NO317225B1

NO317225B1 - Nye overforingsmidler for nukleinsyrer, preparater inneholdende disse samt midlenes anvendelse

Info

Publication number: NO317225B1
Application number: NO20004780A
Authority: NO
Inventors: Gerardo Byk; Marc Frederic; Hans Hofland; Daniel Schermann
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2004-09-20
Also published as: AU3406100A; IL138625A0; AU759301B2; JP2002513543A; HUP0102455A3; WO1999051581A1; HUP0102455A2; CA2324931A1; BR9909350A; EP1068188A1; KR20010042318A; PL342886A1; CN1294582A; NO20004780D0; NO20004780L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye forbindelser som kan benyttes som overføringsmid-ler for nukleinsyrer i celler. Disse nye forbindelser hører mer spesielt til familien av lipopolyaminer og bærer minst en cyklisk amidinfunksjon. De er brukbare for transfeksjon av nukleinsyrer til forskjellige celle typer, så vel in vitro som ex vivo eller in vivo.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av slike forbindelser, preparater som inneholder forbindelsene som aktiv bestanddel og forbindelsenes anvendel-

se for fremstilling av medikamenter.

Til slutt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for overføring av nukleinsyrer i celler in vitro.

Med utviklingen av bioteknologien er muligheten for effektivt å overføre nukleinsyre til celler blitt en nødvendighet. Det kan dreie seg om overføring av nukleinsyrer til celler in vitro, for eksempel for produksjon av rekombinante proteiner, eller i laboratoriet for å studere reguleringen av ekspresjonen av gener, kloningen av gener eller en hvilken som helst annen manipulering som implikerer DNA. Det kan likeledes dreie seg om overfø-ring av nukleinsyrer til celler in vivo, for eksempel for å tilveiebringe transgene dyr, realisering av vaksiner, studium av markering eller eventuelt terapeutiske tilnærmelser. Det kan også dreie seg om overføring av nukleinsyrer i celler ex vivo, i forbindelse med poding av en ryggmarg, immunoterapi eller andre metoder som implikerer overføring av gener til celler som er hentet fra en organisme med henblikk på deres senere readmi-ni streting.

Forskjellige typer syntetiske vektorer er utviklet for å forbedre overføringen av nukleinsyrer til celler. Blant disse vektorer har kationiske lipider spesielt interessante egenskaper. Disse vektorer består av et polart, og kationisk parti som interagerer med nukleinsyrer, og et lipidisk, hydrofobt parti som favoriserer den cellulære penetrasjon. Spesielle eksempler på kationisk lipider er særlig de monokationiske lipider (DOTMA : Lipofec-tin®), visse kationiske detergenser (DDAB), lipopolyaminene og særlig dioktadecyla-midoglysyl spermin (DOGS) eller 5-karboksyspermylamid av palmitoylfosfatidyletano-lamin (DPPES), hvis fremstilling er beskrevet for eksempel i EP 394 111. En ytterligere familie av lipopolyaminer er representert ved de forbindelser som er beskrevet i WO 97/18185 og som er illustrert i figur 1.

Inntil i dag er imidlertid injeksjoner i vev og særlig muskler, gjennomført med DNA som ikke er formulert for å lette inngangen i cellene og assosiasjonen til syntetiske vektorer har ført til komplekser med en størrelse for stor til å kunne innarbeides i cellene.

Det er et av hovedproblemene foreliggende søknad tar sikte på å løse. Således har forbindelsene ifølge oppfinnelsen den uventede fordel at de presenterer et transfeksjonsnivå in vivo i muskler som minst er lik den som oppnås med ikkeformulert DNA og i ethvert tilfelle gir et meget godt nivå for transfeksjon i andre vev. Assosiasjonen med en forbindelse ifølge oppfinnelsen beskytter DNA for nedbrytning på grunn av nukleaser og/eller forringelser under lyofiliseringen, alt faktorer som bidrar til signifikant å forbedre stabiliteten for de nukleolipidiske formuleringer. Videre tillater en slik assosiasjon en langsom og kontrollert frigjøring av nukleinsyrene.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen tilhører familien kationiske lipider og bærer et opp-rinnelig kationisk område som gir forbindelsene forbedrede egenskaper, særlig en redusert cytotoksisitet i forhold til de kationiske vektorer ifølge den kjente teknikk. Dette kationiske parti er mer nøyaktig representert av et eller flere spesielle polyaminer som bærer en eller flere cykliske amidinfunksjoner som sannsynligvis har som virkning å "delokalisere" de positive ladninger, å gjøre forbindelsen totalt sett mindre kationisk, med de fordeler dette medfører på toksisitets planet.

Således er en første gjenstand for oppfinnelsene nye forbindelser i D-, L- eller DL-form, som karakteriseres ved den generelle formel (I):

der:

1. CA betyr en cykloamidingruppe samt mesomere former derav med deri generelle formel (II):

der:

• m og n uavhengig av hverandre er hele tall fra og med 0 til og med 3 slik at m+n er lik større enn 1,

• Ri betyr en gruppe med den generelle formel (ni):

der p og q uavhengig av hverandre er hele tall fra og med 0 til og med 10, Y betyr en karbonyl-, amino-, metylamino eller også metylengruppe idet Y kan ha forskjellige betydninger i forskjellige grupper [(CH2VY], og (<*>) enten betyr et hydrogenatom som gir binding til gruppen Rep, forutsatt at Ri kan være bundet til et hvilket som helst atom i den generelle formel (II), derunder Z, og at det kun er en gruppe Rj i formel (II), • X betyr en gruppe NR2eller også CHR2der R2enten er et hydrogenatom eller en binding til gruppen Ri som definert ovenfor,

<*>1. tilfelle: en gruppe med den generelle formel (IV):

der W betyr CHR"' eller også NR"' og R" og R'" uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom, en metylgruppe eller en binding til gruppen Ri som definert ovenfor, eller også <*>2. tilfelle: en gruppe med den generelle formel (V):

der W betyr CHR'" eller NR'" og R' og R'" uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom, en metylgruppe eller en binding til gruppen Ri som definert ovenfor,

2. Rep er fraværende eller et "avstandsstyrke" med den generelle formel (VI):

der nitrogenatomet er bundet til atomene X, V, W eller Z eller til substituenten Y i gruppen R| alt eftersom, og

• t er et helt tall fra og med 0 til og med 8,

• r er et helt tall fra og med 0 til og med 10 idet r kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper -NRKCH),, • R3som kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper og formelen betyr et hydrogenatom, en metylgruppe eller en gruppe med den generelle formel (VII):

der u er et helt tall fra og med 1 til og med 10, s er et helt tall fra og med 2 til og med 8 og kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper -(CH2)S-NR5, og R5er et hydrogenatom, en gruppe CA som definert ovenfor forutsatt at gruppene CA er uavhengige av hverandre og kan være forskjellige, eller også en gruppe med den generelle formel (VII) forutsatt at gruppene med den generelle formel (VII) er uavhengige av hverandre og kan ha forskjellige betydninger, R4er som definert på samme måte som R3eller også betyr en gruppe CA som defi nert ovenfor forutsatt at gruppene CA er uavhengige av hverandre og kan være forskjellige, og 3. R er bundet til karbonylfunksjonen av gruppen Rep med den generelle formel (VI) eller, hvis Rep er fraværende, er R bundet direkte til gruppen CA og betyr:<*>enten en gruppe med den generelle formel NR6R7der Rg og R7uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en eventuelt mettet, rett eller forgrenet og eventuelt fluorert, alifatisk Ci.22rest, med minst en av de to substituenter Rg eller R7forskjellig fra hydrogen og den andre inneholdene mellom 10 og 22 karbonatomer,<*>eller et steroid valgt blant: kolesterol, kolestanol, 3-o>5-cyklo-5-a-kolestan-6-B-ol, kol syre, kolesterylformiat, kolestanylformiat, 3a, 5-cyklo-5a-kolestan-6fi-yl formiat, kolesterylamin, 6-(l,5-dimetylheksyl)-3a, 5a-dimetyl-heksadekahydrocyklopenta[a]cyklo-propa-[2,3]cyklopenta-[l,2-fjnafta-len-10-ylamin, eller kolestanylamin,

<*>eller en gruppe med den generelle formel (VIII):

der x er et helt tall fra og med 1 til og med 8, y er et helt tall fra og med 1 til og med 10 og Q enten betyr en gruppe C(0)NReR7der R$og R7er som angitt ovenfor, eller Q betyr en gruppe C(0)Rsder Rg betyr en gruppe med den generelle formel (IX):

der z er et helt tall fra og med 2 til og med 8 og R9er en eventuelt mettet, eventuelt fluorert, alifatiske Cs-22rest og de to substituenter Re uavhengig av hverandre er som definert ovenfor,

eller også Rg betyr en gruppe -O-R9der R9er som angitt ovenfor.

I henhold til en variant av oppfinnelsen er gruppen Ri bundet enten til Z eller til V på den ene side og til gruppen Rep på den annen side via Y.

Fortrinnsvis bærer cykloamidingruppen CA med formel (II) 5,6, 7 eller 8 kjedeledd.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er Rep et avstandsstykke eller en "fordeler" med 1, 2 eller 3 "armer". Man kan for eksempel nevne fordelere som følger:

I henhold til en andre variant av oppfinnelsen betyr R3et hydrogenatom eller en metylgruppe og R4er som definert ovenfor, eller også R3og R4som er tilstede i formel (VI) betyr hydrogenatomer, eller også R4er et hydrogenatom og R3er en gruppe med formel (VII) der R5betyr en gruppe CA.

Fortrinnsvis er i formel (V), p og q uavhengig av hverandre valgt blant 2, 3 eller 4.

Rent generelt inneholder gruppen R minst et hydrofobt segment. Innenfor oppfinnelsens ramme menes med "hydrofobt segment" en hvilken som helst gruppe av lipidisk type som favoriserer den cellulære penetrasjon. Særlig inneholder gruppen R minst en alifatisk kjede eller minst et stereoid derivat som definert ovenfor..

I henhold til en foretrukken utførelsesform betyr gruppen R en gruppe med formel NR5R7der R§og R7er som definert tidligere eller også betyr en gruppe med den generelle formel (VIU) der Q betyr en gruppe C(0)NR6R?, Re og R? er som angitt ovenfor.

Særlig betyr Rg og/eller R7uavhengig av hverandre en lineær, eventuelt mettet alifatisk Cio-22kjede, fortrinnsvis med 12,14,16,17,18 eller 19 karbonatomer. Det dreier seg for eksempel om gruppene (CH2)nCH3, (CH2)i3CH3, (CH2)i5CH3, (CH2)i7CH3, oléyl, og så videre.

I en spesiell utførelsesform er gruppene R6og R7identiske og betyr hver en eventuelt mettet, eventuelt lineær og eventuelt fluorert, alifatisk C10.22kjede som definert i det foregående avsnitt.

Disse nye forbindelser med den generelle formel (I) kan foreligge i form av ikke toksiske, farmasøytisk akseptable salter. Disse ikke toksiske salter omfatter salter med mine- ralsyrer (salt-, svovel-, hydrobrom-, fosfor- eller salpetersyre) eller med organiske syrer (eddik-, propion-, rav-, malein-, hydroksymalein-, benzo-, fumar-, metansulfon- eller oksal syre som eksempler), eller med mineralbaser (natrium-, kalium-, litium- eller kal-siumhydroksyd) eller også med organiske baser (tertsiære aminer som trietylamin, pipe-ridin eller benzylamin).

Som illustrerende eksempler på foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen skal nevnes forbindelsene med de følgende formler:

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser som beskrevet ovenfor som karakteriseres ved at man gjennomfører syntesen av byggeklossene som bærer cykloamidin funksjonen(e) og derefter poder byggeklossene på lipidene utstyrt med fordelerne eller avstandsstykkene.

Fortrinnsvis gjennomføres syntesen av analoge lipopolyaminer hvorefler man gjennom-fører ringslutning av cykloamidingruppene.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således fremstilles på forskjellige måter. I henhold til en første metode kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen oppnås ved syntese av analoge lipopolyaminer (det vil si med den samme struktur men uten cykloamidingruppe), idet ringslutningen til cykloamidingrupper gjennomføres i et andre trinn. De analoge lipopolyaminer kan oppnås ved en hvilken som helst kjent metode og særlig i henhold til de metoder som er beskrevet i WO 97/18185, eller ved analoge metoder. Ringslutningen av amidinhodene kan for eksempel gjennomføres ved reaksjon mellom et eller flere primære aminer på lipopolyaminer og reaktanter som hydrogensulfatet av O-metylisoureasulfat [J. Med. Chem., 1995, 38(16), pp. 3053-3061], eller semisulfatet av S-metylisotiourea [Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 40, pp. 119-126]. Fortrinnsvis arbeider man i vandig medium i nærvær av en base i varme [J. Med. Chem., 1985, pp. 694-698 og J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. Som foretrukket oppløsningsmiddel kan man nevne blandinger vann:alkohol eller dimetylformamid. Som base kan man benytte trietylamin, N-etyldiisopropylamin, NaOH, KOH og så videre. Temperaturen ligger fortrinnsvis mellom 40°C og 60°C og aller helst gjennomføres reaksjonen ved rundt 50°C: En annen metode omfatter å gjennomføre en syntese av byggeklosser som bærer cykloamidinfunksjonen og som derefter podes på lipidene utstyrt med "fordelere". Denne metode oppviser fordelen av å gi tilgang til et stort antall produkter. Innenfor oppfinnelsens ramme menes med "byggekloss" ethvert funksjonelt segment av molekylet. For eksempel utgjør cykloamidingruppen CA slik den er definert under den generelle formel (II), Rep eller også R byggeklosser som er forskjellige fra hverandre innenfor oppfinnelsens ramme.

