JP2015007021A - 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法 - Google Patents

脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2015007021A
JP2015007021A JP2013133620A JP2013133620A JP2015007021A JP 2015007021 A JP2015007021 A JP 2015007021A JP 2013133620 A JP2013133620 A JP 2013133620A JP 2013133620 A JP2013133620 A JP 2013133620A JP 2015007021 A JP2015007021 A JP 2015007021A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lipid
group
nucleic acid
nitrogen
containing heterocyclic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2013133620A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5914418B2 (ja
Inventor
西川　尚之
Naoyuki Nishikawa
尚之 西川
京子 千賀
Kyoko Chiga
京子 千賀
雄喜 井上
Yuki Inoue
雄喜 井上
祐子 五十嵐
Yuko Igarashi
祐子 五十嵐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Priority to JP2013133620A priority Critical patent/JP5914418B2/ja
Priority to US14/314,873 priority patent/US9540638B2/en
Publication of JP2015007021A publication Critical patent/JP2015007021A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5914418B2 publication Critical patent/JP5914418B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

【課題】細胞毒性が低く、細胞外(血中)で核酸分子を安定に保持することができ、かつエンドソームから脱出して、速やかに細胞質中で核酸を放出できる脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法を提供すること。
【解決手段】１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として含む脂質粒子。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ等の核酸を細胞内に送達するのに有用な脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法、及び遺伝子導入方法に関する。
核酸医薬は、疾患に対する作用機序が明確で、副作用も少なく、次世代の医薬品として期待されている。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いた核酸医薬は、細胞に存在する標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害することができる。その結果、特定の遺伝子又は遺伝子群の異常な発現が原因となって生じる疾患症状を軽減又は治療することができる。このようなＲＮＡ干渉を利用した核酸医薬においては、例えば、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡなどの核酸が利用されるが、これらの核酸に機能を発現させるためには、核酸を細胞内に送達することが必要である。
核酸を細胞内に効果的に送達する方法として一般にキャリア（ベクター）が用いられる。キャリア（ベクター）には、ウイルス性キャリアと非ウイルス性キャリアがある。ウイルス性キャリアは、病原性、免疫原生及び細胞毒性の安全性の面で不明点が多いため、臨床的な応用には非ウイルス性キャリアの使用が望まれている。
非ウイルス性キャリアとしては、核酸がアニオン性であることから、静電相互作用により核酸を保持できるカチオン性キャリアが用いられる。カチオン性キャリアの例としては、特定構造のカチオン脂質を用いたカチオン性リポソームやカチオン性ポリマーを用いた複合体などが一般に知られている。カチオン性リポソームの例として、核酸を脂質二分子膜の表面に静電相互作用で結合したリポソームや脂質二分子膜の表面、およびその間に挟んだリポプレックスなどが挙げられる。
例えば、非特許文献１には、カチオン脂質とＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン）とポリエチレングリコール脂質からなるリポソームが記載されている。また、特許文献１には５０ｍｏｌ％から８５ｍｏｌ％のカチオン脂質を含むことを特徴とする脂質粒子が記載され、特許文献２には複数のカチオン脂質を用いることを特徴とする脂質粒子が記載されている。さらに特許文献３には、第一のカチオン脂質、第二のカチオン脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール脂質からなる脂質粒子が記載されている。カチオン性ポリマーを用いた複合体も様々なものが知られている（非特許文献２）。
またカチオン性キャリアの更なる改良手段として、例えば、特許文献４には、カチオン性脂質とアニオン性脂質を組み合わせた両性リポソームが記載され、特許文献５には両性の両親媒性脂質からなる両性リポソームが記載されている。
国際公開ＷＯ２０１２／０００１０４Ａ１ 国際公開ＷＯ２０１１／０７５６５５６Ａ１ 米国特許公開ＵＳ２０１３／００１７２２３Ａ１ 特開２０１１−２１０２６号公報 特表２００５−５１７７３９号公報
Gene Therapy, Vol.6, page 271, 1999 Journal of Controlled Release 114 (2006) 100-109
核酸と細胞膜はともにアニオン性であり電気的に反発し合うため、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を単独で直接細胞内に導入することは非常に困難であり、有効な治療効果が得られないという問題がある。さらに、核酸は、血中で不安定であり、体内に直接投与した場合、容易に分解してしまうという問題を有している。核酸を細胞内に効果的に送達する手段としては、非ウイルス性のカチオン性キャリアが使用されている。しかし、一般にカチオン脂質を用いたキャリアは細胞毒性が強いものが多く、例えば、市販の遺伝子導入剤であるLipofectamine2000（登録商標）も細胞毒性は非常に高い。同様に、カチオン性ポリマーを用いた複合体についても、カチオン性ポリマーの細胞毒性に問題があり、その解決が望まれている。カチオン性キャリアの問題を解決する手段として、カチオン性脂質とアニオン性脂質を組み合わせた両性リポソームや両性の両親媒性脂質からなる両性リポソームも検討されているが、まだ実用には至っていない。
本発明は、核酸医薬において、又は遺伝子導入試薬として使用する核酸キャリアの性能を向上させることを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、細胞毒性が低く、細胞外(血中)で核酸分子を安定に保持することができ、かつエンドソームから脱出して、速やかに細胞質中で核酸を放出できる脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として脂質粒子を調製することによって、上記課題を解決した脂質粒子を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として含む脂質粒子が提供される。
好ましくは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質は、１以上のアミノ基と１以上のイミダゾリル基を有するリン脂質である。
好ましくは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質は、ヒスチジンのカルボキシル基とアミノ基を持つリン脂質のアミノ基が結合した構造を有する。
好ましくは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基を有するリン脂質は、下記一般式（Ｉ）で表される脂質又はその塩である。
一般式（Ｉ）
Figure 2015007021
 （一般式（Ｉ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。ＷとＶは、それぞれ独立して単結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、又はこれらの組み合わせからなる連結基を示す。Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のヒドロキシアルキル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基、炭素数１から４のアミノアルキル基、炭素数１から４のグアニジノアルキル基、炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示す。Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示す。ｎが１の場合、Ｒ５とＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｎが２から４の整数の場合、一般式（Ｉ）に含まれる複数のＲ５と複数のＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｌは２から４の整数、ｍは０から４の整数、ｎは１から４の整数を示す。）
