de 30%.
!H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,42 (s, 36H, C(CH3)3), 1,45 (m, 4H, CH2), 1,60 (m, 4H, CH2), , 3,04-3,33 (m, 12H, CH2), 3,91 (s, 2H, NCH2COO).
b) Synthèse du 15-hydroxypentadécanoate de méthyle A 10 g de pentadécalactone (41,60 mmol) dans 41,60 cm3 de méthanol, on ajoute 6,66 cm3 de méthylate de sodium 2N (13,31 mmol) à 0°C.
Après 9 heures, on ajoute 9,24 cm3 d'acide acétique et on laisse agir pendant 15 minutes. Puis on évapore la solution sous vide à sec, on reprend ensuite par du dichlorométhane, et on effectue un lavage au bicarbonate de sodium. On sèche la phase organique obtenue par du sulfate de magnésium et on évapore le solvant à l'évaporateur rotatif. La purification se fait dans un mélange hexane/acétate d'éthyle 6:4. On obtient le 1-ol-pentadécanoate de méthyle avec un rendement de 80 %. !H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,26 (m, 12H, (CH2)\ o), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H- 13), 2,30 (t, 2H, J= 7,60 Hz, H- 14), 3,64 (t, IH, J≈ 5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H- 16).
c) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-a-D-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle A 0°C, on ajoute 5,26 cm3 de chlorure d'étain (44,94 mmol) à 8,72 g de mannose pentaacétylé (22,47 mmol) dans 56 cm3 de dichlorométhane pendant 30 minutes. Puis on ajoute 7,34 g de l-ol pentadécanoate de méthyle précédemment obtenu en a) (26,96 mmol). Après 2 heures, le mélange réactionnel est dilué par de l'éther éthylique et on verse dans une solution d'hydrogénophosphate de sodium (NaHPO4). Les phases aqueuses sont extraites avec du diéthyléther et les phases organiques sont successivement lavées par une solution de carbonate de sodium, de la saumure, puis séchées sur sulfate de magnésium. Le produit obtenu après évaporation sous vide à sec est purifié par chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 7:3. Le rendement est de 53 %. JH RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,26 (m, 20H, (CH2)10), 1,59 (m, 4H, OCH CH et H-
13), 2,01, 2,05, 2,12 et 2,17 (s, 3H, OCOCH3), 2,29 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, IH, J= 7,89 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, IH, J= 7.89 Hz, OCHDCH2), 3,67 (s, 3H, COOCH3), 4,05 (ddd, IH, J= 9,56 Hz et 5,57 Hz, H-5), 4,1 (dd, IH, J≈ 5,57 Hz et 12,32 Hz, H-6a), 4,29 (dd, IH, J= 5,57 Hz et 12,32 Hz, H-6b), 4,8 (d, IH, J≈ 1,85 Hz, H-l), 5,23 (dd, IH, J= 1,85 Hz et 3,23 Hz, H-2), 5,27 (dd, IH, J= 9,97 Hz et 9,56 Hz, H-4), 5,35 (dd, IH, J≈ 9,97 Hz et 3,23 Hz, H-3).
d) Synthèse de l' -D-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle
On traite 3,63 g de produit obtenu à l'étape précédente (6,01 mmol) en solution dans 12 cm3 de méthanol par 3 cm3 de méthylate de sodium 2N (6,01 mmol). Lorsque la réaction terminée, on neutralise cette dernière avec de l'Amberlite IR120 (1 équivalent poids/volume), on filtre et on évapore à sec sous vide.
!H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,59 (m, 4H, OCH2ÇH2 et H- 13), 2,34 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H- 14), 3,41 (m, IH, J≈ 6,71 Hz, OCHaCH2), 3,74 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH3OCO), 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H- 4, H-5 et H-6), 4,75 (d, IH, J≈ 1,82 Hz, H-l).
e) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl-a-D-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle A 2 g (4,56 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente d) en solution dans 20 cm3 de diméthylformamide (DMF) anhydre, on ajoute successivement 4,54 g d'iodure de potassium (27,36 mmol), 1,09 g d'hydrure de sodium 60% (27,36 mmol) et 3,25 cm3 de bromure de benzyle (27,36 mmol). Après 12 heures, on ajoute 18,24 cm3 d'une solution saturée de chlorure d'ammonium, et on laisse agir pendant 10 minutes. Puis, on dilue avec de l'eau et on extrait la phase organique par de l'acétate d'éthyle. Celle- ci est ensuite lavée avec de l'eau et de la saumure, et est finalement séchée par du sulfate de magnésium. On effectue par ailleurs un lavage supplémentaire par une solution saturée de thiosulfate de sodium afin d'éliminer les ions iodures. On évapore sous vide et on purifie l'huile résultante dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 9: 1. Le produit est obtenu avec un rendement de 60 %.
IH RMN (CDCI3) : d (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,49 (m, 2H, OCH2CH2), 1,59 (m, 2H, H-13), 2,31 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H-14), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH3OCO), 3,75 (m, IH, J= 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH2Phe), 3,90 (dd, 1H, J= 6,21 Hz et J= 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH^Phe), 4,52 (dd, J= 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH^Phe), 4,63 (s, 2H, ÇH2Phe), 4,69 (dd, IH, J= 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (IH, J= 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, IH, J≈ 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H, Phe).
f) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl- -D-mannopyranoside de l'acide pentadécanoïque
A 0,50 g (0,73 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente e) en solution dans 7 cm3 de méthanol, on ajoute 4,68 cm3 d'une solution de soude 25 %. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 30 minutes. Puis, on neutralise le mélange à froid avec une solution d'acide chlorhydrique 5 %. On extrait la phase organique par de l'acétate d'éthyle, et on évapore à sec sous vide. La purification se fait dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 4:6. Le produit est obtenu avec un rendement de 62 %. ÏH RMN (CDClj) : d (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)Î 0), 1,49 (m, 2H, OCH2CH2), 1,59 (m, 2H, H-13), 2,34 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H-14), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,75 (m, IH, J≈ 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH2Phe), 3,90 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, IH, J= 6,21 Hz et J≈ 1 1,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH2Phe), 4,52 (dd, J≈ 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH^Phe), 4,69 (dd, IH, J≈ 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (IH, J≈ 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, IH, J≈ 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H, Phe).
g) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl- -D-mannopyranoside de N-octadécyl-15- carbamoyl-pentadécanyle A 0,29 g (0,37 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente f), en solution dans 5 cm3 de chloroforme, on ajoute successivement du 0,23 g de BOP (0,52 mmol), 0,21 cm3 de diisopropyléthylamine (1,48 mmol) et 0,12 g d'octadécylamine (0,44 mmol). Lorsque la réaction est achevée, on dilue par du dichlorométhane et on effectue un lavage par de l'eau. Puis, on sèche par du sulfate de magnésium et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un rendement de 98 %.
