CN111808131B - 一对有效抑制Aβ(1-40)聚集和纤维化的手性磷脂分子及其制备方法和应用 - Google Patents
一对有效抑制Aβ(1-40)聚集和纤维化的手性磷脂分子及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一对有效抑制Aβ(1‑40)聚集和纤维化的手性磷脂分子及其制备方法和应用。采用的方法是：一对手性氨基酸的氨基基团与特定磷脂分子的亲水端羧基基团进行缩合反应；通过挤出法将这对手性磷脂分子加工成手性磷脂囊泡；将手性磷脂囊泡与Aβ(1‑40)单体共同孵育，检测其对Aβ(1‑40)单体的聚集和纤维化的抑制效果。本发明不仅设计和制备了一对手性氨基酸修饰的磷脂分子，而且为研究生物膜的分子手性与淀粉样蛋白聚集之间的关系提供了新的视角，揭露了手性氨基酸修饰的磷脂可用于预防阿兹海默病的潜力。这对生物、化学和材料学领域都有着十分重要的理论和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及材料化学、生物化学和有机化学领域。具体涉及了一种手性氨基酸修饰的磷脂分子及其制备方法及其在与阿兹海默病(AD)相关的Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化方面抑制作用的应用。
背景技术
阿兹海默病(AD)，又被称为“老年痴呆症”，是老年人群体高发的典型神经退行性疾病。近年来，病发人群的年龄不断降低，预计到2050年，全球AD患者的人数将超过1亿人，逐渐成为威胁现代社会的主要疾病之一。AD的特征在于人脑的广泛功能性紊乱，表现为记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。它的主要病理标志是细胞外淀粉样斑块和细胞内神经元纤维缠结的积累。其中，斑块主要由39-43个氨基酸的β淀粉样多肽(Aβ)组成，研究证实Aβ向淀粉样蛋白原纤维的聚集是AD发病机制中的关键步骤。因此，抑制Aβ聚集是预防AD的有效方法。
越来越多的证据表明，分子表面特别是生物膜在蛋白淀粉样变过程中起到至关重要的作用，这启发我们研究界面对该过程产生的影响。从化学的角度来看，生物膜是由磷脂双分子层组成的，目前的研究更多的是关注磷脂膜结构(如组成、亲疏水性、电荷等)对蛋白淀粉样变过程的影响，这显然忽视了磷脂分子典型的手性特征的作用。针对于此，现已存在多种由人工材料构建的手性表面，例如石墨烯、金纳米粒子、硅等，初步推断氨基酸手性可能影响Aβ的纤维化过程。然而，这类人工材料手性表面与生命体内真实的生物膜表面大相径庭，并不能代表真正的生物膜手性效应，因此研究分子手性影响真实磷脂膜表面上的淀粉样变过程十分重要。生物膜主要是由磷脂分子组成的，天然磷脂是具有亲水性头部和疏水性尾部的两亲性分子，并且强烈地倾向于L-磷脂。
据我们所知，细胞膜表面覆盖有各种各样的手性生物分子，例如氨基酸、肽、蛋白质和聚糖，它们或插入到磷脂双分子层中，或修饰在磷脂分子上。其中，氨基酸是与生命活动有关的最基本的物质。构成生物体的氨基酸几乎是左旋的，但已经在各种高等生物体中检测到D-氨基酸的存在，并且L-氨基酸可以在异构酶的存在下转化为相应的D-氨基酸。值得注意的是，D-天门冬氨酸(Asp)在神经和神经内分泌系统中发挥着至关重要的作用，它与AD的发展密切相关。这启发我们从结构化学的角度，通过L-/D-Asp的氨基基团与1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)的羧基基团进行缩合反应的方法，设计并制备出一对具有L-和D-手性的磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)，并且当自组装的L-或D-Asp-DPPE囊泡与Aβ(1-40)单体共同孵育时，观察到手性磷脂表面对Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程存在显著的抑制效果。本发明不仅设计和制备了一对手性氨基酸修饰的磷脂分子，而且为研究生物膜的分子手性与淀粉样蛋白形成之间的关系提供了新的视角，揭露了手性氨基酸修饰的磷脂可用于预防AD的潜力。结合磷脂自身优异的生物相容性，这将会在生物疾病防治和结构生物学等领域有着巨大的应用价值和前景。
发明内容
本发明旨在设计和制备一对具有手性特征的磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)，采用的方法是手性氨基酸(L-/D-Asp)的氨基基团与特定磷脂分子(DPPE)的亲水端羧基基团进行缩合反应。通过挤出法将这对手性磷脂分子加工成手性磷脂囊泡后，形成的手性磷脂表面能够强烈抑制与阿兹海默病密切相关的Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程，该对手性磷脂分子可被用于抑制阿兹海默病的有效分子。本发明提供一对对与阿兹海默病相关的Aβ(1-40)单体聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子及其制备方法和应用。