好ましくは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質は、下記一般式（ＩＩ）又は下記一般式（ＩＩＩ）で表される脂質あるいはそれらの塩である。
一般式（ＩＩ）
Figure 2015007021
 （一般式（ＩＩ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
一般式（ＩＩＩ）
Figure 2015007021
 （一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ３は炭素数１から４のヒドロキシアルキル基又は炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
好ましくは、含窒素複素環基を含まない中性脂質がホスファチジルエタノールアミン類である。
好ましくは、含窒素複素環基を含まない中性脂質が、その相転移点が０℃以下のホスファチジルエタノールアミン類である。
好ましくは、ステロール類がコレステロールである。
好ましくは、本発明の脂質粒子は、ポリエチレングリコール含有脂質をさらに含む。
好ましくは、本発明の脂質粒子は、抗体又はリガンドを有する脂質をさらに含む。
好ましくは、抗体又はリガンドを有する脂質は、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質である。
好ましくは、核酸はｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。
好ましくは、本発明の脂質粒子は、非リポソーム型である。
本発明によればさらに、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、およびステロール類を含む、核酸送達キャリアが提供される。
本発明の核酸送達キャリアは、好ましくは、遺伝子導入試薬として使用するか、又は核酸医薬における核酸送達キャリアとして使用する。
本発明によればさらに、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および有機溶媒を構成成分として含む核酸送達キャリア製造用組成物が提供される。
本発明によればさらに、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質およびステロール類を含む有機溶媒溶液と、核酸を含む溶液とを混合して、核酸と脂質との分散液を製造する工程、及び分散液から有機溶媒を除去する工程を含む、本発明の脂質粒子の製造方法が提供される。
本発明によればさらに、本発明の脂質粒子をインビトロで細胞に導入する工程を含む、細胞への遺伝子導入方法が提供される。
本発明の脂質粒子は、低い細胞毒性を有する。また、本発明の脂質粒子によれば、標的細胞内で効率よく核酸本来の機能を発揮させることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において、脂質粒子中の各成分に該当する物質は複数種存在してもよく、その場合には、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）に対する各成分の量は、特に断らない限り、脂質粒子中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
（１）脂質粒子の成分について
本発明の脂質粒子は、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として含む。
（ａ）１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質
本発明で使用する１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質において、含窒素複素環基とは、少なくとも一つの窒素原子を含む５員環、６員環、あるいはその縮合環である複素環基を示す。具体的には、例えば、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジノ基、キノリノ基、イソキノリノ基等が挙げられ、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ピリジル基が好ましく、イミダゾリル基が特に好ましい。複素環基は置換基を有していてもよい。複素環基上における置換基は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基などが挙げられる。
好ましくは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質が、ヒスチジンのカルボキシル基とアミノ基を持つリン脂質のアミノ基が結合した構造を有する。
１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質の好ましい形態としては、下記一般式（Ｉ）で表される脂質又はその塩が挙げられる。
Figure 2015007021
一般式（Ｉ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、酸素原子であることが好ましい。Ｙはリン脂質を形成する一般的な疎水基を示す。具体的には、例えば、炭素数８から２４のアルキル基、炭素数８から２４のアルキル基、炭素数８から２２のアシル基、炭素数１６から５４の１，２−ジアルキルオキシプロピル基、炭素数１６から５４の１，３−ジアルキルオキシプロピル基、炭素数１６から５４の１，２−ジアシルオキシプロピル基、炭素数１６から５４の１，３−ジアシルオキシプロピル基等が挙げられ、１，２−ジアシルオキシプロピル基、炭素数１６から５４の１，３−ジアシルオキシプロピル基等が好ましい。より具体的には、１，２−ジテトラデシルオキシプロピル基、１，２−ジヘキサデシルオキシプロピル基、１，２−ジオクタデシルオキシプロピル基、１，２−ジミリストイルイルオキシプロピル基、１，２−ジパルミトイルオキシプロピル基、１，２−ジステアロイルオキシプロピル基、１，２−ジオレオイルオキシプロピル基、１，２−ジリノレオイルオキシプロピル基、１，２−ジフィタノイルオキシプロピル基、１−パルミトイルオキシ−２−ジオレオイルオキシプロピル基等が特に好ましい例として挙げられる。
一般式（Ｉ）において、ＷとＶは、それぞれ独立して単結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、又はこれらの組み合わせからなる連結基を示すが、単結合、−Ｏ−基、−ＮＨ−基、−ＣＯ−基、−ＣＯＯ−基、−ＯＣＯ−基、−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＯ−基、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−基等が好ましい例として挙げられ、単結合、−ＣＯＯ−基、−ＯＣＯ−基、−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＯ−基が特に好ましい例として挙げられる。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して水素原子、あるいは炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示すが、水素原子が好ましい。Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のヒドロキシアルキル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基、炭素数１から４のアミノアルキル基、炭素数１から４のグアニジノアルキル基、炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示すが、水素原子、炭素数１から４のヒドロキシアルキル基、炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基が好ましい。Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示す。ｎが１の場合、Ｒ５とＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｎが２から４の整数の場合、一般式（Ｉ）に含まれる複数のＲ５と複数のＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｌは２から４の整数を示すが、ｌは２が好ましい。ｍは０から４の整数を示すが、０あるいは２から４の整数が好ましい。ｎは１から４の整数を示すが、２から３の整数が好ましい。
一般式（Ｉ）で表される脂質又は塩は、下記一般式（ＩＩ）又は下記一般式（ＩＩＩ）で表される脂質あるいはそれらの塩であることが好ましい。
一般式（ＩＩ）
Figure 2015007021
 （一般式（ＩＩ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
一般式（ＩＩＩ）
Figure 2015007021
 （一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ３は炭素数１から４のヒドロキシアルキル基又は炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
一般式（ＩＩ）の化合物の合成は、ウイルス感染の予防、治療薬として特開昭６１−４３１９３に合成法と共に開示されており、この合成法により合成することができる。
