KR20220004984A - Ttr 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 attr 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도 - Google Patents

Ttr 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 attr 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도 Download PDF

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세스 씨. 알렉산더
크리스티 엠. 우드
아티 마헨드라 프라카쉬 칸졸리아
쇼부 오다테
제시카 린 시쳐
레이날드 마이클 레스카뷰
월터 스트랩스
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Abstract

코르티코스테로이드의 투여와 조합하여, 예를 들어, TTR 유전자 내에서 이중-가닥 파손을 유도하는 편집을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 가이드 RNA 및 코르티코스테로이드가 투여되는, 트랜스티레틴과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

TTR 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 ATTR 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도
본 특허 출원은 2019년 3월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/825,676호 및 2019년 3월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/825,637호의 우선권을 주장하며, 이들 기초출원 각각의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 특허 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 2020년 3월 20일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 2020-03-20_01155-0029-00PCT_ST25.txt이며, 크기는 967KB이다.
트랜스티레틴(transthyretin: TTR)은 일반적으로 신체 전체에 레티놀 및 타이록신을 수송하는 기능을 하는 TTR 유전자에 의해 생성되는 단백질이다. TTR은 주로 간에서 합성되며, 작은 분획은 맥락망막(choroid plexus) 및 망막(retina)에서 생성된다. TTR은 일반적으로 혈액에서 가용성 4량체 단백질로 순환한다.
4량체 안정성을 방해할 수 있는 TTR의 병원성 변이체는 TTR 유전자의 돌연변이체 대립형질에 의해 암호화될 수 있다. 돌연변이체 TTR은 잘못 접힌 TTR을 유발할 수 있으며, 이는 아밀로이드(즉, 잘못 접힌 TTR 단백질의 응집체)를 생성할 수 있다. 일부 경우에, TTR의 병원성 변이체는 아밀로이드증(amyloidosis) 또는 아밀로이드의 축적(build-up)으로 인한 질환을 유발할 수 있다. 예를 들어, 잘못 접힌 TTR 단량체는 말초 신경, 심장 및 위장관과 같은 조직 내에서 아밀로이드 원섬유(amyloid fibril)로 중합될 수 있다. 아밀로이드 플라크는 또한 잘못 접힌 TTR에 침착된 야생형 TTR을 포함할 수 있다.
야생형 TTR의 잘못접힘 및 침착은 또한 60세 이상의 남성에서도 관찰되었으며, 심장 박동 문제, 심부전(heart failure) 및 수근관(carpal tunnel)과 관련이 있다.
TTR의 침착을 특징으로 하는 아밀로이드증은 "ATTR", "TTR-관련 아밀로이드증", "TTR 아밀로이드증" 또는 "ATTR 아밀로이드증", "ATTR 가족성 아밀로이드증"(가족의 유전적 돌연변이와 연관되는 경우) 또는 "ATTRwt" 또는 "야생형 ATTR"(야생형 TTR의 잘못접힘 및 침착으로 인해 발생하는 경우)로 지칭될 수 있다.
ATTR은 광범위한 증상을 나타낼 수 있고, 상이한 클래스의 ATTR을 갖는 환자는 상이한 특성 및 예후예측을 가질 수 있다. ATTR의 일부 클래스는 가족성 아밀로이드 다발신경병증(familial amyloid polyneuropathy: FAP), 가족성 아밀로이드 심근증(familial amyloid cardiomyopathy: FAC) 및 야생형 TTR 아밀로이드증(wt-TTR amyloidosis)을 포함한다. FAP는 일반적으로 감각운동 신경병증(sensorimotor neuropathy)과 함께 나타나는 반면, FAC 및 wt-TTR 아밀로이드증은 일반적으로 울혈성 심부전(congestive heart failure)과 함께 나타난다. FAP 및 FAC는 일반적으로 TTR 유전자의 유전적 돌연변이와 관련이 있으며, TTR 유전자의 100개가 넘는 상이한 돌연변이가 ATTR과 관련되어 있다. 대조적으로, wt-TTR 아밀로이드증은 TTR의 유전적 돌연변이가 아니라 노화와 관련이 있다. 세계적으로 대략 50,000명의 환자가 FAP 및 FAC의 영향을 받을 수 있는 것으로 추정된다.
TTR의 100개가 넘는 돌연변이가 ATTR과 관련되어 있지만, 소정의 돌연변이는 신경병증 및/또는 심근증과 더 밀접하게 관련되어 있다. 예를 들어, TTR의 T60에서의 돌연변이는 심근증 및 신경병증 모두와 관련이 있고; V30에서의 돌연변이는 신경병증과 더 관련이 있으며; V122에서의 돌연변이는 심근증과 더 관련이 있다.
ATTR의 치료를 위해 다양한 치료 접근법이 연구되었지만, 질환 진행을 멈추고 삶의 질을 개선시키는 승인된 약물은 없다. 간 이식이 ATTR의 치료를 위해 연구되었지만, 이는 상당한 위험을 수반하며 이식 후에도 질환 진행이 때때로 계속되기 때문에 그 사용이 감소하고 있다. 다이플루니살(diflunisal) 및 타파미디스(tafamidis)와 같은 소분자 안정제는, ATTR 진행을 늦추는 것으로 나타났지만, 이들 작용제는 질환 진행을 중단시키지는 않는다.
파괴를 위해 아밀로이드 원섬유를 표적화하는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA) 넉다운, 안티센스 넉다운 또는 단일클론 항체를 사용하는 접근법이 또한 현재 연구되고 있지만, TTR 발현의 단기 억제에 대한 결과는 고무적인 예비 데이터를 보여주는 반면, TTR의 오래 지속되는 억제를 생성할 수 있는 치료에 대한 필요성이 존재한다.
외래 RNA의 투여는 유전자 편집 및 요법의 맥락에서 바람직하지 않은 선천성 면역 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 염증 또는 면역 반응을 감소시킬 수 있는 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 가이드 RNA를 투여 받는 대상체에게 코르티코스테로이드를 병용 투여하면 이러한 염증 또는 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
따라서, 하기의 실시형태가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 가이드 RNA 및 선택적으로 CRISPR/Cas 시스템과 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제(RNA-guided DNA binding agent)와 조합하여 코르티코스테로이드를 사용하여 TTR 유전자의 발현을 실질적으로 감소 또는 넉아웃시켜, ATTR과 관련된 TTR 단백질의 생산을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다. TTR 유전자의 변경을 통한 ATTR과 관련된 TTR 단백질의 생산의 실질적인 감소 또는 제거는 장기적인 감소 또는 제거일 수 있다.
하기 실시형태가 본 명세서에 제공된다.
실시형태 1은, 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하는 방법이되, 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
를 포함하여 ATTR을 치료한다.
실시형태 2는 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR 혈청 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 TTR 혈청 농도를 감소시키는 방법이되, 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
를 포함하여 TTR 혈청 농도를 감소시킨다.
실시형태 3은 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적의 감소 또는 방지를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이되, 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
을 포함하여 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시킨다.
실시형태 4는 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(double-stranded break: DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한,
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물이다.
실시형태 5는 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한 가이드 RNA를 암호화하는 벡터를 포함하는 조성물이되, 가이드 RNA는
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
을 포함한다.
실시형태 6은 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한,
(i) 가이드 RNA로서,
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
을 포함하는, 상기 가이드 RNA, 및
(ii) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA로서,
오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 가지며;
오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 75%가 표 1에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는
상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 조성물이다.
실시형태 7은 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한,
(i) 가이드 RNA를 암호화하는 벡터로서, 가이드 RNA는
a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
을 포함하는, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 벡터, 및
(ii) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA로서,
오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 가지며;
오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 75%가 표 1에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는
상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA
를 포함하는 조성물이다.
실시형태 8은 실시형태 1 내지 3 또는 5 내지 7 중 어느 하나의 사용을 위한 조성물 또는 방법이되, 방법은 30분 초과, 예를 들어, 60분 초과 또는 120분 초과 동안 주입에 의해 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태 9는 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함한다.
실시형태 10은 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 가이드 RNA는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 61, 63, 65, 66, 68 또는 69로부터 선택되는 가이드 서열을 포함한다.
실시형태 11은 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하는데 사용하기 위한 실시형태 4 내지 10 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 12는 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키는데 사용하기 위한 실시형태 4 내지 11 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 13은 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하는데 사용하기 위한 실시형태 4 내지 12 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 14는 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 실시형태 4 내지 13 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 15는 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는데 사용하기 위한 실시형태 4 내지 14 중 어느 하나의 조성물이다.
실시형태 16은 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손(dexamethasone), 베타메타손(betamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 코르티손(cortisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트라이암시놀론(triamcinolone) 또는 에타메타소넵(ethamethasoneb)이다.
실시형태 17은 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이다.
실시형태 18은 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물 전에 투여된다.
실시형태 19는 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물 후에 투여된다.
실시형태 20은 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물과 동시에 투여된다.
실시형태 21은 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 투여되기 전 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여된다.
실시형태 22는 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 투여된 후 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여된다.
실시형태 23은 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 투여되기 전 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 1일, 1.5일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주에 투여된다.
실시형태 24는 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 투여된 후 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 1일, 1.5일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주에 투여된다.
실시형태 25는 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 적어도 2회 용량의 코르티코스테로이드는 조성물의 투여 전 또는 후에 투여된다.
실시형태 26은 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 적어도 2회 용량의 코르티코스테로이드 및 적어도 2회 용량의 조성물이 투여된다.
실시형태 27은 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 0.75㎎ 내지 20㎎의 용량으로 대상체에 투여된다.
실시형태 28은 실시형태 27의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 0.4 ㎎/㎏, 예컨대, 0.1 ㎎/㎏ 내지 0.35 ㎎/㎏ 또는 0.25 ㎎/㎏ 내지 0.35 ㎎/㎏의 용량으로 대상체에 투여된다.
실시형태 29는 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 비경구적으로 또는 주사에 의해 대상체에 투여된다.
실시형태 30은 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 정맥내 주사를 통해 대상체에 투여된다.
실시형태 31은 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 근육내로 또는 주입에 의해 대상체에 투여된다.
실시형태 32는 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 경구로 대상체에 투여된다.
실시형태 33은 실시형태 32의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 정맥내 주사에 의해 대상체에 투여되기 전에 대상체에 경구로 투여된다.
실시형태 34는 실시형태 32의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 조성물이 정맥내 주사에 의해 대상체에 투여된 후에 대상체에 경구로 투여된다.
실시형태 35는 실시형태 32 및 33 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손 조성물이 대상체에 투여되기 전 6시간 내지 12시간에 20㎎의 양으로 대상체에 경구로 투여된다.
실시형태 36은 실시형태 32, 33 또는 35 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손은 조성물이 대상체에 투여되기 전 6시간 내지 12시간에 30분 동안 20㎎의 양으로 대상체에 정맥내로 투여된다.
실시형태 37은 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 45분 내지 75분, 75분 내지 105분, 105분 내지 135분, 135분 내지 165분, 165분 내지 195분, 195분 내지 225분, 225분 내지 255분, 255분 내지 285분, 285분 내지 315분, 315분 내지 345분 또는 345분 내지 375분 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 1.5시간 내지 6시간 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 38은 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 60분, 약 90분, 약 120분, 약 150분, 약 180분 또는 약 240분 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 39는 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 120분 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 40은 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이다.
실시형태 41은 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 방법은 주입 예방제를 투여하는 단계를 더 포함하고, 주입 예방제는 하나 이상의 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제를 포함하며, 선택적으로 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상은 코르티코스테로이드와 함께 그리고/또는 조성물 전에 동시에 투여된다.
실시형태 42는 실시형태 41의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제가 각각 투여된다.
실시형태 42a는 실시형태 41 또는 42의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, H1 차단제 및/또는 H2 차단제는 경구로 투여된다.
실시형태 42b는 실시형태 41 내지 42a 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 주입 예방제는 정맥내 코르티코스테로이드(예컨대, 덱사메타손 8㎎ 내지 12㎎ 또는 10㎎ 또는 등가물) 및 아세트아미노펜(예컨대, 경구 아세트아미노펜 500㎎)을 포함한다.
실시형태 42c는 실시형태 41 내지 42b 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 주입 예방제는 가이드 RNA-함유 조성물, 예를 들어, LNP 조성물을 투여하기 전에 필요한 예비약제(premedication)로 투여된다.
실시형태 43은 실시형태 41 내지 42c 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, H1 차단제는 다이펜하이드라민(diphenhydramine)이다.
실시형태 44는 실시형태 41 내지 43 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, H2 차단제는 라니티딘(ranitidine)이다.
실시형태 45는 실시형태 1 내지 44 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 투여된다.
실시형태 46은 실시형태 1 내지 45 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 정맥내로 투여된다.
실시형태 47은 실시형태 45 및 46 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 방법은 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상을 투여하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상은 코르티코스테로이드의 제2 용량과 동시에 투여된다.
실시형태 48은 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 정맥내로 투여된다.
실시형태 49는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제의 투여와 동시에 정맥내로 투여된다.
실시형태 50은 실시형태 1 내지 49 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 약 6㎎ 내지 10㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 대상체에 경구로 투여되고, 약 8㎎ 내지 12㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량은 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜의 경구 투여 및 H1 차단제와 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 대상체에 정맥내로 투여되며, 선택적으로 H1 차단제는 다이펜하이드라민이고, H2 차단제는 라니티딘이고/이거나 선택적으로 대상체는 인간이다.
실시형태 51은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 대상체에 경구로 투여되고, 및 덱사메타손의 10㎎의 양의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜의 경구 투여 및 H1 차단제와 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 대상체에 정맥내로 투여되며, 선택적으로 H1 차단제는 다이펜하이드라민이고, H2 차단제는 라니티딘이다.
실시형태 52는 실시형태 1 내지 51 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 1.5시간 내지 6시간 동안 주입에 의해 3 ㎎/㎏의 양으로 투여되고; 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물의 주입 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되며; 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물의 주입 전 약 1시간 내지 2시간에 정맥내로 투여된다.
실시형태 53은 실시형태 1 내지 52 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 내약성을 향상시킨다.
실시형태 54는 실시형태 1 내지 53 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 가이드 RNA를 포함하는 조성물에 대한 반응에서 하나 이상의 염증, 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting), 혈액에서 상승된 ALT 농도, 고열(hyperthermia) 및/또는 통각 과민증(hyperalgesia)의 발생률 또는 중증도를 감소시킨다.
실시형태 55는 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 가이드 RNA를 포함하는 조성물에 대한 반응에서 하나 이상의 인터페론 및/또는 염증성 사이토카인의 생성 또는 활성을 감소시키거나 또는 저해한다.
실시형태 56은 실시형태 1 내지 55 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 혈청 TTR 수준을 감소시킨다.
실시형태 57은 실시형태 56의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 혈청 TTR 수준은 조성물의 투여 전 혈청 TTR 수준과 비교하여 적어도 50% 감소된다.
실시형태 58은 실시형태 56의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 혈청 TTR 수준은 조성물의 투여 전 혈청 TTR 수준과 비교하여 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 98%, 98% 내지 99% 또는 99% 내지 100% 감소된다.
실시형태 59는 실시형태 1 내지 58 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 TTR 유전자의 편집을 초래한다.
실시형태 60은 실시형태 59의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집은 편집된 집단의 백분율(편집 퍼센트)로 계산된다.
실시형태 61은 실시형태 60의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집 퍼센트는 집단의 30% 내지 99%이다.
실시형태 62는 실시형태 61의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집 퍼센트는 집단의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%이다.
실시형태 63은 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 하나의 조직에서 아밀로이드 침착을 감소시킨다.
실시형태 64는 실시형태 63의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 조직은 위, 결장, 좌골 신경(sciatic nerve) 또는 후근 신경절(dorsal root ganglion) 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태 65는 실시형태 63 및 64 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 조성물의 투여 후 8주에 측정된다.
실시형태 66은 실시형태 63 내지 65 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 음성 대조군 또는 조성물의 투여 전에 측정된 수준과 비교된다.
실시형태 67은 실시형태 63 내지 66 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 생검 샘플에서 측정되고/되거나 면역염색에 의해 측정된다.
실시형태 68은 실시형태 63 내지 67 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 음성 대조군에서 관찰된 아밀로이드 침착의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%까지 감소된다.
실시형태 69는 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 조성물의 투여 전에 관찰된 아밀로이드 침착의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%까지 감소된다.
실시형태 70은 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 2회 투여 또는 전달된다.
실시형태 71은 실시형태 70의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 3회 투여 또는 전달된다.
실시형태 72는 실시형태 70의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 4회 투여 또는 전달된다.
실시형태 73은 실시형태 70의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 최대 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 투여 또는 전달된다.
실시형태 74는 실시형태 70 내지 73 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일의 간격으로 발생한다.
실시형태 75는 실시형태 70 내지 73 중 어느 하나 이상의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주의 간격으로 발생한다.
실시형태 76은 실시형태 70 내지 73 중 어느 하나 이상의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월 또는 15개월의 간격으로 발생한다.
실시형태 77은 실시형태 1 내지 76 중 어느 하나 이상의 방법 또는 조성물이되, 가이드 서열은 서열번호 5 내지 82로부터 선택된다.
실시형태 78은 실시형태 1 내지 77 중 어느 하나 이상의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 인간 TTR 유전자에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다.
실시형태 79는 실시형태 78의 방법 또는 조성물이되, 표적 서열은 인간 TTR 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에 있다.
실시형태 80은 실시형태 78의 방법 또는 조성물이되, 표적 서열은 인간 TTR 유전자의 엑손 1에 있다.
실시형태 81은 실시형태 78의 방법 또는 조성물이되, 표적 서열은 인간 TTR 유전자의 엑손 2에 있다.
실시형태 82는 실시형태 78의 방법 또는 조성물이되, 표적 서열은 인간 TTR 유전자의 엑손 3에 있다.
실시형태 83은 실시형태 78의 방법 또는 조성물이되, 표적 서열은 인간 TTR 유전자의 엑손 4에 있다.
실시형태 84는 실시형태 1 내지 83 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 가이드 서열은 TTR의 양성 가닥에 있는 표적 서열에 상보적이다.
실시형태 85는 실시형태 1 내지 83 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 서열은 TTR의 음성 가닥에 있는 표적 서열에 상보적이다.
실시형태 86은 실시형태 1 내지 83 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 제1 가이드 서열은 TTR 유전자의 양성 가닥에 있는 제1 표적 서열에 상보적이고, 조성물은 TTR 유전자의 음성 가닥에 있는 제2 표적 서열에 상보적인 제2 가이드 서열을 더 포함한다.
실시형태 87은 실시형태 1 내지 86 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 이중 가이드(dgRNA)이다.
실시형태 88은 실시형태 1 내지 86 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 단일 가이드(sgRNA)이다.
실시형태 89는 실시형태 88의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 5 내지 82의 가이드 서열 중 어느 하나 및 서열번호 3의 21번 내지 100번 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 90은 실시형태 88 및 89 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 87 내지 124로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함한다.
실시형태 91은 실시형태 88의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 87 내지 124로부터 선택되는 서열을 포함한다.
실시형태 92는 실시형태 1 내지 91 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다.
실시형태 93은 실시형태 92의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 94는 실시형태 92 또는 93의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(phosphorothioate: PS) 결합을 포함한다.
실시형태 95는 실시형태 92 내지 94 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 96은 실시형태 92 내지 95 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 5' 말단 변형, 3' 말단 변형 또는 5' 및 3' 말단 변형을 포함한다.
실시형태 97은 실시형태 92 내지 96 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 5' 말단의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다.
실시형태 98은 실시형태 92 내지 97 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다.
실시형태 99는 실시형태 92 내지 98 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함한다.
실시형태 100은 실시형태 92 내지 99 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함한다.
실시형태 101은 실시형태 92 내지 100 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 102는 실시형태 92 내지 101 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 103은 실시형태 92 내지 102 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 서열번호 3의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 104는 실시형태 1 내지 103 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
실시형태 105는 실시형태 1 내지 104 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)와 관련이 있다.
실시형태 106은 실시형태 105의 방법 또는 조성물이되, LNP는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
실시형태 107은 실시형태 106의 방법 또는 조성물이되, LNP는 생분해성의 이온화 가능한 지질을 포함한다.
실시형태 108은 실시형태 105 내지 107 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 아민 지질, 예를 들어, CCD 지질을 포함한다.
실시형태 109는 실시형태 105 내지 108 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 보조 지질을 포함한다.
실시형태 110은 실시형태 105 내지 109 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 스텔스 지질을 포함하고, 선택적으로
(i) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A, 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(ii) LNP는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 27-39.5 몰-%의 보조 지질; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, LNP 조성물의 N/P 비는 약 5 내지 7(예를 들어, 약 6)이고;
(iii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(iv) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(v) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(vi) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 0 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(vii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 1 몰-% 미만의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(viii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이며, LNP 조성물은 중성 인지질이 본질적으로 없거나 또는 없거나;
(ix) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 7이다.
실시형태 111은 실시형태 105 내지 110 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 중성 지질을 포함한다.
실시형태 112는 실시형태 105 내지 111 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 약 50 몰-%로 존재한다.
실시형태 113은 실시형태 105 내지 112 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 약 9 몰-%로 존재한다.
실시형태 114는 실시형태 105 내지 113 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 스텔스 지질은 약 3 몰-%로 존재한다.
실시형태 115는 실시형태 105 내지 114 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 약 38 몰-%로 존재한다.
실시형태 116은 실시형태 105 내지 115 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
실시형태 117은 실시형태 105 내지 116 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 9 몰-%의 중성 지질, 예컨대, DSPC; 약 3 몰-%의 스텔스 지질, 예컨대, PEG2k-DMG와 같은 PEG 지질을 포함하며, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질, 예컨대, 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
실시형태 118은 실시형태 105 내지 117 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 지질 A이다.
실시형태 119는 실시형태 105 내지 118 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 DSPC이다.
실시형태 120은 실시형태 105 내지 119 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
실시형태 121은 실시형태 105 내지 120 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 콜레스테롤이다.
실시형태 122는 실시형태 105 내지 121 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 지질 A; 약 9 몰-%의 DSPC; 약 3 몰-%의 PEG2k-DMG를 포함하며, 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
실시형태 123은 실시형태 1 내지 122 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 더 포함한다.
실시형태 124는 실시형태 1 내지 123 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
실시형태 125는 실시형태 124의 방법 또는 조성물이되, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이다.
실시형태 126은 실시형태 123 내지 125 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리베이스(Cas cleavase)이다.
실시형태 127은 실시형태 123 내지 126 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다.
실시형태 128은 실시형태 123 내지 127 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9이다.
실시형태 129는 실시형태 128의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 뉴클레이스이다.
실시형태 130은 실시형태 124 내지 129 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 폴리뉴클레오타이드는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하되,
a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고;
c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 75%가 표 4에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
실시형태 131은 실시형태 130의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열의 적어도 처음 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
실시형태 132는 실시형태 130 또는 131의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태 133은 실시형태 130 내지 132 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임의 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%는 표 4에 열거된 코돈이다.
실시형태 134는 실시형태 130 내지 133 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 101%, 102%, 103%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% 또는 150% 범위의 아데닌 함량을 갖는다.
실시형태 135는 실시형태 130 내지 134 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 101%, 102%, 103%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% 또는 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
실시형태 136은 실시형태 124 내지 135 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 232, 234, 236, 238, 241 또는 275 내지 277 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 5' UTR을 포함한다.
실시형태 137은 실시형태 124 내지 136 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 233, 235, 237, 239 또는 240 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 3' UTR을 포함한다.
실시형태 138은 실시형태 124 내지 137 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 폴리뉴클레오타이드는 동일한 공급원으로부터의 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다.
실시형태 139는 실시형태 124 내지 138 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 폴리뉴클레오타이드는 캡0, 캡1 및 캡2로부터 선택되는 5' 캡을 포함한다.
실시형태 140은 실시형태 124 내지 139 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태 141은 실시형태 125 내지 140 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, mRNA에서 우리딘의 적어도 10%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 142는 실시형태 141의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘, 슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 또는 5-아이오도우리딘 중 하나 이상이다.
실시형태 143은 실시형태 141의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘 또는 5-메톡시우리딘 중 하나 또는 둘 다이다.
실시형태 144는 실시형태 141의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다.
실시형태 145는 실시형태 141의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다.
실시형태 146은 실시형태 141 내지 145 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 우리딘의 15% 내지 45%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 147은 실시형태 141 내지 146 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 우리딘의 적어도 20% 또는 적어도 30%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 148은 실시형태 147의 조성물 또는 방법이되, 우리딘의 적어도 80% 또는 적어도 90%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 149는 실시형태 147의 조성물 또는 방법이되, 우리딘의 100%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 150은 실시형태 123 내지 149 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 변형된다.
실시형태 151은 실시형태 150의 방법 또는 조성물이되, 변형된 RNA-가이드된 DNA 결합제는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함한다.
실시형태 152는 실시형태 1 내지 151 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다.
실시형태 153은 실시형태 1 내지 152 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유를 감소시키거나 또는 방지한다.
실시형태 154는 실시형태 153의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유는 신경, 심장 또는 위장관에 있다.
실시형태 155는 실시형태 1 내지 154 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 비-상동 말단 연결(non-homologous ending joining: NHEJ)은 TTR 유전자에서 DSB의 복구 동안 돌연변이를 유발한다.
실시형태 156은 실시형태 155의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, NHEJ는 TTR 유전자에서 DSB의 복구 동안 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발한다.
실시형태 157은 실시형태 156의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
실시형태 158은 실시형태 155 또는 156의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 적어도 50%의 TTR 유전자에서 유도된다.
실시형태 159는 실시형태 158의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 또는 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99% 또는 99% 내지 100%의 TTR 유전자에서 유도된다.
실시형태 160은 실시형태 156 내지 159 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 표적외 부위보다 적어도 50-배 이상 발생한다.
실시형태 161은 실시형태 160의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 표적외 부위보다 50-배 내지 150-배, 150-배 내지 500-배, 500-배 내지 1500-배, 1500-배 내지 5000-배, 5000-배 내지 15000-배, 15000-배 내지 30000-배 또는 30000-배 내지 60000-배 이상 발생한다.
실시형태 162는 실시형태 156 내지 161 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 일차 인간 간세포(hepatocyte)의 3개, 2개, 1개 또는 0개 이하의 표적외 부위(들)에서 발생하며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서는 발생하지 않는다.
실시형태 163은 실시형태 162의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입이 Cas9-과발현 세포에서 발생하는 표적외 부위의 수보다 적은 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수에서 발생하고, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서는 발생하지 않는다.
실시형태 164는 실시형태 163의 방법 또는 조성물이되, Cas9-과발현 세포는 Cas9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포이다.
실시형태 165는 실시형태 162 내지 164 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수는 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석함으로써 결정되며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 166은 실시형태 162 내지 164 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수는 Cas9 mRNA, 가이드 RNA 및 공여체(donor) 올리고뉴클레오타이드로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 삽입 검정에 의해 결정되며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 167은 실시형태 1 내지 166 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA의 서열은
a) 서열번호 92 또는 104;
b) 서열번호 87, 89, 96 또는 113;
c) 서열번호 100, 102, 106, 111 또는 112; 또는
d) 서열번호 88, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 101, 103, 108 또는 109
이고, 선택적으로 가이드 RNA는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하는 표적외 부위(들)에서 indel을 생성하지 않는다.
실시형태 168은 실시형태 1 내지 167 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물의 투여는 대상체에서 TTR의 수준을 감소시킨다.
실시형태 169는 실시형태 168의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 적어도 50% 감소된다.
실시형태 170은 실시형태 169의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 또는 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99% 또는 99% 내지 100% 감소된다.
실시형태 171은 실시형태 168 또는 169의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌척수액 또는 가래에서 측정된다.
실시형태 172는 실시형태 168 또는 169의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 간, 맥락망막 및/또는 망막에서 측정된다.
실시형태 173은 실시형태 168 내지 172 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)을 통해 측정된다.
실시형태 174는 실시형태 1 내지 173 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR을 갖는다.
실시형태 175는 실시형태 1 내지 174 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 인간이다.
실시형태 176은 실시형태 174 또는 175의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTRwt를 갖는다.
실시형태 177은 실시형태 174 또는 175의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 유전성 ATTR을 갖는다.
실시형태 178은 실시형태 1 내지 177 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 가족력이 있다.
실시형태 179는 실시형태 1 내지 178 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 가족성 아밀로이드 다발신경병증을 갖는다.
실시형태 180은 실시형태 1 내지 179 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 신경 증상만을 또는 주로 ATTR의 신경 증상을 갖는다.
실시형태 181은 실시형태 1 내지 179 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 가족성 아밀로이드 심근증을 갖는다.
실시형태 182는 실시형태 1 내지 179 또는 181 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 심장의 증상만을 또는 주로 ATTR의 심장의 증상을 갖는다.
실시형태 183은 실시형태 1 내지 182 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V30 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 184는 실시형태 183의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, V30 돌연변이는 V30A, V30G, V30L 또는 V30M이다.
실시형태 185는 실시형태 1 내지 184 중 어느 하나의 실시형태의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 T60 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 186은 실시형태 185의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, T60 돌연변이는 T60A이다.
실시형태 187은 실시형태 1 내지 186 중 어느 하나의 실시형태의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V122 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 188은 실시형태 187의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, V122 돌연변이는 V122A, V122I 또는 V122(-)이다.
실시형태 189는 실시형태 1 내지 188 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 야생형 TTR을 발현한다.
실시형태 190은 실시형태 1 내지 182 또는 189 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V30, T60 또는 V122 돌연변이를 갖는 TTR을 발현하지 않는다.
실시형태 191은 실시형태 1 내지 182 또는 189 내지 190 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 병리학적 돌연변이를 갖는 TTR을 발현하지 않는다.
실시형태 192는 실시형태 190 내지 192 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 야생형 TTR의 동종접합(homozygous)이다.
실시형태 193은 실시형태 1 내지 192 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 후 대상체는 감각운동 신경병증의 증상의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화가 있다.
실시형태 194는 실시형태 193의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 감각 신경병증(sensory neuropathy)의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화는 근전도(electromyogram), 신경 전도 테스트 또는 환자-보고 결과를 사용하여 측정된다.
실시형태 195는 실시형태 1 내지 194 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 울혈성 심부전(congestive heart failure)의 증상의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화가 있다.
실시형태 196은 실시형태 195의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 울혈성 심부전의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화는 심장 바이오마커 테스트, 폐 기능 테스트, 흉부 x-선 또는 심전도법(electrocardiography)을 사용하여 측정된다.
실시형태 197은 실시형태 1 내지 196 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물 또는 약제학적 제형은 바이러스 벡터를 통해 투여된다.
실시형태 198은 실시형태 1 내지 197 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물 또는 약제학적 제형은 지질 나노입자를 통해 투여된다.
실시형태 199는 실시형태 1 내지 198 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 조성물 또는 제형을 투여하기 전 TTR 유전자의 특정 돌연변이에 대해 테스트된다.
실시형태 200은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5이다.
실시형태 201은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 6이다.
실시형태 202는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 7이다.
실시형태 203은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 8이다.
실시형태 204는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 9이다.
실시형태 205는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 10이다.
실시형태 206은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 11이다.
실시형태 207은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 12이다.
실시형태 208은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 13이다.
실시형태 209는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 14이다.
실시형태 210은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 15이다.
실시형태 211은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 16이다.
실시형태 212는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 17이다.
실시형태 213은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 18이다.
실시형태 214는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 19이다.
실시형태 215는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 20이다.
실시형태 216은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 21이다.
실시형태 217은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 22이다.
실시형태 218은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 23이다.
실시형태 219는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 24이다.
실시형태 220은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 25이다.
실시형태 221은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 26이다.
실시형태 222는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 27이다.
실시형태 223은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 28이다.
실시형태 224는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 29이다.
실시형태 225는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 30이다.
실시형태 226은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 31이다.
실시형태 227은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 32이다.
실시형태 228은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 33이다.
실시형태 229는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 34이다.
실시형태 230은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 35이다.
실시형태 231은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 36이다.
실시형태 232는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 37이다.
실시형태 233은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 38이다.
실시형태 234는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 39이다.
실시형태 235는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 40이다.
실시형태 236은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 41이다.
실시형태 237은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 42이다.
실시형태 238은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 43이다.
실시형태 239는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 44이다.
실시형태 240은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 45이다.
실시형태 241은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 46이다.
실시형태 242는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 47이다.
실시형태 243은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 48이다.
실시형태 244는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 49이다.
실시형태 245는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 50이다.
실시형태 246은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 51이다.
실시형태 247은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 52이다.
실시형태 248은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 53이다.
실시형태 249는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 54이다.
실시형태 250은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 55이다.
실시형태 251은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 56이다.
실시형태 252는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 57이다.
실시형태 253은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 58이다.
실시형태 254는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 59이다.
실시형태 255는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 60이다.
실시형태 256은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 61이다.
실시형태 257은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 62이다.
실시형태 258은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 63이다.
실시형태 259는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 64이다.
실시형태 260은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 65이다.
실시형태 261은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 66이다.
실시형태 262는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 67이다.
실시형태 263은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 68이다.
실시형태 264는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 69이다.
실시형태 265는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 70이다.
실시형태 266은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 71이다.
실시형태 267은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 72이다.
실시형태 268은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 73이다.
실시형태 269는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 74이다.
실시형태 270은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 75이다.
실시형태 271은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 76이다.
실시형태 272는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 77이다.
실시형태 273은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 78이다.
실시형태 274는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 79이다.
실시형태 275는 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 80이다.
실시형태 276은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 81이다.
실시형태 277은 실시형태 1 내지 199 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 82이다.
실시형태 278은 ATTR을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 실시형태 1 내지 277 중 어느 하나의 조성물 또는 제형의 용도이다.
도 1은 표 1에 제공된 가이드 서열에 의해 표적화되는 TTR 유전자의 영역을 갖는 염색체 18의 개략도를 보여준다.
도 2는 TTR을 표적화하는 소정의 이중 가이드 RNA의 HEK293_Cas9 세포에서의 표적외 분석을 보여준다. 표적 부위는 테스트된 각각의 이중 가이드 RNA에 대해 채워진 사각형으로 나타낸 반면, 닫힌 원은 잠재적인 표적외 부위를 나타낸다.
도 3은 TTR을 표적화하는 소정의 단일 가이드 RNA의 HEK_Cas9 세포에서의 표적외 분석을 보여준다. 표적 부위는 테스트된 각 단일 가이드 RNA에 대해 채워진 사각형으로 나타낸 반면, 열린 원은 잠재적인 표적외 부위를 나타낸다.
도 4는 일차 인간 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 인간 TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 5는 일차 cyno 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 인간 TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 6은 일차 cyno 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 cyno TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 7은 x-축에 제공된 HUH7 세포 서열에서 가이드의 투여 후 TTR의 편집 퍼센트(편집%) 및 분비된 TTR의 감소를 보여준다. 값은 알파-1-항트립신(alpha-1-antitrypsin: AAT) 단백질의 양으로 정규화된다.
도 8은 HUH7 세포에서 표적화된 가이드(표 1에 열거됨)의 투여 후 세포내 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 9는 인간화(G481-G499) 또는 뮤린(G282) TTR을 갖는 마우스에 LNP 제형의 투여 후 관찰된 TTR의 간 편집 백분율을 보여준다. 참고: 각 가이드 ID에서 처음 3개의 '0'은 도면에서 생략되었으며, 예를 들어, 표 2 및 표 3에서 "G481"은 "G000481"이다.
도 10a 내지 도 10b는 ㎍/㎖(도 10a) 또는 TSS 대조군의 백분율(도 10b)로서 수평 축에 표시된 투여 양생법 후에 관찰된 혈청 TTR 수준을 보여준다. MPK = ㎎/㎏ 전체.
도 11a 내지 도 11b는 1 ㎎/㎏(도 11a) 또는 0.5 ㎎/㎏ 투여량(도 11b)에 대해 수평 축에 표시된 투여 양생법 후에 관찰된 혈청 TTR 수준을 보여준다. 단일 2 ㎎/㎏ 용량에 대한 데이터가 두 패널의 오른쪽 열에 포함되어 있다.
도 12a 내지 도 12b는 1 ㎎/㎏(도 12a) 또는 0.5 ㎎/㎏ 투여량(도 12b)에 대해 수평 축에 표시된 투여 양생법 후에 관찰된 간 편집 백분율을 보여준다. 도 12C는 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏의 단일 투여 후 관찰된 간 편집 백분율을 보여준다.
도 13은 TTR 유전자에 대하여 인간화된 마우스에 LNP 제형의 투여 후 관찰된 간 편집 퍼센트를 보여준다. 참고: 각 가이드 ID에서 처음 3개의 '0'은 도면에서 생략되었으며, 예를 들어, 표 2 및 표 3에서 "G481"은 "G000481"이다.
도 14a 내지 도 14b는 TTR 유전자에 대하여 인간화된 마우스에 LNP 제형의 투여 후 간 편집(도 14a)과 혈청 인간 TTR 수준(도 14b) 사이에 상관관계가 있음을 보여준다. 참고: 각 가이드 ID에서 처음 3개의 '0'은 도면에서 생략되었으며, 예를 들어, 표 2 및 표 3에서 "G481"은 "G000481"이다.
도 15a 내지 도 15b는 마우스와 cyno 사이에 교차 상동(교차 상동)인 가이드 G502를 포함하는 LNP 제형의 투여 후 야생형 마우스에서 편집 퍼센트(도 15a) 및 혈청 TTR 수준(도 15b)에 대한 용량 반응이 있음을 보여준다.
도 16은 일차 cyno 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 인간 TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 17은 일차 인간 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 cyno TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 18은 일차 cyno 간세포에 대해 지질 나노입자로 제형화된 cyno TTR 특이적 sgRNA의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 19a 내지 도 19d는 표시된 비 및 양(도 19b 및 도 19d)으로 LNP 제형의 투여 후 혈청 TTR(TSS%; 도 19a 및 도 19c) 및 편집 결과를 보여준다.
도 20은 TTR을 표적화하는 일차 인간 간세포(PHH)에서 소정의 단일 가이드 RNA의 표적외 분석을 보여준다. 그래프에서, 채워진 사각형은 표적 절단 부위의 확인을 나타내는 반면, 열린 원은 잠재적인 표적외 부위의 확인을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21b는 지질 나노입자로 제형화된 G000480의 투여 후 일차 인간 간세포에서 표적(on target: ONT, 도 21a) 및 2개의 표적외 부위(OT2 및 OT4)에서의 편집 퍼센트를 보여준다. 도 21b는 도 21a의 OT2, OT4 및 음성 대조군(Neg Cont) 데이터의 재-변환된(re-scaled) 버전이다.
도 22a 내지 도 22b는 지질 나노입자로 제형화된 G000486의 투여 후 일차 인간 간세포에서 표적(ONT, 도 22a) 및 표적외 부위 (OT4)에서의 편집 퍼센트를 보여준다. 도 22b는 도 22a의 OT4 및 음성 대조군(Neg Cont) 데이터의 재-변환된 버전이다.
도 23a 내지 도 23b는 TTR 유전자좌에서 편집 퍼센트(도 23a) 및 삽입 및 결실 이벤트의 수를 보여준다(도 23b). 도 23a는 대조군 그룹 및 처리 그룹(지질 나노입자로 제형화된 TTR 특이적 sgRNA가 투여됨)에서 TTR 유전자좌에서의 편집 퍼센트를 보여준다. 도 23b는 도 23a의 처리 그룹에서 편집이 관찰되었을 때 TTR 유전자좌에서의 삽입 및 결실 이벤트의 수를 보여준다.
도 24a 내지 도 24b는 대조군 그룹 및 처리 그룹(지질 나노입자로 제형화된 TTR 특이적 sgRNA가 투여됨)에 대한 ㎍/㎖ 단위의 순환 혈청(도 24a) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF)(도 24b)에서의 TTR 수준을 각각 보여준다. 처리는 혈청에서의 TTR 수준의 99% 초과의 넉다운을 초래하였다.
도 25a 내지 도 25d는 대조군 및 처리(지질 나노입자로 제형화된 TTR 특이적 sgRNA가 투여됨) 마우스로부터의 위(도 25a), 결장(도 25b), 좌골 신경(도 25c) 및 후근 신경절(DRG)(도 25d)에서의 TTR에 대한 염색을 사용한 면역조직화학 이미지를 보여준다. 오른쪽에서, 막대 그래프는 각 조직 유형에 대한 점유된 면적의 퍼센트에 의해 측정되는 바와 같은 처리된 마우스의 처리 후 8주에 TTR 염색의 감소를 보여준다.
도 26a 내지 도 26c는 가이드 G000480, G000488, G000489 및 G000502 및 가이드에 대해 중량을 기준으로 1:1의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하는 용량 범위에 걸쳐 LNP 제형이 투여된 인간화된 TTR 마우스로부터의 간 TTR 편집(도 26a) 및 혈청 TTR 결과(㎍/㎖ 단위(도 26b) 및 TSS-처리된 대조군의 백분율(도 26c))를 각각 보여준다.
도 27a 내지 도 27c는 가이드 G000481, G000482, G000486 및 G000499 및 가이드에 대해 중량을 기준으로 1:1의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하는 용량 범위에 걸쳐 LNP 제형이 투여된 인간화된 TTR 마우스로부터의 간 TTR 편집(도 27a) 및 혈청 TTR 결과(㎍/㎖ 단위(도 27b) 및 TSS-처리된 대조군의 백분율(도 27c))를 각각 보여준다.
도 28a 내지 도 28c는 가이드 G000480, G000481, G000486, G000499 및 G000502 및 가이드에 대해 중량을 기준으로 1:2의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하는 용량 범위에 걸쳐 LNP 제형이 투여된 인간화된 TTR 마우스로부터의 간 TTR 편집(도 28a) 및 혈청 TTR 결과(㎍/㎖ 단위(도 28b) 및 TSS-처리된 대조군의 백분율(도 28c))를 각각 보여준다.
도 29는 음성(비처리) 대조군과 비교하여, 표시된 바와 같이 Cas9 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 일차 인간 간세포(PHH)에서의 TTR mRNA의 상대적 발현을 보여준다.
도 30은 음성(비처리) 대조군과 비교하여, 표시된 바와 같이 Cas9 mRNA 및 gRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 일차 인간 간세포(PHH)에서의 TTR mRNA의 상대적 발현을 보여준다.
도 31a 내지 도 31c는 LNP의 30' 투여를 장기 투여 프로토콜과 비교하는 비인간 영장류에서의 생체내 연구에서 혈청 TTR 수준(도 31a), 간 TTR 편집(도 31b) 및 순환 ALT 수준(도 31c)을 보여준다.
이제 본 발명의 소정의 실시형태에 대해 상세하게 참조할 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 예시되어 있다. 본 발명은 예시된 실시형태와 관련하여 기재될 것이지만, 이는 본 발명을 이러한 실시형태로 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
본 교시를 상세하게 설명하기 전에, 본 개시내용은 변경될 수 있는 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "접합체"에 대한 언급은 복수의 접합체를 포함하고, "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다.
수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 측정된 그리고 측정 가능한 값은 측정과 관련된 유효 숫자 자릿수 및 오류를 고려하여 근사치로 이해된다. 또한, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하다(contain)", "함유하다(contains)", "함유하는(containing)", "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"의 사용은 제한하려는 의도가 아니다. 전술한 일반적인 설명 및 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것이며, 교시 내용을 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
위의 명세서에서 구체적으로 언급하지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소를 "구성하는(consisting of)" 또는 "본질적으로 구성하는(consisting essentially of)" 것으로 상정되고; 다양한 구성요소를 "구성하는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 구성하는" 것으로 상정되며; 그리고 인용된 다양한 구성요소를 "본질적으로 구성하는"을 인용하는 명세서의 실시형태는 또한 인용된 구성요소를 "구성하는" 또는 "포함하는" 것으로 상정된다(이러한 호환성은 청구 범위에서 이러한 용어의 사용에 적용되지 않음). 용어 "또는"은 문맥이 달리 명시하지 않는 한 포괄적인 의미, 즉, "및/또는"과 동등한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 부문의 제목은 구조적인 목적만을 위한 것으로, 목적하는 특허 대상을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조에 의해 원용되는 임의의 자료가 본 명세서에 정의된 용어 또는 본 명세서의 다른 명시적 내용과 모순되는 경우 본 명세서가 우선한다. 본 교시가 다양한 실시형태와 관련하여 설명되지만, 본 교시는 이러한 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포함한다.
I. 정의
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다음 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다:
"폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 질소 헤테로고리형 염기 또는 염기 유사체가 백본을 따라 함께 연결된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되며, 종래의 RNA, DNA, 혼합된 RNA-DNA 및 이들의 유사체인 중합체를 포함한다. 핵산 "백본"은 당-포스포다이에스터 연결, 펩타이드-핵산 결합("펩타이드 핵산" 또는 PNA; PCT WO 95/32305), 포스포로티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스 또는 치환, 예를 들어, 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환이 있는 유사한 화합물일 수 있다. 질소 염기는 종래의 염기(A, G, C, T, U), 이들의 유사체(예를 들어, 변형된 우리딘, 예컨대, 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘 또는 N1-메틸슈도우리딘 등); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체(예를 들어, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5번 또는 6번 위치에 치환기를 갖는 피리미딘 염기(예를 들어, 5-메틸사이토신), 2번, 6번 또는 8번 위치에 치환기를 갖는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-다이메틸하이드라진-피리미딘 및 O4-알킬-피리미딘; 미국 특허 제5,378,825호 및 PCT WO 93/13121)일 수 있다. 일반적인 논의를 위해, 문헌[The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992] 참조. 핵산은 백본이 중합체의 위치(들)에 대한 질소 염기를 포함하지 않는 하나 이상의 "비염기성" 잔기를 포함할 수 있다(미국 특허 제5,585,481호). 핵산은 종래의 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나 또는 종래의 구성요소 및 치환(예를 들어, 2' 메톡시 연결이 있는 종래의 염기 또는 종래의 염기와 하나 이상의 염기 유사체를 모두 함유하는 중합체)을 모두 포함할 수 있다. 핵산은 상보적 RNA 및 DNA 서열에 대한 혼성화 친화도를 향상시키는 당 형태를 모방하는 RNA에 잠긴 이중고리형 퓨라노스 단위가 있는 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드 단량체를 함유하는 유사체인 "잠금 핵산"(locked nucleic acid: LNA)을 포함한다(문헌[Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41]). RNA와 DNA는 상이한 당 모이어티를 가지며, RNA에서 우라실 또는 이의 유사체 및 DNA에서 티민 또는 이의 유사체의 존재에 따라 상이할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드"는 3차원 형태를 채택할 수 있는 아미노산 잔기를 포함하는 다량체 화합물을 지칭한다. 폴리펩타이드는 효소, 효소 전구체 단백질, 조절 단백질, 구조적 단백질, 수용체, 핵산 결합 단백질, 항체 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리펩타이드는 번역후 변형, 비-천연 아미노산, 보결기(prosthetic group) 등을 포함할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다.
"가이드 RNA", "gRNA" 및 "가이드"는 crRNA(CRISPR RNA로도 알려짐) 또는 crRNA와 trRNA(tracrRNA로도 알려짐)의 조합을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA, sgRNA)로서 또는 2개의 개별 RNA 분자(이중 가이드 RNA, dgRNA)로 회합될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생적 서열 또는 자연 발생적 서열과 비교하여 변형 또는 변이를 갖는 trRNA 서열일 수 있다. 가이드 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 RNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "가이드 서열"은 표적 서열에 상보적이고, RNA-가이드된 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형(예를 들어, 절단)을 위한 표적 서열로 가이드 RNA를 지시하는 기능을 하는 가이드 RNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열" 또는 "스페이서 서열"로 지칭될 수 있다. 가이드 서열은 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogene)(즉, Spy Cas9) 및 관련 Cas9 상동체/오쏘로그(ortholog)의 경우, 20개의 염기쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 15개-, 16개-, 17개-, 18개-, 19개-, 21개-, 22개-, 23개-, 24개- 또는 25개-뉴클레오타이드 길이의 더 짧거나 또는 더 긴 서열이 또한 가이드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 유전자 또는 염색체에 있으며, 예를 들어, 가이드 서열에 대해 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드와 약 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 또는 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있되, 표적 서열의 총 길이는 적어도 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 가이드 서열이 적어도 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 1개 내지 4개의 미스매치를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 가이드 서열이 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있다.
Cas 단백질에 대한 표적 서열은 단백질에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이기 때문에 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 서열 주어진 및 서열의 역전된 보체)을 모두 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보적"인 것이라 하는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 역전된 보체에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역전된 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T를 U로 치환한 것을 제외하고는 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 소정의 뉴클레오타이드와 동일하다.
본 명세서에서 사용되는 "RNA-가이드된 DNA 결합제"는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하되, DNA 결합 활성은 서열-특이적이며 RNA의 서열에 따라 달라진다. 예시적인 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리베이스/닉케이스(nickase) 및 이들의 불활성화된 형태("dCas DNA 결합제")를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "Cas 단백질"로도 불리는 "Cas 뉴클레이스"는 또한 Cas 클리베이스, Cas 닉케이스 및 dCas DNA 결합제를 포함한다. Cas 클리베이스/닉케이스 및 dCas DNA 결합제는 III형 CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 서브유닛, I형 CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "클래스 2 Cas 뉴클레이스"는 RNA-가이드된 DNA 결합 활성을 갖는 단일쇄 폴리펩타이드, 예컨대, Cas9 뉴클레이스 또는 Cpf1 뉴클레이스이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 클래스 2 Cas 클리베이스 및 클래스 2 Cas 닉케이스(예를 들어, H840A, D10A 또는 N863A 변이체)를 포함하며, 이는 RNA-가이드된 DNA 클리베이스 또는 닉케이스 활성 및 클리베이스/닉케이스 활성이 불활성화된 클래스 2 dCas DNA 결합제를 추가로 갖는다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9(예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9(예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0)(예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체) 및 eSPCas9(1.1)(예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이들의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질(문헌[Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)]은 Cas9와 상동하며, RuvC-유사 뉴클레이스 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 예를 들어, Zetsche의 표 S1 및 S3 참조. "Cas9"는 본 명세서에 열거된 Cas9의 변이체인 Spy Cas9 및 이의 등가물을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397(2015)] 참조.
"변형된 우리딘"은 본 명세서에서 우리딘과 동일한 수소 결합 수여체(acceptor) 및 우리딘과의 하나 이상의 구조적 차이를 갖는 티미딘 이외의 뉴클레오사이드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 치환된 우리딘, 즉, 하나 이상의 비-양성자성 치환기(예를 들어, 메톡시와 같은 알콕시)가 양성자를 대신하는 우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘(pseudouridine)이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 치환된 슈도우리딘, 즉, 하나 이상의 비-양성자성 치환기(예를 들어, 메틸과 같은 알킬)가 양성자를 대신하는 슈도우리딘, 예를 들어, N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 임의의 치환된 우리딘, 슈도우리딘 또는 치환된 슈도우리딘이다.
본 명세서에서 사용되는 "우리딘 위치"는 우리딘 또는 변형된 우리딘이 차지하는 폴리뉴클레오타이드 내의 위치를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "우리딘 위치의 100%가 변형된 우리딘"인 폴리뉴클레오타이드는 동일한 서열의 종래의 RNA(여기서, 모든 염기는 표준 A, U, C 또는 G 염기임)에서 우리딘이 될 모든 위치에 변형된 우리딘을 함유한다. 달리 나타내지 않는 한, 첨부된 본 개시내용에 있거나 또는 이에 수반되는 서열 표 또는 서열 목록의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 U는 우리딘 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제1 서열은 제2 서열에 대한 제1 서열의 정렬이 제2 서열 전체의 위치 중 X% 이상이 제1 서열과 일치됨을 나타내는 경우, 제2 서열에 대해 "적어도 X%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는" 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG에 대해 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이는 정렬이 제2 서열의 3개의 위치 모두에 대한 일치가 있다는 점에서 100%의 동일성을 제공할 것이기 때문이다. RNA와 DNA 사이의 차이(일반적으로 우리딘에서 티미딘으로 교환 또는 그 반대도 가능함) 및 변형된 우리딘과 같은 뉴클레오사이드 유사체의 존재는 관련 있는 뉴클레오타이드(예컨대, 티미딘, 우리딘 또는 변형된 우리딘)가 동일한 보체(예를 들어, 모든 티미딘, 우리딘 또는 변형된 우리딘에 대한 아데노신; 또 다른 예는 사이토신 및 5-메틸사이토신이며, 이들 둘 다 보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 가짐)를 갖는 한, 폴리뉴클레오타이드 간의 동일성 또는 상보성의 차이에 기여하지 않는다. 따라서, 예를 들어, X가 임의의 변형된 우리딘, 예컨대, 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘 또는 5-메톡시우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 다 동일한 서열(5'-CAU)에 완벽하게 상보적이라는 점에서 AUG와 100%의 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당업계에 잘 알려진 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 및 니들만-브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘이다. 당업자는 정렬된 주어진 한 쌍의 서열에 대해 어떤 알고리즘 및 매개변수 설정의 선택이 적절한지를 이해할 것이며; 일반적으로 유사한 길이의 서열 및 아미노산에 대해 50% 초과 또는 뉴클레오타이드에 대해 75% 초과의 예상되는 동일성의 경우, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에 의해 제공되는 니들만-브니쉬 알고리즘 인터페이스의 기본 설정을 갖는 니들만-브니쉬 알고리즘이 일반적으로 적절하다.