Som et eksempel kan man for eksempel gå frem på følgende måte:

1) Syntese av byggeklossen R:

a) Når R betyr -NR6R7er den enten kommersielt tilgjengelig eller kan syntetiseres i henhold til en av de følgende metoder: • ved alkylerende reduksjon mellom et amin som bærer gruppen R$og et aldehyd som bærer gruppen R7. Man arbeider fortrinnsvis i et klorert oppløsningsmiddel (som diklormetan, kloroform, 1,2-diklor-etan og så videre [J. Org. Chem., 1996, pp. 3849-3862]) eller i et hvilket som helst annet organisk oppløsningsmiddel som er kompatibelt med reaksjonen (for eksempel tetrahydrofuran) i nærvær av natrium-triacetoksyborhydrid, natriumcyanoborhydrid eller derivater derav (for eksempel li-tiumcyanoborhydrid) [J.Am. Chem. Soc., 1971, pp. 2897-2904] og eddiksyre. • eller også ved substitusjon av en avgangs gruppe som bæres av R6med et amin som bærer gruppen R7. Som eksempel på avgangs grupper kan man nevne halogenato-mer (Br, Cl, I) eller substituentene tosyl, mesyl og så videre. Man arbeider fortrinnsvis i nærvær av en basisk reaktant, for eksempel natrium- eller kaliumkarbonat, natriumhydroksyd, trietylamin og så videre i en alkohol som etanol, under tilbakeløp

[J. Am. Chem. Soc., 1996, pp. 8524-8530]

• eller også ved kobling mellom en fettsyre (eller derivater derav som for eksempel fettsyreklorider) og et fettamin. Det oppnådde amin reduseres derefter med et hydrid, for eksempel litium aluminiumhydrid, eller et hvilket som helst annet av fagmannen kjent hydrid, i en eter som tetrahydrofuran (THF), t-butylmetyleter (TBME), dimetoksyetan (DME) og så videre.

b) Når R betyr en gruppe med den generelle formel (VHI) gjennomføres peptidkoblingen mellom gruppen Q og H-[NH-(CH2)x]yCOOH. Peptidkoblingen gjennomfø- res i henhold til klassiske metoder som velkjent av fagmannen (Bodanski M., Principles and Practices of peptid Synthesis, Ed. Springe-Verlag) eller på en hvilken som helst annen analog måte. Særlig kan reaksjonen gjennomføres i nærvær av en ikke nukleofil base i hensiktsmessige, aprotiske oppløsningsmidler (som kloroform, dimetylformamid, metylpyrrolidon, acetonitril, diklormetan og så videre) ved tem-peraturer mellom 0 og +100°C idet pH verdien justeres til mellom 9 og 11.

Q er enten tilgjengelig kommersielt men når Q betyr en gruppe C(0)R8 der R8 har for-

mel (IX), kan den syntetiseres ved omsetning mellom et kommersielt klorformiat som kolesterylklorformiat eller oppnås i henhold til klassiske metoder som velkjent av fagmannen fra et kommersielt klorformiat og et kommersielt diamin som N-etylendiamin,

eller oppnås i henhold til klassiske metoder som velkjent av fagmannen. Fortrinnsvis arbeider man i et klorert oppløsningsmiddel som diklormetan, kloroform eller 1,2-dikloretan, eller i et hvilket som helst annet organisk oppløsningsmiddel som er kompatibelt med reaksjonen, for eksempel dimetylformamid, dimetylsulfoksyl, acetonitril osv.

Gruppen H-[NH-(CH2)x]y-COOH er en kommersiell aminosyre når y er lik 1 eller kan også oppnås ved en eller flere cyanoetyleringsreaksjoner i henhold til de metoder som er beskrevet nedenfor under syntesen av Rep når y er større enn 1.

2) Syntese av byggeklossen Rep:

Gruppen Rep oppnås ved cyanoetylering eller ved dicyanoetylering (alt efter som hvor-

vidt man ønsker å oppnå en rett eller forgrenet struktur for Rep) av en aminosyre med formelen HOOC-(CH2)r-NH2 med etterfølgende reduksjon av nitrilfunksjonene til aminer.

a) mono- eller di-cyanoetylering:

Fortrinnsvis arbeider man i basisk, vandig medium. For eksempel gjennomføres reaksjonen i oppløsningsmidler som vann, alkoholer som metanol eller etanol, i nærvær av en base som NaOH, KOH, trietylamin og så videre. Når det gjelder mono-cyanoetylering arbeider man fortrinnsvis i kulde [J. Am. Chem. Soc., 1950, pp. 2599-2603]. Når det gjelder dicyanoetylering arbeider man fortrinnsvis i varme og med et overskudd av akrylnitril [J. Am. Chem. Soc., 1951, pp. 1641-1644].

b) Reduksjonen av nitril funksjonene til aminer gjennomføres ved katalytisk hydrogenering i basisk medium eller på en hvilken som helst annen måte som velkjent

av fagmannen. Som eksempel kan man benytte platinaoksyd eller også Raneynikkel [J. Org. Chem., 1988, pp. 3108-3111] som katalysator. Fortrinnsvis er det valgte oppløs-ningsmiddel en alkohol som metanol, etanol og så videre, og man arbeider i nærvær av en base som NaOH, KOH og så videre.

3) Syntese av byggeklossen Rep-R:

Byggeklossen Rep-R oppnås ved peptidkobling mellom syren Rep og aminet R, begge oppnådd i de foregående trinn.

Peptidkoblingen gjennomføres i henhold til klassiske metoder som velkjent av fagmannen (Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) eller på en hvilken som helst annen analog måte. Særlig kan reaksjonen gjennomføres i nærvær av en ikke nukleofil base i hensiktsmessige aprotiske oppløsningsmidler som klorofor, dimetylformamid, metylpyrrolidon, acetonitril, diklormetan og så videre, ved en temperatur som kan ligge mellom 0 og +100°C, idet pH verdien justeres til mellom 9 og 11.

4) Syntese av forbindelsene CA-Rep-R ifølge oppfinnelsen:

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan oppnås på flere mulige måter:

a) ved kobling i basisk medium mellom det terminale amin som er tilstede på Rep-R oppnådd i det forutgående trinn, og CA-S-CH3, i henhold til klassiske metoder som velkjent av fagmannen. Man arbeider fortrinnsvis i et klorert oppløsningsmiddel som diklormetan, kloroform og så videre, eller i andre organiske oppløsningsmidler som er kompatible med reaksjonen, for eksempel vann, alkoholer, dimetylformamid og så videre, i nærvær av en base som trietylamin, NaOH, KOH, N-etyldiisopropylamin og så videre, og ved omgivelses temperatur, altså rundt 20°C.

Byggeklossen CA-S-CH3er enten kommersielt tilgjengelig (som tilfellet for eksempel er med 2-metyltio-2-imidazolin hydrojodid), eller den kan oppnås ved innvirkning av et karbondisulfid på et egnet diamin (det vil si valgt som funksjon av cykloamidingruppen man ønsker å oppnå), fulgt av en metylering. For eksempel kan reaksjons skjemaet il-lustreres på følgende måte:

Fortrinnsvis gjennomføres reaksjonsprosessen i en alkohol som etanol. Metyleringstrin-net gjennomføres ved innvirkning av et halogenmetyl og halogenatomet kan for eksempel være et jodatom [J. Am. Chem. Soc, 1956, pp. 1618-1620 og Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-354]. b) ved intern ringslutning av cykloamidingruppen ut fra aminofunksjonene som er tilstede på Rep-R, ved innvirkning av hydrogensulfatet av O-metylisourea eller semisulfatet av S-metylisotiourea. Fortrinnsvis arbeider man i vandig medium i nærvær av en base, i varme [J. Med. Chem., 1985, pp. 694-698 og J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. Som eksempel på foretrukket oppløsningsmiddel kan man nevne vann:alkohol-blandinger eller dimetylformamid. Som eksempel kan man benytte trietylamin, N-etyldiisopropylamin, NaOH, KOH og så videre. Temperaturen ligger fortrinnsvis mellom 40°C og 60°C og aller helst gjennomføres reaksjonen ved rundt 50°C. c) ved peptidisk kobling mellom CA-COOH og Rep-R i henhold til klassiske metoder som velkjente for fagmannen og som beskrevet ovenfor.

Byggeklossen CA-COOH kan oppnås på forskjellige måter:

ved omsetning av en byggekloss CA-S-CH3med en aminosyre eller en polyamino syre i henhold til velkjente metoder for fagmannen eller ved en hvilken som helst annen analog metode [J. Am. Chem. Soc, 1956, pp. 1618-1620], Byggeklossen CA-

S-CH3oppnås på samme måte som ovenfor og amino- eller polyaminosyren velges

som funksjon av den forbindelse man ønsker å oppnå, eller også

• ved innvirkning av et S,S-dimetyl-tosyl-iminotiokarbonimidat eller et derivat derav på en polyaminosyre i henhold til velkjente metoder for fagmannen eller metoder analoge med disse [J. Org. Chem., 1971, pp. 46-48]. Fortrinnsvis arbeider man i etanolisk medium i nærvær av en base som NaOH og under blandingens tilbake-løpstemperatur.

Som eksempel på byggeklosser CA-COOH som kan oppnås i henhold til metodene som beskrevet ovenfor kan man nevne de følgende:

I alle de tidligere viste reaksjoner er det når aminosubstituentene som er tilstede på de forskjellige grupper kan interferere med reaksjonene som gjennomføres, foretrukket å beskytte disse på forhånd ved hjelp av kompatible rester som kan bringes på plass og

fjernes uten å berøre resten av molekylet. Som eksempel kan de beskyttende rester velges blant rester som beskrevet av T.W. GREENE, i Protective Groups in Organic

Synthesis, J. Wiley-Interscience Publication (1991) eller av McOmie, i Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973).

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er preparater som karakteriseres ved at de omfatter minst en forbindelse med den generelle formel I.

Fortrinnsvis omfatter preparatet en forbindelse med den generelle formel I og en nukleinsyre.

Når en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en nukleinsyre bringes sammen danner de komplekser ved interaksjon mellom de positive ladninger som er tilstede ved fysiologisk pH på forbindelsen ifølge oppfinnelsen og de negative ladninger på nukleinsyren. Dette kompleks kalles "nukleolipidisk kompleks" i det følgende. Fortrinnsvis er forbindelsen ifølge oppfinnelsen og nukleinsyren tilstede i mengder slik at forholdet mellom de positive ladninger på forbindelsen og de negative ladninger på nukleinsyren ligger mellom 0,1 og 50 og fortrinnsvis mellom 0,1 og 20. Dette forhold kan lett justeres av fagmannen som funksjon av den benyttede forbindelse, nukleinsyren og de tilsiktede anvendelser (særlig typen celler som skal transfekteres).

Innenfor oppfinnelsens rammer menes med "nukleinsyre" både en desoksyribonukleinsyre og en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om naturlige eller kunstige sekvenser og særlig genomisk DNA (gDNA), komplimentær DNA (cDNA), meddeler RNA mRNA), overførings RNA (tRNA), ribosomisk RNA (rRNA), hybridsekvenser eller syntetiske eller semisyntetiske sekvenser av eventuelt modifiserte oligonukleotider. Disse nukleinsyrer kan være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell, viral opprinnelse eller annet. De kan oppnås på en hvilken som helst for fagmannen kjent måte og særlig ved avsø-king av banker, ved kjemisk syntese eller også ved blandede metoder omfattende kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvenser oppnådd ved avsøking av banker. De kan være kjemisk modifisert.

Når det mer spesielt gjelder desoksyribonuklein syrene kan disse være av typen enkel-eller dobbelstreng og videre korte oligonukleotider eller lengre sekvenser. Særlig består nukleinsyrene med fordel av plasmider, vektorer, episomer, ekspresjons kassetter og så videre. Desoksyribonukleinsyrene kan bære en replikasjonsopprinnelse som eventuelt er funksjonell i mål cellen eller et eller flere markør gener, regulerende sekvenser for transkripsjon eller replikasjon, gener av terapeutisk interesse, eventuelt modifiserte anti-retningssekvenser, områder for binding til andre cellulære forbindelser og så videre.

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren en ekspresjonskassett bestående av et eller flere gener av terapeutisk interesse under kontroll av en eller flere promotere og en transkripsjonen terminatorvektor som er aktiv i målcellene.