また、一般式（ＩＩ）の化合物の合成は、下記のスキーム１によっても合成することができる。アミノ基とイミダゾリル基が適当なアミノ保護基で保護されたヒスチジン、あるいはヒスチジンの活性エステルとホスファチジルエタノールアミンを縮合した後、脱保護することにより合成することができる。アミノ保護基としては、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基などの一般的なアミノ保護基を採用することができる。アミノ保護基で保護されたヒスチジンの活性エステルを用いる場合、例えば、ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール等とのエステルを用いることができる。
アミノ保護基で保護されたヒスチジンとホスファチジルエタノールアミンの縮合は、一般的な方法、例えば、Ｎ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド （ＤＩＰＣＤＩ）、カルボジイミド、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、あるいはＷＳＣ）等を縮合剤として用いる方法を採用することができる。この時、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール (ＨＯＢｔ)や３、４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）などの添加剤をエピマー化（epimerization）の防止のために添加してもよい。反応は、有機溶媒、水系溶媒、あるいはその混合溶媒中で行うことができ、必要に応じてトリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基、あるいは炭酸水素ナトリウム等の無機塩基を用いることができる。
アミノ保護基で保護されたヒスチジンの活性エステルの縮合は、一般的な方法、例えば、アミノ保護基で保護されたヒスチジンの活性エステルとホスファチジルエタノールアミンを有機溶媒、水系溶媒、あるいはその混合溶媒中で縮合させればよい。このとき、必要に応じてトリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基、あるいは炭酸水素ナトリウム等の無機塩基を用いることができる。
上記の方法で得られた一般式（ＩＩ）の化合物の保護体を脱保護することにより、目的とする化合物（ＩＩ）の化合物を得ることができる。脱保護工程は、採用したアミノ保護基に適した方法が採用される。例えば、Ｂｏｃ基をアミノ保護基として用いた場合、ジオキサンの塩酸溶液やトリフルオロ酢酸により脱保護することができる。
スキーム１
Figure 2015007021
式中、ＰＧは保護基、ＬＧは水酸基、あるいは活性エステルを構成する脱離基を示す。Ｘ，Ｙは前記と同様である。
一般式（ＩＩＩ）の化合物は、同様に下記のスキーム２によって合成することができる。保護されたヒスチジン誘導体とホスファチジルエタノールアミンを縮合する工程、および一般式（ＩＩＩ）の化合物の保護体を脱保護する工程は上記の一般式（ＩＩ）の記載と同様である。
スキーム２
Figure 2015007021
式中、ＰＧ、ＬＧ、Ｘ，Ｙは前記と同様である。
１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質が塩を形成する場合、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩など医学的に許容される塩を形成することが好ましい。
１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質の光学活性中心に関しては、Ｓ体、Ｒ体、およびラセミ体のいずれでもよい。
１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質の特に好ましい例を以下に具体的に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
化合物１−１
Figure 2015007021
化合物１−２
Figure 2015007021
化合物１−３
Figure 2015007021
化合物１−４
Figure 2015007021
化合物１−５
Figure 2015007021
化合物１−６
Figure 2015007021
化合物１−７
Figure 2015007021
化合物１−８
Figure 2015007021
化合物１−９
Figure 2015007021
化合物１−１０
Figure 2015007021
化合物３−１
Figure 2015007021
化合物３−２
Figure 2015007021
本発明において、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質は、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）の１ｍｏｌ％から６０ｍｏｌ％であることが好ましく、３ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％であることがより好ましく、５ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
（ｂ）含窒素複素環基を含まない中性脂質
本発明に用いられる含窒素複素環基を含まない中性脂質としては特に限定されないが、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、スフィンゴミエリン類、セラミド類が挙げられる。含窒素複素環基を含まない中性脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン類が好ましく、その相転移点が０℃以下のホスファチジルエタノールアミン類が特に好ましい。含窒素複素環基を含まない中性脂質は単独でも、複数の異なる「含窒素複素環基を含まない中性脂質」の組み合わせでもよい。複数の異なる「含窒素複素環基を含まない中性脂質」の組み合わせる場合、少なくとも一種の「含窒素複素環基を含まない中性脂質」はホスファチジルエタノールアミン類であることが好ましく、その相転移点が０℃以下のホスファチジルエタノールアミン類であることが特に好ましい。なお、相転移点の測定は、一般的な方法により測定することができる。例えば、示唆熱走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定により行うことができる。
ホスファチジルコリン類としては特に限定されないが、大豆レシチン（ＳＰＣ）、水添大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、卵黄レシチン（ＥＰＣ）、水添卵黄レシチン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ＤＬｏＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＣ）等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミン類としては特に限定されないが、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジテトラデシルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシルホスファチジルエタノールアミン、ジオクタデシルホスファチジルエタノールアミン、ジフィタニルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）が特に好ましい。
スフィンゴミエリン類としては特に限定されないが、卵黄由来スフィンゴミエリン、牛乳由来スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
また、セラミド類としては特に限定されないが、卵黄由来セラミド、牛乳由来セラミドなどが挙げられる。
本発明において、含窒素複素環基を含まない中性脂質は、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）の５ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％であることが好ましく、１０ｍｏｌ％から６０ｍｏｌ％であることがより好ましく、２０ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
（ｃ）ステロール類
本発明に用いられるステロール類としては特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど）、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテル等を挙げることができるが、コレステロールが特に好ましい。
本発明において、ステロール類は、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）の５ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％であることが好ましく、１０ｍｏｌ％から６０ｍｏｌ％であることがより好ましく、２０ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
（ｄ）核酸
本発明に用いられる核酸としては、公知の任意の形態の核酸が含まれる。核酸の具体例としては、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどが挙げられる。二本鎖ＤＮＡの例として、例えば、構造遺伝子、制御領域および終止領域を含む遺伝子、およびウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡなどが挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例として、例えば、ｓｉＲＮＡならびにａｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどが含まれる。一本鎖核酸の例として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が挙げられる。核酸としては、上記の中でも、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