"mRNA"는 본 명세서에서 RNA 또는 변형된 RNA인 폴리뉴클레오타이드를 지칭하기 위해 사용되며, 폴리펩타이드(즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있음)로 번역될 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 백본을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 포스페이트-당 백본의 당은 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기 또는 이들의 조합으로 본질적으로 구성된다. 일반적으로, mRNA는 상당한 양의 티미딘 잔기를 포함하지 않는다(예를 들어, 0개의 잔기 또는 30개, 20개, 10개, 5개, 4개, 3개 또는 2개보다 적은 티미딘 잔기; 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 티미딘 함량). mRNA는 우리딘 위치의 일부 또는 전부에 변형된 우리딘을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 주어진 ORF의 "최소 우리딘 함량"은 (a) 모든 위치에서 최소 우리딘 코돈을 사용하고, (b) 주어진 ORF와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 ORF의 우리딘 함량이다. 주어진 아미노산에 대한 최소 우리딘 코돈(들)은 우리딘이 가장 적은 코돈(들)이다(보통 최소 우리딘 코돈이 2개의 우리딘을 갖는 페닐알라닌에 대한 코돈을 제외하고 0개 또는 1개). 변형된 우리딘 잔기는 최소 우리딘 함량을 평가하기 위해 우리딘과 동등한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 주어진 ORF의 "최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량"은 (a) 모든 위치에서 최소 우리딘 코돈(위에 논의된 바와 같음)을 사용하고, (b) 주어진 ORF와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 ORF의 가능한 가장 낮은 우리딘 다이뉴클레오타이드(UU) 함량이다. 우리딘 다이뉴클레오타이드(UU) 함량은 ORF에서 UU 다이뉴클레오타이드의 열거(enumeration)로서 절대 용어로 또는 우리딘 다이뉴클레오타이드의 우리딘이 차지하는 위치의 백분율로서 비율 기준으로 표현될 수 있다(예를 들어, 5개의 위치 중 2개가 우리딘 다이뉴클레오타이드의 우리딘이 차지하기 때문에, AUUAU는 40%의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 가질 것임). 변형된 우리딘 잔기는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 평가하기 위해 우리딘과 동등한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 주어진 오픈 리딩 프레임(ORF)의 "최소 아데닌 함량"은 (a) 모든 위치에서 최소 아데닌 코돈을 사용하고, (b) 주어진 ORF와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 ORF의 아데닌 함량이다. 주어진 아미노산에 대한 최소 아데닌 코돈(들)은 아데닌이 가작 적은 코돈(들)이다(최소 아데닌 코돈이 2개의 아데닌을 갖는 라이신 및 아스파라긴에 대한 코돈을 제외하고 보통 0개 또는 1개). 변형된 아데닌 잔기는 최소 아데닌 함량을 평가하기 위한 아데닌과 동등한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 주어진 오픈 리딩 프레임(ORF)의 "최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량"은 (a) 모든 위치에서 최소 아데닌 코돈(위에 논의된 바와 같음)을 사용하고, (b) 주어진 ORF와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 ORF의 가능한 가장 낮은 아데닌 다이뉴클레오타이드(AA) 함량이다. 아데닌 다이뉴클레오타이드(AA) 함량은 ORF에서 AA 다이뉴클레오타이드의 열거로서 절대 용어로 또는 아데닌 다이뉴클레오타이드의 아데닌이 차지하는 위치의 백분율로서 비율 기준으로 표현될 수 있다(예를 들어, 5개의 위치 중 2개가 아데닌 다이뉴클레오타이드의 아데닌이 차지하기 때문에, UAAUA는 40%의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 가질 것임). 변형된 아데닌 잔기는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 평가하기 위해 아데닌과 동등한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "TTR"은 TTR 유전자의 유전자 산물인 트랜스티레틴을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아밀로이드"는 일반적으로 가용성인 단백질 또는 펩타이드의 비정상적인 응집체를 지칭한다. 아밀로이드는 불용성이며, 아밀로이드는 장기와 조직에 단백질성 침전물을 생성할 수 있다. 아밀로이드의 단백질 또는 펩타이드는 단백질의 많은 카피가 서로 달라붙어 원섬유를 형성할 수 있는 형태로 잘못 접힐 수 있다. 일부 형태의 아밀로이드는 인체에서 정상적인 기능을 가질 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 "아밀로이드"는 단백질의 비정상적 또는 병리학적 응집체를 지칭한다. 아밀로이드는 TTR과 같은 단일 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있거나 또는 TTR 및 추가적인 단백질과 같은 다중 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아밀로이드 원섬유"는 분해에 저항성인 아밀로이드의 불용성 섬유를 지칭한다. 아밀로이드 원섬유는 특정 단백질 또는 펩타이드 및 그것이 응집된 조직 및 세포 유형에 기초하여 증상을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아밀로이드증"은 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 침착에 의해 유발되는 증상을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 아밀로이드증은 심장, 신장, 간, 비장, 신경계 및 소화관을 포함하는 수많은 장기에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "ATTR", "TTR-관련 아밀로이드증", "TTR 아밀로이드증", "ATTR 아밀로이드증" 또는 "TTR과 관련된 아밀로이드증"은 TTR의 침착과 관련된 아밀로이드증을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "가족성 아밀로이드 심근증" 또는 "FAC"는 주로 제한성 심근증(restrictive cardiomyopathy)을 특징으로 하는 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증(hereditary transthyretin amyloidosis)(ATTR)을 지칭한다. 울혈성 심부전은 FAC에서 흔하다. 발병의 평균 연령은 대략 60세 내지 70세이며, 진단 후 예측된 예상 수명은 4년 내지 5년이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "가족성 아밀로이드 다발신경병증" 또는 "FAP"는 주로 감각운동 신경병증을 특징으로 하는 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증(ATTR)을 지칭한다. 자율 신경병증(Autonomic neuropathy)은 FAP에서 흔하다. 신경병증이 주요 특징이지만, FAP의 증상은 또한 악액질(cachexia), 신부전(renal failure) 및 심장의 질환도 포함할 수 있다. FAP의 발병의 평균 연령은 대략 30세 내지 50세이며, 진단 후 예측되는 예상 수명은 5세 내지 15세이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "야생형 ATTR" 및 "ATTRwt"는 병리학적 TTR 돌연변이, 예컨대, T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, V122I, V122A 또는 V122(-)와 관련이 없는 ATTR을 지칭한다. ATTRwt는 또한 노인 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis)으로 지칭되기도 한다. 발병은 전형적으로 60세 이상의 남성에서 발생하며, 가장 흔한 증상은 울혈성 심부전 및 심방세동(atrial fibrillation)과 같은 비정상적인 심장 박동이다. 추가적인 증상은 숨가쁨(shortness of breath), 피로(fatigue), 현기증(dizziness), 부기(swelling)(특히, 다리), 메스꺼움(메스꺼움), 협심증(angina), 수면 장애(disrupted sleep) 및 체중 감소와 같은 불량한 심장 기능의 결과를 포함한다. 수근관 증후군의 병력은 ATTRwt의 위험 증가를 나타내며, 어떤 경우에는 초기 단계의 질환을 나타낼 수 있다. ATTRwt는 일반적으로 시간이 지남에 따라 심장 기능을 감소시키지만, 야생형 TTR 침전물이 더 천천히 축적되기 때문에 유전성 ATTR보다 더 나은 예후예측을 가질 수 있다. 기존의 치료는 다른 형태의 ATTR(간 이식 제외)과 유사하며, 일반적으로 이뇨제, 제한된 수분과 염분 섭취에서 항응고제 및 심한 경우 심장 이식에 이르기까지 심장 기능을 지지하거나 개선하는 것에 중점을 둔다. 그럼에도 불구하고, FAC와 마찬가지로, ATTRwt는 심부전으로 사망할 수 있으며, 때로는 진단 3년 내지 5년 이내에 발생할 수 있다.
본 명세서에 기재된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 가이드 서열은 표 1 및 본 출원의 전반에 걸쳐 나타나 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전성 ATTR"은 TTR 유전자의 서열의 돌연변이와 관련된 ATTR을 지칭한다. ATTR과 관련된 TTR 유전자의 공지된 돌연변이는 T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, V122I, V122A 또는 V122(-)의 치환을 갖는 TTR을 초래하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "indel"은 표적 핵산의 이중-가닥 파손(DSB)의 부위에 삽입되거나 또는 결실된 다수의 뉴클레오타이드로 구성된 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "넉다운(knockdown)"은 특정 유전자 산물(예를 들어, 단백질, mRNA 또는 둘 다)의 발현의 감소를 지칭한다. 단백질의 넉다운은 조직 또는 세포 집단(예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서)에 의해 분비되는 단백질을 검출하거나 또는 관심 있는 조직 또는 세포 집단으로부터의 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정될 수 있다. mRNA의 넉다운을 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 관심 있는 조직 또는 세포 집단으로부터 단리된 mRNA의 시퀀싱을 포함한다. 일부 실시형태에서, "넉다운"은 특정 유전자 산물의 발현의 일부 손실, 예를 들어, 전사된 mRNA의 양의 감소 또는 세포 집단(조직에서 발견되는 것과 같은 생체내 집단을 포함)에 의해 발현되거나 또는 분비된 단백질의 양의 감소를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 본 명세서에서 사용되는 "넉아웃"은 세포에서 특정 단백질의 발현의 손실을 지칭한다. 넉아웃은 조직 또는 세포 집단(예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서)로부터의 단백질 분비의 양을 검출하거나 또는 단백질 조직 또는 세포 집단에서 총 세포량을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포에서(예를 들어, 조직에서 발견되는 것들과 같은 생체내 집단을 포함하는 세포 집단에서) TTR을 "넉아웃"시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 넉아웃은, 예를 들어, indel에 의해 생성된 돌연변이체 TTR 단백질의 형성이 아니라, 오히려 세포에서 표적 단백질의 완전한 발현의 상실이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이체 TTR"은 TTR의 야생형 아미노산 서열과 비교하여 TTR의 아미노산 서열이 변화된 TTR의 유전자 산물(즉, TTR 단백질)을 지칭한다. 인간 야생형 TTR 서열은 NCBI 유전자 ID: 7276; 앙상블(Ensembl): 앙상블: ENSG00000118271에서 이용할 수 있다. 예를 들어, 인간에서 ATTR과 관련된 TTR의 돌연변이체 형태는 T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, V122I, V122A 또는 V122(-)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "돌연변이체 TTR" 또는 "돌연변이체 TTR 대립유전자"는 야생형 서열(NCBI 유전자 ID: 7276; 앙상블: ENSG00000118271)과 비교하여 TTR의 뉴클레오타이드 서열에 변화가 있는 TTR 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "리보뉴클레오단백질"(ribonucleoprotein: RNP) 또는 "RNP 복합체"는 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예컨대, Cas 뉴클레이스, 예를 들어, Cas 클리베이스, Cas 닉케이스 또는 dCas DNA 결합제(예를 들어, Cas9)와 함께 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 표적 서열로 가이드하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하며 작용제는 표적 서열에 결합하고; 작용제가 클리베이스 또는 닉케이스인 경우, 결합 후에는 절단(cleaving) 또는 닉킹(nicking)이 생길 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열에 상보성을 갖는 표적 유전자의 핵산의 서열을 지칭한다. 표적 서열 및 가이드 서열의 상호작용은 RNA-가이드된 DNA 결합제가 표적 서열 내에서 결합, 및 잠재적으로 닉킹 또는 절단(작용제의 활성에 따라)되도록 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료"는 대상체의 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하며, 질환의 저해, 질환의 발생의 정지, 이의 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 치료 또는 질환의 하나 이상의 증상의 재발의 방지를 포함한다. 예를 들어, ATTR의 치료는 ATTR의 증상을 완화시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "병리학적 돌연변이"는 TTR과 같은 유전자 산물이 ATTR과 같은 질환의 발병을 유발, 촉진, 기여 또는 저해하지 못하게 만드는 돌연변이를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지질 나노입자"(LNP)는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의(즉, 하나 초과) 지질 분자를 포함하는 입자를 지칭한다. LNP는, 예를 들어, 마이크로스피어(단일층 및 다중층 소포, 예를 들어, "리포솜"(일부 실시형태에서, 실질적으로 구형인 층상 지질 이중층)을 포함하고, 보다 구체적인 실시형태에서, 예를 들어, 상당한 부분의 RNA 분자를 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음), 에멀션 중 분산된 상, 마이셀 또는 현탁액 중 내상(internal phase)일 수 있다. 에멀션, 미셀 및 현탁액이 국부 및/또는 국소 전달에 적합한 조성물일 수 있다. 또한, 예를 들어, 그 내용이 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2017173054A1 및 WO2019067992A1을 참조한다. 대상체에 뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 것으로 당업자에게 공지된 임의의 LNP는 가이드 RNA 및 본 명세서에 기재된 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산과 함께 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공여체 올리고뉴클레오타이드" 또는 "공여체 주형"은 표적 부위(예를 들어, 게놈 DNA의 표적 부위)에 삽입될 목적하는 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 공여체 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여체 올리고뉴클레오타이드는 LNP 또는 형질감염의 사용을 통해 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제(예를 들어, Cas9)를 암호화하는 핵산 서열과 함께 전달될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵 국재화 신호"(NLS) 또는 "핵 국재화 서열"은 진핵생물 세포의 핵에 이러한 서열을 포함하거나 이러한 서열에 연결된 분자의 수송을 유도하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국재화 신호는 수송될 분자의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, NLS는 공유 결합, 수소 결합 또는 이온 상호작용에 의해 분자의 나머지 부분에 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "약제학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 무독성이고, 생물학적으로 바람직하며, 그렇지 않으면 약제학적 용도를 위해 허용 가능한 약제학적 조성물을 제조하는데 유용함을 의미한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 부분적으로 의존한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "주입"은, 예를 들어, 대략 30분 내지 12시간의 주입 시간으로 하나 이상의 작용제의 능동적 투여를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 작용제는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 RNA-가이드된 DNA 결합제(예컨대 Cas9) 및 본 명세서에 기재된 gRNA를 암호화하는 mRNA를 포함하는 LNP를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "주입 예방제" 정맥내 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손(덱사메타손) 10㎎ 또는 등가물), 해열제(예를 들어, 경구 아세트아미노펜 또는 파라세타몰 500㎎), 정맥내 H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물) 및 정맥내 H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물) 중 하나 이상 또는 이들 전부를 포함하는 치료(예를 들어, LNP의 투여를 포함) 전 대상체에 투여된 양생법(regimen)을 지칭한다. 주입 예방제는 경구 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 8㎎ 또는 등가물)의 사전 투여와 선택적으로 조합된다. 일부 실시형태에서, 경구 코르티코스테로이드는 치료 8시간 내지 24시간 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 정맥내 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 10㎎ 또는 등가물), 경구 아세트아미노펜 500㎎, 정맥내 H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물), 정맥내 H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물) 중 하나 이상 또는 이들 전부는 치료 1시간 내지 2시간 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, H1 차단제 및/또는 H2 차단제는 경구로 투여된다.
II. TTR 유전자를 표적화하는 방법 및 조성물
대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물을 포함하는 관련 조성물이 본 명세서에 개시된다. 코르티코스테로이드, 가이드 RNA, RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 것들이 또한 본 명세서에 개시된 방법에 사용하기 위해 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 개시된 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 TTR을 표적화하는 가이드 RNA 및 선택적으로, RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 포함한다. 예를 들어, ATTR이 있는 대상체와 같은 이러한 방법 및 조성물로 치료되는 대상체는 ATTR wt 또는 ATTR의 유전성 또는 가족성 형태일 수 있는 야생형 또는 비-야생형 TTR 유전자 서열을 가질 수 있다.
코르티코스테로이드, 주입 예방제 및 본 명세서에 기재된 조성물을 함유하는 가이드-RNA의 투여량, 빈도 및 투여 방식은 독립적으로 제어될 수 있다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물과 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 다중 용량이 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전 또는 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA-함유 조성물의 다중 용량이 코르티코스테로이드의 전 또는 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 다중 용량 및 가이드 RNA-함유 조성물의 다중 용량이 투여된다.
가이드 RNA-함유 조성물, 예를 들어, 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 LNP 조성물은 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 30분 이상 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 30분 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 60분 이상 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 90분 이상 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 240분 이상, 300분 이상 또는 360분 이상 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간 또는 적어도 12시간 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 0.5시간 내지 1.5시간, 1.5시간 내지 2.5시간, 2.5시간 내지 3.5시간, 3.5시간 내지 4.5시간, 4.5시간 내지 5.5시간, 5.5시간 내지 6.5시간, 6.5시간 내지 7.5시간, 7.5시간 내지 8.5시간, 8.5시간 내지 9.5시간, 9.5시간 내지 10.5시간, 10.5시간 내지 11.5시간 또는 11.5시간 내지 12.5시간 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 60분, 약 90분, 약 120분, 약 150분, 약 180분, 약 240분, 약 300분 또는 약 360분 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 45시간 내지 75분, 75시간 내지 105분, 105시간 내지 135분, 135시간 내지 165분, 165시간 내지 195분, 195시간 내지 225분, 225시간 내지 255분, 255시간 내지 285분, 285시간 내지 315분, 315시간 내지 345분 또는 345시간 내지 375분 동안 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 1.5시간 내지 6시간 동안 주입에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 후 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간에 또는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전 선행하는 값 중 임의의 2개로 범위가 제한된 시간에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간 168시간에 또는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 후 선행하는 값 중 임의의 2개로 범위가 제한된 시간에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전 약 8시간 내지 24시간에 전달되고, 주입 예방제는 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전 1시간 내지 2시간에 투여된다. 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여와 함께 또는 이와 거의 동시에 투여될 수 있다.
적절한 경우, 코르티코스테로이드의 용량은 적절한 간격으로 별도로 투여되는 적어도 2회의 하위-용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전에 적어도 2회 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 용량은 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 후에 적어도 2회 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일; 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주의 간격으로; 또는 선행하는 값 중 임의의 2개로 범위가 제한된 시간에 투여된다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전에, 이와 함께 그리고/또는 이후에). 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일; 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주의 간격으로; 또는 선행하는 값 중 임의의 2개로 범위가 제한된 시간에 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일; 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주의 간격으로; 또는 선행하는 값 중 임의의 2개로 범위가 제한된 시간에 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 투여 후에 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 적어도 2회 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 적어도 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 적어도 4회 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 최대 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 투여된다. 제1 투여는 경구일 수 있고, 제2 또는 후속 투여는 비경구 투여, 예를 들어, 주입에 의한 것일 수 있다. 대안적으로, 제1 투여는 비경구일 수 있고, 제2 또는 후속 투여는 경구 투여에 의한 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 정맥내 투여 전에 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA-함유 조성물의 정맥내 투여시 또는 투여 후 경구로 투여된다.
A. 코르티코스테로이드; 주입 예방제
개시된 방법 및 조성물에 사용되는 코르티코스테로이드는 유전자 편집 조성물로 유전자 편집 및/또는 요법을 받는 대상체를 치료하는데 유용하다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 코르티코스테로이드는 외래 RNA(가이드 RNA 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA)에 대한 염증 또는 면역 반응을 감소시키는데 유용할 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에서 사용되는 코르티코스테로이드는 당업계에 공지된 임의의 것 및/또는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능한 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 주입 예방제는 유전자 편집 조성물 전, 예를 들어, 유전자 편집 조성물의 투여 전 1시간 내지 2시간에 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, 주입 예방제는 정맥내 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎ 또는 등가물 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 코르티코스테로이드), 해열제(예를 들어, 경구 아세트아미노펜(파라세타몰이라고도 함) 500㎎), H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물), H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물) 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 주입 예방제는 정맥내 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎ 또는 등가물) 및 해열제(예를 들어, 경구 아세트아미노펜 또는 파라세타몰 500㎎)를 포함한다. 일부 실시형태에서, H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물) 및/또는 H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물)가 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물) 및/또는 H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물)는 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서 정맥내 H1 차단제 및/또는 정맥내 H2 차단제는 등가물, 예를 들어, 경구로 투여된 등가물로 치환된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 경구 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 6㎎ 내지 10㎎, 예컨대, 8㎎ 또는 등가물 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 코르티코스테로이드)는, 예를 들어, 치료 전 8시간 내지 24시간에 투여될 수 있다. 이들 투여량은, 예를 들어, 대상체가 인간, 예를 들어, 성인 인간인 경우 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주입 예방제는 다음으로 구성된다: 염증의 중증도를 감소시킬 수 있는 정맥내 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손 10㎎ 또는 등가물), 통증과 열을 줄이고/줄이거나 COX 효소 및/또는 프로스타글란딘을 저해할 수 있는 경구 아세트아미노펜 500㎎, H1 및 H2 수용체에서 각각 히스타민의 작용을 차단하는 작용을 하며 선택적으로, 예를 들어, 유전자 편집 조성물의 투여 전 8시간 내지 24시간에 경구 덱사메타손의 투여(예컨대, 8㎎ 또는 등가물의 양으로)가 선행될 수 있는 정맥내 H1 차단제(예를 들어, 다이펜하이드라민 50㎎ 또는 등가물) 및 정맥내 H2 차단제(예를 들어, 라니티딘 50㎎ 또는 등가물). 주입 예방제는 가이드 RNA-함유 조성물, 예를 들어, LNP 조성물을 투여와 관련된 부작용을 줄이는 기능을 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및/또는 주입 예방제는 가이드 RNA-함유 조성물, 예를 들어, LNP 조성물을 투여하기 전 필요한 예비약제로서 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 하나 이상의 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상과 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 아세트아미노펜 및 H1 차단제와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 아세트아미노펜 및 H2 차단제와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 H1 차단제 및 H2 차단제와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, H1 차단제 및/또는 H2 차단제는 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제와 동시에 투여된다.
많은 H1 및 H2 차단제가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, H1 차단제는 다이펜하이드라민, 클레마스틴(clemastine), 세티리진(cetirizine), 테르페나딘(terfenadine), 독실아민(doxylamine), 미르타자핀(mirtazapine), 덱스브롬페니라민(dexbrompheniramine), 트라이프롤리딘(triprolidine), 사이프로헵타딘(cyproheptadine), 로라타딘(loratadine), 하이드록시진(hydroxyzine), 신나리진(cinnarizine), 아스테미졸(astemizole), 아자타딘(azatadine), 메클리진(meclizine), 카비녹사민(carbinoxamine), 에피나스틴(epinastine), 올로파타딘(olopatadine), 트라이펠렌아민(tripelennamine), 브롬페니라민(brompheniramine), 케토티펜(ketotifen), 펙소페나딘(fexofenadine), 데스로라타딘(desloratadine), 아젤라스틴(azelastine), 다이멘하이드리네이트(dimenhydrinate), 프로메타진(promethazine), 메퀴타진(mequitazine), 에메다스틴(emedastine), 레보카바스틴(levocabastine), 클로르페니라민(chlorpheniramine), 사이클리진(cyclizine), 알리메마진(alimemazine), 페닌드라민(phenindamine), 페니라민(pheniramine), 메타피릴린(methapyrilene), 플루나리진(flunarizine), 미안세린(mianserin), 레보세티리진(levocetirizine), 에스미르타자핀(esmirtazapine), 메피라민(mepyramine), 알카프타딘(alcaftadine), 안타졸린(antazoline), 클로로피라민(chloropyramine), 다이메틴덴(dimetindene), 다이메토티아진(dimetotiazine), 아크리바스틴(acrivastine), 덱스클로르페니라민 말레이트(dexchlorpheniramine maleate), 에바스틴(ebastine), 미졸라스틴(mizolastine), gsk-1004723, 옥사토마이드(oxatomide), 덱스클로르페니라민(dexchlorpheniramine), 베포타스틴(bepotastine), 부클리진(buclizine), 리스페리돈(risperidone), 메트다일라진(methdilazine), 마프로틸린(maprotiline), 다이페닐피랄린(diphenylpyraline), 브로모다이펜하이드라민(bromodiphenhydramine), 지프라시돈(ziprasidone), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 프로마진(promazine), 트라조돈(trazodone), 독세핀(doxepin), 데시프라민(desipramine), 오르페나드린(orphenadrine), 메토트라이메프라진(methotrimeprazine), 클로페다놀(clofedanol), 클로르프로티센(chlorprothixene), 퀘티아핀(quetiapine), 아세나핀(asenapine), 벤자트로핀(benzatropine), 아리피프라졸(aripiprazole), 아미트라이프틸린(amitriptyline), 이미프라민(imipramine), 노르트라이프틸린(nortriptyline), 트라이미프라민(trimipramine), 아이소티펜딜(isothipendyl), 클로르프로마진(chlorpromazine), 일로페리돈(iloperidone), 주클로펜티솔(zuclopenthixol), 클로르사이클리진(chlorcyclizine), 아목사핀(amoxapine), 부트라이프틸린(butriptyline), 카리프라진(cariprazine), 바이라스틴(bilastine), 도설레핀(dosulepin), 루파타딘(rupatadine), 피조티펜(pizotifen), 톤질아민(thonzylamine), 벤즈퀴나마이드(benzquinamide), 프로피오마진(propiomazine), 아세프로메타진(aceprometazine), 아리피프라졸 라우록실(aripiprazole lauroxil) 또는 데프트로핀(deptropine)이다.
일부 실시형태에서, H2 차단제는 라니티딘, 니자티딘(nizatidine), 시메티딘(cimetidine) 또는 파모티딘(famotidine)이다. 등가물 코르티코스테로이드 및 투여량은, 예를 들어, 문헌[Liu et al., Allergy, Asthma & Clinical Immunology, 2013, 9:30]에서 찾을 수 있다. 등가물 항히스타민(H1 차단제 및/또는 H2 차단제) 및 투여량은 당업계에 공지된 것과 같은 클래스의 적합한 구성원에 대한 통상적인 투여량을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 2회 용량의 코르티코스테로이드는 조성물의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전에 코르티코스테로이드의 제2 용량이 투여되기 전 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상과 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상과 동시에 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제와 동시에 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드의 제1 용량은 조성물이 투여되기 전 8시간 내지 24시간 이내에 경구로 투여되고, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 조성물이 투여되기 전 1시간 내지 2시간 이내에 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제와 정맥내로 동시에 투여되되, 아세트아미노펜은 경구로 투여되고, H1 차단제 및 H2 차단제는 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 내약성을 개선한다. 예를 들어, 코르티코스테로이드 없이 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 비교하여, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 하나 이상의 부작용, 예컨대, 염증, 메스꺼움, 구토, 혈액에서의 상승된 ALT 농도, 고열 및/또는 통각 과민증 중 하나 이상의 발생률 또는 중증도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 가이드 RNA를 포함하는 조성물에 반응하여 하나 이상의 인터페론 및/또는 염증성 사이토카인의 생성 또는 활성을 감소시키거나 또는 저해한다.
예시적인 코르티코스테로이드는 덱사메타손, 베타메타손(betamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 코르티손(cortisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트라이암시놀론(triamcinolone) 또는 에타메타손(ethamethasone) 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 코르티코스테로이드는 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손(Rayos®, 호라이즌 파르마(Horizon Pharma)), 프레드니솔론(Pred Forte®, 알러간(Allergan); Omnipred™, 노바티스(Novartis)) 메틸프레드니솔론(Medrol®, 파마시아앤드업존(Pharmacia&Upjohn); Solu-Medrolx®, 파마시아앤드업존), 코르티손, 하이드로코르티손, 트라이암시놀론, 에타메타손, 부데소나이드(ENTOCORT®, 페리고 파르마 인터네셔널(Perrigo Pharma Intl); Rhinocort®, Symbicort®, 아스트라제네카 파르마(Astrazeneca Pharms); Ulceris®, 밸리언트 파르마(Valeant Pharms)), 파라메타손(paramethasone) 및 데플라자코트(deflazacort)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이다.
개시된 방법에 사용되는 코르티코스테로이드는 당업계에 공지된 양생법, 예를 들어, 미국 FDA-승인된 양생법에 따라 투여될 수 있다. 투여의 적합한 방식은 장관, 국소 및 비경구 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 일반적으로 주사에 의한 장관(경구를 포함) 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 대상체에 비경구적으로 또는 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 대상체에 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 대상체에 경구로 또는 장관으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 대상체에 국소로 투여된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 인간 대상체에 대한 또는 인간 대상체에서의 사용을 위한 투여를 포함하여, 코르티코스테로이드는 약 0.75㎎ 내지 약 25㎎ 범위의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인간 대상체에 대한 또는 인간 대상체에서의 사용을 위한 투여를 포함하여, 코르티코스테로이드는 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 0.5 ㎎/㎏, 예컨대, 0.1 ㎎/㎏ 내지 0.40 ㎎/㎏ 또는 0.25 ㎎/㎏ 내지 0.40 ㎎/㎏ 범위의 양으로 투여될 수 있다.
한 예에서, 덱사메타손은 가이드 RNA의 정맥내 투여 6시간 내지 12시간 전에 20㎎ 또는 25㎎의 양으로 경구로 투여된다. 또 다른 예에서, 덱사메타손은 가이드 RNA의 정맥내 투여 30분 또는 6시간 내지 12시간 전에 20㎎ 또는 25㎎의 양으로 정맥내로 투여된다. 또 다른 예에서, 덱사메타손은 가이드 RNA 조성물의 주입 8시간 내지 24시간 전에 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎의 양으로 경구로 투여된다. 또 다른 예에서, 덱사메타손은 가이드 RNA 조성물의 주입 1시간 내지 2시간 전에 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎의 양으로 정맥내로 투여된다. 또 다른 예에서, 덱사메타손은 가이드 RNA 조성물의 주입 8시간 내지 24시간 전에 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎의 양으로 경구로 투여되고, 덱사메타손은 가이드 RNA 조성물의 주입 1시간 내지 2시간 전에 8㎎ 내지 12㎎, 예컨대, 10㎎의 양으로 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손은 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 8㎎의 양으로 대상체에 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손은 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 8㎎의 양으로 대상체에 경구로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손은 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 10㎎의 양으로 대상체에 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 덱사메타손은 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 10㎎의 양으로 대상체에 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 대상체에 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 대상체에 정맥내로 투여되되, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 하나 이상의 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제와 동시에 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 대상체에 정맥내로 투여되되, 코르티코스테로이드의 제2 용량은 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제와 동시에 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 아세트아미노펜의 경구 투여 및 H1 차단제와 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 대상체에 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 8시간 내지 24시간 전에 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량이 조성물이 대상체에 투여되기 1시간 내지 2시간 전에 500㎎의 양의 아세트아미노펜의 경구 투여 및 50㎎의 양의 H1 차단제와 50㎎의 양의 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 대상체에 정맥내로 투여된다.
또한, 당업자는 코르티코스테로이드의 용량은 특정 코르티코스테로이드의 선택에 따라 쉽게 조정될 수 있음이 당업자에 의해 인식된다. 예를 들어, 비교를 위해, 다음은 코르티코스테로이드의 대략적인 등가의 ㎎ 투여량이다: 하이드로코르티손 20㎎; 코르티손 25㎎; 프레드니손 또는 프레드니솔론 5㎎; 데플라자코트 6㎎; 메틸프레드니솔론 4㎎; 덱사메타손 또는 베타메타손 0.75㎎; 트라이암시놀론 4㎎. 따라서, 위의 예에 제시된 코르티코스테로이드의 용량은 덱사메타손을 기준으로 하지만, 다른 코르티코스테로이드가 환자에게 투여되는 경우, 당업자는 등가 용량의 다른 코르티코스테로이드를 계산하기 위해 위의 변환 정보를 사용할 것이다.
B. 가이드 RNA(gRNA)
개시된 방법 및 조성물에 사용되는 가이드 RNA는 TTR 유전자를 표적화하는 가이드 서열을 포함한다. 예시적인 TTR 유전자를 표적화하는 가이드 서열은 서열번호 5 내지 82로 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
위의 가이드 서열 각각은 crRNA를 형성하기 위해, 예를 들어, 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는 다음의 예시적인 뉴클레오타이드 서열: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(서열번호 126)을 갖는 추가적인 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. sgRNA의 경우에, 위의 가이드 서열은 sgRNA를 형성하기 위해, 예를 들어, 5'에서 3' 방향으로 가이드 서열의 3' 말단을 따르는 다음의 예시적인 뉴클레오타이드 서열: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(서열번호 125)을 갖는 추가적인 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 변형된다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 아래 서열번호 3에 나타낸 변형 패턴을 포함하되, N은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, N의 전체(totality)는 본 명세서에 기재된 것과 같은 가이드 서열을 포함하며, 변형된 sgRNA는 다음의 서열: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(서열번호 3)을 포함하되, 여기에서 "N"은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 포함되는 것은 서열번호 3이고, 여기에서 N은 본 명세서에 개시된 임의의 가이드 서열로 대체된다. 변형은 가이드의 뉴클레오타이드에 대한 N의 치환에도 불구하고 서열번호 3에 나타난 바와 같이 유지된다. 즉, 가이드의 뉴클레오타이드가 "N"을 대체하지만, 처음 3개의 뉴클레오타이드는 2'OMe 변형되며, 제1 뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드, 제2 뉴클레오타이드와 제3 뉴클레오타이드 및 제3 뉴클레오타이드와 제4 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 연결이 있다.
일부 실시형태에서, 표 2에 언급된 서열 중 어느 하나가 포함된다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상응하는 sgRNA ID와 가이드 ID의 정렬 매핑뿐만 아니라 cyno 게놈 및 cyno 매치된 가이드 ID에 대한 상동성이 표 3에 제공된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 실시형태에서, gRNA는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레이스)일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 TTR의 표적 DNA 서열로 지시하는 가이드 서열을 포함한다. gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. gRNA는 trRNA를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 조성물 및 방법 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA(sgRNA)로서 회합될 수 있거나 또는 별개의 RNA(dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 구성요소는, 예를 들어, 포스포다이에스터　결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 실시형태에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는, 예를 들어, 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유적으로 연결되지 않을 수 있지만, crRNA와 trRNA의 부분 사이의 염기 페어링을 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 실시형태에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유적으로 연결된 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA(또는 이의 일부)를 포함할 수 있다. sgRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA와 trRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 crRNA와 trRNA의 부분 사이의 염기 페어링을 통해 스템-루프 구조를 형성한다. 일부 실시형태에서, crRNA와 trRNA는 포스포다이에스터 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, trRNA는 자연 발생적 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되는 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, trRNA는 절단된 또는 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용되는 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 실시형태에서, trRNA는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 또는 100개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, trRNA는, 예를 들어, 하나 이상의 헤어핀 또는 스템-루프 구조 또는 하나 이상의 벌지(bulge) 구조와 같은 2차 구조를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 61, 63, 65, 66, 68 또는 69이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5, 6, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 63, 65, 66, 68 또는 69이다.
다른 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 82의 가이드 서열 중 임의의 2개 이상으로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 각각 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
다른 실시형태에서, 조성물은 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열 중 임의의 2개 이상으로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 각각 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 임의의 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 61, 63, 65, 66, 68 또는 69로부터 선택되는 서열 또는 2개의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5, 6, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 63, 65, 66, 68 또는 69로부터 선택되는 서열 또는 2개의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 표 2에 나타낸 서열(서열번호 87 내지 124) 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표 2에 나타낸 서열(서열번호 87 내지 124) 중 어느 하나를 포함하지만, 나타낸 바와 같은 변형이 없는 sgRNA(즉, 변형되지 않은 서열번호 87 내지 124)이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 서열번호 87 내지 124의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 서열번호 87 내지 124의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일하지만, 나타낸 바와 같은 변형이 없는 서열(즉, 변형되지 않은 서열번호 87 내지 124)을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 변형이 있는지 여부에 관계없이 서열번호 87 내지 124의 표 2의 sgRNA 서열에 나타낸 가이드 서열 대신에 표 1에 나타낸 가이드 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124 중 어느 하나를 포함하지만, 표 2에 나타낸 바와 같은 변형이 없는 sgRNA(즉, 변형되지 않은 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124) 이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일하지만, 나타낸 바와 같은 변형이 없는 서열(즉, 변형되지 않은 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124)을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 변형이 있는지 여부에 관계없이 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 또는 122 내지 124의 표 2의 sgRNA 서열에 나타낸 가이드 서열 대신에 표 1에 나타낸 가이드 서열 중 어느 하나를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 가이드 RNA는 TTR 유전자에서 표적 서열을 인식(예를 들어, 이에 대한 혼성화)하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, TTR 표적 서열은 가이드 RNA를 포함하는 제공된 Cas 클리베이스에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 따라서, Cas 클리베이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제는 가이드 RNA에 의해 TTR 유전자의 표적 서열로 지시될 수 있되, 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열 및 Cas 클리베이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제와 혼성화하여 표적 서열을 절단한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 TTR 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 결정된다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 유전자의 소정의 영역에서 돌연변이(예를 들어, 뉴클레이스-매개성 DSB의 결과로서 발생하는 indel에서 발생하는 프레임쉬프트 돌연변이)는 유전자의 다른 영역에서의 돌연변이보다 덜 용인될 수 있으므로, DSB의 위치는 발생할 수 있는 단백질 넉다운의 양이나 유형에 중요한 요소이다. 일부 실시형태에서, TTR 내의 표적 서열에 상보적이거나 또는 상보성을 갖는 gRNA가 RNA-가이드된 DNA 결합제를 TTR 유전자 내의 특정 위치로 지시하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 TTR의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에서 표적 서열에 상보적이거나 또는 상보성을 갖는 가이드 서열을 갖도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 가이드 서열은 인간 TTR 유전자에 존재하는 표적 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 또는 동일성의 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열 및 gRNA의 가이드 서열은 100% 상보적이거나 또는 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 서열 및 gRNA의 가이드 서열은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열 및 gRNA의 가이드 서열은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있으며, 여기서 가이드 서열의 총 길이는 20이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열 및 gRNA의 가이드 서열은 가이드 서열이 20개의 뉴클레오타이드인 경우 1개 내지 4개의 미스매치를 포함할 수 있다.
C. gRNA의 변형
일부 실시형태에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA는 표준 A, G, C 및 U 잔기 대신 또는 이에 더하여 사용되는 하나 이상의 비-자연 및/또는 자연 발생적 구성요소 또는 구성의 존재를 설명하기 위해 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA라고 한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 비-표준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 합성되며, 본 명세서에서 "변형된"이라고 한다. 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 변경, 예를 들어, 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스터 백본 연결에서 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 대체(예시적인 백본 변형); (ii) 변경, 예를 들어, 리보스 당의 구성구성요소, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 대체(예시적인 당 변형); (iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포(dephospho)" 링커로의 전면적인 대체(예시적인 백본 변형); (iv) 비-표준 핵염기를 포함하는 자연 발생적 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형(예시적인 백본 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형).
위에 열거된 것들과 같은 화학적 변형은 2개, 3개, 4개 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형되며, 예를 들어, 모든 염기는 포스포로티오에이트기와 같은 변형된 포스페이트기를 갖는다. 소정의 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트기의 전부 또는 실질적으로 전부가 포스포로티오에이트기로 대체된다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단에 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단에 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 1개, 2개, 3개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA의 위치 중 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.
변형되지 않은 핵산은, 예를 들어, 세포내 뉴클레이스 또는 혈청에서 발견되는 뉴클레이스에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레이스는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는, 예를 들어, 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레이스에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체내 및 생체외 모두에서 세포 집단 내로 도입될 때 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
백본 변형의 일부 실시형태에서, 변형된 잔기의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 변형되지 않은 포스페이트 모이어티의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트기로의 전면적인 대체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 백본의 백본 변형은 비대칭적 전하 분포를 갖는 비하전된 링커 또는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 변형되지 않은 포스페이트기에서 인 원자는 비카이랄(achiral)이다. 그러나, 비-브리징 산소 중 하나를 위의 원자 또는 원자의 그룹 중 하나로 대체하면 인 원자가 카이랄(chiral)이 될 수 있다. 입체성인 원자는 "R" 배열(본 명세서에서 Rp) 또는 "S" 배열(본 명세서에서 Sp)을 가질 수 있다. 백본은 또한 브리징 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(브리지된 포스포로아미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 또는 연결 산소 둘 다에서 발생할 수 있다.
포스페이트기는 소정의 백본 변형에서 비-인 함유 커넥터(connector)로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 포스페이트기는 천연 모이어티로 대체될 수 있다. 포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드는 또한 포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레이스 저항성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대체물로 대체되는 구성일 수 있다. 이러한 변형은 백본 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 대체물 백본에 의해 연결될 수 있다. 예는, 제한 없이, 모폴리노, 사이클로뷰틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대체물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당기에 대한 하나 이상의 변형, 즉 당 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 변형, 예를 들어, 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기에 대한 변형은 하이드록실이 2'-알콕사이드 이온을 형성하기 위해 더 이상 탈양자화될 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기에서 "R"은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기에서 R은, 예를 들어, H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20의 정수일 수 있음(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16 및 4 내지 20))일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 2'-플루오로 변형일 수 있으며, 이는 2' 하이드록실기를 플루오라이드로 대체한다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 2' 하이드록실이, 예를 들어, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브리지에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠금" 핵산(LNA)을 포함할 수 있되, 예시적인 브리지는 메틸렌, 프로필렌, 에터 또는 아미노 브리지; O-아미노(여기에서 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기에서 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형에 리보스 고리에 C2'-C3' 결합이 결여되어 있는 "비잠금" 핵산(unlocked nucleic acid: UNA)이 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(methoxyethyl: MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 돌출 부분에서); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로 또는 아이오도); 아미노(여기에서 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 다이헤테로아릴아미노 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기에서 아미노는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기에서 R은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 사이아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알켄일 및 알킨일을 포함할 수 있으며, 이들은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당 변형은 리보스에서 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은, 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 비염기성 당을 포함할 수 있다. 이러한 비염기성 당은 또한 하나 이상의 구성구성요소 당 원자에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태, 예를 들어 L- 뉴클레오사이드인 하나 이상의 당을 포함할 수 있다.
변형된 핵산에 혼압될 수 있는 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기라고도 하는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산에 혼입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 또는 완전히 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는, 예를 들어, 염기의 자연 발생적 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 사용하는 실시형태에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 실시형태에서, sgRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있거나 또는 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 소정의 실시형태는 5' 말단 변형을 포함한다. 소정의 실시형태는 3' 말단 변형을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 가이드 RNA 분자의 단일 가닥 돌출부에 있는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 모두는 데옥시뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 가이드 RNA는 그 내용이 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 "Chemically Modified Guide RNAs"라는 명칭으로 2016년 12월 8일자로 출원된 US 62/431,756에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변형을 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
용어 "mA", "mC", "mU" 또는 "mG"는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변형은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00012
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 나타난 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 뉴클레이스 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "fA", "fC", "fU" 또는 "fG"는 2'-F로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00013
포스포로티오에이트(PS) 연결 또는 결합은, 예를 들어, 뉴클레오타이드 염기 사이의 결합의 포스포다이에스터 연결에서 하나의 비브리징 포스페이트 산소가 황으로 치환된 결합을 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해 포스포로티오에이트가 사용될 때, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 S-올리고로도 지칭될 수 있다.
"*"는 PS 변형을 나타내는데 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U* 또는 G*는 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*", "mC*", "mU*" 또는 "mG*"는 2'-O-Me로 치환되고 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 나타내는데 사용될 수 있다.
아래의 다이어그램은 S-를 비브리징 포스페이트 산소로 치환하여 포스포다이에스터 결합 대신 PS 결합을 생성하는 것을 보여준다:
Figure pct00014
비염기성 뉴클레오타이드는 질소 염기가 결여되어 있는 것을 지칭한다. 아래 도면은 염기가 결여되어 있는 비염기성(비퓨린성(apurinic)으로도 알려져 있음) 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다:
Figure pct00015
역전된 염기는 정상적인 5'에서 3'로의 연결(즉, 5'에서 5'로의 연결 또는 3'에서 3'으로의 연결)이 역전된 연결을 갖는 것을 지칭한다. 예를 들어,
Figure pct00016
.
비염기성 뉴클레오타이드는 역전된 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 비염기성 뉴클레오타이드는 5'에서 5'로의 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나 또는 비염기성 뉴클레오타이드는 3'에서 3'로의 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드에서 역전된 비염기성 뉴클레오타이드는 또한 역전된 비염기성 말단 캡이라고도 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 말단의 처음 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상 및 3' 말단의 마지막 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 역전된 비염기성 뉴클레오타이드, PS 결합 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키기 위해 당업계에 잘 알려진 다른 뉴클레오타이드 변형이다.
일부 실시형태에서, 5' 말단의 처음 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 역전된 비염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 변형된 sgRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 서열번호 3에 나타낸 변형 패턴을 포함하되, N은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, N의 전체는 뉴클레이스를 표적 서열로 지시하는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 서열번호 87 내지 124 중 어느 하나에 나타낸 sgRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 82의 가이드 서열 중 어느 하나 및 서열번호 125의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 포함하되, 서열번호 125의 뉴클레오타이드는 가이드 서열의 3' 말단에 있고, 가이드 서열은 서열번호 3에 나타낸 바와 같이 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 21번 내지 100번을 포함하는 sgRNA를 포함하되, 서열번호 3의 뉴클레오타이드는 가이드 서열의 3' 말단에 있고, 가이드 서열은 서열번호 3에 나타낸 바와 같이 변형될 수 있다.
D. RNA-가이드된 DNA 결합제
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 클래스 2 Cas 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 이중-가닥 엔도뉴클레이스 활성으로도 지칭될 수 있는 클리베이스 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 뉴클레이스, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레이스(이는, 예를 들어, II형, V형 또는 VI형의 Cas 뉴클레이스일 수 있음)를 포함한다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 및 C2c3 단백질 및 이들의 변형을 포함한다. Cas9 뉴클레이스의 예는 S. 피오게네스, S. 아우레우스 및 기타 원핵생물(예를 들어, 다음 단락의 목록 참조)의 II형 CRISPR 시스템의 것들 및 이들의 변형된(예를 들어, 조작된 또는 돌연변이체) 버전을 포함한다. 예를 들어, US2016/0312198 A1; US 2016/0312199 A1 참조. Cas 뉴클레이스의 다른 예는 III형 CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체 또는 이들의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 서브유닛; 및 I형 CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체 또는 이의 Cas3 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 IIA형, IIB형 또는 IIC형 시스템으로부터 유래될 수 있다. 다양한 CRISPR 시스템 및 Cas 뉴클레이스에 대한 논의는, 예를 들어, 문헌[Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477(2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397(2015)] 참조. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리베이스, 예를 들어, Cas9 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 닉케이스, 예를 들어, Cas9 닉케이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 클리베이스 또는 닉케이스와 같은 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스, 예를 들어, 클리베이스이다.
Cas 뉴클레이스가 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 올리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 와즈워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노젠(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseumii), 스트렙토스포란지움 로세움, 알리시클로바실러스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 마이크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종, 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트란에어로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페록시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종, 링비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006) 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 네이세리아 메닌지티디스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코커스 종으로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 추가의 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 라크노스피라세아에 박테리움, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그린박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium), 스미텔라(Smithella), 아시다미노코커스, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens) 또는 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 소정의 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코커스 또는 라크노스피라세아에로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다.
야생형 Cas9는 2개의 뉴클레이스 도메인: RuvC 및 HNH를 갖는다. RuvC 도메인은 비-표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레이스는 하나 이상의 RuvC 도메인 및/또는 하나 이상의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레이스는 야생형 Cas9이다. 일부 실시형태에서, Cas9는 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 소정의 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 dsDNA를 절단할 수 있으며, 이는 dsDNA의 한 가닥을 절단할 수 있거나 또는 DNA 클리베이스 또는 닉케이스 활성을 가지고 있지 않을 수 있다. 예시적인 Cas9 아미노산 서열은 서열번호 203으로서 제공된다. 시작 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 Cas9 mRNA ORF 서열은 서열번호 311로서 제공된다. 융합 단백질에 포함되기에 적합한 예시적인 Cas9 mRNA 코딩 서열은 서열번호 210으로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 단백질의 하나의 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 일부로 대체된 키메라 Cas 뉴클레이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레이스로부터의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 변형된 뉴클레이스일 수 있다.
다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 I형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 I형 CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성요소일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 III형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단일-가닥 닉케이스 활성을 가지며, 즉, "닉(nick)"으로도 알려진 단일-가닥 절단을 생성하기 위해 하나의 DNA 가닥을 자를 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 닉케이스를 포함한다. 닉케이스는 dsDNA에서 닉을 생성하는 효소이며, 즉, DNA 이중 나선의 한 가닥은 자르고 다른 가닥은 자르지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas 닉케이스는, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 핵내분해성(endonucleolytic) 활성 부위가 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. 예를 들어, 닉케이스 및 예시적인 촉매 도메인 변경의 논의의 경우 미국 특허 제8,889,356호 참조. 일부 실시형태에서, Cas9 닉케이스와 같은 Cas 닉케이스는 불활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다. 예시적인 Cas9 닉케이스 아미노산 서열은 서열번호 206으로서 제공된다. 시작 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 Cas9 닉케이스 mRNA ORF 서열은 서열번호 207로서 제공된다. 융합 단백질에 포함시키기에 적합한 예시적인 Cas9 닉케이스 mRNA 코딩 서열은 서열번호 211로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 단 하나의 기능성 뉴클레이스 도메인을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레이스 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 활성이 감소된 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질 뉴클레이스 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레이스 활성을 감소 또는 변경하기 위해 치환된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 D10A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771] 참조. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al.(2015)] 참조. 추가의 예시적인 아미노산 치환은 D917A, E1006A 및 D1255A(프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1(FnCpf1) 서열(UniProtKB - A0Q7Q2(CPF1_FRATN)) 기반)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 닉케이스를 암호화하는 핵산은 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥 각각에 상보적인 가이드 RNA의 쌍과 조합하여 제공된다. 이 실시형태에서, 가이드 RNA는 닉케이스를 표적 서열로 지시하고, 표적 서열의 반대 가닥에 닉을 생성함으로써(즉, 이중 닉킹) DSB를 도입한다. 일부 실시형태에서, u이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선시키며 표적외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 닉케이스는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 DNA의 반대 가닥을 표적화하는 2개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 닉케이스는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 근접하도록 선택된 2개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 클리베이스 및 닉케이스 활성이 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드를 포함한다. dCas 폴리펩타이드는 본질적으로 촉매(클리베이스/닉케이스) 활성이 결여되어 있지만 DNA-결합 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, dCas 폴리펩타이드는 dCas9 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 클리베이스 및 닉케이스 활성이 결여되어 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드는 핵내분해성 활성 부위가, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. 예를 들어, US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1 참조. 예시적인 dCas9 아미노산 서열은 서열번호 208로서 제공된다. 시작 및 종결 코돈을 포함하는 예시적인 dCas9 mRNA ORF 서열은 서열번호 209로서 제공된다. 융합 단백질에 포함시키기에 적합한 예시적인 dCas9 mRNA 코딩 서열은 서열번호 346으로서 제공된다.
a) 이종 기능성 도메인; 핵 국재화 신호
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9와 같은 Cas9 뉴클레이스는 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함한다(예를 들어, 융합 폴리펩타이드이거나 또는 이를 포함함).
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 세포의 핵으로의 수송을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 도메인은 핵 국재화 신호(NLS)일 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1개 내지 10개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1개 내지 5개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 C-말단에서 적어도 하나의 NLS에 융합될 수 있다. NLS는 또한 RNA-가이드된 DNA 결합제 서열 내에 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나 이상의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 소정의 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나(예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 또는 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 카복시 말단에 연결된 2개의 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있으며, 하나는 N-말단에 연결되고 다른 하나는 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 3개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 NLS 없이 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, NLS는, 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV(서열번호 278) 또는 PKKKRRV(서열번호 290)와 같은 단일분절(monopartite) 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, NLS는 뉴클레오플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 91)와 같은 이분절(bipartite) 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, NLS 서열은 LAAKRSRTT(서열번호 279), QAAKRSRTT(서열번호 280), PAPAKRERTT(서열번호 281), QAAKRPRTT(서열번호 282), RAAKRPRTT(서열번호 283), AAAKRSWSMAA(서열번호 284), AAAKRVWSMAF(서열번호 285), AAAKRSWSMAF(서열번호 286), AAAKRKYFAA(서열번호 287), RAAKRKAFAA(서열번호 288) 또는 RAAKRKYFAV(서열번호 289)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 PKKKRKV(서열번호 278) NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커가 선택적으로 융합 부위에 포함된다. 일부 실시형태에서, 임의의 전술한 실시형태에 따른 하나 이상의 NLS(들)는 임의의 아래 기재된 이종 기능성 도메인과 같은 하나 이상의 추가적인 이종 기능성 도메인과 조합하여 RNA-가이드된 DNA-결합제에 존재한다.
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA 결합제의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩타이드로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 분해는, 예를 들어, 프로테오솜, 리소솜 프로테이스 또는 칼파인 프로테이스와 같은 단백질분해성 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질(ubiquitin-like protein: UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비제한적인 예는 소형 유비퀴틴-유사 개질제(small ubiquitin-like modifier: SUMO), 유비퀴틴 교차-반응 단백질(ubiquitin cross-reactive protein: UCRP, 인터페론-자극 유전자-15(interferon-stimulated gene-15: ISG15)로도 알려짐), 유비퀴틴-관련 개질제-1(ubiquitin-related modifier-1: URM1), 신경-전구체-세포-발현이 발달적으로 하향조절된 단백질-8(neuronal-precursor-cell-expressed developmentally downregulated protein-8: NEDD8, S. 세레비시아에(S. cerevisiae)에서 Rub1로도 불림), 인간 백혈구 항원 F-관련(human leukocyte antigen F-associated: FAT10), 자가포식-8(autophagy-8: ATG8) 및 자가포식-12(autophagy-12: ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질(Fau ubiquitin-like protein: FUB1), 막-고정 UBL(membrane-anchored UBL: MUB), 유비퀴틴 접힘-개질제-1(ubiquitin fold-modifier-1: UFM1) 및 유비퀴틴-유사 단백질-5(ubiquitin-like protein-5: UBL5)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체성 아자미 그린(Monomeric Azami Green), CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, 아주라이트(Azurite), mKalamal, GFPuv, 사파이어(Sapphire), T-사파이어(T-Sapphire)), 청록색 형광 단백질(예를 들어, ECFP, 세룰리안(Cerulean), CyPet, AmCyan1, 미도리쉬-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체(DsRed monomer), mCherry, mRFP1, DsRed-익스프레스(DsRed-Express), DsRed2, DsRed-단량체(DsRed-Monomer), HcRed-탠덤(HcRed-Tandem), HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) 및 주황색 형광 단백질(mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체성 쿠사비라-오렌지(Monomeric Kusabira-Orange), mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(glutathione-S-transferase: GST), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein: CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 티오레독신(thioredoxin: TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화도 정제(tandem affinity purification: TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 바이오틴 카복실 캐리어 단백질(biotin carboxyl carrier protein: BCCP), 폴리-His 및 칼모듈린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(GST), 서양고추냉이 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase: HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이스(chloramphenicol acetyltransferase: CAT), 베타-갈락토시데이스, 베타-글루쿠로니데이스, 루시퍼레이스 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 특정 소기관, 세포 유형, 조직 또는 장기로 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 미토콘드리아로 표적화할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 효과기 도메인일 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제가 이의 표적 서열로 지시될 때, 예를 들어, Cas 뉴클레이스가 gRNA에 의해 표적 서열로 지시될 때, 효과기 도메인은 표적 서열을 변형시키거나 또는 이에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레이스 도메인(예를 들어, 비-Cas 뉴클레이스 도메인), 후생적(epigenetic) 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 FokI 뉴클레이스와 같은 뉴클레이스이다. 예를 들어, 미국 특허 제9,023,649 참조. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 전사 활성화 인자 또는 억제 인자이다. 예를 들어, 문헌[Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression," Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors," Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes," Cell 154:442-51 (2013)] 참조. 이와 같이, RNA-가이드된 DNA-결합제는 본질적으로 가이드 RNA를 사용하여 목적하는 표적 서열에 결합하도록 지시될 수 있는 전사 인자가 된다. 소정의 실시형태에서, DNA 변형 도메인은 메틸화 도메인, 예컨대, 탈메틸화 또는 메틸트랜스퍼레이스 도메인이다. 소정의 실시형태에서, 효과기 도메인은 DNA 변형 도메인, 예컨대, 염기-편집 도메인이다. 특정 실시형태에서, DNA 변형 도메인은 데아미네이스 도메인과 같은 특정 변형을 DNA에 도입하는 핵산 편집 도메인이다. 예를 들어, WO 2015/089406; US 2016/0304846 참조. WO 2015/089406 및 US 2016/0304846에 기술되어 있는 핵산 편집 도메인, 데아미네이스 도메인 및 Cas9 변이체는 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
E. RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산
본 명세서에 개시된 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9와 같은 Cas9 뉴클레이스를 암호화하는 ORF를 포함하는 임의의 핵산은 본 명세서에 개시된 임의의 gRNA를 사용하는 조성물 또는 방법과 선택적으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 제시된 임의의 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산은 mRNA일 수 있다.