Innenfor rammen av oppfinnelsen menes med uttrykket "ekspresjonskassett for et gen av interesse" menes et DNA-fragment som kan skytes inn i en vektor på spesifikke rest-riksjonsseter. DNA-fragmentet omfatter en nukleinsyresekvens som koder for en RNA eller et polypeptid av interesse og omfatter i tillegg de sekvenser som er nødvendige for ekspresjonen (enhansere, promotere, polyadenyleringssekvenser og så videre) for sek-vensen. Kassetten og restriksjonssetene er kjent for å sikre en innskyting av ekspre-sjonskassetten i en egnet leseramme for transkripsjon og traduksjon.

Det dreier seg generelt om et plasmid eller et episom som bærer et eller flere gener av terapeutisk interesse. Som eksempel kan man nevne de plasmider som er beskrevet i WO 96/26270 og WO 97/10343.

Innenfor oppfinnelsens ramme menes med gen av terapeutisk interesse særlig ethvert gen som koder for et protein produkt med en terapeutisk virkning. Protein produktet det kodes for kan særlig være et protein eller et peptid. Dette protein produkt kan være ek-sogent homologt eller endogent vis a vis målcellen, det vil si et produkt som vanligvis uttrykket i mål cellen når denne ikke oppviser noen patologi. I dette tilfellet tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et inaktivt eller lite aktivt protein på grunn av en modifikasjon, eller også å over eksprimere proteinet. Genet av terapeutisk interesse kan også kode for en mutant av et cellulært protein med øket stabilitet, modifisert aktivitet og så videre. Proteinpro-duktet kan likeledes være heterologt vis a vis målcellen. I dette tilfellet kan det uttrykte protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en defektiv aktivitet i cellen og derved tillate denne å kjempe mot en patologi, eller stimulere en immun respons.

Blant de terapeutiske produkter innenfor oppfinnelsens ramme kan man særlig nevne enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF og så videre (FR 92/03120), vekstfaktorer, neurotransmettere eller deres forløpere eller synte-seenzymer, trofiske faktorer (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrofin, etc...) apolipoproteiner (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc"..., FR 93/05125), dystrofin eller et minidysfrofin (FR 91/11947), proteinet CFTR assosierte med mukoviskidose, supressorgener for tumorer (p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, etc..., FR 93/04745), gener som koder for faktorer implikert i koagulering (faktorene VII, VIII, IX), gener som intervenerer i reparering av DNA, selvmordsgener (tymidin kinase, cytosin deaminase), gener for hemoglobin eller andre proteintransportører, enzymer for metabolisme, katabolisme og så videre.

Nukleinsyren av terapeutisk interesse kan likeledes være et gen eller et antiretnings sekvens hvis ekspresjon i mål cellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i mål cellen til RNA som er komplimentær til cellulær mRNA og derved blokkere disses traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Terapeutiske gener omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer og som er i stand til selektivt å destruere mål RNA'er (EP 321 201).

Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte et eller flere gener som koder for et antigenisk peptid i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunrespons. I denne spesielle utførelsesform tillater oppfinnelsen realisering enten av vaksiner eller av immunoterapeutiske behandlinger som kan anvendes på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, viruser eller cansere. Det kan særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke mot Epstein-Barr-virus, HIV-virus, hepatitt B-virus (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirus, "syncitia forming virus", andre viruser eller også antigeniske peptider som er spesifikke mot tumorer (EP 259 212).

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyrene likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av genet av terapeutisk interesse og/eller genet som koder for det antigeniske peptid i cellen eller det ønskede organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når sekvensene er i stand til å funksjonere i den infekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om sekvenser som er promotore for eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotorsekvenser som stammer fra genomet av celler man ønsker å infektere. På samme måte kan det dreie seg om promotorsekvenser som stammer fra genomet av en virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterene for genene EIA, MLP, CMV, RSV og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensene modifiseres ved tilsetning av sekvenser for aktivering, regulering og så videre. Det kan videre dreie seg om induktible eller represible promotore.

Videre kan nukleinsyren likeledes, særlig oppstrøms genet av terapeutisk interesse, omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvensen for det terapeutiske produkt men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens. Nukleinsyren kan likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt mot et spesielt rom i cellen.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en eller flere adj uvanter i stand til assosiering til kompleksene som er dannet mellom forbindelsen ifølge oppfinnelsen og nukleinsyren, og å forbedre transfeksjonskraften. I en annen utførelsesform angår således foreliggende oppfinnelse preparater omfattende en nukleinsyre, en forbindelse med formel (I) som angitt ovenfor og en eller flere adjuvanter i stand til assosiering til de nukleolipidiske komplekser forbindelse (I):nukleinsyre og å forbedre transfeksjons kraf-ten. Nærværet av denne type adjuvanter (for eksempel lipider, peptider eller proteiner) kan på fordelaktig måte tillate å øke forbindelsenes transfeksjonskraft.

Ut fra dette synspunktet kan preparatene ifølge oppfinnelsen som adjuvant inneholde et eller flere nøytrale lipider. Slike preparater er særlig fordelaktig, særlig når forholdet mellom ladningene R er lavt. Foreliggende søkere har kunnet påvise at tilsetningen av et nøytralt lipid tillater å forbedre dannelsen av nukleolipidiske partikler og å favorisere penetrering av partiklene i cellen ved destabilisering av dennes membran.

Mer spesielt er de nøytrale lipider som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen lipider med to fettkjeder. På spesielt fordelaktig måte benytter man naturlige eller syntetiske zwitterioniske lipider eller slike som er berøvet for ioneladningen under fysiologiske betingelser. De kan særlig velges blant dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl- eller -mirystoyl fosfatidyletanolaminer samt deres 1 til 3 ganger N-metylerte derivater, fosfatidylglyseroler, diacylglyseroler, glykosyldiacylglyseroler, cerebrosider (som særlig galaktocerebrosi-dene), sfingolipider (som særlig sfingomyelinene) eller også asialogangliosider (som særlig asialoGMl og -GM2).

Disse forskjellige lipider kan oppnås enten ved syntese eller ved ekstrahering fra orga-ner (som for eksempel fra hjernen) eller egg, ved klassiske teknikker som er velkjente for fagmannen. Særlig kan ekstraheringen av naturlige lipider gjennomføres ved hjelp av organiske oppløsningsmidler (se likeledes "Lehninger, Biochemistry").

I den senere tid har foreliggende søkere kunnet påvise at det likeledes er spesielt fordelaktig som adjuvant å benytte et produkt som intervenerer, eventuelt direkte, i kondensasjonen av nukleinsyren (WO 96/25508). Nærværet av et slikt produkt i et preparat ifølge oppfinnelsen tillater å redusere mengden av forbindelser med formel (I) med de fordelaktige konsekvenser dette har på det toksikologiske plan uten å gi avkall på trans-feksjonsaktiviteten. Med produktet som intervenerer i kondensasjonen av nukleinsyren mener man å definere et produkt som eventuelt direkte kompakterer nukleinsyren. Mer spesielt kan produktet enten innvirke direkte på nukleinsyren som skal transfekteres eller intervenere i et anneksprodukt som i sin tur direkte er implikert ved kondensasjonen av denne nukleinsyre. Fortrinnsvis innvirker det direkte på nukleinsyren. For eksempel kan det prekompakterende produkt være et hvilket som helst polykation, for eksempel polylysin. I henhold til en foretrukken utførelsesform stammer dette produktet som intervenerer i kondensasjonen av nukleinsyren helt eller delvis fra et protamin, et histon eller et nukleolin og/eller et derivat derav. Et slikt produkt kan likeledes helt eller delvis bestå av peptid deler (KTPKKAKKP) og/eller (ATPAKKAA), der antallet deler kan variere mellom 2 og 10.1 strukturen for forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan disse deler være repetert på eventuelt kontinuerlig måte. Videre kan de være separert ved forbindelser av biokjemisk art, for eksempel av en eller flere aminosyrer, eller av kjemisk art.

Fortrinnsvis omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen 0,01 til 20 ekvivalenter av en eller flere adjuvanter per ekvivalent nukleinsyre i mol per mol, allerhelst 0,5 til 5.

I en spesielt fordelaktig utførelsesform omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen videre et målelement som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren. Dette målelement kan være et ekstracellulært målelement som tillater å orientere overføringen av DNA mot visse cellulære typer eller visse ønskede vev (tumorale celler, hepatiske celler, hematopoietiske celler og så videre). Det kan likeledes dreie seg om et intracellulært målelement som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren mot visse priviligerte cellulære rom (mitokondrier, kjerne og så videre). Målelementet kan være bundet til forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller også til nukleinsyren slik det er presisert tidligere. Blant målelementene som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan man nevne sukkere, peptider, proteiner, oligonukleotider, lipider, neuromediatorer, hormoner, vitaminer eller derivater derav. Fortrinnsvis dreier det seg om sukkere, peptider eller proteiner som antistoffer eller fragmenter av antistoffer, ligander av cellulære reseptorer eller fragmenter av disse, reseptorer eller fragmenter av reseptorer og så videre. Særlig kan det dreie seg om ligander av reseptorer av vekstfaktorer, reseptorer for cytokiner, reseptorer av typen cellulære lecitiner, eller ligander med RGD sekvens med en affinitet for reseptorer for adhesjonsproteiner som integriner. Man kan likeledes nevne reseptorer for transferrin, HDL eller LDL, eller transportøren for folat. Målelementet kan likeledes være en sukker som tillater å sikte inn på lectiner som reseptorene for asialoglykopro-teinene eller syalydene som sialyde Lewis X, eller også et fragment Fab av antistoff, eller et enkelt kjedet antistoff (ScFv).

Assosiasjonen av målelementer til nukleolipidiske komplekser ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres på en hvilken som helst av fagmannen kjent måte, for eksempel ved kobling til en hydrofob del eller til en del som interagerer med nukleinsyren av forbindelsen med den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen, eller også til en gruppe som interagerer med forbindelsen med den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen eller med nukleinsyren. Disse interaksjonene kan i henhold til en foretrukken måte være av ionisk eller kovalent art.

I henhold til en annen variant kan preparatene ifølge oppfinnelsen også innarbeide minst et ikke ionisk overflate aktivt middel i mengde tilstrekkelig til å stabilisere størrelsen av partiklene av kompleksene av nukleolipidisk forbindelse med den generelle formel (I):nukleinsyre. Innføringen av ikke ioniske overflate aktive midler forhindrer dannelsen av agregatet, noe som gjør preparatet spesielt egnet til administrering in vivo. Preparatene ifølge oppfinnelsen som innarbeider slike overflate aktive midler oppviser en fordel på innokuitetsplanet. De oppviser likeledes en ytterligere fordel dithen at de reduserer risikoen for interferenser med andre proteiner tatt i betraktning reduksjonen av den totale ladning av forbindelsen i de nukleolipidiske komplekser.

De overflate aktive midler består fordelaktig av minst et hydrofobt segment og minst et hydrofilt segment. Fortrinnsvis er det hydrofobe segment valgt blant alifatiske kjeder, polyoksyalkylen, alkylidenpolyestere, polyetylenglykol med benzylisk polyeter hode og kolesterol, og det hydrofile segmentet er fortrinnsvis valgt blant polyoksyalkylener, po-lyvinylalkoholer, polyvinylpyrrolidoner eller sakkarider. Slike ikke-ioniske, overflate aktive midler er beskrevet i WO 98/34648.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelsen av forbindelser med den generelle formel (I) som beskrevet ovenfor for fremstilling av et medikament ment for å lindre sykdommer ved overføring av nukleinsyrer (og mer generelt polyanioner) i primær celler eller i etablerte linjer. Det kan særlig dreie seg om fibroblastiske, muskel- nerve-(neuroner, asterocytter, glyal celler), eller hepatiske celler, fra den hematopoietiske linje (lymfocytter, CD34, eller dendritiske celler) epitelial celler og så videre, i differensiert eller i pluripotent (forløpere) form.

En slik anvendelse er spesielt fordelaktig fordi forbindelsen med den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen oppviser en redusert cytotoksisitet i forhold til kationiske lipider ifølge den kjente teknikk. Foreliggende søkere har særlig kunnet påvise at ved meget høye ladningsforhold som vanligvis medfører død for dyrene efter transfeksjon, er tilsy-nelatende ingen cytotoksisitet utløst. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes særlig for transfeksjon in vitro, ex vivo eller in vivo av nukleinsyrer. For anvendelser in vivo, for eksempel ved terapi eller for studium av regulering av gener eller tildanning av dyremodeller for patologier kan preparatene ifølge oppfinnelsen formuleres med henblikk på administrering ad topisk, kutan, oral, rektal, vaginal, parenteral, intranasal, int-ravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal, intratrakeal, intraperitonial vei og så videre. Fortrinnsvis inneholder preparatene ifølge oppfinnelsen en farmasøy-tisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i de ønskede organ, eller for en administrasjon ad topisk vei (på hud og/eller slimhinne). Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller om tørkede preparater og særlig lyofiliserte slike som ved tilsetting av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløsninger. Nukleinsyre dosene som benyttes for injeksjon samt antallet administreringer kan tilpasses som funksjon av forskjellige pa-rametere og særlig som funksjon av den benyttede administreringsvei, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede varighet av behandlingen. Hva mer spesielt angår administreirngsveien kan det dreie seg enten om direkte injeksjon i vev, for eksempel i tumorer, eller de sirkulatoriske veier, eller en behandling av celler i kultur fulgt av deres reimplantering in vivo ved injeksjon eller poding. De angjeldende vev innenfor rammen av oppfinnelsen er for eksempel muskler, hud, hjerne, lunger, lever, milt, ryggmarg, tymus, hjerte, lymfe, blod, knokler, bindevev, pancreas, nyrer, kar, mage, innvoller, testikler, ovarier, rektum, nervesystem, øyer, kjertler, bindevev og så videre. Fortrinnsvis er de transfekterte vev muskler og lunger.

Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt innledningsvis også en fremgangsmåte for overføring av nukleinsyrer i celler og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter trinnene: (1) å opprette in vitro kontakt mellom nukleinsyren og en forbindelse med den generelle formel (I) som angitt ovenfor for å danne et nukleolipidisk kompleks, og (2) tilveiebringe in vitro kontakt mellom cellene og det nukleolipidiske kompleks dannet under (1).

Kontakten mellom cellene og nukleolipid-komplekset kan realiseres ved inkubering av cellene med komplekset (for anvendelser in vitro eller ex vivo), eller ved av injeksjon av komplekset i en organisme (for anvendelser in vivo). Inkuberingen realiseres fortrinnsvis i nærvær for eksempel av 0,01 til 1000 ug nukleinsyre pr IO<6>celler. For en administrering in vivo kan det for eksempel benyttes nukleinsyre doser som ligger mellom 0,01 og 10 mg.

Der preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg inneholder en eller flere adjuvanter som definert tidligere kan den eller disse på forhånd blandes med forbindelsen med den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen eller også med nukleinsyren.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en spesielt fordelaktig metode for behandling av sykdommer ved administrering av en nukleinsyre som koder for et protein eller som kan transkriberes til en nukleinsyre i stand til å korrigere sykdommen idet nukleinsyren er assosiert til en forbindelse med den generelle formel (I) som definert tidligere under de ovenfor beskrevne betingelser. Mer spesielt er denne metode anvend-bar mot sykdommer som stammer fra en defekt ved et protein- eller nukleinprodukt idet den administrerte nukleinsyre koder for protein produktet eller transkriberes til et nuklein produkt eller også utgjør nuklein produktet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter enhver anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge oppfinnelsen for transfeksjon in vivo, ex vivo eller in vitro av celler.

FIGURFORKLARING

Figur 1: Strukturen for syntetiske vektorer kaldt lipid A, lipid B, lipid C og lipid D i foreliggende oppfinnelse og beskrevet i WO 97/18185.

Figur 2: Skjematisk presentasjon av plasmid pXL2774.

Figur 3: Fasediagram for kompleksene nukleolipidisk forbindelse (1):DNA

Bindingen for forbindelse (1) til DNA bestemmes ved å følge reduksjonen av fluorescens (i % idet 100% er fluorescensen for naken DNA) av etidiumbromid (EtBr) (sym-bol trukken strek), som beskrevet i henhold til y-aksen til høyre. Størrelsen for partiklene av kompleksene (i nm) er indikert på y aksen til venstre. X-aksen representerer ladningsforholdet for overføringsmiddekDNA. Størrelsen for de nukleolipidiske komplekser uten ko-lipid er vist ved symbolet Bi trukken strek. Størrelsen for nukleolipidiske komplekser inneholdende 25% kolesterol er vist ved symbolet □ i brutt strek. Størrelsen for de nukleolipidiske komplekser inneholdende 40% DOPE er representert ved symbolet +i brutt strek. Metoden tillater ikke å bestemme størrelsen for partikler under 3 (im.

Figur 4: Aktivitet for overføring av genet in vitro i HeLa celler av de nukleolipidiske komplekser inneholdende forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen uten ko-lipid (midtre stolpe i mørk grå), med 25% kolesterol (venstre stolpe i middels grå), og med 40 mol % DOPE (høyre stolpe i lys grått), sammenlignet med naken DNA. Kun de nukleolipidiske komplekser der DNA er fullstendig mettet med forbindelsen ifølge oppfinnelsen og der størrelsen ligger mellom 100 nm og 300 nm, er benyttet. Figur 5: Aktiviteten for overføring av genet in vitro av nukleolipidiske komplekser dannet fra forbindelse (3), i HeLa celler. Langs ordinaten vises ekspresjonen av luciferase, uttrykt i pg per transfektert brønn. Langs abscissen angis forholdet for ladningene mellom forbindelse (3) og DNA i nmol/ug. Ekspresjonen er målt hver gang for formuleringer uten ko-lipid (miceller), med DOPE og med kolesterol. Figur 6: Aktiviteten for overføring av genet in vitro av nukleolipidiske komplekser dannet fra forbindelse (5), i HeLa celler. Langs ordinaten vises ekspresjonen av luciferase, uttrykt i pg per transfektert brønn. Langs abscissen angis forholdet for ladningene mellom forbindelse (5) og DNA i nmol/ug. Ekspresjonen er målt hver gang for formuleringer uten ko-lipid (miceller), med DOPE og med kolesterol. Figur 7: Aktiviteten for overføring av genet in vitro av nukleolipidiske komplekser dannet fira forbindelse (6), i HeLa celler. Langs ordinaten vises ekspresjonen av luciferase, uttrykt i pg per transfektert brønn. Langs abscissen angis forholdet for ladningene mellom forbindelse (6) og DNA i nmol/ug. Ekspresjonen er målt hver gang for formuleringer uten ko-lipid (miceller), med DOPE og med kolesterol. Figur 8: Aktivitet for overføringen av gen in vivo efter direkte injeksjon i muskelen av komplekser inneholdende forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen eller forbindelsen med formelen H2N(CH2)3NH(CH2)4>fH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)i7CH3]2(kalt "lipid A" i det følgende) uten ko-lipid (stolpe i mørk grå) med 25% kolesterol (stolpe med middels grått), og med 40 mol % DOPE (stolpe i lys grå), sammenlignet med naken DNA. Kun kompleksene der DNA fullstendig er mettet med lipid og der størrelsen ligger mellom 100 nm og 300 nm, er benyttet.

Fi gur 9: Betydningen av oppfinnelsen er vist ved sammenligning av overføringsaktivite-ten for genet for to forskjellige lipider, forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen og lipid A, og naken DNA via to administreringsveier: intravenøst (iv) og intramuskulært (im). Kun komplekser der DNA er fullstendig mettet på lipid og der størrelsen ligger mellom 100 nm og 300 nm er benyttet.

Figur 10: Aktivitet for overføring av gen in vivo 48 timer efter injeksjon i.m. av nukleolipidiske komplekser inneholdende forbindelsene (5) eller (6) ifølge oppfinnelsen uten ko-lipid og ved et ladningsforhold på 0,25:1, sammenlignet med naken DNA. Ekspresjonen er uttrykt i pg luciferase per ml.

Fra venstre representerer stolpene: (a) negativ kontroll; (b) naken DNA; (c) forbindelse (5) og (d) forbindelse (6).

MATERIELL OG METODER

A\ MATERIELL

Aminosyrene, utgangspolyaminene (eller deres derivater) er kommersielt tilgjengelige. Dette er for eksempel tilfellet for N-(3-aminopropyl)glycin, N-(2-cyanoetyl)glycin, eller også 2,4 diaminosmørsyre, eller de kan syntetiseres i henhold til klassiske metoder.

De cykliske isotiouirnstoffer er likeledes kommersielle produkter som for eksempel 2-metyltio-2-imidazolin hydrojodid, eller kan syntetiseres ved klassiske metoder.

Aminene som er substituert med et eller flere lipider er kommersielle produkter eller kan syntetiseres fra tilsvarende aminer og aldehyder ved alkylativ reduksjon. Produkter som trietylamin, trifluoreddiksyre, heksafluorfosfat av benzotriazol-1-yloksytris(dimetylamino)fosfonium (BOP), dimetylaminopyridin (DMAP), benzylklor-format, di-tert-butyldikarbonat, er alle kommersielle produkter. Oppløsningene av natriumklorid og natriumkarbonat er mettet. Oppløsningen av kaliumsulfat har en konsentrasjon på 0,5 M.

B\ METODER

1) Fysikalske målinger.

Proton NMR-spektrene registreres på Bruker 400 og 600 MHZ spektrometere.

Massespektrene er gjennomført på en API-MS/III.

2) Metoder for rensing oe analyse

a) Betingelser for kromatografi i direkte fase

Tynnsjiktkromatografier gjennomføres på Merck silikagelplater med tykkelse 0,2 mm.

De fremkalles enten ved U.V. (254 nm), ved hjelp av ninhydrin, ved å forstøve (lett spraye) en etanolisk oppløsning av ninhydrin (40 mg/100 cm3 etanol) for å påvise aminene eller amidene ved oppvarming til 150°C, ved hjelp av fluorescamin ved å forstøve en oppløsning (40 mg/100 cm<3>aceton) for å påvise primæraminene, med bromcresol grønt ved å forstøve en oppløsning (0,1% i propanol-2) for å påvise syrene, ved hjelp av vanillin ved forstøvning (lett spray) av en 3% etanolisk oppløsning av vanillin med 3% svovelsyre fulgt av oppvarming til 120°C, eller ved hjelp av jod ved å dekke platen med jodpulver.

Kolonnekromatografien gjennomføres på Merck silikagel 60 med en granulometri 0,063-0,200 mm.

b) Betingelser for rensin<g>ved preparativ HPLC.

Appataruren er en enhet for kromatografi i væskefase ved gradientmodus som tillater en

U.V. detektering. Denne preparative kjede består av følgende elementer:

Pumpe A: GILSON modell 305 utstyrt med et 50 SC hode.

Pumpe B: GILSON modell 303 utstyrt med et 50 SC hode.

Injeksjons sløyfe: 5 ml.

Trykk modul: GILSON modell 806.

Blander: GILSON modell 811 C utstyrt med et hode på 23 ml.

UV detektor: GILSON modell 119 utstyrt med en preparativ celle,

i Fraksjons kollekter: GILSON modell 202 utstyrt med n° 21 porter og glassrør på 10 ml.

Integrator: SHTMADZU modell C-R6A.

Kolonne: C4 kolonne (10 mm) i rustfritt stål med lengde 25 cm og diameter 2.2 cm, markedsført av VYDAC, modell 214 TP 1022.

Oppløsningen av produkt som skal renses chargeres på kolonnen ved hjelp av injeksjons-sløyfen og eluatet samles fraksjonsvis i rør på 30 sekunder. Detektoren reguleres til bølgelengder på 220 nm og 254 nm.

De mobile faser er som følger:

) Gradient:

c) Teknikker ved analytisk kromatografi

HPLC-analysen gjennomføres på en Merck-Hitachi apparatur utstyrt med en integrator-i kalkulator D 2500 HITACHI, en autosampler AS-2000A, en intelligent pumpe L-6200A og en detektor UV-vis L-4000 med regulerbar bølgelengde satt til 220 nm.

Kolonnene for analytisk separering er Browlee kolonner av rustfritt stål med lengde 3 cm og diameter 0,46 cm, markedsført av APPLIED BIOSYSTEM.

Den stasjonært fase består av Aquapore Butyl 7 mikron. De mobile faser er vann (med trifluoreddiksyre) og acetonitril (med trifluoreddiksyre). Injeksjonene er på 20 ul av en oppløsning på rundt 1 mg/cm<3>i en ventil med sløyfe på 0,1 cm<3>. Mengden for analyser reguleres til mellom 1 cmVmin og 4 cm<3>/min. Trykket er rundt 180 bar.

Separeringsbetingelsene er oppsummert nedenfor:

Gradient:

EKSEMPLER

A\ SYNTESER AV FORBINDELSER IFØLGE OPPFINNELSEN

Eksempel 1: Syntese av forbindelse ( 1) (N-dioktadecylkarbamoylmetyl-2-{3-[4-(2-imino-tetrahydro-pyrimidin-l-yl)-butylamino]-propylamino}-acetamid) fra kationisk lipid med den kondenserte formel NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)i7CH3]2, nedenfor kalt "lipid B" (hvis fremstilling er beskrevet i WO 97/18185 og hvis struktur er vist i figur 1).

I en kolbe utstyrt med magnetrør oppløses 0,784 mmol lipid B i 25 cm3 metanol og det tilsettes 10,21 mmol trietylamin. Derefter heller man langsomt (5 minutter) på denne blanding en oppløsning av O-metylisourea og svovelsyre (1,173 mmol) i vann (9 cm<3>). Blandingen holdes ved 50°C i et oljebad i 20 timer.

Derefter konsentreres blandingen til tørr tilstand på en rotasjonsfordamper. Man opplø-ser den tørre resten med en oppløsning av vann (4 cm 3 ), etanol (4 cm 3 ), o"g trifluoreddiksyre (1 cm<3>). Denne oppløsning injiseres to ganger til preparativ HPLC.

De interessante fraksjoner (bestemt ved analytisk HPLC) separeres, fryses og lyofiliseres. Man oppnår på denne måte 194 mg (0,163 mmol) av det saltdannede produkt.

Utbytte: 20,8%

HPLCanaiytisk:Rt=15,99 minutter.