*H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 VLÏ, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH )25), 1,47 (m, 4H, OCH2CH2 et H- 17), 1,58 (m, 2H, H- 13), 2,13 (t, 2H, J≈ 7,92 Hz, H- 14), 3,23 (m, 2H, H-16), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHhCH2), 3,75 (m, IH, J≈ 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH2Phe), 3,90 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH^Phe), 4,52 (dd, J≈ 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH2Phe), 4,69 (dd, IH, J≈ 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (IH, J≈ 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, IH, J≈ 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 5,37 (bande, IH, HNCO), 7,35 (m, 20H, Phe).
h) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl- -D-mannopyranoside de 15- octadécylamino-pentadécanyle A 0,77 g (0,75 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente g), dans 15 cm3 de tétrahydrofuranne (THF) anhydre, on ajoute 0,056 g d'hydrure de lithium aluminium AlLiH4 (1,50 mmol). On chauffe à reflux pendant 10 heures. Puis, le mélange réactionnel est refroidi dans un bain de glace et on ajoute 56 μl d'eau, puis 1 12 μl de soude 2N après 10 minutes, et enfin encore 56 μl d'eau 10 minutes plus tard. On filtre et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié dans un mélange de dichlorométhane/méthanol/ammoniac 28 % 9:2:0,5. Le produit est obtenu avec un rendement de 86 %. lH RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH2)25), 1,4-1,6 (m, 9H, OCH ÇH2, H-17, H-14, H-17et NH), 2,57 (t, 4H, J≈ 7,92 Hz, H-15 et H- 16), 3,34 (m, IH, J≈ 6,71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHhCH?), 3,75 (m, IH, J≈ 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CE^Phe), 3,90 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH2Phe), 4,52 (dd, J≈ 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH^Phe), 4,69 (dd, IH, J≈ 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (IH, J≈ 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, IH, J≈ 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H, Phe).
i) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl- -D-mannopyranoside de (3-[4-(3-tert- butoxycarbonyl-amino-propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert- butoxycarbonyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,63 g (0,61 mmol) d'une solution de produit obtenu précédemment à l'étape h), dans 10 cm3 de chloroforme, on ajoute successivement 0,38 g de BOP (0,85 mmol), 0,425 cm3 de diisopropyléthylamine (2,44 mmol) et 0,48 g d'acide 3-[4-(3-tert- butoxycarbonyl-amino-propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl- amino] -acétique (FRM 375) (0,73 mmol) obtenu à l'étape a). Au bout de 4 heures, on dilue par du dichlorométhane et on effectue un lavage à l'eau. On sèche par du sulfate de magnésium et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un rendement de 80 %. *H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J= 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH )25), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH ÇH2, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 et H-44),l,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 3,09-3 ,33 (m, 12H, H-36, H-38, H- 39, H-42, H-43 et H-45), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,75 (m, IH, J≈ 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, ÇH2Phe), 3,90 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 1 1,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, IH, J≈ 6,21 Hz et J≈ 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH Phe), 4,52 (dd, J≈ 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH2Phe), 4,63 (s, 2H, ÇH^Phe), 4,69 (dd, IH, J≈ 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (IH, J≈ 2,52 Hz, H-l), 4,85 (dd, IH, J≈ 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 18H, Phe).
j) Synthèse de l' -D-mannopyranoside de (3-[4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino- propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl-amino]-méthylène- carbamoyl)-! 5-pentadécanyl-l 6-octadécyle
A 0,63 g (0,38 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente i), dans 5 cm3 de méthanol, on ajoute 10 % de palladium sur charbon (0,027 g). La solution est agitée sous pression d'hydrogène a température ambiante. Au bout de 6 heures, on filtre puis on évapore à sec sous vide. La réaction est quantitative.
*H RMN (CD3OD) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH2)25), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH9CH3,, H- 17, H- 14, H- 17, H-37, H-40, H-41 et H- 44), 1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 3,09-3 ,33 (m, 12H, H- 36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 et H-6), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCH CH2), 4,72 (IH, J≈ 2,52 Hz, H-l).
k) Synthèse de l'a-D-mannopyranoside de (3-[4-(3-amino-propyl-amino)-butyl- amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécyle(composé 1) A 0,37 g (0,28 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente j), on ajoute 21,50 cm1 de tétrahydrofuranne (TFA) distillé. Après 1 heure, le mélange réactionnel est concentré à froid et lyophilisé. On vérifie le degré de pureté du produit en solution dans du méthanol par CLHP comme décrit dans la partie "Matériel et Méthodes".
*H RMN (CD3OD) : 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 14H, (CH2)25), 1,4- 1,6 (m, 17H, OCH2ÇH2, H- 17, H- 14, H- 17, H-37, H-40, H-41 et H-44), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 2,92 (m, 2H, H-45), 2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3,34 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 et H-6), 3,63 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCH CH2), 4,72 (IH, J≈ 2,02 Hz, H-l).
Exemple 2 : synthèse du 6-désoxy-α-L-mannopyranoside de (3-[4-(3-amino- propyI-amino)-butyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyI-16- octadécyle (composé 2)
a) Synthèse de l'acide 3-[4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino-propyl-tert- butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxγcarbonyl-amino] acétique (FRM 375) A une solution de spermine (5 g ; 24,96 mmoles) dans du méthanol (125 ml), on ajoute du cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN (0,548 g ; 8,74 mmoles). La solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une ampoule isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (2,34 g ; 25,46 mmoles) dans du méthanol (80 ml). Après une nuit, on ajoute au mélange de la triéthylamine (3,86 ml ; 27,71 mmoles) et du di-tert-butyl dicarbonate (27,67 g ; 129,79 mmoles) solubilisé dans du tétrahydrofuranne (55 ml). Après une nuit, on concentre à l'évaporateur rotatif puis on reprend par de l'acétate d'éthyle (63 ml) et on effectue un lavage à l'hydrogénosulfate de potassium et à la saumure. Puis on sèche sur sulfate de magnésium et on concentre. Le produit obtenu est purifiée par chromatographie (CH2Cl2/MeOH 9 : 1). Le rendement est de 30%.
*H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,42 (s, 36H, C(CH3)3), 1,45 (m, 4H, CH2), 1,60 (m, 4H, CH2), , 3,04-3,33 (m, 12H, CH2), 3,91 (s, 2H, NCH2COO). b) Synthèse du 15-hydroxy~pentadécanoate de méthyle
A 10 g de pentadécalactone (41 ,60 mmol) dans 41,60 cm3 de méthanol, on ajoute 6,66 cm3 de méthylate de sodium 2N (13,31 mmol) à 0°C. Après 9 heures, on ajoute 9,24 cm3 d'acide acétique et on laisse agir pendant 15 minutes. Puis on évapore à sec sous vide la solution qui est ensuite reprise par du dichlorométhane, et on effectue un lavage au bicarbonate de sodium. On sèche la phase organique obtenue par du sulfate de magnésium et on évapore le solvant à l'évaporateur rotatif. La purification se fait dans un mélange hexane/acétate d'éthyle 6:4. On obtient le 1-ol-pentadécanoate de méthyle avec un rendement de 80 %. *H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,26 (m, 12H, (CH2)10), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H-13), 2,30 (t, 2H, J≈ 7.60 Hz, H-14), 3,64 (t, IH, J≈ 5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H- 16).
c) Synthèse du 2,3,4-tri-0-acétyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle
A O°C, on ajoute 2,49 cm3 de chlorure d'étain (21,30 mmol) à 3,55 g de rhamnose tétraacétylé (10,65 mmol) dans 27 cm3 de dichlorométhane pendant 30 minutes. Puis on additionne 3,48 g de l-ol pentadécanoate de méthyle précédemment obtenu (12,78 mmol). Après 2 heures, le mélange réactionnel est dilué par de l'éther éthylique et on verse dans une solution de phosphate de sodium (Na2PO4). Les phases aqueuses sont extraites avec du diéthyléther et les phases organiques sont successivement lavées par une solution de carbonate de sodium, de la saumure, puis séchées par du sulfate de magnésium. Après évaporation à sec sous vide, on purifie par chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 7:3. Le produit est obtenu avec un rendement de 60 %.