1. 낮은 아데닌 함량을 갖는 ORF
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9와 같은 Cas9 뉴클레이스를 암호화하는 ORF는 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 약 150% 범위의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 아데닌 함량은 최소 아데닌 함량의 약 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하이다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량과 동일한 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 150% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 145% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 140% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 135% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 130% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 125% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 120% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 115% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 110% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서 ORF는 최소 아데닌 함량의 약 105% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 104% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 103% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 102% 이하의 아데닌 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 함량의 약 101% 이하의 아데닌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 200% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 195%, 190%, 185%, 180%, 175%, 170%, 165%, 160%, 155%, 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하이다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량과 동일한 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 200% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 195% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 190% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 185% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 180% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 175% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 170% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 165% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 160% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 155% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량과 동일한 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 150% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 145% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 140% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 135% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 130% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 125% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 120% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 115% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 110% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 105% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 104% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 103% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 102% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 101% 이하의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 90% 이하인 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량은 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 약 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하이다.
일부 실시형태에서, ORF는 0개의 아데닌 트라이뉴클레오타이드에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 범위의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다(더 긴 런(run)의 아데닌은 그 안에 있는 고유한 3개의-아데닌 세그먼트의 수로 계산되며, 예를 들어, 아데닌 테트라뉴클레오타이드는 2개의 아데닌 트라이뉴클레오타이드를 함유하고, 아데닌 펜타뉴클레오타이드는 3개의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 등을 함유함). 일부 실시형태에서, ORF는 0%의 아데닌 트라이뉴클레오타이드에서 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5% 또는 2%의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 범위의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖되, 아데닌 트라이뉴클레오타이드의 백분율 함량은 UUUAAA 및 UUUUAAA 서열이 각각 50%의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 가지도록 아데닌 트라이뉴클레오타이드의 일부를 형성하는 아데닌(또는 더 긴 런의 아데닌)이 차지하는 서열의 위치의 백분율로 계산된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ORF는 2% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ORF는 1.5% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 1% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.9% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.8% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.7% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.6% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.5% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.4% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.3% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.2% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.1% 이하의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아데닌 트라이뉴클레오타이드를 함유하지 않는 ORF를 포함하는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량에서 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량의 90% 이하인 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량 범위의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량은 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량의 약 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하이다.
주어진 ORF는, 예를 들어, ORF의 충분한 분획에서 최소 아데닌 코돈을 사용함으로써 아데닌 함량 또는 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량 또는 아데닌 트라이뉴클레오타이드 함량에서 감소될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드된 DNA-결합제에 대한 아미노산 서열은 아미노산을 코돈으로 전환시킴으로써 ORF 서열로 역-번역될 수 있되, ORF의 일부 또는 전부는 아래 나타낸 예시적인 최소 아데닌 코돈을 사용한다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%는 표 4에 열거된 코돈이다.
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일부 실시형태에서, 코돈의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%가 표 4에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성된 ORF를 포함하는 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9와 같은 Cas9 뉴클레이스를 암호화하는 핵산이 제공된다. ORF는 최소 뉴클레오타이드 단일중합체, 예를 들어, 동일한 뉴클레오타이드의 반복적인 스트링을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표 4에 열거된 코돈으로부터 최소 우리딘 코돈을 선택할 때, 핵산은 뉴클레오타이드 단일중합체의 수 및 길이를 감소시키는 최소 아데닌 코돈을 선택, 예를 들어, 알라닌에 대해 GCC 대신 GCG를 선택하거나 또는 글리신에 대해 GGG 대신 GGC를 선택함으로써 구축된다.
임의의 전술한 실시형태에서, 핵산은 mRNA일 수 있다.
2. 번역을 증가시키고/시키거나 고도로 발현되는 tRNA에 상응하는 코돈; 예시적인 코돈 세트
일부 실시형태에서, 핵산은 인간과 같은 포유동물에서 번역을 증가시키는 코돈을 갖는 ORF를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 핵산은 포유동물, 예를 들어, 인간의 간과 같은 장기에서 번역을 증가시키는 코돈을 갖는 ORF를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 핵산은 포유동물, 예를 들어, 인간의 간세포와 같은 세포 유형에서 번역을 증가시키는 코돈을 갖는 ORF를 포함한다. 포유동물, 세포 유형, 포유동물의 장기, 인간, 인간의 장기 등에서 번역의 증가는 ORF의 야생형 서열의 번역 정도와 관련하여 또는 ORF가 유래되는 유기체 또는 S. 피오게네스, S. 아우레우스(S. aureus) 또는 또 다른 원핵생물과 같은 아미노산 수준에서 가장 유사한 ORF를 포함하는 유기체의 코돈 분포와 일치하는 코돈 분포를 갖는 ORF, 경우에 따라 아래 기재된 다른 원핵생물로부터의 Cas 뉴클레이스와 같은 원핵생물-유래 Cas 뉴클레이스에 대해 결정될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 포유동물, 세포 유형, 포유동물의 장기, 인간, 인간의 장기 등에서 Cas9 서열에 대한 번역의 증가는 임의의 적용 가능한 점 돌연변이, 이종 도메인 등을 포함하여 다른 모든 것이 동일한 서열번호 205의 서열을 갖는 ORF의 번역과 관련하여 결정된다. 인간의 간 및 인간의 간세포를 포함하여 인간에서 발현을 증가시키는데 유용한 코돈은 문헌[Dittmar KA, PLos Genetics 2(12): e221 (2006)]에 논의되어 있는 인간의 간/간세포에서 고도로 발현되는 tRNA에 상응하는 코돈일 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 인간과 같은 포유동물에서 고도로 발현되는 tRNA(예를 들어, 각 아미노산에 대해 가장 고도로-발현되는 tRNA)에 상응하는 코돈이다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 인간 장기와 같은 포유동물 장기에서 고도로 발현되는 tRNA(예를 들어, 각 아미노산에 대해 가장 고도로-발현되는 tRNA)에 상응하는 코돈이다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 인간의 간과 같은 포유동물 간에서 고도로 발현되는 tRNA(예를 들어, 각 아미노산에 대해 가장 고도로-발현되는 tRNA)에 상응하는 코돈이다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 인간의 간세포와 같은 포유동물 간세포에서 고도로 발현되는 tRNA(예를 들어, 각 아미노산에 대해 가장 고도로-발현되는 tRNA)에 상응하는 코돈이다.
대안적으로, 유기체(예를 들어, 인간)에서 고도로 발현되는 tRNA에 상응하는 코돈이 일반적으로 사용될 수 있다.
코돈 선택에 대한 임의의 전술한 접근법은 표 4의 코돈으로 시작하고, 이어서 하나 이상의 옵션이 이용 가능한 경우, 일반적으로 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 간 또는 간세포(예를 들어, 인간 간 또는 인간 간세포)와 같은 관심 장기 또는 세포 유형에서 보다 고도로 발현된 tRNA에 상응하는 코돈을 사용함으로써 위에 나타낸 최소 아데닌 코돈과 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 표 5에 나타낸 코돈 세트로부터의 코돈(예를 들어, 낮은 U 1, 낮은 A 또는 낮은 A/U 코돈 세트)이다. 낮은 U 1, 낮은 G, 낮은 C, 낮은 A 및 낮은 A/U 세트의 코돈은 표시된 뉴클레오타이드를 최소화하는 코돈을 사용하는 동시에 하나 이상의 옵션을 사용할 수 있는 경우 고도로 발현된 tRNA에 상응하는 코돈을 또한 사용한다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 표 5에 나타낸 낮은 U 1 코돈 세트로부터의 코돈이다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 표 5에 나타낸 낮은 코돈 세트로부터의 코돈이다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 표 5에 나타낸 낮은 A/U 코돈 세트로부터의 코돈이다.
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Figure pct00019
3. 예시적인 서열
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF는 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; ORF는 적어도 처음 50개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성 또는 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고/갖거나; ORF는 코돈의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%가 표 1에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고/되거나; ORF는 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 123% 범위의 아데닌 함량을 갖고/갖거나; ORF는 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 377에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF는 서열번호 201, 204, 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 서열번호 203, 206, 208, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 268 또는 386 내지 396 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, ORF는 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고/갖거나 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 암호화된 RNA-가이드된 DNA 결합제는 서열번호 203, 206, 208, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 268 또는 386 내지 396 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, ORF는 최소 우리딘 함량에서 최소 우리딘 함량의 150% 범위의 우리딘 함량을 갖고/갖거나 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 이러한 실시형태에서, 아데닌 및 우리딘 뉴클레오타이드 함량은 모두 이들 각각의 최소값의 150% 이하이다. 일부 실시형태에서, 아데닌 및 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량은 모두 이들 각각의 최소값의 150% 이하이다. 일부 실시형태에서, mRNA는 서열번호 243, 244, 251, 253, 255 내지 261 또는 267 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 서열번호 243, 244, 251, 253, 255 내지 261 또는 267 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하며, 서열번호 243, 244, 251, 253, 255 내지 261 또는 267의 처음 3개의 뉴클레오타이드는 생략된다. 일부 실시형태에서, 전술한 임의의 동일성의 수준은 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF는 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 201, 204, 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드는 A가 뉴클레오타이드 1이고, T가 뉴클레오타이드 2 등이 되도록 시작 코돈(전형적으로, ATG)의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 측정된다. 일부 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 이의 서열의 적어도 처음 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%에 걸쳐 서열번호 201, 204, 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는다. ORF의 서열의 길이는 시작 코돈의 시작에서부터 종결 코돈의 말단까지의 뉴클레오타이드의 수이며, 이의 서열의 처음 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%는 전체 서열의 길이의 표시된 백분율을 구성하는 시작 코돈의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 시작하는 뉴클레오타이드의 수에 해당한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 243(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 243에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 244(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환되는 서열번호 244와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 256(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 대안적인 ORF로 치환되는 서열번호 256과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 257(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 257에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 258(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 258에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 259(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 259에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 260(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 260에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 261(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 261에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 376에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열번호 376(즉, 서열번호 204)의 ORF는 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 377에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열번호 377(즉, 서열번호 204)의 ORF는 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 378에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열번호 378(즉, 서열번호 204)의 ORF는 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 379(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 379에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 380(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 380에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 381(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 381에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 382(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 382에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 383(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 383에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 384(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 384에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 서열번호 385(즉, 서열번호 204)의 ORF가 서열번호 207, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 250, 252, 254, 265, 266 또는 307 내지 375 중 어느 하나의 ORF로 치환된 서열번호 385에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 243, 244, 256 내지 261 또는 376 내지 385의 선택적으로 치환된 서열에 대한 동일성의 정도는 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 243, 244, 256 내지 261 또는 376 내지 385의 선택적으로 치환된 서열에 대한 동일성의 정도는 적어도 98%이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 243, 244, 256 내지 261 또는 376 내지 385의 선택적으로 치환된 서열에 대한 동일성의 정도는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 243, 244, 256 내지 261 또는 376 내지 385의 선택적으로 치환된 서열에 대한 동일성의 정도는 100%이다.
4. 핵산, mRNA 및 ORF의 추가적인 특징
본 명세서에 기재된 임의의 추가적인 특징은 위에 기재된 임의의 실시형태와 실행 가능한 정도로 조합될 수 있다.
a) 낮은 우리딘 함량
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9와 같은 Cas9 뉴클레이스를 암호화하는 ORF는 최소 우리딘 함량에서 최소 우리딘 함량의 약 150% 범위의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 우리딘 함량은 최소 우리딘 함량의 약 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하이다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량과 동일한 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 150% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 145% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 140% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 135% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 130% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 125% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 120% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 115% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 110% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 105% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 104% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 103% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 102% 이하의 우리딘 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 함량의 약 101% 이하의 우리딘 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 200% 범위의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량은 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 195%, 190%, 185%, 180%, 175%, 170%, 165%, 160%, 155%, 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하이다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량과 동일한 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 200% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 195% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 190% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 185% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 180% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 175% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 170% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 165% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 160% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 155% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량과 동일한 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 150% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 145% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 140% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 135% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 130% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 125% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 120% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 115% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 110% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 105% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 104% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 103% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 102% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 101% 이하의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량에서 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 90% 이하인 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량 범위의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량은 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량의 약 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하이다.
일부 실시형태에서, ORF는 0개의 우리딘 트라이뉴클레오타이드에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 범위의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다(여기서, 더 긴 런의 우리딘은 그 안에 있는 고유한 3개의-우리딘 세그먼트의 수로 계산되며, 예를 들어, 우리딘 테트라뉴클레오타이드는 2개의 우리딘 트라이뉴클레오타이드를 함유하고, 우리딘 펜타뉴클레오타이드는 3개의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 등을 함유함). 일부 실시형태에서, ORF는 0%의 우리딘 트라이뉴클레오타이드에서 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5% 또는 2%의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 범위의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖되, 우리딘 트라이뉴클레오타이드의 백분율 함량은 UUUAAA 및 UUUUAAA 서열이 각가 50%의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖도록 우리딘 트라이뉴클레오타이드의 일부를 형성하는 우리딘(또는 더 긴 런의 우리딘)이 차지하는 서열의 위치의 백분율로 계산된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ORF는 2% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ORF는 1.5% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 1% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.9% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.8% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.7% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.6% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.5% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.4% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.3% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.2% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 0.1% 이하의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF는 우리딘 트라이뉴클레오타이드를 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, ORF는 최소 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량에서 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량의 90% 이하인 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량 범위의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF의 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량은 해당 mRNA와 동일한 단백질을 암호화하는 참조 서열의 최대 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량의 약 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하이다.
주어진 ORF는, 예를 들어, ORF의 충분한 분획에서 최소 우리딘 코돈을 사용함으로써 우리딘 함량 또는 우리딘 다이뉴클레오타이드 함량 또는 우리딘 트라이뉴클레오타이드 함량에서 감소될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드된 DNA-결합제에 대한 아미노산 서열은 아미노산을 코돈으로 전환시킴으로써 ORF 서열로 역번역될 수 있되, ORF의 일부 또는 전부는 하기에 나타낸 예시적인 최소 우리딘 코돈을 사용한다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%는 표 6에 열거된 코돈이다.
Figure pct00020
일부 실시형태에서, ORF는 코돈의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%가 표 6에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성된다.
b) 낮은 아데닌 및 우리딘 함량
가능한 범위 내에서, 낮은 아데닌 함량과 관련하여 본 명세서에 기재된 임의의 특징은 낮은 우리딘 함량과 관련하여 본 명세서에 기재된 임의의 특징과 조합될 수 있다. 예를 들어, 최소 우리딘 함량에서 최소 우리딘 함량의 약 150% 범위의 우리딘 함량(예를 들어, ORF의 우리딘 함량은 최소 우리딘 함량의 약 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하임) 및 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 약 150% 범위의 아데닌 함량(예를 들어, 최소 아데닌 함량의 약 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% 또는 101% 이하임)을 갖는 ORF를 포함하는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)이 제공될 수 있다. 우리딘 및 아데닌 다이뉴클레오타이드도 마찬가지이다. 유사하게는, ORF에서 우리딘 뉴클레오타이드 및 아데닌 다이뉴클레오타이드의 함량은 위에 제시된 바와 같을 수 있다. 유사하게는, ORF에서 우리딘 다이뉴클레오타이드 및 아데닌 뉴클레오타이드의 함량은 위에 제시된 바와 같을 수 있다.
주어진 ORF는, 예를 들어, ORF의 충분한 분획에서 최소 우리딘 및 아데닌 코돈을 사용함으로써 우리딘 및 아데닌 뉴클레오타이드 및/또는 다이뉴클레오타이드 함량에서 감소될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드된 DNA-결합제에 대한 아미노산 서열은 아미노산을 코돈으로 전환시킴으로써 ORF 서열로 역번역될 수 있되, ORF의 일부 또는 전부는 하기에 나타낸 예시적인 최소 우리딘 및 아데닌 코돈을 사용한다. 일부 실시형태에서, ORF에서 코돈의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%는 표 7에 열거된 코돈이다.
Figure pct00021
일부 실시형태에서, ORF는 코돈의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%가 표 7에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성된다. 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 3개의 열거된 세린 코돈 각각은 하나의 A 또는 하나의 U를 함유한다. 일부 실시형태에서, 우리딘 최소화는 세린에 대한 AGC 코돈을 사용함으로써 우선적으로 처리된다(prioritized). 일부 실시형태에서, 아데닌 최소화는 세린에 대해 UCC 및/또는 UCG 코돈을 사용함으로써 우선적으로 처리된다.
c) UTR; 코작 서열(Kozak sequence)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 5' UTR, 3' UTR 또는 5' 및 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 mRNA)는 하이드록시스테로이드 17-베타 데하이드로게네이스 4(Hydroxysteroid 17-beta Dehydrogenase 4: HSD17B4 또는 HSD)로부터의 적어도 하나의 UTR, 예를 들어, HSD로부터의 5' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 글로빈 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA), 예를 들어, 인간 알파 글로빈(human alpha globin: HBA) 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA), 인간 베타 글로빈(human beta globin: HBB) 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA) 또는 제노푸스 라에비스 베타 글로빈(Xenopus laevis beta globin: XBG) 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)로부터의 적어도 하나의 UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 HBA, HBB 또는 XBG와 같은 글로빈 mRNA로부터의 5' UTR, 3' UTR 또는 5' 및 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 소 성장 호르몬, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV), 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB 또는 XBG로부터의 5' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 소 성장 호르몬, 사이토메갈로바이러스, 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB 또는 XBG로부터의 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 소 성장 호르몬, 사이토메갈로바이러스, 마우스 Hba-a1, HSD, 알부민 유전자, HBA, HBB, XBG, 열충격 단백질 90(heat shock protein 90: Hsp90), 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게네이스(glyceraldehyde 3-포스페이트 dehydrogenase: GAPDH), 베타-액틴, 알파-튜불린, 종양 단백질(p53) 또는 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)로부터의 5' 및 3' UTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 동일한 공급원, 예를 들어, 액틴, 알부민 또는 HBA, HBB 또는 XBG와 같은 글로빈과 같은 구성적으로 발현된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)로부터 유래된 5' 및 3' UTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 서열번호 232, 234, 236, 238, 241 또는 275 내지 277 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 5' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 서열번호 233, 235, 237, 239 또는 240 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 임의의 전술한 동일성의 수준은 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 서열번호 232, 234, 236, 238 또는 241 중 어느 하나의 서열을 갖는 5' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 서열번호 233, 235, 237, 239 또는 240 중 어느 하나의 서열을 갖는 3' UTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 5' UTR를 포함하지 않으며, 예를 들어, 5' 캡과 시작 코돈 사이에 추가적인 뉴클레오타이드가 없다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 5' 캡과 시작 코돈 사이에 코작 서열(아래 기재됨)을 포함하지만, 임의의 추가적인 5' UTR은 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 3' UTR을 포함하지 않으며, 예를 들어, 종결 코돈과 폴리-A 꼬리 사이에 추가적인 뉴클레오타이드가 없다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 코작 서열을 포함한다. 코작 서열은 번역된 개시 및 핵산으로부터 번역된 폴리펩타이드의 전반적인 수율에 영향을 미칠 수 있다. 코작 서열은 시작 코돈으로 기능할 수 있는 메티오닌 코돈을 포함한다. 최소 코작 서열은 NNNRUGN이되, 다음 중 적어도 하나가 참(true)이다: 첫 번째 N은 A 또는 G이고, 두 번째 N은 G이다. 뉴클레오타이드 서열의 맥락에서, R은 퓨린(A 또는 G)을 의미한다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 RNNRUGN, NNNRUGG, RNNRUGG, RNNAUGN, NNNAUGG 또는 RNNAUGG이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 미스매치가 0개이거나 또는 소문자로 된 위치에 최대 1개 또는 2개의 미스매치가 있는 rccRUGg이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 미스매치가 0개이거나 또는 소문자로 된 위치에 최대 1개 또는 2개의 미스매치가 있는 rccAUGg이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 미스매치가 0개이거나 또는 소문자로 된 위치에 최대 1개, 2개의 또는 3개의 미스매치가 있는 gccRccAUGG(서열번호 305의 4번 내지 13번 뉴클레오타이드)이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 미스매치가 0개이거나 또는 소문자로 된 위치에 최대 1개, 2개의, 3개의 또는 4개의 미스매치가 있는 gccAccAUG이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 GCCACCAUG이다. 일부 실시형태에서, 코작 서열은 미스매치가 0개이거나 또는 소문자로 된 위치에 최대 1개, 2개의, 3개의 또는 4개의 미스매치가 있는 gccgccRccAUGG(서열번호 305)이다.
d) 폴리-A 꼬리
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA)는 폴리-아데닐화된(폴리-A) 꼬리를 더 포함한다. 일부 예에서, 폴리-A 꼬리는 폴리-A 꼬리 내의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드 "앵커(anchor)"로 "단절(interrupted)"된다. 폴리-A 꼬리는 적어도 8개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 또한 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "비-아데닌 뉴클레오타이드"는 아데닌을 포함하지 않는 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 지칭한다. 구아닌, 티민 및 사이토신 뉴클레오타이드는 예시적인 비-아데닌 뉴클레오타이드이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA) 상의 폴리-A 꼬리는 관심 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치한 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA) 상의 폴리-A 꼬리는 관심 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드에 대해 3'에 위치한 비-연속적인 아데닌 뉴클레오타이드를 포함하되, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 규칙적인 또는 불규칙한 간격으로 아데닌 뉴클레오타이드를 단절한다.
일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 mRNA의 시험관내 전사에 사용되는 플라스미드에 암호화되어 전사체의 일부가 된다. 플라스미드에 암호화된 폴리- 서열, 즉, 폴리- 서열에서 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드의 수는 정확하지 않을 수 있고, 예를 들어, 플라스미드에서 100개의 폴리- 서열은 전사된 mRNA에서 정확히 100개의 폴리- 서열을 생성하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 플라스미드에 암호화되지 않으며, 예를 들어, 대장균 폴리(A) 폴리머레이스를 사용하여 PCR 테일링(tailing) 또는 효소적 테일링에 의해 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드를 단절하도록 위치되어 폴리(A) 결합 단백질이 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드(들)는 적어도 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8개 내지 50개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8개 내지 100개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다. 일부 실시형태에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 있고, 적어도 8개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드가 뒤따른다.
본 개시내용의 폴리-A 꼬리는 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 다음에 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드, 선택적으로 추가적인 아데닌 뉴클레오타이드가 뒤따르는 하나의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 1개의 비-아데닌 뉴클레오타이드 또는 2개 내지 10개의 비-아데닌 뉴클레오타이드의 하나의 연속적인 스트레치를 포함하거나 함유한다. 일부 실시형태에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드(들)는 적어도 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다. 일부 예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8개 내지 50개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드는 적어도 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개의 연속적인 아데닌 뉴클레오타이드 뒤에 위치된다.
일부 실시형태에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 구아닌, 사이토신 또는 티민이다. 일부 예에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 사이토신 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 티민 뉴클레오타이드이다. 일부 예에서, 하나 이상의 비-아데닌 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 비-아데닌 뉴클레오타이드는 다음으로부터 선택될 수 있다: a) 구아닌 및 티민 뉴클레오타이드; b) 구아닌 및 사이토신 뉴클레오타이드; c) 티민 및 사이토신 뉴클레오타이드; 또는 d) 구아닌, 티민 및 사이토신 뉴클레오타이드. 비-아데닌 뉴클레오타이드를 포함하는 예시적인 폴리-A 꼬리는 서열번호 262로서 제공된다.
e) 변형된 뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산은 일부 또는 모든 우리딘 위치에 변형된 우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 예를 들어, 할로겐 또는 C1-C3 알콕시로 5번 위치에서 변형된 우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 예를 들어, C1-C3 알킬로 1번 위치에서 변형된 슈도우리딘이다. 변형된 우리딘은 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-아이오도우리딘의 조합이다. 일부 실시형태에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%는 변형된 우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 변형된 우리딘, 예를 들어, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 슈도우리딘 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 5-메톡시우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 5-아이오도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 5-메톡시우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다. 일부 실시형태에서, 핵산에서 우리딘 위치의 10% 내지 25%, 15% 내지 25%, 25% 내지 35%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 55% 내지 65%, 65% 내지 75%, 75% 내지 85%, 85% 내지 95% 또는 90% 내지 100%는 5-아이오도우리딘이고, 나머지는 N1-메틸 슈도우리딘이다.
f) 5' 캡
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 핵산(예를 들어, mRNA)은 캡0, 캡1 또는 캡2와 같은 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트라이포스페이트를 통해 핵산의 5'에서 3' 사슬로의 제1 뉴클레오타이드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오타이드(예를 들어, ARCA와 관련하여 아래에서 논의되는 바와 같이 추가로 변형될 수 있음), 즉, 제1 캡-인접 뉴클레오타이드이다. 캡0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-인접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 다 2'-하이드록실을 포함한다. 캡1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오타이드의 리보스는 각각 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 포함한다. 캡2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-인접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 다 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Katibah et al.(2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al.(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115] 참조. 인간 핵산과 같은 포유동물 핵산을 포함하는 대부분의 내인성 고등 진핵생물 mRNA는 캡1 또는 캡2를 포함한다. 캡1 및 캡2와 다른 캡0 및 기타 캡 구조는 IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천적 면역전된 시스템의 구성요소에 의해 "비-자기(비-self)"로 인식되기 때문에, 인간과 같은 포유동물에서 면역원성일 수 있으며, 이는 I형 인터페론을 포함한 사이토카인 수준을 상승시킬 수 있다. IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천적 면역전된 시스템의 구성요소는 또한 캡1 또는 캡2 이외의 캡과 핵산의 결합에 대해 eIF4E와 경쟁하여 잠재적으로 mRNA의 번역을 저해할 수 있다.
캡은 공동-전사적으로(co-transcriptionally) RNA에 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA(항-역전 캡 유사체(anti-reverse cap analog); 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 카탈로그 번호 AM8045)는 개시 시 시험관 내에서 전사체에 통합될 수 있는 구아닌 리보뉴클레오타이드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트라이포스페이트를 포함하는 캡 유사체이다. ARCA는 제1 캡-인접 뉴클레오타이드의 2' 위치가 하이드록실인 캡0 캡을 생성한다. 예를 들어, 문헌[Stepinski et al., (2001) "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495] 참조. ARCA 구조는 아래에 나타나 있다.
Figure pct00022
CleanCap™ AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; 트라이링크 바이오테크놀로지스(TriLink Biotechnologies) 카탈로그 번호 N-7113) 또는 CleanCap™ GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; 트라이링크 바이오테크놀로지스 카탈로그 번호 N-7133)가 공동-전사적으로 캡1 구조를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CleanCap™ AG 및 CleanCap™ GG의 3'-O-메틸화된 버전이 또한 트라이링크 바이오테크놀로지스로부터 각각 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로 입수 가능하다. CleanCap™ AG 구조는 아래에 나타나 있다. CleanCap™ 구조는 때로는 위에 열거된 카탈로그 번호의 마지막 세 자리를 이용하여 본 명세서에서 지칭된다(예를 들어, 트라이링크 바이오테크놀로지스 카탈로그 번호 N-7113의 경우 "CleanCap™ 113").
Figure pct00023
대안적으로, 캡은 전사후 단계에서(post-transcriptionally) RNA에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 상업적으로 이용 가능하며(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 카탈로그 번호 M2080S), D1 서브유닛에 의해 제공되는 RNA 트라이포스파테이스 및 구아닐릴트랜스퍼레이스 활성 및 D12 서브유닛에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼레이스 활성을 갖는다. 이와 같이, S-아데노실 메티오닌 및 GTP의 존재하에 캡0을 제공하기 위해 RNA에 7-메틸구아닌을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479] 참조. 캡 및 캡핑 접근법의 추가적인 논의의 경우, 예를 들어, WO2017/053297 및 문헌[Ishikawa et al., Nucl. AcID. Symp. Ser.(2009) No. 53, 129-A130] 참조한다.
F. RNA의 효능의 결정
일부 실시형태에서, gRNA의 효능은 다른 구성요소, 예를 들어, 임의의 본 명세서에 기재된 것과 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산과 함께 전달될 때 결정된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및 gRNA, 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산의 조합의 효능이 결정된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 RNA-가이드된 DNA 결합제 및 가이드 RNA의 사용은 세포 기구에 의한 복구시 삽입/결실(indel) 돌연변이의 형성으로 오류를 생성할 수 있는 DNA에서의 이중-가닥 파손을 유발할 수 있다. indel로 인한 많은 돌연변이는 리딩 프레임을 변경하거나 또는 조기 종결 코돈을 도입하여 비-기능성 단백질을 생성한다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA, 조성물 또는 gRNA, 코르티코스테로이드 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 치료의 효능은 시험관내 모델에 기초하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 HUH7 인간 간암종 세포이다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 HepG2 세포이다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 일차 인간 간세포이다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델은 일차 사이노몰구스 간세포이다. 일차 인간 간세포를 사용하는 것과 관련하여, 상업적으로 이용 가능한 일차 인간 간세포가 실험 간에 더 큰 일관성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내 모델(예를 들어, 일차 인간 간세포)에서 결실 또는 삽입이 발생하는 표적외 부위의 수는, 예를 들어, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 이러한 결정은 Cas9 mRNA, 가이드 RNA 및 공여체 올리고뉴클레오타이드로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함한다. 이러한 결정을 위한 예시적인 절차는 아래 실제 실시예에 제공된다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA, 조성물 또는 gRNA, 코르티코스테로이드 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 치료의 효능은 gRNA 선택 과정을 위한 여러 시험관내 세포 모델에 걸쳐 결정된다. 일부 실시형태에서, 선택된 gRNA와 데이터의 세포주 비교가 수행된다. 일부 실시형태에서, 여러 세포 모델에서 교차 스크리닝이 수행된다.
일부 실시형태에서, 특정 gRNA, 조성물 또는 gRNA, 코르티코스테로이드 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 치료의 효능은 생체내 모델에 기초하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 생체내 모델은 설치류 모델이다. 일부 실시형태에서, 설치류 모델은 돌연변이체 인간 TTR 유전자일 수 있는 인간 TTR 유전자를 발현하는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 생체내 모델은 비-인간 영장류, 예를 들어, 사이노몰구스 원숭이이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA, 조성물 또는 gRNA, 코르티코스테로이드 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 치료의 효능은 TTR의 편집 퍼센트에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 편집 퍼센트는, 예를 들어, 시험관내 모델의 경우 세포 배양 배지에서 또는 생체내 모델의 경우 혈청 또는 조직에서 TTR 단백질의 넉다운을 달성하는데 필요한 편집 퍼센트와 비교된다.
일부 실시형태에서, gRNA, 조성물 또는 gRNA, 코르티코스테로이드 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 이러한 작용제를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 치료의 효능은 표적 세포 유형의 게놈 내의 표적외 서열에서 indel의 수 및/또는 빈도에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 세포 집단에서 및/또는 표적 부위에서의 indel 생성의 빈도에 비해 표적외 부위에서 매우 낮은 빈도(예를 들어, 5% 미만)로 indel을 생성하는 효과적인 가이드 RNA가 제공된다. 따라서, 본 개시내용은 표적 세포 유형(예를 들어, 간세포)에서 표적외 indel 형성을 나타내지 않거나 또는 세포 집단에서 및/또는 표적 부위에서의 indel 생성의 빈도에 비해 5% 미만의 표적외 indel 형성 빈도를 생성하는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 세포 유형(예를 들어, 간세포)에서 임의의 표적외 indel 형성을 나타내지 않는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 평가되는 바와 같이, 5개 미만의 표적외 부위에서 indel을 생성하는 가이드 RNA가 제공된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 평가되는 바와 같이, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 표적외 부위(들)에서 indel을 생성하는 가이드 RNA 및 조합이 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적외 부위(들)는 표적 세포(예를 들어, 간세포) 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 DNA에서 삽입/결실("indel") 돌연변이의 형성 및 상동성 지정 복구(homology directed repair: HDR) 이벤트와 같은 유전자 편집 이벤트를 검출하는 것은 태그된 프라이머를 사용한 선형 증폭 및 태그된 증폭 생성물의 단리(이하 본 명세서에서 WO2018/067447 또는 문헌[Schmidt et al., Nature Methods 4:1051-1057(2007)]에 기재된 바와 같이 "LAM-PCR," 또는 "선형 증폭(LA)" 방법으로 지칭됨)를 사용한다.
일부 실시형태에서, 방법은 이중 가닥 파손(DSB)을 갖도록 유도되고, 선택적으로 DSB를 복구하기 위해 HDR 주형이 제공된 세포로부터 세포 DNA를 단리하는 단계; 태그된 프라이머로 DNA의 선형 증폭의 적어도 하나의 사이클을 수행하는 단계; 태그를 포함하는 선형 증폭 산물을 단리하여 태그되지 않은 프라이머로 증폭된 임의의 증폭 산물을 버리는 단계; 선택적으로 단리된 산물을 추가로 증폭시키는 단계; 및 선형 증폭 산물 또는 추가로 증폭된 산물을 분석하여, 예를 들어, 표적 DNA에서의 이중 가닥 파손, 삽입, 결실 또는 HDR 주형 서열과 같은 편집 이벤트의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 편집 이벤트는 정량화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 정량화 등(HDR 및 indel과 같은 비-HDR 편집 이벤트의 맥락에서 포함)은 집단에서 편집 이벤트의 빈도 및/또는 유형(들)을 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 선형 증폭의 한 사이클만이 수행된다.
일부 예에서, 태그된 프라이머는 분자 바코드(molecular barcode)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그된 프라이머는 분자 바코드를 포함하며, 선형 증폭의 한 사이클만이 수행된다.
일부 실시형태에서, 표적 DNA에서 삽입/결실("indel") 돌연변이의 형성 및 상동성 지정 복구(HDR) 이벤트와 같은 유전자 편집 이벤트를 검출하는 것은 시퀀싱 선형 증폭된 생성물 또는 추가의 증폭된 생성물을 시퀀싱하는 것을 더 포함한다. 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 및 클로닝 선형 증폭 생성물 또는 추가의 증폭된 생성물을 플라스미드 또는 플라스미드의 일부로 클로닝하는 것을 포함하여 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 예시적인 차세대 시퀀싱 방법은, 예를 들어, 문헌[Shendure et al., Nature 26:1135-1145(2008)]에 논의되어 있다. 다른 양태에서, 표적 DNA에서 삽입/결실("indel") 돌연변이의 형성 및 상동성 지정 복구(HDR) 이벤트와 같은 유전자 편집 이벤트를 검출하는 것은 선형 증폭된 생성물 또는 추가의 증폭된 생성물에 대해 디지털 PCR(digital PCR: dPCR) 또는 액적 디지털 PCR(droplet digital PCR: ddPCR)을 수행하거나 또는 선형 증폭된 생성물 또는 추가의 증폭된 생성물을 HDR 주형 서열을 포함하는 DNA를 확인하도록 설계된 핵산 프로브와 접촉시키고, 선형 증폭된 생성물(들) 또는 추가의 증폭된 생성물(들)에 결합된 프로브를 검출하는 것을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 표적 DNA에서 HDR 주형의 위치를 결정하는 단계를 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 방법은 표적 DNA에서 삽입 부위의 서열을 결정하는 단계를 더 포함하되, 삽입 부위는 HDR 주형이 표적 DNA에 혼입되는 위치이고, 삽입 부위는 일부 표적 DNA 서열 및 일부 HDR 주형 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 조합의 효능은 TTR의 분비에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 분비는 세포 배양 배지 또는 혈청을 사용한 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 검정을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 분비는 편집을 측정하는데 사용되는 동일한 시험관내 또는 생체내 시스템 또는 모델에서 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 분비는 일차 인간 간세포에서 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 분비는 HUH7 세포에서 측정된다. 일부 실시형태에서, TTR의 분비는 HepG2 세포에서 측정된다.
ELISA 검정은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 혈청 TTR 수준을 결정하도록 설계될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 혈액이 수집되고, 혈청이 단리된다. 총 TTR 혈청 수준은 마우스 프레알부민(트랜스티레틴) ELISA 키트(아비바 시스템 바이올로지(아비바 시스템즈 바이올로지), 카탈로그 번호 OKIA00111) 또는 인간 TTR을 측정하기 위한 유사한 키트를 사용하여 결정될 수 있다. 키트를 사용할 수 없는 경우, ELISA는 측정 중인 TTR에 대해 특이적인 포획 항체로 미리 코팅된 플레이트를 사용하여 발색될 수 있다. 다음으로, 플레이트는 세척하기 전 일정 기간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 효소-항-TTR 항체 접합체가 첨가되고 인큐베이션된다. 결합되지 않은 항체 접합체가 제거되고, 플레이트는 효소와 반응하는 발색 기질 용액의 첨가 전 세척된다. 플레이트는 사용된 효소 및 기질에 특이적인 흡광도에서 적절한 플레이트 판독기에서 판독된다.
일부 실시형태에서, 세포(조직으로부터의 세포 포함)에서 TTR의 양은 gRNA 또는 조합의 효능을 측정한다. 일부 실시형태에서, 세포에서 TTR의 양은 웨스턴 블롯을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포는 HUH7 세포이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포는 일차 인간 간세포이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포는 동물로부터 수득되는 일차 세포이다. 일부 실시형태에서, TTR의 양은 세포 수의 변화를 조절하기 위해 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게네이스 GAPDH(하우스키핑 유전자)의 양과 비교된다.
III. LNP 제형 및 ATTR의 치료
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및, 예를 들어, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, ATTR을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 ATTR을 치료하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)를 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및, 예를 들어, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, ATTR을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 ATTR을 치료하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 선택적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)를 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및, 예를 들어, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 투여하는 단계를 포함하는, TTR 혈청 농도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 투여된다. gRNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)를 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 투여하는 단계를 포함하는, TTR 혈청 농도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 선택적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)을 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및, 예를 들어, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및, 서열번호 87 내지 113 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 투여된다. gRNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 선택적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)을 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 서열번호 87 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82 중 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124 중 임의의 하나 이상의 sgRNA가 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레이스(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터와 함께 선택적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas 클리베이스이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 Cas9이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레이스이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)을 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, 핵산으로부터 번역된 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스와 함께 표 1의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 또는 표 2로부터의 하나 이상의 sgRNA는 복구 중 DSB 및 비상동 말단 연결(NHEJ)을 유도하고, TTR 유전자에서 돌연변이를 유발한다. 일부 실시형태에서, NHEJ는 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발하여, TTR 유전자에서 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드 및 가이드 RNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산)(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내)를 투여하는 것은 대상체에서 TTR의 수준(예를 들어, 혈청 수준)을 감소시키므로, 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적 및 응집을 방지한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 것은 대상체의 하나 이상의 조직, 예컨대, 위, 결장 또는 신경 조직에서 TTR 침착을 감소시키거나 또는 방지하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 신경 조직은 좌골 신경 또는 후근 신경절을 포함한다. 일부 실시형태에서, TTR 침착은 위, 결장, 후근 신경절 및 좌골 신경 중 2개, 3개 또는 4개에서 감소된다. 주어진 조직에서 침착의 수준은 생검 샘플을 사용하여, 예를 들어, 면역염색을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체의 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서 TTR의 축적을 감소시키거나 방지하고/하거나 TTR 침착을 감소시키거나 또는 방지하는 것은 일정 기간 동안 혈청 TTR 수준을 감소시키는 것에 기초하여 추론된다. 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 명세서에 제공되는 방법 및 용도에 따라 혈청 TTR 수준을 감소시키는 것은, 예를 들어, 조성물의 투여 후 8주에 측정된 바와 같이 상기 및 실시예에 논의된 것과 같은 조직으로부터 침착된 TTR의 제거를 초래할 수 있음이 밝혀졌다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 물고기 또는 가금류이다.
일부 실시형태에서, ATTR을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 예를 들어, 표 1의 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 가이드 RNA 또는 표 2로부터의 하나 이상의 sgRNA(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내) 및 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산(예를 들어 mRNA)의 용도가 제공된다. RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas9, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9일 수 있다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 핵산을 포함하는 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 핵산을 포함하는 조성물은 간 순환(hepatic circulation)으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 가이드 RNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산)를 포함하는 조성물의 단일 투여는 돌연변이체 단백질의 넉다운 발현에 충분하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 가이드 RNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산)를 포함하는 조성물의 단일 투여는 세포 집단에서 돌연변이체 단백질의 넉아웃 발현에 충분하다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 가이드 RNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산)를 포함하는 조성물의 1회 초과의 투여는 누적 효과를 통해 편집을 최대화하는데 유익할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물은 2회와 같이 2회, 3회, 4회, 5회 이상 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어, 1일 내지 2년, 예컨대, 1 내지 7일, 7 내지 14일, 14일 내지 30일, 30일 내지 60일, 60일 내지 120일, 120일 내지 183일, 183일 내지 274일, 274일 내지 366일 또는 366일 내지 2년 범위의 기간으로 분리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 0.01 내지 10 ㎎/㎏(mpk), 예를 들어, 0.01 내지 0.1mpk, 0.1 내지 0.3mpk, 0.3 내지 0.5mpk, 0.5 내지 1mpk, 1 내지 2mpk, 2 내지 3mpk, 3 내지 5mpk, 5 내지 10mpk 또는 0.1mpk, 0.2mpk, 0.3mpk, 0.5mpk, 1mpk, 2mpk, 3mpk, 5mpk 또는 10mpk 범위의 유효량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 2mpk 내지 4mpk, 예컨대, 2.5mpk 내지 3.5mpk의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 3mpk의 양으로 투여된다. 본 명세서에 보고된 바와 같이, LNP 조성물의 경우, 투여량 또는 유효량은 투여된 총 RNA에 의해 평가된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 사용한 치료의 효능은 전달 후 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 10년에 나타난다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 사용한 치료의 효능은 치료 전 및 후에 혈청 TTR의 수준을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 혈청 TTR의 수준의 감소를 통해 평가된 조성물을 사용한 치료의 효능은 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월 또는 11개월에 나타났다.
일부 실시형태에서, 치료는 질환 진행을 늦추거나 중단시킨다.
일부 실시형태에서, 치료는 FAP의 진행을 늦추거나 중단시킨다. 일부 실시형태에서, 치료는 감각운동 신경병증 또는 자율 신경병증의 증상의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화를 초래한다.
일부 실시형태에서, 치료는 FAC의 증상의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 치료는 제한성 심근증 또는 울혈성 심부전의 증상의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화를 초래한다.
일부 실시형태에서, 치료의 효능은 대상체의 증가된 생존 시간에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 치료의 증가된 내약성에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 증가된 내약성, 예를 들어, 사이토카인, 보체 또는 다른 면역 반응이 측정된다.
일부 실시형태에서, 치료의 효능은 감각운동 또는 자율 신경병증의 증상의 개선 또는 진행의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 신체의 한 부분을 움직이거나 또는 신체의 임의의 부분에서 느끼는 능력의 증가 또는 감소의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 삼키기; 숨쉬기; 팔, 손, 다리의 사용; 또는 걷는 능력의 개선 또는 감소의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 신경통의 개선 또는 진행의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 신경통은 통증, 작열감, 따끔거림 또는 비정상적인 느낌을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 기립성 저혈압(postural hypotension), 현기증, 위장 운동장애(gastrointestinal dysmotility), 방광 기능장애(bladder dysfunction) 또는 성기능 장애(sexual dysfunction)의 증가의 개선 또는 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 쇠약의 개선 또는 진행의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 근전도, 신경 전도 테스트 또는 환자-보고된 결과를 사용하여 측정된다.
일부 실시형태에서, 치료의 효능은 울혈성 심부전 또는 CHF의 증상의 개선 또는 진행의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 숨가쁨, 호흡 곤란, 피로 또는 발목, 발, 다리, 복부 또는 경정맥의 부종의 감소 또는 증가의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 체중 증가, 잦은 배뇨 또는 야간 기침과 같은 측정에 의해 평가될 수 있는 신체의 체액 축적(fluid buildup)의 개선 또는 진행의 둔화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 치료의 효능은 심장의 바이오마커 테스트(예컨대, B-유형 나트륨이뇨성 펩타이드[B-type natriuretic peptide: BNP] 또는 N-말단 프로 b-유형 나트륨이뇨성 펩타이드[N-terminal pro b-type natriuretic peptide: NT-proBNP]), 폐 기능 테스트, 흉부 x-선 또는 심전도법을 사용하여 측정된다.
A. 병용 요법
일부 실시형태에서, 본 발명은 코르티코스테로이드, 및 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 S. 피오게네스 Cas9를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산(예를 들어, mRNA) 또는 벡터와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산)(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내)를 ATTR의 증상을 완화시키는데 적합한 추가적인 요법과 함께 투여하는 단계를 포함하는 병용 요법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산은 CCD 지질(예를 들어, 아민 지질, 예컨대, 지질 A), 보조 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG) 및 선택적으로 중성 지질(예를 들어, DSPC)을 포함하는 LNP와 같은 본 명세서에 기재된 LNP로 투여된다.
일부 실시형태에서, ATTR에 대한 추가적인 요법은 감각운동 또는 자율 신경병증에 대한 치료이다. 일부 실시형태에서, 감각운동 또는 자율 신경병증에 대한 치료제는 비스테로이드성 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug), 항우울제(antidepressant), 항경련제(anticonvulsant medication), 항부정맥제(antiarrythmic medication) 또는 마약(narcotic agent)이다. 일부 실시형태에서, 항우울제는 삼환계 작용제(tricylic agent) 또는 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 저해제(serotonin-norepinephrine reuptake inhibition)이다. 일부 실시형태에서, 항우울제는 아미트리프탈린(amitriptyline), 둘로섹틴(duloxetine) 또는 벤라팍신(venlafaxine)이다. 일부 실시형태에서, 항경련제는 가바펜틴(gabapentin), 프레가발린(pregabalin), 토피라메이트(topiramate) 또는 카바마제핀(carbamazepine)이다. 일부 실시형태에서, 감각운동 신경병증에 대한 추가적인 요법은 경피적 전기 신경 자극이다.
일부 실시형태에서, ATTR에 대한 추가적인 요법은 제한성 심근증 또는 울혈성 심부전(CHF)에 대한 치료이다. 일부 실시형태에서, CHF에 대한 치료제는 ACE 저해제, 알도스테론 길항제, 안지오텐신 수용체 차단제, 베타 차단제, 디곡신(digoxin), 이뇨제 또는 아이소소르바이드 다이나이트레이트/하이드랄라진 하이드로클로라이드이다. 일부 실시형태에서, ACE 저해제는 에날라프릴(enalapril), 캅토프릴(Captopril), 라미프릴(ramipril), 페린도프릴(perindopril), 이미다프릴(imidapril) 또는 퀴나프릴(quinapril)이다. 일부 실시형태에서, 알도스테론 길항제는 에플레레논(eplerenone) 또는 스피로노락톤(spironolactone)이다. 일부 실시형태에서, 안지오텐신 수용체 차단제는 아질사르탄(azilsartan), 카데사르탄(cadesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 올메사르탄(olmesartan), 텔미사르탄(telmisartan) 또는 발사르탄(valsartan)이다. 일부 실시형태에서, 베타 차단제는 아세뷰톨롤(acebutolol), 아테놀롤(atenolol), 비소프롤롤(bisoprolol), 메토프롤롤(metoprolol), 나돌롤(nadolol), 네비볼롤(nebivolol) 또는 프로프라놀롤(propranolol)이다. 일부 실시형태에서, 이뇨제는 클로로티아자이드(chlorothiazide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 하이드로클로로티아자이드(hydrochlorothiazide), 인다파마이드(indapamide), 메톨라존(metolazone), 뷰메타나이드(bumetanide), 퓨로세마이드(furosemide), 토르세마이드(torsemide), 아밀로라이드(amiloride) 또는 트라이아메테렌(triameterene)이다.
일부 실시형태에서, 병용 요법은 코르티코스테로이드, 및 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산)(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내)를 TTR 또는 돌연변이체 TTR을 표적화하는 siRNA와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA는 야생형 또는 돌연변이체 TTR의 발현을 추가로 감소시키거나 또는 제거할 수 있는 임의의 siRNA이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 파티시란(Patisiran)(ALN-TTR02) 또는 ALN-TTRsc02라는 약물이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내) 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, siRNA는 본 명세서에 제공되는 임의의 gRNA 조성물로 치료한 후 정기적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 병용 요법은 코르티코스테로이드, 및 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산)(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내)을 TTR 또는 돌연변이체 TTR을 표적화하는 안티센스 뉴클레오타이드와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 야생형 또는 돌연변이체 TTR의 발현을 추가로 감소시키거나 또는 제거할 수 있는 임의의 안티센스 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 이노테센(Inotersen)(IONS-TTRRx)이라는 약물이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA 및 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 핵산(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내) 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 본 명세서에 제공되는 임의의 gRNA 조성물로 치료한 후 정기적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 병용 요법은 코르티코스테로이드, 및 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산)(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내)을 TTR의 올바르게 접힌 4량체 형태의 동역학적 안정화를 촉진하는 소분자 안정제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자 안정제는 약물 타파미디스(Vyndaqel®) 또는 다이플루니살이다. 일부 실시형태에서, 소분자 안정제는 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 또는 표 2의 임의의 하나 이상의 sgRNA(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 조성물 내) 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 소분자 안정제는 본 명세서에서 제공되는 임의의 조성물로 치료한 후 정기적으로 투여된다.
임의의 전술한 실시형태에서, 표 1에 개시된 가이드 서열은 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택될 수 있고/있거나, 표 2의 sgRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124로부터 선택되고/되거나, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된 가이드 RNA일 수 있다.
B. 핵산 조성물의 전달
일부 실시형태에서, gRNA 및 선택적으로 RNA로서 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하거나 또는 하나 이상의 벡터에 암호화된 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 본 명세서에 기재된 핵산 조성물은 지질 나노입자로 제형화되거나 또는 이를 통해 투여되며; 예를 들어, 그 내용이 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 2017년 10월 5일자로 공개된 WO2017173054A1 및 2019년 4월 4일자로 공개된 WO2019067992A1을 참조한다. 뉴클레오타이드를 대상체에 전달할 수 있는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 지질 나노입자(LNP)는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산과 함께 이용될 수 있다.
CRISPR/Cas 카고(cargo)를 포함하는 RNA를 위한 LNP 제형의 다양한 실시형태가 본 명세서에 개시된다. 이러한 LNP 제형은 (i) CCD 지질, 예컨대, 아민 지질, (ii) 중성 지질, (iii) 보조 지질, 및 (iv) 스텔스 지질, 예컨대, PEG 지질을 포함할 수 있다. LNP 제형의 일부 실시형태는 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질과 같은 스텔스 지질과 함께 "아민 지질"을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 제형은 1 퍼센트 미만의 중성 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 제형은 0.5 퍼센트 미만의 중성 인지질을 포함한다. "지질 나노입자"는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합되는 복수의(즉, 하나 이상의) 지질 분자를 포함하는 입자를 의미한다.
CCD 지질
CRISPR/Cas mRNA 및 가이드 RNA 구성요소를 간 세포와 같은 표적 세포로 전달하기 위한 지질 조성물은 CCD 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, CCD 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트인 지질 A이이다. 지질 A는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00024
지질 A는 WO2015/095340(예를 들어, 84 내지 86 페이지)에 따라 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, CCD 지질은 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥테인-8,1-다이일) 비스(데카노에이트)로도 불리는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥테인-8,1-다이일)비스(데카노에이트)인 지질 B이다. 지질 B는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00025
지질 B는 WO2014/136086(예를 들어, 107 내지 109 페이지)에 따라 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, CCD 지질은 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로페인-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트)인 지질 C이다.
Figure pct00026
일부 실시형태에서, CCD 지질은 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트인 지질 D이다.
지질 D는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00027
지질 C 및 지질 D는 WO2015/095340에 따라 합성될 수 있다.
CCD 지질은 또한 지질 A, 지질 B, 지질 C 또는 지질 D에 대한 등가물일 수 있다. 소정의 실시형태에서, CCD 지질은 지질 A에 대한 등가물, 지질 B에 대한 등가물, 지질 C에 대한 등가물 또는 지질 D에 대한 등가물이다.
아민 지질
일부 실시형태에서, 생물학적 활성제의 전달을 위한 LNP 조성물은 지질 A, 지질 B, 지질 C, 지질 D 또는 지질 A의 등가물(지질 A의 아세탈 유사체 포함), 지질 B의 등가물, 지질 C의 등가물 및 지질 D의 등가물로 정의되는 "아민 지질"을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아민 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트인 지질 A이다. 지질 A는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00028
지질 A는 WO2015/095340(예를 들어, 84 내지 86 페이지)에 따라 합성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A에 대한 등가물이다.
소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A의 유사체이다. 소정의 실시형태에서, 지질 유사체는 지질 A의 아세탈 유사체이다. 특정 LNP 조성물에서, 아세탈 유사체는 C4-C12 아세탈 유사체이다. 일부 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C5-C12 아세탈 유사체이다. 추가적인 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C5-C10 아세탈 유사체이다. 추가의 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11 및 C12 아세탈 유사체로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 LNP에 사용하기에 적합한 아민 지질은 생체내에서 생분해성이며, RNA와 같은 생물학적 활성제를 세포에 전달하기에 적합하다. 아민 지질은 낮은 독성을 갖는다(예를 들어, 10 ㎎/㎏ 이상의 RNA 카고의 양에서 부작용 없이 동물 모델에서 용인됨). 소정의 실시형태에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는 아민 지질의 적어도 75%가 8시간, 10시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 또는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것들을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는 mRNA 또는 gRNA의 적어도 50%가 8시간, 10시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 또는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것들을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질을 포함하는 LNP는, 예를 들어, 지질(예를 들어, 아민 지질), RNA(예를 들어, mRNA) 또는 또 다른 구성요소를 측정함으로써 LNP의 적어도 50%가 8시간, 10시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 또는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것들을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질-캡슐화 대 유리 지질, RNA 또는 LNP의 핵산 구성요소가 측정된다.
