JP3763577B2 - 核酸の輸送 - Google Patents
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Description
特定の化合物を細胞内に輸送することが望まれる状況は多い。このような適用の一つが、DNAを用いた真核細胞のトランスフェクションである。これは、現在、“トランスフェクタム(Transfectam)”(Promega)、“DOTAP”(Boehringer Mannheim)、“リポフェクチン(Lipofectin)”もしくは“リポフェクタミン(Lipofectamine)”(BRL)等の種々の商業的試薬を用いて、あるいはリン酸カルシウムを介したトランスフェクションを用いて行われている。
細胞に核酸をベースとする化合物を輸送する力を、薬物輸送および遺伝子治療にも適用できる。細胞内への化合物の輸送は、以下の式の化合物と関連して変わるであろう。このような変化は、作用時間(例えば、ゆっくりとした放出、すなわち持続作用)、必要な試薬の量、もしくは輸送形式に対する変化として現れるかもしれない。以下に記載されたパラメーターの範囲内で種々の化合物を用いて細胞内に輸送することは、試薬の細胞または組織特異的ターゲッティングを可能にするかもしれない。
本願発明者等は、以下の一般式の、脂肪酸アシル誘導体で修飾された化合物と分子とを結合させることにより、容易に細胞内にそれらの化合物を輸送することができることを見出した。
従って、本発明の第一の態様は、以下の式:
[式中、
wは核酸であり、
xはペプチドもしくはアミノ酸であり、
yは1〜20の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
R4はHもしくはCH2O-R3であり、かつ
R1、R2およびR3は同一であっても異なってもよく、R1、R2およびR3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の3〜24炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である]
の化合物に細胞を曝すことを含む、細胞内に核酸を導入する方法からなる。
本願発明の第二の態様は、以下の式:
[式中、
wは核酸であり、
xはペプチドもしくはアミノ酸であり、
yは1〜20の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
R5は飽和もしくは不飽和の3〜24炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である]
の化合物に細胞を曝すことを含む、細胞内に核酸を導入する方法からなる。
本願発明の第三の態様は、以下の式:
[式中、
wは核酸であり、
xはペプチドもしくはアミノ酸であり、
yは1〜20の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
R4はHもしくはCH2O-R3であり、かつ
R1、R2およびR3は同一であっても異なってもよく、R1、R2およびR3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の3〜24炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である]
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物からなる。
本願発明の第四の態様は、以下の式:
[式中、
wは核酸であり、
xはペプチドもしくはアミノ酸であり、
yは1〜20の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
R5は飽和もしくは不飽和の3〜24炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である]
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物からなる。
本願発明の各態様における好ましい形態は、yが存在するものである。
本願発明の好ましい実施態様では、核酸が、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである。核酸は、フルオレセイン(FITC)、コレステロール、ビオチンもしくは放射線ラベル等の化学的付加物を具備することができる。
本願発明の方法は、動物もしくは植物に由来する樹立細胞系、動物もしくは植物に由来する一次細胞系(primary cell lines)、あるいは全身的、局所的もしくはエアゾールのいずれによって投与されるかに関わらず、完全な動物および植物に対して、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせを含む核酸を輸送するのに使用することができる。これについては、欧州特許公開第424688号公報を参照することができ、その開示するところを参照としてここに取り込む。核酸は、フルオレセイン(FITC)、コレステロール、ビオチンもしくは放射線ラベル等の化学的付加物を具備してもよい。
本発明の方法は、一般的に、必須的に水性混合物中で、関心の向けられた細胞の表面に化合物を適用することを含むと考えられる。しかしながら、完全な生物体の場合には、必須に非水性形態で、局部的もしくは全身的注入、局所的もしくは吸入によって化合物を適用する必要が生じるかもしれない。
本発明の記載は、細胞および生物体中における視覚化および追跡のためにペプチドにフルオレセイン(FITC)またはビオチン等のラベル化合物を付加することを含む。ラベル化合物は、上述したあらゆる経路もしくは方法によって細胞に投与される。
ペプチドは、あらゆる長さとすることができ、核局在化シグナルおよび/または核酸結合ドメイン等の機能的ドメインを含むことができる。このような機能的ドメインは、縦列、もしくはリシンを用いて構成されるような分岐構造で含まれてもよい。典型的に、ペプチドは、例えば一つ以上のリシン残基のペプチドと結合することによって、核酸を引きつけ保持する全体的な陽性チャージを有する。しかしながら、in vivoにおける全身的輸送等の異なる形態の輸送に有利であれば、このペプチドは、全体的に中性のチャージを有するように構成されてもよい。
リンカーは、当該技術分野でよく知られた多くの分子とすることができる。しかしながら、現在のところ、リンカーは、アラニン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、リシンもしくはこれらの同一または混合ポリマー等のアミノ酸またはペプチドであることが好ましい。リンカーは、非定型アミノ酸を含んでもよく、このようにすれば標準的なアミノ酸以上にリンカーの長さを伸長させることができる。これについては、リンカーが、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸であることが特に好ましい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、R1、R2およびR3が同一であって、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群を含む脂肪酸、特にラウラートまたはミリスタートのアシル誘導体であることが好ましい。
本願の出願人によるオーストラリア特許出願第649242号には、トロメタミン(tromethamine)もしくはエタノールアミン誘導体を介して脂肪酸の1〜3アシル誘導体にアミノ酸もしくはペプチドを結合させる方法が開示されている。この方法を用いることにより、脂肪酸残基の1〜3アシル誘導体を備えたペプチド/脂肪酸のアシル誘導体を広範囲に形成することができる。この出願に開示された方法を用いて、重要な化合物であるトリリシン・アラニン・トリス・トリパルミタート(K3ATP3)を形成することができる。この出願の開示を、参照としてここに取り込む。
核酸(化合物の“w”)は、リシン、アルギニン、オルニチン等の陽性にチャージしたアミノ酸を用いて、化合物の“x”の位置で、化合物のリマインダー(reminder)と結合することができる。特に好ましい基は、モノリシン基、ジリシン基、トリリシン基、テトラリシン基もしくはペンタリシン基である。あるいは、核酸は、ペプチドもしくはアミノ酸“x”に共有結合してもよい。さらに、リンカー基アラニンを、例えばロイシン、グリシン、フェニルアラニンもしくはα-BOC(ε-フリー)リシン基で置換してもよく、脂肪酸のアシル誘導体の総数は1〜3の範囲で変えることができる。一つの脂肪酸のアシル誘導体を用いることが望まれる場合には、トリスをエタノールアミンで置換できることに注意するべきである。
また、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、DOPC(DOPコリン)もしくはコレステロール等の脂質を用いた標準的な方法でリポソーム中に製剤することにより、細胞内への化合物の輸送を容易にして本発明の能力を増すと信じられる。これは、特に二つの脂肪アシル誘導体がある場合に考えられる。リポソームの形成方法は、例えばFelgner, P.Lら, 1987 PNAS 84 pp7413-7417およびYago, Kら1993 Biochem and Biophys. Res. Comm. 196(3) pp1042-1048に記載されている。化合物の溶液に単にDOPEを添加するだけでも、化合物の活性を顕著に増強することもわかっている(以下の実験例4、ベラフェクチンG2 +/− DOPE)。同様に、塩類等の添加物を用いたトランスフェクション条件の別の変更によって、トランスフェクションを増強することができる。イオン強度の変化およびアルカリ土類カチオンの存在が、トランスフェクション効率を変えるものとして記載されている(LoefflerとBehr, Methods in Enzymology 1993, H, 599-654)。
本発明の主な適用は、遺伝子治療輸送試薬である。低毒性(特に商業的に利用できる試薬と比較した場合)と合わせて、これまで観察された細胞内への遺伝子の比較的効率的な輸送は、本発明を治療用化合物の理想とする。遺伝子治療に係るさらなる情報は、Nabelら, 1993 PNAS 90 pp11307-11311に見出され、その開示するところを参照としてここに取り込む。
本発明の特徴をより明瞭に理解するために、好ましい形態を、以下の実施例および図面を参照して記述する。
図1aは、ベラフェクチンとDMSOの毒性を示し、1bはDMSOと比較したベラフェクチンにおける生存率%を示す。
細胞毒性は、標準的なMTT(3-[4,5−ジメチルチアゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド;チアゾリルブルー)アッセイを用いてアッセイされた。ベラフェクチンはK3ATP3であり、その濃度はμMで示され、DMSOはベラフェクチンの希釈の濃度と同じ濃度で用いられた。
a.細胞死がODを減少させる。
b.希釈されたDMSOのみの存在下における細胞の生存を100%とし、ベラフェクチンの存在下における生存をそれに応じて調節した。
図2aは、ベラフェクチンおよびエタノールの細胞毒性を示し、2bはエタノールと比較したベラフェクチンにおける生存率を示す。
細胞毒性は、標準的なMTT(3-[4,5−ジメチルチアゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド;チアゾリルブルー)アッセイを用いてアッセイされた。
ベラフェクチン(K3ATP3)を、100%の温かいエタノールに10mg/mlとなるように溶解し、μMで示される濃度まで水で希釈した。
a.平行してエタノールを希釈し、ベラフェクチンの希釈と同じ濃度で細胞毒性を試験した。
b.希釈されたエタノールのみの存在下における細胞の生存を100%とし、ベラフェクチンの存在下における生存率をそれに応じて調節した。
図3は、ベラフェクチンに仲介されたpSVLCATのトランスフェクションから48時間後のCAT発現を示す。
μMで示された一定量のベラフェクチンは、トランスフェクション用の細胞上に添加する前に1μgのpSVLCATと混合した。示された結果は、トランスフェクションから48時間後における50μlの細胞培養培地から測定されたCAT発現レベルである。
図4は、テスト試薬によって仲介されたCHO細胞のトランスフェクションから48時間後にアッセイされたCAT発現を示す。
示された結果は、この実験における最も高いレベルのトランスフェクションを与えるトランスフェクション試薬の濃度のものである。これは、どの場合にも5μlであった。CATアッセイは、Neuman J.R., Morency, C.A.およびRussian, K.O. (1987) Biotechniques 5, p444-447によってなされた。
無し;トランスフェクション試薬を含まない、TF;トランスフェクタム(Promega)、
Lfe;リポフェクタミン(BRL)、VF A3:K3ATP3、VF G2;K3GTP2。
図5は、テスト試薬によって仲介されたCos1細胞のトランスフェクションから48時間後にアッセイされたCAT発現を示す。
示された結果は、トランスフェクションの最も高いレベルを与えるトランスフェクション試薬の濃度のものである。無し;試薬を含まない、VF A3:K3ATP3、VF G2;K3GTP2、VF G2+DOPE;K3GTP2+DOPE。
図6はトランスフェクション試薬の相対的な細胞毒性を示す。
用語の説明
a.(CHO細胞)