*H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,20 (d, 3H, J≈ 6,45 Hz, H-6), 1,26 (m, 20H, (CH2)io), 1,59 (m, 4H, OCH2ÇH2 et H- 13), 1,98, 2,04 et 2,16 (s, 3H, OCOCH3), 2,29 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, COOÇH3), 3,88 (m, IH, J≈ 6,45 Hz et 9,97 Hz, H-5), 4,70 (d, IH, J≈ 1, 72 Hz, H-l), 5,06 (dd, IH, J≈ 9,97 Hz et 9,97 Hz, H-4), 5,22 (dd, IH, J≈ 1, 72 Hz et 3,52 Hz, H-2), 5,30 (dd, IH, J≈ 3,52 Hz et 9,97 Hz, H-3). d) Synthèse de l'a-désoxy-L-6-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle
On traite 5,08 g de produit obtenu à l'étape c) (9,34 mmol) en solution dans 20 cm3 de méthanol par 9,34 ml de méthylate de sodium 2N (18,68 mmol). Lorsque la réaction est achevée, on neutralise le mélange réactionnel avec de l'Amberlite IR120, on filtre et on évapore à sec sous vide.
!H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,20 (d, 3H, J≈ 6,45 Hz, H-6), 1,26 (m, 20H, (CH2)ιo), 1,59 (m, 4H, OCH9CH2 et H-13), 2,29 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H- 14), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,66 (m, IH, J≈ 6,71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH3OCO), 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 et H-5), 4,70 (d, IH, J≈ 1,72 Hz, H-l).
e) Synthèse du 2,3,4-tri-0-benzyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle
A 2,09 g (5,00 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente d), dans 30 cm3 de diméthylformamide (DMF) anhydre, on ajoute successivement 3,32 g d'iodure de potassium (20,00 mmol), 0,80 g d'hydrure de sodium 60 % (20,00 mmol) et 2,38 cm3 du bromure de benzyle (20,00 mmol). Après 12 heures, on ajoute 20 cm3 d'une solution saturée de chlorure d'ammonium et on laisse agir pendant 10 minutes. Puis, on dilue avec de l'eau et on extrait la phase organique par de l'acétate d'éthyle. Celle- ci est ensuite lavée avec de l'eau et de la saumure, avant d'être finalement séchée par du sulfate de magnésium. Par ailleurs, un lavage supplémentaire par une solution saturée de thiosulfate de sodium est effectué afin d'éliminer les ions iodures. On évapore à sec sous vide et on purifie l'huile résultante dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 9:1. Le produit est obtenu avec un rendement de 60 %.
'H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)ιo), ,33 (d, 3H, J≈ 6,21 Hz, H-6), 1,59 (m, 4H, OCH7CH7 et H- 13), 2,31 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H- 14), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 (dd, IH, J≈ 8,96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH3OCO), 3,68 (m, IH, J≈ 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, IH, J≈ 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J≈ 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH2Phe), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l), 7,35 (m, 15H, Phe). f) Synthèse du 2,3,4-tri-0-benzyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de l'acide pentadécanoïque
A 0,50 g (0,73 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente e), dans 7 cm3 de méthanol, on ajoute 4,68 ml de soude 25 %. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 30 minutes. Puis, on neutralise le mélange à froid avec une solution d'acide chlorhydrique 5 %. On extrait la phase organique par de l'acétate d'éthyle et on évapore à sec sous vide. La purification se fait dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 4:6. Le produit est obtenu avec un rendement de 72 %.
'H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)ι o), 1,33 (d, 3H, J≈ 6,21 Hz, H-6), 1,59 (m, 4H, OCH2ÇH2 et H-13), 2,34 (t, 2H, J≈ 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 (dd, IH, J≈ 8,96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OÇHbCH2), 3,68 (m, IH, J≈ 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, IH, J≈ 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J≈ 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, ÇH^Phe), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l), 7,35 (m, 20H, Phe).
g) Synthèse du 2,3,4-tri-0-benzyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de N-octadécyl- 15-carbamoyl-pentadécanyle
A 0,70 g (1 ,04 mmol) d'une solution de produit précédemment obtenu à l'étape f), dans 13 cm3 de chloroforme, on ajoute successivement 0,69 g de BOP (1,56 mmol), 0,72 cm3 de diisopropyléthylamine (4,16 mmol) et 0,34 g d'octadécylamine (1,25 mmol). Lorsque la réaction est terminée, on dilue par du dichlorométhane, on effectue un lavage à l'eau, on sèche sur sulfate de magnésium, et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un rendement de 84 %. 'H RMN (CDC13) : δ (ppm 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH2)25), 1,33 (d, 3H, J≈ 6,21 Hz, H-6), 1,47 (m, 4H, OCH7CH7 et H- 17), 1,58 (m, 2H, H- 13), 2,13 (t, 2H, J≈ 7,92 Hz, H- 14), 3,23 (m, 2H, H- 16), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 (dd, IH, J≈ 8,96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, IH, J≈ 6,71 Hz, OCHbCH2), 3,68 (m, IH, J≈ 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, IH, J≈ 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J≈ 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH?Phe), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l), 5,37 (bande, IH, HNCO), 7,35 (m, 15H, Phe).
h) Synthèse du 2,3,4-tri-0-benzyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de 15-octadécyl- am in o-pentadécanyle A 0,81 g (0,86 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente g), dans 15 cm3 de tétrahydrofuranne (THF) anhydre, on ajoute 0,065 g d'hydrure de lithium; aluminium AlLiH4 (1,72 mmol), et on chauffe à reflux pendant 10 heures. Puis, le mélange réactionnel est refroidi dans de un bain de glace et on ajoute 65 μl d'eau, puis 130 μl de soude 2N au bout de 10 minutes, et enfin à nouveau 65 μl d'eau après 10 minutes. On filtre et on évapore à sec sous vide. La purification se fait dans un mélange dichlorométhane/méthanol/ammoniac 28% 9:2:0,5. Le produit est obtenu avec un rendement de 93 %.