本発明で用いられる核酸は、非天然型核酸であってもよい。非天然型核酸の例としては、２’ＯＭe−グアノシン、２’ＯＭe−ウリジン、２’ＯＭe−アデノシン、および/または２’ＯＭe−シトシンヌクレオチドなどの、少なくとも1個の２’ＯＭeプリンまたはピリミジンヌクレオチドを有した非天然型核酸が挙げられる。また、核酸の ２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋した２つの環状構造を持つ非天然型核酸（ＢＮＡ、ＬＮＡ）なども好ましい例として挙げられる。本発明では様々な非天然型核酸を適用でき、本発明は上記に限定されるわけではない。さらに、本発明で用いられる核酸は、例えば、Elbashir ら, Genes Dev., 15 188（2001）またはNykanenら, Cell, 107:309（2001）に記載されているようなオーバーハング構造を有していてもよい。
全脂質量に対する核酸の使用量の質量比（核酸の質量／全脂質の質量）は、特に限定されないが、０．００１〜２が好ましく、０．０１〜１がより好ましい。
（ｅ）ポリエチレングリコール含有脂質
本発明において、粒子の凝集を抑える目的やキャリアの血中安定性や滞留性を高める目的でポリエチレングリコール含有脂質を併用することは好ましい形態の一つである。但し、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとも略記する）含有脂質の使用は本発明において必須ではない。ＰＥＧ含有脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールのＰＥＧ誘導体、ジアルキルグリセロールのＰＥＧ誘導体、コレステロールのＰＥＧ誘導体、セラミドのＰＥＧ誘導体等が挙げられる。ＰＥＧ鎖の分子量は、５００〜５０００が好ましいが、５００〜３０００が特に好ましい。ＰＥＧ鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。
本発明においてＰＥＧ含有脂質を使用する場合、ＰＥＧ含有脂質は、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）の０．０１ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％であることが好ましく、０．０５ｍｏｌ％から７ｍｏｌ％であることがより好ましく、０．１ｍｏｌ％から５ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
（ｆ）抗体又はリガンドを有する脂質
本発明において、核酸キャリアのターゲティング性能や細胞取り込み性能を向上させるために必要に応じて、抗体又はリガンドを有する脂質を併用することも好ましい例である。但し、抗体又はリガンドを有する脂質の使用は本発明において必須ではない。抗体又はリガンドを有する脂質は、ＰＥＧ鎖を有する脂質であることも好ましい例である。例えば、それらの例として、抗体を連結した脂質、細胞膜透過性ペプチドを連結した脂質、インテグリンリガンドを連結した脂質、トランスフェリンを連結した脂質、葉酸を連結した脂質、糖リガンドを連結した脂質などを挙げることができる。
具体的には、下記の周知の抗体又はリガンドを有する脂質を用いることができる。細胞膜透過性ペプチドを連結した脂質としては、Journal of Controlled Release 143 (2010) 311-317に記載のＳＴＲ-Ｒ８（化合物４−１）が具体的に挙げられる。インテグリンリガンドを連結した脂質としては、Life Sciences, 58 (1996) 2263-2270に記載のＲＧＤ関連ペプチドを連結した脂質（化合物４−３、化合物４−４）やJournal of Controlled Release 153 (2011) 141-148に記載のＲＧＤｆＫを連結したＰＥＧ脂質（化合物４−５）、Journal of Controlled Release 160 (2012) 177-181に記載のＲＧＤｆＳを連結したＰＥＧ脂質（化合物４−６）などが具体的に挙げられる。葉酸を連結した脂質としては、Bioconjugate Chemistry, vol. 10, no. 2, pp. 289-298, 1999.に記載の葉酸を連結したＰＥＧ脂質（化合物４−７）が具体的に挙げられる。糖リガンドを連結した脂質としては、Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 94, 2266-2275 (2005)に記載されている（化合物４−８）などが具体的に挙げられる。
本発明において、抗体又はリガンドを有する脂質は、脂質粒子を構成する総脂質量（ステロール類を含む）の０．０１ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％であることが好ましく、０．０５ｍｏｌ％から７ｍｏｌ％であることがより好ましく、０．１ｍｏｌ％から５ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
化合物４−１
C17H35CO-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (STR-R8)
化合物４−２
Figure 2015007021
化合物４−３
Figure 2015007021
化合物４−４
Figure 2015007021
化合物４−５
Figure 2015007021
化合物４−６
Figure 2015007021
化合物４−７
Figure 2015007021
化合物４−８
Figure 2015007021
（ｇ）その他の構成成分
本発明の脂質粒子は、上記（ａ）〜（ｆ）に記載した構成成分以外の構成成分を、必要に応じて加えてもよい。そのような構成成分として、例えば、グリセロールエステル類、又は糖エステル類を挙げることができる。但し、グリセロールエステル類及び糖エステル類の使用は本発明において必須ではない。具体的な例としては、トリアルカノイルグリセロール、ジアルカノイルグリセロール、モノアルカノイルグリセロール、ショ糖エステル類などを挙げることができる。具体的には、トリオレオイルグリセロール（グリセリル トリオレート）、ジオレオイルグリセロール（グリセリル ジオレート）、モノオレオイルグリセロール、あるいはこれらの混合物を用いることができる。
本発明においてグリセロールエステル類又は糖エステル類を使用する場合、グリセロールエステル類又は糖エステル類は、脂質粒子を構成する総脂質量（グリセロールエステル類、糖エステル類、ステロール類を含む）の０．０１ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％であることが好ましく、１ｍｏｌ％から３５ｍｏｌ％であることがより好ましく、５ｍｏｌ％から３０ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。
（２）脂質粒子について
（ａ）脂質粒子の構造
本発明において、脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとしては、多重リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、巨大一枚膜リポソームなどの構造が知られているが、特に限定されるものではない。本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造（ラメラ構造）を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。脂質粒子としては、非リポソーム型のものが好ましく、脂質二分子膜構造（ラメラ構造）を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子が好ましい。
脂質粒子の形成は、電子顕微鏡観察やエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）や内水層を持つ構造やリポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）や内水層を持たず、粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有していることを確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。
（ｂ）脂質粒子の粒径
本発明の脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは２０ｎｍ〜６００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ〜５９０ｎｍであり、さらに好ましくは４０ｎｍ〜５６０ｎｍである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法（例えば、動的光散乱法など）により測定できる。
（３）脂質粒子の製造
本発明の脂質粒子は、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質およびステロール類を含む有機溶媒溶液と、核酸を含む溶液とを混合して、核酸と脂質との分散液を製造する工程、及び分散液から有機溶媒を除去する工程によって製造することができる。より具体的には、例えば、以下の方法により製造することができる。最初に、核酸の水溶液又は緩衝液と、脂質（１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、さらに必要に応じてＰＥＧ脂質、必要に応じて抗体又はリガンドを有する脂質などのその他の構成成分）を有機溶媒に溶かした脂質溶液を調製する。次に、上記で調製した核酸の水溶液又は緩衝液に対し、上記で調製した脂質溶液を攪拌下で加え、核酸と脂質の分散液を調製する。得られた分散液から有機溶媒を除去することにより、目的とする脂質粒子の分散液を調製することができる。得られた脂質粒子の分散液は、必要に応じてサイジングや濃縮を行うことができる。