本发明目的采用下述方案来实现：
一对手性磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)，其特征在于，具有附图1所示的分子结构。本发明的一对手性磷脂分子的制备方法：利用缩合反应机制，将手性氨基酸的氨基与磷脂分子的亲水端羧基脱水缩合。然后将其加工成手性磷脂囊泡，应用于抑制与阿兹海默病密切相关的Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化。
一对对Aβ(1-40)聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子分子结构如下：
一对对Aβ(1-40)聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的制备方法，该制备方法利用氨基与羧基的缩合反应机制，将一对手性氨基酸分别连接到磷脂分子的亲水端，具体步骤如下：
(1)圆底烧瓶中依次加入Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶，再加入氯仿，将反应体系加热并搅拌过夜；
(2)将上述反应体系冷却至室温，通过旋转蒸发仪除去溶剂，并用硅胶柱纯化残余物，得到粗产物；
(3)将步骤(2)得到的粗产物溶于哌啶和氯仿的混合溶剂中，在室温下搅拌1小时后通过旋转蒸发仪除去溶剂得到残余物；其中哌啶和氯仿的体积比为1：4；
(4)将步骤(3)得到的残余物溶于三氟乙酸、三异丙基硅烷和纯水的混合溶剂中，在室温下搅拌1小时后通过氮气流吹走溶剂，其中三氟乙酸、三异丙基硅烷和纯水的体积比为95：2.5：2.5；
(5)将粗产物再次通过硅胶柱纯化，得到一对手性氨基酸修饰的磷脂分子。
所述反应物Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶的添加量的摩尔比为1：0.5-1.5：2-3：2-3：2-3。
所述步骤(2)和步骤(5)中的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为25：1。
一对手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，可应用于抑制与阿兹海默病相关的Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程。将手性氨基酸修饰的磷脂分子加工成手性磷脂囊泡，与Aβ(1-40)单体共同孵育，然后使用全功能微孔板检测仪观察Aβ(1-40)的聚集和纤维化情况。
具体操作过程如下
1)将手性氨基酸修饰的磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)分别与未修饰的磷脂分子(DPPE)混合，溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，超声至完全溶解后用旋转蒸发仪除去溶剂，在烧瓶底部形成一层透明薄膜，之后向烧瓶中加入缓冲液使干燥的脂质膜再水化，并将多层囊泡悬浮液通过小型挤出机挤出，得到单层手性磷脂囊泡；
2)将Aβ(1-40)多肽粉末溶解在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，震荡后用氮气吹干溶液，之后将Aβ(1-40)重新溶解在二甲基亚砜中，并用缓冲液稀释至所需浓度；
3)将手性磷脂囊泡与Aβ(1-40)单体共同孵育，并加入荧光分子(硫黄素T)，加注于96孔板中，通过全功能微孔板检测仪观察Aβ(1-40)的聚集和纤维化情况。
所述步骤1)中L-/D-Asp-DPPE与DPPE的质量比为1：1，二氯甲烷和甲醇的体积比为2：1，缓冲液为磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，50mM)，其中溶剂为去离子水，水化温度为70℃并不断搅拌，单层手性磷脂囊泡浓度为1mg/mL，挤出机的滤膜尺寸为100nm，并循环挤出19次。
所述步骤2)中Aβ(1-40)在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中的浓度为1mg/mL，震荡时间为1-2小时，震荡速率为500r/min，氮气吹扫轻柔，Aβ(1-40)在二甲基亚砜中的浓度为2.3mM，缓冲液为磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，50mM)，其中溶剂为去离子水。
所述步骤3)中手性磷脂囊泡的浓度为1mg/mL，Aβ(1-40)的浓度为50μM，二者按照体积比1：1混合，硫黄素T的浓度为25μM，96孔板为黑色底部透光，孵育温度为37℃。
