KR20210152514A - 조작된 생산자 세포주 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

조작된 생산자 세포주 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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오브리 알. 티어넌
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울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 역가를 증가시키기 위해 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에 관한 것이다. 상기 조작된 세포주를 생성시키는 방법이 또한 본원에 기재되어 있다.

Description

조작된 생산자 세포주 및 그의 제조 및 사용 방법
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2019년 4월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/833,548; 2019년 4월 26일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/839,207; 및 2020년 2월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/979,483의 이익 및 그에 대한 우선권을 주장하며, 그의 개시내용은 모든 목적에 있어서 그 전문이 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 참조로 포함된다. 2020년 4월 9일에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 ULP-005WO_SL.txt이며, 크기가 113 kb 바이트이다.
개시내용의 분야
본 출원은 일반적으로 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 역가를 증가시키기 위한 조작된 생산자 및/또는 패키징 세포주 및 조작된 생산자 및/또는 패키징 세포주를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
rAAV-기반 벡터는 인간 유전자 요법의 가장 유망한 비히클 중 하나이다. rAAV 벡터는 매우 다양한 유전자 요법 적용분야에서 고려 중에 있다. 특히, rAAV 벡터는 분할 및 비분할 세포에 치료용 유전자를 전달할 수 있으며, 해당 유전자는 표적 세포의 게놈에 통합되지 않으면서 장기간의 기간 동안 지속될 수 있다. 지난 이십년 동안 rAAV를 생산하기 위한 시스템들이 발전되어 오기는 하였지만, 몇 가지 문제가 해결되지 않고 남아 있다. rAAV 생산 시스템의 한 가지 한계는 rAAV 입자의 낮은 역가 수율이다. 전임상 단계에서의 rAAV-기반 유전자 산물의 제약학적 개발은 인간에서의 투여량을 예측하는데 도움이 되는 완전한 독성학 및 생체분포 연구를 가능하게 하는 더 큰 종에서의 연구를 위한 다량의 rAAV 벡터를 필요로 한다. 또한, 현재의 rAAV 생산 시스템들은 낮은 역가 수율을 초래하기 때문에, 인간 시험 및 상업용 적용분야에서 사용하기에 충분한 수준의 rAAV를 제조하기가 까다롭다. 연구자들이 적정하게 높은 역가의 rAAV 입자를 생성시키기 위한 수많은 방법들을 모색하고 있기는 하지만, 이와 같은 문제를 해소하기 위한 커다란 요구가 여전히 존재한다. 특히, 높은 역가 수율로 고품질 rAAV를 생산할 수 있는 효율적인 세포주에 대한 요구가 존재한다. 본원에서 기재되는 조작된 세포주에 의한 고역가 rAAV의 생산은 생체내에서의 유전자 요법 사용에 대한 해당 벡터 시스템의 적용을 촉진한다.
본 개시내용은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질이 변형된 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공하는 것에 의해 유전자 요법 적용분야를 위한 개선된 rAAV 역가를 수득하는 것에 대한 요구를 해소한다. 본원에서 또한 기재되는 것은 rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질을 식별하는 방법, 및 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생성시키는 방법이다.
본원에서 기재되는 것은 대조군 모체 세포에 비해 더 높은 rAAV 역가를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생성시키는 조성물 및 방법이다. 더 구체적으로, 본원에서 제공되는 것은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조정되어 대조군 모체 세포에 비해 더 높은 rAAV 역가를 초래하는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다. 예를 들어, ATP5EP2 (ATP 신타제 F1 서브유닛 엡실론 위유전자 2), LINC00319 (긴 유전자간 비-단백질 코딩 RNA 319), CYP3A7 (시토크롬 P450 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 7), ABCA10 (ATP 결합 카세트 서브패밀리 A 구성원 10), NOG (노긴(Noggin)), RGMA (반발 유도 분자 BMP 보조-수용체 A), SPANXN3 (SPANX 패밀리 구성원 N3), PGA5 (펩시노겐 A5), MYRIP (미오신 VIIA 및 Rab 상호작용 단백질), KCNN2 (칼륨 칼슘-활성화 채널 서브패밀리 N 구성원 2) 및/또는 NALCN-AS1 (NALCN 안티센스 RNA 1)의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상응하는 비변형 모체 세포와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1으로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상응하는 모체 세포주와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 감소된 발현 및/또는 활성을 나타내는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 뉴클레아제, 이중 가닥 RNA (dsRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA) 또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용하여 1종 이상의 유전자의 발현이 감소되는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-11의 서열 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA를 사용하여 감소된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, ATP5EP2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 32의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, LINC00319의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 33의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, CYP3A7의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, NOG의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, SPANXN3의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, MYRIP의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 37의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, KCNN2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 38의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, NALCN-AS1의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, RGMA의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 40의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, PGA5의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 10의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 41의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, ABCA10의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 11의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 42의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키는데 사용되는 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 된클러스터링 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 연관 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소된다. 일부 실시양태에서는, 유전자를 표적화하여 그 유전자의 발현을 감소시키고/거나 그것을 제거하는데 가이드 RNA 쌍이 사용된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 발현은 가이드 RNA 쌍을 사용하여 감소되며, 여기서 각각의 가이드 RNA는 (a) 서열식별번호: 12-15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고/거나, (b) 서열식별번호: 16-31의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 선택된 표적 DNA 서열을 표적화한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, gRNA 쌍은 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA 쌍은 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 15의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 gRNA 분자는 그의 5' 및 3' 단부 중 어느 하나 또는 둘 다 상의 말단 3개 뉴클레오티드에 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 2' O-메틸 유사체이다.
특정 실시양태에서는, 1종의 가이드 RNA 쌍이 1종의 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된다. 다른 특정 실시양태에서는, 다중 가이드 RNA 쌍이 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 유전자의 유전자 발현, 및/또는 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 활성은 대조군 모체 세포주에 비해 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서 감소되고/거나 제거된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현 및/또는 활성은 대조군 모체 세포에 비해 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포에서는 제거된다.
본원에서 기재되는 일부 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 진핵 세포주이다. 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 인간 세포주이다. 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 곤충 세포주이다. 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 HeLa 세포주이다. 다른 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주이다.
본원에서 기재되는 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 대조군 모체 세포주에 비해 더 높은 rAAV 역가를 생산한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 생산자 세포주의 세포로부터 생산되는 rAAV 역가는 대조군 모체 세포를 포함하는 세포주로부터 생산되는 rAAV 역가에 비해 약 1.5 내지 약 7배 증가된다. 본원에서 또한 기재되는 것은 조작된 세포주의 용해물이다. 특정 실시양태에서, 더 높은 역가의 rAAV는 용해물로부터 수확된다. 본원에서 또한 기재되는 것은 조작된 세포주로부터의 세포 배양 상청액이다. 특정 실시양태에서, 더 높은 역가의 rAAV는 세포 배양 상청액으로부터 수확된다.
본원에서 또한 기재되는 것은 생산자 세포주를 생성시키는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 패키징 세포주의 세포에 rAAV 벡터를 전달하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 생산자 세포주를 생성시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 패키징 세포주의 세포에 rAAV 벡터를 전달하는 것을 포함한다.
본원에서 또한 기재되는 것은 패키징 세포주에 의해 생성된 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것에 의해 rAAV를 생산하는 방법으로서, 여기서 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 패키징 세포주에서 감소되는 것인 방법이다. 특정 실시양태에서는, KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 패키징 세포주에서 감소된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것에 의해 rAAV를 생산하는 방법으로서, 여기서 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 생산자 세포주에서 감소되는 것인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것에 의해 rAAV를 생산하는 방법으로서, 여기서 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 생산자 세포주에서 감소되는 것인 방법을 제공한다.
본원에서 또한 기재되는 것은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포주에 비해 감소되는 생산자 세포주로부터 rAAV를 수확하는 방법이다. 또한 기재되는 것은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포주에 비해 감소되는 생산자 세포주로부터 rAAV를 수확하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 생산자 세포주로부터의 rAAV의 생산은 대조군 모체 세포주에 비해 향상된다.
본원에서 또한 기재되는 것은 rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 i.) 세포주에서 rAAV 역가를 증가시키는 1종 이상의 보충제를 첨가하는 것; ii.) 보충 및 비-보충 세포주에서 트랜스크립톰에 대하여 전체 유전자 발현을 측정하는 것; iii.) 보충 및 비-보충 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 목록을 수득하는 것; 및 iv.) rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 식별되는 유전자(들)는 rAAV의 생산을 감소시키는 것을 담당한다.