（ａ）核酸の水溶液又は緩衝液の調製
本発明において、緩衝液のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ２からｐＨ１０の周知の緩衝液を用いることができる。ｐＨ２．５からｐＨ９の緩衝液が好ましく、ｐＨ３からｐＨ８．５の緩衝液が特に好ましい。また、用いる緩衝液は医薬的に許容される緩衝液が特に好ましい。核酸の水溶液、あるいは緩衝液には、脂質粒子の核酸以外の構成成分を必要に応じて添加しておいてもよい。核酸以外の構成成分を添加する場合、その構成成分が水溶性であることが好ましい。
（ｂ）脂質溶液の調製
本発明において、脂質溶液の調製に用いる有機溶媒は特に限定されないが、水溶性の有機溶媒が好ましく、アルコール類（例えば、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール等）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等）、エーテル類（例えば、テトラヒドロフラン）などが特に好ましい。
（ｃ）核酸の水溶液又は緩衝液と脂質溶液の混合
核酸の水溶液又は緩衝液と脂質溶液とを混合するためには、核酸の水溶液又は緩衝液に対し、脂質溶液を攪拌下において添加又は滴下すればよい、また、マイクロミキサーやマイクロ流路を用いて核酸の水溶液又は緩衝液と脂質溶液とを混合してもよい。混合の温度は特に限定されないが、０℃から８０℃の範囲が好ましく、５℃から７０℃の範囲がさらに好ましく、１０℃から６０℃の範囲が特に好ましい。
（ｄ）分散液からの有機溶媒の除去
核酸の水溶液又は緩衝液と脂質溶液との混合により得られた分散液からの有機溶媒の除去は、例えば、種々の透析による方法を使用できる。透析は透析膜を用いる一般的な方法を採用できる。そのカットオフ分子量は特に限定されないが、５０００から３００００のものが好ましく、１００００から２００００のものがさらに好ましい。透析液には、水や種々のｐＨの緩衝液を用いることができる。所望の透析液を用いて透析することにより、分散液を所望の目的にあった液に置換することができる。
（ｅ）サイジング
得られた脂質粒子は必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングには、槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理することにより、粒子径を小さくすることができる。
（ｆ）濃縮
得られた脂質粒子分散液は濃縮することができる。濃縮には種々の既知の方法を採用できる。例えば、限外ろ過膜を用いて濃縮する方法を採用できる。
（４）脂質粒子の利用
本発明の脂質粒子の一例としては、本発明の脂質粒子をインビトロで細胞に導入することによって、細胞に核酸（遺伝子）を導入することができる。
また、本発明の脂質粒子に含まれる核酸として、医薬用途を有する核酸を使用する場合には、本発明の脂質粒子は、核酸医薬として生体に投与することができる。
本発明の脂質粒子を核酸医薬として使用する場合には、本発明の脂質粒子は単独で、または薬学的に許容される投与媒体（例えば、生理食塩水又はリン酸緩衝液）と混合して、生体に投与することができる。薬学的に許容される担体との混合物中における脂質粒子の濃度は特に限定されず、一般的には０．０５質量％から９０質量％とすることができる。また、本発明の脂質粒子を含む核酸医薬には、薬学的に許容される他の添加物質、例えばpH調整緩衝剤、浸透圧調整剤などを添加してもよい。
本発明の脂質粒子を含む核酸医薬をインビボで投与する際の投与経路は特に限定されず、任意の方法で投与することができ、経口投与でもよいし、非経口投与（例えば、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与など）でもよい。本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、疾患部位に直接注射することにより投与することもできる。
非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および等張滅菌注射剤、懸濁化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、安定化剤又は保存料などの添加剤を適宜含めることができる。経口投与を行う場合には、本発明の脂質粒子は、適当な賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができるが、特にこれらに限定されない。
脂質粒子の投与量は、治療剤である核酸と総脂質との比、使用する核酸の種類、処置される疾患、並びに患者の年齢、体重および状態などに応じて適宜決定することができる。例えば、１回の投与当たりの脂質粒子の量としては、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜３００ｍｇの量で投与することができる。
（５）核酸送達キャリア及び核酸送達キャリア製造用組成物
上記した、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として含む脂質粒子によれば、標的細胞内で効率よく核酸本来の機能を発揮させることができる。これは、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、およびステロール類の組み合わせからなる組成物は、核酸送達キャリアとして有用であることを意味する。即ち、本発明によれば、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、およびステロール類を含む、核酸送達キャリアが提供される。本発明によればさらに、１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および有機溶媒を構成成分として含む核酸送達キャリア製造用組成物が提供される。１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、およびステロール類の具体例や好ましい例などは、本明細書中上記した通りである。また、核酸送達キャリア製造用組成物において使用する有機溶媒の具体例も、本明細書中上記の「（３）脂質粒子の製造」の「（ｂ）脂質溶液の調製」において記載した通りである。
本発明の核酸送達キャリアは、例えば、核酸と混合して、得られた脂質粒子を細胞にインビトロでトランスフェクションすることにより、細胞に核酸を導入することができる。即ち、本発明の核酸送達キャリアは、遺伝子導入試薬として有用である。また、上記した通り、本発明の核酸送達キャリアは、核酸医薬における核酸送達キャリアとしても有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
本発明において、ＤＯＰＥ（1，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓ，ｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＥ８１８１ ＮＯＦ製 （登録商標）、ＤＰＰＥ（1，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓ，ｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＥ6060 ＮＯＦ製 （登録商標）、ＤＬｏＰＥ（1，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓ，ｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＥ6060 ＮＯＦ製 （登録商標）、Ｄ(Ｐｈｙ)ＰＥ（1，２−Ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−ｓ，ｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）は、 Ａｖａｎｔｉ製、コレステロールは、Ｗａｋｏ製を用いた。
合成例１：化合物１−５の合成
ＤＰＰＥ ６９２ｍｇ、Ｂｏｃ-Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）-ＯＳｕ（Ｂａｃｈｅｍ製）６８０ｍｇ、トリエチルアミン(Ｗａｋｏ製) ３０３ｍｇをクロロホルム２０ｍＬに溶解し、６時間攪拌した後、減圧で濃縮、乾燥させた。残留物に水を加えて懸濁液にした後、透析、凍結乾燥して白色粉体６７６ｍｇを得た。得られて白色粉体を３０ｍＬのジオキサンに溶解し、同量の４Ｍ−塩酸のジオキサン溶液を加えて１５分攪拌した。次に、６０度まで加温し、冷却して得られた白色個体をろ過により集め、６３１ｍｇの化合物１−５（塩酸塩）を得た。
ＦＡＢ-ＭＳ ８２８．６（Ｍ＋Ｈ）＋
合成例２：化合物１−７の合成
ＤＯＰＥ １．４９ｇ、Ｂｏｃ-Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）-ＯＳｕ（Ｂａｃｈｅｍ製）１．３６ｇ、トリエチルアミン(Ｗａｋｏ製) ０．６１ｇをクロロホルム４０ｍＬに溶解し、一昼夜攪拌した。反応液を０％クエン酸水溶液で洗浄した後、飽和炭酸水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応液を減圧下で濃縮、乾燥させて得られて無色シロップを３０ｍＬのジオキサンに溶解し、同量の４Ｍ−塩酸のジオキサン溶液を加えて１時間攪拌した。次に、反応液を減圧下で濃縮、乾燥させて得られた残留物に水を加えて懸濁液にした後、透析、凍結乾燥して白色粉体として０．９６ｇの化合物１−７（塩酸塩）を得た。
ＦＡＢ-ＭＳ ８８１．４（Ｍ＋Ｈ）＋
合成例３：化合物４−５の合成
１ｍｇのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＧＳ（ＮＯＦ製、登録商標）と１ｍｇのｃ（ＲＧＤｆＫ）（Ｂａｃｈｅｍ製）を０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して二日間攪拌した。反応液を、透析、凍結乾燥して白色粉体として約１ｍｇの化合物４−５を得た。目的物の生成はＴＯＦ−ＭＳにより、分子量が４６７増加していることで確認した。
合成例４：化合物４−６の合成
２５ｍｇのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ（ＮＯＦ製、登録商標）１ｍＬの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、５ｍｇのｃ（ＲＧＤｆＣ）（Ｂａｃｈｅｍ製）を１ｍＬの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した液を室温で一日間攪拌した。反応液を、透析、凍結乾燥して白色粉体として２２ｍｇの化合物４−６を得た。目的物の生成はＴＯＦ−ＭＳにより、分子量が５５６増加していることで確認した。
実施例１：脂質粒子の調製（Ａ法）
０．５ｍｇのｓｉＲＮＡを溶解した１００ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７）０．１ｍＬに総脂質濃度が平均分子量で６５ｍＭになるように調製した脂質アルコール溶液１．２７ｍＬを攪拌下で加えた後、滅菌水１．６５ｍＬを加えた。得られたsiRNA、脂質の分散液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２（登録商標）を用いて１００ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７）で透析を行い、目的とする脂質粒子分散液を得た。
ここでｓｉＲＮＡは以下の配列のものを用いた。また、脂質アルコール溶液としては以下の表１に示す組成を有するＡ−１〜Ａ−１１を使用した。
siRNA 1
5’-GUUCAGACCACUUCAGCUUTT-3’ (sense) （配列番号１）
5’-AAGCUGAAGUGGUCUGAACTT-3’ (antisense)（配列番号２）
Figure 2015007021
実施例２：脂質粒子の調製（Ｂ法）
０．５ｍｇのsiRNAを溶解した滅菌水０．１ｍＬに総脂質濃度が平均分子量で６５ｍＭになるように調製した脂質アルコール溶液１．２７ｍＬを攪拌下で加えた後、滅菌水１．６５ｍＬを加えた。得られたsiRNA、脂質の分散液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２（登録商標）を用いて水で透析を行い、目的とする脂質粒子分散液を得た。
ここでsiRNAは以下の配列のものを用いた。また、脂質アルコール溶液としては以下の表２に示す組成を有するＢ−１〜Ｂ−４を使用した。
siRNA 1
5’-GUUCAGACCACUUCAGCUUTT-3’ (sense) （配列番号１）
5’-AAGCUGAAGUGGUCUGAACTT-3’ (antisense)（配列番号２）
Figure 2015007021
実施例３：脂質粒子の調製（Ｂ法）
グリセロール オレイン酸エステル ＮＩＫＫＯＬ ＤＧＯ−８０（日光ケミカルズ製、登録商標）を構成成分として含む脂質粒子（試料Ｎｏ．Ｃ−１）、およびショ糖オレイン酸エステル Ｏ−１７０（三菱化学フーズ製、登録商標）を構成成分として含む脂質粒子（試料Ｎｏ．Ｃ−２）は実施例２の方法により調製した。
Figure 2015007021
実施例４：Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により脂質粒子の確認
本発明の脂質粒子（試料Ｎｏ．Ａ−２、試料Ｎｏ．Ｂ−４）のＣｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察を行った。Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察に関しては、International Journal of Pharmaceutics、４１７（２０１１）、１２０−１３７に記載されている。本観察により、試料Ｎｏ．Ａ−２及び試料Ｎｏ．Ｂ−４の脂質粒子は、脂質二分子膜構造（ラメラ構造）や内水層を持たず、粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから脂質をはじめとする構成成分が詰まった脂質粒子であることを確認した。
実施例５：粒径の測定
脂質粒子の粒径は、脂質粒子分散液を水、または用いた緩衝液に１０〜５０倍の範囲で希釈して大塚電子株式会社のゼータ電位・粒径測定システムを用いて測定した。
実施例６：細胞における標的ｍＲＮＡ産生抑制率の評価
（１）脂質粒子の細胞へのトランスフェクション
0.9×103個のTOV112D細胞（ヒト卵巣癌細胞株）を播種した２４穴プレートに対し、翌日、培地を２００μＬのOpti-MEM（登録商標）に交換した。次に、処理濃度の3倍濃度になるようにOpti-MEM（登録商標）で希釈した１００μＬの脂質粒子分散液を２４穴プレートに添加した（全液量300μｌ）。その後、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間から４８時間培養した。また、陽性対照としては脂質粒子分散液の代わりにlipofectamine 2000 （登録商標）を使用して上記と同様の実験を行った。
（２）全RNA抽出
培養後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社、登録商標)を用いて細胞から全RNAを抽出した。抽出後の全RNA濃度の吸光度を測定後、RNA濃度が５ｎｇ／μLとなるようにRNase free水で希釈した。
（３）定量PCR反応
逆転写反応とPCR反応はQUANTIFAST PROBE RTPCR KIT(QIAGEN社、登録商標)を用いて行った。用いたsiRNA遺伝子に対するプライマー/プローブはTaqMan Gene expression assay(ABI、登録商標)を使用し、Mx3000P（アジレント・テクノロジー株式会社、登録商標）を用いて定量PCRを実施した。ＰＣＲのコンディションは５０℃、３０分、９５℃、１５分, ９４℃ １５秒, ６０℃ ３０秒 (40 サイクル)とした。内部標準はTaqMan Encogeneous Control Human ACTB(ABI、登録商標)を使用した。得られたデータはΔΔCT法を用いTransfection未処理に対する相対定量でmRNA産生抑制率として算出した。
表１に示す試料Ｎｏ．Ａ−１〜Ａ−１１及びlipofectamine 2000（登録商標）を使用した場合におけるmRNA産生抑制率を表４に示す。
表２に示す試料Ｎｏ．Ｂ−１〜Ｂ−４及びlipofectamine 2000（登録商標）を使用した場合におけるmRNA産生抑制率を表５に示す。
表３に示す試料Ｎｏ．Ｃ−１及びＣ−２、並びにlipofectamine 2000（登録商標）を使用した場合におけるmRNA産生抑制率を表６に示す。
Figure 2015007021
Figure 2015007021
Figure 2015007021
比較例１：比較例となる脂質粒子の調製（Ｂ法）
実施例２に記載した方法と同様にして、表７に示す脂質組成を有する脂質粒子を比較例として調製した。試料Ｎｏ．Ｄ−１及びＤ−２は、「１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環置換基を有するリン脂質」を含まない脂質粒子である。
Figure 2015007021
比較例２：細胞における標的ｍＲＮＡ産生抑制率の評価
実施例６に記載した方法と同様にして、「１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環置換基を有するリン脂質」を含まない脂質粒子の細胞における標的ｍＲＮＡ産生抑制率を比較例として評価した。結果を表８に示す。
「１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環置換基を有するリン脂質」を含まない脂質粒子ではsiRNAの濃度依存的な標的ｍＲＮＡ産生抑制を示さなかった。
Figure 2015007021
上記の結果から、「１以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環置換基を有するリン脂質」を含む本発明の脂質によれば、細胞外(血中)で核酸分子を安定に保持することができ、かつエンドソームから脱出して、速やかに細胞質中で核酸を放出して標的細胞内で効率よく核酸本来の機能を発揮させることができることが分かる。
実施例７：脂質粒子の細胞毒性
処理前日に1.0×104個のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を９６穴プレートに播種した（培地量100μl/穴）。５％ＣＯ２インキュベーター内で１２時間以上培養後、培地を５０μｌ除去した。脂質粒子は終濃度の２倍濃度になるようにOPTI-MEMにて希釈を行い、この希釈液を５０μｌ/穴で添加後、５％ＣＯ２インキュベーター内でさらに２４時間
培養した。
２４時間培養後の細胞生存性と障害性はMultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay(Promega)により評価した。生細胞由来プロテアーゼ活性はインフィニットｓ200(Tecan)を用いλex/λem=405nm/488nmで測定し、死細胞由来プロテアーゼ活性はEnvision(PerkinElmer)を用い測定した。IC50またはEC50はGraphPad Prism5.0を用いて算出した。
化合物1−７／ＤＯＰＥ／コレステロール／化合物４−５＝２０／４０／４０／０．１の組成で、実施例２に従って調製した脂質粒子を用いて、細胞毒性を評価した。細胞毒性の評価結果を表９に示す。
Figure 2015007021
表９に示すように遺伝子導入試薬であるリポフェクタミン２０００（登録商標）と比較して、本発明のキャリアは細胞毒性が低いことがわかる。