^- NMR- spektrum (400 MHz, (CD3)2SO d6, 6 en ppm): 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H : CH3fra fettkjeden) ; 1,24 (mt, 60H : CH2sentral i fettkjedene); fra 1,35 til 1,70 (mt, 4H : 1 CH2i hver fettkjede); 1,57 (mt, 4H : (CH2)2sentral i butyl); 1,88 og 1,96 (2 mts, 2H hver: CH2sentral i propyl og CH2sentral i ringen); fra 2,85 til 3,35 (2 mts, 16H til sammen : de 8 NCH2); 3,81 ( s stor, 2H : NCH2CON) ; 4,03 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); 7,25 og 7,84 (henholdsvis s og s stor, 1H hver: de 2 NH i ringen); 8,61 (t, J = 5,5 Hz, 1H : NHCO); 8,70 og 9,02 (2 mfs, 1H hver: de 2 NH).

MH<+>= 846

Eksempel 2: Syntese av forbindelse ( 2) (N-ditetradecylkarbamoylmetyl-2-{3-[4-(2-imino-tetrahydro-pyrimidin-l-yl)-butylamino]-propylamino}-acetamid) fra forbindelsen med den kondenserte formel NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2, i det følgende kalt "lipid C" (hvis fremstilling er beskrevet i WO 97/18185 og hvis struktur er vist i figur 1).

I en kolbe utstyrt med magnetstav oppløses 1,036 mmol lipid C i 30 cm<3>metanol og man tilsetter 13,13 mmol trietylamin. Derefter heller man langsomt (5 minutter) i en oppløsning av O-metylisourea og svovelsyre (1,554 mmol) i vann (9 cm ). Blandingen holdes ved 50°C i et oljebad i et tyvetalls timer. Derefter konsentreres blandingen til tørr tilstand på en rotasjonsfordamper. Man oppløser tørrstoffet med en oppløsning av 3 cm<3>vann, 2 cm etanol og 0,5 cm trifluoreddiksyre. Denne oppløsning injiseres i preparativ

HPLC.

De interessante fraksjoner (bestemt ved analytisk HPLC) separeres, fryses og lyofiliseres. Man oppnår til slutt 218 mg (0,2022 mmol) av det saltdannede produkt.

Utbytte: R =19,5%

HPLCanaiytiSk : Rt = 10.76 minutter.

' H- NMR- spektrum (400 MHz, (CD3)2SO d6,8 en ppm): 0,88 (t, J = 7 hz, 6H : CH3 av fettkjedene); fra 1,15 til 1,40 (mt, 44H : (CH2)nsentral i fettkjedene); 1,45 og fra 1,50 til 1.65 (2 mts, 2H hver: 1 CH2av hver fettkjede) ; 1,59 (mt, 4H : 2 CH2sentral i butyl) ; 1,91 og 1,97 (2 mts, 2H hver : CH2sentral i propylene); fra 2,85 til 3,10 (mt, 10H : 2 NCH2av butyl - de 2 NHC2av en av de 2 propyler - og 1 av de 2 NCH2av den andre propyl); 3,23 og fra 3,30 til 3,50 (2 mts, henholdsvis 5H og 1H : den andre NCH2av den andre propyl og NCH2av fettkjedene); 3,79 (mf, 2H : NCH2CON) ; 4,03 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); 7,27 og fra 8,40 til 9,30 (respektivt s stor og mf, 2H og 4H : NH2<+>CF3COO, NH<1>" CF3COO" og = NH); 7,88 og 8,61 (respektivt s og s stor, 1H hver: respektivt NHC=N og CONH).

Mj£ = 734

Eksempel 3: Syntese av forbindelse ( 3i f2-(3-i4-r3-(4,5-dihydro-lH-imidazol-2-ylamino)-propylamino]-butylamino}-propylamino)-N-ditetradecylkarbamoylmetyl-acetamid) fra lipid C (se eksempel 2 og figur 1 når det gjelder strukturen).

I en kolbe utstyrt med dråpeteller og magnetrører oppløses 0,36 mmol 2-metylmerkapto-2-imidazolium jodid i 0,36 cm<3>IN NaOH. Til denne oppløsning settes 0,36 mmol lipid C som på forhånd er oppløst i 1,44 cm3 IN NaOH, 5 cm<3>vann og 4 cm<3>etanol. Blandingen holdes under omrøring inntil frigjøringen av metylmerkaptan gir seg (24 timer). Blandingen konsentreres derefter til tørr tilstand på en rotasjonsfordamper. Tørrstoffet oppløses med en oppløsning av 4 cm<3>vann, 4 cm3 etanol og 0,5 cm<3>trifluoreddiksyre. Denne oppløsning injiseres to ganger til preparativ HPLC.

De interessante fraksjoner (bestemt ved analytisk HPLC) separeres, fryses og lyofiliseres. Man oppnår til slutt 213 mg (0,1727 mmol) av det saltdannede produkt.

Utbytte: R = 48%

HPLC™^.*: Rt = 8,90 minutter.

' H- NMR- spektrum ("400 MHz, (CD3)2SOd6 med noen dråper CD3COOD d4,8 en ppm): 0,87 (t, J = 7 hz, 6H : CH3av fettkjedene); fra 1,15 til 1,40 (mt, 44H : (CH2)nsentral i fettkjedene); 1,45 og 1,55 (2 mts, 2H hver: 1 CH2av hver fettkjede); 1,65 (mt, 4H : 2 CH2sentral i butyl); fra 1,80 til 1,95 (mt, 4H : CH2sentral i propylene); fra

2,80 til 3,05 (mt, 10H : de 2 NCH2av butyl - de 2 NCH2av en av de 2 propyler - og 1 av de 2 NCH2i den andre propyl); 3,24 (mt, 6H : den andre NCH2av den andre propyl og NCH2av fettkjedene); 3,56 (s, 2H : NCH2CON) ; 3,62 (s, 4H : NCH2CH2N) ; 4,02 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl).

MH<+>= 777

Eksempel 4: Syntese av forbindelse ( 4^ (2-(3-f bis-r3-f4.5-dihvdro-lH-imidazol-2-ylamino)-propyl] -amino} -propylamino)-N-ditetradecylkarbamoylmetyl-acetamid) ved metoden med syntese av "byggeklosser".

I) SYNTESE AV BOC-GLY-DITETRADECYLAMIN (a)

Gruppen Gly der aminene er beskyttet med Boe grupper (10 mmol) og ditetradecylamin (10 mmol) innføres i en kolbe på 250 ml hvorefter det tilsettes 100 cm diklormetan.

Blandingen omrøres til fullstendig oppløsning. 30 mmol N-etyldiisopropylamin (DIEA) og 11 mmol benzotriazol-l-yloksytirsdimetylaminfosfonium (BOP) tilsettes. PH verdien holdes ved 10 ved hjelp av DIEA og blandingen omrøres i 2 timer. Når reaksjonen er ferdig (fulgt ved CCM og/eller HPLC) fordampes diklormetanet og det oppnådde faststoff tas opp i 300 cm etylacetat. Den organiske fase vaskes med 4 ganger 100 cm av en oppløsning av kaliumsulfat, 4 ganger 100 cm<3>natriumkarbonat og 4 ganger 100 cm<3>natriumklorid. Den organiske fase blir derefter tørket over magnesiumsulfat, filtrert og fordampet under undertrykk. Produktet (a) oppnås med et utbytte på 93%.

CCM: Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH' =567

II) SYNTESE AV [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (b)

1) Syntese av NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c) Aminet av N-(cyanoetyl)-glysin (0,1 mol/amin, kommersiell) oppløseliggjøres i IN NaOH (200 cm<3>/amin) og 200 cm<3>dioksan. Oppløsningen omrøres i et isbad og derefter tilsettes dråpevis en oppløsning av 0-(/-butyoksykarbonyl)2eller p-klorbenzyloksykarbonyl (C1Z, 0,14 mol/amin) i 200 cm<3>dioksan. pH-verdien holdes ved en verdi over 9. Derefter omrøres blandingen ved rundt 20 °C over natten. Dioksanet fordampes under undertrykk og derefter surgjøres blandingen til pH 3 ved hjelp av en oppløsning av kaliumsulfat. Det uoppløselige ekstraheres med 3 ganger 100 cm etylacetat og vaskes så med 2 ganger 100 cm<3>natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magne siumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktet (c) med formelen NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH oppnås i et utbytte på 98%.

CCM: Rf = 0,66 (CHCla/MeOH, 8:2)

MH+ : 229

2) Syntese av NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (d)

I en rustfri autoklav på 1 liter innføres 50 mmol produkt (c) med formelen NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH. I et begerglass fremstilles samtidig en oppløsning av 10 cm3 etanol (95%) og 3,3 g natriumhydroksyd (80 mol). Når hydroksydet er oppløst innføres 2 cm Raney-nikkel på karbon. Autoklaven lukkes. Hydrogeneringsstarttrykket er cirka 52 bar og dette synker til rundt 48,5 bar over natten ved romtemperatur (20°C). Suspensjonen filtreres på papir og filtratet vaskes med 4 ganger 25 cm<3>etanol hvoretter filtratene konsentreres under undertrykk. Man oppnår produkt (d) som benyttes i det følgen-de uten ytterligere rensing.

CCM: Rf = 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)

Mj<£>:233

3) Syntese av [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (e)

I en kolbe oppløses produkt (d) med formelen NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (0,05 mol) og natriumhydroksyd (0,1 mol) i 150 cm vann. Oppløsningen avkjøles i et isbad. Under heftig omrøring heller man langsomt i akrylnitril (0,12 mol) mens man holder temperaturen i massen under 20°C. Reaksjonsblandingen holdes over natten ved omgivelsestemperatur (20°C). Derefter holdes blandingen ved 50°C i 2 timer. Oppløsnings-middelet fordampes under undertrykk og derefter surgjøres blandingen til pH 3 med en oppløsning av kaliumsulfat. Det uoppløselige ekstraheres med 3 ganger 200 cm<3>etylacetat og vaskes så med 2 ganger 100 cm3 natriumkloirdoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og filtreres og fordampes under undertrykk. "Råproduktet" renses eventuelt på en silika-kolonne. Man oppnår produkt (e) med et utbytte på 50%.

CCM: Rf = 0,75 (CHCl3/MeOH, 6:4)

MH<+>: 339

4) Syntese av [Z-NH-(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (b)

I en stålautoklav på 1 liter innføres produkt (e) med formelen [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-NH-B0C-CH2-COOH (50 mmol). I et begerglass fremstilles samtidig en oppløsning av 10 cm3 etanol (95%) og 3,3 g natriumhydroksyd (80 mol). Når hydroksydet er oppløst innføres denne oppløsning i autoklaven. En nitrogenstrøm føres gjennom autoklaven og man innfører 2 cm<3>Raney-nikkel på karbon. Autoklaven lukkes. Hydrogeneringsstarttrykket er rundt 52 bar og dette synker til 48,5 bar over natten ved omgivelsestemperatur (20°C). Suspensjonen filtreres på papir, filteret vaskes med 4 ganger 25 cm etanol og filtratene konsentreres til tørr tilstand under undertrykk. Man oppnår et hvitt faststoff som oppløseliggjøres uten ytterligere rensing efter en tynnsjiktkromatografisk analyse.

CCM : Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6:4)

Det tidligere oppnådde faststoff oppløses i IN NaOH (200 cm /amin) og 200 cm dioksan. Oppløsningen omrøres i et isbad og derefter tilsettes dråpevis en oppløsning av (/-butoksykarbonyl)20 eller p-klorbenzyloksykarbonyl (0,14 mol/amin) i 200 cm dioksan. pH-verdien holdes ved en verdi over 9. Derefter blir blandingen omrørt ved omgivelses temperatur (20°C) over natten. Dioksanet fordampes under undertrykk og derefter surgjøres blandingen til pH 3 ved hjelp av en oppløsning av kaliumsulfat. Det uoppløse-lige ekstraheres med 3 ganger 100 cm<3>etylacetat og vaskes derefter med 2 ganger 100 cm3 natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesium sulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene analyseres ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC.

Råproduktet renses på en silikakolonne (diklormetan:metanoI, 8:2).

Man oppnår produkt (b) i et utbytte av 66% i forhold til produkt (d).

CCM : Rf = 0,42 (CHCl3/MeOH, 6:4)

MH<*>:615

III) SYNTESE AV [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CHrCOG]yNf(CH2),3-CH3]2(f)

Produkt (a) der aminene er beskyttet med Boe grupper (1 mmol) innføres i en kolbe utstyrt med magnetrører. 30 cm<3>trifluoreddiksyre tilsettes ved 4°C og derefter omrøres oppløsningen i 1 time. Når reaksjonen er oppnådd (fulgt ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC) fordampes trifluoreddiksyren under undertrykk og derefter tørkes produktet ved kofordamping med 3 ganger 30 cm3 etyleter.