지질 청소율(clearance)은 문헌에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 문헌[Maier, M.A., et al. Biodegradable LipID Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nano입자s for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier")] 참조. 예를 들어, Maier에서, 루시퍼레이스-표적화 siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템은 측면 꼬리 정맥을 통한 정맥내 볼루스 주사에 의해 0.3 ㎎/㎏으로 6주 내지 8주령의 수컷 C57Bl/6 마우스에 투여되었다. 혈액, 간 및 비장 샘플은 투여 후 0.083시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 96시간 및 168시간에 수집되었다. 조직 수집 전에 마우스에 식염수를 관류시키고, 혈액 샘플이 혈장을 얻기 위해 처리되었다. 모든 샘플이 처리되고, LC-MS에 의해 분석되었다. 또한, Maier는 LNP-siRNA 제형의 투여 후 독성을 평가하기 위한 절차를 기술하고 있다. 예를 들어, 루시퍼레이스-표적화 siRNA는 수컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트에 5 ㎖/㎏의 용량 부피로 단일 정맥내 볼루스 주사를 통해 0 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏(5마리의 동물/그룹)으로 투여되었다. 24시간 후, 약 1㎖의 혈액이 의식이 있는 동물의 경정맥으로부터 얻어졌으며, 혈청이 단리되었다. 투여 후 72시간에, 모든 동물은 부검을 위해 안락사되었다. 임상적 징후, 체중, 혈청 화학, 장기 무게 및 조직병리학의 평가가 수행되었다. Maier는 siRNA-LNP 제형을 평가하는 방법을 기술하고 있지만, 이들 방법은 본 개시내용의 LNP 조성물의 투여의 청소율, 약동학 및 독성을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
아민 지질은 청소율(clearance rate)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 청소율은 지질 청소율, 예를 들어, 지질이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 비율이다. 일부 실시형태에서, 청소율은 RNA 청소율, 예를 들어, mRNA 또는 gRNA가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 비율이다. 일부 실시형태에서, 청소율은 LNP가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 비율이다. 일부 실시형태에서, 청소율은 LNP가 조직, 예컨대, 간 조직 또는 비장 조직으로부터 제거되는 비율이다. 소정의 실시형태에서, 높은 청소율은 실질적인 부작용이 없는 안전성 프로파일로 이어진다. 아민 지질은 순환계 및 조직에서 LNP 축적을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 순환계 및 조직에서 LNP 축적의 감소는 실질적인 부작용이 없는 안전성 프로파일로 이어진다.
본 개시내용의 아민 지질은 그것이 있는 매질의 pH에 따라 이온화될 수 있다(예를 들어, 염을 형성할 수 있음). 예를 들어, 약산성 매질에서, 아민 지질은 양성자화되어 양전하를 가질 수 있다. 반대로, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약염기성 매질에서, 아민 지질은 양성자화되지 않아 전하를 띠지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 적어도 약 10의 pH에서 양성자화될 수 있다.
아민 지질이 주로 양성자화되는 pH는 이의 고유한 pKa와 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.5 내지 약 6.6 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.6 내지 약 6.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.5 범위의 pKa를 가질 수 있다. 아민 지질의 pKa는 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 갖는 양이온성 지질이 생체내, 예를 들어, 간으로의 카고의 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에 LNP로 제형화하는데 중요한 고려사항일 수 있다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4 범위의 pKa를 갖는 양이온성 지질은 생체내, 예를 들어, 종양으로의 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, WO2014/136086 참조.
추가적인 지질
본 개시내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 "중성 지질"은 예를 들어, 다양한 중성, 비하전 또는 양성이온 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 , 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올(레조르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 계란 포스파티딜콜린(EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 라이소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 중성 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중성 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중성 인지질은 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)일 수 있다.
"보조 지질"은 스테로이드, 스테롤 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 보조 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 보조 지질은 콜레스테롤일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질은 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
"스텔스 지질"은 나노입자기 생체내에서(예를 들어, 혈액에서) 존재할 수 있는 기간을 변경하는 지질이다. 스텔스 지질은 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제형화 과정을 도울 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 스텔스 지질은 LNP의 약동학 특성을 조절할 수 있다. 본 개시내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 그룹을 갖는 스텔스 지질을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 스텔스 지질 및 이러한 지질의 생화학에 대한 정보는 문헌[Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71 및 Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004) 41-52]에서 찾을 수 있다. 추가적인 적합한 PEG 지질은 예를 들어, WO 2006/007712에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 그룹은 PEG에 기반한 중합체로부터 선택되는 중합체 모이어티를 포함한다. 스텔스 지질은 지질 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG 지질이다. PEG 지질은, 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제형화 과정을 도울 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 PEG 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 전형적으로, PEG 지질은 지질 모이어티 및 PEG에 기반한 중합체 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG(때로는 폴리(에틸렌 옥사이드)로도 지칭됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(바이닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-바이닐피롤리돈), 폴리아미노산 및 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아마이드]에 기반한 중합체로부터 선택되는 중합체 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG(때로는 폴리(에틸렌 옥사이드)로도 지칭됨)에 기반한 중합체 모이어티를 포함한다.
PEG 지질은 지질 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 모이어티는 약 C4 내지 약 C40의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 독립적으로 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 다이알킬글리세롤기 또는 다이알킬글리카마이드기를 포함하는 것들을 포함하는, 다이아실글리세롤 또는 다이아실글리카마이드로부터 유래될 수 있되, 사슬은 예를 들어, 아마이드 또는 에스터와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알킬 사슬 길이는 약 C10 내지 C20을 포함한다. 다이알킬글리세롤기 또는 다이알킬글리카마이드기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 더 포함할 수 있다. 사슬 길이는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 폴리알킬렌 에터 중합체를 의미한다. 일 실시형태에서, PEG는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 중합체이다. 일 실시형태에서, PEG는 비치환된다. 일 실시형태에서, PEG는, 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시 또는 아릴 기에 의해 치환된다. 일 실시형태에서, 용어는 PEG 공중합체, 예컨대, PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌을 포함하고(예를 들어, 문헌[J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)] 참조); 또 다른 실시형태에서, 용어는 PEG 공중합체를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, PEG는 약 130 내지 약 50,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 30,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 20,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 15,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 10,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 6,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 5,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 4,000, 하위-실시형태에서, 약 150 내지 약 3,000, 하위-실시형태에서, 약 300 내지 약 3,000, 하위-실시형태에서, 약 1,000 내지 약 3,000 및 하위-실시형태에서, 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
소정의 실시형태에서, PEG(예를 들어, 지질 모이어티 또는 스텔스 지질과 같은 지질에 접합됨)는 평균 분자량이 약 2,000 달톤인 "PEG 2000"으로도 지칭되는 "PEG-2K"이다. PEG-2K는 본 명세서에서 하기 화학식 (I)로 표시되되, n은 45이며, 이는 수 평균 중합도가 약 45개의 서브유닛을 포함함을 의미한다. 그러나, 예를 들어, 수-평균 중합도가 약 23개의 서브유닛(n=23) 및/또는 68개의 서브유닛(n=68)을 포함하는 것들을 포함하는 당업계에 공지된 다른 PEG 실시형태가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 45일 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 H, 치환된 알킬 및 비치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 비치환된 알킬일 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 메틸일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)(NOF(일본, 도쿄 소재)의 카탈로그 번호 GM-020), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤(PEG-DSPE)(카탈로그 번호 DSPE-020CN, NOF(일본, 도쿄 소재)), PEG-다이라우릴글리카마이드, PEG-다이미리스틸글리카마이드, PEG-다이팔미토일글리카마이드 및 PEG-다이스테아로일글리카마이드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-다이옥사옥탄일]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에터), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE)(아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar LipID)(미국, 앨라배마주 앨라바스터 소재)의 카탈로그 번호 880120C), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG; GS-020, NOF(일본, 도쿄 소재)), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-다이메타크릴레이트(PEG2k-DMA) 및 1,2-다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 WO2016/010840(문단 [00240] 내지 [00244])에 개시된 화합물 S027일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 일 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
LNP 제형
LNP는 (i) 캡슐화 및 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 위한 아민 지질, (ii) 안정화를 위한 중성 지질, (iii) 안정화를 위한 보조 지질 및 (iv) PEG 지질과 같은 스텔스 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 생략될 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 RNA-가이드된 DNA-결합제, Cas 뉴클레이스 mRNA, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA, Cas9 mRNA 및 gRNA 중 하나 이상을 포함하는 RNA 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 RNA 구성요소로서 클래스 2 Cas 뉴클레이스, 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 RNA 구성요소, 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 스텔스 지질을 포함할 수 있다. 소정의 LNP 조성물에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. 추가적인 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A 또는 지질 A의 등가물; 보조 지질; 중성 지질; 스텔스 지질; 및 가이드 RNA를 포함한다. 소정의 조성물에서, 아민 지질은 지질 A이다. 소정의 조성물에서, 아민 지질은 지질 A 또는 이의 아세탈 유사체이고; 보조 지질은 콜레스테롤이며; 중성 지질은 DSPC이고; 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 제형 내 지질 구성요소의 각각의 몰비에 따라 기술된다. 본 개시내용의 실시형태는 제형 내 지질 구성요소의 각각의 몰비에 따라 기술되는 지질 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 30 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 40 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 45 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 50 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 55 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 50 몰-% 내지 약 55 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 50 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 아민 지질의 몰-%는 약 55 몰-%일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 배취(batch)의 아민 지질 몰-%는 표적 몰-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 일부 실시형태에서, LNP 배취의 아민 지질 몰-%는 표적 몰-%의 ±4 몰-%, ±3 몰-%, ±2 몰-%, ±1.5 몰-%, ±1 몰-%, ±0.5 몰-% 또는 ±0.25 몰-%일 것이다. 모든 몰-%의 숫자는 LNP 조성물의 지질 구성요소의 분율(fraction)로 주어진다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질 몰-%의 LNP 로트간(inter-lot) 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 5 몰-% 내지 약 15 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 7 몰-% 내지 약 12 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 0 몰-% 내지 약 5 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 0 몰-% 내지 약 10 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 5 몰-% 내지 약 10 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 8 몰-% 내지 약 10 몰-%일 수 있다.
일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 5 몰-%, 약 6 몰-%, 약 7 몰-%, 약 8 몰-%, 약 9 몰-%, 약 10 몰-%, 약 11 몰-%, 약 12 몰-%, 약 13 몰-%, 약 14 몰-% 또는 약 15 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 9 몰-%일 수 있다.
일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 1 몰-% 내지 약 5 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질의 몰-%는 약 0.1 몰-% 내지 약 1 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예컨대, 중성 인지질의 몰-%는 약 0.1 몰-%, 약 0.2 몰-%, 약 0.5 몰-%, 1 몰-%, 약 1.5 몰-%, 약 2 몰-%, 약 2.5 몰-%, 약 3 몰-%, 약 3.5 몰-%, 약 4 몰-%, 약 4.5 몰-% 또는 약 5 몰-%일 수 있다.
일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 1 몰-%의 미만일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 0.5 몰-%의 미만일 수 있다. 일 실시형태에서, 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질의 몰-%는 약 0 몰-%, 약 0.1 몰-%, 약 0.2 몰-%, 약 0.3 몰-%, 약 0.4 몰-%, 약 0.5 몰-%, 약 0.6 몰-%, 약 0.7 몰-%, 약 0.8 몰-%, 약 0.9 몰-% 또는 약 1 몰-%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제형은 중성 지질이 없다(즉, 0 몰-%의 중성 지질). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제형은 중성 지질이 본질적으로 없다(즉, 약 0 몰-%의 중성 지질). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제형은 중성 인지질이 없다(즉, 0 몰-%의 중성 인지질). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제형은 중성 인지질이 본질적으로 없다(즉, 약 0 몰-%의 중성 인지질).
일부 실시형태에서, LNP 배취의 중성 지질 몰-%는 표적 중성 지질 몰-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 20 몰-% 내지 약 60 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 25 몰-% 내지 약 55 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 25 몰-% 내지 약 50 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 25 몰-% 내지 약 40 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 30 몰-% 내지 약 50 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 약 30 몰-% 내지 약 40 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 지질 구성요소가 100 몰-%의가 되도록 아민 지질, 중성 지질 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정된다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 지질 구성요소가 100 몰-%의가 되도록 아민 지질 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정된다. 일 실시형태에서, 보조 지질의 몰-%는 지질 구성요소가 적어도 99 몰-%의가 되도록 아민 지질 및 PEG 지질 농도를 기준으로 조정된다. 일부 실시형태에서, LNP 배취의 보조 몰-%는 표적 몰-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 1 몰-% 내지 약 10 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 2 몰-% 내지 약 10 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 2 몰-% 내지 약 8 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 2 몰-% 내지 약 4 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 2.5 몰-% 내지 약 4 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 3 몰-%일 수 있다. 일 실시형태에서, 몰-%의 PEG 지질은 약 2.5 몰-%일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 배취의 PEG 지질 몰-%는 표적 PEG 지질 몰-%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
소정의 실시형태에서, 카고는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 핵산(예를 들어, Cas 뉴클레이스, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 또는 Cas9) 및 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산 또는 mRNA와 gRNA의 조합을 포함한다. 일 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A 또는 이의 등가물을 포함한다. 일부 양태에서, 아민 지질은 지질 A이다. 일부 양태에서, 아민 지질은 지질 A 등가물, 예를 들어, 지질 A의 유사체이다. 소정의 양태에서, 아민 지질은 지질 A의 아세탈 유사체이다. 다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 중성 지질, 보조 지질 및 PEG 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다. 특정 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 DMG를 포함하는 PEG 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A 및 지질 A의 아세탈 유사체를 포함하는 지질 A의 등가물로부터 선택된다. 추가적인 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함한다. 다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질, 중성 인지질 및 PEG 지질을 포함한다. 다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질로 구성되는 지질 구성요소를 포함한다. 다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질 및 PEG 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 중성 인지질과 같은 중성 지질을 포함하지 않는다. 다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질 및 PEG 지질로 구성되는 지질 구성요소를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DAPC, DMPC, DOPC, DOPE 및 DSPE 중 하나 이상으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DPPC이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DAPC이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DMPC이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DOPC이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DOPE이다. 소정의 실시형태에서, 중성 지질은 DSPE이다. 소정의 실시형태에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. 특정 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A, 보조 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A, 보조 지질 및 PEG 지질로 구성되는 지질 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질로 구성되는 지질 구성요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 DMG를 포함하는 PEG 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A 및 지질 A의 아세탈 유사체를 포함하는 지질 A의 등가물로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 C5-C12 또는 C4-C12 지질 A의 아세탈 유사체이다. 추가적인 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 A, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 캡슐화될 아민 지질(N)의 양으로 하전된 아민기와 핵산의 음으로 하전된 포스페이트기(P) 사이의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 이는 수학적으로 N/P 방정식으로 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함하는 지질 구성요소; 및 핵산 구성요소를 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 대 10이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질 및 PEG 지질을 포함하는 지질 구성요소; 및 핵산 구성요소를 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 보조 지질을 포함하는 지질 구성요소; 및 RNA 구성요소를 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 아민 지질, 보조 지질 및 PEG 지질을 포함하는 지질 구성요소; 및 RNA 구성요소를 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일 실시형태에서, N/P 비는 약 5 내지 7일 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 약 3 내지 7일 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 약 4.5 내지 8일 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 약 6일 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 6±1일 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 6±0.5일 수 있다. 일부 실시형태에서, N/P 비는 표적 N/P 비의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일부 실시형태에서, RNA 구성요소는, 예를 들어, Cas 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 개시된 핵산과 같은 핵산을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, RNA 구성요소는 Cas9 mRNA를 포함할 수 있다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 핵산을 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 gRNA와 같은 gRNA 핵산을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 구성요소는 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 구성요소는 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 임의의 전술한 실시형태에서, gRNA는 본 명세서에 기재된 화학적으로 변형된 sgRNA와 같은 본 명세서에 기재된 sgRNA일 수 있다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물은, 예를 들어, 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 개시된 핵산, gRNA, 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 소정의 LNP 조성물에서, 보조 지질은 콜레스테롤이고; 중성 지질은 DSPC이고/이거나 PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 특정 조성물에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대, 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다. 일 실시형태에서, LNP 조성물의 지질 구성요소는 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질로 구성된다. 일 실시형태에서, LNP 조성물의 지질 구성요소는 아민 지질, 보조 지질 및 PEG 지질로 구성된다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 소정의 조성물에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 소정의 조성물은 약 1 몰-%의 미만의 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질을 포함한다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 소정의 조성물은 약 0.5 몰-%의 미만의 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질을 포함한다. 소정의 조성물에서, LNP는 중성 지질, 예를 들어, 중성 인지질을 포함하지 않는다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대, 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
일 실시형태에서, LNP 조성물은 sgRNA를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, LNP 조성물은 Cas9 sgRNA를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, LNP 조성물은 Cpf1 sgRNA를 포함할 수 있다. sgRNA를 포함하는 일부 조성물에서, LNP는 아민 지질, 보조 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함한다. sgRNA를 포함하는 소정의 조성물에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. sgRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. sgRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG 또는 PEG2k-C11이다. 소정의 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A 및 이의 등가물, 예컨대, 지질 A의 아세탈 유사체로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 Cas 뉴클레이스 mRNA(예컨대, 클래스 2 Cas mRNA) 및 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 25:1 내지 약 1:25의 gRNA 대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA와 같은 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 제형은 약 10:1 내지 약 1:10의 gRNA 대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA와 같은 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 제형은 약 8:1 내지 약 1:8의 gRNA 대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA와 같은 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비를 포함한다. 본 명세서에서 측정된 바와 같이, 비는 중량 기준이다. 일부 실시형태에서, LNP 제형은 약 5:1 내지 약 1:5의 gRNA 대 클래스 2 Cas mRNA와 같은 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비의 범위는 약 3:1 내지 1:3, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:2, 약 3:1 내지 1:1, 약 3:1, 약 2:1 내지 1:1이다. 일부 실시형태에서, gRNA 대 mRNA의 비는 약 3:1 또는 약 2:1이다. 일부 실시형태에서, gRNA 대 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비는 약 1:1이다. 비는 약 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 또는 1:25일 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP는 RNA 수용액을 유기 용매-기반 지질 용액, 예를 들어, 100% 에탄올과 혼합하여 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 물, PBS, Tris 완충액, NaCl, 시트레이트 완충액, 에탄올, 클로로폼, 다이에틸에터, 사이클로헥세인, 테트라하이드로퓨란, 메탄올, 아이소프로판올을 포함하거나 또는 포함할 수 있다. 예를 들어, LNP의 생체내 투여를 위한 약제학적으로 허용 가능한 완충액이 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 완충액은 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 6.5 또는 그 이상으로 유지하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 완충액은 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 7.0 또는 그 이상으로 유지하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 약 7.2 내지 약 7.7의 범위의 pH를 갖는다. 추가적인 실시형태에서, 조성물은 약 7.3 내지 약 7.7의 범위 또는 약 7.4 내지 약 7.6의 범위의 pH를 갖는다. 추가의 실시형태에서, 조성물은 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.7의 pH를 갖는다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 프로브로 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 동결보호제(cryoprotectant)가 조성물에 포함된다. 동결보호제의 비제한적인 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은 예를 들어, 수크로스와 같은 최대 10%의 동결보호제를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 동결보호제를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충액은 포스페이트 완충액(PBS), Tris 완충액, 시트레이트 완충액 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 완충액은 NaCl을 포함한다. 소정의 실시형태에서, NaCl은 생략된다. NaCl의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 45mM의 범위일 수 있다. NaCl의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 50mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, NaCl의 양은 약 45mM이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 Tris 완충액이다. Tris의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. Tris의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Tris의 양은 약 50mM이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 NaCl 및 Tris를 포함한다. LNP 조성물의 소정의 예시적인 실시형태는 Tris 완충액 중 5% 수크로스 및 45mM NaCl을 함유한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 조성물은 약 5% w/v 양의 수크로스, 약 45mM의 NaCl 및 약 50mM의 Tris(pH 7.5)를 함유한다. 염, 완충액 및 동결보호제의 양은 전체 제형의 삼투압 농도가 유지되도록 다양할 수 있다. 예를 들어, 최종 삼투압 농도는 450 mOsm/ℓ 미만으로 유지될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 삼투압 농도는 350 mOsm/ℓ 내지 250 mOsm/ℓ이다. 소정의 실시형태는 300 +/- 20 mOsm/ℓ의 최종 삼투압 농도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 미세유체(microfluidic) 혼합, T-혼합 또는 교차-혼합이 사용된다. 소정의 양태에서, 유속, 접합부 크기, 접합부 기하학, 접합부 형상, 튜브 직경, 용액 및/또는 핵산 및 지질 농도는 다양할 수 있다. LNP 또는 LNP 조성물은 예를 들어, 투석, 접선 유동 여과 또는 크로마토그래피를 통해 농축 또는 정제될 수 있다. LNP는, 예를 들어, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조된 분말로서 보관될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 보관되며, 소정의 양태에서, LNP 조성물은 실온에서 보관된다. 추가적인 실시형태에서, LNP 조성물은 예를 들어, -20℃ 또는 -80℃에서 냉동 보관된다. 다른 실시형태에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 보관된다. 냉동된 LNP 조성물은 실온 또는 25℃에서, 예를 들어, 얼음 위에서 사용하기 전에 해동될 수 있다.
LNP는, 예를 들어, 마이크로스피어(단일층 및 다중층 소포, 예를 들어, "리포솜"(일부 실시형태에서, 실질적으로 구형인 층상 지질 이중층)을 포함하고, 보다 구체적인 실시형태에서, 예를 들어, 상당한 부분의 RNA 분자를 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음), 에멀션 중 분산된 상, 마이셀 또는 현탁액 중 내상일 수 있다.
또한, LNP 조성물은 치료학적 유효 용량에서 생체내에서 세포독성 수준으로 축적되지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 실질적인 부작용을 초래하는 선천성 면역 반응을 일으키지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 LNP 조성물은 치료 용량 수준에서 독성을 일으키지 않는다.
일부 실시형태에서, pdi는 약 0.005 내지 약 0.75의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0.01 내지 약 0.5의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.4의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.35의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.35의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.3의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.25의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0 내지 약 0.2의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 약 0.08, 0.1, 0.15, 0.2 또는 0.4 미만일 수 있다.
본 명세서에 개시된 LNP는 약 1㎚ 내지 약 250㎚의 크기(예를 들어, Z-평균 직경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 10㎚ 내지 약 200㎚의 크기를 갖는다. 추가의 실시형태에서, LNP는 약 20㎚ 내지 약 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 120㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 60㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 120㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 언급되는 모든 크기는 MalveRNA Zetasizer에서 동적 광 산란에 의해 측정되는 바와 같은 완전히 형성된 나노입자의 평균 크기(직경)이다. 나노입자 샘플은 계수율(count rate)이 대략 200 kcps 내지 400 kcps가 되도록 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중-평균(Z-평균 직경)으로 표시된다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50% 내지 약 70% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 1.00E+05 g/㏖ 내지 약 1.00E+10 g/㏖ 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 5.00E+05 g/㏖ 내지 약 7.00E+07g/㏖ 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 1.00E+06 g/㏖ 내지 약 1.00E+10 g/㏖ 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 1.00E+07 g/㏖ 내지 약 1.00E+09 g/㏖ 범위의 평균 분자량으로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 5.00E+06 g/㏖ 내지 약 5.00E+09 g/㏖ 범위의 평균 분자량으로 형성된다.
일부 실시형태에서, 다분산성(Mw/Mn; 중량 평균 몰 질량(Mw) 대 수 평균 몰 질량(Mn)의 비)은 약 1.000 내지 약 2.000의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Mw/Mn은 약 1.00 내지 약 1.500의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Mw/Mn은 약 1.020 내지 약 1.400의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Mw/Mn은 약 1.010 내지 약 1.100의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Mw/Mn은 약 1.100 내지 약 1.350의 범위일 수 있다.
동적 광 산란("DLS(dynamic light scattering)")은 본 개시내용의 LNP의 다분산 지수("pdi") 및 크기를 특성화하기 위해 사용될 수 있다. DLS는 샘플을 광원에 노출시켜 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 PDI는 PDI가 0인 완벽하게 균일한 집단과 함께 집단에서의 입자 크기 분포(대략 평균 입자 크기)를 나타낸다. 일부 실시형태에서, pdi는 0.005 내지 0.75의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 0.01 내지 0.5의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 0.02 내지 0.4의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 0.03 내지 0.35의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, pdi는 0.1 내지 0.35의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 LNP는 1㎚ 내지 250㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 10㎚ 내지 200㎚의 크기를 갖는다. 추가의 실시형태에서, LNP는 20㎚ 내지 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 50㎚ 내지 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 50㎚ 내지 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 50㎚ 내지 120㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 75㎚ 내지 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 30㎚ 내지 200㎚의 크기를 갖는다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 언급되는 모든 크기는 MalveRNA Zetasizer에서 동적 광 산란에 의해 측정되는 바와 같은 완전히 형성된 나노입자의 평균 크기(직경)이다. 나노입자 샘플은 계수율이 대략 200 kcts 내지 400 kcts가 되도록 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중-평균(Z-평균 직경)으로 표시된다. 일부 실시형태에서, LNP는 50% 내지 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. LNP는 50% 내지 70% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 70% 내지 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 90% 내지 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 75% 내지 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 ATTR을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 ATTR을 갖는 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서의 TTR의 축적 및 응집을 감소시키거나 또는 방지하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 혈청 TTR 농도를 감소시키기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 대상체, 예컨대, 포유동물, 예를 들어, 인간과 같은 영장류에서 ATTR을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 ATTR을 갖는 대상체, 예컨대, 포유동물, 예를 들어, 인간과 같은 영장류에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유에서의 TTR의 축적 및 응집을 감소시키거나 또는 방지하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 대상체, 예컨대, 포유동물, 예를 들어, 인간과 같은 영장류에서 혈청 TTR 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 것이다. 임의의 전술한 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 개시된 gRNA 및 본 명세서에 개시된 RNA-가이드된 DNA 결합제(예를 들어, Cas9, Spy Cas9)를 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)과 관련될 수 있다.
전기 천공법도 또한 카고의 전달을 위한 잘 알려진 수단이며, 임의의 전기 천공법 방법론이 본 명세서에 개시된 gRNA 중 어느 하나의 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전기 천공법은 본 명세서에 개시된 gRNA 및 선택적으로 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산 중 어느 하나를 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 gRNA 중 어느 하나를 생체외 세포에 전달하는 방법을 포함하되, gRNA는 LNP와 회합되거나 또는 LNP와 회합되지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 또한 선택적으로 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 또는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 핵산, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 RNA-가이드된 DNA 결합제(예를 들어, Cas9, Spy Cas9)를 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)과 회합된다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 임의의 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 서열에 더하여, 벡터는 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산을 더 포함한다. 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산은 프로모터, 인핸서, 조절 서열, 및 선택적으로 Cas9와 같은 뉴클레이스일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 crRNA, trRNA 또는 crRNA와 trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 sgRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들) 및 선택적으로 Cas9 또는 Cpf1과 같은 Cas 뉴클레이스일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 crRNA, trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들) 및 선택적으로 Cas9와 같은 Cas 단백질일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 본 명세서에 기재된 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다(즉, Spy Cas9). 일부 실시형태에서, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA(sgRNA일 수 있음)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 전부 또는 일부가 측면에 있는 가이드 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된다. crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 핵산은 벡터 서열을 더 포함할 수 있되, 벡터 서열은 crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내의 비-인접 핵산에 의해 암호화된다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 인접 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대 가닥에 의해 암호화된다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 원형일 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터는 선형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비-지질 나노입자 또는 바이러스 캡시드에 봉입될 수 있다. 비제한적인 예시적인 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 이의 야생형 대응물로부터 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 촉진하거나 또는 벡터의 하나 이상의 특성이 변경되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성은 패키징 능력, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사 및 번역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈의 일부는 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 결실될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 서열의 숙주 게놈 내로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예컨대, 예를 들어, 인테그레이스)는 바이러스가 비-통합되도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제 결함이 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 벡터 상의 코딩 서열의 발현을 유도하기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 보조-의존적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 증폭시키고 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 바이러스 구성요소(예컨대, 예를 들어, 바이러스 단백질)를 공급하기 위해 하나 이상의 보조 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우에, 바이러스 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 보조 구성요소가 본 명세서에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스는 보조가 없을 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 임의의 보조 바이러스 없이 벡터를 증폭시키고 패키징할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 구성요소를 암호화할 수 있다.
비제한적인 예시적인 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터(helper dependent adenoviral vector: HDAd), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV-1) 벡터, 박테리오파지 T4, 바큘로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV2, AAV3, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAVLK03이다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스는 비-통합형(non-integrating)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스는 클로닝 용량이 높거나 또는 5' 및 3' 역전된 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 및 패키징 신호('I')를 제외한 모든 코딩 바이러스 영역이 바이러스에서 결실되어 패키징 능력이 증가하는 "유전자 미함유(gutless)" 아데노바이러스일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 HSV-1 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, HSV-1-기반 벡터는 헬퍼 의존성이고, 다른 실시형태에서는 헬퍼 독립성이다. 예를 들어, 패키징 서열만을 유지하는 앰플리콘 벡터는 패키징을 위한 구조적 구성요소가 있는 헬퍼 바이러스가 필요한 반면, 비필수 바이러스 기능을 제거하는 30kb-결실 HSV-1 벡터는 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는다. 추가적인 실시형태에서, 바이러스 벡터는 박테리오파지 T4일 수 있다. 일부 실시형태에서, 박테리오파지 T4는 바이러스의 헤드가 비어 있을 때 임의의 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 패키징할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 벡터일 수 있다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 실시형태에서, 클로닝 용량이 더 작은 경우, 본 명세서에 개시된 바와 같은 벡터 시스템의 모든 구성요소를 전달하기 위해 하나 이상의 벡터를 사용할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 하나의 AAV 벡터는 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 서열을 포함할 수 있는 반면, 제2 AAV 벡터는 하나 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 세포에서 하나 이상의 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는, 예를 들어, 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는, 예를 들어, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 진핵생물 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 진핵생물 세포는 인간 세포일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서 발현을 유도하기에 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 야생형일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 보다 효율적이거나 또는 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 절단될 수 있지만 기능은 유지한다. 예를 들어, 프로모터는 벡터의 바이러스 내로의 적절한 패키징에 적합한 정상적인 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적, 유도적 또는 조직-특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터(cytomegalovirus immediate early 프로모터: CMV), 시미안 바이러스(simian virus: SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기(adenovirus major late: MLP) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus: MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 카이네이스(phosphoglycerate kinase: PGK) 프로모터, 연장 인자-알파(elongation factor-alpha: EF1α) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이들의 기능성 단편 또는 임의의 전술한 것들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 절단된 CMV 프로모터일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 EF1a 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열충격, 빛, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도될 수 있는 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터는, 예를 들어, Tet-On® 프로모터(클론테크(Clontech))와 같은 낮은 기본(비-유도성) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 간에서의 발현에 특이적인 프로모터일 수 있다.
벡터는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나의 카피를 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나 이상의 카피를 포함한다. 하나 이상의 가이드 RNA를 갖는 실시형태에서, 가이드 RNA는 상이한 표적 서열을 표적으로 하도록 동일하지 않을 수 있거나 또는 표적 동일한 표적 서열을 표적화하는 점에서 동일할 수 있다. 벡터가 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 일부 실시형태에서, 각 가이드 RNA는 Cas RNP 복합체와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스와의 복합체 내에서의 활성 또는 안정성과 같은 다른 상이한 특성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역된 제어 서열, 예컨대, 프로모터, 3' UTR 또는 5' UTR에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNALys3 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 문헌[Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628] 참조. 일부 실시형태에서, 프로모터는 RNA 폴리머레이스 III(Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적인 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 H1 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 하나 이상의 가이드 RNA를 갖는 실시형태에서, 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 가이드 RNA의 trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 trRNA는 이중-분자 가이드 RNA를 형성하기 위해 단일 전사체로부터 처리될 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 trRNA는 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)로 전사될 수 있다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 동일한 벡터 상의 상응하는 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 선택적으로 명세서에 기재된 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터에 의해 암호화된 뉴클레이스는 Cas 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 하나의 카피를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터 시스템은 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동일한 벡터에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스의 발현은 이들 자신의 상응하는 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 발현은 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스의 발현을 구동하는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질 전사체와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스는 단일 전사체 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 Cas 단백질 전사체와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스의 비번역 영역(untranslated region: UTR) 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 전사체의 5' UTR 내에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA는 전사체의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 전사체의 세포내 반감기는 3' UTR 내에 가이드 RNA를 포함시켜 3' UTR의 길이를 단축시킴으로써 감소될 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 가이드 RNA는 전사체의 인트론 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 스플라이스 부위는 가이드 RNA가 전사체에서 적절하게 스플라이싱되도록 위치되는 인트론에 추가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시간적으로 가까운 근접성으로(in close temporal proximity) 동일한 벡터로부터의 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레이스 및 가이드 RNA의 발현은 CRISPR RNP 복합체의 보다 효율적인 형성을 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 벡터 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 하나의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함할 수 있다. 다중화를 위해 상이한 가이드 RNA가 사용될 때 또는 가이드 RNA의 다중 카피가 사용될 때, 벡터 시스템은 3개 초과의 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 표적 세포에 전달된 후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열충격, 빛, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도될 수 있는 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터는, 예를 들어, Tet-On® 프로모터(클론테크)와 같은 낮은 기준(비-유도성) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 벡터 시스템은 특정 조직에 전달된 후에만 발현을 시작하는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
벡터는 리포솜, 나노입자, 엑소솜 또는 미세소포체에 의해 전달될 수 있다. 벡터는 또한 지질 나노입자(LNP)에 의해 전달될 수 있으며; 예를 들어, 이들 각각의 내용이 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 "LIPID NANO입자 FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS"라는 명칭으로 2017년 10월 5일자로 공개된 WO2017/173054 및 "FORMULATIONS"라는 명칭으로 2019년 4월 4일자로 공개된 WO2019067992A1를 참조한다. 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 및 LNP 제형은 가이드를 단독으로 또는 cas 뉴클레이스 또는 cas 뉴클레이스를 암호화하는 핵산과 함께 전달하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, RNA 구성요소 및 지질 구성요소를 포함하는 LNP 조성물이 포함되되, 지질 구성요소는 아민 지질, 중성 지질, 보조 지질 및 스텔스 지질을 포함하고; N/P 비는 약 1 내지 10이다.
일부 예에서, 지질 구성요소는 지질 A 또는 이의 아세탈 유사체, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG-DMG를 포함하며; N/P 비는 약 1 내지 10이다. 일부 실시형태에서, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 PEG 지질을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시형태에서, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 PEG 지질을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 8이다. 일부 예에서, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질; 약 5 내지 15 몰-%의 DSPC; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 PEG 지질을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 8이다. 일부 예에서, 지질 구성요소는 48 내지 53 몰-%의 지질 A; 약 8 내지 10 몰-%의 DSPC; 및 1.5 내지 10 몰-%의 PEG 지질을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 3 내지 8±0.2이다.
일부 실시형태에서, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 9 몰-%의 중성 지질, 예컨대, DSPC; 약 3 몰-%의 PEG 지질과 같은 스텔스 지질, 예컨대, PEG2k-DMG을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 또는 이들로 구성되며, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질, 예컨대, 콜레스테롤이되, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다. 일부 실시형태에서, 아민 지질은 지질 A이다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다. 일부 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG 지질이다. 일부 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 실시형태에서, 보조 지질은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 지질 A; 약 9 몰-%의 DSPC; 약 3 몰-%의 PEG2k-DMG를 포함하며, 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이되, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 전신적으로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 간 순환으로 전달될 수 있다.
이러한 설명 및 예시적인 실시형태는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 양, 백분율 또는 비율을 나타내는 모든 숫자 및 기타 수치는 이미 그렇게 수정되지 않은 범위 내에서 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 표시되지 않는 한, 다음 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 얻고자 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도 청구범위의 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자 자릿수의 관점에서 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 및 임의의 단어의 단수 사용은 명시적이고 및 명백하게 제한되지 않는 한 하나의 지시 대상에 대해 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은 목록에 있는 항목의 인용이 열거된 항목에 대체되거나 또는 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않도록 비제한적인 것으로 의도된다.
실시예
다음 실시예는 소정의 개시된 실시형태를 예시하기 위해 제공되며, 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 물질 및 방법
뉴클레이스 mRNA의 시험관내 전사("IVT")
N1-메틸 슈도-U를 포함하는 캡핑되고 폴리아데닐화된 스트렙토코커스 피오게네스("Spy") Cas9 mRNA를 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성하였다. T7 프로모터, 서열번호 1, 2 또는 본 명세서에 개시된 또 다른 서열에 따른 전사를 위한 서열 및 90nt 내지 100nt의 폴리 (A/T) 영역을 포함하는 플라스미드 DNA를 다음의 조건을 사용하여 XbaI과 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 선형화하였다: 200 ng/㎕의 플라스미드, 2 U/㎕의 XbaI(NEB) 및 1× 반응 완충액. XbaI는 65℃에서 20분 동안 반응물을 가열함으로써 불활성화시켰다. 선형화된 플라스미드를 효소 및 완충액으로부터 정제하였다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응을 다음 조건을 사용하여 37℃에서 1.5시간 내지 4시간 동안 인큐베이션함으로써 수행하였다: 50 ng/㎕의 선형화된 플라스미드; GTP, ATP, CTP 및 N1-메틸 슈도-UTP(트라이링크(Trilink)) 각각 2mM 내지 5mM; 10mM 내지 25mM ARCA(트라이링크); 5 U/㎕의 T7 RNA 폴리머레이스(NEB); 1 U/㎕의 뮤린 RNase 저해제(NEB); 0.004 U/㎕의 무기 대장균 피로포스파테이스(NEB); 및 1× 반응 완충액. TURBO DNase(써모피셔(ThermoFisher))를 최종 농도가 0.01 U/㎕이 되도록 첨가하고, 반응물을 추가로 30분 동안 배양하여 DNA 주형을 제거하였다. Cas9 mRNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 MegaClear Transcription Clean-up 키트(써모피셔) 또는 RNeasy Maxi 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 정제하였다. 대안적으로, mRNA는 침전 프로토콜을 통해 정제되었으며, 일부 경우에는 HPLC-기반 정제가 뒤따른다. 간단히 말해서, DNase 분해 후, mRNA는 LiCl 침전, 암모늄 아세테이트 침전 및 소듐 아세테이트 침전을 사용하여 정제된다. HPLC 정제된 mRNA의 경우, LiCl 침전 및 재구성 후, mRNA는 RP-IP HPLC에 의해 정제된다(예를 들어, 문헌[Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142] 참조). 풀링을 위해 선택된 분획을 합하고, 위에 기재된 바와 같은 소듐 아세테이트/에탄올 침전에 의해 탈염하였다. 추가의 대안적인 방법에서, mRNA는 LiCl 침전 방법을 이용하여 정제되고, 이어서 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 추가로 정제된다. RNA 농도를 260㎚(나노드롭(Nanodrop))에서 빛 흡광도를 측정하여 결정하였고, 전사체를 BioanlayzeR(애질런트(Agilent))에 의한 모세관 전기영동으로 분석하였다.
서열번호 1 및 2가 RNA와 관련하여 하기에 언급될 때, T는 U(이는 위에 기재된 바와 같이 N1-메틸 슈도우리딘임)로 대체되어야 하는 것으로 이해된다. 실시예에서 사용된 Cas9 mRNA는 5' 캡 및, 예를 들어, 최대 100nt이며 서열번호로 식별되는 3' 폴리-A 꼬리를 포함한다.
사이노몰구스 원숭이 상동성 가이드 설계를 사용한 인간 TTR 가이드 설계 및 인간 TTR
관심 있는 영역에서 PAM을 확인하기 위해, 인간 참조 게놈(예를 들어, hg38) 및 관심 있는 사용자 정의된 게놈 영역(예를 들어, TTR 단백질 코딩 엑손)을 사용하여 초기 가이드 선별을 인실리코(in silico)로 수행하였다. 각각의 확인된 PAM에 대해, 분석을 수행하고, 통계를 보고하였다. gRNA 분자를 추가로 선택하고, 여러 기준(예를 들어, GC 함량, 예측된 표적 활성 및 잠재적인 표적외 활성)에 기초하여 순위를 매겼다.
총 68개의 가이드 RNA를 엑손 1, 2, 3 및 4 내의 단백질 코딩 영역을 표적화하는 TTR(ENSG00000118271)에 대해 설계하였다. 총 68개의 가이드 중, 33개가 사이노몰구스 원숭이("cyno")에서 100% 상동이었다. 또한, cyno에서 완벽하게 상동이 아닌 인간 TTR 가이드 중 10개에 대해, "대리(surrogate)" 가이드를 상응하는 cyno 표적 서열과 완벽하게 일치하도록 병렬로 설계 및 제작하였다. 이러한 "대리" 또는 "도구(tool)" 가이드는, 예를 들어, 상동 인간 가이드 서열의 활성 및 기능과 비슷하도록 cyno에서 스크리닝될 수 있다. 가이드 서열 및 상응하는 게놈 좌표가 제공되어 있다(표 1). 모든 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA로 제작하였고, 가이드 서열의 서브세트는 변형된 단일 가이드 RNA로 제작하였다(표 2). 이중 가이드 RNA(dgRNA) ID에 대한 가이드 ID 정렬, 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA) ID, cyno 게놈에 대한 미스매치의 수뿐만 아니라 cyno와 정확히 일치하는 ID가 제공된다(표 3). 실시예 전반에 걸쳐 상세히 설명된 실험에서 dgRNA가 사용되는 경우, 서열번호 270을 사용하였다.
하기 실시예에서 sgRNA는 포스포라미다이트를 사용하여 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성하였다.
시험관내 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA 전달
HEK293_Cas9 세포주. Spy Cas9를 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 선암종 세포주 HEK293("HEK293_Cas9")을 10% 소 태아 혈청 및 500 ㎍/㎖의 G418이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 형질감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에 10,000개 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(써모피셔, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. 세포를 개별 crRNA(25nM), trRNA(25nM), 리포펙타민 RNAiMAX(0.3 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 리포플렉스(lipoplex)로 형질감염시켰다.
HUH7 세포주. 인간 간세포 암종 세포주 HUH7(재패니즈 콜렉션 오브 리서치 바이오리소시스 셀 뱅크(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank), Cat. JCRB0403)을 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 형질감염 20시간 전에 96-웰 플레이트에 15,000개 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 MessengerMAX(써모피셔, Cat. LMRNA003)로 형질감염시켰다. 세포를 순차적으로 Spy Cas9 mRNA(100ng), MessengerMAX(0.3 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 리포플렉스로 형질감염시킨 후, 개별 crRNA(25nM), tracer RNA(25nM), MessengerMAX(0.3 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 별도의 리포플렉스로 형질감염시켰다.
HepG2 세포주. 인간 간세포 암종 세포주 HepG2(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), Cat. HB-8065)를 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 계수하고, 형질감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에서 10,000개 세포/웰의 밀도로 Bio-coat collagen I이 코팅된 96-웰 플레이트(써모피셔, Cat. 877272) 상에 평판배양하였다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(써모피셔, Cat. 11668019)으로 형질감염시켰다. 세포를 순차적으로 Spy Cas9 mRNA(100 ng), 리포펙타민 2000(0.2 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 리포플렉스로 형질감염시킨 후, 개별 crRNA(25nM), tracer RNA(25nM), 리포펙타민 2000(0.2 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 별도의 리포플렉스로 형질감염시켰다.
일차 간 간세포. 일차 인간 간 간세포(PHH) 및 일차 사이노몰구스 간 간세포(PCH)(깁코(Gibco))를 제조업체의 프로토콜(인비트로젠(Invitrogen), 프로토콜 11.28.2012)에 따라 배양하였다. 간단히 말해서, 세포를 해동하고, 보충제가 포함된 간세포 해동 배지(깁코, Cat. CM7000)에 재현탁시킨 후, 인간의 경우 100g에서 10분 및 cyno의 경우 80g에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠릿화된 세포를 간세포 평판배양 배지와 보충 팩(인비트로젠, Cat. A1217601 및 CM3000)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 인간의 경우 33,000 세포/웰의 밀도 또는 cyno의 경우 60,000 세포/웰의 밀도(또는 TTR 단백질에 대한 효과를 검정할 때 65,000개 세포/웰, 아래에 추가로 기재됨)로 Bio-coat collagen I 코팅된 96-웰 플레이트(써모피셔, Cat. 877272) 상에 평판배양하였다. 평판배양된 세포를 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 조직 배양 인큐베이터에서 6시간 또는 24시간 동안 정착 및 부착되도록 하였다. 인큐베이션 후, 세포를 단층 형성에 대해 확인하고, 배지를 무혈청 보충 팩이 포함된 간세포 배양 배지(인비트로젠, Cat. A1217601 및 CM4000)로 교체하였다.
리포펙타민 RNAiMaX(써모피셔, Cat. 13778150) 기반 형질감염을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 세포를 순차적으로 Spy Cas9 mRNA(100 ng), 리포펙타민 RNAiMaX(0.4 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 리포플렉스로 형질감염시킨 후, crRNA(25nM) 및 tracer RNA(25nM) 또는 sgRNA(25nM), 리포펙타민 RNAiMaX(0.4 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 별도의 리포플렉스로 형질감염시켰다.
세포에 가이드 RNA(RNP)가 로딩된 Spy Cas9 단백질의 전기천공 또는 형질감염 전에 리보뉴클레오타이드 형성을 수행하였다. 이중 가이드(dgRNA)의 경우, 개별 crRNA 및 trRNA를 동일한 양의 시약을 혼합하고, 95℃에서 2분 동안 인큐베이션하고, 실온으로 냉각하여 사전 어닐링하였다. 단일 가이드(sgRNA)를 95℃에서 2분 동안 끓이고, 실온으로 냉각하였다. 끓인 dgRNA 또는 sgRNA를 Optimem 중 Spy Cas9 단백질과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성하였다.
일차 인간 및 cyno 간세포로의 RNP 전기천공을 위해, 세포를 해동하고, 인간 간세포의 경우 ㎕당 2500개 세포 및 cyno 간세포의 경우 ㎕당 3500개 세포의 농도로 Lonza 전기천공 일차 세포 P3 완충액에 재현탁시켰다. 20㎕ 부피의 재현탁된 세포 및 5㎕의 RNP를 가이드당 함께 혼합하였다. 20㎕의 혼합물을 Lonza 전기천공 플레이트에 넣었다. 세포 미리 정해진 프로토콜 EX-147과 함께 Lonza 뉴클레오펙터를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포를 예열된 유지 배지를 포함하는 Biocoat 플레이트로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2의 조직 배양 인큐베이터에 넣었다.
RNP 리포플렉스 형질감염을 위해, 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine RNAiMAX(써모피셔, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. 세포를 Spy Cas9 (10nM), 개별 가이드(10nM), tracer RNA(10nM), 리포펙타민 RNAiMAX(1.0 ㎕/웰) 및 OptiMem을 포함하는 RNP로 형질감염시켰다. 위에 기재된 바와 같이 RNP 형성을 수행하였다.
LNP는 제조업체의 프로토콜에 따라 Precision Nanosystems NanoAssemblr™　Benchtop 기기를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 형성하였다.
LNP 제형 - NanoAssemblr
일반적으로, 지질 나노입자 구성요소를 다양한 몰비의 지질 구성요소와 함께 100% 에탄올에 용해시켰다. RNA 카고를 25mM 시트레이트, 100mM NaCl(pH 5.0)에 용해시켜, RNA 카고의 농도가 대략 0.45 ㎎/mℓ이 되도록 하였다. LNP를 약 4.5 또는 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비로 제형화하였으며, mRNA 대 gRNA의 비는 중량 기준으로 1:1이었다.
제조업체의 프로토콜에 따라 Nanosystems NanoAssemblr™　Benchtop 기기를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 LNP를 형성하였다. 수성 대 유기 용매의 2:1의 비를 차등 유속(differential flow rate)을 사용하는 혼합 동안 유지하였다. 혼합 후, LNP를 수집하고, 물에 희석하고(대략 1:1 v/v), 실온에서 1시간 동안 유지하고, 최종 완충액 교환 전에 물(대략 1:1 v/v)로 추가 희석하였다. 50mM Tris, 45mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스(pH 7.5)(TSS)로의 최종 완충액 교환은 PD-10 탈염 칼럼(GE)으로 완료하였다. 필요한 경우, 제형을 Amicon 100kDa 원심분리 필터(밀리포어)로 원심분리하여 농축하였다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 0.2㎛ 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP를 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
LNP 제형 - 교차 흐름
교차 흐름 기법을 사용하여 제조된 LNP의 경우, 2 부피의 RNA 용액과 1 부피의 물과 함께 에탄올 중 지질의 충돌 제트 혼합(impinging jet mixing)에 의해 LNP를 형성하였다. 에탄올 중 지질을 2 부피의 RNA 용액과 교차 혼합을 통해 혼합하였다. 네 번째 물의 스트림은 인라인 티(inline tee)를 관통하는 출구 스트림과 혼합하였다. (WO2016010840, 도 2 참조). LNP를 실온에서 1시간 동안 유지하고, 물(대략 1:1 v/v)로 추가로 희석하였다. 희석된 LNP를 평판 카트리지(싸토리우스(Sartorius), 100kD MWCO)에서 접선 유동 여과를 사용하여 농축시킨 다음, 정용여과에 의해 완충액을 50mM Tris, 45mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스, pH 7.5(TSS)로 교환하였다. 대안적으로, TSS로의 최종 완충액 교환은 PD-10 탈염 칼럼(GE)으로 완료하였다. 필요한 경우, 제형을 Amicon 100kDa 원심분리 필터(밀리포어(Millipore))로 원심분리하여 농축시켰다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 0.2㎛ 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP를 추가로 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관하였다.
제형 분석
동적 광 산란("DLS")을 사용하여 본 개시내용의 LNP의 다분산 지수("pdi(polydispersity index)") 및 크기를 특성화하였다. DLS는 샘플을 광원에 노출시켜 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 PDI는 PDI가 0인 완벽하게 균일한 집단과 함께 집단에서의 입자 크기 분포(대략 평균 입자 크기)를 나타낸다. 평균 입자 크기 및 다분산을 MalveRNA Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정하였다. LNP 샘플을 PBS에 30×로 희석한 후, DLS에 의해 측정하였다. 평균 입자 크기의 강도 기반 측정인 Z-평균 직경은 수 평균 직경 및 pdi와 함께 보고하였다. MalveRNA Zetasizer 기기를 또한 사용하여 LNP의 제타 전위를 측정하였다. 샘플을 측정 전에 0.1× PBS(pH 7.4)에 1:17로(50㎕를 800㎕로) 희석하였다.
전기영동 광 산란(Electrophoretic light scattering)을 사용하여 특정 pH에서 LNP의 표면 전하를 특성화하였다. 표면 전하 또는 제타 전위는 LNP 현탁액에서 입자 사이의 정전기적 반발/끌어당김의 크기를 측정한 것이다.
비대칭-유동 장 유동 분별(Asymmetric-Flow Field Flow Fractionation) - 다중 각도 광 산란(multi-angle light scattering)(AF4-MALS)을 사용하여 유체역학적 반경으로 조성물의 입자를 분리한 다음, 분별된 입자의 분자량, 유체역학적 반경 및 제곱 평균 제곱근(root mean square) 반경을 측정하였다. 이는 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 버차드-스톡마이어 플롯(Burchard-Stockmeyer plot)(입자의 내부 코어 밀도를 나타내는 시간 경과에 따른 유체역학적 반경에 대한 제곱 평균 제곱근("rms") 반경의 비) 및 rms 형태 플롯(생성된 선형 맞춤의 기울기가 압축성(compactness) 대 연신(elongation)의 정도를 제공하는 rms 반경의 로그 대 분자량의 로그)과 같은 2차 특성을 평가할 수 있다.
나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis: NTA, 말번 나노사이트(MalveRNA Nanosight))을 사용하여 입자 크기 분포뿐만 아니라 입자 농도를 결정할 수 있다. LNP 샘플을 적절하게 희석하고, 현미경 슬라이드 위에 주입하였다. 입자가 시야를 통해 천천히 주입됨에 따라 카메라가 산란된 빛을 기록하였다. 동영상이 캡처된 후, 나노입자 추적 분석은 픽셀을 추적하고 확산 계수를 계산하여 동영상을 처리한다. 이 확산 계수는 입자의 유체역학적 반경으로 번역될 수 있다. 기기는 또한 분석에서 계산된 개별 입자의 수를 계산하여 입자 농도를 제공한다.
극저온-전자 현미경("cryo-EM")을 사용하여 LNP의 입자 크기, 형태 및 구조적 특성을 결정할 수 있다.
LNP의 지질 조성 분석은 액체 크로마토그래피에 이어 하전된 에어로졸 검출(LC-CAD)로부터 결정될 수 있다. 이 분석은 실제 지질 함량 대 이론적 지질 함량의 비교를 제공할 수 있다.
LNP 조성물을 평균 입자 크기, 다분산 지수(pdi), 총 RNA 함량, RNA의 캡슐화 효율 및 제타 전위에 대해 분석하였다. LNP 조성물은 지질 분석, AF4-MALS, NTA 및/또는 cryo-EM에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 평균 입자 크기 및 다분산을 MalveRNA Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정하였다. LNP 샘플을 PBS 완충액으로 희석한 후, DLS에 의해 측정하였다. 평균 입자 크기의 강도-기반 측정인 Z-평균 직경은 수 평균 직경 및 pdi와 함께 보고하였다. MalveRNA Zetasizer 기기를 또한 사용하여 LNP의 제타 전위를 측정하였다. 샘플을 측정 전에 0.1×PBS(pH 7.4)에 1:17(50㎕에서 800㎕로)로 희석하였다.