본원에서 또한 기재되는 것은 rAAV의 증가된 생산을 촉진하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생산하는 방법이다. 일부 실시양태에서, rAAV 생산은 보충 및 비-보충 rAAV 생산자 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 목록으로부터 식별되는 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하는 것에 의해 증가된다. 특정 실시양태에서, rAAV 역가는 보충 및 비-보충 rAAV 생산자 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 목록으로부터 식별되는 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하는 것에 의해 증가된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 상기 조정은 조정이 없는 세포주의 rAAV 역가에 비해 적어도 1.5배 rAAV 역가를 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 발현을 조정하는 것은 1종 이상의 유전자의 발현 감소이다. 특정 실시양태에서, 발현을 조정하는 것은 1종 이상의 단백질의 발현 감소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현을 조정하는 것은 1종 이상의 유전자 발현의 제거이다. 특정 실시양태에서, 발현을 조정하는 것은 1종 이상의 단백질 발현의 제거를 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 진핵 세포주이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포주는 인간 세포주이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 곤충 세포주이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 HeLa 세포주이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주이다.
본원에서 또한 기재되는 것은 상응하는 비변형 모체 세포와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주이다.
일부 실시양태에서, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성은 무기한으로 또는 영구적으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 세포주는 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴 또는 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포주는 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포주는 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포주는 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포주는 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있다.
또한 제공되는 것은 패키징 및/또는 생산자 세포주로서, 여기서 상기 세포주는 상응하는 모체 세포주와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 감소된 발현 및/또는 활성을 나타낸다.
본 개시내용의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위에서 명백해질 것이다.
반대로 주지되지 않은 한, 본원의 모든 공개물, 참고문헌, 특허 및/또는 특허 출원 참고문헌은 모든 목적에 있어서 그 전문이 참조로 포함된다.
하기를 참조하면, 본 개시내용을 더 완전하게 이해할 수 있다.
도 1은 본원에서 기재되는 rAAV 패키징 및 생산자 세포의 생성 방법을 제시하는 개략도이다.
도 2A-2D는 HPRT1 siRNA 녹다운 실험의 최적화 및 개발로부터 생성되는 실험 데이터를 제시한다. 도 2A-2B는 24 웰에서 수행된 HPRT1 siRNA 녹다운 실험으로부터 생성되는 퍼센트 녹다운 (도 2A) 및 단백질 발현 (도 2B) 데이터를 제시한다. 도 2C-2D는 6 웰에서 수행된 HPRT1 siRNA 녹다운 실험으로부터 생성되는 퍼센트 녹다운 (도 2C) 및 단백질 발현 (도 2D) 데이터를 제시한다.
도 3A-3B는 비감염 세포 (헬퍼 바이러스로 감염되지 않은 세포)에 대비한 비보충 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 유전자 발현의 log 배수 변화, 그리고 비보충 세포 배양 배지에 대비한 보충된 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 유전자 발현의 log 배수 변화로 나타낸, PGA5 (도 3A) 및 SPANXN3 (도 3B)에 대한 RNA-Seq 데이터의 생물정보공학 분석으로부터 수득되는 유전자 발현의 log 배수 변화 값을 제시한다. 도 3C-3D는 비감염 세포에 대비한 비보충 및 보충 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 PGA5 (도 3C) 및 SPANXN3 (도 3D) 발현의 RT-qPCR 배수 변화 값을 제시한다.
도 4A-4B는 RT-qPCR에서 결정 시, 비감염 세포 (헬퍼 바이러스로 감염되지 않은 세포)에 대비한 비보충 세포 배양 배지 및 보충된 세포 배양 배지에서 배양된 생산자 세포주 클론에서의 PGA5 (도 4A) 및 SPANXN3 (도 4B) 발현의 배수 변화 값을 제시한다. 21C5, 3C6, 2B6는 HeLa 생산자 세포주의 상이한 클론을 나타낸다. 도 4C-4D는 비-보충 세포 배양 배지에서 배양된 클론과 비교한 보충 세포 배양 배지에서 배양된 생산자 세포주 클론 21C5, 3C6, 2B6에서의 PGA5 (도 4C) 및 SPANXN3 (도 4D) 발현의 상대적 배수 증가를 제시한다.
도 5A-5F는 rAAV 역가에 대한 상이한 생산자 세포주에서 개별 유전자의 발현을 감소시키는 것의 효과를 제시한다. 도면은 생산자 세포주 # 1 (도 5A), 생산자 세포주 # 2 (도 5B) 및 생산자 세포주 # 3 (도 5C)에서의 밀리리터 (mL)당 게놈 카피 (GC)로 나타낸 생산된 rAAV의 역가를 제시한다. 도 5D-5F는 생산자 세포주 # 1 (도 5D), 생산자 세포주 # 2 (도 5E) 및 생산자 세포주 # 3 (도 5F)으로부터 생산되는 rAAV 역가의 배수 변화를 제시한다. 도 5A-5B는 3개 생물학적 반복에 걸친 평균을 나타낸다. 도 5C-5F는 4개 생물학적 반복에 걸친 평균을 나타낸다.
도 6은 대표적인 유전자 필터링 방법론을 제시하는 예시적인 흐름도이다.
도 7A는 상위 19개 2H5 녹아웃 클론의 24 딥 웰 역가를 제시한다. 역가는 mL당 게놈 카피로 기록하였다. 대조군 샘플은 비변형 2H5이다. 도 7B는 2H5 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 2H5 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 2H5 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다. 도 7C는 상위 19개 7B12 녹아웃 클론의 24 딥 웰 역가를 제시한다. 역가는 mL당 게놈 카피로 기록하였다. 대조군 샘플은 비변형 7B12이다. 도 7D는 7B12 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 7B12 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 7B12 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다.
도 8A는 상위 5개 2H5 녹아웃 클론의 ambr® 15 역가를 제시한다. 역가는 mL당 게놈 카피로 기록하였다. 대조군 샘플은 비변형 2H5이다. 도 8B는 2H5 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 2H5 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 2H5 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다. 도 8C는 상위 4개 7B12 녹아웃 클론의 ambr® 15 역가를 제시한다. 역가는 mL당 게놈 카피로 기록하였다. 대조군 샘플은 비변형 7B12이다. 도 8D는 7B12 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 7B12 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 7B12 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다.
도 9A-9B는 2종의 생산자 세포주에서의 다양한 유전자 조합의 발현을 감소시키는 것에 의한, 생성되는 rAAV 역가에 대한 효과를 제시한다. 도면은 미스센스 siRNA로 처리된 대조군에 비교한 rAAV 역가의 배수 변화를 제시한다. 도 9A는 2H5 미스센스 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 2H5 미스센스 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 2H5 미스센스 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다. 도 9B는 7B12 미스센스 대조군에 비교한 역가의 배수 변화를 제시한다. 7B12 미스센스 역가는 1로 설정하였으며, 다른 역가는 7B12 미스센스 대조군을 상회하는 배수 증가로 나타내었다.
본 개시내용은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조정되는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주에 대해 기재한다. 유전자 발현의 상기 조정은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조정되지 않은 세포주에 비해 증가된 역가 수율을 초래한다.
달리 주지되지 않는 한, 기술 용어들은 통상적인 용법에 따라 사용된다. 일반적인 분자 생물학 용어들의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8]에서 찾아볼 수 있다.
하기의 정의들은 본 발명 주제를 이해할 목적으로, 그리고 첨부된 특허 청구범위를 구축하기 위하여 포함된다. 본원에서 사용되는 약어들은 화학 및 생물학 기술분야 내에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, "조정" 또는 "조정하다"는 유전자 및/또는 단백질의 조절, 발현 또는 활성의 변경을 지칭한다. 조정은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 것, 감소시키는 것 (감축하는 것) 또는 제거하는 것일 수 있다. 다수 종의 유전자 및/또는 단백질이 조정되는 경우, 모든 유전자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성이 증가될 수 있거나, 모든 유전자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성이 감소될 수 있거나, 또는 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질은 증가되고 다른 유전자 및/또는 단백질은 감소될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포"라는 용어는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산할 수 있는 임의의 세포 또는 세포들을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, HeLa 세포, COS 세포, HEK293 세포, A549 세포, BHK 세포 또는 Vero 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포, Sf-21 세포, Tn-368 세포 또는 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브(High-Five)) 세포이다. "세포주"라는 용어는 계속 분할할 수 있으며 노화를 겪지 않는 세포의 클론 군집을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, "세포" 또는 "세포주"라는 용어는 나타낸 세포 또는 세포주의 변형되거나 조작된 변이체를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조작된 세포주"라는 용어는 rAAV의 생산을 증대시키기 위하여 1종 이상의 내인성으로 발현되는 유전자 및/또는 단백질 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1)의 발현 또는 다른 특성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 감소시키는 1종 이상의 수단에 의해 변형된 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대조군 모체 세포"라는 용어는 rAAV의 생산을 증대시키기 위하여 1종 이상의 내인성으로 발현되는 유전자 및/또는 단백질 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1)의 발현 또는 다른 특성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 감소시키는 1종 이상의 수단에 의해 변형되지 않은 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대조군 모체 세포주"라는 용어는 계속 분할할 수 있으며 노화를 겪지 않는 대조군 모체 세포의 클론 군집을 지칭한다.