HPLC: Rt = 12,86 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

Det oppnådde produkt (Gly-ditetradecylamin, 10 mmol) og produkt (b) (10 mmol) inn-føres i en kolbe på 250 cm<3>,100 cm<3>diklormetan tilsettes og blandingen omrøres til fullstendig oppløsning. 30 mmol N-etyldiisopropylamin (DIEA) og 11 mmol heksafluorfosfat av BOP tilsettes så. pH-verdien holdes ved 10 ved hjelp av DIEA og blandingen omrøres i 2 timer. Efter ferdig reaksjon (fulgt ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC) fordampes diklormetanet og det oppnådde faststoff tas opp i 300 cm<3>etylacetat. Den organiske fase vaskes med 4 ganger 100 cm<3>kaliumsulfatoppløsning, 4 ganger 100 cm3 natriumkarbonatoppløsning og 4 ganger 100 cm<3>natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene benyttes uten ytterligere rensing. Produkt (f) oppnås med et utbytte på 75% efter rensing på en silikakolonne (diklormetan:metanol, 8:2).

CCM: Rf = 0,86 (CHCl3/MeOH, 8:2)

HPLC: Rt = 17,44 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

IV) SYNTESE AV [NH2(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)i3-CH3]2(g)

Produkt (f) der aminene er beskyttet innføres i en kolbe utstyrt med magnetstav og opp-løst i 10 cm<3>metanol per gram produkt. Palladium på karbon (10%, 1 g/g produkt) og ammoniumformiat (1 g/g produkt) tilsettes ved omgivelses temperatur. Hydrogenolysen følges ved HPLC. Efter 2 timer er reaksjonen ferdig, blandingen filtreres og filtratet vaskes med 3 ganger 10 cm<3>metanol per gram produkt. 2 ganger destillert vann tilsettes og oppløsningen fryses og lyofiliseres eller filtratet konsentreres til tørr tilstand og fast stoffet tas opp i 300 cm3 etylacetat. Den organiske fase vaskes med 2 ganger 100 cm<3>av en oppløsning av natriumkarbonat og 2 ganger 100 cm<3>av en oppløsning av natriumklorid hvoretter den tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene analyseres ved HPLC og benyttes uten ytterligere rensing. Produkt (g) oppnås med et utbytte på 40% i forhold til produkt (f).

HPLC: Rt = 9,62 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]). MH<+>: 795.

V) SYNTESE AV FORBINDELSE (4)

Produkt (g) som inneholder primær aminer som skal modifiseres (1 mmol/amin) opplø-ses i 10 cm3 diklormetan og derefter tilsettes 2-metyltio imidazolin hydrojodid (1,2 mmol/amin) og trietylamin (1,3 mmol/amin). Blandingen omrøres ved omgivelsestemperatur (20°C) akkurat til utviklingen av metylsulfid opphører. Ved slutten av reaksjonen, fulgt ved HPLC, fordampes diklormetanet under undertrykk.

Det oppnådde produktet der aminene er beskyttet ved Boe grupper (1 mmol) innføres i en ballong utstyrt med magnetrører. 30 cm<3>trifluoreddiksyre tilsettes ved 4 °C og derefter omrøres oppløsningen i 1 time. Efter ferdig reaksjon (fulgt ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC) fordampes trifluoreddiksyren under undertrykk hvoretter produktet tørkes ved kofordamping med 3 ganger 30 cm etyleter.

Det oppnådde produkt renses ved preparativ HPLC og fraksjonene analyseres ved HPLC. Man oppnår på denne måte forbindelse (4) ifølge oppfinnelsen med et utbytte på 34%.

HPLC: R, = 10,07 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

' H NMR s<p>ektre (400 MHz, (CD3)2SO de ved en temperatur av 383K, d en ppm): 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3av fettkjeder) ; fra 1,25 til 1,45 (mt, 44H : (CH2)U sentral i fettkjedene) ; 1,57 (mt, 4H : 1 CH2av hver fettkjede) ; fra 1,70 til 1,90 (mt, 6H : CH2sentral av propylene); fra 2,50 til 3,40 (mt, 16H : de 2 NCH2av propylene og NCH2er av fettkjedene); 3,68 (s, 8H : 2 NCH2CH2N); 3,72 (s stor, 2H: NCH2CON); 4,06 (s, 2H:

CONCH2CON av glycyl).

MH+ : 831

Eksempel 5: Syntese av forbindelse ( 5) : (N-ditetradecvlkarbamoylmetyl-2-f 3-f3-(1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-ylamino)-propyIamino]propylamino} -acetamid) ved metoden med syntese av "byggeklosser".

I) SYNTESE AV BOC-GLY-DITETRADECYLAMIN (a)

Man arbeider på samme måte som i det foregående eksempel. Produkt (a) oppnås med et utbytte på 93%.

CCM: Rf 0,9 (CHCls/MeOH, 9:1)

Mi£: 567

II) SYNTESE AV Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b)

1) Syntese av NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c) Man arbeider på samme måte som i eksempel 4. Produkt (c) oppnås med et utbytte på 98%.

CCM: Rf = 0,66 (CHCl3/MeOH, 8:2)

MH+ : 229 2) Syntese av NH2-(CH2)3-NH~Boc-CH2-COOH (d) Produkt (d) oppnås på samme måte som ovenfor i eksempel 4.

CCM: Rf = 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)

MH+: 233

3) Syntese av NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (e)

I en kolbe blir produkt (d) (0,05 mol) og en NaOH (0,1 mol) oppløst i 150 cm3 vann. Oppløsningen avkjøles i et isbad. Under heftig omrøring ihelles langsomt akrylnitril (0,05 mol) idet man passer på at temperaturen i massen ikke overskrider 20°C. Reaksjonsblandingen holdes natten over ved omgivelsestemperatur (20°C).

Oppløsningsmiddelet fordampes under undertrykk og derefter surgjøres blandingen til pH 3 med en kaliumsulfatoppløsning. Det uoppløselige ekstraheres med 3 ganger 200 cm etylacetat og vaskes så med 2 ganger 100 cm3 av en natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesium sulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Det oppnådde produkt renses eventuelt på en silika kolonne.

Det oppnådde produkt (0,1 mol/amin) oppløses i IN NaOH (200 cm /amin) og dioksan (200 cm ). Oppløsningen omrøres i et isbad og derefter tilsettes dråpevis en oppløsning av (Boc)20 eller p-klorbenzyloksykarbonyl (0,14 mol/amin) i 200 cm<3>dioksan. PH verdien holdes ved en verdi over 9. Derefter omrøres blandingen ved omgivelsestemperatur (20°C) over natten. Dioksanet fordampes under undertrykk og derefter surgjøres blandingen til pH 3 med en kaliumsulfatoppløsning. Det uoppløselige ekstraheres med 3 ganger 100 cm<3>etylacetat og vaskes så med 2 ganger 100 cm3 natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene analyseres ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC.

Produkt (e) oppnås med et utbytte på 93%.

CCM: Rf = 0.75 (CHClj/MeOH, 8:2)

MH* 386

4) Syntese av Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc<:H2-COOH (b)

I en rustfri autoklav på 1 liter innføres produkt (e) (50 mmol). Man fremstiller samtidig i et begerglass en oppløsning av 10 cm<3>etanol (95%) og 3,3 g NaOH (80 mol). Efter at hydroksydet er oppløst innføres denne oppløsning i autoklaven. En nitrogenstrøm føres gjennom autoklaven og man innfører 2 cm<3>Raney-nikkel på karbon. Autoklaven lukkes. Hydrogeneringsstarttrykket er cirka 52 bar og dette synker til cirka 48,5 bar i løpet av en natt ved omgivelsestemperatur (20°C). Suspensjonen filtreres på papir, filteret vaskes med 4 ganger 25 cm3 etanol og filtratene konsentreres til tørr tilstand under undertrykk. Man oppnår et hvitt fast stoff som benyttes uten ytterligere rensing efter en tynnsjiktkromatografisk analyse.

CCM: Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6:4)

Det oppnådde produkt (0,1 mol/amin) oppløses i IN natriumhydroksyd (200 cm /amin) og dioksan (200 cm ). Oppløsningen omrøres i et isbad og derefter tilsettes dråpevis en oppløsning av p-klorbenzyloksykarbonyl (0,14 mol/amin) i 200 cm<3>dioksan. pH-verdien holdes ved en verdi over 9. Derefter omrøres blandingen ved omgivelses temperatur (20°C) over natten. Dioksanet fordampes under undertrykk og man surgjør blandingen til pH 3 ved hjelp av en kaliumsulfatoppløsning. Det uoppløselige ekstraheres med 3 ganger 100 cm3 etylacetat og vaskes så med 2 ganger 100 cm<3>natriumkloridoppløsning. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Det oppnådde produkt renses på en silikakolonne (diklormetan:metanol, 9:1). Produktene analyseres ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC. Produkt (b) oppnås i et utbytte av 32% i forhold til produkt (d).

CCM: Rf = 0,63 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH+: 523

III) SYNTESE AV 2-metylsulfonyl-l ,4,5,6-tetrahydropyrimidin (f)

I en kolbe ble det under omrøring og en nitrogenstrøm fylt i 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidintiol (0,0103 mol) hvoretter 5 cm metanol og 0,65 cm metyl jodid (0,0105 mol) ble tilsatt. Blandingen ble brakt til tilbakeløp i 1 time og derefter satt hen for av-kjøling til omgivelsestemperatur (20°C). Produktet precipiteres ved tilsetting av 5 cm<3>etyleter. Bunnfallet filtreres og vaskes derefter i etyleter. Produktet tørkes så over natten under et trykk på 34 mbar.

Man oppnår 1,5 g (0,0041 mol) av produkt (VI), det vil si et utbytte på 40%.

CCM: Rf = 0,25 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH+ : 131

d) SYNTESE AV Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)i3-CH3]2(g)

Produktet (a) der aminene er beskyttet ved Boe grupper (1 mmol) innføres i en kolbe

utstyrt med magnetrører. 30 cm3 trifluoreddiksyre tilsettes ved 4°C og derefter omrøres oppløsningen i 1 time. Når reaksjonen er ferdig (fulgt ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC) fordampes trifluoreddiksyren under undertrykk hvorefter det oppnådde produktet tørkes ved kofordamping med 3 ganger 30 cm etyleter.

HPLC: Rt = 12,86 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

Det oppnådde produkt (10 mmol) og produkt (b) (10 mmol) innføres i en kolbe på 250 cm<3>. 100 cm<3>diklormetan tilsettes og blandingen omrøres til fullstendig oppløsning. 30 mmol DIEA og 11 mmol BOP tilsettes så. pH-verdien holdes ved 10 ved hjelp av DIEA og blandingen omrøres i 2 timer. Efter ferdig reaksjon (fulgt ved tynnsjiktkromatografi og/eller HPLC) fordampes diklormetanet og det oppnådde faststoff tas opp i 300 cm etylacetat. Den organiske fase vaskes med 4 ganger 100 cm av en oppløsning av kaliumsulfat, 4 ganger 100 cm natriumkarbonat og 4 ganger 100 cm natriumklorid. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene benyttes uten ytterligere rensing.

Efter rensing på silikagelkolonner (diklormetan:metanol, 8:2), oppnås produkt (g) i et utbytte på 85%.

CCM: Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9:1)

HPLC: Rt = 19,79 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

V) SYNTESE AV NH2(CH2)3]2-N-Boc-{CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)i3-CH3]200

Produkt (g) innføres i en kolbe utstyrt med magnetrører og oppløst i 10 cm<3>metanol/g produkt. Palladium på karbon (10%, 1 g/g produkt) samt ammoniumformiat (1 g/g produkt) tilsettes ved omgivelsestemperatur (20°C). Hydrogenolysen følges ved HPLC. Efter 2 timer er reaksjonen ferdig, blandingen filtreres og vaskes med 3 ganger 10 cm metanol/g produkt. 2 ganger destillert vann tilsettes og oppløsningen fryses og lyofiliseres hvoretter filtratet konsentreres til tørr tilstand og fast stoffet tas opp i 300 cm<3>etylacetat. Den organiske fase vaskes med 2 ganger 100 cm<3>av en oppløsning av natriumkarbonat, 2 ganger 100 cm<3>av en oppløsning av natriumklorid og tørkes så over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Produktene analyseres ved HPLC og benyttes uten ytterligere rensing. Produkt (h) oppnås i et utbytte på 93% beregnet på produkt (g).

CCM: Rf = 0,42 (CHCl3/MeOH, 6:4)

HPLC: Rt = 14,66 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

MH* 838

VI) SYNTESE AV FORBINDELSE (5)

Produkt (h) inneholdene det primære amin som skal modifiseres (1 mmol/amin) opplø-ses i 10 cm<3>diklormetan hvoretter man tilsetter produkt (f) (1,2 mmol/amin) og trietylamin (1,3 mmol/amin). Blandingen omrøres ved romtemperatur (20°C) inntil stans av utviklingen av metylsulfid. Efter ferdig reaksjon (fulgt ved HPLC) fordampes diklormetanet under undertrykk.

Det oppnådde produkt renses ved preparativ HPLC og fraksjonene analyseres ved HPLC. Forbindelse (5) oppnås på denne måte i et utbytte av 38%.