CATアッセイにおける細胞収穫時に種々の試薬でトランスフェクションした後の細胞の生存能力。
無し;トランスフェクション試薬を含まない、TF;トランスフェクタム、Lfe;リポフェクタミン、VF G2:ベラフェクチンG2。全て5μl。高いODは高い細胞生存率を示す。
b.(Cos1細胞)
図aと同様の細胞生存能力。VF A3;ベラフェクチンA3 9μl、Lfe 5μl。この実験例におけるアッセイは、35mmの皿で行われた。
図7a〜7bは、“x”ペプチド実験例“a”の結果を示す。
図8は、“x”ペプチド実験例“b”の結果を示す。
図9は、“x”ペプチド実験例“c”の結果を示す。
(用語の説明 − 図7、8および9;無し;プラスミドDNAと共に用いられる試薬を含まない、rb/ブランク;試薬空欄、化合物の記載の後の数字は、2mMのストックのμl数を示す(水で希釈)。7b:DNAすなわちトランスフェクション試薬を用いずに“モック・トランスフェクションされた(mock transfected)”皿から100%の細胞生存率が得られた。細胞の非存在下では0%の生存率がアッセイされた。生存能力は、アラマーブルー(alamar blue)染料を用いて評価された。)
図10aおよび10bは、“y”リンカー実験例“a”の結果を示す。
図11は、“y”リンカー実験例“b”の結果を示す。
図12は、“y”リンカー実験例“c”の結果を示す。
(用語の説明 − 図10a、10b、11、12:試薬;2mMストックからのテスト化合物、そうでない場合には記載する。(.4);0.4mMでの試薬ストック。0:試薬を含まない。標準的なトランスフェクション条件下でDNAのみ。培地ブランク:CATアッセイで培地のみ。相対生存力(アラマーブルー):37℃でのインキュベーション中に添加されたアラマーブルーを用いて、培地のOD570-595を測定。)
図13aおよび13bは、R1−R4誘導体実験例“a”から得られた結果を示す。
(用語の説明:図10a、10b、11、12の用語の説明と同じ)
図14aおよび14bは、R1−R4誘導体実験例“b”から得られた結果を示す。
(用語の説明:図10a、10b、11、12の用語の説明と同じ)
図15aおよび15bは、R1−R4実験例“c”から得られた結果を示す。
(用語の説明:図10a、10b、11、12の用語の説明と同じ。標準偏差が示されている)
図16aおよび16bは、R1−R4誘導体実験例“d”から得られた結果を示す。
図17aおよび17bは、R1−R4誘導体実験例“e”から得られた結果を示す。
図18aおよび18bは、R1−R4誘導体実験例“g”から得られた結果を示す。
Cos1細胞は、60mm皿で標準的なアッセイに従ってトランスフェクトされた。50μl、48時間培養した上清を、CATアッセイのために5時間37℃でインキュベートした。
図19aおよび19bは、R1−R4、C10−C16実験例“b”の結果を示す。Hela細胞。
(用語の説明 − 図19aおよび19b;Lfe;リポフェクタミン、最適なトランスフェクションが起こる[脂質]/[DNA]の比率(1.39)、無し;試薬を含まないがトランスフェクションに係るDNAは含む。細胞毒性は、アラマーブルーで調べられた。)
図20aおよび20bは、“y”リンカー非標準アミノ酸実験例“1”の結果を示す。
(用語の説明;LFE;リポフェクタミン。遺伝子発現のレベルは、β-ガラクトシダーゼのユニットとして“a”に示されている。相対生存能力は、染料“アラマーブルー”を用いて“b”でアッセイされ、染料の存在下でインキュベーションした後に測定された光学密度として示されている。高いODは、高い細胞生存率を示す。)
図21aおよび21bは、“y”リンカー非標準アミノ酸“実験例2”の結果を示す。
(用語の説明;lfe;リポフェクタミン、vf;ベラフェクチンA3、C3;K3C3TL3、C5;K3C5TL3、C7;K3C7TL3、トランスフェクタントの%は、染色されていない細胞数と比較して、多くのフィールドにおいて、青く染色された細胞数から計算した。a;CHO細胞、b;Cos1細胞)
図22aおよび22bは、PC3およびジャーカット(Jurkat)細胞系において“y”リンカー非標準アミノ酸の結果を示す。
図23aは、“製剤”実験例“A”の結果を示す。
種々のリポソーム製剤、成分およびリポフェクタミン(Lfe)を用いてトランスフェクションされたCHO細胞から発現されたCAT。代表的な実験結果が示されている。
図23bは、“製剤”実験例“b”の結果を示す。
リポソーム製剤、成分試薬および商業的調製物を用いてトランスフェクションされた細胞のパーセント。VF A2;K3ATP2。リポソームは、VF A2とDOPEを用いて、所望の比率のVF A2:DOPEに製剤された。示された結果は、一回の実験のものである。
図24は、“未製剤の混合物”実験例“2”の結果を示す。
(用語の説明;トランスフェクション効率は、48時間後に発現されたβ-galユニットのレベルとして評価された。L3:K3ATL3、M3;K3ATM3。ピークは、最も高い読み取り値を与えるリポペプチドとDNAの組み合わせを示す。[脂質]は、用いられた全体のリポペプチドの濃度を示す。)
実施例
化学的用語
使用される略号:
α-BOC(ε-Z-Lys)= α-ブチルオキシカルボニル-ε-カルボベンゾキシ-リシン
AEP= アラニン-エタノールアミン-パルミタート
ATP1= アラニン-トリス-モノパルミタート
ATP2= アラニン-トリス-ジパルミタート
ATP3= アラニン-トリス-トリパルミタート
CDCl3= クロロホルム-d
DCCD= ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM= ジクロロメタン
DIEA= ジイソプロピルエチルアミン
DMAP= ジメチルアミノピリジン
DMF= ジメチルホルムアミド
DMSO-D6= ジメチルスルホキシド-d6
DSC= ジスクシンイミジルカルボナート
FATP1= フルオレセイン=アラニン-トリス-モノパルミタート
FATP2= フルオレセイン=アラニン-トリス-ジパルミタート
FATP3= フルオレセイン=アラニン-トリス-トリパルミタート
FITC= フルオレセインイソチオシアナート(異性体I)
HOSU= ヒドロキシスクシンイミド
TEA= トリエチルアミン
TFA= トリフルオロ酢酸
THF= テトラヒドロフラン
Tris= 2-アミノ-2-ヒドロキシ-メチル-1,3-プロパンジオール
Z= N-カルボベンゾキシ
材料および方法
α-BOC(ε-Z-Lys)は、Peptide Institute, Inc.(大阪、日本)、DSCは、Tokyo Kasei Kogyo Co.(東京、日本)から購入した。全てのアミノ酸はL型であり、言及しない限りSigma Chemical Company(St. Louis, MO)から購入した。全ての溶剤は、分析用試薬であり、購入したままの状態で用いられた。
薄層クロマトグラフィー(TLC)
以下の溶媒系、すなわちRf1 クロロホルム/メタノール/酢酸:95/5/3;Rf2 クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン:95/7/3で、Alufolein Silica gel 60 F254プレート(Merck)上で行った。
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)
自動勾配調節器とモデル746データモジュールとを備えた6000Aシリーズの溶媒輸送システムを具備するMillipore Waters HPLC装置(Waters Chromatography Division of Millipore, Milford, MA)で分析HPLCを行った。クロマトグラフィーは、NOVAPAKTMC18逆相カラム(100x8mm)を用いて行われた。ペプチドおよびペプチド-トリス複合体は、2ml/分の流速で5分以内で0.1%TFAの24〜80%アセトニトリルから線形勾配溶出で分析した(系A)。Waters Lambda Max 480を用いて260nmで検出を行った;(Rt A)。リポペプチド複合体を、2ml/分の流速で5分以内で、0.1%TFAの50%水、50%アセトニトリルから、0.1%TFAの50%アセトニトリル、50%THFまでの線形勾配を用いて、C18カラム上で分析した(系B);(Rt B)。蛍光ラベル化合物の分離は、PrepPakR C4セミプレパラティブ逆相カラム(Semipreparative Reverse Phase column)(25x10)上で、流速6ml/分で行った。
分離HPLC
分離は、PrePak C4逆相カラム(100x40mm)を用いてMillipore Waters DeltaPrep 4000 HPLC上で、20ml/分の流速で、上述した分析HPLCと同じ溶出バッファー系の線形勾配を用いて溶出して行われた。
核磁気共鳴(NMR)
NMRスペクトルを200MHzのBruckerスペクトロメーターを用いて記録した。
化学合成
ATP1、ATP2およびATP3の調製
これらの化合物は、エタノール中の炭素(10%)にパラジウムの存在下で、パーヒドロゲネーター(Parr hydrogenator)で40psi.圧でZ-Ala-Tris-モノ、ジ、およびトリパルミタートを水素化することによって得られた。ベンジルオキシカルボニル基の除去は、HPLC(系B)で観察した。ろ過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させた後、ATP1、ATP2、およびATP3を量的収率で得た。ZATP1、ZATP2、ZATP3および対応するグリシル化合物の合成および精製は、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J., 1993 Peptide Research 6, 125-128、並びにWhittaker R.W.特許第649242号、脂肪と結合したアミノ酸、ペプチドもしくはこれらの誘導体(Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats)に記載されている。
FATP1、FATP2およびFATP3の調製
DCM(500μl)中のATP1(10mg、25μモル)の溶液に、DMF(500μl)中のFITC(10mg25μモル)の溶液を攪拌しながら添加した。反応の見かけのpHを、TEAを添加することによって9.0に維持し、反応をHPLC(系B)で観察した。フルオレセイン-Ala-Tris-パルミタートの形成は10分で完了し、クロマトグラフィーで精製された状態、R1:7.08でFATP1産物を与えるように、生成物を分離HPLCで精製した。溶媒を減圧下で除去し、FATP1生成物をtert-ブタノールから凍結乾燥した。
FATP2およびFATP3は、それぞれ、クロマトグラフィーで精製された生成物 R1:8.61および9.92を与えるように、FITC(10mg、26μモル)を含むDCM(500μl)中でATP2(16.3mg、25μモル)とATP3(22mg、25μモル)を反応させることによって同一の方法で合成した。
フルオレセインラベルされたアラニン−エタノールアミン-パルミタートの調製
アラニン−エタノールアミン-パルミタート(AEP)を、エタノール中の炭(charcoal)(10%)にパラジウムの存在下でパーヒドロゲネーター(Parr hydrogenator)でZ-Ala-エタノールアミン-パルミタートの水素化によって調製した。ベンジルオキシカルボニル基の除去はHPLC(系B)で観察した。ろ過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させた後、化合物を得た。
(Lys)n化合物の調製
Z-Ala-エタノールアミンと対応するパルミタートの合成および精製は、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J.,(1993), Peptide Research 6, 125-128.,およびWhittaker R.G.特許第649242号、脂肪と結合したアミノ酸、ペプチドもしくはこれらの誘導体(Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats)に記載されている。
DMF(500μl)中のAEP(20mg、54μモル)の溶液に、FITC(22mg、56μモル)を攪拌しながら添加し、見かけのpHをTEAを添加することによって9.0に維持した。反応は20分未満で完了し、生成物を分離HPLCで精製して、クロマトグラフィーでRt:7.01の純度の上記化合物を得た。
オリゴ−Lys化合物[(BOC(ε-Z-Lys)n]の合成を古典的な溶液法(1)で行った。リポペプチドBOC(ε-Z-Lys)n-X-Tris-パルミタートを、リンカーアミノ酸(X)-Tris化合物を介してオリゴ−Lysとパルミチン酸とをカップリングすることによって合成した。この合成は、活性化されたエステル法(an activated ester method)でBOC(ε-Z-Lys)n−OHをアミノ酸-Tris(2)とカップリングし、さらに対称無水法(the symmetrical anhydride method)(1)でパルミチン酸と前記複合体をカップリングすることによって行われる。中間体および最終的な生成物の純度を、TLC、HPLC、およびNMRで確認した。
1)Bodanszky, M.とBodanszky, A. 1984. Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin.