Claims (18)

  1. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および核酸を構成成分として含む脂質粒子。
  2. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質が、１以上のアミノ基と１以上のイミダゾリル基を有するリン脂質である、請求項１に記載の脂質粒子。
  3. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質が、ヒスチジンのカルボキシル基とアミノ基を持つリン脂質のアミノ基が結合した構造を有する請求項１又は２に記載の脂質粒子。
  4. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基を有するリン脂質が、下記一般式（Ｉ）で表される脂質又はその塩である、請求項１から３の何れか１項に記載の脂質粒子。
    一般式（Ｉ）
    Figure 2015007021
     （一般式（Ｉ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。ＷとＶは、それぞれ独立して単結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、又はこれらの組み合わせからなる連結基を示す。Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のヒドロキシアルキル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基、炭素数１から４のアミノアルキル基、炭素数１から４のグアニジノアルキル基、炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示す。Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基を示す。ｎが１の場合、Ｒ５とＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｎが２から４の整数の場合、一般式（Ｉ）に含まれる複数のＲ５と複数のＲ６の内の少なくとも一つはアミノ基を示す。ｌは２から４の整数、ｍは０から４の整数、ｎは１から４の整数を示す。）
  5. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質が、下記一般式（ＩＩ）又は下記一般式（ＩＩＩ）で表される脂質あるいはそれらの塩である、請求項１から４の何れか１項に記載の脂質粒子。
    一般式（ＩＩ）
    Figure 2015007021
     （一般式（ＩＩ）において、Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
    一般式（ＩＩＩ）
    Figure 2015007021
     （一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ３は炭素数１から４のヒドロキシアルキル基又は炭素数４から７のイミダゾリルアルキル基を示す。Ｘは酸素原子または硫黄原子、Ｙは疎水基を示す。）
  6. 含窒素複素環基を含まない中性脂質がホスファチジルエタノールアミン類である、請求項１から５の何れか１項に記載の脂質粒子。
  7. 含窒素複素環基を含まない中性脂質が、その相転移点が０℃以下のホスファチジルエタノールアミン類である、請求項１から６の何れか１項に記載の脂質粒子。
  8. ステロール類がコレステロールである、請求項１から７の何れか１項に記載の脂質粒子。
  9. ポリエチレングリコール含有脂質をさらに含む，請求項１から８の何れか１項に記載の脂質粒子。
  10. 抗体又はリガンドを有する脂質をさらに含む、請求項１から９の何れか１項に記載の脂質粒子。
  11. 抗体又はリガンドを有する脂質が、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質である、請求項１０に記載の脂質粒子。
  12. 核酸がｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項１から１１の何れか１項に記載の脂質粒子。
  13. 非リポソーム型である、請求項１から１２の何れか１項に記載の脂質粒子。
  14. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、およびステロール類を含む、核酸送達キャリア。
  15. 遺伝子導入試薬として使用するか、又は核酸医薬における核酸送達キャリアとして使用する請求項１４に記載の核酸送達キャリア。
  16. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質、ステロール類、および有機溶媒を構成成分として含む核酸送達キャリア製造用組成物。
  17. １以上のアミノ基と１以上の含窒素複素環基とを有するリン脂質、含窒素複素環基を含まない中性脂質およびステロール類を含む有機溶媒溶液と、核酸を含む溶液とを混合して、核酸と脂質との分散液を製造する工程、及び分散液から有機溶媒を除去する工程を含む、請求項１から１３の何れか１項に記載の脂質粒子の製造方法。
  18. 請求項１から１３の何れか１項に記載の脂質粒子をインビトロで細胞に導入する工程を含む、細胞への遺伝子導入方法。
JP2013133620A 2013-06-26 2013-06-26 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法 Active JP5914418B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013133620A JP5914418B2 (ja) 2013-06-26 2013-06-26 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法
US14/314,873 US9540638B2 (en) 2013-06-26 2014-06-25 Lipid particle, nucleic acid transfer carrier, compound for manufacturing nucleic acid transfer carrier, method for manufacturing lipid particle, and gene transfer method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013133620A JP5914418B2 (ja) 2013-06-26 2013-06-26 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2015007021A true JP2015007021A (ja) 2015-01-15
JP5914418B2 JP5914418B2 (ja) 2016-05-11