"용해"는 종종 그의 완전성을 훼손하는 바이러스, 효소 또는 삼투 메카니즘에 의한 세포의 붕괴를 지칭한다. "용해된 세포"는 실질적인 용해를 겪은 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "용해물"이라는 용어는 용해된 세포의 내용물을 함유하는 유체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "더 높은 역가"라는 용어는 비변형 대조군 모체 세포주 및/또는 대조군 모체 세포에 의해 생산되는 역가와 비교하여 증가된 역가를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포 배양 상청액"이라는 용어는 세포가 현탁되고/거나 배양되는 세포 배양 배지를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자"라는 용어는 전사 단위, 그리고 전사 단위에 인접하여 (예를 들어, 그의 상류 및 하류에 위치하여) 그와 작용가능하게 연결되는 조절 영역을 지칭한다. 전사 단위는 RNA 분자로 전사되는 일련의 뉴클레오티드이다. 전사 단위는 코딩 영역을 포함할 수 있다. "코딩 영역"은 차후에 mRNA로 프로세싱되는, 비프로세싱된 프리RNA (즉 엑손 및 인트론 둘 다를 포함하는 RNA 분자)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 전사 단위는 비-코딩 RNA를 코딩할 수 있다. 비-코딩 RNA는 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자이다. 비-코딩 RNA의 예에는 마이크로RNA가 포함된다. 전사 단위의 경계는 일반적으로 그의 5' 단부의 개시 부위 및 그의 3' 단부의 전사 종결인자에 의해 결정된다. "조절 영역"은 그것이 작용가능하게 연결되는 전사 단위의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절 서열의 비제한적인 예에는 프로모터, 인핸서, 전사 개시 부위, 번역 개시 부위, 번역 중지 부위, 전사 종결인자 및 폴리(A) 신호가 포함된다. 전사 단위의 상류에 위치하는 조절 영역은 5' UTR로 지칭될 수 있으며, 전사 단위의 하류에 위치하는 조절 영역은 3' UTR로 지칭될 수 있다. 조절 영역은 전사되어 비프로세싱된 프리RNA의 일부가 될 수 있다.
본 문서의 맥락에서, "표적" 또는 "표적 유전자"라는 용어는 단백질-코딩 유전자, 그리고 조정될 경우 바이러스 생산의 일부 측면을 변경시키는 비-코딩 RNA (예를 들어, miRNA)를 코딩하는 유전자를 포함한 임의의 유전자를 지칭한다. 표적 유전자에는 내인성 유전자, 바이러스 유전자 및 트랜스진이 포함된다.
유전자 칭호와 관련하여, 단일 유전자가 종종 다수의 기호로 표시되기도 한다. 본 문서의 맥락에서, 유전자 기호는 그것이 인간의 것인지 또는 비-인간의 것인지에 관계없이 대문자 또는 소문자 중 어느 하나로 지정될 수 있다. 본 개시내용의 문맥에서, 한 가지 특정한 기호의 사용은 물론 소문자 또는 대문자 기호의 채택 중 어느 것도 유전자의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 달리 밝히지 않는 한, 본원에서 식별되는 모든 유전자 식별 번호 (GeneID)는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) "엔트레즈(Entrez) 유전자" 또는 KEGG 웹 사이트에서 유래한다.
"약"이라는 용어는 본원에서 대략, 정도, 거의 또는 가량을 의미하는데 사용된다. 숫자 범위와 연계되어 "약"이라는 용어가 사용되는 경우, 그것은 허용가능한 값 범위 내에서 제시되는 숫자 값 초과 및/또는 미만으로 경계를 연장하는 것에 의해 그 범위를 수식한다.
본 개시내용에서 사용된 바와 같이, 연결 어구인지 또는 청구범위의 내용인지에 관계없이 "포함하다" 및 "포함하는"이라는 용어는 개방-종료형의 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 가지는" 또는 "적어도 포함하는"의 구와 동의어로 해석되어야 한다. 방법의 맥락에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는 방법이 적어도 언급되는 단계를 포함하나 추가적인 단계도 포함할 수 있음을 의미한다. 조성물의 맥락에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는 조성물이 적어도 언급되는 특색 또는 성분을 포함하나 추가적인 특색 또는 성분도 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에서 기재되는 실시양태의 이해를 용이하게 할 목적으로, 바람직한 실시양태를 참조하며 그것을 기재하기 위해 특정 언어가 사용된다. 본원에서 사용되는 전문용어는 특정한 실시양태만을 기재할 목적의 것이며, 본 개시내용의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용될 때, 단수 형태는 문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본원에서 사용되는 모든 백분율 및 비는 달리 나타내지 않는 한 중량 기준이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되는 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료들이 본 개시내용을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있기는 하지만, 하기에서는 적합한 방법 및 재료를 기재한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로서 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에서 언급되는 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참조로 포함된다.
아데노 -연관 바이러스 ( AAV )
AAV는 인간 및 일부 다른 영장류 종들을 감염시키는 소형의 복제-결함성인 비-외피보유 바이러스이다. AAV는 질환을 야기하지는 않으며, 매우 약한 면역 반응을 도출하는 것으로 알려져 있다. AAV를 이용하는 유전자 요법 벡터는 분할 세포 및 휴지 세포 둘 다를 감염시킬 수 있으며, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 지속될 수 있다. 이러한 특색은 AAV를 매력적인 유전자 요법용 바이러스 벡터가 되게 한다. AAV는 혈청형 AAV-1 내지 AAV-12은 물론, 비인간 영장류 유래의 100종을 초과하는 혈청형들을 포함한 수많은 혈청학적으로 구분가능한 유형들을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Srivastava, J. Cell Biochem., 105(1): 17-24 (2008)] 및 [Gao et al., J. Virol., 78(12), 6381-6388 (2004)] 참조). AAV는 비-자동 복제성이며, 잠복기 및 감염기를 포함하는 생활 주기를 갖는다. 세포가 AAV로 감염된 후, 잠복기에, AAV는 프로바이러스로서 숙주의 게놈에 부위-특이적으로 통합된다. AAV가 복제되는 것을 가능하게 하는 헬퍼 바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 (AV) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스)로 세포가 또한 감염되지 않는 한, 감염기는 발생하지 않는다.
야생형 AAV 게놈은 AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 유도하는 신호 서열을 포함하는 2개의 145 뉴클레오티드 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. ITR 이외에, 3개의 AAV 프로모터인 p5, p19 및 p40이 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개 오픈 리딩 프레임의 발현을 추진한다. 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 연계되는 2개의 rep 프로모터는 rep 유전자로부터의 4종의 rep 단백질 (Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40)의 생산을 초래한다. rep 단백질은 게놈 복제를 담당한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, cap 유전자의 스플라이스 변이체인 3종의 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)을 코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 형성한다.
복제, 캡시드화 및 통합을 위한 시스-작용 신호가 ITR 내에 포함되어 있기 때문에, 4.3 kb 내부 게놈의 일부 또는 전부가 외래 DNA, 예를 들어, 관심 외인성 단백질용 발현 카세트로 대체될 수 있다. 이와 같은 경우에서, rep 및 cap 단백질은, 예를 들어, 플라스미드 상에 트랜스로 제공된다. AAV 벡터를 생산하기 위해서는, AAV 복제에 대하여 허용성인 세포주가 rep 및 cap 유전자, ITR-플랭킹된 발현 카세트, 및 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 헬퍼 기능, 예를 들어 AV 유전자 E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 및 VA를 발현해야 한다 (문헌 [Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1-23, 2011]). AAV 벡터의 생산은 헬퍼 바이러스 입자의 생산도 초래할 수 있는데, 그것은 AAV 벡터의 사용 전에 제거되거나 불활성화되어야 한다. HEK293 세포, COS 세포, HeLa 세포, BHK 세포, Vero 세포는 물론, 곤충 세포를 포함하여, 수많은 세포 유형들이 AAV 벡터를 생산하는데 적합하다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,156,303, 5,387,484, 5,741,683, 5,691,176, 5,688,676, 8,163,543, 미국 공개 번호 20020081721, PCT 공개 번호 WO00/47757, WO00/24916 및 WO96/17947 참조). 이러한 세포 유형들에서, AAV 벡터는 전형적으로 ITR-플랭킹된 발현 카세트를 포함하는 1종의 플라스미드, 그리고 추가적인 AAV 및 헬퍼 바이러스 유전자를 제공하는 1종 이상의 추가적인 플라스미드에 의해 생산된다.