2)Whittaker, R.G., Hayes, P.J.,とBender, V.J., 1993, Trisをアミノ酸およびペプチドに結合させる穏やかな方法(A Gentle Method for Linking Tris to Amino Acids and Peptides), Peptide Reserch, 6,3(p.125-128).
典型的な合成例を以下に記す。
工程(I) α-BOC(ε-Z-Lys)2OH
α-BOC(ε-Z-Lys)OH(9.9g、30mmol)を100mlのDCMに溶解した。HOSU(5.2g、45mmol)およびDIEA(9.0g、15mmol)をこの溶液に添加し、0℃まで冷却した。50mlのDCMに溶解したDCCD(6.2g、30mmol)を反応混合物中に滴下した。0℃で1時間、次いで室温で夜通し攪拌し、活性化されたエステル(α-BOC(ε-Z-Lys)OSU、HPLCで86%の収率)を得た。DCU(ジシクロヘキシル尿素)沈降物をろ過し、α-アミノ((ε-Z-Lys)OH(7.56g、27mmol)をこの反応混合物に添加し、室温で夜通し攪拌した。化合物Iは、HPLCで調べたところ93%の収率で生成された。溶媒を減圧下で除去し、油性残渣を酢酸エチルに溶解し、酸、塩基、および水で洗浄した。酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残渣をジエチルエーテルで粉砕して、93%の収率で16.6gの化合物Iを得た。Rf1:0.52、RtA:7.33分;1HNMR:δ(DMSO-d6、ppm)、1.39(9H、s、BOC(CH3)3)、1.4−1.8(12H、brs、β、γ、δ CH2)、2.99(4H、brs、εCH2)、3.95(1H、m、αCH)、4.14(1H、m、αCH)、5.03(4H、s、Ar-CH2)、6.89(1H、d、α-ウレタン NH、J=7.5Hz)、7.25(2H、t、ε-ウレタン NH)、7.41(10H、m、Ar(H))、7.95(1H、d、アミド NH、J=8.5Hz)。
工程(II) H(ε-Z-Lys)2OH
化合物I(15.6g、27mmol)を50mlのDCMに溶解し、0℃まで冷却した。TFA(50ml)を反応混合物中に添加し、0℃で10分間、さらに室温で50分間攪拌した。溶媒および過剰なTFAを蒸発させて乾燥させ、油性残渣をジエチルエーテルで粉砕した。15.3gの化合物IIを得た:Rf 2:0.19、Rt A:6.07分。
工程(III) α-BOC(ε-Z-Lys)3OH
α-BOC(ε-Z-Lys)OH(8.96g、27mmol)をHOSUとDCCDによって実施例Iのようにして活性化した。DCUをろ過し、ろ過物を15.1gの化合物IIに添加した。DIEA(6g、46mmol)を反応混合物に添加し、室温で夜通し攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、酸、塩基および水で洗浄した。酢酸エチルを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。この残渣をジエチルエーテルで破砕し、20gの化合物IIIの白色の沈殿物を87%の収率で得た。Rf1:0.36、RtA:7.92分;1HNMR:δ(DMSO-d6、ppm)、1.39(9H、s、BOC(CH3)3)、1.4−1.8(18H、brs、β、γ、δ CH2)、2.99(6H、brs、εCH2)、3.95(1H、m、αCH)、4.14(1H、m、α CH)、4.34(1H、m、α CH)、5.03(6H、s、Ar-CH2)、6.8(1H、d、ε-ウレタン NH、J=7.5Hz)、7.25(3H、t、ε-ウレタン NH)、7.41(15H、m、Ar(H)、7.08(1H、d、アミド NH、J=8Hz)、8.15(1H、d、アミド NH、J=8Hz)。
工程(IV) α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris
α-BOC(ε-Z-Lys)3OH(1g、1.2mmol)を40mlのDMFに溶解し、DSC(0.92g、3.6mmol)を添加した。DIEA(0.2ml、1.2mmol)を添加し、室温で1時間攪拌した後、HPLCで調べたところ78%の収率のトリ-Lysの活性化エステルを生成した。Ala-Tris(0.46g、2.4mmol)を反応混合物に添加し、0.6mlのDIEAを添加してpHを8に調節した。表題の化合物の形成をHPLCで調べた。2時間後、活性化されたエステルはほぼ完全に利用され、Ala−Trisにカップリングして化合物IVを形成するか、トリ-Lys化合物に加水分解された。化合物IVの全体的な収率はHPLCで52%であった。分離HPLCで270mgの純粋な化合物を収穫した。RtA:7.4分;1HNMR:δ(DMSO-d6、ppm)、1.39(9H、s、BOC(CH3)3)、1.4−1.9(18H、brs、β、γ、δ CH2)、2.97(6H、brs、εCH2)、3.53(6H、d、Tris(CH2)、J=3Hz、3.75−4.43(4H、brs、α CH)、3.89(3H、t、CH)、5.08(6H、s、Ar-CH2)、6.8(1H、d、α-ウレタン NH、J=7.4Hz)、7.19(3H、t、ε-ウレタン NH)、7.41(15H、m、Ar(H)、7.80(1H、d、アミド NH、J=8Hz)、8.15(1H、d、アミド NH、J=8Hz)、8.35(1H、d、アミド NH、J=8Hz)。
工程(V) α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris(パルミタート)nn=1、2、3
α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris(173mg、0.173mmol)を3mlのDCMと1mlのDMFに溶解した。パルミチン酸(89mg、0.346mmol)と触媒量のDMAPを反応混合物に添加した。0℃まで冷却し、2mlのDCMに溶解したDCCD(71mg、0.346mmol)を反応混合物中に滴下した。0℃で30分間、次いで室温で夜通し攪拌した。モノ、ジ、およびトリパルミタート化合物を備えた表題の化合物の比率は、HPLC(系B)で17%、40%、および43%であった。
溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣をDCMに再懸濁した。DCUをろ過し、ろ過物を炭酸水素ナトリウム(5%)と水で洗浄した。この混合物の分離HPLCにより、高い純度のモノパルミタート化合物(17mg、Rt B:7.63分)、ジパルミタート化合物(76mg、Rt B:8.65分)、およびトリパルミタート化合物(63mg、Rt B:9.29分)が得られた。トリパルミタート化合物の1HNMR:δ(CDCl3、ppm):0.8−0.95(9H、t、CH3)、1.3−1.47(84H、m、BOC(CH3)3、パルミタート(CH2)、Ala(CH3))、1.47−1.9(18H、brs、β、γ、δ CH2)、1.83(6H、t CH2)、2.28(6H、t、CH2)、3.09(6H、brs、ε CH2)、3.97 2H、m、α CH)、4.29(1H、m、α CH)、4.35(6H、s、Tris(CH2))、4.47(1H、t、α CH)、5.04(6H、s、Ar-CH2)、5.56(1H、d、アミド NH、J=7Hz)、5.7(1H、d、アミド NH、J=7.5Hz)、5.78(1H、d、アミド NH、J=7.5Hz)、6.92(1H、d、α-ウレタン NH、J=7.4Hz)、7.19(3H、t、ε-ウレタン NH)、7.35(15H、m、Ar(H))。
工程(VI) (Lys)3-Ala-Tris(パルミタート)3
化合物V(45mg)をDCM(2ml)に溶かし、0℃まで冷却した。Boc基を除去するために、0℃で10分間、室温で30分間でTFA(2ml)を加えた。溶媒および過剰のTFAを、ジエチルエーテルとの共蒸発(co-evaporation)を繰り返すことによって完全に除去した。この化合物の1HNMRは、BOC(CH3)基が消えたことを示した。残渣をDCM/メタノール(50/50、4ml)の溶液に溶かし、Z基を除去するために10%のパラジウム/炭素を用いてパーヒドロゲネーターで2時間40psiで水素化した。Z基の除去は、1HNMR分光法で確認した(5.04および7.35ppmにおける化学的シフトがないことに基づく)。
生物学的用語
使用される略号:
A= アラニン
DDME= 2倍の濃度に調製され、凍結され、37℃で溶かされ、ろ過され、使用前に1倍に希釈される(枯渇した(depleted))ダルベッコ修飾イーグル培地(Loeffler, J-PとBehr, J-P, Method in Enzymology (1993) H, p599-654.