'H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH2)25), 1,33 (d, 3H, J≈ 6,21 Hz, H-6), 1,4-1,6 (m, 9H, OCH2ÇH2, H- 17, H- 14, H-17et NH), 2,57 (t, 4H, J≈ 7,92 Hz, H-15 et H-16), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 (dd, IH, J≈ 8,96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,68 (m, IH, J≈ 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, IH, J≈ 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J≈ 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH^Phe), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l), 7,35 (m, 15H, Phe).
i) Synthèse du 2,3,4-tri-0-benzyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3-[4-(3-tert- butoxycarbonyl-amino-propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert- butoxycarbonyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,78 g (0,86 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente h), en solution dans 7 cm3 de chloroforme, on ajoute successivement 0,53 g de BOP (1,20 mmol), 0,30 cm3 de diisopropyléthylamine (1,72 mmol) et 0,62 g de FRM 375 obtenu à l'étape a) (0,95 mmol). Après 4 heures, on dilue avec du dichlorométhane, on effectue un lavage à l'eau, on sèche sur sulfate de magnésium, et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie "flash" dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un rendement de 72 %. 'H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H, (CH2)25), 1,33 (d, 3H, J≈ 6,21 Hz, H-6), 1,4-1 ,6 (m, 17H, OCH7CH?, H- 17, H- 14, H- 17, H-37, H-40, H-41 et H-44),l,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 3,09- 3 ,33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,65 (s, 2H, CH2Phe), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,68 (m, IH, J≈ 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,99 (s, 2H, CH2Phe), 4,02 (dd, i H, J= 8,96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 4.32 (s, 2H, CH^Phe), 4.57 (dd, IH, J≈ 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l), 4,82 (dd, J≈ 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 7,35 (m, 18H, Phe).
j) Synthèse du 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3-[4-(3-tert-butoxycarbonyl- amino-propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl-amino]- méthylène-carbamoyl)-! 5-pentadécanyl-l 6-octadécyle
A 0,74 g (0,48 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente i), en solution dans 10 cm3 de méthanol, on ajoute 10 % (0,034 g) de palladium sur charbon. La solution est agité sous pression d'hydrogène a température ambiante. Après 4 heures, on filtre puis on évapore à sec sous vide. La réaction est quantitative.
'H RMN (CD3OD) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J≈ 6,45 Hz,
H-6), 1,27 (m, 14H, (CH2)25), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH2ÇH2, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 et H-44),l,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 3,09-
3 ,33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,40 (m, IH, J≈ 6,71 Hz,
OCHaCH2), 3,66 (m, IH, J≈ 6,71 Hz, OCHbCH2), 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 et
H-5), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l).
k) Synthèse du 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3-[4-(3-amino-propyl-amino)- butyl-amino]-méthylene-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécyle (composé 2)
A 0,40 g (0,31 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente j), on ajoute 24 cm3 de tétrahydrofuranne (TFA) distillé. Après 1 heure, le mélange réactionnel est évaporé sous vide à froid et à sec, puis est lyophilisé. On vérifie le degré de pureté du produit en solution dans du méthanol par CLHP. 'H RMN (CD3OD) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J≈ 6,45 Hz, H-6'), 1,27 (m, 14H, (CH )25), 1 ,4-1,6 (m, 17H, OCH2CH2, H- 17, H-14, H-l 7, H- 37, H-40, H-41 et H-44), 2,8-2,9 (m, 6H, H-l 5, H-16 et H-35), 2.92 (m, 2H, H-45), 2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3,40 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, IH, J≈ 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 et H-5), 4,73 (IH, J≈ 2,01 Hz, H-l).
Exemple 3 : Synthèse du 6-désoxy-β-L-galactopyrannoside du l-[-(3-[4-(3- amino-propyl-amino)-butyl-amino-propyl-amino]-méthyIène-carbamoyl)-15- pentadécanyl-16-octadécanyle (composé 3)
a) Synthèse de l'acide {3-[4-(3-benzyloxycarbonyl-amino-propyl- benzyloxycarbonyl-amino)-butyl-benzyloxycarbonyl-amino]-propylamino} acétique
A une solution de spermine (10 g ; 49,91 mmoles) dans du méthanol (200 ml), on ajoute du cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN (1,10 g ; 17,47 mmoles). La solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une ampoule isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (4,59 g ; 49,91 mmoles) dans du méthanol (120 ml). Après une nuit, on place le mélange réactionnel dans un bain de glace et on ajoute successivement de la soude 2N (34 ml) et du chloroformate de benzyle (14,25 ml ; 99,82 mmoles) en 10 portions. On mélange vigoureusement en maintenant le bain entre 5°C et 10°C. Au bout de 2 heures à température ambiante, le mélange est extrait avec de l'éther et neutralisé par une solution d'acide chlorhydrique 5N. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, et on concentre à l'évaporateur rotatif. Le produit obtenu est purifié par chromatographie (100 % CH2C12 puis CH2Cl2/MeOH 9 : 1). Le rendement est de 52%.
!H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 1,28 (t, 4H, CH2), 1,60 (m, 4H, CH2), , 3,04-3,33 (m, 12H, CH2), 3,49 (s, 2H, NCH COO), 5,07 (s, 8H, CH2), 7,27 (m, 20H, Phe).
b) Synthèse du 15-hydroxypentadécanoate de méthyle La pentadécalactone (10 g ; 41,6 mmol) en solution dans du méthanol (41,6 ml) est traitée par du méthylate de sodium 2N (6,656 ml ; 13,31 mmol) à 0°C. Après 9 heures, on ajoute 9,24 ml d'acide acétique et on laisse agir pendant 15 minutes. Puis on concentre la solution et l'huile résultante est dissoute dans du dichlorométhane et lavée par du bicarbonate de sodium. Après décantation, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et on évapore. La purification se fait dans un mélange 6 : 4 hexane/acétate d'éthyle (AcOEt) pour donner le 15-hydroxypentadécanoate de méthyle avec un rendement de 80%.
!H RMN (CDC13) : δ (ppm) 1,29 (m, 20H, (CH2)ιo), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H- 13), 2,30 (t, 2H, J≈ 7.60 Hz, H- 14), 3,64 (t, IH, J≈ 5,84 Hz, H-l), 3,67 (s, 3H, H-16).
c) Syntèse de la N-octadécyl-15-hydroxypentadécanamide
On fond 10g de 15-hydroxypentadécanoate de méthyle obtenu à l'étape précédente b) (36,85 mmol) et 19,86 g d'octadécylamine (73,70 mmol) à 150°C sous vide. Au bout de 24 heures, le mélange est refroidi et dilué par du dichlorométhane. On obtient un précipité qui est filtré sur Bϋchner. Le solide obtenu est ensuite recristallisé dans le méthanol pour donner la N-octadécyl-15-hydroxypentadécanamide avec un rendement de 100 %.
*H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m, 54H, (CH )27), 1,4-1,6 (m, 6H, H-2, H- 13 et H- 17), 2,30 (t, 2H, J≈ 7.60 Hz, H- 14), 3,25 (m, 2H, H-l 6), 3,64 (t, 2H, J≈ 5,84 Hz, H-l), 5,39 (bande NHCO).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,48 (C-33), 25,3 et 26,3 (C-2 et C-13), 29,72 ((CH2)27)), 36,7 et 34,8 (C-14 et C-16), 63,6 (C-l), 174,31 (CO).
d) Synthèse du 15-octadécylamino-pentadécanol
A une solution de 20 g de N-octadécyl-15-hydroxypentadécanamide obtenu à l'étape précédente c) (39,22 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (250 ml), on ajoute 2,98 g d'hydrure de lithium aluminium LiAlH4 (78,44 mmol). La réaction se fait à reflux pendant 10 heures. Après avoir refroidi le mélange réactionnel, on ajoute successivement de l'eau (2,98 ml) et de la soude 2N (2,98 ml). Après 10 minutes, on rajoute de l'eau (2,98 ml). Le précipité formé est filtré sur Bϋchner et le filtrat est concentré à l'évaporateur rotatif pour donner le 15-octadécylamino-pentadécanol.