어떠한 혈청형의 AAV도 본 개시내용에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 어떠한 AV 유형도 사용될 수 있을 것으로 생각되는데, 관련 기술분야 통상의 기술자라면 그의 원하는 재조합 AAV 벡터 (rAAV)의 생산에 적합한 AAV 및 AV 유형을 식별할 수 있을 것이다. AAV 및 AV 입자는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 아이오딕사놀 구배 또는 CsCl 구배에 의해 정제될 수 있다.
야생형 AAV의 게놈은 단일-가닥 DNA이며, 4.7 kb이다. AAV 벡터는 크기가 4.7 kb이거나, 또는 5.2 kb만큼 큰 초과크기의 게놈 또는 3.0 kb만큼 작은 것을 포함하여 4.7 kb에 비해 더 크거나 더 작은 단일-가닥 게놈을 가질 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 실질적으로 자가-상보성일 수 있어서, 바이러스 내에서는 게놈이 실질적으로 이중 가닥이다. 모든 유형의 게놈을 포함하는 AAV 벡터가 본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합하다.
상기에서 논의된 바와 같이, AAV는 그의 생활 주기 중 감염기에 진입하기 위하여 헬퍼 바이러스로의 공동-감염을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스에는 아데노바이러스 (AV) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)가 포함되며, 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포에서 AAV를 생산하기 위한 시스템이 존재한다. 또한, 파필로마 바이러스가 AAV를 위한 헬퍼 기능을 제공할 수도 있다고 제안되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hermonat et al., Molecular Therapy 9, S289-S290 (2004)] 참조). 헬퍼 바이러스에는 AAV 복제를 창출하고 가능하게 할 수 있는 모든 바이러스가 포함된다. AV는 대략 36 kb의 이중-가닥 DNA 게놈을 갖는 비외피보유 핵 DNA 바이러스이다. AV는 E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 및 VA 유전자를 제공하여 AAV 복제 및 캡시드화를 가능하게 하는 것에 의해, 세포 중 잠복성 AAV 프로바이러스를 구제할 수 있다. HSV는 지질 이중층 외피 중에 랩핑되어 있는 20면체 캡시드에 캡시드화된 상대적으로 큰 이중-가닥 선형 DNA 게놈을 갖는 바이러스의 패밀리이다. HSV는 감염성이며, 고도로 전파성이다. 하기 HSV-1 복제 단백질이 AAV 복제에 필요한 것으로 식별되어 있다: 헬퍼 기능을 향상시키는 다른 단백질과 함께, 헬리카제/프리마제 복합체 (UL5, UL8 및 UL52) 및 UL29 유전자에 의해 코딩되는 DNA 결합 단백질 ICP8. AAV 패키징 시스템은 하기 두 가지 목적으로 사용된다: 그것은 형질감염 과정의 문제를 우회하며, 1종 또는 수종의 헬퍼 기능의 사용을 바탕으로 하는 생산 기술을 제공한다.
rAAV의 생산
rAAV의 일반적인 원리는 다른 어딘가에서 고찰할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539]; 및 [Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129)] 참조). 일반적으로 말하자면, rAAV의 생산을 가능하게 하기 위해서는, 예를 들어, 관심 이종유래 뉴클레오티드 서열에 플랭킹할 수 있는 AAV ITR, AAV rep 및 cap 유전자 기능은 물론, 추가적인 헬퍼 기능들이 세포에 제공되어야 한다. 이들은 임의 수의 적절한 플라스미드 또는 벡터를 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 추가적인 헬퍼 기능은, 예를 들어, 아데노바이러스 (AV) 감염에 의해, 모든 필요한 AV 헬퍼 기능 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해, 또는 HSV 또는 바큘로바이러스와 같은 다른 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 세포에 의한 rAAV 생산에 필요한 임의의 유전자, 유전자 기능 또는 유전 물질은 세포 내에 일시적으로 존재할 수 있거나, 또는 세포 게놈에 안정하게 삽입될 수 있다. 본 개시내용의 방법과 함께 사용하기에 적합한 rAAV 생산 방법에는 문헌 [Clark et al., Human Gene Therapy 6:1329-1341 (1995)], [Martin et al., Human Gene Therapy Methods 24:253-269 (2013)], [Thorne et al., Human Gene Therapy 20:707-714 (2009)], [Fraser Wright, Human Gene Therapy 20:698-706 (2009)] 및 [Virag et al., Human Gene Therapy 20:807-817 (2009)]에 개시되어 있는 것들이 포함된다. AAV 생산 시스템을 위한 두 가지 주요 접근법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 세포주 및 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 생산자 세포주이다.
재조합 아데노 -연관 바이러스 ( rAAV ) 패키징 및/또는 생산자 세포주
rAAV 패키징 세포주는 본원에서 기재되는 AAV 유전자 요소의 세포 발현을 가능하게 하는 것에 의해 생산될 수 있다. AAV rep 및 cap 유전자를 코딩하는 플라스미드에 의한 세포주 (예를 들어, HEK293, HeLa)의 안정한 형질감염은 패키징 세포주의 생산을 초래할 수 있다. 이와 같은 rAAV 패키징 세포주는 rAAV 입자를 생산하기 위하여 2종의 상이한 아데노바이러스 (헬퍼 바이러스 및 AAV 유전자-요법 요소를 포함하는 하이브리드 바이러스)로 공동-감염될 수 있다. 대안적으로, rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드에 의한 패키징 세포의 안정한 형질감염 또는 rAAV 벡터로의 그의 감염은 rAAV 생산자 세포주로 이어진다. 헬퍼 바이러스에 의한 생산자 세포의 감염은 rAAV의 생산으로 이어진다. 도 1은 패키징 및 생산자 세포주를 도시한다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, AAV rep 및 cap 유전자 기능을 포함하는 rAAV 패키징 세포주는 rAAV 역가가 증가되도록 조작된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 세포주를 제공한다. 예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 세포주를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 생산자 세포주를 제공한다. 예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 생산자 세포주는 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 유전자 발현이 감소되도록 조작되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 세포주는 부착 또는 현탁 형태로 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)는 포유동물 세포주 (예를 들어, HeLa, 인간 배아 신장 (HEK) 293, COS, A549 또는 Vero 세포주)이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 곤충 세포주 (예를 들어, Sf9, Sf-21, Tn-368 또는 BTI-Tn-5B1-4)이다.
rAAV 생산자 세포주를 생성시키는 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 조작된 rAAV 패키징 세포주에 rAAV 벡터를 전달하는 것에 의해 생산자 세포주를 생성시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 조작된 rAAV 패키징 세포주에 rAAV 벡터를 전달하는 것에 의해 생산자 세포주를 생성시키는 방법을 제공한다.
보충제
본원에서 사용된 바와 같이, "보충제"라는 용어는 기원이 화학적인지 또는 생물학적인지에 관계없이, rAAV 역가를 증가시키거나 rAAV 역가의 증가를 검정하기 위하여 세포 배양용 배지에 사용될 수 있는 임의의 화합물 또는 다른 물질을 지칭한다. 보충제의 비-제한적인 예에는 아미노산, 염, 금속, 당, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 단백질, 효소, 뉴클레오시드, 대사물, 계면활성제, 유화제, 무기 염 및 중합체가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에 첨가되는 1종 이상의 보충제는 글루코코르티코이드 유사체이다. 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에 첨가되는 1종 이상의 보충제에는 덱사메타손, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 코르티손, 프레드니손, 부데소니드 및/또는 트리암시놀론이 포함된다.
특정 실시양태에서, rAAV 역가를 증가시키기 위한 용액 중 글루코코르티코이드 유사체의 농도는 1 μM 이상, 0.1 μM 이상, 0.01 μM 이상, 0 내지 1 μM, 0 내지 0.1 μM, 0 내지 0.01 μM, 0.01 내지 1 μM 또는 0.01 내지 0.1 μM일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보충 세포주"는 rAAV 역가를 증가시키기 위하여 1종 이상의 보충제 (예를 들어, 글루코코르티코이드 유사체)가 첨가되어 있는 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-보충 세포주"는 rAAV 역가를 증가시키기 위한 보충제 또는 보충제들에 노출되지 않은 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-보충" 및 "비보충"이라는 용어는 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)가 rAAV 역가를 증가시키기 위한 보충제 또는 보충제들에 노출되지 않은 배양 조건을 지칭하여 호환가능하게 사용된다.
rAAV 생성과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법
본 개시내용은 부분적으로 보충 및 비-보충 세포주에서 전체 유전자 발현 패턴을 비교하는 것에 의해 rAAV의 생성과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법에 관한 것이다.