형광-기반 검정(Ribogreen®, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 총 RNA 농도 및 유리 RNA를 결정하였다. LNP 샘플을 0.2% Triton-X 100을 함유하는 1×TE 완충액으로 적절하게 희석하여 총 RNA를 결정하거나 또는 1×TE 완충액을 사용하여 유리 RNA를 결정하였다. 표준 곡선은 조성물을 만들고 1×TE 완충액 +/- 0.2% Triton-X 100에 희석하는데 사용된 시작 RNA 용액을 사용하여 준비하였다. 그런 다음, 희석된 Ribogreen® 염료(제조업체의 지침에 따름)를 각각의 표준물질 및 샘플에 첨가하고, 빛이 없는 상태에서 실온에서 대략 10분 동안 인큐베이션하였다. 여기, 오토 컷오프(auto cutoff) 및 방출 파장 세트가 각각 488㎚, 515㎚ 및 525㎚인 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기(몰리큘러 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 샘플을 판독하였다. 총 RNA 및 유리 RNA는 적절한 표준 곡선으로부터 결정하였다.
캡슐화 효율은 (총 RNA-유리 RNA)/총 RNA로 계산하였다. 동일한 절차를 사용하여 DNA-기반 카고 구성요소의 캡슐화 효율을 결정하였다. 형광-기반 검정에서, 단일-가닥 DNA의 경우 Oligreen 염료를 사용할 수 있으며, 이중-가닥 DNA의 경우, Picogreen 염료를 사용할 수 있다. 대안적으로, 총 RNA 농도는 역-상 이온-페어링(reverse-phase ion-pairing: RP-IP) HPLC 방법에 의해 결정될 수 있다. Triton X-100을 사용하여 LNP를 파괴하고, RNA를 방출시켰다. 그런 다음, RNA를 RP-IP HPLC에 의해 크로마토그래피로 지질 구성요소로부터 분리하고, 260㎚에서 UV 흡광도를 사용하여 표준 곡선에 대해 정량화하였다.
AF4-MALS를 사용하여 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 이러한 계산의 2차 통계를 확인하였다. LNP를 적절하게 희석하고, 초점이 맞춰진 HPLC 오토샘플러를 사용하여 AF4 분리 채널로 주입한 다음, 채널을 가로지르는 교차 흐름의 지수 구배로 용리시켰다. 모든 유체는 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse 기기에 의해 구동하였다. AF4 채널로부터 용리되는 입자는 UV 검출기, 다중-각도 광 산란 검출기, 준-탄성 광 산란 검출기(quasi-elastic light scattering detector) 및 시차 굴절률 지수 검출기(differential refractive index detector)를 통해 흐른다. 원시 데이터를 Debeye 모델을 사용하여 처리하여 검출기 신호로부터 분자량과 rms 반경을 결정하였다.
LNP의 지질 구성요소를 하전된 에어로졸 검출기(CAD)에 결합된 HPLC에 의해 정량적으로 분석하였다. 4가지 지질 구성요소의 크로마토그래피 분리는 역상 HPLC에 의해 달성하였다. CAD는 모든 비-휘발성 화합물을 검출하는 파괴적인 질량-기반 검출기이고, 신호는 분석물 구조에 관계없이 일관된다.
전형적으로, LNP를 제조할 때, 캡슐화는 80% 초과였고, 입자 크기는 120㎚ 미만이었으며, pdi는 0.2 미만이었다.
생체내 LNP 전달
달리 언급하지 않는 한, 6주 내지 10주령의 CD-1 암컷 마우스를 각 연구에 사용하였다. 그룹 평균 체중을 기준으로 투여 용액을 제조하기 위해 체중에 따라 그룹화하였다. LNP를 동물당 0.2㎖의 부피(체중 킬로그램당 대략 10㎖)로 측면 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 동물을 부작용에 대해 투여 후 대략 6시간째에 관찰하였다. 투여 후 24시간에 체중을 측정하고, 동물을 동물을 아이소플루레인 마취하에 심장 천자를 통한 방혈(exsanguination)에 의해 다양한 시점에서 안락사시켰다. 혈액을 혈청 분리기 튜브 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈장용 완충된 소듐 시트레이트를 함유하는 튜브에 수집하였다. 생체내 편집과 관련된 연구를 위해, DNA 추출 및 분석을 위해 각 동물의 중앙 엽 또는 3개의 독립된 엽(예를 들어, 우측의 중앙 엽, 좌측의 엽 및 좌측 측면의 엽)으로부터 간 조직을 전형적으로 수집하였다.
동물 연구에서 사용되는 트랜스티레틴(TTR) ELISA 분석
혈액을 수집하고, 표시된 바와 같이 혈청을 단리하였다. 각각 제조업체의 프로토콜에 따라, 총 마우스 TTR 혈청 수준을 마우스 프레알부민(트랜스티레틴) ELISA 키트(아비바 시스템즈 바이올로지(Aviva Systems Biology), Cat. OKIA00111)를 사용하여 결정하고; 래트 TTR 혈청 수준을 래트 특이적 ELISA 키트(아비바 시스템즈 바이올로지 카탈로그 번호 OKIA00159)를 사용하여 측정하고; 인간 TTR 혈청 수준을 인간 특이적 ELISA 키트(아비바 시스템즈 바이올로지 카탈로그 번호 OKIA00081)를 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 마우스 혈청에서 인간 TTR을 측정할 때, 혈청은 10,000-배 또는 5,000-배의 최종 희석까지 키트 샘플 희석액으로 연속 희석하였다. 준비된 표준 곡선 또는 희석된 혈청 샘플 100㎕를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 제공된 세척액으로 3회 세척하였다. 그런 다음, 100㎕의 검출 항체를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 다음 3회 세척하였다. 100㎕의 기질을 첨가한 다음 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 100㎕의 정지액을 첨가하였다. 내용물의 흡광도를 SoftmaxPro 버전 7.0 소프트웨어를 사용한 분석과 함께 Spectramax M5 플레이트 판독기 상에서 측정하였다. 혈청 TTR 수준은 4개의 매개변수 로지스틱 피트(parameter logistic fit)를 사용하여 표준 곡선에서 정량화하고, ㎍/mℓ의 혈청 또는 넉다운 상대 대조군(비히클 처리) 동물 퍼센트로 나타내었다.
게놈 DNA 단리
형질감염된 세포를 형질감염 후 24시간, 48시간 또는 72시간에 수확하였다. 제조사의 프로토콜에 따라서 50 ㎕/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액(에피센터(Epicentre), 카탈로그 번호 QE09050)을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 모든 DNA 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 거쳤다.
차세대 시퀀싱("NGS") 분석
게놈의 표적 위치에서의 편집의 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 시퀀싱을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
프라이머를 관심 있는 유전자 내에 있는 표적 부위(예를 들어, TTR) 주위에 설계하고, 관심 있는 게놈 영역을 증폭시켰다.
시퀀싱을 위한 화학물질을 추가하기 위해 제조사의 프로토콜(일루미나(Illumina))에 따라 추가적인 PCR을 수행하였다. Illumina MiSeq 기기 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 판독물을 낮은 품질 점수를 갖는 것들을 제거한 후 참조 게놈(예를 들어, 인간 참조 게놈(hg38), 사이노몰구스 참조 게놈(mf5), 래트 참조 게놈(rn6) 또는 마우스 참조 게놈(mm10))에 대해 정렬하였다. 판독물을 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)에 대해 맵핑하였으며, 여기에서 관심 있는 표적 영역과 중첩되는 판독물을 선택하고, 야생형 판독물의 수 대 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 판독물의 수를 계산하였다.
편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 퍼센트" 또는 "indel 빈도")은 야생형을 포함한 총 서열 판독물의 수에 대한 삽입/결실("indel") 또는 치환이 있는 총 서열 판독물의 수로서 정의된다.
웨스턴 블롯에 의한 분비된 트랜스티레틴("TTR") 단백질의 분석
배지에 분비된 TTR의 수준 단백질을 웨스턴 블로팅 방법을 사용하여 결정하였다. HepG2 세포를 이전에 표 1로부터 선택된 가이드로 이전에 기술된 바와 같이 형질감염시켰다. 배지 변경은 형질감염 후 3일마다 수행하였다. 형질감염 후 제6일에, 배지를 제거하고, 세포를 소 태아 혈청(FBS)을 함유하고 있지 않은 배지로 1회 세척하였다. 혈청이 없는 배지를 세포에 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 임의의 찌거기를 원심분리하여 펠릿화하고; 각 웰에 대한 세포 수를 나머지 세포에 대한 CTG 검정으로부터 얻은 값과 플레이트 평균과의 비교에 기초하여 추정하였다. 원심분리 후, 배지를 새로운 플레이트로 옮기고, -20℃에 보관하였다. 배지의 아세톤 침전을 수행하여 배지에 분비된 임의의 단백질을 침전시켰다. 4 부피의 얼음 냉각된 아세톤을 1 부피의 배지에 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, -20℃에서 90분 동안 유지하였다. 아세톤:배지 혼합물을 15,000xg 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 잔류 펠릿을 공기 건조시켜 임의의 잔류 아세톤을 제거하였다. 펠릿을 15㎕의 RIPA 완충액(보스톤 바이오 프로덕츠(Boston Bio Products), Cat. BP-115)과 완전 프로테이스 저해 칵테일(시그마(Sigma), Cat. 11697498001) 및 1mM DTT로 구성된 새로 첨가된 프로테이스 저해 혼합물에 재현탁시켰다. 용해물을 Laemmli 완충액과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 변성시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 12% Bis-Tris 겔(써모피셔)에서 NuPage 시스템을 사용하여 웨스턴 블롯을 실행한 다음, 0.45㎛의 나이트로셀룰로스 막(바이오-래드(Bio-Rad), Cat. 1620115)으로 옮겼다. 실온의 실험실 로커에서 30분 동안 TBS 중 5% 분유(분유)를 사용하여 블롯을 차단하였다. 블롯을 TBST로 헹구고, TBST 중 1:1000의 토끼 α-TTR 단일클론 항체(압캠(Abcam), Cat. Ab75815)로 프로빙하였다. TBST 중 1:1000의 알파-1 항트립신을 로딩 대조군(시그마, Cat. HPA001292)으로 사용하고, TTR 일차 항체와 함께 동시에 인큐베이션하였다. 블롯을 백에 밀봉하고, 실험실 로커에서 4℃에서 밤새 유지하였다. 인큐베이션 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 헹구고, TBST 중 1:25,000의 토끼(써모피셔, Cat. PISA535571)에 대한 2차 항체로 실온에서 30분 동안 프로빙하였다. 인큐베이션 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 헹구고, PBS로 2회 헹구었다. Licor Odyssey 시스템을 사용하여 블롯을 시각화하고 분석하였다.
웨스턴 블롯에 의한 세포내 TTR의 분석
간세포 암종 세포주 HUH7을 표 1로부터 선택된 가이드로 이전에 기술한 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 후 제6일에, 배지를 제거하고, 세포를 50 ㎕/웰 RIPA 완충액(보스톤 바이오 프로덕츠, Cat. BP-115)과 완전 프로테이스 저해 칵테일(시그마, Cat. 11697498001), 1mM DTT 및 250 U/㎖ 벤조네이스(이엠디 밀리포어(EMD Millipore), Cat. 71206-3)로 구성된 새로 첨가된 프로테이스 저해 혼합물로 용해시켰다. 세포를 30분 동안 얼음 위에 유지하고, 이 시간에 NaCl(1M 최종 농도)을 첨가하였다. 세포 용해물을 완전히 혼합하고, 얼음 위에서 30분 동안 유지하였다. 전체 세포 추출물("WCE(whole cell extract)")을 PCR 플레이트로 옮기고, 원심분리하여 찌꺼기를 펠릿화하였다. Bradford 검정(바이오-래드, Cat. 500-0001)을 사용하여 용해물의 단백질 함량을 평가하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Bradford 검정 절차를 완료하였다. 추출물은 사용하기 전 영하 20℃에 보관하였다. 웨스턴 블롯을 수행하여 세포내 TTR 단백질 수준을 평가하였다. 용해물을 Laemmli 완충액과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 변성시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 12% Bis-Tris 겔(써모피셔)에서 NuPage 시스템을 사용하여 웨스턴 블롯을 실행한 후, 0.45㎛의 나이트로셀룰로스 막(바이오-래드, Cat. 1620115)으로 습식 전사(wet transfer)하였다. 전사 후, 막을 물로 완전히 헹구고, Ponceau S 용액(보스톤 바이오 프로덕츠, Cat. ST-180)으로 염색하여 완전하고 균일한 전사를 확인하였다. 블롯을 실온의 실험실 록커에서 30분 동안 TBS 중 5% 분유를 사용하여 차단하였다. 블롯을 TBST로 헹구고, TBST 중 1:1000의 토끼 α-TTR 단일클론 항체(압캠, Cat. Ab75815)로 프로빙하였다. TBST 중 1:2500의 β-액틴을 로딩 대조군(써모피셔, Cat. AM4302)으로 사용하고, TTR 일차 항체와 함께 동시에 인큐베이션하였다. 블롯을 백에 밀봉하고, 실험실 록커에서 4℃에서 밤새 유지하였다. 인큐베이션 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 헹구고, TBST 중 각각 1:25,000의 마우스 및 토끼(써모피셔, Cat. PI35518 및 PISA535571)에 대한 2차 항체로 실온에서 30분 동안 프로빙하였다. 인큐베이션 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 헹구고, PBS로 2회 헹구었다. Licor Odyssey 시스템을 사용하여 블롯을 시각화하고 분석하였다.
실시예 2. dgRNA 서열의 스크리닝
여러 세포 유형에서 TTR dgRNA의 교차 스크리닝
인간 TTR 및 사이노몰구스 매칭된 서열을 표적화하는 dgRNA 형식의 가이드는 실시예 1에 기재된 바와 같이 HEK293_Cas9, HUH7 및 HepG2 세포주뿐만 아니라 일차 인간 간세포 및 일차 사이노몰구스 원숭이 간세포에 전달되었다. 각 세포 유형에 걸쳐 각 가이드 서열을 포함하는 crRNA에 대해 편집 퍼센트를 결정한 다음, 가이드 서열을 최고 편집%를 기준으로 순위를 매겼다. 5개의 세포주에서의 표 1의 가이드 서열에 대한 스크리닝 데이터는 아래에 열거되어 있다(표 4 내지 표 11).
표 6은 Spy Cas9 단백질을 구성적으로 과발현하는 인간 신장 선암종 세포주인 HEK293_Cas9에서 TTR crRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
표 7은 인간 간세포 암종 세포주인 HUH7에서 Spy Cas9 mRNA(서열번호 2)로 공동-형질감염된 테스트된 TTR crRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00032
Figure pct00033
표 8은 인간 간세포 암종 세포주인 HepG2에서 Spy Cas9 mRNA(서열번호 2)로 공동-형질감염된 테스트된 TTR 및 대조군 crRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
표 9는 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 전기천공된 테스트된 TTR dgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
표 10은 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 형질감염된 테스트된 TTR 및 대조군 dgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
표 11은 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 mRNA(서열번호 2)로 공동-형질감염된 테스트된 TTR 및 대조군 dgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
표 12는 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 전기천공된 테스트된 TTR dgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00046
Figure pct00047
표 13은 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 전기천공된 테스트된 cyno 특이적 TTR dgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00048
실시예 3. sgRNA 서열의 스크리닝
여러 세포 유형에서 TTR sgRNA의 교차 스크리닝
인간 및/또는 cyno TTR을 표적화하는 변형된 sgRNA 형식의 가이드는 실시예 1에 기재된 바와 같이 일차 인간 간세포 및 일차 cyno 간세포를 전달하였다. 각 세포 유형에 걸쳐 각 가이드 서열을 포함하는 crRNA에 대해 편집 퍼센트를 결정한 다음, 가이드 서열을 최고 편집%를 기준으로 순위를 매겼다. 두 세포주에서의 표 2의 가이드 서열에 대한 스크리닝 데이터는 아래에 열거되어 있다(표 14 내지 표 16).
표 14는 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 형질감염된 테스트된 TTR sgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00049
표 15는 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 mRNA(서열번호 2)로 공동-형질감염된 테스트된 TTR sgRNA에 대한 12.5nM에서의 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00050
표 16은 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 전기천공된 테스트된 TTR sgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다. 가이드 G000480 및 G000488에는 cyno에 대한 하나의 미스매치가 있어, cyno 세포에서 편집 효율이 저하될 수 있음에 유의한다.
Figure pct00051
표 17은 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 단백질(RNP)로 전기천공된 테스트된 cyno 특이적 TTR sgRNA에 대한 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다.
Figure pct00052
실시예 4. Spy Ca9 mRNA 및 sgRNA를 함유하는 지질 나노입자(LNP) 제형의 스크리닝
일차 인간 간세포 및 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 mRNA와 함께 LNP로 제형화된 TTR sgRNA의 교차 스크리닝.
인간 TTR 및 cyno 매칭된 sgRNA 서열을 표적화하는 변형된 sgRNA의 지질 나노입자 제형을 용량 반응 곡선에서 일차 인간 간세포 및 일차 cyno 간세포에 대해 테스트하였다. 일차 인간 및 cyno 간세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 평판배양하였다. 두 세포주를 모두 LNP로 처리하기 전에 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 표 18 내지 표 21에 설명된 실험에 사용된 LNP는 각각 지질을 갖는 특정 sgRNA 및 Cas9 mRNA(서열번호 2)를 포함하는 Nanoassemblr™ 절차를 사용하여 제조하였다. LNP는 각각 45:44:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하고, 4.5의 N:P 비를 갖는다. 6% cyno 혈청을 포함하는 간세포 유지 배지에서 LNP를 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, LNP를 100ng의 mRNA에서 시작하여 8 포인트 2-배 용량 반응 곡선으로 일차 인간 또는 cyno 간세포에 첨가하였다. 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 처리 72시간 후에 용해시켰다. 각 세포 유형에 걸쳐 각 가이드 서열을 포함하는 crRNA에 대해 편집 퍼센트를 결정한 다음, 가이드 서열을 12.5ng의 mRNA 투입(input) 및 3.9nM의 가이드 농도에서의 최고 편집%를 기준으로 순위를 매겼다. 두 세포주에서 가이드 서열에 대한 용량 반응 곡선 데이터는 도 4 내지 도 7에 나타나 있다. 12.5ng mRNA 투입 및 3.9nM의 가이드 농도에서의 편집%는 아래에 열거되어 있다(표 16 내지 표 18).
표 18은 용량 반응 곡선으로서 일차 인간 간세포에서 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 TTR sgRNA에 대한 12.5ng의 cas9 mRNA에서의 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다. G000570은 실험의 인공 산물일 수 있는 다른 sgRNA와 비교하여 비특징적인(uncharacteristic) 용량 반응 곡선을 나타내었다. 데이터는 도 4에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00053
표 19는 용량 반응 곡선으로서 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 TTR sgRNA에 대한 12.5ng의 mNRA 및 3.9nM의 가이드 농도에서의 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 도 5에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00054
표 20은 용량 반응 곡선으로서 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 cyno 특이적 TTR sgRNA에 대한 12.5ng의 mRNA 및 3.9nM의 가이드 농도에서의 편집%, 삽입%(In) 및 결실%(Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 보여준다. 데이터는 도 6에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00055
일차 인간 간세포 및 일차 cyno 간세포에서 Spy Cas9 mRNA와 함께 LNP로 제형화된 TTR sgRNA의 교차 스크리닝
지질 나노입자 제형을 용량 반응 곡선에서 일차 인간 간세포 및 일차 cyno 간세포 에 대해 테스트하였다. 일차 인간 및 cyno 간세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 평판배양하였다. 두 세포주를 LNP로 처리하기 전에 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 표 20 내지 표 22에 설명된 실험에서 사용된 LNP는 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 준비하였지만, PD-10 칼럼(지이 헬스케서 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))를 사용하여 정제하고, Amicon 원심분리 필터 유닛(밀리포어 시그마)을 사용하여 농축하였으며, 각각은 특정 sgRNA 및 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 포함하였다. LNP는 각각 50:38:9:3의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 포함하고, 6.0의 N:P 비를 갖는다. LNP를 6% cyno 혈청을 포함하는 간세포 유지 배지에서 37℃, 5% CO2에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, LNP를 300ng의 mRNA에서 시작하여 8 포인트 3-배 용량 반응 곡선으로 일차 인간 또는 cyno 간세포에 LNP를 첨가하였다. 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 처리 72시간 후에 용해시켰다. 각 세포 유형에 걸쳐 각 가이드 서열을 포함하는 crRNA에 대해 편집 퍼센트를 결정한 다음, 가이드 서열을 EC50 값 및 최대 편집 퍼센트를 기준으로 순위를 매겼다. 두 세포주에서 가이드 서열에 대한 용량 반응 곡선 데이터는 도 4 내지 도 7에 나타나 있다. EC 50 값 및 최대 편집 퍼센트 아래에 열거되어 있다(표 19 내지 표 22).
표 21은 용량 반응 곡선으로서 일차 인간 간세포에서 U-고갈된 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 인간 특이적 TTR sgRNA의 EC50 및 최대 편집을 보여준다. 데이터는 도 4에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00056
Figure pct00057
표 22는 용량 반응 곡선으로서 일차 cyno 간세포에서 U-고갈된 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 인간 특이적 TTR sgRNA의 EC50 및 최대 편집을 보여준다. 데이터는 도 16에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00058
표 23은 용량 반응 곡선으로서 일차 인간 간세포에서 U-고갈된 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 cyno 매칭된 TTR sgRNA의 EC50 및 최대 편집을 보여준다. 데이터는 도 17에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00059
표 24는 용량 반응 곡선으로서 일차 cyno 간세포에서 U-고갈된 Spy Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자로 제형화된 테스트된 cyno 매칭된 TTR sgRNA의 EC50 및 최대 편집을 보여준다. 데이터는 도 18에 그래프로 나타나 있다.
Figure pct00060
실시예 5. TTR dgRNA 및 sgRNA의 표적외 분석
TTR 가이드의 표적외 분석
올리고 삽입 기반 검정(예를 들어, 문헌[Tsai et al., Nature Biotechnology 33, 187-197; 2015] 참조)을 사용하여 TTR을 표적화하는 Cas9에 의해 절단된 잠재적인 표적외 게놈 부위를 결정하였다. HEK293_Cas9 세포에서 표 1로부터의 45개의 dgRNA(및 공지의 표적외 프로파일을 갖는 2개의 대조군 가이드)를 선별하였다. Spy Cas9를 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 선암종 세포주 HEK293("HEK293_Cas9")을 10% 소 태아 혈청 및 500 ㎍/㎖의 G418이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 형질감염 24시간 전에 30,000개 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(써모피셔, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. 세포를 개별 crRNA(15nM), trRNA(15nM), 리포펙타민 RNAiMAX(0.3 ㎕/웰)와 OptiMem을 포함하는 공여체 올리고(10nM)를 포함하는 리포플렉스로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 24시간 후 용해시키고, 게놈 DNA를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Zymo's Quick gDNA 96 추출 키트(카탈로그 # D3012)를 사용하여 추출하였다. gDNA를 Qubit High Sensitivity dsDNA 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 정량화하였다. 문헌[Tsai et al, 2015]에서 이전에 기술된 방법에 따라 약간 수정하여 라이브러리를 준비하였다. Illumina의 MiSeq 및 HiSeq 2500에서 시퀀싱을 수행하였다. 검정은 도 2에 플로팅된 일부 crRNAd에 대한 잠재적인 표적외 부위를 확인하였다.
표 25는 이중 가닥 DNA 올리고 공여체 서열과 함께 TTR dgRNA로 형질감염된 HekCas9 세포에서 검출된 표적외 통합 부위의 수를 보여준다.
Figure pct00061
Figure pct00062
추가적으로, 가이드의 서브세트를 위에 기재된 올리고 기반 삽입 방법을 통해 Hek_Cas9 세포에서 변형된 sgRNA로서 표적외 잠재력에 대해 평가하였다. 표적외 결과는 도 4에 플로팅하였다.
표 26은 이중 가닥 DNA 올리고 공여체 서열과 함께 TTR sgRNA로 형질감염된 HekCas9 세포에서 검출된 표적외 통합 부위의 수를 보여준다.
Figure pct00063
실시예 6. 잠재적인 표적외 부위를 검증하기 위한 표적화된 시퀀싱
Cas9를 구성적으로 과발현하는 잠재적인 표적외 표적을 검출하기 위해 실시예 5에서 사용된 HEK293_Cas9 세포는 다양한 세포 유형에서 일시적 전달 패러다임과 비교하여 더 많은 수의 잠재적인 표적외 "히트(hit)"를 초래한다. 또한, sgRNA를 전달할 때(dgRNA와는 반대임), dgRNA(특히 화학적으로 변형된 경우)보다 더 안정적이기 때문에 잠재적인 표적외 히트의 수가 더 늘어날 수 있다. 따라서, 실시예 5에서 사용된 올리고 삽입 방법에 의해 확인된 잠재적인 표적외 부위는 확인된 잠재적인 표적외 부위의 표적화된 시퀀싱을 사용하여 검증될 수 있다.
한 접근법에서, 일차 간세포는 Cas9 mRNA 및 관심 있는 sgRNA(예를 들어, 평가를 위한 잠재적인 표적외 부위를 갖는 sgRNA)를 포함하는 LNP로 처리된다. 그런 다음, 일차 간세포가 용해되고, 잠재적인 표적외 부위(들)의 측면에 있는 프라이머를 사용하여 NGS 분석을 위한 앰플리콘이 생성된다. 소정의 수준의 indel의 확인은 잠재적인 표적외 부위를 검증할 수 있는 반면, 잠재적인 표적외 부위에서 발견된 indel의 결여는 HEK293_Cas9 세포 검정에서 위양성을 나타낼 수 있다.
실시예 7. 표현형 분석
분비된 TTR의 웨스턴 블롯 분석
간세포 암종 세포주 HepG2를 표 1로부터의 선택된 가이드로 삼중으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 후 제2일에, 하나의 복제물을 게놈 DNA 및 편집 효율을 위한 NGS 시퀀싱에 의한 분석을 위해 수확하였다. 형질감염 후 제5일에, 하나의 복제물에 대해 혈청이 없는 배지를 교체하였다. 4시간 후, 앞서 기재된 바와 같이 WB에 의한 분비된 TTR의 분석을 위해 배지를 수확하였다. 각 가이드에 대한 편집% 및 세포외 TTR의 감소에 대한 데이터는 도 7에 제공된다.
세포내 TTR의 웨스턴 블롯 분석
간세포 암종 세포주 HUH7을 표 1로부터의 선택된 가이드를 포함하는 crRNA로 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 풀(pool)을 조직 배양에서 유지하고, 추가의 분석을 위해 계대하였다. 형질감염 후 제7일에, 세포를 수확하고, 전세포 추출물(whole cell extract: WCE)을 준비하고, 앞서 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
WCE을 TTR 단백질의 감소에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 전장 TTR 단백질의 예상 분자량은 약 16kD였다. 이 분자량의 밴드는 웨스턴 블롯의 대조군 레인(lane)에서 관찰되었다.
TTR 단백질의 감소 퍼센트를 Licor Odyssey Image Studio 버전 5.2 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였으며, TTR과 동시에 프로빙하였다. TTR 밴드를 포함하는 전체 영역과 비교하여 각 샘플 내의 GAPDH에 대한 농도측정(densitometry) 값에 대한 비를 계산하였다. TTR 단백질의 감소 퍼센트를 대조군 레인으로 정규화한 후 결정하였다. 결과는 도 8에 나타나 있다.
실시예 8. 인간화된 TTR 마우스 및 wt(뮤린) TTR을 갖는 마우스로의 LNP 전달
TTR 유전자와 관련하여 인간화된 마우스에 표 27에 나타낸 가이드를 포함하는 LNP 제형 701 내지 704를 투여하였다(제형당 5마리의 마우스). 이러한 인간화된 TTR 마우스를 내인성 뮤린 TTR 유전자좌의 영역이 결실되고, 이종상동성(orthologous) 인간 TTR 서열로 대체되어 유전자좌가 인간 TTR 단백질을 암호화하도록 조작하였다. 비교를 위해, 뮤린 TTR을 갖는 6마리의 마우스에 뮤린 TTR을 표적화하는 가이드(G000282)를 포함하는 LNP700을 투여하였다. 표 27에서 제형 번호 1 내지 5의 LNP는 위에 기재된 바와 같은 Nanoassemblr™ 절차를 사용하여 제조한 반면, 제형 번호 6 내지 16의 LNP는 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하였지만 PD-10 칼럼(지이 헬스케서 라이프 사이언시스)을 사용하여 정제하고 Amicon 원심분리 필터 유닛(밀리포어 시그마)을 사용하여 농축하였다. 음성 대조군으로서, 상응하는 유전자형의 마우스에 비히클 단독(Tris-식염수-수크로스 완충액(Tris-saline-sucrose buffer: TSS))을 투여하였다. 표 27의 제형 번호 2 내지 5의 LNP가 투여된 인간화된 TTR 마우스의 배경은 50% 129S6/SvEvTac 50% C57BL/6NTac이었고; 표 25의 제형 번호 6 내지 16의 LNP가 투여된 인간화된 TTR 마우스뿐만 아니라 뮤린 TTR을 갖는 마우스(LNP700이 투여됨, 제형 번호 1)의 배경은 75% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac였다.
Figure pct00064
Figure pct00065
제형 번호 1 내지 5의 LNP는 서열번호 2의 Cas9 mRNA를 함유하고, 제형 번호 6 내지 16의 LNP는 서열번호 1의 Cas9 mRNA를 함유하며, 모두 가이드에 대해 중량 기준으로 1:1의 비이다. LNP는 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 각각 표 27에 나열된 몰비로 함유하였다. 제형 번호 1 내지 5의 LNP의 투여는 2 ㎎/㎏(총 RNA 함량)이었고, 제형 번호 6 내지 16의 LNP의 투여는 1 ㎎/㎏(총 RNA 함량)이었다. 간 편집 결과를 NGS 분석을 위해 관심 있는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 결정하였다. 제형 번호 1 내지 5에 대한 간 편집 결과는 도 9에 나타나 있으며, 60%에 가까운 값을 제공하는 G000494 및 G000499로 35 편집%(평균값) 초과의 수준에서 테스트된 4개의 가이드 각각을 이용한 인간 TTR 서열의 편집을 나타낸다. 제형 번호 6 내지 8, 10 내지 13 및 15 내지 16에 대한 간 편집 결과는 도 13 및 표 28에 나타나 있으며, 이는 테스트된 각 제형을 이용한 인간 TTR 서열의 효율적인 편집을 보여준다. 모든 제형에 대해 38 편집% 이상이 나타났으며, 몇 개의 제형은 60%보다 큰 편집 값을 제공하였다. 제형 9 및 14는 PCR 앰플리콘의 설계 및 그 결과 생성된 적은 수의 시퀀싱 판독물로 인해 나타내지 않았다.
혈청 내 인간 TTR의 수준을 제형 번호 6 내지 8, 10 내지 13 및 15 내지 16을 제공한 마우스에서 측정하였다. 도 14b 참조. 도 14a는 비교 목적으로 제공된 도 13의 반복이다. 혈청 인간 TTR의 넉다운이 테스트된 각 제형에 대해 검출되었으며, 이는 간에서 검출된 편집량과 상관관계가 있었다(도 14a 대 도 14b, 표 28).
Figure pct00066
또 다른 세트의 실험에서, 인간화된 TTR 마우스에 가이드 G000480, G000488, G000489 및 G000502를 갖는 다양한 용량의 LNP 제형을 투여하였다. 제형은 가이드에 대해 중량 기준으로 1:1의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하였다. LNP는 각각 50:38:9:3의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하며, 6의 N:P 비를 갖는다. 투여량은 1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 또는 0.03 ㎎/㎏이었다(n=5/그룹). LNP는 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하고, 각각 PD-10 칼럼 및 Amicon 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제 및 농축하였다. 간 편집 결과를 NGS 분석을 위한 관심 있는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 결정하였고, 혈청 인간 TTR 수준을 위에 기재된 바와 같이 측정하였다. 간 편집에 대한 결과는 도 26a에 나타나 있고, 혈청 인간 TTR 수준은 도 26b 내지 도 26c에 나타나 있다. 편집 및 혈청 TTR 수준 모두에 대한 용량 반응은 분명하였다.
또 다른 세트의 실험에서, 인간화된 TTR 마우스에 가이드 G000481, G000482, G000486 및 G000499를 갖는 다양한 용량의 LNP 제형을 투여하였다. 제형은 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 가이드에 대해 중량 기준으로 1:1의 비로 함유하였다. LNP는 각각 50:38:9:3의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하고, 6의 N:P 비를 갖는다. 투여량은 1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏ 또는 0.1 ㎎/㎏이었다(n=5/그룹). LNP는 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하고, 각각 PD-10 칼럼 및 Amicon 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제 및 농축하였다. 간 편집 결과를 NGS 분석을 위한 관심 있는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 결정하였고, 혈청 인간 TTR 수준을 위에 기재된 바와 같이 측정하였다. 간 편집에 대한 결과는 도 27a에 나타나 있고, 혈청 인간 TTR 수준은 도 27b 내지 도 27c에 나타나 있다. 편집 및 혈청 TTR 수준 모두에 대한 용량 반응은 분명하였다.
또 다른 세트의 실험에서, 인간화된 TTR 마우스에 가이드 G000480, G000481, G000486, G000499 및 G000502를 갖는 다양한 용량의 LNP 제형을 투여하였다. 제형은 가이드에 대해 중량을 기준으로 1:2의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하였다. LNP는 각각 50:38:9:3의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하고, 6의 N:P 비를 갖는다. 투여량은 1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏ 또는 0.1 ㎎/㎏이었다(n=5/그룹). LNP를 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하고, 각각 PD-10 칼럼 및 Amicon 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제 및 농축하였다. 간 편집 결과를 NGS 분석을 위한 관심 있는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 결정하였고, 혈청 인간 TTR 수준을 위에 기재된 바와 같이 측정하였다. 간 편집에 대한 결과는 도 28a에 나타나 있고, 혈청 인간 TTR 수준은 도 28b 내지 도 28c에 나타나 있다. 편집 및 혈청 TTR 수준 모두에 대한 용량 반응은 분명하였다.
야생형 CD-1 마우스를 사용하는 별도의 실험에서, 마우스와 cyno 사이에 교차 상동인 가이드 G000502를 포함하는 LNP 제형을 용량 반응 연구에서 테스트하였다. 제형은 가이드에 대해 중량 기준으로 1:1의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1)를 함유하였다. LNP는 각각 45:44:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하고, 6의 N:P 비를 갖는다. 투여량은 1 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.03 ㎎/㎏ 또는 0.01 ㎎/㎏이었다(n=5/그룹). 간 편집 결과를 NGS 분석을 위한 관심 있는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 결정하였다. 간 편집에 대한 결과는 도 15a에 나타나 있고, 혈청 마우스 TTR 수준은 도 15b에 나타나 있다. 편집 및 혈청 TTR 수준 모두에 대한 용량 반응은 분명하였다.
실시예 9. 다중 용량의 마우스로의 LNP 전달
마우스(찰스 리버 래보러토리(Charles River Laboratory)로부터의 암컷, 대략 6주 내지 7주령)에 중량 기준으로 1:1의 비 및 0.5 ㎎/mℓ의 총 RNA 농도로 G000282("G282") 및 Cas9 mRNA(서열번호 2)를 함유하는 위에 기재된 바와 같은 교차 흐름 및 TFF 절차를 사용하여 제조된 LNP 제형 LNP705를 투여하였다. LNP는 4.5의 N:P 비를 가지며, 각각 45:44:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하였다. 그룹에 주 1회, 최대 1주, 2주, 3주 또는 4주(QW×1 내지 4)에 한 번 또는 월 1회, 최대 2개월 또는 3개월(QM×2 내지 3)에 한 번 투여된다. 투여량은 0.5 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏(총 RNA 함량)이었다. 대조군 그룹에는 제1일에 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏의 단일 용량을 투여하였다. 각 그룹은 5마리의 마우스를 포함하였다. 혈청 TTR을 ELISA에 의해 분석하고, NGS 편집 분석을 위해 부검시 간, 비장 및 근육을 각각 수집하였다. 그룹은 표 29에 나타나 있다. X = 희생 및 부검. MPK = ㎎/㎏.
Figure pct00067
표 30 및 도 10a 내지 도 11b는 혈청 TTR 수준 결과(KD% = 넉다운%)를 보여준다. 표 30 및 도 12a 내지 도 12C는 간 편집 결과를 보여준다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
결과는 증가하는 편집 수준 및 TTR의 KD%를 달성하기 위해, 매주 또는 매월 간격을 포함하여 시간 경과에 따른 다중 투여로 누적 용량 및 효과를 축적할 수 있음을 보여준다.
실시예 10. RNA 카고: 다양한 mRNA 및 gRNA 비
이 연구는 상이한 비의 gRNA 대 mRNA의 마우스에서의 생체내 효능을 평가하였다. 서열번호 4의 ORF, HSD 5' UTR, 인간 알부민 3' UTR, 코작 서열 및 폴리-A 꼬리를 갖는 CleanCap™ 캡핑된 Cas9 mRNA를 우리딘 트라이포스페이트 대신 N1-메틸슈도우리딘 트라이포스페이트를 사용하여 실시예 1에 나타낸 바와 같이 IVT 합성에 의해 제조하였다.
LNP 제형을 50:38:9:3의 몰비의 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG 및 6의 N:P 비를 갖는 기재된 mRNA 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 G282(서열번호 124)로부터 제조하였다. 제형의 gRNA:Cas9 mRNA 중량비는 도 19a 및 도 19b에 나타낸 바와 같았다.
생체내 특성화를 위해, LNP를 ㎏당 0.1㎎ 총 RNA(mg 가이드 RNA+㎎ mRNA)로 마우스에 투여하였다(그룹당 n=5). 투여 후 제7일 내지 제9일에, 동물을 희생시키고, 혈액 및 간을 수집하고, 혈청 TTR 및 간 편집을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 혈청 TTR 및 간 편집 결과는 도 19a 및 도 19b에 나타나 있다. 음성 대조군 마우스에는 TSS 비히클을 투여하였다.
또한, 위의 LNP를 ㎏당 0.05㎎ mRNA의 일정한 mRNA 용량으로 마우스에 투여한 반면(그룹당 n=5), gRNA 용량은 ㎏당 0.06㎎ 내지 ㎏당 0.4㎎으로 다양하였다. 투여 후 제7일 내지 제9일에, 동물을 희생시키고, 혈액 및 간을 수집하고, 혈청 TTR 및 간 편집을 측정하였다. 혈청 TTR 및 간 편집 결과는 도 19c 및 도 19d에 나타나 있다. 음성 대조군 마우스에는 TSS 비히클을 투여하였다.
실시예 11. 일차 인간 간세포에서 TTR sgRNA의 표적외 분석
TTR을 표적화하는 sgRNA의 표적외 분석을 실시예 5에 기재된 바와 같은 일차 인간 간세포(PHH)에서 다음과 같이 수정하여 수행하였다. PHH를 실시예 1에 기재된 바와 같이 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰당 33,000개 세포의 밀도로 평판배양하였다. 평판배양 24시간 후, 세포를 배지로 세척하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 리포펙타민 RNAiMAX(써모피셔, Cat. 13778150)를 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 100ng의 Cas9 mRNA를 포함하는 리포플렉스로 형질감염시킨 후, 즉시 25nM의 sgRNA 및 12.5nM의 공여체 올리고(0.3 ㎕/웰)를 포함하는 또 다른 리포플렉스를 첨가하였다. 세포를 형질감염 48시간 후에 용해시키고, gDNA를 추출하고, 실시예 5에 추가로 기재된 바와 같이 분석하였다. 데이터는 도 20에 그래프로 나타내었다.
표 32는 PHH에서 검출된 표적외 통합 부위의 수를 나타내며, 실시예 5에서 사용된 HekCas9 세포에서 검출된 부위의 수와 비교한다. HekCas9 세포주와 비교하여 테스트된 모든 가이드에 대해 PHH에서 더 적은 부위가 검출되었고, PHH에서만 고유한 부위가 검출되지 않았다.
Figure pct00071
올리고 삽입 검정을 통해 PHH에서 잠재적인 표적외 부위를 확인한 후, 예를 들어, 실시예 6에 기재된 바와 같이 표적화된 앰플리콘 시퀀싱에 의해 소정의 잠재적인 부위를 추가로 평가하였다. 올리고 삽입 전략에 의해 확인된 잠재적인 표적외 부위 이외에, 인실리코 예측에 의해 확인된 추가적인 잠재적인 표적외 부위를 분석에 포함시켰다.
이를 위해, PHH를 실시예 4에 기재된 바와 같이 100ng의 Cas9 mRNA(서열번호 1) 및 14.68nM의 관심 있는 gRNA를 (중량 기준으로 1:1의 비로) 포함하는 LNP로 처리하였다. LNP를 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하고, 각각 PD-10 칼럼 및 Amicon 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제 및 농축하였다. LNP를 6.0의 N:P 비를 갖고, 각각 50:38:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하도록 제형화하였다. LNP 처리 후, 단리된 게놈 DNA를 (예를 들어, 실시예 1 및 실시예 6에 기재된 바와 같이) NGS에 의해 분석하여 indel이 Cas9-매개성 절단 이벤트를 나타낼 수 있는 잠재적인 표적외 부위에서 검출될 수 있는지 여부를 결정하였다. 표 33 및 표 34는 각각 gRNA G000480 및 G000486에 대해 평가된 잠재적인 표적외 부위를 보여준다.
도 21a 내지 도 21b 및 도 22a 내지 도 22b 및 아래의 표 35에 나타낸 바와 같이, indel은 G000480에 대한 올리고 삽입 검정에 의해 확인된 잠재적인 표적외 부위 중 2개 및 G000486에 대해 1개에 대해서만 낮은 수준에서 검출되었다. 두 가이드에 대해 인실리코 예측된 부위 중 어느 것에서도 indel은 검출되지 않았다. 또한, G000480 및 G000486에 대한 표적 부위에서 관찰된 indel 비율이 각각 약 97% 및 약 91%였기 때문에, indel은 거의 포화 용량의 LNP를 사용하여 이러한 부위에서만 검출되었다(표 35 참조). 이들 부위의 게놈 좌표는 또한 표 33 및 표 34에 보고되어 있으며, 각각은 어떠한 단백질도 코딩하지 않는 서열에 해당한다.
그런 다음, 표적외의 것이 검출되지 않은 LNP의 최고 용량을 결정하기 위해 용량 반응 검정을 수행하였다. PHH를 실시예 4에 기재된 바와 같이 G000480 또는 G000486을 포함하는 LNP로 처리하였다. 용량은 gRNA 농도(0.001nM, 0.002nM, 0.007nM, 0.02nM, 0.06nM, 0.19nM, 0.57nM, 1.72nM, 5.17nM, 15.51nM 및 46.55nM)와 관련하여 11개 지점에 걸쳐 있다. 도21A 내지 도 21b 및 도 22a 내지 도 22b에서 수직 파선으로 나타낸 바와 같이, 잠재적인 표적외 부위가 G000480 및 G000486에 대해 더 이상 검출되지 않는 최고 농도(gRNA의 농도와 관련하여)는 각각 0.57nM 및 15.51nM이었고, 각각 84.60% 및 89.50%의 표적내 indel 비율을 초래하였다.
Figure pct00072
Figure pct00073
"INS-OT.N"은 올리고 삽입에 의해 검출된 표적외 부위 ID를 지칭하며, 여기서 N은 위에 명시된 정수이고; "PRED-OT.N"은 인실리코 방법을 통해 예측된 표적외 부위 ID를 지칭하며, 여기서 N은 위에 명시된 정수이다.
Figure pct00074
"INS-OT.N"은 올리고 삽입에 의해 검출된 표적외 부위 ID를 지칭하며, 여기서 N은 위에 명시된 정수이고; "PRED-OT.N"은 인실리코 방법을 통해 예측된 표적외 부위 ID를 지칭하며, 여기서 N은 위에 명시된 정수이다.
Figure pct00075
실시예 12. ATTR의 인간화된 마우스 모델로의 LNP 전달
인간 TTR 단백질의 V30M 병원성 돌연변이체 형태를 발현하는 유전성 ATTR 아밀로이드증의 잘 확립된 인간화된 형질전환 마우스 모델을 이 실시예에서 사용하였다. 이 마우스 모델 말초 신경계 및 위장관(GI) 내를 포함하여 ATTR 환자에서 관찰된 조직에서 TTR 침착 표현형을 개괄한다(문헌[Santos et al., Neurobiol Aging.　2010 Feb;31(2):280-9] 참조).
마우스(대략 4개월 내지 5개월령)에 실시예 1에 기재된 바와 같이 교차 흐름 및 TFF 절차를 사용하여 제조된 LNP 제형을 투여하였다. LNP를 6.0의 N:P 비를 갖고, 각각 50:38:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하도록 제형화하였다. LNP는 각각 중량을 기준으로 gRNA:mRNA의 1:1의 비로 Cas9 mRNA(서열번호 1) 및 G000481("G481") 또는 비-표적화 대조군 가이드 G000395("G395"; 서열번호 273)를 함유하였다.
마우스에 실시예 1에 기재된 바와 같이 마우스에 측면 꼬리 정맥을 통해 n=10/그룹의 LNP의 단일 1㎎/㎏(총 RNA 함량의) 용량을 주사하였다.　처리 후 8주에, 샘플 수집을 위해 마우스를 마취시켰다.　문헌[Butler et al., Amyloid.　2016 Jun;23(2):109-18]에서 이전에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 혈청 및 뇌척수액(CSF)에서 인간 TTR 단백질 수준을 측정하였다. 간 조직을 실시예 1에 기재된 바와 같이 편집 수준에 대해 검정하였다. 문헌[Gonηalves et al., Amyloid. 2014 Sep; 21(3): 175-184]에서 이전에 기술된 바와 같이 반-정량적 면역조직화학을 위해 다른 조직(위, 결장, 좌골 신경, 후근 신경절(DRG))을 수집하고 처리하였다. p-값이 0.0001 미만인 맨 휘트니(Mann Whitney) 테스트를 사용하여 면역조직화학 데이터에 대한 통계적 분석을 수행하였다.
도 23a 내지 도 23b에 나타낸 바와 같이, TTR의 강력한 편집(49.4%)이 G481을 포함하는 LNP의 단일 투여 후 인간화된 마우스의 간에서 관찰되었으며, 대조군 그룹에서는 편집이 검출되지 않았다. 편집 이벤트의 분석은 이벤트의 96.8%가 삽입이었고, 나머지는 결실임을 보여주었다.
도 24a 내지 도 24b에 나타낸 바와 같이, TTR 단백질 수준은 혈장에서 감소되었지만, 처리된 마우스로부터의 CSF에서는 감소되지 않았으며, TTR 혈장 수준의 99% 초과의 넉다운이 관찰되었다(p<0.001).
처리된 동물의 혈장에서 관찰된 TTR의 거의 완전한 넉다운은 검정된 조직에서 TTR 단백질 아밀로이드 침착의 제거와 상관관계가 있었다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스는 ATTR을 갖는 인간 대상체에서 관찰된 병태생리와 유사한 조직에서 아밀로이드 염색을 나타내었다. HuTTR V30M 유전자좌를 편집하여 순환 TTR을 감소시키면 조직에서 아밀로이드 침착이 극적으로 감소하였다. TTR 염색의 대략 85% 이상의 감소가 처리 후 8주에 처리된 조직에 걸쳐 관찰되었다(도 25).
실시예 13. 일차 인간 간세포(PHH)에서 TTR mRNA 넉다운
한 실험에서, 실시예 4에 기재된 바와 같이 PHH를 배양하고, Cas9 mRNA(서열번호 1) 및 관심 있는 gRNA(도 29, 표 36 참조)를 포함하는 LNP로 처리하였다. LNP를 위에 기재된 교차 흐름 절차를 사용하여 제조하고, 각각 PD-10 칼럼 및 Amicon 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제 및 농축하였다. LNP를 6.0의 N:P 비를 갖고, 각각 50:38:9:2의 몰비로 지질 A, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 함유하도록 제형화하였다. LNP는 1:2의 gRNA:mRNA 비를 포함하며, 세포는 (전달된 mRNA 카고의 양에 대해) 300ng의 용량으로 처리하였다.
LNP 처리(각 조건에 대해 3개의 생물학적 샘플을 사용) 아흔 여섯(96)시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Dynabeads mRNA DIRECT 키트(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 PHH 세포로부터 mRNA를 정제하였다. 역전사(역 Transcription: RT)를 Maxima 역전사효소(써모피셔 사이언티픽) 및 폴리-dT 프라이머로 수행하였다. 생성된 cDNA를 Ampure XP Beads(에이젠코트(Agencourt))로 정제하였다. 정량적 PCR을 위해, 정제된 cDNA의 2%를 Taqman Fast Advanced Mastermix 및 3개의 Taqman 프로브 세트, TTR(검정 ID: Hs00174914_m1), GAPDH(검정 ID: Hs02786624_g1) 및 PPIB(검정 ID: Hs00168719_m1)로 증폭시켰다. 제조업체의 지침(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 따라 QuantStudio 7 Flex 실시간 PCR 시스템에서 검정을 실시하였다. TTR mRNA의 상대적 발현을 내인성 대조군(GAPDH 및 PPIB)에 대해 개별적으로 정규화하여 계산한 다음 평균을 내었다.
도 29에 나타내고 및 아래 표 36에 수치적으로 재현된 바와 같이, 테스트된 각각의 LNP 제형은 음성(비처리) 대조군과 비교하여 TTR mRNA의 넉다운을 초래하였다. 도 29 및 표 36의 그룹은 각각의 LNP 제제에 사용된 gRNA ID에 의해 확인되었다. TTR mRNA의 상대적 발현은 도 29에 플로팅된 반면, TTR mRNA의 넉다운 퍼센트는 표 36에 제공된다.
Figure pct00076
별도의 실험에서, G000480, G000486 및 G000502를 포함하는 LNP로 처리한 후 TTR mRNA 넉다운을 평가하였다. (전달된 mRNA 카고의 양에 대해) 100ng의 용량으로 처리한 것을 제외하고는, 이 실시예의 위의 실험에 기재된 바와 같이 각각 LNP를 제형화하고, PHH를 배양하고, LNP로 처리하였다.
LNP 처리(각 조건에 대해 단일 처리) 후 아흔 여섯(96)시간에, 제조업체의 프로토콜에 따라 Dynabeads mRNA DIRECT 키트(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 PHH 세포로부터 mRNA를 정제하였다. 제조업체의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 역전사(RT)를 수행하였다. 정량적 PCR을 위해, cDNA의 2%를 Taqman Fast Advanced Mastermix 및 3 Taqman 프로브 세트, TTR(검정 ID: Hs00174914_m1), GAPDH(검정 ID: Hs02786624_g1) 및 PPIB(검정 ID: Hs00168719_m1)로 증폭시켰다. 제조업체의 지침(라이프 테크놀로지스)에 따라 QuantStudio 7 Flex 실시간 PCR 시스템에서 검정을 실시하였다. TTR mRNA의 상대적 발현을 내인성 대조군(GAPDH 및 PPIB)에 대해 개별적으로 정규화하여 계산한 다음 평균을 내었다.
도 30에 나타내고 아래 표 37에 수치적으로 재현된 바와 같이, 테스트된 각각의 LNP 제형은 음성(비처리) 대조군과 비교하여 TTR mRNA의 넉다운을 초래하였다. 도 30 및 표 37의 그룹은 각각의 LNP 제제에 사용된 gRNA ID에 의해 확인되었다. TTR mRNA의 상대적 발현은 도 30에 플로팅된 반면, TTR mRNA의 넉다운 퍼센트는 표 37에 제공된다.
Figure pct00077
실시예 14. 비-인간 영장류에 대한 코르티코스테로이드 전처리 및 LNP 전달
n=3의 코호트에서 수컷 사이노몰구스 원숭이를 덱사메타손 및 다양한 용량의 LNP로 처리하여 NHP당 1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 또는 6 ㎎/㎏(RNA)을 제공하였다. 각 제형은 중량 기준으로 1:2의 gRNA:mRNA 비로 Cas9 mRNA000042(서열번호 377) 및 가이드 RNA(gRNA) G000502(서열번호 114)를 함유하였다. 비히클 대조군으로 처리된 동물을 제외하고, 모든 동물은 LNP 투여 1시간 내지 2시간 전에 IV 볼루스 주사에 의해 2 ㎎/㎏으로 덱사메타손(Dex) 전처리를 받았다. LNP의 용량(㎎/㎏ 단위, 총 RNA 함량)을 30분 IV 주입에 의해 투여하였다.
투여 후 제15일에, 16-게이지 SuperCore 생검 바늘을 사용하여 간의 우엽/측면을 표적으로 하는 초음파-유도 경피 생검을 통해 간 표본을 수집하였다. 동물당 최소 1.5㎤의 전체 간 생검을 수집하였다. 각 생검 표본을 액체 질소에서 급속 동결시키고, -86℃ 내지 -60℃에서 보관하였다. 간 표본의 편집 분석을 앞서 기술된 NGS 시퀀싱을 통하여 수행하였다. 간 편집에 대한 결과는 모든 용량에서 내약성이 우수한 최대 약 70 편집%인 것으로 나타났다. 기재된 LNP 처리를 사용한 코르티코스테로이드 전처리는 내약성이 우수하였다.
실시예 14에 대한 물질 및 방법. 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하여 시험관내 전사(IVT)에 의해 mRNA를 합성하였다. 전사는 일반적으로 T7 프로모터(서열번호 231), 본 명세서에 개시된 전사체 서열, 예컨대, 서열번호 377(서열번호 311의 RNA ORF를 암호화함) 및 플라스미드에 암호화된 폴리-A 꼬리(서열번호 263)를 포함하는 작제물로부터 수행하였다.
모든 방법에 대해, 전사체 농도는 260㎚(나노드롭)에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고, 전사체는 Bioanalyzer(애질런트)에 의한 모세관 전기영동으로 분석하였다.
LNP 제형
지질 구성요소를 아래에 기재된 지질 구성요소 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 합하고, 25mM 시트레이트, 100mM NaCl(pH 5.0)에 용해시켜 대략 1.5 ㎎/㎖의 총 RNA 카고 농도를 생성하였다. LNP는 아래 기재된 바와 같은 1:2 w/w의 비의 화학적으로 변형된 sgRNA: Cas9 mRNA의 비와 함께 약 6의 N/P 비로 제형화하였다. LNP를 50% 지질 A, 9% DSPC, 38% 콜레스테롤 및 3% PEG2k-DMG로 제형화하고, LNP를 실시예 1에 기술된 바와 같은 교차 흐름 기법에 의해 형성하였다. 혼합하는 동안, 차등 유속을 사용하여 수성 대 유기 용매의 2:1의 비를 유지하였다. 희석된 LNP를 접선 흐름 여과를 사용하여 농축시킨 다음, 여과 및 보관 전에 정용 여과(diafiltration)에 의해 완충액을 교환하였다.