采用全功能微孔板检测仪观察Aβ(1-40)的聚集和纤维化情况时，直观看到的是荧光强度的变化，采用底部读取模式，数据间隔为10分钟，每次检测之前先振板2秒，激发和发射波长分别为445nm和485nm。
本发明的有益效果为：
1、本发明制备的一对手性氨基酸修饰的磷脂分子，对Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程具有显著的抑制效果，可拓展到对其他β-淀粉样蛋白的手性作用。
2、本发明制备的一对手性氨基酸修饰的磷脂分子，通过挤出法将这对手性磷脂分子加工成手性磷脂囊泡后，因其具备亲水区和疏水区，可用作水溶性药物和水不溶性药物的包覆材料进行药物运输。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1.手性氨基酸修饰的磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)结构示意图。
图2.手性磷脂囊泡的示意图。
图3.手性磷脂囊泡的AFM图像。
图4.硫黄素T监测的Aβ(1-40)纤维化动力学曲线。
图5.Aβ(1-40)单独孵育后的AFM图像。
图6.Aβ(1-40)与L-Asp-DPPE囊泡孵育后的AFM图像。
图7.Aβ(1-40)与D-Asp-DPPE囊泡孵育后的AFM图像。
图8.Aβ(1-40)的CD光谱变化曲线。
图9.手性磷脂单分子层形成过程示意图和QCM吸附曲线，手性磷脂单分子层对Aβ(1-40)单体的QCM吸附曲线。
图10.Aβ(1-40)单体与D-Asp-DPPE表面相互结合的传感图，不同浓度Aβ(1-40)单体与L-/D-Asp-DPPE表面的亲和力拟合曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中所用原料及设备：Aβ-淀粉样蛋白(1-40)(Aβ(1-40))由上海杰肽生物科技有限公司购得。L-天冬氨酸(L-Asp)，D-天冬氨酸(D-Asp)，Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)，Fmoc-D-天冬氨酸-4-叔丁酯(Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH)，1-羟基苯并三唑(HOBT)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·I)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)由吉尔生化(上海)有限公司购得。1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，1-十八烷硫醇和硫黄素T由阿拉丁试剂(上海)有限公司购得。氯仿，二氯甲烷，甲醇，乙醇，三氟乙酸(TFA)，哌啶，三异丙基硅烷(Tis)，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，氢氧化钠，磷酸二氢钠二水合物，磷酸氢二钠十二水合物，过氧化氢，氢氧化铵，二甲基亚砜(DMSO)均使用色谱纯。荧光数据由Biotek SynergyTM H1M多功能微孔板测试仪获得。圆二色谱(CD)数据由MOS-450CD光谱仪记录。石英晶体微天平(QCM)吸附数据由Q-Sense E4系统检测。原子力显微镜(AFM)形貌数据由JPK NanoWizard UltraSpeed AFM获得。表面等离子共振(SPR)结合数据由Biacore T200生物传感器系统获得。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
手性氨基酸修饰的磷脂分子的制备
手性氨基酸修饰的磷脂分子(L-/D-Asp-DPPE)的结构如图1所示。以L-Asp-DPPE为例，反应物Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶的添加量的摩尔比为1：1：2.5：2.5：2.5；在干燥的100mL圆底烧瓶中依次加入1mmol Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)(410mg)，1mmol 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)(690mg)，2.5mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·I)(480mg)，2.5mmol 1-羟基苯并三唑(HOBT)(340mg)和2.5mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)(305mg)，然后加入50mL氯仿。