Family

ID=52115958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013133620A Active JP5914418B2 (ja) 2013-06-26 2013-06-26 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9540638B2 (ja)
JP (1) JP5914418B2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023021715A1 (ja) * 2021-08-17 2023-02-23 国立大学法人大阪大学 糖誘導体および糖－核酸コンジュゲート体

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808131B (zh) * 2019-04-11 2021-09-17 中国科学院大连化学物理研究所 一对有效抑制Aβ(1-40)聚集和纤维化的手性磷脂分子及其制备方法和应用
WO2023198085A1 (zh) * 2022-04-12 2023-10-19 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种含有叔胺的氮支化非线性聚乙二醇化脂质及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143193A (ja) * 1984-07-25 1986-03-01 チバ‐ガイギー　アクチエンゲゼルシヤフト ホスフアチジル化合物及びその製造方法並びにこの化合物を含有する医薬
JPH02500360A (ja) * 1986-07-28 1990-02-08 リポソーム　テクノロジー，インコーポレイテッド 粘膜組織上での高い保持力を有するリポソーム
JPH11507815A (ja) * 1995-06-07 1999-07-13 ジンタ・インコーポレイテッド ホスホン酸基本カチオン性脂質
JP2004331630A (ja) * 2003-05-12 2004-11-25 Nippon Fine Chem Co Ltd Ｐｅｇ結合ペプチド
WO2008056623A1 (fr) * 2006-11-09 2008-05-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Composition pour l'introduction d'acide nucléique
WO2009125858A1 (ja) * 2008-04-07 2009-10-15 大鵬薬品工業株式会社 ２－インドリノン誘導体を含有する脂質分散体製剤
WO2010026621A1 (ja) * 2008-09-02 2010-03-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ポリカチオン化リン脂質誘導体
JP2010540559A (ja) * 2007-09-28 2010-12-24 エスデイージー・インコーポレーテツド 経口的に生物学的に利用可能な脂質ベースの構築物
JP2012509272A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 核酸送達系のための放出性カチオン脂質

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4804539A (en) * 1986-07-28 1989-02-14 Liposome Technology, Inc. Ophthalmic liposomes
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143193A (ja) * 1984-07-25 1986-03-01 チバ‐ガイギー　アクチエンゲゼルシヤフト ホスフアチジル化合物及びその製造方法並びにこの化合物を含有する医薬
JPH02500360A (ja) * 1986-07-28 1990-02-08 リポソーム　テクノロジー，インコーポレイテッド 粘膜組織上での高い保持力を有するリポソーム
JPH11507815A (ja) * 1995-06-07 1999-07-13 ジンタ・インコーポレイテッド ホスホン酸基本カチオン性脂質
JP2004331630A (ja) * 2003-05-12 2004-11-25 Nippon Fine Chem Co Ltd Ｐｅｇ結合ペプチド
WO2008056623A1 (fr) * 2006-11-09 2008-05-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Composition pour l'introduction d'acide nucléique
JP2010540559A (ja) * 2007-09-28 2010-12-24 エスデイージー・インコーポレーテツド 経口的に生物学的に利用可能な脂質ベースの構築物
WO2009125858A1 (ja) * 2008-04-07 2009-10-15 大鵬薬品工業株式会社 ２－インドリノン誘導体を含有する脂質分散体製剤
WO2010026621A1 (ja) * 2008-09-02 2010-03-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ポリカチオン化リン脂質誘導体
JP2012509272A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 核酸送達系のための放出性カチオン脂質

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023021715A1 (ja) * 2021-08-17 2023-02-23 国立大学法人大阪大学 糖誘導体および糖－核酸コンジュゲート体

Also Published As

Publication number Publication date
US20150004695A1 (en) 2015-01-01
US9540638B2 (en) 2017-01-10
JP5914418B2 (ja) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022519557A (ja) 脂質ナノ粒子の調製方法
US20210369862A1 (en) Therapeutic nanoparticles and methods of use thereof
EP3733647B1 (en) Cationic lipid
US20210169804A1 (en) Nanomaterials
US20210230112A1 (en) Nanomaterials
AU2018359904B2 (en) Fusogenic compounds for delivery of biologically active molecules
JP5914418B2 (ja) 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法
JP5931212B2 (ja) 弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソーム
US9974862B2 (en) Lipid particles and nucleic acid delivery carrier
JP6388700B2 (ja) 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア
JP6495995B2 (ja) 脂質粒子および核酸送達キャリア
US20170121714A1 (en) Method for producing lipid particles and nucleic acid delivery carrier having lipid particles
RU2808990C2 (ru) Фузогенные соединения для доставки биологически активных молекул
WO2024035932A1 (en) Lyophilized nanoparticle compositions and methods of use thereof
JP2020079303A (ja) リポソーム及びリポソーム組成物
WO2023116804A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN117982460A (zh) 一种球棍状脂质纳米颗粒的制备及应用
CN117460537A (zh) 核酸递送

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150203

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20151117

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160114

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160329

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160404

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5914418

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250