*H RMN (CDC13) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m, 54H, (CH2)27), 1 ,43-1,59 (m, 7H, H-2, H- 14, H- 17 et bande NH), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H-13), 2,60 (t, 4H, J≈ 6,50 Hz, H-15 et H- 16), 3,64 (t, 2H, J≈ 5,84 Hz, H-l).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,48 (C-33), 25,3 et 26,3 (C-2 et C-14), 29,72 ((CH2)27)), 51,7 (C-15 et C-16), 63,6 (C-l).
e) Synthèse du N-fbenzyloxycarbonylJ-15-octadécylamino-pentadécanol
On ajoute goutte à goutte 7,89 ml de chloroformate de benzyle (55,26 mmol) à une solution refroidie à 0°C de 15-octadécylamino-pentadécanol obtenu à l'étape précédente d) (13,71 g ; 27,63 mmol) et de triéthylamine (7,7 ml ; 55,26 mmol) dans du dichlorométhane sec (150 ml). Après 10 minutes, on vérifie le pH du mélange. Le mélange réactionnel est ensuite laissé à température ambiante pendant une nuit. Puis, la solution est lavée par de l'eau, séchée sur sulfate de magnésium (MgSO4) et concentrée. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie (heptane/AcOEt 6 : 4). On obtient le N-[benzyloxycarbonyl]-15-octadécylamino-pentadécanol avec un rendement de 70%>.
*H RMN (CDCI3) : δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m, 54H, (CH2)27), 1,43-1,59 (m, 6H, H-2, H-l 4, H-l 7), 3,20-3,22 (m, 4H, H-15 et H-l 6), 3,64 (t, 2H, J≈ 5,84 Hz, H-l), 5,12 (s, 2H, OCH2Phe), 7,34 (m, 5H, Phe).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,48 (C-33), 25,8, 26,9 et 31,94 (C-2, C-14 et C-l 7), 29,72 ((CH2)27)), 47,26-48,04 (C-15 et C-16), 63,08 (C-l), 66,79 (OCH2), 128,40 (Phe).
f) Synthèse du 2,3,4-tri-0-acétyl-6-désoxy-$-L-galactopyrannoside du 15-fN- (benzyloxycarbonyl)-octadécylamino]-pentadécanyle
1,5 g de fucose tétraacétylé (4,52 mmol) sont mis à réagir avec 0,634 ml de tétrachlorure d'étain (5,42 mmol) dans de l'acétonitrile séché (50 ml) pendant 30 minutes. Puis on ajoute 3, 132 g de N-[benzyloxycarbonyl]-15-octadécylamino- pentadécanol obtenus à l'étape précédente e) (4,97 mmol). Après 5 heures, la réaction est extraite et le produit obtenu est alors purifié par chromatographie (heptane/acétate d'éthyle 6 : 4). Le rendement est de 69 %. !H RMN : δ (ppm) 0,87 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J≈ 6,51 Hz, H-6), 1,25 (m, 54H, (CH2) 7), 1,52 (m, 6H, OCH2CH2, H-14 et H- 17), 1,95, 2,05 et 2,15 (s, 3H, OCOCH3), 3,14-3.25 (m, 4H, H-15 et H-16), 3,44 (m, IH, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, OCHbCH2), 3,79 (m, IH, H-5), 4,41 (d, IH, J≈ 7,98 Hz, H-l), 4,99 (dd, IH, J≈ 3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), 5,09 (s, 2H, OCH?Phe), 5,16 (dd, IH, J≈ 7,98 Hz et 10,46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J≈ 3,52 Hz et 3,37Hz, H-4), 7.32 (m, 5H, Phe).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,68 (C-33), 17,31 (C-2), 20,75 (CH3COO), 27,29 (C-6), 29,72 ((CH2)27)), 25,89-31,98 (OCH7CH7, C-14, C-l 7), 47.25-48.04 (C-15 et C-16), 66.91 (CH2Phe), 69,63 (OCH7CH7), 69,45 (C-2), 70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3), 96,25 (C-l), 128.43 (Phe), 156.21 et 171,30 (CO).
g) Synthèse du 2,3,4-tri-O-acétyl-ό-désoxy-β-L-galactopyrannoside du 15- octadécylamino-pentadécanyle
A une solution de 2,3,4-tri-O-acétyl-6-désoxy-β-L-galactopyrannoside du 15-[N- (benzyloxycarbonyl)-octadécylamino]-pentadécanyle obtenu à l'étape précédente f) (2,72 g ; 4,23 mmol) dans du méthanol (100 ml), on ajoute du palladium sur charbon actif à 10% (0,5 g) sous pression d'hydrogène. La réaction est quantitative.
!H RMN : δ (ppm) 0,87 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J≈ 6,51 Hz, H-6), 1,25 (m, 54H, (CH2)27), 1,52 (m, 6H, OCH2ÇH2, H-14 et H-l 7), 1.88-1.93 (bande NH),1,95, 2,05 et 2,15 (s, 3H, OCOCH3), 2,64 (m, 4H, H-15 et H-l 6), 3,46 (m, IH, OCHaCH2), 3,63 (m, IH, OCHbCH ), 3,79 (m, IH, H-5), 4,41 (d, IH, J≈ 7,98 Hz, H-l), 4,99 (dd, IH, J≈ 3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), 5,16 (dd, IH, J≈ 7,98 Hz et 10,46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J≈ 3,52 Hz et 3,31Hz, H-4).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,68 (C-33), 17,31 (C-2), 20,75 (CH3COO), 27,29 (C-6), 29,72 ((CH2)27)), 25,89-31,98 (OCH2ÇH2, C-14, C-l 7), 47.75-48.04 (C-15 et C-16), 69,63 (OCH2CH2), 69,45 (C-2), 70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3), 96,25 (C-l), 171,30 (CO).
h) Synthèse du 2,3,4-tri-0-acétyl-6-désoxy- -L-galactopyrannoside du (3-[4-(3- amino-propyl-amino)-butyl-amino-propyl-benzyloxycarbonyl-amino]-méthylene carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécanyle
A une solution de 0,60 g du composé obtenu à l'étape précédente g) (0,94 mmol) dans du chloroforme (15 ml), on ajoute successivement de la diisopropyléthylamine (0,491 ml ; 2,82 mmol), du BOP (0,457 g ; 1,03 mmol) et devl'acide {3-[4-(3- benzyIoxycarbonyI-amino-propyl-benzyIoxycarbonyl-amino)-butyI- benzyloxycarbonyl-amino]-propylamino} -acétique obtenu à l'étape a) (0,748 g ; 0,94 mmol). L'huile résultante est purifié par chromatographie (heptane/acétate d'éthyle 4 : 6). On obtient le 2,3,4-tri-<9-acétyl-6-désoxy-β-L-galactopyrannoside du (3-[4-(3- amino-propyl-amino)-butyl-amino-propyl-benzyloxycarbonyl-amino]-méthylene- carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-octadécanyle avec un rendement de 45 % . *H RMN : δ (ppm) 0,87 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J≈ 6,51 Hz, H-6), 1,24 (m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 15H, OCH7CH7, H- 14, H-l 7, NH, CH2), 1,95, 2,05 et 2,15 (s, 3H, OCOCH3), 3,05-3,35 (m, 18H, H-15, H-16 et CH7N), 3,43 (m, IH, OCHaCH2), 3,67 (m, IH, J≈ 6, 74 Hz, OCHbCH2), 3,79 (m, IH, H-5), 4,41 (d, IH. J≈ 7,98 Hz, H-l), 4,99 (dd, IH, J≈ 3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), 5,05 (s, 8H, CH2Phe), 5,16 (dd, IH, J≈ 7,98 Hz et 10,46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J≈ 3,52 Hz et 3,37Hz, H-4), 5,47 (bande CONH, IH), 7.32 (m, 20H, Phe).