"전체 유전자 발현"이라는 용어에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (문헌 [Wang Z. et al., Nature Reviews Genetics, 10(1), 57-63 (2009)] 참조). "전체 유전자 발현"이라는 용어는 유전자 발현의 상이한 측면들에 관한 정보를 포함하는 1종 이상의 데이터 세트를 지칭한다. 상기 데이터 세트는 임의적으로 하기에 관한 정보를 포함한다: 세포 또는 세포-유래 샘플 중 표적-전사체의 존재; 표적 전사체의 상대적 및 절대적 풍부도 수준; 특정 유전자의 발현을 조정하는 다양한 처리 (예를 들어, 보충제의 첨가)의 능력; 및 특정 유전자의 발현을 상이한 수준으로 변화시키는 다양한 처리 (예를 들어, 보충제의 첨가)의 능력.
"차등적으로 발현되는"이라는 용어에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (문헌 [Wang Z. et al., Nature Reviews Genetics, 10(1), 57-63 (2009)], [Ozsolak , F. et al. Nature Reviews Genetics, 12(2), 87-98 (2011)], [Han, Y. et al. Bioinformatics and Biology Insights, 9, 29-46 (2015)] 참조).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)에는 rAAV의 생산을 증가시키는 1종 이상의 보충제가 보충된다. 일부 실시양태에서는, 널리 알려져 있는 절차 중 어느 것을 사용하여 1종 이상의 세포주 (보충 및 비-보충)로부터 RNA 샘플이 추출된다. 예를 들어, 자동화-적합성 96-웰 포맷, 예컨대 알엔이지(Rneasy)® 정제 플랫폼 (퀴아젠, 인크.(Qiagen, Inc.); 캘리포니아주 발렌시아 소재)에서 실리카-기반 단리를 사용하여 세포로부터 총 RNA가 정제될 수 있다.
발현된 RNA 샘플에서의 유전자 발현 패턴은 정성적 및 정량적 수단 중 어느 하나 (또는 둘 다)에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 다른 발현 산물에 대비하고/거나 대조군 서열에 대비하여 유전자의 발현 수준을 정량화하는 것이 유용하다. 한 가지 통상적이고 광범위하게 적용가능한 상대적 발현의 결정 방법은 하우스키핑 유전자 (예를 들어, HPRT1, HSP70 또는 β-액틴)와 같은 대조군 유전자의 발현에 대하여 1종 이상의 관심 유전자의 발현을 비교하는 것이다.
관찰되는 발현 데이터, 예를 들어, 생물학적 샘플 (예를 들어, 보충 및 비-보충 세포주)의 1종 이상의 처리 (예를 들어, 보충제의 첨가)에 반응하는 유전자 발현 프로파일의 변화가 유의성이 있으며 예를 들어 단지 실험 노이즈 또는 군집 비균질성의 산물이 아닌지 여부를 확인하기 위해서는, 각각의 생물학적 샘플에서의 각각의 유전적 및 표현형적 종말점에 대하여 가능성 분포의 추정치가 구축될 수 있다. 추정 군집 분포의 구축은 각각의 처리에 대하여 다수의 독립적인 실험을 전개하는 것을 수반하며, 예를 들어, 모든 실험이 이중, 삼중, 사중 등으로 전개된다. 다수의 생물학적 샘플 (예를 들어, 보충 및 비-보충 세포주)로부터의 발현 데이터는 다변량 통계학을 사용하여 그룹화 또는 클러스터화될 수 있다. 데이터의 분석은, 예를 들어, 보충 및 비-보충 세포주 사이에서 처리에 반응하여 차등적으로 발현되는 유전자의 목록을 생산할 수 있다. 차등적으로 발현되는 유전자의 목록은 rAAV의 생산을 증가시키는데 유용한 1종 이상의 유전자를 식별하기 위하여 다양한 유전자 필터링 방법론을 사용하여 필터링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV의 생산과 관련성이 있는 보충 및 비-보충 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자 목록으로부터의 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포주는 진핵 세포주이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포주는 인간 세포주이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포주는 HeLa 세포주 또는 HEK293 세포주이다. 특정 실시양태에서는, rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하기 위하여, 상이한 세포주들을 교차하여 (예를 들어, 비-보충 HeLa 및 보충 HeLa 세포주 사이, 비-보충 HEK 293 및 보충 HEK 293 세포주 사이, 비-보충 HeLa 및 보충 HEK 293 세포주 사이, 비-보충 HeLa 및 비-보충 HEK 293 세포주 사이, 보충 HeLa 및 보충 HEK 293 세포주 사이) 전체 유전자 발현이 측정된다. 특정 실시양태에서는, rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하기 위하여, 보충 HEK 293 및 보충 HeLa로부터의 조합된 전체 유전자 발현 데이터가 조합되어 비-보충 HEK 293 및 비-보충 HeLa 세포주로부터의 전체 유전자 발현 데이터와 비교될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV의 증가된 생산을 촉진하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 보충 및 비-보충 rAAV 생산자 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자 목록에서 식별된 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하는 것에 의해 rAAV 생산이 증가된다. 특정 실시양태에서, 보충 및 비-보충 rAAV 생산자 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자 목록에서 식별된 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하는 것에 의해 rAAV의 역가가 증가된다. 일부 실시양태에서, rAAV 역가는 상응하는 유전자(들) 및/또는 단백질(들) 발현의 조정이 없는 세포주에 의해 생산되는 rAAV 역가에 비해 적어도 1.5배 (예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배 또는 30배) 증가된다.
조정된 유전자 및/또는 단백질
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서 (개별적으로 또는 조합으로써) 조정될 경우 rAAV의 생산을 향상시키는 유전자의 목록을 제공한다.
ATP 신타제 F1 서브유닛 엡실론 위유전자 2 (ATP5EP2로도 알려져 있음)는 미토콘드리아의 ATP 신타제 서브유닛 엡실론-유사 단백질을 코딩한다. ATP5EP2는 호흡 연쇄의 전자 수송 복합체에 의해 생성되는 멤브레인을 가로지르는 양성자 구배의 존재 하에 ADP로부터 ATP를 생산하는 미토콘드리아 멤브레인 ATP 신타제이다. 인간 ATP5EP2 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_006886.4 (서열식별번호: 43) 또는 NG_053163.1 (서열식별번호: 44) 하에 가용하다.
긴 유전자간 비-단백질 코딩 RNA 319 (LINC00319로도 알려져 있음)는 RNA 유전자로서, 비-코딩 RNA 클래스와 관계가 있다. 긴 비-코딩 RNA (lncRNA)는 다수 암의 발병기전 및 진행에서 중요한 조절 역할을 하는 것으로 제시된 바 있다. LINC00319 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_194309 (서열식별번호: 45) 또는 NR_026960.1 (서열식별번호: 46) 하에 가용하다.
시토크롬 P450 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 7 (CYP3A7로도 알려져 있음)은 약물 대사, 그리고 콜레스테롤, 스테로이드 및 다른 지질의 합성에 참여하는 시토크롬 P450 효소 슈퍼패밀리의 구성원을 코딩하는 유전자이다. 이와 같은 효소는 임신 동안 에스트리올의 형성에 수반되는 테스토스테론 및 데히드로에피안드로스테론 3-술페이트를 히드록실화한다. 이와 같은 유전자는 염색체 7q21.1상 관련 유전자들의 클러스터의 일부이다. CYP3A7 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_000765 (서열식별번호: 47) 하에 가용하다.
ATP 결합 카세트 서브패밀리 A 구성원 10 (ABCA10으로도 알려져 있음)은 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체 슈퍼패밀리의 구성원에 속하는 멤브레인-연관 단백질을 코딩한다. ABC 단백질은 세포외 및 세포내 멤브레인들을 가로질러 다양한 분자들을 수송한다. ABC 유전자는 7종의 구별되는 서브패밀리 (ABC1, MDR/TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20 및 화이트(White))로 나누어진다. ABCA10은 ABC1 서브패밀리의 구성원이다. ABC1 서브패밀리의 구성원은 전적으로 다세포 진핵생물에서 발견되는 유일한 주 ABC 서브패밀리를 포함한다. 이와 같은 유전자는 17q24상 4종의 다른 ABC1 패밀리 구성원들과 함께 클러스터화된다. ABCA10 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_080282.3 (서열식별번호: 48) 하에 가용하다.
노긴 (NOG로도 알려져 있음)은 골 형태형성 단백질-4 (BMP4)와 같은 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리 신호전달 단백질의 구성원에 결합하여 그것을 불활성화하는 분비 폴리펩티드를 코딩한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원에 비해 더 효율적으로 세포외 매트릭스를 통하여 확산하는 것에 의해, 이와 같은 단백질은 형태형성 구배를 창출하는데 주요한 역할을 할 수 있는 것으로 여겨진다. NOG는 발생 초기는 물론 후기 단계 둘 다에 다형발현 효과를 갖는 것으로 보인다. NOG 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_005450.4 (서열식별번호: 49) 하에 가용하다.