将反应体系加热至50℃并搅拌过夜。反应结束后，待反应体系冷却至室温，通过旋转蒸发仪除去溶剂，并用硅胶柱纯化残余物，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(25：1v/v)。将收集的粗产物溶于哌啶和氯仿(1：4v/v)的混合物中，在室温下搅拌1小时以脱除Fmoc保护基，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂。将三氟乙酸，三异丙基硅烷和纯水(95：2.5：2.5v/v/v)加入到残余物中并在相同条件下搅拌以脱除OtBu保护基团，通过氮气流除去溶剂。最后，将粗产物再次通过硅胶柱纯化，得到L-Asp-DPPE，结构式如图1所示。
实施例2
手性磷脂囊泡的制备
手性磷脂囊泡的示意图如图2所示。以L-Asp-DPPE为例，在干燥的25mL圆底烧瓶中加入等质量的L-Asp-DPPE和DPPE，加入氯仿和甲醇(2：1v/v)的混合溶剂，超声至完全溶解后用旋转蒸发仪除去溶剂，在烧瓶底部形成一层透明薄膜。向圆底烧瓶中加入磷酸盐缓冲液，浓度为1mg/mL，升温到70℃搅拌1小时得到多层囊泡悬浮液。然后，通过小型挤出机进行19次循环挤出得到直径为100nm左右的单层手性囊泡，存于-4℃且保质期为一周。图3为制备的手性磷脂囊泡的AFM图像。
实施例3
Aβ(1-40)单体溶液的制备
将Aβ(1-40)多肽粉末溶解在HFIP中，浓度为1mg/mL。在室温下中速震荡2小时后，用轻柔的氮气吹干溶液以除去HFIP。之后将Aβ(1-40)重新溶解在DMSO中，初始浓度为2.3mM，储存在-20℃备用。使用前，用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，50mM)稀释至所需浓度。
实施例4
通过全功能微孔板检测仪观察L-/D-Asp-DPPE对Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程的影响。按实施例1-3所述方法，将L-/D-Asp-DPPE囊泡(0.5mg/mL)分别与Aβ(1-40)单体(25μM)在37℃下共同孵育，并使用硫磺素T(25μM)标记Aβ(1-40)实时观察荧光强度的变化。图4显示了硫黄素T监测的Aβ(1-40)的纤维化动力学过程，即L-/D-Asp-DPPE能够显著抑制Aβ(1-40)单体的纤维化。图5-7为Aβ(1-40)与L-/D-Asp-DPPE囊泡孵育后扫描的AFM图像。
实施例5
通过CD记录L-/D-Asp-DPPE对Aβ(1-40)从α-螺旋到β-折叠构象转变的影响。按实施例1-3所述方法，将L-/D-Asp-DPPE囊泡(0.5mg/mL)分别与Aβ(1-40)单体(25μM)在37℃下共同孵育，记录初始状态并每隔24小时记录一次。图8显示了Aβ(1-40)的CD光谱随时间的变化曲线，即L-/D-Asp-DPPE能够显著延缓Aβ(1-40)从α-螺旋到β-折叠的构象转变。
实施例6
通过QCM吸附量测定的方法，以评价这对手性磷脂分子对Aβ(1-40)单体的吸附行为。按实施例1-3所述方法，首先将QCM的裸金片在1mM正十八烷基硫醇的乙醇溶液中浸泡12小时形成疏水单层，然后在25℃条件下分别吸附1mg/mL的L-/D-Asp-DPPE囊泡得到自组装磷脂单层膜，再分别吸附25μM的Aβ(1-40)单体。图9显示L-/D-Asp-DPPE囊泡的吸附量一致，表示形成了一致的单层磷脂膜；并且这两种手性磷脂膜对Aβ(1-40)单体均具有一定的吸附能力。
实施例7
通过SPR亲和力测定的方法，以评价这对手性磷脂分子与Aβ(1-40)单体的亲和力大小。按实施例1-3所述方法，首先将传感器裸金片在1mM正十八烷基硫醇的乙醇溶液中浸泡12小时形成疏水单层，然后在25℃条件下分别吸附1mg/mL的L-/D-Asp-DPPE囊泡得到自组装磷脂单层膜，再依次吸附不同浓度的Aβ(1-40)单体(1.56，3.12，6.25，12.5，25，50和75μM)。图10显示L-/D-Asp-DPPE表面对Aβ(1-40)单体均具有一定的结合能力。
综上所述，本发明设计和制备的一对具有手性特征的磷脂分子对于与阿兹海默病密切相关的β-淀粉样蛋白Aβ(1-40)单体的聚集和纤维化过程显示出强烈的抑制效果，因此可被用于抑制阿兹海默病的有效生物分子。鉴于该对手性磷脂分子加工成手性磷脂囊泡后同时具备亲水区域和疏水区域，因此可用作水溶药物和水不溶药物的运输载体。另外，这种分子结构设计的思路有望合成制备出更具生物效应和医学效应的分子，拓展到其他类型的疾病，对于疾病的早期预防等更具意义。
Claims (10)
1.一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子，其特征在于：所述手性氨基酸修饰的磷脂分子具有如下分子结构：