13C RMN (CDCI3) : δ (ppm) 14,84 (C-33), 20,75 (CH3COO), 27,29 (C-6'), 29,72 ((CH )27)), 25,89-31,98 (OCH2CH2, C-14, C-17 et CH2), 37.87-46.87 (C-15, C-16 et C-N), 66,84 (CH2Phe), 68,63 (OCH7CH7), 69,45 (C-2), 70,57 (C-5), 70,85 (C-4), 71 ,44 (C-3), 96,25 (C-l), 128,31 (Phe), 157,01 et 171,30 (CO).
i) Synthèse du 6-désoxy- -L-galactopyrannoside du l-[-(3-[4-(3-amino-propyl- amino)-butyl-amino-propyl-benzyloxycarbonyl-amino]-méthylène -carbamoyl)-15- pentadécanyl-16-octadécanyle A une solution méthanolique (3 ml) contenant le produit obtenu à l'étape précédente h) (0,60 g ; 0,94 mmol) on ajoute une solution méthanolique (1 ml) saturée d'ammoniac. Après une heure, on concentre.
*H RMN : δ (ppm) 0,87 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 2H, J≈ 6,51 Hz, H-6), 1,24 (m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 15H, OCH2CH2, H- 14, H-17, NH, CH ), 3,05- 3,35 (m, 18H, H-15, H-16 et CH?N), 3,4-3,7 (m, 6H, OCH2CH2, H-3, H-4, H-5, H- 2), 4,73 (d, IH, J≈ 7,98 Hz, H-l), 5,05 (s, 8H, ÇH2Phe), 5,47 (bande CONH, IH), 7.32 (m, 20H, Phe). j) Synthèse du 6-désoxy- -L-galactopyrannoside du l-[-(3-[4-(3-amino-propyl- amino)-butyl-amino-propyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16- octadécanyle (composé 3)
A une solution du produit obtenu à l'étape précédente i) (0,072 g ; 0,05 mmol), on ajoute du palladium sur charbon à 10% (0,032 g) dans du méthanol. Après une nuit, on filtre sur papier en verre et on concentre à l'évaporateur rotatif. Le produit est ensuite purifié par CLHP sur une colonne préparative de type C-4.
*H RMN : δ (ppm) 0,87 (t, 3H, J≈ 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 2H, J≈ 6,51 Hz, H-6), 1,24 (m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 15H, OCH2CH , H- 14, H- 17, CH2), 2,92-3,19 (m, 18H, H-l 5, H-16 et CH2N), 3,4-3,7 (m, 6H, OCH2CH2, H-3, H-4, H-5, H-2), 4,73 (d, 1H, J= 7,98 Hz, H-l).
C \ UTILISATION DES AGENTS DE TRANSFERT SELON L'INVENTION
Exemple 4 : préparation de complexes agent de transfert/acide nucléique avec le composé 2 et mesure de leur taille
Cet exemple illustre la préparation de complexes entre un agent de transfert selon l'invention et un acide nucléique, leur taille ayant ensuite été mesurée.
Le glycolipide utilisé dans cet exemple et dans les exemples qui suivent est le composé 2 , en solution dans du chloroforme, à une concentration de 10 mg/ml. Dans certains cas, un co-lipide neutre, cholestérol ou DOPE, a été préalablement mélangé au composé 2.
La solution lipidique est préparée de la façon suivante : un échantillon de quantité désirée est prélevé, le solvant est évaporé sous flux d'argon et on laisse sécher pendant 1 heure. Puis, le lipide est réhydraté avec une solution contenant du dextrose 5% et lO mM de chlorure de sodium pendant toute une nuit à 4°C. Le jour suivant, les solutions lipidiques sont chauffées à 60°C pendant 5 minutes puis passées aux ultrasons pendant 1 minute. L'opération est répétée jusqu'à ce que la taille des particules lipidiques soit stable.
L'ADN utilisé est le plasmide pXL3031 (figure 1) en solution dans un mélange de dextrose 5% et de chlorure de sodium 10 mM à une concentration de 0,5 mg/ml ou de 1,0 mg/ml. Ce plasmide contient le gène lue codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus. Sa taille est de 3671 bp. Le schéma de ce plasmide est représentée à la figure 1. Le plasmide pXL3031 a été purifié selon les méthodes décrites dans la demande de brevet WO 97/35002.
Les complexes composé 2/ADN sont préparés en mélangeant rapidement des volumes appropriés de solution d'ADN plasmidique et de composé 2 (selon le rapport de charges désiré), à température ambiante. La quantité d'agent transfectant varie entre 0,25 nmoles/μg d'ADN et 12 nmoles/μg d'ADN. La taille des complexes a été analysée en mesurant le diamètre hydrodynamique par diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Laser Light Scattering) à l'aide d'un appareil Coulter N4Plus. Les échantillons sont dilués 20 fois dans une solution contenant 5% de dextrose et 20 mM de chlorure de sodium pour éviter les diffusions multiples. A un rapport de 3 nmoles de lipide/μg d'ADN, les résultats suivants ont été obtenus :
Figure imgf000050_0001
Le terme "micelles" indique que le composé 2 a été utilisé seul, c'est-à-dire sans ajout de co-lipide neutre, et il forme donc une solution micellaire.
Ce tableau montre que les complexes obtenus ont une taille comprise entre 130 nm et 150 nm environ, ce qui est compatible avec une utilisation pharmaceutique, notamment en injection.
Exemple 5 : Comportement des complexes formés à partir du composé 2 à différents rapports de charge
Cet exemple illustre le comportement des complexes agent de transfert selon l' invention/acide nucléique lorsqu'on fait varier le rapport de charge. L'impact de l'ajout d'un co-lipide (cholestérol ou DOPE) est également illustré.
De façon classique, on distingue 3 phases physico-chimiques lorsqu'on augmente le rapport de charges agents de transfert/ADN (B. Pitard et al, Virus-sized self- assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote g ne transfer, PNAS, Vol. 94, pp. 14412-14417, 1997). Ces trois phases déterminent le potentiel thérapeutique de l'agent de transfert.
A faible rapport de charge, l'ADN n'est pas saturé par l'agent de transfert. Il reste encore de l'ADN non-complexé, et les complexes sont globalement chargés négativement et de petite taille. Cette phase, stable, est appelée "Phase A". Le fait que l'ADN ne soit pas complètement saturé par l'agent de transfert signifie que l'ADN n'est pas complètement protégé. L'ADN peut donc être soumis aux dégradations par les nucléases. Par ailleurs, les complexes étant globalement négatifs, le passage de la membrane cellulaires est difficile. Pour ces raisons, les complexes nucléolipidiques de la phase A sont relativement inactifs.
A rapport de charge intermédiaire, l'ADN est complètement saturé par l'agent de transfert, et les complexes sont globalement neutres ou légèrement positifs. Cette phase est instable car les répulsions ioniques sont minimales et un phénomène de d'agrégation peut se produire. La taille des particules est bien au dessus de la limite de détection par diffusion dynamique de la lumière (très supérieure à 3 μ ). Cette phase instable est appelée "phase B". Une telle taille de complexes n'est pas adaptée pour des utilisations en injection, bien que cela ne signifie pas que les complexes soient inactifs dans la phase B : ils sont seulement sous une formulation qui n'est pas appropriée pour leur injection dans un but pharmaceutique.