반발 유도 분자 BMP 보조-수용체 A (RGMA로도 알려져 있음)는 반발 유도 분자 패밀리의 구성원을 코딩하는 유전자이다. 코딩되는 단백질은 발생 및 성체 중추신경계에서 축삭 유도 단백질로 기능하는 글리코실포스파티딜이노시톨-고정 당단백질이다. 이와 같은 단백질은 일부 암에서는 종양 억제인자로 기능할 수도 있다. RGMA 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_020211.2 (서열식별번호: 50) 또는 NM_001166283.1 (서열식별번호: 51) 하에 가용하다.
SPANX (X 염색체상 핵과 연관되어 있는 정자 단백질) 패밀리 구성원 N3 (SPANXN3로도 알려져 있음)는 단백질 코딩 유전자이다. SPANXN3 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_001009609 (서열식별번호: 52) 하에 가용하다.
펩시노겐-5, 그룹 I (PGA5 또는 펩시노겐 A로도 알려져 있음)은 엔도펩티다제 중 펩티다제 A1 패밀리의 구성원인 소화 효소 펩신의 단백질 전구체를 코딩한다. 코딩되는 전구체는 위 으뜸 세포에 의해 분비되며, 산성 조건에서 자가촉매촉진 절단에 적용되어 식이 단백질의 소화에서 기능하는 활성 효소를 형성한다. 이와 같은 유전자는 각각 다수의 펩시노겐 중 1종을 코딩하는 염색체 11상 관련 유전자 클러스터에서 발견된다. PGA5 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_014224.4 (서열식별번호: 53) 하에 가용하다.
미오신 VIIA 및 Rab 상호작용 단백질 (MYRIP으로도 알려져 있음)은 멜라닌소체-결합 RAB27A와 운동 단백질 MYO5A 및 MYO7A 사이의 고리로 작용하는 멜라닌소체 수송에 수반된 Rab 이펙터 단백질을 코딩한다. 이와 같은 Rab 이펙터 단백질은 단백질 키나제 A-고정 단백질 (AKAP)로 기능하며, 세포외유출 기구의 구성요소에 PKA를 연결하는 스캐폴딩 단백질로 작용함으로써 인슐린 방출을 포함한 세포외유출을 촉진할 수 있다. MYRIP 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_015460 (서열식별번호: 54) 또는 NM_001284423.1 (서열식별번호: 55) 하에 가용하다.
칼륨 칼슘-활성화 채널 서브패밀리 N 구성원 2 (KCNN2로도 알려져 있음) 유전자는 칼륨 채널 유전자 중 KCNN 패밀리의 구성원이다. 코딩되는 단백질은 3개의 다른 칼모듈린-결합 서브유닛과 전압-비의존성 칼슘-활성화 채널을 형성하는 통합 멤브레인 단백질이다. 이와 같은 유전자의 대안적인 스플라이싱은 다수의 전사체 변이체로 이어진다. KCNN2 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NM_170775.2 (서열식별번호: 56) 또는 NM_001278204.1 (서열식별번호: 57) 하에 가용하다.
NALCN 안티센스 RNA 1 (NALCN-AS1으로도 알려져 있음)은 RNA 유전자로서, 비-코딩 RNA 클래스와 관계가 있다. NALCN-AS1 서열의 예는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스 (뉴클레오티드 서열)에서 참조 서열 NW_011332700.1 (서열식별번호: 58) 또는 NR_047687.1 (서열식별번호: 59) 하에 가용하다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서 개별적으로 조정될 경우 대조군 모체 세포주에 비해 rAAV의 생산을 향상시키는 유전자의 목록을 제공한다. 일부 측면에서는, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 상이한 유전자 조합의 조정이 rAAV의 생산을 증가시킨다. 일부 측면에서는, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종 또는 적어도 11종의 유전자의 발현을 조정하는 것이 대조군 모체 세포주에 비해 증가된 rAAV 생산으로 이어진다.
1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조정 방법
유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 또는 NALCN-AS1)의 발현 또는 활성을 조정하는 것 (예를 들어, 감소시키는 것)은 비제한적으로 하기 중 1종 이상을 변경시키는 것을 포함한 상이한 메카니즘에 의해 달성될 수 있다: 1) 유전자 카피 수, 2) 유전자의 전사 또는 번역, 3) 전사체 안정성 또는 수명, 4) mRNA 또는 miRNA의 카피 수, 5) 비-코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA 표적 부위의 가용성, 6) 단백질상 번역-후 수식의 위치 또는 정도, 또는 7) 단백질의 활성. 유전자 발현을 조정하는데 사용될 수 있는 도구에는 뉴클레아제, 이중 가닥 RNA (dsRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 (ASO), 유전자 붕괴, 또는 부분적이거나 완전한 유전자 결실이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
뉴클레아제
특정 실시양태에서, 유전자 조정은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하여 달성된다. 합성 ZFN은, 예를 들어, FokI DNA 절단 도메인과 융합된 아연 핑거 결합 도메인으로 구성된다. ZFN은 비제한적으로 광범위한 생물체에서 유전자 발현을 녹아웃 또는 녹인하는 것을 포함하여 세포의 게놈을 편집하도록 설계/조작될 수 있다. 메가뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 된클러스터링 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 연관 단백질 (예를 들어, Cas 뉴클레아제), 그리고 트리플렉스가 또한 광범위한 일련의 세포 유형에서 게놈 조작에 사용될 수 있다. 기재되는 반응물들은 프로모터, 단백질-코딩 영역 (엑손), 인트론, 5' 및 3' UTR 등을 표적화하는데 사용될 수 있다.
조정용 이중 가닥 RNA ( dsRNA ) 분자
특정 실시양태에서는, 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자가 본원에서 기재되는 세포주 (예를 들어, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주)에서 1종 이상의 유전자의 발현을 조정하는데 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 상응하는 RNA 서열의 서열 상동성-기준 표적화에 의해 1종 이상의 유전자를 길항하도록 설계될 수 있다. 그와 같은 dsRNA는 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 마이크로-RNA (miRNA)일 수 있다. 그와 같은 dsRNA의 서열은 조정될 1종 이상의 유전자를 코딩하는 mRNA의 상보성인 부분을 포함하게 된다. 이와 같은 부분은 mRNA 내의 표적 부분에 대하여 100% 상동성일 수 있으나, 더 낮은 수준의 상보성 (예를 들어, 90% 이상 또는 95% 이상)이 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 퍼센트 상보성은 일정 길이의 연속되는 핵산 잔기에 걸쳐 결정된다. 본 개시내용의 dsRNA 분자는, 예를 들어, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 그 초과의 핵산 잔기에 걸쳐 측정 시 mRNA 내의 표적 부위에 대하여 적어도 80%의 상보성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, dsRNA 분자는 dsRNA 분자의 전체 길이에 걸쳐 mRNA의 표적 부위에 대하여 적어도 80%의 상보성을 갖는다.
RNA 간섭 (RNAi) 경로를 사용하는 또 다른 유전자 표적화 반응물은 shRNA로도 지칭되는 소형 헤어핀 RNA이다. 예를 들어 발현 구축물 (예를 들어, 플라스미드, 렌티바이러스)을 통하여 세포에 전달된 shRNA는 사용되는 프로모터의 유형에 따라 상시성이거나 조절되는 방식으로 유전자 발현의 장기 감소를 제공하는 능력을 갖는다. 일 실시양태에서는, 렌티바이러스 입자의 게놈이 관심 유전자 (또는 유전자들)를 표적화하는 1종 이상의 shRNA 발현 카세트를 포함하도록 변형된다. 그와 같은 렌티바이러스는 세포를 감염시켜, 그의 바이러스 게놈을 숙주 게놈에 안정하게 통합시킨 후, 상시성이거나, 조절되거나, 또는 (다수의 shRNA가 발현되는 경우) 상시성이면서 조절되는 방식으로 shRNA를 발현할 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, shRNA는 단일 유전자 또는 다수의 밀접하게 관련된 유전자 패밀리 구성원들의 개별 변이체를 표적화하도록 설계될 수 있다. 개별 shRNA는 유사하거나 중복성인 기능 또는 서열 모티프를 갖는 표적들의 집합을 조정할 수 있다. 통상의 기술자라면, 렌티바이러스 구축물이 클로닝된 DNA 또는 ORF 발현 구축물을 포함할 수도 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본원에서 기재되는 실시양태에서는, 소형 간섭 RNA (siRNA)는 물론 마이크로RNA (miRNA)를 포함하는 유전자 표적화 반응물들이 유전자 기능을 조정하는데 사용될 수 있다. siRNA 및 miRNA는 화학적 변형, 관심 표적 전사체에 대한 상보성 수준, 그리고 안정성, 세포 전달, 특이성 및 기능성을 향상시키기 위한 설계 (미국 특허 번호 8,188,060 참조)를 광범위하게 포함할 수 있다. 또한, 그와 같은 반응물은 다양한 영역의 유전자 (mRNA의 5' UTR, 오픈 리딩 프레임, 3' UTR 포함) 또는 (일부 경우에서는) 관심 유전자를 코딩하는 게놈 DNA의 프로모터/인핸서 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 유전자 조정 (예를 들어, 유전자 발현의 감소, 녹다운)은 하나의 mRNA 전사체의 상이한 영역을 표적으로 하는 단일 siRNA 또는 miRNA 또는 다수의 siRNA 또는 miRNA 풀을 (세포에) 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 합성 siRNA/miRNA 전달은 비제한적으로 1) 자가-전달, 2) 지질-매개 전달, 3) 전기천공 또는 4) 벡터/플라스미드-기반 발현 시스템을 포함한 어떠한 수의 방법에 의해서도 달성될 수 있다. 도입되는 RNA 분자는 외인성 뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA는 단일 유전자의 개별 변이체 또는 다수의 밀접하게 관련된 유전자 패밀리 구성원들을 표적화하도록 설계될 수 있다.
siRNA는 1종 이상의 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1)의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 서열식별번호: 1 내지 11로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 siRNA가 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된다.