HPLC: R, = 8,42 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

' H- NMR- spektrum (400 MHz, (CD3)2SO d6,6 en ppm): 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3av fettkjeden); fra 1,10 til 1,35 (mt, 44H : (CH2)nsentral i fettkjeden) ; 1,44 og 1,53 (2

mts, 2H hver: 1CH2av hver fettkjede) ; fra 1,80 til 2,00 (mt, 6H : CH2sentral i propy-len og CH2av 1,3,4,5-tetrahydro-pyrimidin); fra 2, 80 til 3,10 (mt, 10H : NCH2av propylene ogNCH2av 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidin); fra 3,15 til 3,45 (mt, 6H'ene tilsvarende NCH2av 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidin og NCH2av fettkjedene) ; 3,81 (mf, 2H : NCH2CON) ; 4,04 (D, J = 5 Hz, 2H: CONCH2CON fra glysyl); 7,89-8,62-8,75 og 9,01 (4 mfs, 8H til sammen: de utskiftbare og OH av CF3COOH).

MH~j 720

Eksempel 6: Syntese av forbindelse ( 6): (N-dioktadecylkarbamoylmetyl-2-{3-[3-(l,4,5,6-terj^ydropyrimidin-2-ylamino)-propylamino]propylamino}-acetamid) ved metoden for syntese av "byggeklosser".

I) SYNTESE AV BOC-GLY-DITETRADECYLAMIN (a)

Man arbeider på samme måte som i det foregående eksempel. Produkt (a) oppnås i et utbytte av 93%.

CCM: Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH<+>: 567

II) SYNTESE AV Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b) 1) Syntese av NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c) Man arbeider på samme måte som tidligere i eksempel 5. Produkt (c) oppnås i et utbytte av 98%.

CCM: Rf = 0,66 (CHCljMeOH, 8:2)

MH<+>: 229 2) Syntese av NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (d) Produkt (d) oppnås på samme måte som tidligere i eksempel 5.

CCM: Rf = 0,12 (CHCl3ÆvleOH, 6:4)

MH*: 233 3) Syntese av NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CHrCOOH (e) Man arbeider på samme måte som tidligere i eksempel 5. Produkt (e) oppnås på denne måte i et utbytte av 93%.

CCM: Rf = 0,75 (CHCl3/MeOH, 8:2)

MH+: 386 4) Syntese av Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b) Man arbeider på samme måte som tidligere under eksempel 5. Man oppnår et hvitt fast stoff som benyttes uten ytterligere rensing efter en tynnsjiktkromatografisk analyse.

CCM: Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6:4)

Det oppnådde produkt benyttes på samme måte som tidligere for å beskytte det terminale amin med en benzyloksykarbonylgruppe. Produkt (b) oppnås på denne måte i et utbytte av 32% beregnet på produkt (d).

CCM: Rf = 0,63 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH+: 523

III) SYNTESE AV 2-metylsulfonyl-1,4,5,6-tetrahydropyrirnidin (f)

Man arbeider på samme måte som tidligere i eksempel 5. Man oppnår på denne måte 1,5 g (0,0041 mol) av produkt (f), det vil si et utbytte på 40%.

CCM: Rf = 0,25 (CHCl3/MeOH, 9:1)

MH<+>: 131

IV) SYNTESE AV Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)!7CH3]2(g)

Man arbeider på samme måte som tidligere i eksempel 5. Man oppnår på denne måte produkt (a) der Boe gruppene er spaltet.

HPLC: Rt = 19.44 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

Dette produkt benyttes på samme måte som med produkt (b) som tidligere i eksempel 5. Efter rensing på silikagelkolonne (diklormetan:metanol, 8:2), oppnås produkt (g) i et utbytte av 84%.

CCM: Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9:1)

HPLC: Rt = 23,95 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

V) SYNTESE AV NH2(CH2)3]2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)i7-CH3]2

(h)

Man arbeider på samme måte som tidligere med eksempel 5. Produkt (h) oppnås i et utbytte på 73% beregnet på produkt (g).

CCM: Rf = 0,28 (CHCl3/MeOH, 6:4)

HPLC: Rt = 20,59 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

MH* : 838

VI) SYNTESE AV FORBINDELSE (6)

Man arbeider på samme måte som tidligere i eksempel 5. Forbindelse (6) oppnås på denne måte i et utbytte av 68%.

HPLC: R, = 15,83 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).

' H NMR spektrum (500 MHz, (CD3)2SO d6,8 en ppm): 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3i fettkjeden); fra 1,15 til 1,35 (mt, 60H : (CH2)i5sentralt i fettkjeden); 1,46 og 1,54 (2 mts, 2H hver: 1 CH2av hver fettkjede); fra 1,80 til 2,00 (mt, 6H : CH2sentral av propylene og CH2av 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidin); fra 2,85 til 3,05 (mt, 10H : NCH2av propylene og NCH2av 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidim) ; fra 3,15 til 3,45 (mt, 6H'ene tilsvarende NCH2av 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidin ogNCH2av fettkjedene); 3,81 (mf, 2H : NCH2CON); 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glysyl); 7,88-8,61-8,74 og 8,99 (4 mfs, 8H til sammen: de utskiftbare og OH av CF3COOH).

MH<+>: 832

B\ ANVENDELSE AV TRANSFEKSJONS MIDLENE IFØLGE OPPFINNELSEN

Eksempel 7: Fremstilling av nukleolipid- komplekser

Dette eksempel viser fremstilling av nukleolipid komplekser ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsen som benyttes i dette eksempel er forbindelse (1) i oppløsning i kloroform. Mengder på 10 nmol forbindelse (1) (det vil si 11,8 ug) per ug DNA benyttes. I visse tilfeller blir et nøytralt ko-lipid, kolesterol eller DOPE, iblandet med forbindelsen på forhånd. En fin lipidfilm dannes når man fordamper kloroformen ved hjelp av en lett argonstrøm men den rehydratiseres i en blanding av 5% dekstrose og 20 mm natriumklorid over natten ved 4°C. Prøver behandles så med ultralyd i 5 minutter, oppvarmes til 65°C i 30 minutter og behandles så på ny med ultralyd i S minutter. Man oppnår på denne måte lipidsuspensjoner som oppbevares ved 4°C inntil anvendelse.

Det benyttede DNA er plasmid pXL2774 (figur 2) i oppløsning i en blanding av 5% dekstrose og 20 mM natriumklorid ved en konsentrasjon av 0,5 mg/ml eller 1,0 mg/ml. Plasmid pXL2774 har følgende egenskaper:

- endotoksin-nivå under 50 EU/mg,

- mengde superoppviklet DNA over 60%,

- innehold av RNA, det vil si mRNA, tRNA eller ribosomisk RNA (bestemt ved

HPLC) under 5%,

- mengde kromosomal DNA under 1%,

- proteininnhold under 1%,

- osmolaritet under 15 mosmol/kg.

Man fremstiller nukleolipidiske komplekser ifølge oppfinnelsen ved hurtig å blande like volumer av DNA oppløsning og lipidsuspensjon som beskrevet ovenfor. Mengden av forbindelse som kompleks bindes til DNA varierer fra 0,5 nmol/ug DNA til 12 nmol/ug

DNA.

Eksempel 8: Oppførselen hos de dannede komplekser ved forskjellige ladningsfor-hoid

Dette eksempel illustrerer oppførselen hos nukleolipidkompleksene ifølge oppfinnelsen ved forskjellige ladningsforhold. Innflytelsen av tilsetningen av et nøytralt ko-lipid er også illustrert.

Størrelsen på kompleksene analyseres ved å måle den hydrodynamiske diameter ved dynamisk diffusjon av lys (Dynamic Laser Light Scattering) ved hjelp av en Coulter N4plus apparatur. Prøvene fortynnes 20 ganger i en oppløsning inneholdene 5% dekstrose og 20 mM natriumklorid for å unngå multiple diffusjoner. Virkningen av cykloamidingruppen, lipidforbindelsen og ladningsforhold på størrelsen av de nukleolipidiske komplekser ifølge oppfinnelsen, studeres på denne måte.

Man atskiller tre mulige faser når man øker ladningsforholdet mellom forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen og DNA. Disse tre faser bestemmer det terapeutiske potensialet for forbindelse (1). Figur 3 viser de 3 faser for forbindelse (1). Man oppnår den samme oppførsel for andre forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Ved lavt ladningsforhold blir DNA ikke mettet av forbindelse (1). Det forblir fremdeles naken DNA og kompleksene er totalt sett negativt ladet. Partiklene er av liten størrelse (mellom 100 og 300 nm). Denne fase kalles "fase A".

Det faktum at DNA ikke er fullstendig mettet med forbindelse (1) betyr at DNA ikke er fullstendig beskyttet med denne. DNA kan således undergå nedbrytning av enzymer (DNAaser). Videre er kompleksene totalt sett negative og passasjen gjennom det cellulære membran er vanskelig. Av disse grunner har nukleolipid-kompleksene i fase A en meget lavere effektivitet ved transfeksjon.

Ved midlere ladningsforhold er DNA komplett mettet av forbindelse (1) og kompleksene er totalt sett nøytrale eller lett positive. Denne fase er ustabil fordi de ioniske repulsjoner er minimale og fordi det kan oppstå et "fornettnings"-fenomen. Størrelsen for partiklene er godt over detekterings grensen for den dynamiske diffusjon av lys (godt over 3 um). Denne ustabile fase kalles "fase B".

En slik kompleks-størrelse er ikke tilpasset for bruk ved injeksjon. Imidlertid betyr dette ikke at kompleksene er inaktive i fase B men de er kun uten noen formulering som er egnet for injeksjon i farmasøytisk formål.

Ved relativt høye ladningsforhold er det angjeldende DNA overmettet med forbindelse (1) og forbindelsene er totalt sett positive. På grunn av de sterke repulsjoner mellom de positive ladninger er denne fase stabil. Den angis under betegnelsen "fase C". I motset-ning til fase A foreligger de nukleolipidiske komplekser i en slik form at dette DNA er meget godt beskyttet mot enzymer og deres totale positive ladning letter passasjen gjennom det cellulære membran av anionisk art. Kompleksene i fase C er således spesielt egnet for anvendelse for overføring av nukleinsyrer i celler.

I tillegg til cykloamidingruppen i forbindelsen ifølge oppfinnelsen har anvendelsen av et nøytralt ko-lipid en sterk innvirkning på stabiliteten for kompleksene slik dette er vist i figur 3. Ko-lipidene som tilsettes er enten DOPE (kationisk lipid:DOPE=3:2), eller kolesterol (kationisk lipid:kolesterol=3:l). Generelt øker tilsetningen av nøytralt ko-lipid kompleksenes instabilitet, noe som medfører en økning av den mengde forbindelse som er nødvendig for å nå fase C. Dette vises klart i figur 3 når man sammenligner ladningsforholdet for fase C som nås i nærvær og fravær av ko-lipid.

Man skal merke seg at verdiene for ladningsforholdet som begrenser de tre faser A, B og C avhenger av den benyttede forbindelse. Således kan disse verdier variere sterkt fra en forbindelse til en annen.

Til slutt er affiniteten for forbindelsene vis a vis DNA som funksjon av ladningen, stu-dert. For dette forhold målte man reduksjonen av fluorescensen efter 3 tilsetninger på 3 ug etidiumbromid (EtBr). Således er substitusjonen av etidiumbromid på DNA med forbindelsen en indikasjon på bindingen til DNA.

Den benyttede formulering fortynnes ut 20 ganger inntil en sluttkonsentrasjon på 25 ug DNA/ml. Den relative fluorescens som måles for naken DNA defineres til 100%. Bin-dingsgraden med forbindelse (1) representeres ved reduksjonen av fluorescens i forhold til prøven. Figur 3 viser at fluorescensen synker når ladningsforholdet øker, noe som sier at en større mengde forbindelse (1) er disponibel for binding til DNA (jo mer fluorescensen synker, jo større mengde forbindelse bindes til DNA inntil metning).

På denne måte har man kunnet vise at affiniteten for forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen for DNA bestemmes av cykloamidingrupper men ikke ved tilsetning av et ko-lipid.

Eksempel 9; transfeksjon in vitro med forbindelse ( li

Dette eksempel viser evnen hos forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen til å transfektere DNA i celler in vitro sammenlignet med ikke formulert DNA.

Mikroplater med 24 brønner såes ut med 60000 HeLa celler (per brønn) og transfekteres 24 timer senere. Kompleksene inneholdene 1 fig DNA fortynnes i 0,5 ml kulturmedium DMEM (Gibco/BRL) i fråvær av serum og settes så til hver brønn. Cellene inkuberes ved 37°C i 4 timer. Mediet inneholdende kompleksene fjernes derefter og erstattes med en blanding av DMEM og 10% føtalt kalveserum. Derefter blir cellene nok en gang brakt i kultur i 24 timer. Til slutt lyseres cellene og testes under anvendelse av en kit for test av luciferase (Promega) og et Dynex MLX luminometer.

Resultatene som indikeres i figur 4 understreker forskjellen mellom ytelsene for naken DNA i forhold til kompleksene forbindelse (1):DNA ifølge oppfinnelsen og som helt er mettet: ingen luciferase aktivitet har kunnet detekteres (sensibilitet for apparaturen under 1 pg per brønn) efter in vitro transfeksjon av naken DNA mens overføringsaktivite-ten for genet av kompleksene ifølge oppfinnelsen varierer fra 200 til 8000 pg/brønn.

Dette eksempel viser således klart den fordelaktige anvendelse av forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen for transfeksjon av celler in vitro.