A rapport de charge plus élevé, l'ADN est sursaturé par l'agent de transfert, et les complexes sont globalement positifs. Du fait des fortes répulsions entre les charges positives, cette phase est stable. Elle est désignée sous le nom de "phase C". Contrairement à la phase A, les complexes obtenus sont sous une forme telle que l'ADN est très bien protégé vis-à-vis des nucléases, et la charge globalement positive de ces complexes facilite la fixation sur la membrane cellulaire de nature anionique et le passage de cette membrane. Les complexes de la phase C sont donc particulièrement adaptés à une utilisation pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules.
Ces 3 zones A, B et C ont été également mises à jour avec le composé 2 selon l'invention comme agent de transfert :
Figure imgf000052_0001
Comme le montre le tableau ci-dessus, la zone B, qui est la zone d'instabilité, est particulièrement petite et se situe à des rapports de charge très faibles. La zone C commence dès 2 nmoles de lipide/μg d'ADN lorsque le composé 2 est utilisé conjointement à un co-lipide (Cholestérol ou DOPE), et à partir de 3 nmoles de lipide/μg d'ADN lorsque le composé est utilisé seul. Comme cela a été précisé précédemment, c'est dans cette zone qu'il est particulièrement avantageux de se placer pour une utilisation pharmaceutique. A titre de comparaison, il a été montré avec un des lipides cationiques divulgué dans la demande WO 97/18185 que la zone C commençait à se former à des rapports de charge au moins égal à 2 selon la concentration en chlorure de sodium de la solution (voir figure 3 A dans B. Pitard et al., PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997).
Ainsi, le composé 2 est un agent de transfert particulièrement avantageux car il est stable à de faibles rapports de charge, ce qui permet de former des complexes stables avec de faibles quantités de glycolipides, avec les conséquences bénéfiques qui en découle sur le plan de la toxicité.
Exemple 6 : utilisation du composé 2 pour le transfert in vitro d'ADN Cet exemple illustre la capacité des agents de transfert selon l'invention à transfecter l'ADN dans les cellules in vitro, à différents rapports de charge, en l'absence et en présence d'un co-lipide neutre (cholestérol ou DOPE).
Des microplaques de 24 puits sont ensemencées avec 60000 cellules HeLa par puit, et sont mises en croissance une nuit. Le nombre de cellules après une nuit, et donc au moment de la transfection, est de 100000 cellules par puit.
Chaque puit est mis en contact avec les complexes formés avec le composé 2 et contenant 1 μg d'ADN plasmidique dans 0,5 ml de milieu de culture DMEM (Gibco/BRL sans sérum.. Les cellules sont incubées à 37°C pendant 5 heures. Le milieu contenant les complexes est ensuite enlevé et remplacé par un milieu de culture DMEM et 10% de sérum de veau foetal. Puis, les cellules sont à nouveau mises en culture pendant 24 heures. Enfin, les cellules sont lysées et testées en utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex MLX.
Les résultats obtenus sont indiqués sur l'histogramme de la figure 2. L'efficacité du transfert est représentée par l'expression de la luciférase en pg/puit. On constate que la transfection maximale est de 500 pg/puit environ. En conclusion, cet exemple montre clairement qu'il est possible d'utiliser le composé 2 selon l'invention pour former des complexes susceptible de promouvoir le transfert de l'ADN dans les cellules in vitro.
Exemple 7 : utilisation du composé 2 pour le transfert in vivo d'ADN Cet exemple illustre la capacité des agents de transfert selon l'invention à transfecter l'ADN dans les cellules in vivo.
Le transfert de gène in vivo a été effectué sur des souris Balb/C par administration intratrachéale, intraveineuse et intramusculaire.
Dans le cas des injections intramusculaires, chaque souris a reçu 30 μl de formulation contenant 15 μg d'ADN plasmidique dans le muscle antérieur du tibia. Les tissus sont récupérés 7 jours après l'injection, ils sont congelés et stockés à -80°C en attendant d'effectuer les tests d'activité luciférase.
Dans le cas des injections par voie intraveineuse, chaque souris a reçu 200 μl de formulation contenant 50 μg d'ADN plasmidique. Les tissus sont récupérés 24 heures après l'injection, puis sont congelés et stockés de la même façon que précédemment.
La figure 3 illustre l'activité des complexes formés avec le composé 2 pour le transfert de gène in vivo en intramusculaire. Ces résultats montrent clairement que la formation de complexes avec le composé 2 selon l'invention et de l'ADN permet de promouvoir le transfert dudit ADN dans les cellules in vivo.
De la même façon, on peut utiliser tout agent de transfert tel que défini dans la présente invention pour promouvoir le transfert d'ADN dans les cellules de tout type de tissus.

Claims

REVENDICATIONS
1. Agents de transfert d'acides nucléiques caractérisés en ce qu'ils comprennent un espaceur hydrophobe lié chimiquement d'une part à un polycation et d'autre part à au moins un substituant hydrophile.
2. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 caractérisés en ce que ledit espaceur hydrophobe est constitué de 2 ou 3 chaînes grasses linéaires hydrocarbonées comprenant entre 10 et 20 atomes de carbone par chaîne, chaque chaîne pouvant être de longueur différente, ou bien ledit espaceur hydrophobe est constitué d'une très longue chaîne grasse linéaire hydrocarbonée, comprenant entre 20 et 50 atomes de carbone.
3. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 caractérisés en ce que le ou les substituants hydrophiles sont choisis parmi les substituants hydroxy, amino, les polyols, les sucres, ou encore les peptides hydrophiles.
4. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 ou 3 caractérisés en ce que l'un au moins des substituants hydrophiles est un sucre.
5. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 de formule générale (I) :
Figure imgf000055_0001
pour laquelle : - R représente un polycation,
- Z représente un atome d'hydrogène ou un atome de fluor, les différents Z étant indépendant les uns des autres, et
- soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un groupement -OAlk où Alk représente un alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxy, un groupement amino, un polyol, un sucre, un peptide hydrophile ou non-hydrophile, ou un oligonucléotide, étant entendu que l'un au moins des substituants X et Y représente un groupe hydrophile choisi parmi les hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou les peptides hydrophiles,
- soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et 50, X est soit un atome d'hydrogène soit un groupement -OAlk où Alk représente un alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone, et Y est un groupe hydrophile choisi parmi les hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou les peptides hydrophiles, le cas échéant sous leurs formes isomères, ainsi que leurs mélanges, ou leurs sels lorsqu'ils existent.
6. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 ou 5 de formule générale (III) :
Figure imgf000056_0001
pour laquelle :
- R représente un polycation, et
- soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène ou un sucre, étant entendu que l'un au moins des substituants X et Y représente un sucre,
- soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et 50, X est un atome d'hydrogène et Y est un sucre. le cas échéant sous leurs formes isomères, ainsi que leurs mélanges, ou leurs sels lorsqu'ils existent.
7. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 6 caractérisés en ce que x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers compris entre 10 et 22 inclus, et l'un de X et Y représente un atome d'hydrogène et l'autre un sucre.
8. Agents de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 et 5 à 7 caractérisés en ce que ledit polycation est une polyamine linéaire ou ramifiée, chaque groupe amino étant séparé par un ou plusieurs groupes méthylène.
9. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 8 caractérisés en ce que ledit polycation a pour formule générale (II) :
Figure imgf000057_0001
dans laquelle :
- R„ R2 et R3 représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène ou un groupement (CH2)qNR'R" avec q un nombre entier pouvant varier de 1 à 6, ceci de manière indépendante entre les différents groupements R,, R2 et R3, étant entendu que l'un au moins de R„ R2 et R3 est différent d'un atome d'hydrogène, - R' et R" représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement (CH2)qNH2 avec q défini comme précédemment,
- m représente un nombre entier compris entre 1 et 6, et
- n et p représentent indépendamment l'un de l'autre des nombres entiers compris entre 0 et 6, avec lorsque n est supérieur ou égal à 2, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale (II), et lorsque n est égal à 0, l'un au moins des substituants R, et R2 est différent d'un atome d'hydrogène.
10. Agents de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 et 5 à 7 caractérisés en ce que ledit polycation est choisi parmi la spermine, la spermidine, la cadavérine, la putrescine, l'hexamethylènetétramine (hexamine), le chlorure de méthacrylamidopropyl-triméthylammonium (AMBTAC), le chlorure de 3- acrylamido-3-méthylbutyltriméthylammonium (AMBTAC), les polyvinylamines, les polyéthylèneimines, ou les ionènes.
1 1. Agents de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisés en ce que le ou les sucres sont des molécules de mono-, oligo- ou polysaccharide.
12. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 1 caractérisés en ce que ledit ou lesdits sucres sont choisis parmi le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, le maltose, le lactose, le saccharose, le sucrose, le fucose, le cellobiose, l'allose, le laminarabiose, le gentiobiose, le sophorose, le mélibiose, le dextran, l'α-amylose, l'amylopectine, les fructans, les mannans, les xylans et les arabinans.
13. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 5 caractérisés en ce que ledit oligonucléotide est toute chaîne contenant un ou plusieurs nucléotides, désoxynucléotides, ribonucléotides et /ou désoxyribonucléotides, éventuellement couplée à une ou plusieurs molécules ayant des propriétés distinctes.
14. Agents de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 5 caractérisés en ce que ledit peptide est toute chaîne contenant un ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons de nature peptidique, éventuellement substituée par un ou plusieurs groupes aliphatiques qui peuvent être saturés ou insaturés, et linéaires, ramifiés ou cycliques.
15. Agent de transfert selon la revendication 1 de formule :
Figure imgf000058_0001
16. Agent de transfert selon la revendication 1 de formule :
Figure imgf000059_0001
[ 7 Agent de transfert selon la revendication 1 de formule :
Figure imgf000059_0002
18. Composition caractérisée en ce qu'elle contient un agent de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans les revendications 1 à 17 et un acide nucléique.
19. Composition selon la revendication 18 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique ou bien un acide ribonucléique.
20. Composition selon la revendication 18 ou 19 caractérisée en ce que ledit acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation.
21. Composition selon les revendications 18 à 20 caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un gène ou une séquence antisens.
22. Composition selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs adjuvants.
23. Composition selon la revendication 22 caractérisée en ce que l'adjuvant est un ou plusieurs lipides neutres.
24. Composition selon la revendication 23 caractérisée en ce que les lipides neutres sont des lipides à deux chaînes grasses.
25. Composition selon les revendications 23 et 24 caractérisée en ce que les lipides neutres sont des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques, choisis par exemple parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, - mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyelines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
26. Composition selon la revendication 22 caractérisée en ce que ledit adjuvant est un composé intervenant directement ou non au niveau de la condensation de l'acide nucléique.
27. Composition selon la revendication 26 caractérisée en ce que ledit adjuvant dérive en tout ou en partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une nucléoline et/ou de l'un de leur dérivés, ou bien est constitué, en tout ou en partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou(ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10, et pouvant être répétés de manière continue ou non.
28. Composition selon les revendications 18 à 27 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
29. Composition selon les revendications 18 à 27 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses.
30. Utilisation d'un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 17 pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies.
31. Méthode de traitement du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini dans les revendications 1 à 17, pour former un complexe, et (2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec le complexe formé en (l).
32. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que défini, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
33. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules selon les revendications 31 ou 32 caractérisée en ce que ledit agent de transfert et/ou ledit acide nucléique sont préalablement mélangés à un ou plusieurs adjuvant(s) tels que définis dans les revendications 22 à 27.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2805271B1 (fr) * 2000-02-18 2002-04-26 Aventis Pharma Sa Procede de preparation de polyalkylenimines fonctionnalises, compositions les contenant et leurs utilisations
JP2005080598A (ja) * 2003-09-10 2005-03-31 Japan Science & Technology Agency β−１，３−グルカン誘導体を用いるプラスミドＤＮＡの導入法
CN103820320B (zh) * 2013-06-25 2017-03-15 宁波有成生物医药科技有限公司 一种非冻型rna保护液

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021036A2 (fr) * 1994-12-30 1996-07-11 Chiron Viagene, Inc. Agents de concentration d'acide nucleique ayant une immunogenicite reduite
WO1996025508A1 (fr) * 1995-02-17 1996-08-22 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Compositions contenant des acides nucleiques, preparation et utilisation
WO1998006869A1 (fr) * 1996-08-14 1998-02-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Vehicules non viraux a utiliser dans le transfert genique

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021036A2 (fr) * 1994-12-30 1996-07-11 Chiron Viagene, Inc. Agents de concentration d'acide nucleique ayant une immunogenicite reduite
WO1996025508A1 (fr) * 1995-02-17 1996-08-22 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Compositions contenant des acides nucleiques, preparation et utilisation
WO1998006869A1 (fr) * 1996-08-14 1998-02-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Vehicules non viraux a utiliser dans le transfert genique

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE CHEMICAL ABSTRACTS [en ligne] abstract no. 126:207866, ERBACHER ET AL: "THE REDUCTION OF THE POSITIVE CHARGES OF POLYLYSINE BY PARTIAL GLUCONOYLATION INCREASES THE TRANSFECTION EFFICIENCY OF POLYLYSINE/DNA COMPLEXES" XP002116398 & BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1324, no. 1, 1997, pages 27-36, *
DATABASE MEDLINE [en ligne] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; abstract 1999129193, GOULA ET AL: "POLYETHYLENIMINE-BASED INTRAVENOUS DELIVERY OF TRANSGENES TO MOUSE LUNG" XP002116399 & GENE THERAPY, vol. 5, no. 9, septembre 1998 (1998-09), pages 1291-1295, *
DATABASE MEDLINE [en ligne] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; ABSTRACT 96200295, OKU ET AL: "EFFECT OF SERUM PROTEIN BINDING ON REAL-TIME TRAFFICKING OF LIPOSOMES WITH DIFFERENT CHARGES ANALYZED BY POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY" XP002116400 & BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1280, no. 1, 3 avril 1996 (1996-04-03), pages 149-154, *
FUHRHOP J -H ET AL: "BOLAAMPHIPHILES WITH MANNOSE- AND TETRAALKYLAMMONIUM HEAD GROUPS ASCOATINGS FOR NUCLEIC ACIDS AND POSSIBLE REAGENTS FOR TRANSFECTIONS" CHEMISTRY AND PHYSICS OF LIPIDS, vol. 43, 1 avril 1987 (1987-04-01), pages 193-213, XP000562618 ISSN: 0009-3084 *

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