표 1: 유전자의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
* 유전자의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA 서열 (센스 및 안티센스). 서열 중 소문자 뉴클레오티드는 3' 오버행을 나타냄.
일부 실시양태에서, ATP5EP2의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 32의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, LINC00319의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 33의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CYP3A7의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, NOG의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, SPANXN3의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, MYRIP의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 37의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, KCNN2의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 38의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, NALCN-AS1의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, RGMA의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 40의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, PGA5의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 10의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 10의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 41의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ABCA10의 발현을 감소시키는데 사용되는 siRNA는 서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥에 서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 42의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 ( ASO )
안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 (ASO)가 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서 1종 이상의 유전자의 발현을 조정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, ASO는 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키는데 사용된다. 공지의 기술을 사용하고 조정될 1종 이상의 유전자의 서열에 대한 지식을 기반으로 하여, ASO 분자는 상응하는 RNA의 서열 상동성-기반 표적화에 의해 1종 이상의 유전자를 길항하도록 설계될 수 있다. ASO 서열은 1종 이상의 유전자로부터 생산되는 mRNA 또는 lncRNA의 표적 부분에 대하여 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 부분은 mRNA 또는 lncRNA 내의 표적 부분에 대하여 100% 상보성일 수 있으나, 더 낮은 수준의 상보성 (예를 들어, 90% 이상 또는 95% 이상)이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO는 서열 중 적어도 하나의 뉴클레오시드 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 그리고 아미노알킬포스포르아미데이트 연결, 티오포스포르아미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 또는 보라노포스페이트 연결인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
CRISPR 게놈 편집
일부 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 유전자 발현의 조정은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 수행된다. CRISPR 게놈 편집은 전형적으로 하기 두 가지 구별되는 구성요소를 포함한다: (1) 가이드 RNA 및 (2) 엔도뉴클레아제, 구체적으로는 CRISPR 연관 (Cas) 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9). 가이드 RNA는 내인성 세균 crRNA와 트레이서RNA의 단일 키메라 가이드 RNA (gRNA) 전사체로의 조합이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, gRNA와 Cas가 세포 내에서 발현될 경우, 게놈 표적 서열은 변형되거나 영구적으로 붕괴될 수 있는 것으로 여겨진다.
gRNA/Cas 복합체는 gRNA 서열과 감소용 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 또는 NALCN-AS1) 중 표적 DNA 서열에 대한 상보체 사이의 염기-쌍형성에 의해 표적 서열로 동원된다. Cas의 성공적인 결합을 위해서는, 게놈 표적 서열이 표적 서열 직후에 올바른 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM: Protospacer Adjacent Motif) 서열도 포함해야 한다. gRNA/Cas 복합체의 결합은 본 개시내용의 1종 이상의 유전자의 게놈 표적 서열에 Cas를 정위시키며, 그에 따라 야생형 Cas는 DNA의 가닥 둘 다를 절단하여 이중 가닥 절단을 야기할 수 있다. 이는 하기 2종의 일반적인 복구 경로 중 하나를 통하여 복구될 수 있다: (1) 비-상동성 단부 연결 DNA 복구 경로 또는 (2) 상동성 유도 복구 경로. 비-상동성 복구 경로는 이중 가닥 절단부에서의 삽입/결실을 초래할 수 있으며, 그것은 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임을 효과적으로 붕괴시키는 프레임쉬프트 및/또는 미성숙 정지 코돈으로 이어질 수 있다. 상동성 유도 복구 경로는 이중 가닥 절단을 수선하는데 사용되는 복구 주형의 존재를 필요로 한다.
임의의 적절한 gRNA 쌍이 CRISPR 게놈 편집에 사용될 수 있다. 전형적으로, gRNA 쌍은 1종 이상의 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1)의 발현을 감소시키는데 사용된다. 본원에서 기재되는 일부 실시양태에서, gRNA 쌍은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현을 조정하는데 (예를 들어, 감소시키거나 제거/녹아웃하는데) 사용된다.
gRNA 쌍은 공지의 기술을 사용하고 조정될 1종 이상의 유전자의 서열에 대한 지식을 기반으로 하여, 전형적으로는 임의의 공공에서 가용한 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 설계될 수 있다. 녹아웃된 패키징 및/또는 생산자 세포는 관련 기술분야에 알려져 있는 표준 기술 및 시중에서 가용한 적합한 키트를 사용하는 임의의 적절한 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
gRNA 쌍은 임의의 적절한 수단에 의해 본 개시내용의 생산자 세포주로 전달될 수 있다. 적합한 기술에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는데, 생산자 세포주로 gRNA 쌍을 전달하는데 플라스미드, 바이러스 및 세균 벡터의 사용을 포함한다. 전형적으로, gRNA 쌍은 플라스미드 DNA를 사용하여 전달된다.
gRNA 쌍은 1종 이상의 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1)의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 다수의 gRNA 쌍이 유전자의 발현을 조정하는데 사용될 수도 있다. 본원에서 기재되는 일부 실시양태에서, gRNA 쌍은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종의 발현을 감소시키는데 사용된다. 다수의 gRNA 쌍은 KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현을 조정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA는 표적 부위에 대한 결합을 증가시키는 것 및 뉴클레아제 분해를 억제하는 것에 의해 편집 효율이 향상되도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형은 gRNA 5' 및 3' 단부 둘 다 상의 말단 3개 뉴클레오티드에서의 2' O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결일 수 있다. 1종 이상의 유전자의 유전자 발현을 조정하는데 사용되는 gRNA 쌍에 의해 표적화되는 대표적인 표적 DNA 서열은 하기 표 2에 목록화되어 있는 서열식별번호: 16-31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 변이체 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
표 2: gRNA 쌍 (서열식별번호: 12-15)의 대표적인 표적 영역 서열 및 표적 DNA 서열 (서열식별번호: 16-31)
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예를 들어, KCNN2를 표적화하는데 사용되는 gRNA 쌍은 서열식별번호: 12-15 (표 2에 제시되어 있음)의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, KCNN2를 표적화하는데 사용되는 gRNA 쌍은 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, KCNN2를 표적화하는데 사용되는 gRNA 쌍은 서열식별번호: 14의 서열을 포함하거나 또는 갖는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 15의 서열을 포함하거나 또는 갖는 제2 gRNA 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, KCNN2를 표적화하는 gRNA 분자는 그의 5' 및 3' 단부 중 어느 하나 또는 둘 다 상의 말단 3개 뉴클레오티드에 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 2' O-메틸 유사체로서, 서열식별번호: 12, 13, 14 또는 15의 서열을 포함한다.
변이체 gRNA 서열은, 임의의 적절한 서열 길이에 걸쳐 측정 시, 본 개시내용의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 전형적으로, 퍼센트 서열 동일성은 연속되는 핵산의 일정 길이에 걸쳐 결정된다. 본 개시내용의 변이체 gRNA 서열은, 예를 들어, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 그 초과의 핵산 잔기에 걸쳐 측정 시, 본 개시내용의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 gRNA 분자는 변이체 gRNA 분자의 전체 길이에 걸쳐 본 개시내용의 gRNA 분자와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 gRNA 분자는 그의 표적 영역이 서열식별번호: 16 내지 30 중 1종의 표적 서열에 대하여 상보성인 gRNA 분자 중 1종 이상의 변이체일 수 있다. 본 개시내용의 gRNA 쌍은, 예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 유전자인 유전자를 표적으로 하는 쌍의 2종의 gRNA 서열 중 하나 또는 둘 다의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함하는 gRNA 쌍의 변이체는 1) 서열식별번호: 12 서열의 변이체를 포함하는 제1 gRNA 분자, 2) 서열식별번호: 13 서열의 변이체를 포함하는 제2 gRNA 분자 또는 3) 이들 둘 다를 포함할 수 있다.