2.一种如权利要求1所述一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的制备方法，其特征在于：该制备方法利用氨基与羧基的缩合反应机制，将一对手性氨基酸分别连接到磷脂分子的亲水端，具体步骤如下：
(1)圆底烧瓶中依次加入Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶，再加入氯仿，将反应体系加热并搅拌过夜；
(2)将上述反应体系冷却至室温，通过旋转蒸发仪除去溶剂，并用硅胶柱纯化残余物，得到粗产物；
(3)将步骤(2)得到的粗产物溶于哌啶和氯仿的混合溶剂中，在室温下搅拌1小时后通过旋转蒸发仪除去溶剂得到残余物，其中哌啶和氯仿的体积比为1：4；
(4)将步骤(3)得到的残余物溶于三氟乙酸、三异丙基硅烷和纯水的混合溶剂中，在室温下搅拌1小时后通过氮气流吹走溶剂，其中三氟乙酸、三异丙基硅烷和纯水的体积比为95：2.5：2.5；
(5)将粗产物再次通过硅胶柱纯化，得到一对手性氨基酸修饰的磷脂分子。
3.根据权利要求2所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中反应物Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶的添加量的摩尔比为1：0.5-1.5：2-3：2-3：2-3。
4.根据权利要求2所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(5)中的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为25：1。
5.一种如权利要求1所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：应用于抑制与阿兹海默病相关的Aβ1-40单体的聚集和纤维化。
6.根据权利要求5所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：将手性氨基酸修饰的磷脂分子加工成手性磷脂囊泡，与Aβ1-40单体共同孵育，然后使用全功能微孔板检测仪观察Aβ1-40的聚集和纤维化情况；
具体操作过程如下
1)将手性氨基酸修饰的磷脂分子L-/D-Asp-DPPE分别与未修饰的磷脂分子DPPE混合，溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，超声至完全溶解后用旋转蒸发仪除去溶剂，在烧瓶底部形成一层透明薄膜，之后向烧瓶中加入缓冲液使干燥的脂质膜再水化，并将多层囊泡悬浮液通过小型挤出机挤出，得到单层手性磷脂囊泡；
2)将Aβ1-40多肽粉末溶解在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，震荡后用氮气吹干溶液，之后将Aβ1-40重新溶解在二甲基亚砜中，并用缓冲液稀释至所需浓度；
3)将手性磷脂囊泡与Aβ1-40单体共同孵育，并加入荧光分子硫黄素T，加注于96孔板中，通过全功能微孔板检测仪观察Aβ1-40的聚集和纤维化情况。
7.根据权利要求6所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：所述步骤1)中L-/D-Asp-DPPE与DPPE的质量比为1：1，二氯甲烷和甲醇的体积比为2：1，缓冲液为磷酸盐缓冲溶液pH＝7.4，50mM，其中溶剂为去离子水，水化温度为70℃并不断搅拌，单层手性磷脂囊泡浓度为1mg/mL，挤出机的滤膜尺寸为100nm，并循环挤出19次。
8.根据权利要求6所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：所述步骤2)中Aβ1-40在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中的浓度为1mg/mL，震荡时间为1-2小时，震荡速率为500r/min，氮气吹扫轻柔，Aβ1-40在二甲基亚砜中的浓度为2.3mM，缓冲液为磷酸盐缓冲溶液pH＝7.4，50mM，其中溶剂为去离子水。
9.根据权利要求6所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：所述步骤3)中手性磷脂囊泡的浓度为1mg/mL，Aβ1-40的浓度为50μM，二者按照体积比1：1混合，硫黄素T的浓度为25μM，96孔板为黑色底部透光，孵育温度为37℃。
10.根据权利要求6所述的一对对Aβ1-40聚集和纤维化有抑制效果的手性氨基酸修饰的磷脂分子的应用，其特征在于：采用全功能微孔板检测仪观察Aβ1-40的聚集和纤维化情况时，直观看到的是荧光强度的变化，采用底部读取模式，数据间隔为10分钟，每次检测之前先振板2秒，激发和发射波长分别为445nm和485nm。
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