Cas9 mRNA 및 gRNA 카고
캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA를 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하는 시험관내 전사에 의해 생성하였다.
게놈 DNA 단리
제조업체의 프로토콜에 따라 50 ㎕/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액(에피센터, 카탈로그 번호 QE09050)을 사용하여 간 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 모든 DNA 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 거쳤다.
NGS 시퀀싱
간단히 말해서, 게놈의 표적 위치에서의 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 게놈 DNA를 단리하고, 딥 시퀀싱을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
PCR 프라이머를 표적 부위(예를 들어, TTR) 주위에 설계하고, 관심 있는 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 아래에 제공된다. 시퀀싱에 필요한 화학물질을 추가하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라서(일루미나) 추가적인 PCR을 수행하였다. 일루미나 MiSeq 기기 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 낮은 품질 점수를 갖는 것들을 제거한 후, 판독물을 cyno 참조 게놈(예를 들어, macFas5)에 대해 정렬하였다. 판독물을 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)에 대해 맵핑하였으며, 여기서 관심 있는 표적 영역과 중첩되는 판독물을 선택하고, 야생형 판독물의 수 대 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 판독물의 수를 계산하였다.
편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 퍼센트")은 야생형을 포함하는 총 서열 판독물의 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 총 서열 판독물의 수로서 정의하였다.
실시예 15: 사이노몰구스 원숭이에서 30분 및 2시간 IV 주입을 통해 투여된 다중 용량 LNP 연구
n=3의 코호트에서 수컷 사이노몰구스 원숭이에 LNP 또는 비히클 대조군 투여 최소 1시간 전에 2 ㎎/㎏의 IV 볼루스 주입을 통해 덱사메타손(Dex)을 투여하였다. 각 코호트에 다양한 용량의 LNP를 투여하여 NHP당 3 ㎎/㎏ 또는 6 ㎎/㎏(RNA)을 제공하였다. 투여 그룹은 표 38에 나타나 있다. 주입 시간을 비교하기 위해, 2개의 코호트에 3 ㎎/㎏의 LNP 용량을 투여하였다. Cas9 mRNA 및 가이드 RNA를 함유하는 제형은 하기 및 실시예 14에 기재된 바와 같이 제조하였다. LNP 제형은 하기 및 실시예 14에 기재된 바와 같이 제조하였다. 3㎎/㎏(총 RNA 함량)의 LNP 용량을 투여받은 코호트는 30-분 또는 120-분 IV 주입에 의해 투여하였다. 다양한 용량의 LNP(㎎/㎏ 단위, 총 RNA 함량)를 사용하는 모든 다른 코호트 120-분 IV 주입에 의해 투여하였다.
Figure pct00078
Figure pct00079
투여 후 제29일에, 케타민/자일라진의 근육내 주입하에 16-게이지 SuperCore 생검 바늘을 사용하여 간의 우엽/측면을 표적화하는 단일 초음파-유도 경피 생검을 통해 간 표본을 수집하였다. 동물당 1.0㎤에서 1.5㎤ 사이의 전체 간 생검의 샘플을 수집하였다. 각 생검 표본을 액체 질소에서 급속 동결시키고, -80℃에서 보관하였다. 간 표본의 편집 분석을 앞서 기술된 NGS 시퀀싱을 통하여 수행하였으며, 이는 도 31b에 나타나 있다. 간 편집에 대한 결과는 최대 약 70 편집%인 것으로 나타났다. 혈청 TTR 수준은 도 31a에 도시되어 있다. 기재된 LNP 처리를 사용한 코르티코스테로이드 전처리는 내약성이 우수하였다.
Figure pct00080
샘플을 표 39 및 도 31a 내지 도 31b 및 표 40 및 도 31c에 각각 나타낸 바와 같이 편집 퍼센트 데이터, 혈청 TTR 데이터 및 알라닌 트랜스아미네이스(ALT) 수준에 대해 분석하였다. 간 편집 및 혈청 TTR 데이터에 대한 결과는 30분 주입 시간을 이용한 3 ㎎/㎏ 용량과 120분 주입 시간을 이용한 3 ㎎/㎏ 용량 간에 효능에 유의한 차이가 없음을 보여준다. 그러나, 30' 이상의 주입 시간 투여는 간 손상 바이오마커인 ALT의 낮은 수준을 보여준다. ALT 수준은 잠재적인 간 스트레스를 나타내는 30분의 주입 시간을 사용한 3 ㎎/㎏ 용량에서 더 높은 것으로 관찰되었다.
실시예 4에 대한 물질 및 방법. 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하여 시험관내 전사(IVT)에 의해 mRNA를 합성하였다. 전사는 일반적으로 T7 프로모터(서열번호 231), 본 명세서에 개시된 전사체 서열, 예컨대, 서열번호 377(서열번호 311의 RNA ORF를 암호화함) 및 플라스미드에 암호화된 폴리-A 꼬리(서열번호 263)를 포함하는 작제물로부터 수행하였다.
모든 방법에 대해, 전사체 농도는 260㎚(나노드롭)에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고, 전사체는 Bioanalyzer(애질런트)에 의한 모세관 전기영동으로 분석하였다.
LNP 제형
지질 구성요소를 아래에 기재된 지질 구성요소 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 합하고, 25mM 시트레이트, 100mM NaCl(pH 5.0)에 용해시켜 대략 1.5 ㎎/㎖의 총 RNA 카고 농도를 생성하였다. LNP는 아래 기재된 바와 같은 1:2 w/w의 비의 화학적으로 변형된 sgRNA: Cas9 mRNA의 비와 함께 약 6의 N/P 비로 제형화하였다. LNP를 50% 지질 A, 9% DSPC, 38% 콜레스테롤 및 3% PEG2k-DMG로 제형화하고, LNP를 실시예 1에 기술된 바와 같은 교차 흐름 기법에 의해 형성하였다. 혼합하는 동안, 차등 유속을 사용하여 수성 대 유기 용매의 2:1의 비를 유지하였다. 희석된 LNP를 접선 흐름 여과를 사용하여 농축시킨 다음, 여과 및 보관 전에 정용 여과에 의해 완충액을 교환하였다.
Cas9 mRNA 및 gRNA 카고
캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA를 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하는 시험관내 전사에 의해 생성하였다.
게놈 DNA 단리
제조사의 프로토콜에 따라 50 ㎕/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액(에피센터, 카탈로그 번호 QE09050)을 사용하여 간 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 모든 DNA 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 거쳤다.
NGS 시퀀싱
간단히 말해서, 게놈의 표적 위치에서의 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 게놈 DNA를 단리하고, 딥 시퀀싱을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
PCR 프라이머를 표적 부위(예를 들어, TTR) 주위에 설계하고, 관심 있는 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 아래에 제공된다. 시퀀싱에 필요한 화학물질을 추가하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라서(일루미나) 추가적인 PCR을 수행하였다. 일루미나 MiSeq 기기 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 낮은 품질 점수를 갖는 것들을 제거한 후, 판독물을 cyno 참조 게놈(예를 들어, macFas5)에 대해 정렬하였다. 판독물을 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)에 대해 맵핑하였으며, 여기서 관심 있는 표적 영역과 중첩되는 판독물을 선택하고, 야생형 판독물의 수 대 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 판독물의 수를 계산하였다.
편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 퍼센트")은 야생형을 포함하는 총 서열 판독물의 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 총 서열 판독물의 수로서 정의하였다.
실시예 16: 추가 번호가 매겨진 실시형태
하기의 추가적인 실시형태가 제공된다.
실시형태 A1은
(i) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산으로서,
a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나;
b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 50개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성 또는 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고/갖거나;
c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%가 표 4에 열거된 코돈, 표 5의 낮은 A 세트 또는 표 5의 낮은 A/U 세트인 코돈의 세트로 구성되고/되거나;
d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 123% 범위의 아데닌 함량을 갖고/갖거나;
e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산; 및
(ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터로서, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터
를 포함하는 조성물이다.
실시형태 A2는 TTR 유전자를 변형시키고/시키거나 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하되, 조성물은,
(i) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산으로서,
a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나;
b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 50개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 93%의 동일성 또는 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고/갖거나;
c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%가 표 4에 열거된 코돈, 표 5의 낮은 A 세트 또는 표 5의 낮은 A/U 세트인 코돈의 세트로 구성되고/되거나;
d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 123% 범위의 아데닌 함량을 갖고/갖거나;
e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산; 및
(ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터로서, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터
를 포함한다.
실시형태 A3은 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고, TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고/하거나 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법으로서, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 조성물은,
(i) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산으로서,
a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나;
b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고/갖거나;
c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%는 표 4에 열거된 코돈, 표 5의 낮은 A 세트 또는 표 5의 낮은 A/U 세트인 코돈의 세트로 구성되고/되거나;
d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고/갖거나;
e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산; 및
(ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터로서, 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하여, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고/하거나 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 벡터
를 포함한다.
실시형태 A4는 실시형태 A1 내지 A3 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 가이드 RNA는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 61, 63, 65, 66, 68 또는 69로부터 선택되는 가이드 서열을 포함한다.
실시형태 A5는 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하는데 사용하기 위한 실시형태 A1 또는 A4의 조성물이다.
실시형태 A6은 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키는데 사용하기 위한 실시형태 A1, A4 또는 A5의 조성물이다.
실시형태 A7은 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하는데 사용하기 위한 실시형태 A1, A4, A5 또는 A6의 조성물이다.
실시형태 A8은 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 실시형태 A1, A4, A5, A6 또는 A7의 조성물이다.
실시형태 A9는 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는데 사용하기 위한 실시형태 A1, A4, A5, A6, A7 또는 A8의 조성물이다.
실시형태 A10은 실시형태 A2 내지 A9 중 어느 하나의 사용을 위한 조성물 또는 방법이되, 방법은 30분 초과 동안 주입에 의해 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태 A11은 실시형태 A10의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 45분 내지 75분, 75분 내지 105분, 105분 내지 135분, 135분 내지 165분, 165분 내지 195분, 195분 내지 225분, 225분 내지 255분, 255분 내지 285분, 285분 내지 315분, 315분 내지 345분, 345분 내지 375분 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 A12는 실시형태 A10 또는 A11의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 1.5시간 내지 6시간 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 A13은 실시형태 A10의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 60분, 약 90분, 약 120분, 약 150분, 약 180분 또는 약 240분 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 A14는 실시형태 A10의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약 120분 동안 주입에 의해 투여된다.
실시형태 A15는 실시형태 A2 내지 A14 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 혈청 TTR 수준을 감소시킨다.
실시형태 A16은 실시형태 A15의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 혈청 TTR 수준은 조성물의 투여 전 혈청 TTR 수준과 비교하여 적어도 50%까지 감소된다.
실시형태 A17은 실시형태 A151의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 혈청 TTR 수준은 조성물의 투여 전 혈청 TTR 수준과 비교하여 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 98%, 98% 내지 99% 또는 99% 내지 100%까지 감소된다.
실시형태 A18은 실시형태 A2 내지 A17 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 TTR 유전자의 편집을 초래한다.
실시형태 A19는 실시형태 A18의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집은 편집된 집단의 백분율(편집 퍼센트)로 계산된다.
실시형태 A20은 실시형태 A19의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집 퍼센트는 집단의 30% 내지 99%이다.
실시형태 A21은 실시형태 A19의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 편집 퍼센트는 집단의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%이다.
실시형태 A22는 실시형태 A2 내지 A21 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 하나의 조직에서 아밀로이드 침착을 감소시킨다.
실시형태 A23은 실시형태 A22의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 조직은 위, 결장, 좌골 신경 또는 후근 신경절 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태 A24는 실시형태 A22 또는 A23의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 조성물의 투여 후 8주에 측정된다.
실시형태 A25는 실시형태 A22 내지 A24 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 음성 대조군 또는 조성물의 투여 전에 측정된 수준과 비교된다.
실시형태 A26은 실시형태 A22 내지 A25 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 생검 샘플 및/또는 면역염색에 의해 측정된다.
실시형태 A27은 실시형태 A22 내지 A26 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 음성 대조군에서 관찰된 아밀로이드 침착의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%까지 감소된다.
실시형태 A28은 실시형태 A22 내지 A27 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 침착은 조성물의 투여 전 관찰된 아밀로이드 침착의 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%까지 감소된다.
실시형태 A29는 실시형태 A2 내지 A28 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 2회 투여 또는 전달된다.
실시형태 A30은 실시형태 A29의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 3회 투여 또는 전달된다.
실시형태 A31은 실시형태 A29의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 적어도 4회 투여 또는 전달된다.
실시형태 A32는 실시형태 A29의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 최대 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 투여 또는 전달된다.
실시형태 A33은 실시형태 A29 내지 A32 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일의 간격으로 발생한다.
실시형태 A34는 실시형태 A29 내지 A32 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주의 간격으로 발생한다.
실시형태 A35는 실시형태 A29 내지 A32 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 또는 전달은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월 또는 15개월의 간격으로 발생한다.
실시형태 A36은 실시형태 A1 내지 A35 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하고, 서열번호 126의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 서열번호 126의 뉴클레오타이드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따른다.
실시형태 A37은 선행하는 실시형태 A1 내지 A37 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 이중 가이드(dgRNA)이다.
실시형태 A38은 실시형태 A37의 방법 또는 조성물이되, 이중 가이드 RNA는 서열번호 126의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA 및 trRNA를 포함하고, 서열번호 126의 뉴클레오타이드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따른다.
실시형태 A39는 실시형태 A1 내지 A36 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 단일 가이드(sgRNA)이다.
실시형태 A40은 실시형태 A39의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 3의 패턴을 갖는 가이드 서열을 포함한다.
실시형태 A41은 실시형태 A39의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 3의 서열을 포함한다.
실시형태 A42는 실시형태 A39 내지 A41 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82의 가이드 서열 중 어느 하나 및 서열번호 126의 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A43은 실시형태 A39 내지 A42 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 서열을 포함한다.
실시형태 A44는 실시형태 A39의 방법 또는 조성물이되, sgRNA는 서열번호 87 내지 113, 115 내지 120 및 122 내지 124로부터 선택되는 서열을 포함한다.
실시형태 A45는 선행하는 실시형태 A1 내지 A44 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다.
실시형태 A46은 실시형태 A45의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A47은 실시형태 A45 또는 A46의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
실시형태 A48은 실시형태 A45 내지 A47 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A49는 실시형태 A45 내지 A48 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 5' 말단에서 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다.
실시형태 A50은 실시형태 A45 내지 A49 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 3' 말단에서 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다.
실시형태 A51은 실시형태 A45 내지 A50 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함한다.
실시형태 A52는 실시형태 A45 내지 A51 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 PS 결합을 포함한다.
실시형태 A53은 실시형태 A45 내지 A52 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A54는 실시형태 A45 내지 A53 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 적어도 하나의 변형은 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A55는 실시형태 A45 내지 A54 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 서열번호 3의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태 A56은 실시형태 A1 내지 A55 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
실시형태 A57은 실시형태 A1 내지 A56 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산은 지질 나노입자(LNP)와 관련이 있다.
실시형태 A58은 실시형태 A57의 방법 또는 조성물이되, LNP는 CCD 지질을 포함한다.
실시형태 A59는 실시형태 A58의 방법 또는 조성물이되, CCD 지질은 지질 A 또는 지질 B이고, 선택적으로 CCD 지질은 지질 A이다.
실시형태 A60은 실시형태 A57 내지 A59 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 보조 지질을 포함한다.
실시형태 A61은 실시형태 A60의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 콜레스테롤이다.
실시형태 A62는 실시형태 A57 내지 A61 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함한다.
실시형태 A63은 실시형태 A62의 방법 또는 조성물이되, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
실시형태 A64는 실시형태 A57 내지 A63 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되,
(i) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A, 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(ii) LNP는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 27-39.5 몰-%의 보조 지질; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, LNP 조성물의 N/P 비는 약 5 내지 7(예를 들어, 약 6)이고;
(iii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(iv) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(v) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
(vi) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 0 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(vii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 1 몰-% 미만의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
(viii) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이며, LNP 조성물은 중성 인지질이 본질적으로 없거나 또는 없거나;
(ix) LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 7이다.
실시형태 A64a는 실시형태 A64의 방법 또는 조성물이되, PEG 지질의 몰-%는 약 3이다.
실시형태 A64b는 실시형태 A64 또는 A64a의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 약 50이다.
실시형태 A64c는 실시형태 A64 내지 A64b 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 약 55이다.
실시형태 A64d는 실시형태 A64 내지 A64c 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 ±3 몰-%이다.
실시형태 A64e는 실시형태 A64 내지 A64d 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 ±2 몰-%이다.
실시형태 A64f는 실시형태 A64 내지 A64e 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 47 내지 53 몰-%이다.
실시형태 A64g는 실시형태 A64 내지 A64f 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 48 내지 53 몰-%이다.
실시형태 A64h는 실시형태 A64 내지 A64g 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질의 몰-%는 53 내지 57 몰-%이다.
실시형태 A64i는 실시형태 A64 내지 A64h 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, N/P 비는 6±1이다.
실시형태 A64j는 실시형태 A64 내지 A64i 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, N/P 비는 6±0.5이다.
실시형태 A64k는 실시형태 A64 내지 A64j 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 지질 A이다.
실시형태 A64l은 실시형태 A64 내지 A64k 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 지질 A의 유사체이다.
실시형태 A64m은 실시형태 A64l의 방법 또는 조성물이되, 유사체는 아세탈 유사체이다.
실시형태 A64n은 실시형태 A64m의 방법 또는 조성물이되, 아세탈 유사체는 C4-C12 아세탈 유사체이다.
실시형태 A64o는 실시형태 A64m의 방법 또는 조성물이되, 아세탈 유사체는 C5-C12 아세탈 유사체이다.
실시형태 A64p는 실시형태 A64m의 방법 또는 조성물이되, 아세탈 유사체는 C5-C10 아세탈 유사체이다.
실시형태 A64q는 실시형태 A64m의 방법 또는 조성물이되, 아세탈 유사체는 C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11 및 C12 유사체로부터 선택된다.
실시형태 A64r은 실시형태 A64 내지 A64q 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 콜레스테롤이다.
실시형태 A64s는 실시형태 A64 내지 A64r 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 DSPC이다.
실시형태 A64t는 실시형태 A64 내지 A64s 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 DPPC이다.
실시형태 A64u는 실시형태 A64 내지 A64t 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, PEG 지질은 다이미리스토일글리세롤(DMG)을 포함한다.
실시형태 A64v는 실시형태 A64 내지 A64u 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, PEG 지질은 PEG-2k를 포함한다.
실시형태 A64w는 실시형태 A64 내지 A64v 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, PEG 지질은 PEG-DMG이다.
실시형태 A64x는 실시형태 A64w의 방법 또는 조성물이되, PEG-DMG는 PEG2k-DMG이다.
실시형태 A64y는 실시형태 A64 내지 A64x 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP 조성물은 중성 지질이 본질적으로 없다.
실시형태 A64z는 실시형태 A64y의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 인지질이다.
실시형태 A65는 실시형태 A57 내지 A64z 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 중성 지질을 포함하고, 선택적으로 중성 지질은 DSPC이다.
실시형태 A66은 실시형태 A64 내지 A65 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 약 50 몰-%로 존재한다.
실시형태 A67은 실시형태 A64 내지 A66 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 약 9 몰-%로 존재한다.
실시형태 A68은 실시형태 A62 내지 A67 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 스텔스 지질은 약 3 몰-%로 존재한다.
실시형태 A69는 실시형태 A60 내지 A68 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 약 38 몰-%로 존재한다.
실시형태 A70은 실시형태 A1 내지 A69 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, LNP는 약 6의 N/P 비를 갖는다.
실시형태 A71은 실시형태 A70의 방법 또는 조성물이되, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 9 몰-%의 중성 지질, 예컨대, DSPC; 약 3 몰-%의 스텔스 지질, 예컨대, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG를 포함하며, 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질, 예컨대, 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
실시형태 A72는 실시형태 A64 내지 A71 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 아민 지질은 지질 A이다.
실시형태 A73은 실시형태 A64 내지 A72 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 중성 지질은 DSPC이다.
실시형태 A74는 실시형태 A62 내지 A73 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
실시형태 A75는 실시형태 A60 내지 A74 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 보조 지질은 콜레스테롤이다.
실시형태 A76은 실시형태 A70의 방법 또는 조성물이되, LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 지질 A; 약 9 몰-%의 DSPC; 약 3 몰-%의 PEG2k-DMG를 포함하며, 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이다.
실시형태 A77은 실시형태 A1 내지 A76 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리베이스이다.
실시형태 A78은 실시형태 A77의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9이다.
실시형태 A79는 실시형태 A1 내지 A78 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 변형된다.
실시형태 A80은 실시형태 A79의 방법 또는 조성물이되, 변형된 RNA-가이드된 DNA 결합제는 핵 국재화 신호(NLS)를 포함한다.
실시형태 A81은 실시형태 A1 내지 A80 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, RNA-가이드된 DNA 결합제는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas이다.
실시형태 A82는 선행하는 실시형태 A1 내지 A81 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다.
실시형태 A83은 실시형태 A2 내지 A82 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물은 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유를 감소시키거나 또는 방지한다.
실시형태 A84는 실시형태 A83의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유는 신경, 심장 또는 위장관이다.
실시형태 A85는 실시형태 A2 내지 A84 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 비-상동 말단 연결(NHEJ)은 TTR 유전자에서 DSB의 복구 동안 돌연변이를 유발한다.
실시형태 A86은 실시형태 A85의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, NHEJ는 TTR 유전자에서 DSB의 복구 동안 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발한다.
실시형태 A87은 실시형태 A86의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
실시형태 A88은 실시형태 A86의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 적어도 50%의 TTR 유전자에서 유도된다.
실시형태 A89는 실시형태 A88의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 프레임 쉬프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 또는 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99% 또는 99% 내지 100%의 TTR 유전자에서 유도된다.
실시형태 A90은 실시형태 A86 내지 A89 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 표적외 부위보다 적어도 50-배 이상 발생한다.
실시형태 A91은 실시형태 A90의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 TTR 유전자에서 표적외 부위보다 50-배 내지 150-배, 150-배 내지 500-배, 500-배 내지 1500-배, 1500-배 내지 5000-배, 5000-배 내지 15000-배, 15000-배 내지 30000-배 또는 30000-배 내지 60000-배 이상 발생한다.
실시형태 A92는 실시형태 A86 내지 A91 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 일차 인간 간세포에서 3개, 2개, 1개 또는 0개 이하의 표적외 부위(들)에서 발생하며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 A93은 실시형태 A92의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 Cas9-과발현 세포에서 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입이 발생하는 표적외 부위의 수보다 적은 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수에서 발생하며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 A94는 실시형태 A93의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, Cas9-과발현 세포는 Cas9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포이다.
실시형태 A95는 실시형태 A92 내지 A94 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수는 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석함으로써 결정되며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 A96은 실시형태 A92 내지 A94 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 일차 인간 간세포의 표적외 부위의 수는 Cas9 mRNA, 가이드 RNA 및 공여체 올리고뉴클레오타이드로 시험관내 형질감염된 일차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 삽입 검정에 의해 결정되며, 선택적으로 표적외 부위(들)는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
실시형태 A97은 실시형태 A1 내지 A36 또는 A39 내지 A96 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA의 서열은:
a) 서열번호 92 또는 104;
b) 서열번호 87, 89, 96 또는 113;
c) 서열번호 100, 102, 106, 111 또는 112; 또는
d) 서열번호 88, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 101, 103, 108 또는 109
이다.
실시형태 A98은 실시형태 A97의 방법 또는 조성물이되, 가이드 RNA는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하는 표적외 부위(들)에서 indel을 생성하지 않는다.
실시형태 A99는 실시형태 A2 내지 A98 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물을 투여하는 것은 대상체에서 TTR의 수준을 감소시킨다.
실시형태 A100은 실시형태 A99의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 적어도 50% 감소된다.
실시형태 A101은 실시형태 A100의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 또는 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99% 또는 99% 내지 100%까지 감소된다.
실시형태 A102는 실시형태 A100 또는 A101의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌척수액 또는 가래에서 측정된다.
실시형태 A103은 실시형태 A100 또는 A101의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 간, 맥락망막 및/또는 망막에서 측정된다.
실시형태 A104는 실시형태 A99 내지 A103 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, TTR의 수준은 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)을 통해 측정된다.
실시형태 A105는 실시형태 A2 내지 A104 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR을 갖는다.
실시형태 A106은 실시형태 A2 내지 A105 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 인간이다.
실시형태 A107은 실시형태 A105 또는 A106의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTRwt를 갖는다.
실시형태 A108은 실시형태 A105 또는 A106의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 유전성 ATTR을 갖는다.
실시형태 A109는 실시형태 A2 내지 A106 또는 A108 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 가족력이 있다.
실시형태 A110은 실시형태 A2 내지 A106 또는 A108 내지 A109 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 가족성 아밀로이드 다발신경병증(familial amyloid polyneuropathy)을 갖는다.
실시형태 A111은 실시형태 A2 내지 A110 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 신경 증상만을 또는 주로 ATTR의 신경 증상을 갖는다.
실시형태 A112는 실시형태 A2 내지 A111 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 가족성 아밀로이드 심근증을 갖는다.
실시형태 A113은 실시형태 A2 내지 A110 또는 A112 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 ATTR의 심장의 증상만을 또는 주로 ATTR의 심장의 증상을 갖는다.
실시형태 A114는 실시형태 A2 내지 A113 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V30 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 A115는 실시형태 A114의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, V30 돌연변이는 V30A, V30G, V30L 또는 V30M이다.
실시형태 A116은 실시형태 A2 내지 A113 중 어느 하나의 실시형태의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 T60 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 A117은 실시형태 A116의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, T60 돌연변이는 T60A이다.
실시형태 A118은 실시형태 A2 내지 A113 중 어느 하나의 실시형태의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V122 돌연변이를 갖는 TTR을 발현한다.
실시형태 A119는 실시형태 A118의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, V122 돌연변이는 V122A, V122I 또는 V122(-)이다.
실시형태 A120은 실시형태 A2 내지 A113 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 야생형 TTR을 발현한다.
실시형태 A121은 실시형태 A2 내지 A107 또는 A120 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 V30, T60 또는 V122 돌연변이를 갖는 TTR을 발현하지 않는다.
실시형태 A122는 실시형태 A2 내지 A107 또는 A120 내지 A121 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 병리학적 돌연변이를 갖는 TTR을 발현하지 않는다.
실시형태 A123은 실시형태 A122의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 야생형 TTR에 대해 동종접합이다.
실시형태 A124는 실시형태 A2 내지 A123 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 투여 후 대상체는 감각운동 신경병증의 증상에 개선, 안정화 또는 변화의 둔화가 있다.
실시형태 A125는 실시형태 A124의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 감각 신경병증의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화는 근전도, 신경 전도 테스트 또는 환자-보고 결과를 사용하여 측정된다.
실시형태 A126은 실시형태 A2 내지 A125 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 울혈성 심부전의 증상에 개선, 안정화 또는 변화의 둔화가 있다.
실시형태 A127은 실시형태 A126의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 울혈성 심부전의 개선, 안정화 또는 변화의 둔화는 심장 바이오마커 테스트, 폐 기능 테스트, 흉부 x-선 또는 심전도법을 사용하여 측정된다.
실시형태 A128은 실시형태 A2 내지 A127 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물 또는 약제학적 제형은 바이러스 벡터를 통해 투여된다.
실시형태 A129는 실시형태 A2 내지 A127 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 조성물 또는 약제학적 제형은 지질 나노입자를 통해 투여된다.
실시형태 A130은 실시형태 A2 내지 A129 중 어느 하나의 사용을 위한 방법 또는 조성물이되, 대상체는 조성물 또는 제형을 투여하기 전 TTR 유전자의 특정 돌연변이에 대해 테스트된다.
실시형태 A131은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5, 6, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 63, 65, 66, 68 또는 69이다.
실시형태 A132는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 5이다. 실시형태 A133은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 6이다. 실시형태 A134는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 7이다. 실시형태 A135는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 8이다. 실시형태 A136은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 9이다. 실시형태 A137은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 10이다. 실시형태 A138은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 11이다. 실시형태 A139는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 12이다. 실시형태 A140은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 13이다. 실시형태 A141은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 14이다. 실시형태 A142는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 15이다. 실시형태 A143은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 16이다. 실시형태 A144는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 17이다. 실시형태 A145는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 18이다. 실시형태 A146은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 19이다. 실시형태 A147은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 20이다. 실시형태 A148은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 21이다. 실시형태 A149는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 22이다. 실시형태 A150은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 23이다. 실시형태 A151은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 24이다. 실시형태 A152는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 25이다. 실시형태 A153은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 26이다. 실시형태 A154는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 27이다. 실시형태 A155는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 28이다. 실시형태 A156은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 29이다. 실시형태 A157은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 30이다. 실시형태 A158은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 31이다. 실시형태 A159는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 32이다. 실시형태 A160은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 33이다. 실시형태 A161은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 34이다. 실시형태 A162는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 35이다. 실시형태 A163은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 36이다. 실시형태 A164는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 37이다. 실시형태 A165는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 38이다. 실시형태 A166은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 39이다. 실시형태 A167은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 40이다. 실시형태 A168은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 41이다. 실시형태 A169는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 42이다. 실시형태 A170은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 43이다. 실시형태 A171은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 44이다. 실시형태 A172는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 45이다. 실시형태 A173은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 46이다. 실시형태 A174는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 47이다. 실시형태 A175는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 48이다. 실시형태 A176은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 49이다. 실시형태 A177은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 50이다. 실시형태 A178은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 51이다. 실시형태 A179는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 52이다. 실시형태 A180은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 53이다. 실시형태 A181은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 54이다. 실시형태 A182는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 55이다. 실시형태 A183은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 56이다. 실시형태 A184는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 57이다. 실시형태 A185는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 58이다. 실시형태 A186은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 59이다. 실시형태 A187은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 60이다. 실시형태 A188은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 61이다. 실시형태 A189는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 62이다. 실시형태 A190은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 63이다. 실시형태 A191은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 64이다. 실시형태 A192는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 65이다. 실시형태 A193은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 66이다. 실시형태 A194는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 67이다. 실시형태 A195는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 68이다. 실시형태 A196은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 69이다. 실시형태 A197은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 70이다. 실시형태 A198은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 71이다. 실시형태 A199는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 72이다. 실시형태 A200은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 74이다. 실시형태 A201은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 75이다. 실시형태 A202는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 76이다. 실시형태 A203은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 77이다. 실시형태 A204는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 78이다. 실시형태 A205는 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 80이다. 실시형태 A206은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 81이다. 실시형태 A207은 실시형태 A1 내지 A130 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이되, 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 서열은 서열번호 82이다. 실시형태 A208은 실시형태 A1 내지 A207 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 서열의 적어도 처음 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%에 걸쳐 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
실시형태 A209는 실시형태 A1 내지 A208 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태 A210은 실시형태 A1 내지 A209 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임의 코돈의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%는 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈이다.
실시형태 A211은 실시형태 A210의 조성물 또는 방법이되, 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈은 표 4에 열거된 코돈이다.
실시형태 A212는 실시형태 A210의 조성물 또는 방법이되, 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈은 표 5의 낮은 U 코돈 세트의 코돈이다.
실시형태 A213은 실시형태 A210의 조성물 또는 방법이되, 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈은 표 5의 낮은 A 코돈 세트의 코돈이다.
실시형태 A214는 실시형태 A210의 조성물 또는 방법이되, 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈은 표 5의 낮은 A/U 코돈 세트의 코돈이다.
실시형태 A215는 실시형태 A210의 조성물 또는 방법이되, 표 4, 표 5 또는 표 7에 열거된 코돈은 표 7에 열거된 코돈이다.
실시형태 A216은 실시형태 A1 내지 A215 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 101%, 102%, 103%, 105%, 110%, 115%, 120% 또는 123% 범위의 아데닌 함량을 갖는다.
실시형태 A217은 실시형태 A1 내지 A216 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 101%, 102%, 103%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% 또는 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
실시형태 A218은 실시형태 A1 내지 A217 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 핵산은 서열번호 232, 234, 236, 238, 241 또는 275 내지 277 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 5' UTR을 포함한다.
실시형태 A219는 실시형태 A1 내지 A218 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 핵산은 서열번호 233, 235, 237, 239 또는 240 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 3' UTR을 포함한다.
실시형태 A220은 실시형태 A1 내지 A219 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 핵산은 동일한 공급원으로부터의 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다
실시형태 A221은 실시형태 A1 내지 A220 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 핵산은 캡0, 캡1 및 캡2로부터 선택되는 5' 캡을 포함하는 mRNA이다.
실시형태 A222는 실시형태 A1 내지 A221 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 오픈 리딩 프레임은 서열번호 377에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태 A223은 실시형태 A1 내지 A222 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, 핵산은 우리딘의 적어도 10%가 변형된 우리딘으로 치환된 mRNA이다.
실시형태 A224는 실시형태 A223의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 하나 이상의 N1-메틸-슈도우리딘, 슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 또는 5-아이오도우리딘이다.
실시형태 A225는 실시형태 A223의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘 또는 5-메톡시우리딘 중 하나 또는 둘 다이다.
실시형태 A226은 실시형태 A223의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다.
실시형태 A227은 실시형태 A223의 조성물 또는 방법이되, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다.
실시형태 A228은 실시형태 A223 내지 A227 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, mRNA의 우리딘의 15% 내지 45%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 A229는 실시형태 A223 내지 A228 중 어느 하나의 조성물 또는 방법이되, mRNA의 우리딘의 적어도 20% 또는 적어도 30%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 A230은 실시형태 A229의 조성물 또는 방법이되, mRNA의 우리딘의 적어도 80% 또는 적어도 90%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 A231은 실시형태 A229의 조성물 또는 방법이되, mRNA의 우리딘의 100%는 변형된 우리딘으로 치환된다.
실시형태 A232는 ATTR을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 실시형태 A1 또는 A4 내지 A231 중 어느 하나에 따른 조성물 또는 제형의 용도이다.
서열 표
하기 서열 표는 본 명세서에 개시된 서열의 목록을 제공한다. DNA 서열(T를 포함)이 RNA와 관련하여 참조된다면, T는 U(문맥에 따라 수정되거나 또는 수정되지 않을 수 있음)로 대체되어야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지인 것으로 이해된다.
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SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TTR GENE EDITING AND TREATING ATTR AMYLOIDOSIS COMPRISING A CORTICOSTEROID OR USE THEREOF <130> WO 2020/198706 <140> PCT/US2020/025533 <141> 2020-03-27 <150> US 62/825,676 <151> 2019-03-28 <150> US 62/825,637 <151> 2019-03-28 <160> 396 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 transcript with 5 UTR of HSD, ORF corresponding to SEQ ID NO: 204, Kozak sequence, and 3 UTR of ALB <400> 1 gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcggatcc gccaccatgg acaagaagta cagcatcgga ctggacatcg gaacaaacag 120 cgtcggatgg gcagtcatca cagacgaata caaggtcccg agcaagaagt tcaaggtcct 180 gggaaacaca gacagacaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagcactgc tgttcgacag 240 cggagaaaca gcagaagcaa caagactgaa gagaacagca agaagaagat acacaagaag 300 aaagaacaga atctgctacc tgcaggaaat cttcagcaac gaaatggcaa aggtcgacga 360 cagcttcttc cacagactgg aagaaagctt cctggtcgaa gaagacaaga agcacgaaag 420 acacccgatc ttcggaaaca tcgtcgacga agtcgcatac cacgaaaagt acccgacaat 480 ctaccacctg agaaagaagc tggtcgacag cacagacaag gcagacctga gactgatcta 540 cctggcactg gcacacatga tcaagttcag aggacacttc ctgatcgaag gagacctgaa 600 cccggacaac agcgacgtcg acaagctgtt catccagctg gtccagacat acaaccagct 660 gttcgaagaa aacccgatca acgcaagcgg agtcgacgca aaggcaatcc tgagcgcaag 720 actgagcaag agcagaagac tggaaaacct gatcgcacag ctgccgggag aaaagaagaa 780 cggactgttc ggaaacctga tcgcactgag cctgggactg acaccgaact tcaagagcaa 840 cttcgacctg gcagaagacg caaagctgca gctgagcaag gacacatacg acgacgacct 900 ggacaacctg ctggcacaga tcggagacca gtacgcagac ctgttcctgg cagcaaagaa 960 cctgagcgac gcaatcctgc tgagcgacat cctgagagtc aacacagaaa tcacaaaggc 1020 accgctgagc gcaagcatga tcaagagata cgacgaacac caccaggacc tgacactgct 1080 gaaggcactg gtcagacagc agctgccgga aaagtacaag gaaatcttct tcgaccagag 1140 caagaacgga tacgcaggat acatcgacgg aggagcaagc caggaagaat tctacaagtt 1200 catcaagccg atcctggaaa agatggacgg aacagaagaa ctgctggtca agctgaacag 1260 agaagacctg ctgagaaagc agagaacatt cgacaacgga agcatcccgc accagatcca 1320 cctgggagaa ctgcacgcaa tcctgagaag acaggaagac ttctacccgt tcctgaagga 1380 caacagagaa aagatcgaaa agatcctgac attcagaatc ccgtactacg tcggaccgct 1440 ggcaagagga aacagcagat tcgcatggat gacaagaaag agcgaagaaa caatcacacc 1500 gtggaacttc gaagaagtcg tcgacaaggg agcaagcgca cagagcttca tcgaaagaat 1560 gacaaacttc gacaagaacc tgccgaacga aaaggtcctg ccgaagcaca gcctgctgta 1620 cgaatacttc acagtctaca acgaactgac aaaggtcaag tacgtcacag aaggaatgag 1680 aaagccggca ttcctgagcg gagaacagaa gaaggcaatc gtcgacctgc tgttcaagac 1740 aaacagaaag gtcacagtca agcagctgaa ggaagactac ttcaagaaga tcgaatgctt 1800 cgacagcgtc gaaatcagcg gagtcgaaga cagattcaac gcaagcctgg gaacatacca 1860 cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaagaaa acgaagacat 1920 cctggaagac atcgtcctga cactgacact gttcgaagac agagaaatga tcgaagaaag 1980 actgaagaca tacgcacacc tgttcgacga caaggtcatg aagcagctga agagaagaag 2040 atacacagga tggggaagac tgagcagaaa gctgatcaac 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ctgatcagag aagtcaaggt 2940 catcacactg aagagcaagc tggtcagcga cttcagaaag gacttccagt tctacaaggt 3000 cagagaaatc aacaactacc accacgcaca cgacgcatac ctgaacgcag tcgtcggaac 3060 agcactgatc aagaagtacc cgaagctgga aagcgaattc gtctacggag actacaaggt 3120 ctacgacgtc agaaagatga tcgcaaagag cgaacaggaa atcggaaagg caacagcaaa 3180 gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagaca gaaatcacac tggcaaacgg 3240 agaaatcaga aagagaccgc tgatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtctggga 3300 caagggaaga gacttcgcaa cagtcagaaa ggtcctgagc atgccgcagg tcaacatcgt 3360 caagaagaca gaagtccaga caggaggatt cagcaaggaa agcatcctgc cgaagagaaa 3420 cagcgacaag ctgatcgcaa gaaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gaggattcga 3480 cagcccgaca gtcgcataca gcgtcctggt cgtcgcaaag gtcgaaaagg gaaagagcaa 3540 gaagctgaag agcgtcaagg aactgctggg aatcacaatc atggaaagaa gcagcttcga 3600 aaagaacccg atcgacttcc tggaagcaaa gggatacaag gaagtcaaga aggacctgat 3660 catcaagctg ccgaagtaca gcctgttcga actggaaaac ggaagaaaga gaatgctggc 3720 aagcgcagga gaactgcaga agggaaacga actggcactg 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gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcggatcc atgcctaaga aaaagcggaa ggtcgacggg gataagaagt actcaatcgg 120 gctggatatc ggaactaatt ccgtgggttg ggcagtgatc acggatgaat acaaagtgcc 180 gtccaagaag ttcaaggtcc tggggaacac cgatagacac agcatcaaga aaaatctcat 240 cggagccctg ctgtttgact ccggcgaaac cgcagaagcg acccggctca aacgtaccgc 300 gaggcgacgc tacacccggc ggaagaatcg catctgctat ctgcaagaga tcttttcgaa 360 cgaaatggca aaggtcgacg acagcttctt ccaccgcctg gaagaatctt tcctggtgga 420 ggaggacaag aagcatgaac ggcatcctat ctttggaaac atcgtcgacg aagtggcgta 480 ccacgaaaag tacccgacca tctaccatct gcggaagaag ttggttgact caactgacaa 540 ggccgacctc agattgatct acttggccct cgcccatatg atcaaattcc gcggacactt 600 cctgatcgaa ggcgatctga accctgataa ctccgacgtg gataagcttt tcattcaact 660 ggtgcagacc tacaaccaac tgttcgaaga aaacccaatc aatgctagcg gcgtcgatgc 720 caaggccatc ctgtccgccc ggctgtcgaa gtcgcggcgc ctcgaaaacc tgatcgcaca 780 gctgccggga gagaaaaaga acggactttt cggcaacttg atcgctctct cactgggact 840 cactcccaat ttcaagtcca attttgacct 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tctcagccta ccatgagaat aagagaaaga 4260 aaatgaagat caatagctta ttcatctctt tttctttttc gttggtgtaa agccaacacc 4320 ctgtctaaaa aacataaatt tctttaatca ttttgcctct tttctctgtg cttcaattaa 4380 taaaaaatgg aaagaacctc gag 4403 <210> 3 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: modified sgRNA sequence (N may be any natural or non-natural nucleotide) <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-O-Me nucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> PS linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (29)..(40) <223> 2'-O-Me nucleotide <220> <221> modified_base <222> (69)..(100) <223> 2'-O-Me nucleotide <220> <221> modified_base <222> (97)..(100) <223> PS linkage <400> 3 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 4 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 30/30/39 poly-A sequence <400> 4 aaaaaaaaaa 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gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700 acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760 cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820 acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc 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215 gacaagaagu acagcaucgg acuggacauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320 aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380 uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440 gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500 cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560 aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620 ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680 aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740 ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800 aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860 acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980 cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040 uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100 cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160 gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220 aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280 gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340 aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400 gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460 auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520 gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580 aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640 uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700 aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760 gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820 aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880 cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940 caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000 ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060 aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180 cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240 acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300 acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360 agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420 agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480 gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540 cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600 agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660 aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720 uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780 cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840 cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900 aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960 gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020 guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080 cugagccagc ugggaggaga c 4101 <210> 216 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence of Cas9 nickase (without NLS) <400> 216 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile 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acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020 cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080 ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140 gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200 aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260 gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320 gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380 agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440 gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500 aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560 uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620 agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680 gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740 agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860 cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920 caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980 agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040 gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100 agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160 cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220 gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280 aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400 gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460 gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520 aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640 aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700 acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760 cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820 acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540 uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600 uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660 cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720 cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780 cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840 auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900 ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960 ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020 gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080 gaccugagcc agcugggagg agacuag 4107 <210> 218 <211> 4101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase coding sequence encoding SEQ ID NO: 16 using minimal uridine codons as listed in Table 3 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 218 gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320 aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380 uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440 gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500 cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560 aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620 ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680 aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740 ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800 aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860 acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980 cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040 uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100 cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160 gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220 aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280 gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340 aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400 gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460 auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520 gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580 aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640 uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700 aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760 gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820 aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880 cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940 caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000 ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060 aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180 cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240 acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300 acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360 agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420 agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480 gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540 cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600 agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660 aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720 uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780 cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840 cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900 aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960 gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020 guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080 cugagccagc ugggaggaga c 4101 <210> 219 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence of dCas9 (without NLS) <400> 219 Met Asp 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ugcugaaggc acuggucaga 1020 cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080 ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140 gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200 aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260 gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320 gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380 agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440 gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500 aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560 uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620 agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680 gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740 agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860 cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920 caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980 agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040 gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100 agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160 cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220 gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280 aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400 gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460 gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgacgca 2520 aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640 aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700 acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760 cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820 acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540 uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600 uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660 cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720 cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780 cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840 auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900 ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960 ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020 gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080 gaccugagcc agcugggagg agacuag 4107 <210> 221 <211> 4113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: dCas9 coding sequence encoding SEQ ID NO: 19 using minimal uridine codons as listed in Table 3 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 221 gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320 aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380 uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440 gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500 cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560 aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620 ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680 aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740 ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800 aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860 acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980 cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040 uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100 cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160 gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220 aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280 gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340 aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400 gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460 auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgacgcaauc 2520 gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580 aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640 uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700 aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760 gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820 aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880 cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940 caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000 ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060 aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180 cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240 acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300 acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360 agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420 agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480 gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540 cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600 agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660 aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720 uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780 cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840 cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900 aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960 gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020 guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080 cugagccagc ugggaggaga cggaggagga agc 4113 <210> 222 <211> 1392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence of Cas9 with two nuclear localization signals as the C-terminal amino acids <400> 222 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp 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Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 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Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro 1370 1375 1380 Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly 1385 1390 <210> 223 <211> 4179 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 mRNA ORF encoding SEQ ID NO: 22 using minimal uridine codons as listed in Table 3, with start and stop codons <400> 223 auggacaaga aguacagcau cggacuggac aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60 aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120 cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240 uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300 cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360 aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420 aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480 augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540 gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600 aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660 agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720 cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780 gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840 cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900 cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960 augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020 cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080 ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140 gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200 aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260 gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320 gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380 agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440 gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500 aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560 uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620 agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680 gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740 agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860 cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920 caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980 agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040 gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100 agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160 cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220 gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280 aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400 gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460 gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520 aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640 aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700 acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760 cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820 acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540 uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600 uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660 cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720 cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780 cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840 auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900 ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960 ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020 gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080 gaccugagcc agcugggagg agacggaagc ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac 4140 ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179 <210> 224 <211> 4173 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 coding sequence encoding SEQ ID NO: 23 using minimal uridine codons as listed in Table 3 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 224 gacaagaagu acagcaucgg acuggacauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320 aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380 uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440 gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500 cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560 aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620 ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680 aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740 ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800 aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860 acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980 cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040 uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100 cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160 gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220 aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280 gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340 aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400 gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460 auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520 gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580 aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640 uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700 aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760 gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820 aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880 cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940 caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000 ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060 aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180 cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240 acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300 acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360 agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420 agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480 gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540 cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600 agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660 aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720 uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780 cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840 cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900 aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960 gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020 guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080 cugagccagc ugggaggaga cggaagcgga agcccgaaga agaagagaaa ggucgacgga 4140 agcccgaaga agaagagaaa ggucgacagc gga 4173 <210> 225 <211> 1392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence of Cas9 nickase with two nuclear localization signals as the C-terminal amino acids <400> 225 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro 1370 1375 1380 Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly 1385 1390 <210> 226 <211> 4179 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase mRNA ORF encoding SEQ ID NO: 25 using minimal uridine codons as listed in Table 3, with start and stop codons <400> 226 auggacaaga aguacagcau cggacuggca aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60 aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120 cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240 uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300 cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360 aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420 aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480 augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540 gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600 aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660 agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720 cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780 gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840 cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900 cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960 augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020 cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080 ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140 gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200 aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260 gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320 gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380 agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440 gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500 aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560 uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620 agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680 gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740 agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860 cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920 caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980 agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040 gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100 agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160 cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220 gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280 aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400 gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460 gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520 aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640 aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700 acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760 cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820 acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540 uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600 uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660 cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720 cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780 cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840 auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900 ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960 ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020 gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080 gaccugagcc agcugggagg agacggaagc ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac 4140 ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179 <210> 227 <211> 4173 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase coding sequence encoding SEQ ID NO: 25 using minimal uridine codons as listed in Table 3 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 227 gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 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acugaagagc 2880 aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940 uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000 uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060 augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120 aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180 ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240 gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300 cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360 gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420 uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480 aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540 uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600 uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660 cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720 cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780 cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840 auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900 ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960 ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020 gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080 gaccugagcc agcugggagg agacggaagc ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac 4140 ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179 <210> 230 <211> 4173 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: dCas9 coding sequence encoding SEQ ID NO: 28 using minimal uridine codons as listed in Table 3 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 230 gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60 acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120 agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180 acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240 cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300 gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360 aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420 cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480 aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540 gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600 aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660 cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720 aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780 gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840 aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900 cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960 aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020 cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080 uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140 aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200 cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260 auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320 aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380 uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440 gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500 cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560 aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620 ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680 aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740 ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800 aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860 acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980 cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040 uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100 cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160 gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220 aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280 gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340 aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400 gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460 auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgacgcaauc 2520 gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580 aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640 uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700 aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760 gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820 aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880 cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940 caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000 ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060 aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180 cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240 acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300 acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360 agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420 agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480 gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540 cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600 agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660 aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720 uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780 cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840 cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900 aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960 gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020 guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080 cugagccagc ugggaggaga cggaagcgga agcccgaaga agaagagaaa ggucgacgga 4140 agcccgaaga agaagagaaa ggucgacagc gga 4173 <210> 231 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: T7 promoter <400> 231 taatacgact cactata 17 <210> 232 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Human 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Sequence <220> <223> Synthetic: Xenopus laevis beta-globin 3 UTR <400> 237 accagcctca agaacacccg aatggagtct ctaagctaca taataccaac ttacacttta 60 caaaatgttg tcccccaaaa tgtagccatt cgtatctgct cctaataaaa agaaagtttc 120 ttcacattct 130 <210> 238 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Bovine Growth Hormone 5 UTR <400> 238 cagggtcctg tggacagctc accagct 27 <210> 239 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Bovine Growth Hormone 3 UTR <400> 239 ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 60 tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg ca 102 <210> 240 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Mus musculus hemoglobin alpha, adult chain 1 (Hba-a1), 3UTR <400> 240 gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc atgcccttct tctctccctt gcacctgtac 60 ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg aag 93 <210> 241 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HSD17B4 5 UTR <400> 241 tcccgcagtc ggcgtccagc 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tcaaggtcct 180 gggaaacaca gacagacaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagcactgc tgttcgacag 240 cggagaaaca gcagaagcaa caagactgaa gagaacagca agaagaagat acacaagaag 300 aaagaacaga atctgctacc tgcaggaaat cttcagcaac gaaatggcaa aggtcgacga 360 cagcttcttc cacagactgg aagaaagctt cctggtcgaa gaagacaaga agcacgaaag 420 acacccgatc ttcggaaaca tcgtcgacga agtcgcatac cacgaaaagt acccgacaat 480 ctaccacctg agaaagaagc tggtcgacag cacagacaag gcagacctga gactgatcta 540 cctggcactg gcacacatga tcaagttcag aggacacttc ctgatcgaag gagacctgaa 600 cccggacaac agcgacgtcg acaagctgtt catccagctg gtccagacat acaaccagct 660 gttcgaagaa aacccgatca acgcaagcgg agtcgacgca aaggcaatcc tgagcgcaag 720 actgagcaag agcagaagac tggaaaacct gatcgcacag ctgccgggag aaaagaagaa 780 cggactgttc ggaaacctga tcgcactgag cctgggactg acaccgaact tcaagagcaa 840 cttcgacctg gcagaagacg caaagctgca gctgagcaag gacacatacg acgacgacct 900 ggacaacctg ctggcacaga tcggagacca gtacgcagac ctgttcctgg cagcaaagaa 960 cctgagcgac gcaatcctgc tgagcgacat cctgagagtc aacacagaaa tcacaaaggc 1020 accgctgagc gcaagcatga tcaagagata cgacgaacac caccaggacc tgacactgct 1080 gaaggcactg gtcagacagc agctgccgga aaagtacaag gaaatcttct tcgaccagag 1140 caagaacgga tacgcaggat acatcgacgg aggagcaagc caggaagaat tctacaagtt 1200 catcaagccg atcctggaaa agatggacgg aacagaagaa ctgctggtca agctgaacag 1260 agaagacctg ctgagaaagc agagaacatt cgacaacgga agcatcccgc accagatcca 1320 cctgggagaa ctgcacgcaa tcctgagaag acaggaagac ttctacccgt tcctgaagga 1380 caacagagaa aagatcgaaa agatcctgac attcagaatc ccgtactacg tcggaccgct 1440 ggcaagagga aacagcagat tcgcatggat gacaagaaag agcgaagaaa caatcacacc 1500 gtggaacttc gaagaagtcg tcgacaaggg agcaagcgca cagagcttca tcgaaagaat 1560 gacaaacttc gacaagaacc tgccgaacga aaaggtcctg ccgaagcaca gcctgctgta 1620 cgaatacttc acagtctaca acgaactgac aaaggtcaag tacgtcacag aaggaatgag 1680 aaagccggca ttcctgagcg gagaacagaa gaaggcaatc gtcgacctgc tgttcaagac 1740 aaacagaaag gtcacagtca agcagctgaa ggaagactac ttcaagaaga tcgaatgctt 1800 cgacagcgtc gaaatcagcg gagtcgaaga cagattcaac gcaagcctgg gaacatacca 1860 cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaagaaa acgaagacat 1920 cctggaagac atcgtcctga cactgacact gttcgaagac agagaaatga tcgaagaaag 1980 actgaagaca tacgcacacc tgttcgacga caaggtcatg aagcagctga agagaagaag 2040 atacacagga tggggaagac tgagcagaaa gctgatcaac ggaatcagag acaagcagag 2100 cggaaagaca atcctggact tcctgaagag cgacggattc gcaaacagaa acttcatgca 2160 gctgatccac gacgacagcc tgacattcaa ggaagacatc cagaaggcac aggtcagcgg 2220 acagggagac agcctgcacg aacacatcgc aaacctggca ggaagcccgg caatcaagaa 2280 gggaatcctg cagacagtca aggtcgtcga cgaactggtc aaggtcatgg gaagacacaa 2340 gccggaaaac atcgtcatcg aaatggcaag agaaaaccag acaacacaga agggacagaa 2400 gaacagcaga gaaagaatga agagaatcga agaaggaatc aaggaactgg gaagccagat 2460 cctgaaggaa cacccggtcg aaaacacaca gctgcagaac gaaaagctgt acctgtacta 2520 cctgcagaac ggaagagaca tgtacgtcga ccaggaactg gacatcaaca gactgagcga 2580 ctacgacgtc gaccacatcg tcccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 2640 ggtcctgaca agaagcgaca agaacagagg aaagagcgac aacgtcccga gcgaagaagt 2700 cgtcaagaag atgaagaact actggagaca gctgctgaac gcaaagctga tcacacagag 2760 aaagttcgac aacctgacaa aggcagagag aggaggactg agcgaactgg acaaggcagg 2820 attcatcaag agacagctgg tcgaaacaag acagatcaca aagcacgtcg cacagatcct 2880 ggacagcaga atgaacacaa agtacgacga aaacgacaag ctgatcagag aagtcaaggt 2940 catcacactg aagagcaagc tggtcagcga cttcagaaag gacttccagt tctacaaggt 3000 cagagaaatc aacaactacc accacgcaca cgacgcatac ctgaacgcag tcgtcggaac 3060 agcactgatc aagaagtacc cgaagctgga aagcgaattc gtctacggag actacaaggt 3120 ctacgacgtc agaaagatga tcgcaaagag cgaacaggaa atcggaaagg caacagcaaa 3180 gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagaca gaaatcacac tggcaaacgg 3240 agaaatcaga aagagaccgc tgatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtctggga 3300 caagggaaga gacttcgcaa cagtcagaaa ggtcctgagc atgccgcagg tcaacatcgt 3360 caagaagaca gaagtccaga caggaggatt cagcaaggaa agcatcctgc cgaagagaaa 3420 cagcgacaag ctgatcgcaa gaaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gaggattcga 3480 cagcccgaca gtcgcataca gcgtcctggt cgtcgcaaag gtcgaaaagg gaaagagcaa 3540 gaagctgaag agcgtcaagg aactgctggg aatcacaatc atggaaagaa gcagcttcga 3600 aaagaacccg atcgacttcc tggaagcaaa gggatacaag gaagtcaaga aggacctgat 3660 catcaagctg ccgaagtaca gcctgttcga actggaaaac ggaagaaaga gaatgctggc 3720 aagcgcagga gaactgcaga agggaaacga actggcactg ccgagcaagt acgtcaactt 3780 cctgtacctg gcaagccact acgaaaagct gaagggaagc ccggaagaca acgaacagaa 3840 gcagctgttc gtcgaacagc acaagcacta cctggacgaa atcatcgaac agatcagcga 3900 attcagcaag agagtcatcc tggcagacgc aaacctggac aaggtcctga gcgcatacaa 3960 caagcacaga gacaagccga tcagagaaca ggcagaaaac atcatccacc tgttcacact 4020 gacaaacctg ggagcaccgg cagcattcaa gtacttcgac acaacaatcg acagaaagag 4080 atacacaagc acaaaggaag tcctggacgc aacactgatc caccagagca tcacaggact 4140 gtacgaaaca agaatcgacc tgagccagct gggaggagac ggaggaggaa gcccgaagaa 4200 gaagagaaag gtctagctag ccatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa 4260 gagaaagaaa atgaagatca atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag 4320 ccaacaccct gtctaaaaaa cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct 4380 tcaattaata aaaaatggaa agaacctcga g 4411 <210> 244 <211> 4405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 transcript with 5 UTR of HSD, ORF corresponding to SEQ ID NO: 4, and 3 UTR of ALB <400> 244 gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcggatcc atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg 120 atgggcagtc atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa 180 cacagacaga cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga 240 aacagcagaa gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa 300 cagaatctgc tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt 360 cttccacaga ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc 420 gatcttcgga aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca 480 cctgagaaag aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc 540 actggcacac atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga 600 caacagcgac gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga 660 agaaaacccg atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag 720 caagagcaga agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact 780 gttcggaaac ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga 840 cctggcagaa gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa 900 cctgctggca cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag 960 cgacgcaatc ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct 1020 gagcgcaagc atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc 1080 actggtcaga cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa 1140 cggatacgca ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa 1200 gccgatcctg gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga 1260 cctgctgaga aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg 1320 agaactgcac gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag 1380 agaaaagatc gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag 1440 aggaaacagc agattcgcat ggatgacaag aaagagcgaa gaaacaatca caccgtggaa 1500 cttcgaagaa gtcgtcgaca agggagcaag cgcacagagc ttcatcgaaa gaatgacaaa 1560 cttcgacaag aacctgccga acgaaaaggt cctgccgaag cacagcctgc tgtacgaata 1620 cttcacagtc tacaacgaac tgacaaaggt caagtacgtc acagaaggaa tgagaaagcc 1680 ggcattcctg agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag 1740 aaaggtcaca gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag 1800 cgtcgaaatc agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct 1860 gctgaagatc atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga 1920 agacatcgtc ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa 1980 gacatacgca cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac 2040 aggatgggga agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa 2100 gacaatcctg gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat 2160 ccacgacgac agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg 2220 agacagcctg cacgaacaca tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat 2280 cctgcagaca gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga 2340 aaacatcgtc atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag 2400 cagagaaaga atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa 2460 ggaacacccg gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca 2520 gaacggaaga gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga 2580 cgtcgaccac atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct 2640 gacaagaagc gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa 2700 gaagatgaag aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt 2760 cgacaacctg acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat 2820 caagagacag ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag 2880 cagaatgaac acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac 2940 actgaagagc aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga 3000 aatcaacaac taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact 3060 gatcaagaag tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga 3120 cgtcagaaag atgatcgcaa agagcgaaca ggaaatcgga aaggcaacag caaagtactt 3180 cttctacagc aacatcatga acttcttcaa gacagaaatc acactggcaa acggagaaat 3240 cagaaagaga ccgctgatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtct gggacaaggg 3300 aagagacttc gcaacagtca gaaaggtcct gagcatgccg caggtcaaca tcgtcaagaa 3360 gacagaagtc cagacaggag gattcagcaa ggaaagcatc ctgccgaaga gaaacagcga 3420 caagctgatc gcaagaaaga aggactggga cccgaagaag tacggaggat tcgacagccc 3480 gacagtcgca tacagcgtcc tggtcgtcgc aaaggtcgaa aagggaaaga gcaagaagct 3540 gaagagcgtc aaggaactgc tgggaatcac aatcatggaa agaagcagct tcgaaaagaa 3600 cccgatcgac ttcctggaag caaagggata caaggaagtc aagaaggacc tgatcatcaa 3660 gctgccgaag tacagcctgt tcgaactgga aaacggaaga aagagaatgc tggcaagcgc 3720 aggagaactg cagaagggaa acgaactggc actgccgagc aagtacgtca acttcctgta 3780 cctggcaagc cactacgaaa agctgaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagct 3840 gttcgtcgaa cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gaacagatca gcgaattcag 3900 caagagagtc atcctggcag acgcaaacct ggacaaggtc ctgagcgcat acaacaagca 3960 cagagacaag ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa 4020 cctgggagca ccggcagcat tcaagtactt cgacacaaca atcgacagaa agagatacac 4080 aagcacaaag gaagtcctgg acgcaacact gatccaccag agcatcacag gactgtacga 4140 aacaagaatc gacctgagcc agctgggagg agacggagga ggaagcccga agaagaagag 4200 aaaggtctag ctagccatca catttaaaag catctcagcc taccatgaga ataagagaaa 4260 gaaaatgaag atcaatagct tattcatctc tttttctttt tcgttggtgt aaagccaaca 4320 ccctgtctaa aaaacataaa tttctttaat cattttgcct cttttctctg tgcttcaatt 4380 aataaaaaat ggaaagaacc tcgag 4405 <210> 245 <400> 245 000 <210> 246 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF with splice junctions removed; 12.75% U content <400> 250 atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60 atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120 cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccaccgg 300 ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420 aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480 atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga caacagcgac 540 gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga agaaaacccg 600 atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag caagagcaga 660 agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact gttcggaaac 720 ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga cctggcagaa 780 gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa cctgctggca 840 cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag cgacgcaatc 900 ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct gagcgcaagc 960 atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc actggtcaga 1020 cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa cggatacgca 1080 ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140 gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga cctgctgaga 1200 aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg agaactgcac 1260 gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag agaaaagatc 1320 gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag aggaaacagc 1380 agattcgcat ggatgacaag aaagagcgaa gaaacaatca caccgtggaa cttcgaagaa 1440 gtcgtcgaca agggagcaag cgcacagagc ttcatcgaaa gaatgacaaa cttcgacaag 1500 aacctgccga acgaaaaggt cctgccgaag cacagcctgc tgtacgaata cttcacagtc 1560 tacaacgaac tgacaaaggt caagtacgtc acagaaggaa tgagaaagcc ggcattcctg 1620 agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag aaaggtcaca 1680 gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag cgtcgaaatc 1740 agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga agacatcgtc 1860 ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa gacatacgca 1920 cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac aggatgggga 1980 agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa gacaatcctg 2040 gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg agacagcctg 2160 cacgaacaca tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat cctgcagaca 2220 gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga aaacatcgtc 2280 atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa ggaacacccg 2400 gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca aaacggaaga 2460 gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga cgtcgaccac 2520 atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640 aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt cgacaacctg 2700 acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat caagagacag 2760 ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag cagaatgaac 2820 acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac actgaagagc 2880 aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga aatcaacaac 2940 taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact gatcaagaag 3000 tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060 atgatcgcaa agagcgaaca ggaaatcgga aaggcaacag caaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gacagaaatc acactggcaa acggagaaat cagaaagaga 3180 ccgctgatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtct gggacaaggg aagagacttc 3240 gcaacagtca gaaaggtcct gagcatgccg caggtcaaca tcgtcaagaa gacagaagtc 3300 cagacaggag gattcagcaa ggaaagcatc ctgccgaaga gaaacagcga caagctgatc 3360 gcaagaaaga aggactggga cccgaagaag tacggaggat tcgacagccc gacagtcgca 3420 tacagcgtcc tggtcgtcgc aaaggtcgaa aagggaaaga gcaagaagct gaagagcgtc 3480 aaggaactgc tgggaatcac aatcatggaa agaagcagct tcgaaaagaa cccgatcgac 3540 ttcctggaag caaagggata caaggaagtc aagaaggacc tgatcatcaa gctgccgaag 3600 tacagcctgt tcgaactgga aaacggaaga aagagaatgc tggcaagcgc aggagaactg 3660 cagaagggaa acgaactggc actgccgagc aagtacgtca acttcctgta cctggcaagc 3720 cactacgaaa agctgaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagct gttcgtcgaa 3780 cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gaacagatca gcgaattcag caagagagtc 3840 atcctggcag acgcaaacct ggacaaggtc ctgagcgcat acaacaagca cagagacaag 3900 ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa cctgggagca 3960 ccggcagcat tcaagtactt cgacacaaca atcgacagaa agagatacac aagcacaaag 4020 gaagtcctgg acgcaacact gatccaccag agcatcacag gactgtacga aacaagaatc 4080 gacctgagcc agctgggagg agacggagga ggaagcccga agaagaagag aaaggtctag 4140 <210> 251 <211> 4411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 transcript with 5 UTR of HSD, ORF corresponding to SEQ ID NO: 50, Kozak sequence, and 3 UTR of ALB <400> 251 gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcggatcc gccaccatgg acaagaagta cagcatcgga ctggacatcg gaacaaacag 120 cgtcggatgg gcagtcatca cagacgaata caaggtcccg agcaagaagt tcaaggtcct 180 gggaaacaca gacagacaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagcactgc tgttcgacag 240 cggagaaaca gcagaagcaa caagactgaa gagaacagca agaagaagat acacaagaag 300 aaagaacaga atctgctacc tgcaggaaat cttcagcaac gaaatggcaa aggtcgacga 360 cagcttcttc caccggctgg aagaaagctt cctggtcgaa gaagacaaga agcacgaaag 420 acacccgatc ttcggaaaca tcgtcgacga agtcgcatac cacgaaaagt acccgacaat 480 ctaccacctg agaaagaagc tggtcgacag cacagacaag gcagacctga gactgatcta 540 cctggcactg gcacacatga tcaagttcag aggacacttc ctgatcgaag gagacctgaa 600 cccggacaac agcgacgtcg acaagctgtt catccagctg gtccagacat acaaccagct 660 gttcgaagaa aacccgatca acgcaagcgg agtcgacgca aaggcaatcc tgagcgcaag 720 actgagcaag agcagaagac tggaaaacct gatcgcacag ctgccgggag aaaagaagaa 780 cggactgttc ggaaacctga tcgcactgag cctgggactg acaccgaact tcaagagcaa 840 cttcgacctg gcagaagacg caaagctgca gctgagcaag gacacatacg acgacgacct 900 ggacaacctg ctggcacaga tcggagacca gtacgcagac ctgttcctgg cagcaaagaa 960 cctgagcgac gcaatcctgc tgagcgacat cctgagagtc aacacagaaa tcacaaaggc 1020 accgctgagc gcaagcatga tcaagagata cgacgaacac caccaggacc tgacactgct 1080 gaaggcactg gtcagacagc agctgccgga aaagtacaag gaaatcttct tcgaccagag 1140 caagaacgga tacgcaggat acatcgacgg aggagcaagc caggaagaat tctacaagtt 1200 catcaagccg atcctggaaa agatggacgg aacagaagaa ctgctggtca agctgaacag 1260 agaagacctg ctgagaaagc agagaacatt cgacaacgga agcatcccgc accagatcca 1320 cctgggagaa ctgcacgcaa tcctgagaag acaggaagac ttctacccgt tcctgaagga 1380 caacagagaa aagatcgaaa agatcctgac attcagaatc ccgtactacg tcggaccgct 1440 ggcaagagga aacagcagat tcgcatggat gacaagaaag agcgaagaaa caatcacacc 1500 gtggaacttc gaagaagtcg tcgacaaggg agcaagcgca cagagcttca tcgaaagaat 1560 gacaaacttc gacaagaacc tgccgaacga aaaggtcctg ccgaagcaca gcctgctgta 1620 cgaatacttc acagtctaca acgaactgac aaaggtcaag tacgtcacag aaggaatgag 1680 aaagccggca ttcctgagcg gagaacagaa gaaggcaatc gtcgacctgc tgttcaagac 1740 aaacagaaag gtcacagtca agcagctgaa ggaagactac ttcaagaaga tcgaatgctt 1800 cgacagcgtc gaaatcagcg gagtcgaaga cagattcaac gcaagcctgg gaacatacca 1860 cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaagaaa acgaagacat 1920 cctggaagac atcgtcctga cactgacact gttcgaagac agagaaatga tcgaagaaag 1980 actgaagaca tacgcacacc tgttcgacga caaggtcatg aagcagctga agagaagaag 2040 atacacagga tggggaagac tgagcagaaa gctgatcaac ggaatcagag acaagcagag 2100 cggaaagaca atcctggact tcctgaagag cgacggattc gcaaacagaa acttcatgca 2160 gctgatccac gacgacagcc tgacattcaa ggaagacatc cagaaggcac aggtcagcgg 2220 acagggagac agcctgcacg aacacatcgc aaacctggca ggaagcccgg caatcaagaa 2280 gggaatcctg cagacagtca aggtcgtcga cgaactggtc aaggtcatgg gaagacacaa 2340 gccggaaaac atcgtcatcg aaatggcaag agaaaaccag acaacacaga agggacagaa 2400 gaacagcaga gaaagaatga agagaatcga agaaggaatc aaggaactgg gaagccagat 2460 cctgaaggaa cacccggtcg aaaacacaca gctgcagaac gaaaagctgt acctgtacta 2520 cctgcaaaac ggaagagaca tgtacgtcga ccaggaactg gacatcaaca gactgagcga 2580 ctacgacgtc gaccacatcg tcccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 2640 ggtcctgaca agaagcgaca agaacagagg aaagagcgac aacgtcccga gcgaagaagt 2700 cgtcaagaag atgaagaact actggagaca gctgctgaac gcaaagctga tcacacagag 2760 aaagttcgac aacctgacaa aggcagagag aggaggactg agcgaactgg acaaggcagg 2820 attcatcaag agacagctgg tcgaaacaag acagatcaca aagcacgtcg cacagatcct 2880 ggacagcaga atgaacacaa agtacgacga aaacgacaag ctgatcagag aagtcaaggt 2940 catcacactg aagagcaagc tggtcagcga cttcagaaag gacttccagt tctacaaggt 3000 cagagaaatc aacaactacc accacgcaca cgacgcatac ctgaacgcag tcgtcggaac 3060 agcactgatc aagaagtacc cgaagctgga aagcgaattc gtctacggag actacaaggt 3120 ctacgacgtc agaaagatga tcgcaaagag cgaacaggaa atcggaaagg caacagcaaa 3180 gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagaca gaaatcacac tggcaaacgg 3240 agaaatcaga aagagaccgc tgatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtctggga 3300 caagggaaga gacttcgcaa cagtcagaaa ggtcctgagc atgccgcagg tcaacatcgt 3360 caagaagaca gaagtccaga caggaggatt cagcaaggaa agcatcctgc cgaagagaaa 3420 cagcgacaag ctgatcgcaa gaaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gaggattcga 3480 cagcccgaca gtcgcataca gcgtcctggt cgtcgcaaag gtcgaaaagg gaaagagcaa 3540 gaagctgaag agcgtcaagg aactgctggg aatcacaatc atggaaagaa gcagcttcga 3600 aaagaacccg atcgacttcc tggaagcaaa gggatacaag gaagtcaaga aggacctgat 3660 catcaagctg ccgaagtaca gcctgttcga actggaaaac ggaagaaaga gaatgctggc 3720 aagcgcagga gaactgcaga agggaaacga actggcactg ccgagcaagt acgtcaactt 3780 cctgtacctg gcaagccact acgaaaagct gaagggaagc ccggaagaca acgaacagaa 3840 gcagctgttc gtcgaacagc acaagcacta cctggacgaa atcatcgaac agatcagcga 3900 attcagcaag agagtcatcc tggcagacgc aaacctggac aaggtcctga gcgcatacaa 3960 caagcacaga gacaagccga tcagagaaca ggcagaaaac atcatccacc tgttcacact 4020 gacaaacctg ggagcaccgg cagcattcaa gtacttcgac acaacaatcg acagaaagag 4080 atacacaagc acaaaggaag tcctggacgc aacactgatc caccagagca tcacaggact 4140 gtacgaaaca agaatcgacc tgagccagct gggaggagac ggaggaggaa gcccgaagaa 4200 gaagagaaag gtctagctag ccatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa 4260 gagaaagaaa atgaagatca atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag 4320 ccaacaccct gtctaaaaaa cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct 4380 tcaattaata aaaaatggaa agaacctcga g 4411 <210> 252 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF with minimal uridine codons frequently used in humans in general; 12.75% U content <400> 252 atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgacaga 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccaccagac tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agagacaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgagactga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tcagaggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg ccagactgag caagagcaga 660 agactggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900 ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgccagc 960 atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgaga 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga acagagagga cctgctgaga 1200 aagcagagaa ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctga gaagacagga ggacttctac cccttcctga aggacaacag agagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttcag aatcccctac tacgtgggcc ccctggccag aggcaacagc 1380 agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgaga gaatgaccaa cttcgacaag 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gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gaccagaatc 4080 gacctgagcc agctgggcgg cgacggcggc ggcagcccca agaagaagag aaaggtgtga 4140 <210> 253 <211> 4411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 transcript with 5 UTR of HSD, ORF corresponding to SEQ ID NO: 52, Kozak sequence, and 3 UTR of ALB <400> 253 gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcggatcc gccaccatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 120 cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc agcaagaagt tcaaggtgct 180 gggcaacacc gacagacaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 240 cggcgagacc gccgaggcca ccagactgaa gagaaccgcc agaagaagat acaccagaag 300 aaagaacaga atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 360 cagcttcttc cacagactgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 420 acaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt accccaccat 480 ctaccacctg agaaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga gactgatcta 540 cctggccctg gcccacatga tcaagttcag aggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 600 ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 660 gttcgaggag aaccccatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 720 actgagcaag agcagaagac tggagaacct gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa 780 cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa 840 cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 900 ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 960 cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc 1020 ccccctgagc gccagcatga tcaagagata cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 1080 gaaggccctg gtgagacagc agctgcccga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 1140 caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 1200 catcaagccc atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 1260 agaggacctg ctgagaaagc agagaacctt cgacaacggc agcatccccc accagatcca 1320 cctgggcgag ctgcacgcca tcctgagaag acaggaggac ttctacccct tcctgaagga 1380 caacagagag aagatcgaga agatcctgac cttcagaatc ccctactacg tgggccccct 1440 ggccagaggc aacagcagat tcgcctggat gaccagaaag agcgaggaga ccatcacccc 1500 ctggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagagaat 1560 gaccaacttc gacaagaacc tgcccaacga gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta 1620 cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 1680 aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 1740 caacagaaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 1800 cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga cagattcaac gccagcctgg gcacctacca 1860 cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 1920 cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agagagatga tcgaggagag 1980 actgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agagaagaag 2040 atacaccggc tggggcagac tgagcagaaa gctgatcaac ggcatcagag acaagcagag 2100 cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca 2160 gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 2220 ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc 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aaggtgctga gcgcctacaa 3960 caagcacaga gacaagccca tcagagagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 4020 gaccaacctg ggcgcccccg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acagaaagag 4080 atacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 4140 gtacgagacc agaatcgacc tgagccagct gggcggcgac ggcggcggca gccccaagaa 4200 gaagagaaag gtgtgactag ccatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa 4260 gagaaagaaa atgaagatca atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag 4320 ccaacaccct gtctaaaaaa cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct 4380 tcaattaata aaaaatggaa agaacctcga g 4411 <210> 254 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF with minimal uridine codons infrequently used in humans in general; 12.75% U content <400> 254 atggacaaaa aatacagcat agggctagac atagggacga acagcgtagg gtgggcggta 60 ataacggacg aatacaaagt accgagcaaa aaattcaaag tactagggaa cacggaccga 120 cacagcataa aaaaaaacct aataggggcg ctactattcg acagcgggga aacggcggaa 180 gcgacgcgac taaaacgaac ggcgcgacga cgatacacgc gacgaaaaaa ccgaatatgc 240 tacctacaag aaatattcag caacgaaatg gcgaaagtag acgacagctt cttccaccga 300 ctagaagaaa gcttcctagt agaagaagac aaaaaacacg aacgacaccc gatattcggg 360 aacatagtag acgaagtagc gtaccacgaa aaatacccga cgatatacca cctacgaaaa 420 aaactagtag acagcacgga caaagcggac ctacgactaa tatacctagc gctagcgcac 480 atgataaaat tccgagggca cttcctaata gaaggggacc taaacccgga caacagcgac 540 gtagacaaac tattcataca actagtacaa acgtacaacc aactattcga agaaaacccg 600 ataaacgcga gcggggtaga cgcgaaagcg atactaagcg cgcgactaag caaaagccga 660 cgactagaaa acctaatagc gcaactaccg ggggaaaaaa aaaacgggct attcgggaac 720 ctaatagcgc taagcctagg gctaacgccg aacttcaaaa gcaacttcga cctagcggaa 780 gacgcgaaac tacaactaag caaagacacg tacgacgacg acctagacaa cctactagcg 840 caaatagggg accaatacgc ggacctattc ctagcggcga aaaacctaag cgacgcgata 900 ctactaagcg acatactacg agtaaacacg gaaataacga aagcgccgct aagcgcgagc 960 atgataaaac gatacgacga acaccaccaa gacctaacgc tactaaaagc gctagtacga 1020 caacaactac cggaaaaata caaagaaata ttcttcgacc aaagcaaaaa 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agaggatacc tgtcgcagag 480 aaagaacgaa ggagaaacag cagacaagga actgggagca ctgctgaagg gagtcgcagg 540 aaacgcacac gcactgcaga caggagactt cagaacaccg gcagaactgg cactgaacaa 600 gttcgaaaag gaatcgggac acatcagaaa ccagagatcg gactactcgc acacattctc 660 gagaaaggac ctgcaggcag aactgatcct gctgttcgaa aagcagaagg aattcggaaa 720 cccgcacgtc tcgggaggac tgaaggaagg aatcgaaaca ctgctgatga cacagagacc 780 ggcactgtcg ggagacgcag tccagaagat gctgggacac tgcacattcg aaccggcaga 840 accgaaggca gcaaagaaca catacacagc agaaagattc atctggctga caaagctgaa 900 caacctgaga atcctggaac agggatcgga aagaccgctg acagacacag aaagagcaac 960 actgatggac gaaccgtaca gaaagtcgaa gctgacatac gcacaggcaa gaaagctgct 1020 gggactggaa gacacagcat tcttcaaggg actgagatac ggaaaggaca acgcagaagc 1080 atcgacactg atggaaatga aggcatacca cgcaatctcg agagcactgg aaaaggaagg 1140 actgaaggac aagaagtcgc cgctgaacct gtcgccggaa ctgcaggacg aaatcggaac 1200 agcattctcg ctgttcaaga cagacgaaga catcacagga agactgaagg acagaatcca 1260 gccggaaatc ctggaagcac tgctgaagca catctcgttc gacaagttcg tccagatctc 1320 gctgaaggca ctgagaagaa tcgtcccgct gatggaacag ggaaagagat acgacgaagc 1380 atgcgcagaa atctacggag accactacgg aaagaagaac acagaagaaa agatctacct 1440 gccgccgatc ccggcagacg aaatcagaaa cccggtcgtc ctgagagcac tgtcgcaggc 1500 aagaaaggtc atcaacggag tcgtcagaag atacggatcg ccggcaagaa tccacatcga 1560 aacagcaaga gaagtcggaa agtcgttcaa ggacagaaag gaaatcgaaa agagacagga 1620 agaaaacaga aaggacagag aaaaggcagc agcaaagttc agagaatact tcccgaactt 1680 cgtcggagaa ccgaagtcga aggacatcct gaagctgaga ctgtacgaac agcagcacgg 1740 aaagtgcctg tactcgggaa aggaaatcaa cctgggaaga ctgaacgaaa agggatacgt 1800 cgaaatcgac cacgcactgc cgttctcgag aacatgggac gactcgttca acaacaaggt 1860 cctggtcctg ggatcggaaa accagaacaa gggaaaccag acaccgtacg aatacttcaa 1920 cggaaaggac aactcgagag aatggcagga attcaaggca agagtcgaaa catcgagatt 1980 cccgagatcg aagaagcaga gaatcctgct gcagaagttc gacgaagacg gattcaagga 2040 aagaaacctg aacgacacaa gatacgtcaa cagattcctg tgccagttcg tcgcagacag 2100 aatgagactg acaggaaagg gaaagaagag agtcttcgca tcgaacggac agatcacaaa 2160 cctgctgaga ggattctggg gactgagaaa ggtcagagca gaaaacgaca gacaccacgc 2220 actggacgca gtcgtcgtcg catgctcgac agtcgcaatg cagcagaaga tcacaagatt 2280 cgtcagatac aaggaaatga acgcattcga cggaaagaca atcgacaagg aaacaggaga 2340 agtcctgcac cagaagacac acttcccgca gccgtgggaa ttcttcgcac aggaagtcat 2400 gatcagagtc ttcggaaagc cggacggaaa gccggaattc gaagaagcag acacactgga 2460 aaagctgaga acactgctgg cagaaaagct gtcgtcgaga ccggaagcag tccacgaata 2520 cgtcacaccg ctgttcgtct cgagagcacc gaacagaaag atgtcgggac agggacacat 2580 ggaaacagtc aagtcggcaa agagactgga cgaaggagtc tcggtcctga gagtcccgct 2640 gacacagctg aagctgaagg acctggaaaa gatggtcaac agagaaagag aaccgaagct 2700 gtacgaagca ctgaaggcaa gactggaagc acacaaggac gacccggcaa aggcattcgc 2760 agaaccgttc tacaagtacg acaaggcagg aaacagaaca cagcaggtca aggcagtcag 2820 agtcgaacag gtccagaaga caggagtctg ggtcagaaac cacaacggaa tcgcagacaa 2880 cgcaacaatg gtcagagtag acgtcttcga aaagggagac aagtactacc tggtcccgat 2940 ctactcgtgg caggtcgcaa agggaatcct gccggacaga gcagtcgtcc 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Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 292 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for SV40 NLS <400> 292 ccgaagaaga agagaaaggt c 21 <210> 293 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS1 <400> 293 ctggcagcaa agagaagcag aacaaca 27 <210> 294 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS2 <400> 294 caggcagcaa agagaagcag aacaaca 27 <210> 295 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS3 <400> 295 ccggcaccgg caaagagaga aagaacaaca 30 <210> 296 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS4 <400> 296 caggcagcaa agagaccgag aacaaca 27 <210> 297 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS5 <400> 297 agagcagcaa agagaccgag aacaaca 27 <210> 298 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS6 <400> 298 gcagcagcaa agagaagctg gagcatggca gca 33 <210> 299 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS7 <400> 299 gcagcagcaa agagagtctg gagcatggca ttc 33 <210> 300 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS8 <400> 300 gcagcagcaa agagaagctg gagcatggca ttc 33 <210> 301 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS9 <400> 301 gcagcagcaa agagaaagta cttcgcagca 30 <210> 302 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS10 <400> 302 agagcagcaa agagaaaggc attcgcagca 30 <210> 303 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for NLS11 <400> 303 agagcagcaa agagaaagta cttcgcagtc 30 <210> 304 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary coding sequence for alternate SV40 NLS <400> 304 ccgaagaaga agagaagagt c 21 <210> 305 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: exemplary Kozak sequence <400> 305 gccgccrcca ugg 13 <210> 306 <400> 306 000 <210> 307 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using long half life codons of Table 4, with start and stop codons <400> 307 atggacaaga agtactctat cggtttggac atcggtacca actctgtcgg ttgggccgtc 60 atcaccgacg aatacaaggt cccatctaag aagttcaagg tcttgggtaa caccgacaga 120 cactctatca agaagaactt gatcggtgcc ttgttgttcg actctggtga aaccgccgaa 180 gccaccagat tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacttgcaag aaatcttctc taacgaaatg gccaaggtcg acgactcttt cttccacaga 300 ttggaagaat ctttcttggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc aatcttcggt 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ctaccacgaa aagtacccaa ccatctacca cttgagaaag 420 aagttggtcg actctaccga caaggccgac ttgagattga tctacttggc cttggcccac 480 atgatcaagt tcagaggtca cttcttgatc gaaggtgact tgaacccaga caactctgac 540 gtcgacaagt tgttcatcca attggtccaa acctacaacc aattgttcga agaaaaccca 600 atcaacgcct ctggtgtcga cgccaaggcc atcttgtctg ccagattgtc taagagcaga 660 agattggaaa acttgatcgc ccaattgcca ggtgaaaaga agaacggttt gttcggtaac 720 ttgatcgcct tgtctttggg tttgacccca aacttcaagt ctaacttcga cttggccgaa 780 gacgccaagt tgcaattgtc taaggacacc tacgacgacg acttggacaa cttgttggcc 840 caaatcggtg accaatacgc cgacttgttc ttggccgcca agaacttgtc tgacgccatc 900 ttgttgtctg acatcttgag agtcaacacc gaaatcacca aggccccatt gtctgcctct 960 atgatcaaga gatacgacga acaccaccaa gacttgacct tgttgaaggc cttggtcaga 1020 caacaattgc cagaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc aatctaagaa cggttacgcc 1080 ggttacatcg acggtggtgc ctctcaagaa gaattctaca agttcatcaa gccaatcttg 1140 gaaaagatgg acggtaccga agaattgttg gtcaagttga acagagaaga cttgttgaga 1200 aagcaaagaa ccttcgacaa cggttctatc ccacaccaaa tccacttggg tgaattgcac 1260 gccatcttga gaagacaaga agacttctac ccattcttga aggacaacag agaaaagatc 1320 gaaaagatct tgaccttcag aatcccatac tacgtcggtc cattggccag aggtaacagc 1380 agattcgcct ggatgaccag aaagtctgaa gaaaccatca ccccatggaa cttcgaagaa 1440 gtcgtcgaca agggtgcctc tgcccaatct ttcatcgaaa gaatgaccaa cttcgacaag 1500 aacttgccaa acgaaaaggt cttgccaaag cactctttgt tgtacgaata cttcaccgtc 1560 tacaacgaat tgaccaaggt caagtacgtc accgaaggta tgagaaagcc agccttcttg 1620 tctggtgaac aaaagaaggc catcgtcgac ttgttgttca agaccaacag aaaggtcacc 1680 gtcaagcaat tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgactc tgtcgaaatc 1740 tctggtgtcg aagacagatt caacgcctct ttgggtacct accacgactt gttgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttctt ggacaacgaa gaaaacgaag acatcttgga agacatcgtc 1860 ttgaccttga ccttgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagattgaa gacctacgcc 1920 cacttgttcg acgacaaggt catgaagcaa ttgaagagaa gaagatacac cggttggggt 1980 agattgagca gaaagttgat caacggtatc agagacaagc aatctggtaa gaccatcttg 2040 gacttcttga agtctgacgg tttcgccaac agaaacttca tgcaattgat ccacgacgac 2100 tctttgacct tcaaggaaga catccaaaag gcccaagtct ctggtcaagg tgactctttg 2160 cacgaacaca tcgccaactt ggccggttct ccagccatca agaagggtat cttgcaaacc 2220 gtcaaggtcg tcgacgaatt ggtcaaggtc atgggtagac acaagccaga aaacatcgtc 2280 atcgaaatgg ccagagaaaa ccaaaccacc caaaagggtc aaaagaacag cagagaaaga 2340 atgaagagaa tcgaagaagg tatcaaggaa ttgggttctc aaatcttgaa ggaacaccca 2400 gtcgaaaaca cccaattgca aaacgaaaag ttgtacttgt actacttgca aaacggtaga 2460 gacatgtacg tcgaccaaga attggacatc aacagattgt ctgactacga cgtcgaccac 2520 atcgtcccac aatctttctt gaaggacgac tctatcgaca acaaggtctt gaccagatct 2580 gacaagaaca gaggtaagtc tgacaacgtc ccatctgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640 aactactgga gacaattgtt gaacgccaag ttgatcaccc aaagaaagtt cgacaacttg 2700 accaaggccg aaagaggtgg tttgtctgaa ttggacaagg ccggtttcat caagagacaa 2760 ttggtcgaaa ccagacaaat caccaagcac gtcgcccaaa tcttggacag cagaatgaac 2820 accaagtacg acgaaaacga caagttgatc agagaagtca aggtcatcac cttgaagtct 2880 aagttggtct ctgacttcag aaaggacttc caattctaca aggtcagaga aatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacttgaac gccgtcgtcg gtaccgcctt gatcaagaag 3000 tacccaaagt tggaatctga attcgtctac ggtgactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060 atgatcgcca agtctgaaca agaaatcggt aaggccaccg ccaagtactt cttctactct 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accttggcca acggtgaaat cagaaagaga 3180 ccattgatcg aaaccaacgg tgaaaccggt gaaatcgtct gggacaaggg tagagacttc 3240 gccaccgtca gaaaggtctt gtctatgcca caagtcaaca tcgtcaagaa gaccgaagtc 3300 caaaccggtg gtttctctaa ggaatctatc ttgccaaaga gaaactctga caagttgatc 3360 gccagaaaga aggactggga cccaaagaag tacggtggtt tcgactctcc aaccgtcgcc 3420 tactctgtct tggtcgtcgc caaggtcgaa aagggtaagt ctaagaagtt gaagtctgtc 3480 aaggaattgt tgggtatcac catcatggaa agatcttctt tcgaaaagaa cccaatcgac 3540 ttcttggaag ccaagggtta caaggaagtc aagaaggact tgatcatcaa gttgccaaag 3600 tactctttgt tcgaattgga aaacggtaga aagagaatgt tggcctctgc cggtgaattg 3660 caaaagggta acgaattggc cttgccatct aagtacgtca acttcttgta cttggcctct 3720 cactacgaaa agttgaaggg ttctccagaa gacaacgaac aaaagcaatt gttcgtcgaa 3780 caacacaagc actacttgga cgaaatcatc gaacaaatct ctgaattctc taagagagtc 3840 atcttggccg acgccaactt ggacaaggtc ttgtctgcct acaacaagca cagagacaag 3900 ccaatcagag aacaagccga aaacatcatc cacttgttca ccttgaccaa cttgggtgcc 3960 ccagccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgacagaa agagatacac ctctaccaag 4020 gaagtcttgg acgccacctt gatccaccaa tctatcaccg gtttgtacga aaccagaatc 4080 gacttgtctc aattgggtgg tgacggtggt ggttctccaa agaagaagag aaaggtctaa 4140 <210> 308 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using U rich codons of Table 4, with start and stop codons <400> 308 atggataaaa aatattctat tggtttagat attggtacta attctgttgg ttgggctgtt 60 attactgatg aatataaagt tccttctaaa aaatttaaag ttttaggtaa tactgatcgt 120 cattctatta aaaaaaattt aattggtgct ttattatttg attctggtga aactgctgaa 180 gctactcgtt taaaacgtac tgctcgtcgt cgttatactc gtcgtaaaaa tcgtatttgt 240 tatttacaag aaattttttc taatgaaatg gctaaagttg atgattcttt ttttcatcgt 300 ttagaagaat cttttttagt tgaagaagat aaaaaacatg aacgtcatcc tatttttggt 360 aatattgttg atgaagttgc ttatcatgaa aaatatccta ctatttatca tttacgtaaa 420 aaattagttg attctactga taaagctgat ttacgtttaa tttatttagc tttagctcat 480 atgattaaat ttcgtggtca ttttttaatt gaaggtgatt taaatcctga taattctgat 540 gttgataaat tatttattca attagttcaa acttataatc aattatttga agaaaatcct 600 attaatgctt ctggtgttga tgctaaagct attttatctg ctcgtttatc taaatctcgt 660 cgtttagaaa atttaattgc tcaattacct ggtgaaaaaa aaaatggttt atttggtaat 720 ttaattgctt tatctttagg tttaactcct aattttaaat ctaattttga tttagctgaa 780 gatgctaaat tacaattatc taaagatact tatgatgatg atttagataa tttattagct 840 caaattggtg atcaatatgc tgatttattt ttagctgcta aaaatttatc tgatgctatt 900 ttattatctg atattttacg tgttaatact gaaattacta aagctccttt atctgcttct 960 atgattaaac gttatgatga acatcatcaa gatttaactt tattaaaagc tttagttcgt 1020 caacaattac ctgaaaaata taaagaaatt ttttttgatc aatctaaaaa tggttatgct 1080 ggttatattg atggtggtgc ttctcaagaa gaattttata aatttattaa acctatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga agaattatta gttaaattaa atcgtgaaga tttattacgt 1200 aaacaacgta cttttgataa tggttctatt cctcatcaaa ttcatttagg tgaattacat 1260 gctattttac gtcgtcaaga agatttttat ccttttttaa aagataatcg tgaaaaaatt 1320 gaaaaaattt taacttttcg tattccttat tatgttggtc ctttagctcg tggtaattct 1380 cgttttgctt ggatgactcg taaatctgaa gaaactatta ctccttggaa ttttgaagaa 1440 gttgttgata aaggtgcttc tgctcaatct tttattgaac gtatgactaa ttttgataaa 1500 aatttaccta atgaaaaagt tttacctaaa cattctttat tatatgaata ttttactgtt 1560 tataatgaat taactaaagt taaatatgtt actgaaggta tgcgtaaacc tgctttttta 1620 tctggtgaac aaaaaaaagc tattgttgat ttattattta aaactaatcg taaagttact 1680 gttaaacaat taaaagaaga ttattttaaa aaaattgaat gttttgattc tgttgaaatt 1740 tctggtgttg aagatcgttt taatgcttct ttaggtactt atcatgattt attaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt agataatgaa gaaaatgaag atattttaga agatattgtt 1860 ttaactttaa ctttatttga agatcgtgaa atgattgaag aacgtttaaa aacttatgct 1920 catttatttg atgataaagt tatgaaacaa ttaaaacgtc gtcgttatac tggttggggt 1980 cgtttatctc gtaaattaat taatggtatt cgtgataaac aatctggtaa aactatttta 2040 gattttttaa aatctgatgg ttttgctaat cgtaatttta tgcaattaat tcatgatgat 2100 tctttaactt ttaaagaaga tattcaaaaa gctcaagttt ctggtcaagg tgattcttta 2160 catgaacata ttgctaattt agctggttct cctgctatta aaaaaggtat tttacaaact 2220 gttaaagttg ttgatgaatt agttaaagtt atgggtcgtc ataaacctga aaatattgtt 2280 attgaaatgg ctcgtgaaaa tcaaactact caaaaaggtc aaaaaaattc tcgtgaacgt 2340 atgaaacgta ttgaagaagg tattaaagaa ttaggttctc aaattttaaa agaacatcct 2400 gttgaaaata ctcaattaca aaatgaaaaa ttatatttat attatttaca aaatggtcgt 2460 gatatgtatg ttgatcaaga attagatatt aatcgtttat ctgattatga tgttgatcat 2520 attgttcctc aatctttttt aaaagatgat tctattgata ataaagtttt aactcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc tgataatgtt ccttctgaag aagttgttaa aaaaatgaaa 2640 aattattggc gtcaattatt aaatgctaaa ttaattactc aacgtaaatt tgataattta 2700 actaaagctg aacgtggtgg tttatctgaa ttagataaag ctggttttat taaacgtcaa 2760 ttagttgaaa ctcgtcaaat tactaaacat gttgctcaaa ttttagattc tcgtatgaat 2820 actaaatatg atgaaaatga taaattaatt cgtgaagtta aagttattac tttaaaatct 2880 aaattagttt ctgattttcg taaagatttt caattttata aagttcgtga aattaataat 2940 tatcatcatg ctcatgatgc ttatttaaat gctgttgttg gtactgcttt aattaaaaaa 3000 tatcctaaat tagaatctga atttgtttat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta aatctgaaca agaaattggt aaagctactg ctaaatattt tttttattct 3120 aatattatga atttttttaa aactgaaatt actttagcta atggtgaaat tcgtaaacgt 3180 cctttaattg aaactaatgg tgaaactggt gaaattgttt gggataaagg tcgtgatttt 3240 gctactgttc gtaaagtttt atctatgcct caagttaata ttgttaaaaa aactgaagtt 3300 caaactggtg gtttttctaa agaatctatt ttacctaaac gtaattctga taaattaatt 3360 gctcgtaaaa aagattggga tcctaaaaaa tatggtggtt ttgattctcc tactgttgct 3420 tattctgttt tagttgttgc taaagttgaa aaaggtaaat ctaaaaaatt aaaatctgtt 3480 aaagaattat taggtattac tattatggaa cgttcttctt ttgaaaaaaa tcctattgat 3540 tttttagaag ctaaaggtta taaagaagtt aaaaaagatt taattattaa attacctaaa 3600 tattctttat ttgaattaga aaatggtcgt aaacgtatgt tagcttctgc tggtgaatta 3660 caaaaaggta atgaattagc tttaccttct aaatatgtta attttttata tttagcttct 3720 cattatgaaa aattaaaagg ttctcctgaa gataatgaac aaaaacaatt atttgttgaa 3780 caacataaac attatttaga tgaaattatt gaacaaattt ctgaattttc taaacgtgtt 3840 attttagctg atgctaattt agataaagtt ttatctgctt ataataaaca tcgtgataaa 3900 cctattcgtg aacaagctga aaatattatt catttattta ctttaactaa tttaggtgct 3960 cctgctgctt ttaaatattt tgatactact attgatcgta aacgttatac ttctactaaa 4020 gaagttttag atgctacttt aattcatcaa tctattactg gtttatatga aactcgtatt 4080 gatttatctc aattaggtgg tgatggtggt ggttctccta aaaaaaaacg taaagtttga 4140 <210> 309 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using low G codons of Table 4, with start and stop codons <400> 309 atggacaaaa aatactccat cggcctcgac atcggcacca actccgtcgg ctgggccgtc 60 atcaccgacg aatacaaagt cccctccaaa aaattcaaag tcctcggcaa caccgacaga 120 cactccatca aaaaaaacct catcggcgcc ctcctcttcg actccggcga aaccgccgaa 180 gccaccagac tcaaaagaac cgccagaaga agatacacca gaagaaaaaa cagaatctgc 240 tacctccaag aaatcttctc caacgaaatg gccaaagtcg acgactcctt cttccacaga 300 ctcgaagaat ccttcctcgt cgaagaagac aaaaaacacg aaagacaccc catcttcggc 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ctaccacgaa aaatacccca ccatctacca cctcagaaaa 420 aaactcgtcg actccaccga caaagccgac ctcagactca tctacctcgc cctcgcccac 480 atgatcaaat tcagaggcca cttcctcatc gaaggcgacc tcaaccccga caactccgac 540 gtcgacaaac tcttcatcca actcgtccaa acctacaacc aactcttcga agaaaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtcga cgccaaagcc atcctctccg ccagactctc caaatccaga 660 agactcgaaa acctcatcgc ccaactcccc ggcgaaaaaa aaaacggcct cttcggcaac 720 ctcatcgccc tctccctcgg cctcaccccc aacttcaaat ccaacttcga cctcgccgaa 780 gacgccaaac tccaactctc caaagacacc tacgacgacg acctcgacaa cctcctcgcc 840 caaatcggcg accaatacgc cgacctcttc ctcgccgcca aaaacctctc cgacgccatc 900 ctcctctccg acatcctcag agtcaacacc gaaatcacca aagcccccct ctccgcctcc 960 atgatcaaaa gatacgacga acaccaccaa gacctcaccc tcctcaaagc cctcgtcaga 1020 caacaactcc ccgaaaaata caaagaaatc ttcttcgacc aatccaaaaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc ctcccaagaa gaattctaca aattcatcaa acccatcctc 1140 gaaaaaatgg acggcaccga agaactcctc gtcaaactca acagagaaga cctcctcaga 1200 aaacaaagaa ccttcgacaa cggctccatc ccccaccaaa tccacctcgg cgaactccac 1260 gccatcctca gaagacaaga agacttctac cccttcctca aagacaacag agaaaaaatc 1320 gaaaaaatcc tcaccttcag aatcccctac tacgtcggcc ccctcgccag aggcaactcc 1380 agattcgcct ggatgaccag aaaatccgaa gaaaccatca ccccctggaa cttcgaagaa 1440 gtcgtcgaca aaggcgcctc cgcccaatcc ttcatcgaaa gaatgaccaa cttcgacaaa 1500 aacctcccca acgaaaaagt cctccccaaa cactccctcc tctacgaata cttcaccgtc 1560 tacaacgaac tcaccaaagt caaatacgtc accgaaggca tgagaaaacc cgccttcctc 1620 tccggcgaac aaaaaaaagc catcgtcgac ctcctcttca aaaccaacag aaaagtcacc 1680 gtcaaacaac tcaaagaaga ctacttcaaa aaaatcgaat gcttcgactc cgtcgaaatc 1740 tccggcgtcg aagacagatt caacgcctcc ctcggcacct accacgacct cctcaaaatc 1800 atcaaagaca aagacttcct cgacaacgaa gaaaacgaag acatcctcga agacatcgtc 1860 ctcaccctca ccctcttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactcaa aacctacgcc 1920 cacctcttcg acgacaaagt catgaaacaa ctcaaaagaa gaagatacac cggctggggc 1980 agactctcca gaaaactcat caacggcatc agagacaaac aatccggcaa aaccatcctc 2040 gacttcctca aatccgacgg 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tgctgggcaa caccgaccgg 120 cactccatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actccggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgactcctt cttccaccgg 300 ctggaggagt ccttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg actccaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc caagtcccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgtccctggg cctgaccccc aacttcaagt ccaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgtc caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900 ctgctgtccg acatcctgcg ggtgaacacc gagatcacca aggcccccct gtccgcctcc 960 atgatcaagc ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgg 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc ctcccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga ccttcgacaa cggctccatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc ggcggcagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg ggagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg gatcccctac tacgtgggcc ccctggcccg gggcaactcc 1380 cggttcgcct ggatgacccg gaagtccgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgcctc cgcccagtcc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cactccctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcggaagcc cgccttcctg 1620 tccggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaggtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgactc cgtggagatc 1740 tccggcgtgg aggaccggtt caacgcctcc ctgggcacct accacgacct 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gaagatgaag 2640 aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcggaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcggggcgg cctgtccgag ctggacaagg ccggcttcat caagcggcag 2760 ctggtggaga cccggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggactc ccggatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgggaggtga aggtgatcac cctgaagtcc 2880 aagctggtgt ccgacttccg gaaggacttc cagttctaca aggtgcggga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agtccgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctactcc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgggacttc 3240 gccaccgtgc ggaaggtgct gtccatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctgcccaagc ggaactccga caagctgatc 3360 gcccggaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgactcccc caccgtggcc 3420 tactccgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaagt ccaagaagct gaagtccgtg 3480 aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cggtcctcct tcgagaagaa ccccatcgac 3540 ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600 tactccctgt tcgagctgga gaacggccgg aagcggatgc tggcctccgc cggcgagctg 3660 cagaagggca acgagctggc cctgccctcc aagtacgtga acttcctgta cctggcctcc 3720 cactacgaga agctgaaggg ctcccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgggtg 3840 atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggacaag 3900 cccatccggg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960 cccgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgga agcggtacac ctccaccaag 4020 gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag tccatcaccg gcctgtacga gacccggatc 4080 gacctgtccc agctgggcgg cgacggctcc ggctccccca agaagaagcg gaaggtggac 4140 ggctccccca agaagaagcg gaaggtggac tccggctga 4179 <210> 314 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase ORF using low A codons of Table 4, with start and stop codons <400> 314 atggacaaga agtactccat cggcctggcc atcggcacca actccgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gccctccaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cactccatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actccggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgactcctt cttccaccgg 300 ctggaggagt ccttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg actccaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc caagtcccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgtccctggg cctgaccccc aacttcaagt ccaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgtc caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900 ctgctgtccg acatcctgcg ggtgaacacc gagatcacca aggcccccct gtccgcctcc 960 atgatcaagc ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgg 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc ctcccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga ccttcgacaa cggctccatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc ggcggcagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg ggagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg gatcccctac tacgtgggcc ccctggcccg gggcaactcc 1380 cggttcgcct ggatgacccg gaagtccgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgcctc cgcccagtcc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cactccctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcggaagcc cgccttcctg 1620 tccggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaggtgacc 1680 gtgaagcagc 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nickase ORF using low A codons of Table 4, with start and stop codons and no NLS <400> 315 atggacaaga agtactccat cggcctggcc atcggcacca actccgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gccctccaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cactccatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actccggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgactcctt cttccaccgg 300 ctggaggagt ccttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg actccaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc caagtcccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgtccctggg cctgaccccc aacttcaagt ccaacttcga cctggccgag 780 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tccggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaggtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgactc cgtggagatc 1740 tccggcgtgg aggaccggtt caacgcctcc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860 ctgaccctga ccctgttcga ggaccgggag atgatcgagg agcggctgaa gacctacgcc 1920 cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcggc ggcggtacac cggctggggc 1980 cggctgtccc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gaccatcctg 2040 gacttcctga agtccgacgg cttcgccaac cggaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 tccctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtgt ccggccaggg cgactccctg 2160 cacgagcaca tcgccaacct ggccggctcc cccgccatca agaagggcat cctgcagacc 2220 gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280 atcgagatgg cccgggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaactc ccgggagcgg 2340 atgaagcgga tcgaggaggg catcaaggag ctgggctccc agatcctgaa ggagcacccc 2400 gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgg 2460 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase ORF using low A codons of Table 4, with two C-terminal NLS sequences and start and stop codons <400> 316 atggacaaga agtactccat cggcctggcc atcggcacca actccgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gccctccaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cactccatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actccggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgactcctt cttccaccgg 300 ctggaggagt ccttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg actccaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc caagtcccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 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atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccaccgg 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg cccggctgag caagagccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc 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gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gacccggagc 2580 gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg cccagcgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcggaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcggggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat caagcggcag 2760 ctggtggaga cccggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag ccggatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgggaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880 aagctggtga gcgacttccg gaaggacttc cagttctaca aggtgcggga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgggacttc 3240 gccaccgtgc ggaaggtgct gagcatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgcccaagc ggaacagcga caagctgatc 3360 gcccggaaga aggactggga 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A/U codons of Table 4, with two C-terminal NLS sequences and start and stop codons <400> 326 atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccaccgg 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg cccggctgag caagagccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900 ctgctgagcg acatcctgcg ggtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgccagc 960 atgatcaagc ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgg 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc ggcggcagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg ggagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg gatcccctac tacgtgggcc ccctggcccg gggcaacagc 1380 cggttcgcct ggatgacccg gaagagcgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcggaagcc cgccttcctg 1620 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gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aaccggctga gcgactacga cgtggacgcc 2520 atcgtgcccc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gacccggagc 2580 gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg cccagcgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcggaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcggggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat caagcggcag 2760 ctggtggaga cccggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag ccggatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgggaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880 aagctggtga gcgacttccg gaaggacttc cagttctaca aggtgcggga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgggacttc 3240 gccaccgtgc ggaaggtgct gagcatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 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ggcagcccca agaagaagcg gaaggtggac agcggctga 4179 <210> 327 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: dCas9 ORF using low A/U codons of Table 4, with start and stop codons and no NLS <400> 327 atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccacccggc tgaagcggac cgcccggcgg cggtacaccc ggcggaagaa ccggatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccaccgg 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcggaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg cccggctgag caagagccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900 ctgctgagcg acatcctgcg ggtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgccagc 960 atgatcaagc ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgg 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc ggcggcagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg ggagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg gatcccctac tacgtgggcc ccctggcccg gggcaacagc 1380 cggttcgcct ggatgacccg gaagagcgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcggaagcc cgccttcctg 1620 agcggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaggtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgacag cgtggagatc 1740 agcggcgtgg aggaccggtt caacgccagc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860 ctgaccctga ccctgttcga ggaccgggag atgatcgagg agcggctgaa gacctacgcc 1920 cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcggc ggcggtacac cggctggggc 1980 cggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agagcggcaa gaccatcctg 2040 gacttcctga agagcgacgg cttcgccaac cggaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtga gcggccaggg cgacagcctg 2160 cacgagcaca tcgccaacct ggccggcagc cccgccatca agaagggcat cctgcagacc 2220 gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280 atcgagatgg cccgggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacag ccgggagcgg 2340 atgaagcgga tcgaggaggg catcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa ggagcacccc 2400 gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgg 2460 gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aaccggctga gcgactacga cgtggacgcc 2520 atcgtgcccc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gacccggagc 2580 gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg cccagcgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcggaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcggggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat caagcggcag 2760 ctggtggaga cccggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag ccggatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgggaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880 aagctggtga gcgacttccg gaaggacttc cagttctaca aggtgcggga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgggacttc 3240 gccaccgtgc ggaaggtgct gagcatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgcccaagc ggaacagcga caagctgatc 3360 gcccggaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420 tacagcgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaaga gcaagaagct gaagagcgtg 3480 aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cggagcagct tcgagaagaa ccccatcgac 3540 ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600 tacagcctgt tcgagctgga gaacggccgg aagcggatgc tggccagcgc cggcgagctg 3660 cagaagggca acgagctggc cctgcccagc aagtacgtga acttcctgta cctggccagc 3720 cactacgaga agctgaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttcag caagcgggtg 3840 atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca ccgggacaag 3900 cccatccggg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960 cccgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgga agcggtacac cagcaccaag 4020 gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacccggatc 4080 gacctgagcc agctgggcgg cgactga 4107 <210> 328 <211> 3312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Nme Cas9 ORF using low A codons of Table 4, with start and stop codons <400> 328 atggccgcct tcaagcccaa ctccatcaac tacatcctgg gcctggacat cggcatcgcc 60 tccgtgggct gggccatggt ggagatcgac gaggaggaga accccatccg gctgatcgac 120 ctgggcgtgc gggtgttcga gcgggccgag gtgcccaaga ccggcgactc cctggccatg 180 gcccggcggc tggcccggtc cgtgcggcgg ctgacccggc ggcgggccca ccggctgctg 240 cggacccggc ggctgctgaa gcgggagggc gtgctgcagg ccgccaactt cgacgagaac 300 ggcctgatca agtccctgcc caacaccccc tggcagctgc gggccgccgc cctggaccgg 360 aagctgaccc ccctggagtg gtccgccgtg ctgctgcacc tgatcaagca ccggggctac 420 ctgtcccagc ggaagaacga gggcgagacc gccgacaagg agctgggcgc cctgctgaag 480 ggcgtggccg gcaacgccca cgccctgcag accggcgact tccggacccc cgccgagctg 540 gccctgaaca agttcgagaa ggagtccggc cacatccgga accagcggtc cgactactcc 600 cacaccttct cccggaagga cctgcaggcc gagctgatcc tgctgttcga 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1500 atccacatcg agaccgcccg ggaggtgggc aagtccttca aggaccggaa ggagatcgag 1560 aagcggcagg aggagaaccg gaaggaccgg gagaaggccg ccgccaagtt ccgggagtac 1620 ttccccaact tcgtgggcga gcccaagtcc aaggacatcc tgaagctgcg gctgtacgag 1680 cagcagcacg gcaagtgcct gtactccggc aaggagatca acctgggccg gctgaacgag 1740 aagggctacg tggagatcga ccacgccctg cccttctccc ggacctggga cgactccttc 1800 aacaacaagg tgctggtgct gggctccgag aaccagaaca agggcaacca gaccccctac 1860 gagtacttca acggcaagga caactcccgg gagtggcagg agttcaaggc ccgggtggag 1920 acctcccggt tcccccggtc caagaagcag cggatcctgc tgcagaagtt cgacgaggac 1980 ggcttcaagg agcggaacct gaacgacacc cggtacgtga accggttcct gtgccagttc 2040 gtggccgacc ggatgcggct gaccggcaag ggcaagaagc gggtgttcgc ctccaacggc 2100 cagatcacca acctgctgcg gggcttctgg ggcctgcgga aggtgcgggc cgagaacgac 2160 cggcaccacg ccctggacgc cgtggtggtg gcctgctcca ccgtggccat gcagcagaag 2220 atcacccggt tcgtgcggta caaggagatg aacgccttcg acggcaagac catcgacaag 2280 gagaccggcg aggtgctgca ccagaagacc cacttccccc agccctggga gttcttcgcc 2340 caggaggtga tgatccgggt gttcggcaag cccgacggca agcccgagtt cgaggaggcc 2400 gacaccctgg agaagctgcg gaccctgctg gccgagaagc tgtcctcccg gcccgaggcc 2460 gtgcacgagt acgtgacccc cctgttcgtg tcccgggccc ccaaccggaa gatgtccggc 2520 cagggccaca tggagaccgt gaagtccgcc aagcggctgg acgagggcgt gtccgtgctg 2580 cgggtgcccc tgacccagct gaagctgaag gacctggaga agatggtgaa ccgggagcgg 2640 gagcccaagc tgtacgaggc cctgaaggcc cggctggagg cccacaagga cgaccccgcc 2700 aaggccttcg ccgagccctt ctacaagtac gacaaggccg gcaaccggac ccagcaggtg 2760 aaggccgtgc gggtggagca ggtgcagaag accggcgtgt gggtgcggaa ccacaacggc 2820 atcgccgaca acgccaccat ggtgcgggtg gacgtgttcg agaagggcga caagtactac 2880 ctggtgccca tctactcctg gcaggtggcc aagggcatcc tgcccgaccg ggccgtggtg 2940 cagggcaagg acgaggagga ctggcagctg atcgacgact ccttcaactt caagttctcc 3000 ctgcacccca acgacctggt ggaggtgatc accaagaagg cccggatgtt cggctacttc 3060 gcctcctgcc accggggcac cggcaacatc aacatccgga tccacgacct ggaccacaag 3120 atcggcaaga acggcatcct ggagggcatc ggcgtgaaga ccgccctgtc cttccagaag 3180 taccagatcg acgagctggg caaggagatc cggccctgcc ggctgaagaa gcggcccccc 3240 gtgcggtccg gcaagcggac cgccgacggc tccgagttcg agtcccccaa gaagaagcgg 3300 aaggtggagt ga 3312 <210> 329 <211> 3312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Nme Cas9 ORF using low A/U codons of Table 4, with start and stop codons <400> 329 atggccgcct tcaagcccaa cagcatcaac tacatcctgg gcctggacat cggcatcgcc 60 agcgtgggct gggccatggt ggagatcgac gaggaggaga accccatccg gctgatcgac 120 ctgggcgtgc gggtgttcga gcgggccgag gtgcccaaga ccggcgacag cctggccatg 180 gcccggcggc tggcccggag cgtgcggcgg ctgacccggc ggcgggccca ccggctgctg 240 cggacccggc ggctgctgaa gcgggagggc gtgctgcagg ccgccaactt cgacgagaac 300 ggcctgatca agagcctgcc caacaccccc tggcagctgc gggccgccgc cctggaccgg 360 aagctgaccc ccctggagtg gagcgccgtg ctgctgcacc tgatcaagca ccggggctac 420 ctgagccagc ggaagaacga gggcgagacc gccgacaagg agctgggcgc cctgctgaag 480 ggcgtggccg gcaacgccca cgccctgcag accggcgact tccggacccc cgccgagctg 540 gccctgaaca agttcgagaa ggagagcggc cacatccgga accagcggag cgactacagc 600 cacaccttca gccggaagga cctgcaggcc gagctgatcc tgctgttcga gaagcagaag 660 gagttcggca acccccacgt gagcggcggc ctgaaggagg gcatcgagac cctgctgatg 720 acccagcggc ccgccctgag cggcgacgcc gtgcagaaga tgctgggcca ctgcaccttc 780 gagcccgccg agcccaaggc cgccaagaac acctacaccg ccgagcggtt catctggctg 840 accaagctga acaacctgcg gatcctggag cagggcagcg agcggcccct gaccgacacc 900 gagcgggcca ccctgatgga cgagccctac cggaagagca agctgaccta cgcccaggcc 960 cggaagctgc tgggcctgga ggacaccgcc ttcttcaagg gcctgcggta cggcaaggac 1020 aacgccgagg ccagcaccct gatggagatg aaggcctacc acgccatcag ccgggccctg 1080 gagaaggagg gcctgaagga caagaagagc cccctgaacc tgagccccga gctgcaggac 1140 gagatcggca ccgccttcag cctgttcaag accgacgagg acatcaccgg ccggctgaag 1200 gaccggatcc agcccgagat cctggaggcc ctgctgaagc acatcagctt cgacaagttc 1260 gtgcagatca gcctgaaggc cctgcggcgg atcgtgcccc tgatggagca gggcaagcgg 1320 tacgacgagg cctgcgccga gatctacggc gaccactacg gcaagaagaa caccgaggag 1380 aagatctacc tgccccccat ccccgccgac gagatccgga accccgtggt 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catcgacaag 2280 gagaccggcg aggtgctgca ccagaagacc cacttccccc agccctggga gttcttcgcc 2340 caggaggtga tgatccgggt gttcggcaag cccgacggca agcccgagtt cgaggaggcc 2400 gacaccctgg agaagctgcg gaccctgctg gccgagaagc tgagcagccg gcccgaggcc 2460 gtgcacgagt acgtgacccc cctgttcgtg agccgggccc ccaaccggaa gatgagcggc 2520 cagggccaca tggagaccgt gaagagcgcc aagcggctgg acgagggcgt gagcgtgctg 2580 cgggtgcccc tgacccagct gaagctgaag gacctggaga agatggtgaa ccgggagcgg 2640 gagcccaagc tgtacgaggc cctgaaggcc cggctggagg cccacaagga cgaccccgcc 2700 aaggccttcg ccgagccctt ctacaagtac gacaaggccg gcaaccggac ccagcaggtg 2760 aaggccgtgc gggtggagca ggtgcagaag accggcgtgt gggtgcggaa ccacaacggc 2820 atcgccgaca acgccaccat ggtgcgggtg gacgtgttcg agaagggcga caagtactac 2880 ctggtgccca tctacagctg gcaggtggcc aagggcatcc tgcccgaccg ggccgtggtg 2940 cagggcaagg acgaggagga ctggcagctg atcgacgaca gcttcaactt caagttcagc 3000 ctgcacccca acgacctggt ggaggtgatc accaagaagg cccggatgtt cggctacttc 3060 gccagctgcc accggggcac cggcaacatc aacatccgga tccacgacct ggaccacaag 3120 atcggcaaga acggcatcct ggagggcatc ggcgtgaaga ccgccctgag cttccagaag 3180 taccagatcg acgagctggg caaggagatc cggccctgcc ggctgaagaa gcggcccccc 3240 gtgcggagcg gcaagcggac cgccgacggc agcgagttcg agagccccaa gaagaagcgg 3300 aaggtggagt ga 3312 <210> 330 <211> 4146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Open reading frame for Cas9 with NLS1, with start and stop codons <400> 330 atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60 atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120 cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccacaga 300 ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420 aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480 atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga caacagcgac 540 gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga agaaaacccg 600 atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag caagagcaga 660 agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact gttcggaaac 720 ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga cctggcagaa 780 gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa cctgctggca 840 cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag cgacgcaatc 900 ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct gagcgcaagc 960 atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc actggtcaga 1020 cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa cggatacgca 1080 ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140 gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga cctgctgaga 1200 aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg agaactgcac 1260 gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag agaaaagatc 1320 gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac 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tcatgaaaaa tatcctacta tttatcattt acgtaaaaaa 420 ttagttgatt ctactgataa agctgattta cgtttaattt atttagcttt agctcatatg 480 attaaatttc gtggtcattt tttaattgaa ggtgatttaa atcctgataa ttctgatgtt 540 gataaattat ttattcaatt agttcaaact tataatcaat tatttgaaga aaatcctatt 600 aatgcttctg gtgttgatgc taaagctatt ttatctgctc gtttatctaa atctcgtcgt 660 ttagaaaatt taattgctca attacctggt gaaaaaaaaa atggtttatt tggtaattta 720 attgctttat ctttaggttt aactcctaat tttaaatcta attttgattt agctgaagat 780 gctaaattac aattatctaa agatacttat gatgatgatt tagataattt attagctcaa 840 attggtgatc aatatgctga tttattttta gctgctaaaa atttatctga tgctatttta 900 ttatctgata ttttacgtgt taatactgaa attactaaag ctcctttatc tgcttctatg 960 attaaacgtt atgatgaaca tcatcaagat ttaactttat taaaagcttt agttcgtcaa 1020 caattacctg aaaaatataa agaaattttt tttgatcaat ctaaaaatgg ttatgctggt 1080 tatattgatg gtggtgcttc tcaagaagaa ttttataaat ttattaaacc tattttagaa 1140 aaaatggatg gtactgaaga attattagtt aaattaaatc gtgaagattt attacgtaaa 1200 caacgtactt ttgataatgg ttctattcct catcaaattc atttaggtga attacatgct 1260 attttacgtc gtcaagaaga tttttatcct tttttaaaag ataatcgtga aaaaattgaa 1320 aaaattttaa cttttcgtat tccttattat gttggtcctt tagctcgtgg taattctcgt 1380 tttgcttgga tgactcgtaa atctgaagaa actattactc cttggaattt tgaagaagtt 1440 gttgataaag gtgcttctgc tcaatctttt attgaacgta tgactaattt tgataaaaat 1500 ttacctaatg aaaaagtttt acctaaacat tctttattat atgaatattt tactgtttat 1560 aatgaattaa ctaaagttaa atatgttact gaaggtatgc gtaaacctgc ttttttatct 1620 ggtgaacaaa aaaaagctat tgttgattta ttatttaaaa ctaatcgtaa agttactgtt 1680 aaacaattaa aagaagatta ttttaaaaaa attgaatgtt ttgattctgt tgaaatttct 1740 ggtgttgaag atcgttttaa tgcttcttta ggtacttatc atgatttatt aaaaattatt 1800 aaagataaag attttttaga taatgaagaa aatgaagata ttttagaaga tattgtttta 1860 actttaactt tatttgaaga tcgtgaaatg attgaagaac gtttaaaaac ttatgctcat 1920 ttatttgatg ataaagttat gaaacaatta aaacgtcgtc gttatactgg ttggggtcgt 1980 ttatctcgta aattaattaa tggtattcgt gataaacaat ctggtaaaac tattttagat 2040 tttttaaaat ctgatggttt tgctaatcgt 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ttttataaag ttcgtgaaat taataattat 2940 catcatgctc atgatgctta tttaaatgct gttgttggta ctgctttaat taaaaaatat 3000 cctaaattag aatctgaatt tgtttatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060 attgctaaat ctgaacaaga aattggtaaa gctactgcta aatatttttt ttattctaat 3120 attatgaatt tttttaaaac tgaaattact ttagctaatg gtgaaattcg taaacgtcct 3180 ttaattgaaa ctaatggtga aactggtgaa attgtttggg ataaaggtcg tgattttgct 3240 actgttcgta aagttttatc tatgcctcaa gttaatattg ttaaaaaaac tgaagttcaa 3300 actggtggtt tttctaaaga atctatttta cctaaacgta attctgataa attaattgct 3360 cgtaaaaaag attgggatcc taaaaaatat ggtggttttg attctcctac tgttgcttat 3420 tctgttttag ttgttgctaa agttgaaaaa ggtaaatcta aaaaattaaa atctgttaaa 3480 gaattattag gtattactat tatggaacgt tcttcttttg aaaaaaatcc tattgatttt 3540 ttagaagcta aaggttataa agaagttaaa aaagatttaa ttattaaatt acctaaatat 3600 tctttatttg aattagaaaa tggtcgtaaa cgtatgttag cttctgctgg tgaattacaa 3660 aaaggtaatg aattagcttt accttctaaa tatgttaatt ttttatattt agcttctcat 3720 tatgaaaaat taaaaggttc tcctgaagat 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ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca tcctggagga catcgtgctg 1860 accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc ggctgaagac ctacgcccac 1920 ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980 ctgtcccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac catcctggac 2040 ttcctgaagt ccgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgactcc 2100 ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgtccg gccagggcga ctccctgcac 2160 gagcacatcg ccaacctggc cggctccccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220 aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaactcccg ggagcggatg 2340 aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggctcccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400 gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460 atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgtccg actacgacgt ggaccacatc 2520 gtgccccagt ccttcctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac ccggtccgac 2580 aagaaccggg gcaagtccga caacgtgccc tccgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700 aaggccgagc ggggcggcct gtccgagctg gacaaggccg gcttcatcaa gcggcagctg 2760 gtggagaccc ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc tggactcccg gatgaacacc 2820 aagtacgacg agaacgacaa gctgatccgg gaggtgaagg tgatcaccct gaagtccaag 2880 ctggtgtccg acttccggaa ggacttccag ttctacaagg tgcgggagat caacaactac 2940 caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca ccgccctgat caagaagtac 3000 cccaagctgg agtccgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060 atcgccaagt ccgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactccaac 3120 atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggccc 3180 ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg acaagggccg ggacttcgcc 3240 accgtgcgga aggtgctgtc catgccccag gtgaacatcg tgaagaagac cgaggtgcag 3300 accggcggct tctccaagga gtccatcctg cccaagcgga actccgacaa gctgatcgcc 3360 cggaagaagg actgggaccc caagaagtac ggcggcttcg actcccccac cgtggcctac 3420 tccgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagtcca agaagctgaa gtccgtgaag 3480 gagctgctgg gcatcaccat catggagcgg tcctccttcg agaagaaccc catcgacttc 3540 ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcatcaagct gcccaagtac 3600 tccctgttcg agctggagaa cggccggaag cggatgctgg cctccgccgg cgagctgcag 3660 aagggcaacg agctggccct gccctccaag tacgtgaact tcctgtacct ggcctcccac 3720 tacgagaagc tgaagggctc ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtggagcag 3780 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gcgggtgatc 3840 ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960 gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacacctc caccaaggag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagtcc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080 ctgtcccagc tgggcggcga cggcggcggc tcccccaaga agaagcggaa ggtg 4134 <210> 347 <211> 4134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using low A/U codons of Table 4 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 347 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaaca gcgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300 gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct 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ggtgaccgtg 1680 aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgacagcgt ggagatcagc 1740 ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca tcctggagga catcgtgctg 1860 accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc ggctgaagac ctacgcccac 1920 ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980 ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcaga gcggcaagac catcctggac 2040 ttcctgaaga gcgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100 ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg gccagggcga cagcctgcac 2160 gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220 aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaacagccg ggagcggatg 2340 aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400 gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460 atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgagcg actacgacgt 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<223> Synthetic: Cas9 ORF using low A codons of Table 4, with two C-terminal NLS sequences (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 348 gacaagaagt actccatcgg cctggacatc ggcaccaact ccgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc ctccaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 tccatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgact ccggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttctccaa cgagatggcc aaggtggacg actccttctt ccaccggctg 300 gaggagtcct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggact ccaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa ctccgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgcctccg gcgtggacgc caaggccatc ctgtccgccc ggctgtccaa gtcccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctgt ccctgggcct gacccccaac ttcaagtcca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgtccaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgtccgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgtc cgcctccatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgcctc ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg ctccatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caactcccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gtccgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgcctccgc ccagtccttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac tccctgctgt acgagtactt 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cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa ctccgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgcctccg gcgtggacgc caaggccatc ctgtccgccc ggctgtccaa gtcccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctgt ccctgggcct gacccccaac ttcaagtcca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgtccaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgtccgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgtc cgcctccatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgcctc ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg ctccatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg 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agttctccaa gcgggtgatc 3840 ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960 gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacacctc caccaaggag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagtcc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080 ctgtcccagc tgggcggcga c 4101 <210> 351 <211> 4173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase ORF using low A codons of Table 4, with two C-terminal NLS sequences (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 351 gacaagaagt actccatcgg cctggccatc ggcaccaact ccgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc ctccaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 tccatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgact ccggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttctccaa cgagatggcc aaggtggacg actccttctt ccaccggctg 300 gaggagtcct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggact ccaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa ctccgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgcctccg gcgtggacgc caaggccatc ctgtccgccc ggctgtccaa gtcccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctgt ccctgggcct gacccccaac ttcaagtcca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgtccaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgtccgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgtc cgcctccatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgcctc ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 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ggctgaagac ctacgcccac 1920 ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980 ctgtcccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac catcctggac 2040 ttcctgaagt ccgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgactcc 2100 ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgtccg gccagggcga ctccctgcac 2160 gagcacatcg ccaacctggc cggctccccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220 aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaactcccg ggagcggatg 2340 aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggctcccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400 gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460 atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgtccg actacgacgt ggacgccatc 2520 gtgccccagt ccttcctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac ccggtccgac 2580 aagaaccggg gcaagtccga caacgtgccc tccgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700 aaggccgagc ggggcggcct gtccgagctg gacaaggccg 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354 gacaagaagt actccatcgg cctggccatc ggcaccaact ccgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc ctccaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 tccatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgact ccggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttctccaa cgagatggcc aaggtggacg actccttctt ccaccggctg 300 gaggagtcct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggact ccaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa ctccgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgcctccg gcgtggacgc caaggccatc ctgtccgccc ggctgtccaa gtcccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctgt ccctgggcct gacccccaac ttcaagtcca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgtccaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgtccgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgtc cgcctccatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgcctc ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg ctccatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caactcccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gtccgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgcctccgc ccagtccttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac tccctgctgt acgagtactt caccgtgtac 1560 aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc ggaagcccgc cttcctgtcc 1620 ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa ggtgaccgtg 1680 aagcagctga 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ccttcctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac ccggtccgac 2580 aagaaccggg gcaagtccga caacgtgccc tccgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700 aaggccgagc ggggcggcct gtccgagctg gacaaggccg gcttcatcaa gcggcagctg 2760 gtggagaccc ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc tggactcccg gatgaacacc 2820 aagtacgacg agaacgacaa gctgatccgg gaggtgaagg tgatcaccct gaagtccaag 2880 ctggtgtccg acttccggaa ggacttccag ttctacaagg tgcgggagat caacaactac 2940 caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca ccgccctgat caagaagtac 3000 cccaagctgg agtccgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060 atcgccaagt ccgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactccaac 3120 atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggccc 3180 ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg acaagggccg ggacttcgcc 3240 accgtgcgga aggtgctgtc catgccccag gtgaacatcg tgaagaagac cgaggtgcag 3300 accggcggct tctccaagga gtccatcctg cccaagcgga actccgacaa gctgatcgcc 3360 cggaagaagg actgggaccc caagaagtac ggcggcttcg actcccccac cgtggcctac 3420 tccgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagtcca agaagctgaa gtccgtgaag 3480 gagctgctgg gcatcaccat catggagcgg tcctccttcg agaagaaccc catcgacttc 3540 ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcatcaagct gcccaagtac 3600 tccctgttcg agctggagaa cggccggaag cggatgctgg cctccgccgg cgagctgcag 3660 aagggcaacg agctggccct gccctccaag tacgtgaact tcctgtacct ggcctcccac 3720 tacgagaagc tgaagggctc ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtggagcag 3780 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gcgggtgatc 3840 ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960 gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacacctc caccaaggag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagtcc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080 ctgtcccagc tgggcggcga cggctccggc tcccccaaga agaagcggaa ggtggacggc 4140 tcccccaaga agaagcggaa ggtggactcc ggc 4173 <210> 355 <211> 4173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using low A/U codons of Table 4, with two C-terminal NLS sequences (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 355 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaaca gcgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300 gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900 ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgccagcatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caacagccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gagcgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac 1560 aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc ggaagcccgc cttcctgagc 1620 ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa ggtgaccgtg 1680 aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgacagcgt ggagatcagc 1740 ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca tcctggagga catcgtgctg 1860 accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc ggctgaagac ctacgcccac 1920 ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980 ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcaga gcggcaagac catcctggac 2040 ttcctgaaga gcgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100 ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg gccagggcga cagcctgcac 2160 gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220 aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaacagccg ggagcggatg 2340 aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400 gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460 atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgagcg actacgacgt ggaccacatc 2520 gtgccccaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca aggtgctgac ccggagcgac 2580 aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc agcgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700 aaggccgagc ggggcggcct gagcgagctg gacaaggccg gcttcatcaa gcggcagctg 2760 gtggagaccc ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc tggacagccg gatgaacacc 2820 aagtacgacg agaacgacaa gctgatccgg gaggtgaagg tgatcaccct gaagagcaag 2880 ctggtgagcg acttccggaa ggacttccag ttctacaagg tgcgggagat caacaactac 2940 caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca ccgccctgat caagaagtac 3000 cccaagctgg agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060 atcgccaaga gcgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120 atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggccc 3180 ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg acaagggccg ggacttcgcc 3240 accgtgcgga aggtgctgag catgccccag gtgaacatcg tgaagaagac cgaggtgcag 3300 accggcggct tcagcaagga gagcatcctg cccaagcgga acagcgacaa gctgatcgcc 3360 cggaagaagg actgggaccc caagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctac 3420 agcgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagagca agaagctgaa gagcgtgaag 3480 gagctgctgg gcatcaccat catggagcgg agcagcttcg agaagaaccc catcgacttc 3540 ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcatcaagct gcccaagtac 3600 agcctgttcg agctggagaa cggccggaag cggatgctgg ccagcgccgg cgagctgcag 3660 aagggcaacg agctggccct gcccagcaag tacgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720 tacgagaagc tgaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtggagcag 3780 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttcagcaa gcgggtgatc 3840 ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960 gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacaccag caccaaggag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080 ctgagccagc tgggcggcga cggcagcggc agccccaaga agaagcggaa ggtggacggc 4140 agccccaaga agaagcggaa ggtggacagc ggc 4173 <210> 356 <211> 4101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 ORF using low A/U codons of Table 4 (no NLS and no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 356 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaaca gcgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300 gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900 ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgccagcatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caacagccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gagcgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac 1560 aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc ggaagcccgc cttcctgagc 1620 ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa ggtgaccgtg 1680 aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgacagcgt ggagatcagc 1740 ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca tcctggagga catcgtgctg 1860 accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc ggctgaagac ctacgcccac 1920 ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc ggtacaccgg ctggggccgg 1980 ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcaga gcggcaagac catcctggac 2040 ttcctgaaga gcgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100 ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg gccagggcga cagcctgcac 2160 gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccc gccatcaaga agggcatcct gcagaccgtg 2220 aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga agaacagccg ggagcggatg 2340 aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga tcctgaagga gcaccccgtg 2400 gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa cggccgggac 2460 atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgagcg actacgacgt ggaccacatc 2520 gtgccccaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca aggtgctgac ccggagcgac 2580 aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc agcgaggagg tggtgaagaa gatgaagaac 2640 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccagc ggaagttcga caacctgacc 2700 aaggccgagc ggggcggcct gagcgagctg gacaaggccg gcttcatcaa gcggcagctg 2760 gtggagaccc ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc tggacagccg gatgaacacc 2820 aagtacgacg agaacgacaa gctgatccgg gaggtgaagg tgatcaccct gaagagcaag 2880 ctggtgagcg acttccggaa ggacttccag ttctacaagg tgcgggagat caacaactac 2940 caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca ccgccctgat caagaagtac 3000 cccaagctgg agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060 atcgccaaga gcgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120 atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggccc 3180 ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg acaagggccg ggacttcgcc 3240 accgtgcgga aggtgctgag catgccccag gtgaacatcg tgaagaagac cgaggtgcag 3300 accggcggct tcagcaagga gagcatcctg cccaagcgga acagcgacaa gctgatcgcc 3360 cggaagaagg actgggaccc caagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctac 3420 agcgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagagca agaagctgaa gagcgtgaag 3480 gagctgctgg gcatcaccat catggagcgg agcagcttcg agaagaaccc catcgacttc 3540 ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcatcaagct gcccaagtac 3600 agcctgttcg agctggagaa cggccggaag cggatgctgg ccagcgccgg cgagctgcag 3660 aagggcaacg agctggccct gcccagcaag tacgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720 tacgagaagc tgaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtggagcag 3780 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttcagcaa gcgggtgatc 3840 ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 atccgggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc tgaccaacct gggcgccccc 3960 gccgccttca agtacttcga caccaccatc gaccggaagc ggtacaccag caccaaggag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac ccggatcgac 4080 ctgagccagc tgggcggcga c 4101 <210> 357 <211> 4134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Cas9 nickase ORF using low A/U codons of Table 4 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 357 gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc ggcaccaaca gcgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300 gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900 ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgccagcatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc 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ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caacagccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gagcgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgacaagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac 1560 aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc ggaagcccgc cttcctgagc 1620 ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa ggtgaccgtg 1680 aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct tcgacagcgt ggagatcagc 1740 ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc acgacctgct gaagatcatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caacgaggag 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accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca gcggcgagac cgccgaggcc 180 acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc ggaagaaccg gatctgctac 240 ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccaccggctg 300 gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gcggaagaag 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct acctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga gaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900 ctgagcgaca 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ctgagcgccc ggctgagcaa gagccggcgg 660 ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga acggcctgtt cggcaacctg 720 atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggac 780 gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga acctgagcga cgccatcctg 900 ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgccagcatg 960 atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaggccct ggtgcggcag 1020 cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggag 1140 aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc gggaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggcga gctgcacgcc 1260 atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg acaaccggga gaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc tggcccgggg caacagccgg 1380 ttcgcctgga tgacccggaa gagcgaggag accatcaccc cctggaactt cgaggaggtg 1440 gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga 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gtccggccac atccggaacc agcggtccga ctactcccac 600 accttctccc ggaaggacct gcaggccgag ctgatcctgc tgttcgagaa gcagaaggag 660 ttcggcaacc cccacgtgtc cggcggcctg aaggagggca tcgagaccct gctgatgacc 720 cagcggcccg ccctgtccgg cgacgccgtg cagaagatgc tgggccactg caccttcgag 780 cccgccgagc ccaaggccgc caagaacacc tacaccgccg agcggttcat ctggctgacc 840 aagctgaaca acctgcggat cctggagcag ggctccgagc ggcccctgac cgacaccgag 900 cgggccaccc tgatggacga gccctaccgg aagtccaagc tgacctacgc ccaggcccgg 960 aagctgctgg gcctggagga caccgccttc ttcaagggcc tgcggtacgg caaggacaac 1020 gccgaggcct ccaccctgat ggagatgaag gcctaccacg ccatctcccg ggccctggag 1080 aaggagggcc tgaaggacaa gaagtccccc ctgaacctgt cccccgagct gcaggacgag 1140 atcggcaccg ccttctccct gttcaagacc gacgaggaca tcaccggccg gctgaaggac 1200 cggatccagc ccgagatcct ggaggccctg ctgaagcaca tctccttcga caagttcgtg 1260 cagatctccc tgaaggccct gcggcggatc gtgcccctga tggagcaggg caagcggtac 1320 gacgaggcct gcgccgagat ctacggcgac cactacggca agaagaacac cgaggagaag 1380 atctacctgc cccccatccc cgccgacgag 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atccggatcc acgacctgga ccacaagatc 3120 ggcaagaacg gcatcctgga gggcatcggc gtgaagaccg ccctgtcctt ccagaagtac 3180 cagatcgacg agctgggcaa ggagatccgg ccctgccggc tgaagaagcg gccccccgtg 3240 cggtccggca agcggaccgc cgacggctcc gagttcgagt cccccaagaa gaagcggaag 3300 gtggag 3306 <210> 364 <211> 3306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Nme Cas9 ORF using low A/U codons of Table 4 (no start or stop codons; suitable for inclusion in fusion protein coding sequence) <400> 364 gccgccttca agcccaacag catcaactac atcctgggcc tggacatcgg catcgccagc 60 gtgggctggg ccatggtgga gatcgacgag gaggagaacc ccatccggct gatcgacctg 120 ggcgtgcggg tgttcgagcg ggccgaggtg cccaagaccg gcgacagcct ggccatggcc 180 cggcggctgg cccggagcgt gcggcggctg acccggcggc gggcccaccg gctgctgcgg 240 acccggcggc tgctgaagcg ggagggcgtg ctgcaggccg ccaacttcga cgagaacggc 300 ctgatcaaga gcctgcccaa caccccctgg cagctgcggg ccgccgccct ggaccggaag 360 ctgacccccc tggagtggag cgccgtgctg ctgcacctga tcaagcaccg gggctacctg 420 agccagcgga agaacgaggg 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ctgcggaagg tgcgggccga gaacgaccgg 2160 caccacgccc tggacgccgt ggtggtggcc tgcagcaccg tggccatgca gcagaagatc 2220 acccggttcg tgcggtacaa ggagatgaac gccttcgacg gcaagaccat cgacaaggag 2280 accggcgagg tgctgcacca gaagacccac ttcccccagc cctgggagtt cttcgcccag 2340 gaggtgatga tccgggtgtt cggcaagccc gacggcaagc ccgagttcga ggaggccgac 2400 accctggaga agctgcggac cctgctggcc gagaagctga gcagccggcc cgaggccgtg 2460 cacgagtacg tgacccccct gttcgtgagc cgggccccca accggaagat gagcggccag 2520 ggccacatgg agaccgtgaa gagcgccaag cggctggacg agggcgtgag cgtgctgcgg 2580 gtgcccctga cccagctgaa gctgaaggac ctggagaaga tggtgaaccg ggagcgggag 2640 cccaagctgt acgaggccct gaaggcccgg ctggaggccc acaaggacga ccccgccaag 2700 gccttcgccg agcccttcta caagtacgac aaggccggca accggaccca gcaggtgaag 2760 gccgtgcggg tggagcaggt gcagaagacc ggcgtgtggg tgcggaacca caacggcatc 2820 gccgacaacg ccaccatggt gcgggtggac gtgttcgaga agggcgacaa gtactacctg 2880 gtgcccatct acagctggca ggtggccaag ggcatcctgc ccgaccgggc cgtggtgcag 2940 ggcaaggacg aggaggactg gcagctgatc 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cgacguggac aagcuguuca 600 uccagcuggu gcagaccuac aaccagcugu ucgaggagaa ccccaucaac gccuccggcg 660 uggacgccaa ggccauccug uccgcccggc uguccaaguc ccggcggcug gagaaccuga 720 ucgcccagcu gcccggcgag aagaagaacg gccuguucgg caaccugauc gcccuguccc 780 ugggccugac ccccaacuuc aaguccaacu ucgaccuggc cgaggacgcc aagcugcagc 840 uguccaagga caccuacgac gacgaccugg acaaccugcu ggcccagauc ggcgaccagu 900 acgccgaccu guuccuggcc gccaagaacc uguccgacgc cauccugcug uccgacaucc 960 ugcgggugaa caccgagauc accaaggccc cccuguccgc cuccaugauc aagcgguacg 1020 acgagcacca ccaggaccug acccugcuga aggcccuggu gcggcagcag cugcccgaga 1080 aguacaagga gaucuucuuc gaccagucca agaacggcua cgccggcuac aucgacggcg 1140 gcgccuccca ggaggaguuc uacaaguuca ucaagcccau ccuggagaag auggacggca 1200 ccgaggagcu gcuggugaag cugaaccggg aggaccugcu gcggaagcag cggaccuucg 1260 acaacggcuc caucccccac cagauccacc ugggcgagcu gcacgccauc cugcggcggc 1320 aggaggacuu cuaccccuuc cugaaggaca accgggagaa gaucgagaag auccugaccu 1380 uccggauccc cuacuacgug ggcccccugg cccggggcaa cucccgguuc 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aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 4380 taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 4440 aatggaaaga acctcgagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4538 <210> 385 <211> 4517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mRNA transcript with ORF encoding Cas9 with HiBiT tag, XBG 5 UTR and human ALB 3 UTR <400> 385 gggaagctca gaataaacgc tcaactttgg ccggatctcg ccaccatgga caagaagtac 60 agcatcggac tggacatcgg aacaaacagc gtcggatggg cagtcatcac agacgaatac 120 aaggtcccga gcaagaagtt caaggtcctg ggaaacacag acagacacag catcaagaag 180 aacctgatcg gagcactgct gttcgacagc ggagaaacag cagaagcaac aagactgaag 240 agaacagcaa gaagaagata cacaagaaga aagaacagaa tctgctacct gcaggaaatc 300 ttcagcaacg aaatggcaaa ggtcgacgac agcttcttcc acagactgga agaaagcttc 360 ctggtcgaag aagacaagaa gcacgaaaga cacccgatct tcggaaacat cgtcgacgaa 420 gtcgcatacc acgaaaagta cccgacaatc taccacctga gaaagaagct ggtcgacagc 480 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tctacccgtt cctgaaggac aacagagaaa agatcgaaaa gatcctgaca 1380 ttcagaatcc cgtactacgt cggaccgctg gcaagaggaa acagcagatt cgcatggatg 1440 acaagaaaga gcgaagaaac aatcacaccg tggaacttcg aagaagtcgt cgacaaggga 1500 gcaagcgcac agagcttcat cgaaagaatg acaaacttcg acaagaacct gccgaacgaa 1560 aaggtcctgc cgaagcacag cctgctgtac gaatacttca cagtctacaa cgaactgaca 1620 aaggtcaagt acgtcacaga aggaatgaga aagccggcat tcctgagcgg agaacagaag 1680 aaggcaatcg tcgacctgct gttcaagaca aacagaaagg tcacagtcaa gcagctgaag 1740 gaagactact tcaagaagat cgaatgcttc gacagcgtcg aaatcagcgg agtcgaagac 1800 agattcaacg caagcctggg aacataccac gacctgctga agatcatcaa ggacaaggac 1860 ttcctggaca acgaagaaaa cgaagacatc ctggaagaca tcgtcctgac actgacactg 1920 ttcgaagaca gagaaatgat cgaagaaaga ctgaagacat acgcacacct gttcgacgac 1980 aaggtcatga agcagctgaa gagaagaaga tacacaggat ggggaagact gagcagaaag 2040 ctgatcaacg gaatcagaga caagcagagc ggaaagacaa tcctggactt cctgaagagc 2100 gacggattcg caaacagaaa cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacattcaag 2160 gaagacatcc 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tcatcgaaca gatcagcgaa ttcagcaaga gagtcatcct ggcagacgca 3900 aacctggaca aggtcctgag cgcatacaac aagcacagag acaagccgat cagagaacag 3960 gcagaaaaca tcatccacct gttcacactg acaaacctgg gagcaccggc agcattcaag 4020 tacttcgaca caacaatcga cagaaagaga tacacaagca caaaggaagt cctggacgca 4080 acactgatcc accagagcat cacaggactg tacgaaacaa gaatcgacct gagccagctg 4140 ggaggagacg gaggaggaag cccgaagaag aagagaaagg tcagcgaaag cgcaacaccg 4200 gaaagcgtca gcggatggag actgttcaag aagatcagct agctagccat cacatttaaa 4260 agcatctcag cctaccatga gaataagaga aagaaaatga agatcaatag cttattcatc 4320 tctttttctt tttcgttggt gtaaagccaa caccctgtct aaaaaacata aatttcttta 4380 atcattttgc ctcttttctc tgtgcttcaa ttaataaaaa atggaaagaa cctcgagaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaa 4517 <210> 386 <211> 1381 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence for Cas9 with NLS1 <400> 386 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly 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Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 Gly Gly Gly Ser Arg Ala Ala Lys Arg Lys Ala Phe Ala Ala 1370 1375 1380 <210> 396 <211> 1382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Amino acid sequence for Cas9 with NLS11 <400> 396 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 Gly Gly Gly Ser Arg Ala Ala Lys Arg Lys Tyr Phe Ala Val 1370 1375 1380

Claims (91)

  1. TTR과 관련된 아밀로이드증(amyloidosis associated with TTR: ATTR)을 치료하는 방법으로서, 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR과 관련된 아밀로이드증의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
    을 포함하여 ATTR을 치료하는, 방법.
  2. TTR 혈청 농도를 감소시키는 방법으로서, 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR 혈청 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
    을 포함하여 TTR 혈청 농도를 감소시키는, 방법.
  3. 대상체에서 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법으로서, 코르티코스테로이드 및 조성물을 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적의 감소 또는 방지를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 다음을 포함하는 가이드 RNA:
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
    을 포함하여 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키는, 방법.
  4. 가이드 RNA를 포함하는 조성물로서,
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
    을 포함하며, 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(double-stranded break: DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한, 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
  5. 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 암호화하는 벡터로서, 상기 가이드 RNA는,
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열
    을 포함하며, 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 또는 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한, 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 암호화하는 벡터.
  6. 조성물로서,
    (i) 가이드 RNA로서,
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는, 상기 가이드 RNA, 및
    (ii) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA로서,
    a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고;
    c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 75%가 표 1에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
    d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
    e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA
    를 포함하며, 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한, 조성물.
  7. 조성물로서,
    (i) 가이드 RNA를 암호화하는 벡터로서, 상기 가이드 RNA는
    a. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열;
    b. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열의 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드; 또는
    c. 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%의 동일한 가이드 서열을 포함하는, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 벡터, 및
    (ii) RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA로서,
    a. 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    b. 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고;
    c. 오픈 리딩 프레임은 코돈의 적어도 75%가 표 1에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
    d. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
    e. 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA
    를 포함하며, 대상체의 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는 방법에서 코르티코스테로이드와 병용하여 사용하기 위한, 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 30분 초과, 예를 들어, 60분 초과 또는 120분 초과 동안 주입에 의해 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 조성물 또는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 5 내지 72, 74 내지 78 및 80 내지 82로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는, 조성물 또는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 27, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 55, 61, 63, 65, 66, 68 또는 69로부터 선택되는 가이드 서열을 포함하는, 조성물 또는 방법.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자 내에 이중-가닥 파손(DSB)을 유도하고, 세포 또는 대상체에서 TTR 유전자를 변형시키고, 대상체에서 TTR과 관련된 아밀로이드증(ATTR)을 치료하고, 대상체에서 TTR 혈청 농도를 감소시키고/시키거나 대상체에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유의 축적을 감소시키거나 방지하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손(dexamethasone), 베타메타손(betamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 코르티손(cortisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트라이암시놀론(triamcinolone) 또는 에타메타소넵(ethamethasoneb)인, 방법 또는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손인, 방법 또는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물 전에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물 후에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물과 동시에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물이 투여되기 전 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물이 투여된 후 약 5분 내지 약 168시간 이내에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물이 투여되기 전 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 1일, 1.5일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2회 용량의 코르티코스테로이드는 상기 조성물의 투여 전 또는 후에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2회 용량의 코르티코스테로이드 및 상기 적어도 2회 용량의 조성물이 투여되는, 방법 또는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 0.75㎎ 내지 20㎎의 용량 또는 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 0.4 ㎎/㎏, 예컨대, 0.1 ㎎/㎏ 내지 0.35 ㎎/㎏ 또는 0.25 ㎎/㎏ 내지 0.35 ㎎/㎏의 용량으로 상기 대상체에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 정맥내 주사를 통해 상기 대상체에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 대상체에 경구로 투여되며, 선택적으로 상기 코르티코스테로이드는 상기 조성물이 정맥내 주사에 의해 상기 대상체에 투여되기 전 상기 대상체에 경구로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 상기 덱사메타손은 상기 조성물이 상기 대상체에 투여되기 전 6시간 내지 12시간에 20㎎의 양으로 상기 대상체에 경구로 투여되거나, 또는 상기 덱사메타손은 상기 조성물이 상기 대상체에 투여되기 전 30분 또는 6시간 내지 12시간 동안 20㎎의 양으로 상기 대상체에 정맥내로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 60분, 약 90분, 약 120분, 약 150분, 약 180분 또는 약 240분 동안 주입에 의해 투여되는, 방법 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손인, 방법 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 주입 예방제(infusion prophylaxis)를 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 주입 예방제는 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 상기 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상은 코르티코스테로이드와 함께 그리고/또는 조성물 전에 동시에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제는 각각 투여되는, 방법 또는 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 H1 차단제 및/또는 H2 차단제는 각각 경구로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주입 예방제는 정맥내 코르티코스테로이드(예컨대, 덱사메타손 8㎎ 내지 12㎎ 또는 10㎎ 또는 등가물) 및 아세트아미노펜(예컨대, 경구 아세트아미노펜 500㎎)을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주입 예방제는 가이드 RNA-함유 조성물, 예를 들어, LNP 조성물을 투여하기 전에 필요한 예비약제(premedication)로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H1 차단제는 다이펜하이드라민(diphenhydramine)인, 방법 또는 조성물.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H2 차단제는 라니티딘(ranitidine)인, 방법 또는 조성물.
  35. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드의 제1 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 투여되고, 상기 코르티코스테로이드의 제2 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 방법은 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상을 투여하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 아세트아미노펜, H1 차단제 또는 H2 차단제 중 하나 이상은 상기 코르티코스테로이드의 제2 용량과 동시에 투여되는, 방법 또는 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드의 제1 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되고, 상기 코르티코스테로이드의 제2 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 정맥내로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드의 제1 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되고, 상기 코르티코스테로이드의 제2 용량은 상기 조성물이 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜, H1 차단제 및 H2 차단제의 투여와 동시에 정맥내로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 약 6㎎ 내지 10㎎의 양의 상기 덱사메타손의 제1 용량이 상기 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 상기 대상체에 경구로 투여되고, 약 8㎎ 내지 12㎎의 양의 상기 덱사메타손의 제2 용량은 상기 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜의 경구 투여 및 H1 차단제와 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 정맥내로 투여되며, 선택적으로 상기 H1 차단제는 다이펜하이드라민이고, 상기 H2 차단제는 라니티딘이고/이거나 선택적으로 상기 대상체는 인간인, 방법 또는 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손이고, 8㎎의 양의 덱사메타손의 제1 용량이 상기 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 8시간 내지 24시간에 상기 대상체에 경구로 투여되고, 10㎎의 양의 덱사메타손의 제2 용량은 상기 조성물이 대상체에 투여되기 전 약 1시간 내지 2시간에 아세트아미노펜의 경구 투여 및 H1 차단제와 H2 차단제의 정맥내 투여와 동시에 상기 대상체에 정맥내로 투여되며, 선택적으로 상기 H1 차단제는 다이펜하이드라민이고, 상기 H2 차단제는 라니티딘인, 방법 또는 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 1.5시간 내지 6시간 동안 주입에 의해 3 ㎎/㎏의 양으로 투여되고; 상기 코르티코스테로이드의 제1 용량은 상기 조성물의 주입 전 약 8시간 내지 24시간에 경구로 투여되며; 상기 코르티코스테로이드의 제2 용량은 상기 조성물의 주입 전 약 1시간 내지 2시간에 정맥내로 투여되는, 방법 또는 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 상기 가이드 RNA를 포함하는 상기 조성물의 내약성을 개선하는, 방법 또는 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 상기 가이드 RNA를 포함하는 상기 조성물에 대한 반응에서 하나 이상의 염증, 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting), 혈액에서 상승된 ALT 농도, 고열(hyperthermia) 및/또는 통각 과민증(hyperalgesia)의 발생률 또는 중증도를 감소시키는, 방법 또는 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드를 투여하는 것은 상기 가이드 RNA를 포함하는 상기 조성물에 대한 반응에서 하나 이상의 인터페론 및/또는 염증성 사이토카인의 생성 또는 활성을 감소시키거나 또는 저해하는, 방법 또는 조성물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 TTR 수준을 감소시키는, 방법 또는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 혈청 TTR 수준은 상기 조성물의 투여 전 혈청 TTR 수준과 비교하여 적어도 50% 감소되는, 방법 또는 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 TTR 유전자의 편집을 초래하는, 방법 또는 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 편집은 편집된 집단의 백분율 (편집 퍼센트)로 계산되고, 선택적으로 상기 편집 퍼센트는 상기 집단의 30% 내지 99%인, 방법 또는 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 조직에서 아밀로이드 침착을 감소시키고, 선택적으로 상기 적어도 하나의 조직은 하나 이상의 위, 결장, 좌골 신경 또는 후근 신경절을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 2회 투여 또는 전달되는, 방법 또는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 투여 또는 전달은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월 또는 15개월의 간격으로 발생하는, 방법 또는 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 5 내지 82로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 상기 인간 TTR 유전자에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 방법 또는 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 TTR 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에 있는, 방법 또는 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 상기 TTR 유전자의 양성 가닥에 있는 제1 표적 서열에 상보적이고, 상기 조성물은 상기 TTR 유전자의 음성 가닥에 있는 제2 표적 서열에 상보적인 제2 가이드 서열을 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 가이드(sgRNA)인, 방법 또는 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 5 내지 82의 가이드 서열 중 어느 하나 및 서열번호 3의 21번 내지 100번 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  58. 제56항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 87 내지 124로부터 선택되는 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 87 내지 124로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(phosphorothioate: PS) 결합 또는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  62. 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합, 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 3의 상기 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)와 관련이 있는, 방법 또는 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 LNP는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  66. 제64항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 생분해성의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  67. 제64항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 아민 지질, 예를 들어, CCD 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  68. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 보조 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  69. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 스텔스 지질을 포함하되, 선택적으로
    (i) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A, 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
    (ii) 상기 LNP는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 27-39.5 몰-%의 보조 지질; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 5 내지 7(예를 들어, 약 6)이고;
    (iii) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
    (iv) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
    (v) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 5 내지 15 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 6이고;
    (vi) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 0 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
    (vii) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 1 몰-% 미만의 중성 지질; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이고;
    (viii) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 지질 구성요소는 약 40 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 및 약 1.5 내지 10 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 10이며, 상기 LNP 조성물은 중성 인지질이 본질적으로 없거나 또는 없거나;
    (ix) 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 내지 60 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 8 내지 10 몰-%의 중성 지질; 및 약 2.5 내지 4 몰-%의 스텔스 지질(예를 들어, PEG 지질)을 포함하되, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질이고, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 3 내지 7인
    방법 또는 조성물.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 중성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 아민 지질, 예컨대, 지질 A; 약 9 몰-%의 중성 지질, 예컨대, DSPC; 약 3 몰-%의 스텔스 지질, 예컨대, PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG를 포함하며, 상기 지질 구성요소의 나머지는 보조 지질, 예컨대, 콜레스테롤이되, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 6인, 방법 또는 조성물.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 지질 구성요소를 포함하고, 상기 지질 구성요소는 약 50 몰-%의 지질 A; 약 9 몰-%의 DSPC; 약 3 몰-%의 PEG2k-DMG를 포함하며, 상기 지질 구성요소의 나머지는 콜레스테롤이되, 상기 LNP 조성물의 N/P 비는 약 6인, 방법 또는 조성물.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  74. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 mRNA인, 방법 또는 조성물.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리베이스인, 방법 또는 조성물.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하되,
    a. 상기 오픈 리딩 프레임은 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    b. 상기 오픈 리딩 프레임은 적어도 처음 30개, 50개, 70개, 100개, 150개, 200개, 250개 또는 300개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 서열번호 311과 적어도 95%의 동일성을 갖고;
    c. 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 코돈의 적어도 75%가 표 4에 열거된 코돈인 코돈의 세트로 구성되고;
    d. 상기 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 함량에서 최소 아데닌 함량의 150% 범위의 아데닌 함량을 갖고; 그리고/또는
    e. 상기 오픈 리딩 프레임은 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량에서 최소 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량의 150% 범위의 아데닌 다이뉴클레오타이드 함량을 갖는
    방법 또는 조성물.
  78. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 232, 234, 236, 238, 241 또는 275 내지 277 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 5' UTR; 및/또는 서열번호 233, 235, 237, 239 또는 240 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 3' UTR을 포함하는, 조성물 또는 방법.
  79. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이며, 상기 mRNA에서 우리딘의 적어도 10%가 변형된 우리딘으로 치환되는, 조성물 또는 방법.
  80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제는 변형되는, 방법 또는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 변형된 RNA-가이드된 DNA 결합제는 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이며, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 TTR을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유를 감소시키거나 또는 방지하는, 방법 또는 조성물.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-상동 말단 연결(NHEJ)은 상기 TTR 유전자에서 DSB의 복구 동안 돌연변이를 유발하는, 방법 또는 조성물.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 서열은,
    a) 서열번호 92 또는 104;
    b) 서열번호 87, 89, 96 또는 113;
    c) 서열번호 100, 102, 106, 111 또는 112; 또는
    d) 서열번호 88, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 101, 103, 108 또는 109
    를 포함하되, 선택적으로 상기 가이드 RNA는 일차 인간 간세포의 게놈의 단백질 코딩 영역에서 발생하는 표적외 부위(들)에서 indel을 생성하지 않는, 방법 또는 조성물.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 상기 대상체에서 TTR의 수준을 감소시키고, 선택적으로 상기 TTR의 수준은 적어도 50% 감소되는, 방법 또는 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 TTR의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌척수액 또는 가래 또는 간, 맥락망막, 및/또는 망막에서 측정되며, 선택적으로 상기 TTR의 수준은 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)을 통해 측정되는, 방법 또는 조성물.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 ATTR, 가족성 아밀로이드 다발신경병증 또는 가족성 아밀로이드 심근증을 갖는, 방법 또는 조성물.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법 또는 조성물.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 조성물 또는 제형을 투여하기 전 상기 TTR 유전자에서 특정 돌연변이에 대해 테스트되는, 방법 또는 조성물.
  91. ATTR을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제형의 용도.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117098541A (zh) 2020-11-25 2023-11-21 阿卡格拉医药公司 用于递送核酸的脂质纳米粒及相关使用方法
IL303506A (en) * 2020-12-11 2023-08-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compounds and methods for genome editing involving deamination
EP4322920A1 (en) * 2021-04-17 2024-02-21 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP4359531A1 (en) * 2021-06-22 2024-05-01 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for in vivo editing of a liver gene
WO2024003805A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Geneditbio Limited Methods and compositions for ttr gene editing and therapy using crispr system

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
ATE515510T1 (de) 1991-12-24 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP3553174A1 (en) 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
EA030650B1 (ru) 2013-03-08 2018-09-28 Новартис Аг Липиды и липидные композиции для доставки активных агентов
SG10201804973TA (en) * 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
JP6778175B2 (ja) 2014-07-16 2020-10-28 ノバルティス アーゲー 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
CA2978314A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
ES2968391T3 (es) 2015-09-21 2024-05-09 Trilink Biotechnologies Llc Cebadores oligonucleotídicos iniciadores con caperuza para sintetizar ARN con caperuza 5'
TWI773666B (zh) 2016-03-30 2022-08-11 美商英特利亞醫療公司 Crispr/cas 組分之脂質奈米粒子調配物
WO2018007871A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2018067447A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Itellia Therapeutics, Inc. Improved methods for identifying double strand break sites
IL311278A (en) * 2017-09-29 2024-05-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, preparations, and methods for genome editing
PT3688162T (pt) 2017-09-29 2024-04-23 Intellia Therapeutics Inc Formulações

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