Eksempel 10: transfeksjon in vitro med forbindelsene ( 3), ( 5) og ( 6)

Dette eksempel illustrerer evnen hos forbindelsene (3), (5) og (6) ifølge oppfinnelsen til å transfektere DNA i celler in vitro sammenlignet med ikke formulert DNA.

Transfeksjonen gjennomføres ifølge protokollen ifølge det foregående eksempel 9 i HeLa celler. Resultatene er vist i figurene 5, 6 og 7. Man observerer således at 3 forbindelser oppviser et godt transfeksjonsnivå in vitro.

Eksempel 11: transfeksjon in vivo av forbindelse ( li

Dette eksempel viser evnen hos forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen til å transfektere DNA i celler in vivo sammenlignet med ikke formulert DNA og med lipid A med formelen NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)i7CH3]2som beskrevet i søknad WO 97/18185 og der strukturen er vist i figur 1.

Overføringen av genet in vivo gjennomføres på Balb/C mus ved intramuskulær og int-ravenøs administrering. Formuleringene som sammenlignes er formuleringer av naken DNA, formuleringer inneholdene lipid A samt formuleringer inneholdene forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen.

Når det gjelder de intramuskulære injeksjoner mottar hver mus 30 ul formulering inneholdene 15 ug DNA i den fremre tibia-muskel. Vevene hentes ut 7 dager efter injeksjon, fryses og lagres ved -80°C under påvente av å gjennomføre luciferase-aktivitets tester. Målingene på luciferase-aktiviteten skjer som i eksempel 8.

Når det gjelder de intravenøse injeksjoner mottar hver mus 200 (il formulering inneholdene 50 ug DNA. Vevene hentes ut i dette tilfellet 24 timer efter injeksjon, fryses og lagres på samme måte som ovenfor.

Resultatene av overføringen av gen in vivo er vist i figur 8 og figur 9. Forholdet mellom forbindelse (1) og DNA er 10 nmol/ug DNA. Forholdet mellom lipid A og DNA er 4 nmol/ug DNA. Figur 8 viser aktiviteten in vivo i muskelen for forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen sammenlignet med naken DNA og lipid A. Man fastslår at nivåene for luciferaseaktiviteten er ekvivalente mellom naken DNA og forbindelse (1) der den sistnevnte i tillegg oppviser en meget forbedret aktivitet i forhold til lipid A. Mekanismene for overføring som er implikert synes forskjellig mellom naken DNA og anvendelsen av forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen. Kompleksene ifølge oppfinnelsen som benyttes inneholder ikke fri DNA (fase C) og i tillegg er deres resultater in vitro overlegne de til naken DNA. Figur 9 sammenligner aktivitetene for forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen med naken DNA og lipid A ad intravenøs og ad intramuskulær vei.

Man fastslår at effektiviteten for transfeksjon er omtrent ekvivalent for lipid A og for forbindelse (1) intravenøst. Derimot er effektiviteten ved transfeksjonen for forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen vesentlig over den til lipid A når det gjelder den intramuskulære administrering.

I forhold til naken DNA oppviser forbindelse (1) en transfeksjon intravenøst i tillegg til en transfeksjon som minst er ekvivalent intramuskulært.

Det synes således som om overførings effektiviteten for nukleinsyren in vivo med forbindelse (1) ifølge oppfinnelsen totalt sett er større enn den med lipid A som er et kjent kationisk lipid og den til ikke formulert DNA.

Til slutt synes det som om kompleksene ifølge oppfinnelsen har fordelen av, i forhold til transfeksjon av naken DNA, å beskytte DNA mot nedbrytning på grunn av nukleaser og derved bidra til en signifikant forbedring av stabiliteten for formuleringene.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan likeledes benyttes for å beskytte DNA mot forringelser under lyofilisering og derved også å forbedre stabiliteten for formuleringene.

Eksempel 12: transfeksjon in vivo av forbindelsene ( 5) oe ( 6)

Dette eksempel viser evnen til forbindelsene (5) og (6) til å kunne transfektere nukleinsyre in vivo på effektiv måte.

Det ble benyttet den samme protokoll som i det foregående eksempel. Figur 10 viser at forbindelse 5 og forbindelse 6, formulert med et ladnings forhold på 0,25:1 med DNA uten ko-lipid, oppviser et transfeksjons nivå in vivo som er lik eller større enn naken DNA 48 timer efter injeksjon intramuskulært.

Tabellen gir de resultater som ble oppnådd med forbindelsene (5) og (6) i forskjellige formuleringer:

Claims

1. Forbindelse i D-, L- eller DL-form samt salter derav,karakterisert vedat ved den generelle formel (I):

der:

1. CA betyr en cykloamidingruppe samt mesomere former derav med den generelle formel (II):

der: • m og n uavhengig av hverandre er hele tall fra og med 0 til og med 3 slik at m+n er lik større enn 1, • Ri betyr en gruppe med den generelle formel (III):

der p og q uavhengig av hverandre er hele tall fra og med 0 til og med 10, Y betyr en karbonyl-, amino-, metylamino eller også metylengruppe idet Y kan ha forskjellige betydninger i forskjellige grupper [(CH2)P-Y], og (<*>) enten betyr et hydrogenatom som gir binding til gruppen Rep, forutsatt at Ri kan være bundet til et hvilket som helst atom i den generelle formel (II), derunder Z, og at det kun er en gruppe Ri i formel (II), • X betyr en gruppe NR2eller også CHR2der R2enten er et hydrogenatom eller en binding til gruppen Ri som definert ovenfor»• Gruppen

<*>1. tilfelle: en gruppe med den generelle formel (IV):

der W betyr CHR'" eller også NR'" og R" og R'" uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom, en metylgruppe eller en binding til gruppen R]som definert ovenfor, eller også <*>2. tilfelle: en gruppe med den generelle formel (V):

2. Rep er fraværende eller et "avstandsstyrke" med den generelle formel (VI):

der nitrogenatomet er bundet til atomene X, V, W eller Z eller til substituenten Y i gruppen R]alt ettersom, og • t er et helt tall fra og med 0 til og med 8, • r er et helt tall fra og med 0 til og med 10 idet r kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper -NR4-(CH>, • R3som kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper -NR4-(CH)rR3betyr et hydrogenatom, en metylgruppe eller en gruppe med den generelle formel (VII):

der u er et helt tall fra og med 1 til og med 10, s er et helt tall fra og med 2 til og med 8 og kan ha forskjellige betydninger i de forskjellige grupper -(CH2)s-NRs, og R5er et hydrogenatom, en gruppe CA som definert ovenfor forutsatt at gruppene CA er uavhengige av hverandre og kan være forskjellige, eller også en gruppe med den generelle formel (VII) forutsatt at gruppene med den generelle formel (VIT) er uavhengige av hverandre og kan ha forskjellige betydninger, R4er som definert på samme måte som R3eller også betyr en gruppe CA som defi nert ovenfor forutsatt at gruppene CA er uavhengige av hverandre og kan være forskjellige, og

3. R er bundet til karbonylfunksjonen av gruppen Rep med den generelle formel (VI) eller, hvis Rep er fraværende, er R bundet direkte til gruppen CA og betyr:<*>enten en gruppe med den generelle formel NR6R7der Rg og R7uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en eventuelt mettet, rett eller forgrenet og eventuelt fluorert, alifatisk C1-22rest, med minst en av de to substituenter R$eller R7forskjellig fra hydrogen og den andre inneholdene mellom 10 og 22 karbonatomer,<*>eller et steroidderivat valgt blant kolesterol, kolestanol, 3-ct-5-cyklo-5-a-kolestan-6-B-ol, kol syre, kolesterylformiat, kolestanylformiat, 3a, 5-cyklo-5a-kolestan-66-yl formiat, kolesterylamin, 6-(l,5-dimetylheksyl)-3a, Sa-dimetyl-heksadekahydrocyklopenta-[a]cyklopropa-[2,3]cyklopenta-[l,2-f]nafta-len-10-ylamin, eller kolestanylamin.<*>eller en gruppe med den generelle formel (VIII):

der x er et helt tall fra og med 1 til og med 8, y er et helt tall fra og med 1 til og med 10 og Q enten betyr en gruppe C(0)NReR7der R^og R7er som angitt ovenfor, eller Q betyr en gruppe C(0)Rg der Rg betyr en gruppe med den generelle formel (DC):

der z er et helt tall fra og med 2 til og med 8 og Rg er en eventuelt mettet, eventuelt fluorert, alifatiske Cg.22rest og de to substituenter Re uavhengig av hverandre er som definert ovenfor, eller også Rg betyr en gruppe -O-R9der R9er som angitt ovenfor.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppen Ri er forbundet enten til Z eller til V på den ene side og til gruppen Rep på den andre side via Y.

3. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat cykloamidinhode CA med formel (II) omfatter 5, 6,7 eller 8 kjedeledd.

4. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat R3representerer et hydrogenatom eller en metylrest og R4er som angitt i krav 1, eller R3og R4i formel (VI) betyr hydrogenatomer, eller også R4er et hydrogenatom og R3er en gruppe med formel (VII) der R5er en gruppe CA.

5. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat, i formel (V), p og q uavhengig av hverandre er valgt blant 2, 3 eller 4.

6. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppene Re og R7er like eller forskjellige og hver betyr eventuelt mettede, rette eller for-grenede, eventuelt fluorerte, alifatiske Cto-22kjeder.

7. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat gruppene Re og R7er like eller forskjellige og hver betyr eventuelt mettede, rette eller for-grenede, eventuelt fluorerte, alifatiske kjeder med 12, 14,16,17, 18 eller 19 karbonatomer.

8. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert vedformle-ne:

9. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge kravene 1 til 8,karakterisert vedat man gjennomfører syntesen av byggeklossene som bærer cykloamidin funksjonen(e) og derefter poder byggeklossene på lipidene utstyrt med fordelerne eller avstandsstykkene.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge kravene 1 til 7,karakterisert vedat man gjennomfører syntesen av analoge lipopolyaminer og derefter gjennomfører ringslutning av cykloamidingruppene.

11. Preparat,karakterisert vedat det omfatter minst en forbindelse med den generelle formel (I).

12. Preparat ifølge krav 11,karakterisert vedat den omfatter en forbindelse med den generelle formel (I) og en nukleinsyre.

13. Preparat ifølge krav 11 eller 12,karakterisert vedat den i tillegg omfatter en eller flere adjuvanter.

14. Preparat ifølge krav 13,karakterisert vedatadjuvan-ten(e) er en eller flere nøytrale lipider med to fettkjeder.

15. Preparat ifølge krav 14,karakterisert vedat de nøyt-rale lipider er naturlige eller syntetiske, zwitterioniske lipider eller slike som er berøvet for den ioniske ladning under fysiologiske betingelser, for eksempel valgt blant dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl- eller -mirystoyl fosfatidyletanolaminer samt deres 1 til 3 ganger N-metylerte derivater, fosfatidylglyceroler, diacylglyceroler, glykosyldiacylglyceroler, cerebrosider (som særlig galakto-cerebrosider), sfingolipider (som særlig sfingomyeli-ner) eller også asialogangliosider (som særlig asialoGMl og -GM2).

16. Preparat ifølge krav 15,karakterisert vedatadjuvan-ten er en forbindelse som intervenerer eventuelt direkte i kondensasjonen av nukleinsyren.

17. Preparat ifølge krav 16,karakterisert vedatadjuvan-ten helt eller delvis stammer fra et protamin, et histon eller et nukleolin og/eller et derivat derav, eller også helt eller delvis består av peptid deler (KTPKKAKKP) og/eller (ATPAKKAA) idet antallet deler kan varierer mellom 2 og 10, og kan repeteres eventuelt kontinuerlig.

18. Preparat ifølge kravene 11 til 17,karakterisert vedat den i tillegg inneholder et eller flere ikke-ioniske overflateaktive midler i mengde tilstrekkelig til å stabilisere størrelsen for partiklene av de nukleolipidiske komplekser.

19. Preparater ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 18,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.

20. Preparater ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 18,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer ak-septerbar for en anvendelse på hud og/eller slimhinner.

21. Preparat ifølge krav 12,karakterisert vedat nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre.

22. Preparat ifølge krav 21,karakterisert vedat nukleinsyren omfatter en ekspresjonskassett bestående av et eller flere gener av terapeutisk interesse under kontroll av en eller flere promotere og en transkripsjonen terminator som er aktiv i mål cellene.

23. Anvendelse av en forbindelse ifølge et av kravene 1 til 8 for fremstilling av et medikament ment for å lindre sykdommer.

24. Anvendelse av en forbindelse ifølge et av kravene 1 til 8 for fremstilling av et medikament ment for å lindre sykdommer ved overføring av nukleinsyrer i celler intramuskulært.

25. Fremgangsmåte for overføring av nukleinsyrer i celler,karakterisert vedat den omfatter trinnene:

(3) å opprette in vitro kontakt mellom nukleinsyren og en forbindelse med den generelle formel (I) som angitt ovenfor for å danne et nukleolipidisk kompleks, og

(4) tilveiebringe in vitro kontakt mellom cellene og det nukleolipidiske kompleks dannet under (1).

26. Fremgangsmåte for overføring av nukleinsyrer i celler ifølge krav 25,karakterisert vedat nukleinsyren og/eller forbindelsen på forhånd blandes med en eller flere adjuvanter.