DME= ダルベッコ修飾イーグル培地
DOPE= ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
EM= 電子顕微鏡
F= フェニルアラニン
FCS= ウシ胎児血清
FLAEP= フルオレセイン・アラニン・エタノールアミン・パルミタート
FLATP3= フルオレセイン・アラニン・Tris・トリパルミタート
G= グリシン
K= リシン
K3ATP1−3= トリリシン・アラニン・トリス・モノ−トリパルミタート
L= ロイシン
Lfe= リポフェクタミン(Gibco BRL)
MTS= 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、内部塩(inner salt);(Owen試薬)
MTT= 3-[4,5,ジメチルチアゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド;チアゾールブルー
PBS= リン酸バッファー生理食塩水
TEM= 透過(transmission)電子顕微鏡
VF= ベラフェクチン= K3ATP3
VFA3= K3ATP3
VFG2= K3GTP2
A.細胞の取り込みおよび分布
細胞内に化合物を輸送する能力を評価するために、フルオレセイン・アラニン・エタノールアミン・パルミタート(FLAEP)およびフルオレセイン・アラニン・トリス・トリパルミタート(FLATP3)を用いて予備実験を行った。
FLAEPとFLATP3複合体を、DMSO溶液から水性媒体(PBS)に10μMまで希釈し、煮沸したカバーガラス上で生育された半集密的(subconfluent)なCos1細胞の洗浄された単層上に添加した。24時間まで曝すこの実験に明示された時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ホルムアルデヒドで20分間固定した。Bio Rad MRC 500共焦点顕微鏡でレーザー励起して細胞を観察した。
FLAEPもしくはFLATP3のいずれかで処理してから15分間のみで固定された細胞は、強烈な細胞質染色を示した。等レベルのフルオレセインのみに曝された細胞は、細胞全体から非常に弱い蛍光を示したに過ぎなかった。FLATP3が細胞および核の膜と優先的に結合すること、複合体溶液が単層から洗い流され、2時間後に培地を含む血清で置換されたにも関わらず、細胞に残ったパターンが24時間成長し続けたことは特に注目するべきである。これと同じ染色の持続性は、同じ条件下でFLAEP複合体では観察されなかった。
4%のパラホルムアルデヒドにおける固定は、ホルムアルデヒド定着剤より細胞の形態を保持した。結果的に、細胞中の蛍光のより高分解能の映像が得られた。これは、両方の複合体が、一般的な分布を示すよりもむしろ、細胞質の分離した領域に局在することを示した。ライトミクロスコープレベルでの観察により、局在の領域が、小胞体、ゴルジ装置およびミトコンドリア膜であることが示唆された。
固定された細胞と同じ暴露時間でなされた未固定の生きた細胞を低分解能で観察することにより、異なるパターンの染色が示唆された。FLAEP複合体は、容易に細胞に入るようであるが、特に核に濃縮される。これは、おそらく、この一般的な細胞質および核の分布が、これらを仕切る成分に付着していない分子によることを示唆している。固定において、これらの分子は、細胞の構成要素に結合する複合体のみを残して細胞から洗い流される。しかしながら、FLATP3複合体は、細胞が生きていようと固定されていようと類似したパターンを示した。
明白でない細胞毒性が、10μMの濃度で2時間まで各化合物で処理された細胞に見られた。50μMもしくはそれ以上のFLAEPにCos1細胞を72時間連続して曝した後、標準的なMTT細胞毒性アッセイ(以下参照)でアッセイして顕著な細胞毒性が観察された。72時間の同じ暴露時間後、FLATP3は12.5μMで約80%の細胞毒性を示し(同じ濃度のDMSO希釈物と比較)、6.25μMで70%の細胞毒性を示した。
これらの結果は、脂肪アシル誘導体を備えた模範化合物が細胞内への自身の進入を容易にできることを示唆した。観察された細胞毒性は、化合物が細胞に進入するのに必要な時間では無視できるが、曝す時間が長くなると顕著に増大する。従って、結合によってDNA等の他の化合物を細胞に導入するのに、類似した化合物を用いることができるか否かを調べるために実験を行った。
B.トランスフェクション実験
a)細胞毒性
細胞毒性を、標準的なMTT(3-[4,5,ジメチルチアゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド;チアゾールブルー)アッセイを用いてアッセイした。簡単に、Cos1細胞を96ウェルミクロタイタートレイの2x104細胞/ウェルにまき、100μlの培養液で夜通し付着させた。テスト化合物を、プレートに2倍希釈で100μlの培養液に2x濃度で添加した。細胞を37℃、5%CO2で72時間の通常の培養条件でインキュベートした。20μlのMTT(PBS中に5mg/ml)を2.5時間37℃で添加し、次いで全ての液体を除いた。ref ODを630nmとし、570nmでODを読む前に100μlの酸性プロパノールを添加し、プレートを10分間振った。
ベラフェクチンA3と称される模範化合物K3ATP3(トリ・リシン・アラニン・トリス・トリパルミタート)を、その全体的な陽性チャージでDNAを引きつけるように設計した。これは水性溶液に不溶性であり、温かいエタノールに部分的に溶け、DMSOに可溶性である。細胞毒性は、2.5mg/mlの25%DMSOストックから希釈されたK3ATP3に、72時間連続的にCos1細胞を曝すことによって試験した。12.5−50μM化合物の同じ濃度のDMSO希釈物と比較して70%の細胞が生存していた(図aおよびb)。化合物が同じ濃度のエタノールに希釈された場合、細胞の生存はわずかに優れていた(図2aおよびb)。
b)DNA輸送
実験例1:模範化合物K3ATP3(ベラフェクチンA3)のトランスフェクション特性を調べるために、SV40後期プロモーターの支配下にCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)をコードする遺伝子を備えた完全な未切断のプラスミド、pSVLCAT(Cameron, F.H.とJennings, P.A.(1989) PNAS 86, 9139-9143)を試験試薬と混合し、種々の条件下でCos1細胞に添加した。48時間培養した後、分泌されたCATレベルを培地からアッセイした。
方法:
溶液I:500μlのダルベッコ修飾イーグル培地(DME)中の1μgのプラスミドDNA
溶液II:500μlのDME中の0−20μlのベラフェクチンA3(2.5mg/ml 25%DMSO)、ボルテックス
溶液IとIIを組み合わせ、簡単にボルテックスし、室温で10分間インキュベートする。
混合物を60mm組織培養皿中の洗浄された細胞(前日に0.5x106/皿でまかれた)に37℃、5%CO2で6時間添加する。
残りの48時間は2mlのDME+10%FCSを加える。
組織培養培地におけるCATレベルをアッセイする(Sleigh, M.J. (1986) Anal. Biochem. 156. 251-256)。
結果:
顕著なCATレベルを、5μl(12.5μg)およびそれ以上のベラフェクチンA3(2.5mg/ml=1.8mM)でトランスフェクションされたこれらのサンプルから調べた。ピークCATレベルは10μl(25μg)のベラフェクチンA3で観察された(図3)。
実験例2:
100%のDMSOもしくはエタノールに溶解されたベラフェクチンA3ストック溶液(10mg/ml)を用いたCos1細胞中のトランスフェクションレベルの比較および細胞のベラフェクチンA3/DNA複合体の暴露時間の最適化
方法:
a- DMSOまたはエタノールに溶かされたベラフェクチンA3を比較。
b- 6時間から夜通し、細胞上におけるベラフェクチンA3の比較。
100%溶媒中の10mg/mlのベラフェクチンA3を水で2.5mg/mlに希釈した。
実験例1と同様にしてトランスフェクションを行った。ベラフェクチンA3を、種々の時間で細胞と接触させた。
結果:
i) 顕著なレベルのCATが、10μl(25μg)以上のベラフェクチンA3で処理された全てのサンプルから検出された。
(ii) エタノール性サンプルは、低いトランスフェクション性能を示した。
(iii) ベラフェクチンA3を用いて夜通しインキュベーションしたものは、6時間インキュベーションしたものと比べて約50%CATレベルを低減した。
実験例3:
CHO細胞におけるベラフェクチンA3とG2を用いてなされるトランスフェクションレベルと、商業的に利用できる試薬トランスフェクタム(Promega)とリポフェクタミン(BRL)を用いてなされるトランスフェクションレベルとの比較。
方法:
60mm皿当たり0.5μgのpSVLCAT DNAを用いたこと以外は、ベラフェクチンおよびトランスフェクタム(上記参照)と同じプロトコルを用いた。
リポフェクタミンプロトコルは、製造元の説明に従った。0.5μgのpSVLCAT/60mm皿。
CHO細胞を1x105/60mm皿となるようにまき、10%FCSを含むDME/Hams培地に夜通し付着させた。
トランスフェクタム5もしくは10μl 1mg/400μlストック溶液。
リポフェクタミン5もしくは10μl 2mg/ml(DOPEと3:1の混合試薬)。
ベラフェクチンA3(K3ATP3)とベラフェクチンG2(K3G[グリシン]TP2)、それぞれ5、10および15μlの2mM(それぞれ2.8および2.3mg/ml))ストック溶液。
テスト試薬およびDNAの存在下で、血清を含まずに6時間インキュベーションした後、1mlのDME/Hams+10%FCSを加えた。48時間で収穫するまで、24時間で培地を2mlの新鮮なDME/Hams+10%FCSに変えた。
結果:
CHO細胞をトランスフェクション工程開始から48時間後に溶解させ、CAT活性をアッセイした。トランスフェクションのピークは、どの場合でも5μlのトランスフェクション試薬を用いた場合に観察された。ベラフェクチンA3を用いて得られたCATレベルは、トランスフェクタムを用いて得られた値の約54%、リポフェクタミンを用いて得られた値の18%であった。
ベラフェクチンG2を用いて得られたCATレベルは、トランスフェクタムを用いて得られた値の約64%、リポフェクタミンを用いて得られた値の22%であった。
図4参照。
実験例4:
Cos1細胞におけるベラフェクチンA3(K3ATP3)とベラフェクチンG2(K3GTP2)を用いてなされるトランスフェクションレベルと、商業的に利用できる試薬リポフェクタミン(BRL)を用いてなされるトランスフェクションレベルとの比較。
プロトコルは、上記のベラフェクチンの場合と同じである。リポフェクタミンプロトコルは、製造元の説明に従った。
Cos1細胞を5x105/60mm皿となるようにまき、10%FCSを含むDMEに夜通し付着させた。
溶液A:0.5μgのpSVLCAT/60mm。
溶液B:リポフェクタミン10および15μl 2mg/ml(DOPEと3:1の混合試薬)。
OR;ベラフェクチンA3とベラフェクチンG2 20μl 2mM(それぞれ2.8および2.3mg/ml)ストック溶液。
OR;ベラフェクチンG2を等モルのDOPEと共に試験した。
ベラフェクチンG2とDOPEをDDMEに混合し、使用前に30秒間ボルテックスした。
溶液AとBとを混合してから、洗浄した細胞上に添加した。
テスト試薬およびDNAの存在下で、血清を含まずに6時間インキュベーションした後、1mlのDME+10%FCSを加えた。48時間で収穫するまで、24時間で培地を2mlの新鮮なDME+10%FCSに変えた。
結果:
Cos1細胞からの組織培養液サンプル(上清)について、トランスフェクション工程開始後48時間のCAT活性をアッセイした。ベラフェクチンA3およびベラフェクチンG2は、それぞれ、リポフェクタミンを用いてなされるレベルの約60%および30%のレベルまでCos1細胞をトランスフェクションした。等モルの未製剤のDOPE(DMSO/H2O中に2mM)をベラフェクチンG2サンプルに添加することにより、ベラフェクチンG2のみと比較してほぼ二倍のトランスフェクション効率が示され、リポフェクタミンでなされるレベルの60%、並びにベラフェクチンA3と同じレベルに相当した。得られたCATレベルは、図5に示されている。
C. 相対細胞毒性
種々の試薬によって引き起こされる細胞毒性の相対レベルを、染料“アラマーブルー(Alamar Blue)”(Alamar, Sacramento CA)を用いた実験で比較した。本発明のタイプの化合物は、他の試薬より一般的に顕著に低い細胞毒性を示した。
たとえば図6aおよびb。
細胞毒性の相対レベルも、Cell titre 96 Aqueous(Promega)として市販されているMTS染料を用いた実験でアッセイした。
D. 模範の“トランスフェクション”化合物の変異体の相対効率
Cos1もしくはCHO細胞系を、ある範囲の濃度の各トランスフェクション化合物を用いて、0.5μgのpSVLCATもしくは2μgのpPGKlacZプラスミドでトランスフェクションした。化合物の最適濃度、すなわち、48時間で最高レベルのCATを生じる濃度、もしくは24時間でもっとも高いパーセントのlacZ(β−ガラクトシダーゼ)染色細胞を生じる濃度を、表1のデータに用いた。全ての化合物を一回の実験でテストしていないので、トランスフェクションを示す絶対的な量は用いられていない。むしろ、記号は、全ての実験で対照として含まれるリポフェクタミン(BRL)に対するトランスフェクション効率を示すために用いられる。表1は、少なくとも一つの細胞型のトランスフェクションを仲介する多数の化合物の相対効率を示す。
実験例3に記載された変異体を用いて、上記実験例1のBに記載の通りに実験を行った。示された結果は、最適化されたレベルのトランスフェクション試薬から得られたものである。示された全ての結果は、発明者らによって得られたものである。商業的試薬を伴う会社の文献は含まれていない。
合成され試験された他の種類の化合物は以下に記載されている。
結果
上表に示された結果は、K1−4、AもしくはGリンカーおよびパルミタート1−3を備えた全ての試験化合物が、試験された細胞型においてあるレベルのトランスフェクションをすることを示している。リシンもしくはパルミタートのいずれかを欠く化合物は、トランスフェクションを支持できなかった。このことは、DNAを引きつける分子(K)および推定上の細胞浸透分子(パルミタート)の両方の必要性を示唆している。別のリンカーは、トランスフェクションレベルに影響を与えるが、両方ともトランスフェクションを支持することができた。
模範化合物の変異体はトランスフェクション効率を変える
2頁に記載された一般式の化合物は、記載された基本構造ブロック“x、y、R1−R4”からなる。これらの構成要素は、標準アッセイ系で標準細胞系をトランスフェクションするのに最適な構造ブロックを評価するために組織的に変えられる。結果は、実験例を使用することによって示され、標準的な条件下でどちらかの全体的なレベル(CATもしくはβ-ガラクトシダーゼ発現)によって表されるレポーター遺伝子の発現レベルとして、あるいはトランスフェクションした細胞(β-ガラクトシダーゼ − 青色細胞)の%として示される。細胞毒性の代表的なレベルも記載される。
“x”ペプチド
上述の模範化合物“ベラフェクチンA3”は、分子に4+のチャージを付与する3つのリシン残基を備えている。0+〜6+を有するK0〜K5を具備する変異体を試験した。
目的:効率的なトランスフェクションのための最適な数のK残基を調べる。
方法:各実験では、以下の間で比較を行った。
a. K0ATP3、K3ATP3、K5ATP3およびK2ATP2、K5ATP2(CHO細胞)
b. K1ATP2、K2ATP2(Cos1細胞)。
c. K3ATP3、K4ATP3、K5ATP3(CHO細胞)
全ての試験リポペプチド試薬は、最初は75%のDMSO中に10mMで溶かされており、次いで水で希釈して、4℃で貯蔵される2mMストックを調製した。2μl〜15μlの範囲の2mMストックリポペプチドの体積を500μlのDDMEに希釈した。1μgのプラスミドpSVLCATを、500μlのDDMEに分けて希釈した。CHO細胞(2x105/日)もしくはCos1細胞(5x105/日)の60mm皿中の500μlのDDMEに加える前に室温で10−20分間溶液を合わせた。
細胞を、37℃かつ5%CO2の標準的な条件下で6時間インキュベートした。夜通しインキュベートするために、1.5mlのDME/Hams+10%FCS(CHO)もしくはDME+10%FCS(Cos1)を細胞に添加した。収穫前の24時間に、新鮮なDME/Hams+10%FCSもしくはDME+10%FCSを用いて培地を置換した。細胞溶解物を調製し、上述したようにCAT活性をアッセイした。Cos1細胞では、培養上清をCAT活性についてアッセイした。
結果:
a:トリパルミタート化合物では、K3ATP3が良好なトランスフェクションを示した(37℃、1μlのC14アセチルCoAで20分間のアッセイ時間後25μl溶解物から平均6237cpm(全利用可能カウントは40−50000cpm))。K5化合物は、その最適レベルにおいて顕著に低減したカウントを示した(平均1785cpm)。K0化合物は、このアッセイ系では測定可能なトランスフェクションを示さなかったが、低レベルのトランスフェクションが、CHO細胞でβ−galアッセイ系(後述)を用いて観察された。
ジパルミタート化合物では、K2の存在がトランスフェクションにおいて顕著に優れており、K5化合物の132cpmと比較して、平均5418cpmを与えた。トランスフェクションした皿の細胞の生存力はグラフ7bに示されている。毒性は、最も高いレベルのトランスフェクションを示す皿で最も高い(ODは最も低い)。
図7aおよびb参照。
b:単一のKの含有は、平均12670cpmの顕著なトランスフェクションを可能にした(25μlの溶解物、37℃で135分のインキュベーション、2μlのC14アセチルCoA(全利用可能カウントは90−100000cpm)。第二のリシン残基の存在は、同じレベルの化合物で生じる最適な結果である約5倍のトランスフェクションレベル(平均62215cpm)を示した。
図8
c:K4ATP3とK5ATP3化合物の両方は、K3等価物に比べて顕著に低いトランスフェクションを生じ、20μlの溶解物を2時間インキュベーションした後の各CAT活性の平均レベルは、それぞれ1071、6363および13467cpmであった。
図9
結論
示されたデータから、Kn=1〜5ATP2/3の0〜5のリシン含有の間の最適活性の序列は以下のように示される:
K3≧K2>K5>K4>>K1。
細胞生存能力の代表的なグラフは実験bに示されている(図7b参照)。これは、細胞生存能力とトランスフェクションとの関係の逆を示す。これは、共通に見いだされることである。
“y”リンカー
上述の模範化合物は、3つのリシン残基(K3)と、“y”の位置にアラニン(A)リンカーとを備えている。アラニン(A)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、リシン(K)もしくはグリシン(G)を備えた変異体を試験した。
目的:効率的なトランスフェクションのための最適なリンカー残基を調べる。
方法:それぞれの実験で、比較を以下の間で行った:
a. K2 K/F/L TP2 (Cos1)
b. K2 A/L TP2 (Cos1)
c. K3 A/L/G TL3 (Cos1)
pSVLCATのトランスフェクションおよびCAT酵素のアッセイに関して、実験例“a”および“b”を上述の通りに行った。
実験例“c”に関しては、マウスPGKプロモーターの支配下にβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドpPGKlaczNLS(G. Hannan提供)もしくはSV40初期プロモーター(Sleigh, M.J.とLockett, T.J. (1985). EMBO J. 4:3831-3837)を利用したpSVGALをトランスフェクションした。この実験とアッセイは、FelgnerらJ. Biol Chem. 269(4) 2550-2561 1994から修飾されている。このプロトコルによれば、ミクロタイタートレイで72の異なる組み合わせおよび濃度のDNAおよびテスト試薬を同時に評価することができる。最大レベルの遺伝子産物を示すウェルは、各試薬の最適な結果として選択された。細胞毒性は、アラマーブルーを用いて評価され、サンプルグラフは実験例aについて示されている。
結果
a:ジリシン、ジパルミタート化合物中のリンカーK、FおよびLの比較において、LはFとほとんど変わらない結果を示したが、実質的にK化合物より効果的であった。図10a参照。LおよびF化合物の毒性は、K化合物よりもわずかに高く、このことは単に細胞生存レベルがより高いというだけでは、より高いCATレベルが観察されないことを示唆している。
図10b参照。
b:ペプチド比較実験で用いられたAリンカーと、実験例“a”でより高いレベルの遺伝子発現を与えることが示されたLリンカーとの比較において、二つの化合物が、非常に類似した活性を備えていることが示された。
図11。
c:二つの模範的なリンカーAおよびLを、Gリンカーに対してトリリシン、トリラウラート(L3)のバックグラウンドで試験した。この場合では、Aリンカー化合物は、トランスフェクションにおいて優れており、他の化合物は、L57%、G 12%、リポフェクタミン 39%の相対トランスフェクションレベルを示した。
図12。
結論
示されたデータの比較から、種々のリンカーの効率の序列は、以下のように推定される。
A≧L>F>K>>G。
“R1−R4”脂肪アシル誘導体
I. トリスリンカーのアシル誘導体数、1〜3
トリスリンカーは、ペプチドおよびリンカーに一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を付加しやすくする。一般的にこれらの全ての誘導体は、互いに同一である。一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を具備する点で異なるが、全て同一の構成ブロックを有する化合物を、上記の標準的なトランスフェクションおよびアッセイ方法を用いて比較した。
目的:一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を具備するペプチド脂肪アシル誘導体化合物が哺乳動物細胞をトランスフェクションする能力を比較。
方法:プラスミド上にCATもしくはβ−gal遺伝子のいずれかをトランスフェクトする能力について化合物を試験し、上記のようにアッセイした。
実験例:
結果
a:実験例“a”で試験された化合物の比較により、ジおよびトリパルミタートの両方は高レベルのトランスフェクションを与えるが、モノパルミタート分子は非常に非効率的であることが示された。
図13a。
他の実験では、K3モノパルミタート化合物は、トリパルミタートK3分子の30%の活性を示した(データ示さず)。
図13b。
b:フェニルアラニンリンカーを備えたモノ、ジおよびトリパルミタート化合物の相対トランスフェクション能力は、アラニンリンカー(a)を備えたものと類似していた。
図14aおよびb。
c:ロイシンリンカーを備えたモノ、ジおよびトリパルミタート化合物の相対トランスフェクション能力は、アラニンリンカー(a)を備えたものと類似していた。
図15aおよびb。
d:リシンリンカーの場合は、ジパルミタートはトリパルミタート分子より顕著に低い活性であることが示された。トリパルミタートの増大したトランスフェクション活性は、先の場合にみられたように、細胞毒性の増大と付随している。
図16aおよびb。
e:この比較では、トリパルミタート分子(平均8325cpm)は、ジパルミタート(平均984cpm)より劇的に効率的であった。細胞毒性レベルは、増大したトランスフェクションと共にわずかに大きかった。
図17aおよびb。
f:異なる数の脂肪アシル基(n=1〜3)を備えた化合物を、3つの異なる長さの脂肪アシル誘導体(パルミタート、ミリスタートおよびラウラート)のバックグラウンドにおけるトランスフェクション効率に関して比較したところ、3つの脂肪アシル基を備えた化合物は、一貫して、2つもしくは1つの基を備えた化合物よりも、トランスフェクションにおいてより効果的であることが示された。3つの脂肪アシル基が存在する場合の毒性は、一般的にわずかに高いが、常にリポフェクタミンより低かった。表2参照。
示されたそれぞれの結果は、72の異なる条件のミクロタイタープレートからの最も高い読みである。最大値が得られた[脂質]/[DNA]の比率が示されている。示された実験は、上記のようにしてCos1細胞中で行われた。MTS ODは、異なる試薬に曝された細胞の相対生存能力の測定値であり、高い値は、優れた細胞生存能力を示す。*これらのポイントは、別の実験から得られたもので、実験の間に絶対値のわずかな変化があることが予想される。この実験では、生存能力は染料アラマーブルーを用いて測定され、直接比較し得るものではない。
g:K4化合物
テトラリシンアラニンのバックグラウンドに1〜3のパルミタート(K4ATP1/2/3)の間で比較を行った。先の実験にみられるように、トリパルミタートは、ジもしくはモノパルミタートより効果的であった。化合物のいずれか一つを用いて活性を測定した。最適なトランスフェクションには高レベルのこれらの試薬を必要としたにもかかわらず、細胞毒性は低かった。
図18aおよびb参照。
結論
“K3”化合物を用いた実験の結果は、“K4”化合物を用いた場合と類似して見える。すなわち、三つの脂肪アシル基は、細胞をトランスフェクトする能力において、二つもしくは一つの基よりも優れている。
R1−R4のセクションの結論
上記実験に示されたように、3つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物は、一般に、一つまたは二つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物よりも、細胞をトランスフェクトすることにおいて優れた能力を示す。トランスフェクションの最適ポイントでは、一般的に、商業的試薬“リポフェクタミン”より細胞に対する毒性が顕著に低い。この節に示されたほとんどのデータは、Cos1細胞で行われた実験によるものであるが、これらの結果はCHO細胞で得られた結果に反映していた。遺伝子産物の絶対的なレベルがそうであるように、種々の化合物に関する最適濃度は細胞系間で変わるが、[脂質]/[DNA]間の最適な比率は、一般的に細胞に依存し、トランスフェクション能力における化合物の相対的位置付けは類似している。
示されたデータの比較により、未製剤の混合されていない化合物の種々の数の脂肪アシル基(n=1〜3)の効率の序列を以下のように推定することができる。
3>2>1。
“R1−R4”脂肪アシル誘導体
II. 炭素鎖の長さ
目的:C16(パルミタート)と異なる長さの脂肪アシル誘導体が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのにより優れた能力を有するか否かを調べる。
方法:以下のような長さの異なる1〜3つの同一の脂肪アシル誘導体を備えたトリリシンアラニントリス(K3AT)の変異化合物を調製した。
C16 パルミタート (P)
C14 ミリスタート (M)
C12 ラウラート (L)
C10 カプロアート (C)
これらの各化合物を、上記の標準的な条件を用いて標準的な細胞系でトランスフェクション能力および細胞毒性を調べた。
結果
a. Cos1およびCHO細胞におけるP、M、LおよびC誘導体間の比較。
この表は、ラウラートおよびミリスタートを備えた化合物が、始めに用いられていたパルミタート誘導体より効率的に細胞をトランスフェクトできることを示している。カプロアートは、これらの化合物中で最も低い活性誘導体であった。
用語の説明:
示されたそれぞれの結果は、72の異なる条件のミクロタイタープレートからの最も高い読みである。最大値を与える[脂質]/[DNA]比は、(Cos1)(CHO)の順で二つの異なる細胞型について括弧内に示されている。示された実験は、上述のようにしてCos1細胞中で行われた。生存能力は、染料アラマーブルーで測定した。#は、別の実験で試験された化合物を示す。*この実験における生存能力を、MTSを用いて調べた。ODは、種々の試薬に曝された細胞の相対生存能力の測定値であり、アラマーブルーを用いた場足のように、高い値は優れた細胞生存能力を示す。
b. Hela細胞で調べられたC10〜C16のR1−R4
目的:Cos1およびCHO細胞において最も効率的な脂肪アシル基がHela細胞でも最も効率的であるか否か調べる。
方法:Hela細胞を、Cos1もしくはCHO細胞の代わりにDME+10%FCSに2x104/ウェルの密度となるようにまき、上記のようにpPGKlaczNLSでトランスフェクトした。
48時間で、アラマーブルーを用いて毒性を調べ、細胞にβ-galアッセイを行った。
結果:
β-galアッセイの結果は、Cos1およびCHO細胞におけるのと同様に、炭素鎖の長さがC16からC12に減少すると、トランスフェクション能力が増大した。C10分子を用いた場合には、トランスフェクション能力は非常に低くなり、ここではC12がピークのトランスフェクション効率であることを示している。予期せぬことに、細胞生存能力のピークレベルもC12化合物(K3ATL3)でみられた。
図19aおよびb。
結論
脂肪アシル誘導体の長さの変化は、いくつかの細胞型をトランスフェクトする化合物の能力に劇的な影響を与える。トランスフェクションの序列は、試験された全ての細胞型で維持されている。この位置におけるミリスタートおよびラウラートの両方が、原型のパルミタートより優れたトランスフェクションレベルを与え、ラウラートは試験された全てのものより優れていた。
“y”リンカー 標準的ではないアミノ酸
一連のアミノ酸をリンカー基として用いた。これらは、上述したロイシン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、α-BOC(ε-フリー)リシンを含んでいる。さらに、アミノ酪酸、アミノカプロン酸およびアミノカプリル酸等(それぞれ、3、5および7炭素−炭素単結合のリンカーを有する)の非標準アミノ酸についても調べた。
実験1
目的:位置“y”に種々の長さの非標準アミノ酸リンカーを用いることによって、Trisとチャージしたペプチド“x”との間に、より長いスペースを備えた化合物のトランスフェクション特性を調べる。
方法:ペプチド/脂肪アシル複合体を、リンカー基として非標準アミノ酸であるアミノ酪酸(C3)、アミノカプロン酸(C5)およびアミノカプリル酸(C7)、トリリシン核酸結合ドメイン、および三つの脂肪アシル基にラウラートを用いて合成した。これらの新しい複合体では、DNA結合およびトリス/脂肪アシル分子は、原型分子と比較した際に、それぞれ余分な3、5および7炭素結合の長さによって分類された。これらの化合物を、細胞をトランスフェクトする相対的な能力を調べるために、上記の標準的な方法で試験した。
結果:K3“y”TL3化合物、y=C3、C5、C7、A、L、Gを、上記の標準的なβ-galレポーター遺伝子系を用いてトランスフェクション効率について、互いにおよび商業的試薬リポフェクタミンと比較した。K3GTL3を除く全ての化合物は、リポフェクタミンよりトランスフェクションにおいてより効率的であることがわかった。C3、C5、特にC7化合物は、標準的な単一のアミノ酸リンカーを用いた化合物より劇的に効率的であることが示された。
図20a。
試薬の細胞毒性は、付随したグラフに示されている。図20b。トランスフェクションレベルの増大が、細胞毒性の増大と連動しないことに注目すべきである。
実験2
トランスフェクトされた細胞の割合
目的:C3−C7化合物によって示されたトランスフェクションの増大が、トランスフェクトされた細胞の割合の増大に反映されているか調べる。
方法:トランスフェクトされた細胞の割合を評価するために、pPGKlacZNLSでCHOおよびCos1細胞をトランスフェクトするためにこれらの複合体を用いた。用いられたトランスフェクション条件は、トランスフェクション用の35mm皿で生育された細胞を用いたCAT実験で上述されているものである。トランスフェクションの前日に、3.4x105/皿(Cos1)もしくは6.8x104/皿(CHO)の密度に細胞をまいた。トランスフェクション後24時間における生存能力の分析をした後、細胞をPBSで2回洗浄し、0.1Mリン酸バッファー中に0.2%グルタルアルデヒド、pH7.3に4℃で5分間固定した。細胞を冷却したPBSで2度洗浄した。新鮮な染色溶液(10mlの0.1Mリン酸バッファー、pH7.3;2.5mlのH2O中に105mgのフェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanido)と2.5mlのH2O中に82mgのフェリシアン化カリウム(potassium ferricyanide)の1.0mlの1:1混合物;ジメチルホルムアミド中に2%のX-galを0.2ml、11.2μlの1MのMgSO4)(2ml)を各皿に添加して、発色するまで皿を37℃でインキュベートした。光学顕微鏡で不規則なフィールドの細胞を調べ、青色(β-GALの発現)細胞の比率を調べた。
結果:試験試薬を用いて観察されたトランスフェクションの増大は、青く染まった細胞数で示されているように、トランスフェクションした細胞比の増大に反映された。
図21aは、CHO細胞で得られた結果を示し、図21bは、Cos1細胞で得られた結果を示している。このグラフのX軸において、Lfeはリポフェクタミン、vfは原型のペプチド/脂肪アシル複合体K3ATP3、AはK3ATP3を示し、C3、C5、C7は、それぞれアミノ酪酸、アミノカプロン酸およびアミノカプリル酸が連結している複合体を示す。
図21aおよびb。
結論
ペプチド/脂肪アシル複合体のリンカー部の長さを増すことにより、レポーター遺伝子の全体的な発現レベルとトランスフェクトされた細胞比の両方において、トランスフェクション特性が改善される。これらの試薬を用いることにより、トランスフェクションのピークレベルが、比較的低レベルの毒性でなされることに特に注意するべきである。これらの試薬は、トランスフェクションレベルの増大が直接細胞毒性レベルの増大につながるという最初の観察に合うものではない。
トランスフェクションを行う長いリンカーを備えた複合体の改善された能力は、細胞型から独立であると思われる。
図22aおよびbに示されたデータは、アミノカプリル酸連結複合体K3C7TL3が、ヒト前立腺ガン上皮細胞系PC3(図22a)およびJurkat T細胞系(図22b)を用いた場合にも、リポフェクタミンより効果的なトランスフェクション試薬であることを示している。
図22aおよびb。
試験した細胞型
上述の通り、記載された一般式の複合体は、いくつかの細胞型のトランスフェクを成功させるために用いられた。より完全なリストを以下に示す。
オリゴヌクレオチドトランスフェクション
目的:細胞にプラスミド全体のレポーター遺伝子をトランスフェクトする能力を示した化合物がオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにも効率的であるか否かを調べる。
方法:18マーの5’−フルオレセイン化ホスホロチオアート(fluoresceinated phosphorothioate)オリゴヌクレオチドをCHO細胞にトランスフェクトした。K3C7ATL3、K3ATL3および無試薬の、細胞内にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする能力を比較した。オリゴヌクレオチドを、121.2μMヌクレオチド、60.6、および30.3μMヌクレオチドまで連続的に希釈した。テストリポペプチドを、84μM、42、および21μMまで連続して希釈した。これらの希釈物を、3x3マトリックス中で組み合わせ、上記の半分の濃度とされた。すなわち、オリゴヌクレオチドの最初の希釈は、60.6μMヌクレオチド(3.37μMの18マーオリゴヌクレオチド)およびリポペプチド42μMとなった。混合物を室温で10分間インキュベートし、CHO細胞(前日に1x104/ウェルとなるようにまかれた)に添加し、全体で100μlの血清を含まないDDMEで洗浄した。テスト試薬を含まない混合物を含むウェルは、同じ条件下で添加された3つの異なる濃度のオリゴヌクレオチドを含有している。
37℃かつ5%CO2の標準条件で3時間インキュベーションした後、混合物を除去し、50μlのDDMEで置換した。共焦点顕微鏡(the confocal microscope)で細胞の生存を観察した。蛍光レベルが高いので、BioRad MRC 500共焦点顕微鏡のレーザーのピンホール装置を最小まで絞った。全ての画像を定量的比較のために同じ設定で回収した。
共焦点分析後、100μlのEMEM+10%のFCSをウェルに添加し、細胞を夜通し標準的な条件下でインキュベートした。細胞を蛍光で再度調べた。
結果
トランスフェクションの時点から3時間後のトランスフェクションの結果を表4に示す:
結論
各トランスフェクション試薬の使用により、高レベルのオリゴヌクレオチドを取り込んだ100%の生存細胞を生じた。実験に記載された3時間の時点では、細胞核は蛍光化オリゴヌクレオチドで強烈に染色された。
アスタリスク“*”でマークされた結果は、無試薬の実験を除いて、マークされていないものより低い傾向を発した。無試薬では、蛍光レベルは、実験に用いられた検出レベルで、蛍光を発する各細胞における強度を変える単一スポットに限定された。
表4に特定されたものより高い割合の細胞が、トランスフェクション試薬の無い条件下でオリゴヌクレオチドを取り込んだが、取り込みの量は、用いられた検出レベルで記すには不十分であった。
十分な培地(EMEM+10%FCS)で夜通しインキュベートしたした後、全てのサンプルにおいて蛍光レベルが減少し、最も重要な変化はほとんどの核における蛍光の損失であり、細胞質の染色は局所的であった。トランスフェクション試薬を用いたサンプルの蛍光レベルは、トランスフェクション試薬を用いなかったサンプルより実質的に高いままであった。
製剤
商業的に利用できるほとんどのトランスフェクション化合物は、中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)を用いて製剤されたリポソームである。さらに、二つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物は、一つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物より安定なリポソーム構造を形成するらしいことが示唆されており、商業的試薬は決まって二つのアシル誘導体を備えている。短い鎖の脂肪アシル誘導体、特にラウラートが、細胞をトランスフェクトするのに大きな力を示すということを示唆した上記の結果から、より短い鎖のホスファチジルエタノールアミン化合物を使用することによって、より効率的なトランスフェクションが示されるかもしれない。しかして、DOPEの使用は、トランスフェクションに効果的なリポソーム構造を形成する能力において例証的であって、限定的なものではないとみられるべきである。
目的:脂質DOPEを用いたリポソーム製剤の効率を調べる。
方法:ベラフェクチンA2(K3ATP2)を、標準的な方法(K.YagiらBiochem. Biophys. Res. Comm. 196 3., 1993 pp1042-1048)を用いてリポソーム中に製剤し、H2O中に2mMとなるように取り込んだ。製剤は、DOPEと1:2、1:1、および2:1モーラーで調製された。
以下の別々の実験に記載されたようにして、リポソーム製剤を商業的化合物と比較した。
a. 上記の標準的なトランスフェクション方法および1μgのプラスミドpSVLCATを用いて、これらの製剤を、サンプル当たり10μlのベラフェクチンA2(2mM)に相当する単一の濃度でCHO細胞上で試験し、同じ細胞型で未製剤の化合物およびリポフェクタミンと比較した。CAT産生をトランスフェクション後48時間で調べた。
b. リポソーム製剤を、β-gal発現を含むプラスミド、pPGKlacZを用いて同じ濃度で試験し、リポフェクタミンおよびDOTAP(Boehringer Mannheim)と比較した。トランスフェクションから24時間後、細胞を固定し、β-gal発現物を染色した。
結果:
a. リポソーム製剤の使用により、二つの別々の実験で3つの異なる比率を用いて、最適なリポフェクタミン誘発発現の62%〜156%の範囲のCHO細胞からの発現を得た。非リポソーム製剤中のVFA2化合物を使用すると、リポフェクタミンのたったの5%程度のCATレベルが与えられた。未製剤もしくはリポソーム方法を介して“製剤された”いずれの場合でも、DOPEのみでは、トランスフェクションしなかった。
注意:DOPEのみでは、真のリポソームを形成しない。以下のEMセクションを参照。
図23a。
b. 染色細胞対未染色細胞の予備的な細胞数により、リポフェクタミンによるものと比較して、最高のリポソーム製剤(K3ATP2:DOPE 1:2)が2倍のトランスフェクトされた細胞数を与え、DOTAPが約半分の細胞数を与えることが示唆された。これらの条件下でリポフェクタミンを用いてトランスフェクトされたCHO細胞の比率は、17.5%であると調べられた。
図23b。
試薬の濃度は、これらのベラフェクチンA2/DOPE製剤にとって最適ではなかった。しかしながら、リポフェクタミンとDOTAPからのデータは、最適化された濃度から得られたものであった。
予備的データは、これらの製剤の細胞毒性が、リポフェクタミンおよびDOTAPとほぼ同じであることを示唆した(データ示さず)。
電子顕微鏡
製剤されたもしくは未製剤の化合物の溶液を、潜在的な膜様構造について分析した。別々の実験で以下のサンプルを分析した。
a:製剤された化合物K3ATP2:DOPE、DOPEと、未製剤の化合物K3C7ATL3とリポフェクタミンのネガティブ染色サンプル。
b:二つの比率のヌクレオチド(プラスミド)と混合されたK3C7ATL3とリポフェクタミンのロータリーシャドウサンプル(rotary shadowed sample)。
方法:
ネガティブ染色
2mMのリポソームストックサンプルを、濾過した蒸留水で10分の1に希釈し、濾過したネガティブ染料(アンモニウムモリブタート2%、pH6.5)を1:1で混合し、炭素−ホームバー(carbon-formvar)被覆銅/ロジウム200メッシュ電子顕微鏡グリッド上にまき、33k〜100kの間の倍率で60kVでJeol JEM 100CX電子顕微鏡で調べた。
ロータリー金属シャドウイング
0.69および0.25のリポソーム:1モルのDNAヌクレオチド比を水に希釈し、10分間室温で混合し、7°の角度で蒸発したプラチナ−パラジウム(60:40)を用いて炭素−ホームバー被覆グリッドおよびロータリー金属シャドウにまき、26k〜66kの間の倍率で60kVで電子顕微鏡で調べた。
結果:
a:リポソームの形成の成功を調べるために、製剤されたK3ATP2:DOPEのネガティブに染色されたサンプルをTEMで分析した。これらのサンプルは、DOPEのみのものは同じ条件下ではなかったが、マルチラメラリポソーム構造を形成したことを示した。
製剤されたリポソームが効率的なトランスフェクションを与えうるので、効率的なトランスフェクションを示す純粋な未製剤の化合物が何らかの膜様構造を有するか否かを調べることは興味深い。これらの化合物のいくつかをネガティブに染色し、再度TEMで分析した。興味深いことに、効率的なトランスフェクションを与え、3つの脂肪アシル誘導体を備えた上記化合物は、10nm〜0.2μmのサイズの膜結合小胞の“束(rafts)”“塊(stacks)”を自発的に形成したことがわかった。
b:化合物を準最適(0.25)および最適(0.69)な比率のリポペプチド:ヌクレオチドでプラスミドDNAと混合し、ロータリーシャドウをした。これらのサンプルの分析により、トランスフェクションに最適な比率においてほとんどのDNAがリポソームの内部に取り込まれたことが、劇的に示された。不十分な化合物が存在する比率(0.25:1)では、大量のDNAが溶液中でフリーであった。これは、テスト化合物K3C7TL3とリポフェクタミンのいずれにおいても正しく、DNAと混合した際にEMでは非常に類似して見えるが、DNAと結合していない外観は非常に異なる。
トランスフェクション化合物と他の脂質の未製剤の混合物
オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞の比率(100%蛍光細胞)と遺伝子産物を発現した細胞の比率(<100%青色細胞)との間に食い違いがあった。“トランスフェクション”をするためにオリゴヌクレオチドは形質膜を通過することのみ必要とするが、遺伝子産物を産生するために、DNAが核に取り込まれ、転写および翻訳される必要があるので、このことは驚くべき結果ではない。しかしながら、トランスフェクションの成功および遺伝子産物の生成が、形質膜および核膜等の種々の膜を横切る異なる能力を備えた化合物の組み合わせから得られる多数の工程の方法であることを示唆している。
このことを考慮して、数と長さが異なる種々の脂肪アシル基を備えた多数の同一化合物を、以下に記載するβ−galプレートアッセイで組み合わせ、試験した。
いくつかの化合物によるトランスフェクションの改良も、ベラフェクチンG2(K3GTP2)を用いた実験例4で見られたような中性脂質DOPEの単なる添加によって観察された。
化合物の混合物;実験例1
方法:化合物K3ATL3を用いてなされたトランスフェクションの最適レベルを、5μMのK3ATL3を必要とすると予め調べた。K3ATL3を、100μl中に5μMの脂質の全濃度となるように、K3ATL1、K3ATL2、K3ATM3、K3ATP3およびK3ATC3のいずれかと、0:5、1:4、2:3、3:2、4:1および5:0の比率で混合した。K3ATM3を、同様にK3ATM1、K3ATM2、およびK3ATP3と混合した。各脂質混合物を、一定量のpSVGAL DNA 0.5μg/ウェルと組み合わせ、トランスフェクションを通常に行った。
結果:全てのウェルからの発現物は、最適レベルのDNAが用いられた2倍くらい低かったが、K3ATL3とK3ATM3の4:1の組み合わせを含むウェルにおける発現レベルは強く、K3ATL3またはK3ATM3を単独で含む場合より高いレベルのβ−gal発現を示した(データ示さず)。
実験例2:
これは、二つのリポペプチドK3ATL3とK3ATM3の4:1モルの混合物を作成し、リポペプチドとDNAの濃度の両方の二重希釈を含む標準的なプレートアッセイでさらに試験を行った。同じ条件下で純粋な化合物K3ATL3を用いて行われた発現を比較した。
結果:小さいが明らかな発現の増大が、リポペプチドの混合物を用いてなされた。試験された各濃度のリポペプチドにおいて、最適なレベルのトランスフェクション試薬が、同じ濃度におけるL3のみと比べて、L3/M3の4:1混合物を使用することにより、より高レベルのトランスフェクションを示した。
図24。
結論
リポペプチドトランスフェクション試薬の組み合わせは、いずれかの試薬のみと比較して優れたレベルのトランスフェクションを可能にする。さらにこのような試験を行えば、それぞれの化合物のみと比べて優れたレベルのトランスフェクションを示す別の組み合わせを見いだすことができるであろう。この結果は、これらの分子の混合物が、個々のトランスフェクション特性に重要な効果を及ぼすことを示唆している。
In vivoトランスフェクション
目的:記載された式の化合物が、完全な生物体に効果的にDNAを輸送し、輸送された遺伝子を発現するために用いられるか否かを調べる。
方法:緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein)をコードするプラスミドpGFP-N1(Clontech)を、水中に5%のデキストロース20μl中に10μg(10μl)となるように希釈し、水中に5%のデキストロース27.9μl中に10mMのK3ATL3(10%DMSO)2.1μlと合わせた。室温で10分間インキュベートした後、混合物を無毛マウスの足の筋肉に注射した。24時間後にマウスをと殺し、筋肉のスナップをドライアイスで凍結させた。組織の凍結部位を調製し、共焦点顕微鏡で蛍光を調べた。
結果:蛍光が筋肉細胞の細胞質に観察され、非常に強い蛍光がモーター終板(the motor end-plate)に観察された。注射されていない方の足の組織には蛍光が観察されなかった。
結論
予備的な実験によって、効果的な遺伝子の完全な動物への移入が、これらの化合物を用いてなされることが示された。
本発明は、化合物、特にDNAを真核細胞に輸送する有効な方法を提供する。この方法は、標準的なCaPO4型のトランスフェクションより効率的であり、本願発明のある実施態様は商業的に利用できるトランスフェクション試薬より実質的に優れている。本願発明の方法は、リボザイム、アンチセンス等の核酸をベースとする薬剤のような別の化合物の輸送においても同様に使用できると考えられる。
広く記載された本願の範囲の精神から外れることなく、特定の実施態様に示したように、本願発明に多数の変化および/または変更を加えてもよいことは、当業者に理解されるであろう。それゆえ、これらの実施態様は、例証的なものであって、限定でないと見なされるべきである。
Claims (48)
- yが存在する請求項1記載の方法。
- 核酸が、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項1または2記載の方法。
- R1、R2およびR3が同一である、請求項1ないし3のいずれか一項に記載の方法。
- R1、R2および/またはR3が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の方法。
- R1、R2および/またはR3が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項5記載の方法。
- 細胞が動物細胞である、請求項1ないし6のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項1ないし7のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物が、3〜7炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“y”を含む、請求項1ないし8のいずれか一項に記載の方法。
- yがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項9記載の方法。
- xが全体的に陽性チャージを備えている、請求項1ないし10のいずれか一項に記載の方法。
- xがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項11記載の方法。
- wがxに共有結合している、請求項1ないし10のいずれか一項に記載の方法。
- yが存在する請求項14記載の方法。
- 核酸が、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項14または15記載の方法。
- R5が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項14ないし16のいずれか一項に記載の方法。
- R5が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項17記載の方法。
- 細胞が動物細胞である、請求項14ないし18のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項14ないし19のいずれか一項に記載の方法。
- リンカー基“y”が、3〜7炭素原子に相当する鎖長を備えた、請求項14ないし20のいずれか一項に記載の方法。
- yがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項21記載の方法。
- xが全体的に陽性チャージを備えている、請求項14ないし22のいずれか一項に記載の方法。
- xがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項23記載の方法。
- wがxに共有結合している、請求項14ないし22のいずれか一項に記載の方法。
- yが存在する請求項26記載の化合物。
- wが、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項26または27記載の化合物。
- R1、R2およびR3が同一である、請求項26ないし28のいずれか一項に記載の化合物。
- R1、R2および/またはR3が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項26ないし29のいずれか一項に記載の化合物。
- R1、R2および/またはR3が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項30記載の化合物。
- 化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項26ないし31のいずれか一項に記載の化合物。
- 化合物が、3〜7炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“y”を含む、請求項26ないし32のいずれか一項に記載の化合物。
- yがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項33記載の化合物。
- xが全体的に陽性チャージを備えている、請求項26ないし34のいずれか一項に記載の化合物。
- xがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項35記載の化合物。
- wがxに共有結合している、請求項30ないし34のいずれか一項に記載の化合物。
- yが存在する請求項38記載の化合物。
- wが、DNA、RNA、もしくはDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項38または39記載の化合物。
- R5が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項38ないし40のいずれか一項に記載の化合物。
- R5が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項41記載の化合物。
- 化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項38ないし42のいずれか一項に記載の化合物。
- 化合物が、3〜7炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“y”を含む、請求項38ないし43のいずれか一項に記載の化合物。
- yがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項44記載の化合物。
- xが全体的に陽性チャージを備えている、請求項38ないし45のいずれか一項に記載の化合物。
- xがジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項46記載の化合物。
- wがxに共有結合している、請求項38ないし45のいずれか一項に記載の化合物。
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