단백질 수준에서의 조정
또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 및/또는 활성의 조정은 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드) 수준에서 이루어진다. 예를 들자면, 비제한적으로 소형 분자, 펩티드, 압타머, 불안정화 도메인을 사용하여 단백질을 표적화하는 것, 또는 예를 들어 유전자 산물의 활성을 하향-조절하거나 분해 속도를 향상시킬 수 있는 다른 방법들을 포함한 방법들에 의해 단백질 수준에서의 유전자 기능의 감소가 달성될 수 있다. 대안적으로, 위치-지정 돌연변이유발 및/또는 미스센스 또는 넌센스 돌연변이의 도입을 통하여 생물학적 활성이 감소되거나 제거되도록, 발현되는 단백질이 변형될 수도 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들어, 활성 부위에 결합하여 표적 단백질의 기능을 억제하는 소형 분자가 예를 들어 세포 배양 배지에 첨가됨으로써, 패키징 및/또는 생산자 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로는, 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 펩티드를 세포 (예를 들어, 패키징 및/또는 생산자 세포)에 도입하는 것에 의해 표적 단백질 기능이 조정될 수 있다 (문헌 [Shangary et al., (2009) Annual Review of Pharmacology and Toxicology 49:223] 참조). 그와 같은 펩티드는, 예를 들어, 형질감염 또는 전기천공에 의해, 또는 발현 구축물을 통하여 세포 (예를 들어, 패키징 및/또는 생산자 세포)에 도입될 수 있다. 대안적으로, 펩티드는 세포 전달을 용이하게 하는 1종 이상의 잔기를 부가하는 것 (예를 들어, 접합을 통함) 또는 자가-전달을 향상시키기 위하여 분자를 과급하는 것에 의해 세포 (예를 들어, 패키징 및/또는 생산자 세포)에 도입될 수 있다. 펩티드를 발현하기 위한 기술에는 비제한적으로 스캐폴드에의 펩티드의 융합, 또는 신호 서열의 결합, 각각 관심 위치 또는 구획으로 펩티드를 안정화하거나 지시하는 것이 포함된다. 특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 상기 언급된 방법 중 어느 것을 사용하여 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 세포를 포함한다.
1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현에 대한 조정의 효과
특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 높은 rAAV 역가를 생산하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생성시키는데 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 1종 이상의 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1) 발현의 상당한 감소 및/또는 1종 이상의 유전자에 의해 발현되는 단백질 활성의 상당한 감소 (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%의 감소, 또는 그 초과의 감소)를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자의 발현은 약 40% 내지 약 100% (예를 들어, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%; 또는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%) 감소된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 표적 유전자 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1)에 의해 발현되는 단백질 또는 RNA의 상당한 활성 감소를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재되는 방법은 표적 유전자에 의해 발현되는 단백질 또는 RNA의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 초과의 활성 감소를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자 단백질 또는 RNA 활성은 약 40% 내지 약 100% (예를 들어, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%; 또는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%) 감소된다. 또한, 1종 이상의 유전자의 조정은 다수의 유전자의 조정을 초래할 수 있다 (예를 들어, miRNA에 의함).
특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 유전자 산물 (예를 들어, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 유전자 산물) 발현의 상당한 감소 (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 초과의 감소)를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 산물의 발현은 약 40% 내지 약 100% (예를 들어, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%; 또는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%) 감소된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드 발현의 상당한 감소 (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 초과의 감소)를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 발현은 약 40% 내지 약 100% (예를 들어, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%; 또는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%) 감소된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 기재되는 조정 방법은 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드 활성의 상당한 감소 (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 초과의 감소)를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 활성은 약 40% 내지 약 100% (예를 들어, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%; 또는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%) 감소된다.
특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 1종 이상의 유전자, 단백질 또는 RNA의 발현 및/또는 활성 감소는 약 5일 (예를 들어, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일 또는 그 초과) 동안 유지된다.
특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 1종 이상의 유전자, 단백질 또는 RNA의 발현 및/또는 활성 감소는, 예를 들어, 유전자 붕괴 또는 부분적이거나 완전한 유전자 결실의 사용을 통하여 무기한으로 또는 영구적으로 유지되도록 의도된다.
특정 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 1종 이상의 유전자, 단백질 또는 RNA의 발현 및/또는 활성 감소는 배양물에서의 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 저어도 40 또는 그 초과 계대 동안 유지된다.
rAAV 생산 에 대한 조정의 효과
rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조정은 rAAV 역가의 증가를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조정은 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 생산되는 rAAV 역가의 증가를 초래하는데, 약 1.5 내지 약 7-배 (예를 들어, 약 1.5 내지 약 6.5, 약 1.5 내지 약 6, 약 1.5 내지 약 5.5, 약 1.5 내지 약 5, 약 1.5 내지 약 4.5, 약 1.5 내지 약 4, 약 1.5 내지 약 3.5, 약 1.5 내지 약 3.0, 약 1.5 내지 약 2.5, 약 1.5 내지 약 2.0, 약 2 내지 약 7, 약 2.5 내지 약 7, 약 3 내지 약 7, 약 3.5 내지 약 7, 약 4 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 7, 약 5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 7, 약 6 내지 약 7, 약 6.5 내지 약 7, 또는 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 또는 약 7.0)로 증가된다. 일부 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 생산되는 rAAV의 역가는 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 초과 증가된다. 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조정에 기인하는 rAAV 역가의 임의 증가는 대조군 모체 세포주로부터 생산되는 rAAV 역가와 비교될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주에서의 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조정은 적어도 2일, 적어도 5일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일 또는 그 초과 동안 rAAV 역가 생산을 증가시킬 수 있다.
rAAV를 생산하는 방법
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 유전자, 단백질 또는 비-코딩 RNA의 발현이 조정되도록 조작되어 있는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 rAAV를 생산하는 방법에 대해 기재한다. 특정 실시양태에서, rAAV는 조작된 rAAV 패키징 세포주에 rAAV 벡터를 전달함으로써 생성된 rAAV 생산자 세포주의 세포를 감염시키는 것에 의해 생산된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 1종 이상의 유전자, 단백질 또는 비-코딩 RNA의 발현이 조정되어 있는 rAAV 생산자 세포주의 세포를 감염시키는 것에 의해 생산된다. 특정 실시양태에서, 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터의 rAAV의 생산은 대조군 모체 세포주와 비교 시 향상된다.
특정 실시양태에서는, 조작된 패키징 세포주의 세포가 rAAV가 복제되는 것을 가능하게 하는 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 (AV) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스)로 감염된다. 일부 실시양태에서는, 조작된 생산자 세포주의 세포가 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 (AV) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스)로 감염된다.
rAAV를 수확하는 방법
rAAV 입자는 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포로부터 세포를 용해시키는 것에 의해 수득될 수 있다. 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포의 용해는 감염성 바이러스 입자를 방출하기 위하여 화학적 또는 효소적으로 세포를 처리하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 그러한 방법에는 뉴클레아제 예컨대 벤조나제 또는 DNAse, 프로테아제 예컨대 트립신, 또는 세제 또는 계면활성제의 사용이 포함된다. 물리적 붕괴, 예컨대 균질화 또는 마쇄, 또는 미세유동화기 압력 셀을 통한 압력의 적용, 또는 냉동-해동 주기가 사용될 수도 있다. 특정 실시양태에서는, 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포로부터의 용해물이 rAAV 입자를 수확하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서는, 세포 용해에 대한 필요성 없이, 세포 배양 상청액이 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포로부터 수집될 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포는 세포 용해에 대한 필요성 없이 세포 배양 상청액으로부터 수집될 수 있는 rAAV 입자를 분비한다. 특정 실시양태에서, 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주는 대조군 모체 세포주의 것에 비해 더 높은 rAAV 역가를 가지며, 그에 따라 대조군 모체 세포주에 비해 더 많은 rAAV가 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 수확된다.
rAAV 입자를 수확한 후에는, 예를 들어, 세포 용해에 기인하는 세포 잔사를 제거하기 위하여 rAAV를 함유하는 샘플을 정제할 필요가 있을 수 있다. AAV 입자의 최소 정제 방법이 관련 기술분야에 알려져 있다. 두 가지 대표적인 정제 방법은 세슘 클로라이드 (CsCl)- 및 아이오딕사놀-기반 밀도 구배 정제이다. 상기 방법 둘 다에 대해서는 문헌 [Strobel et al., Human Gene Therapy Methods., 26(4): 147-157 (2015)]에 기재되어 있다. 최소 정제는, 예를 들어, AVB 세파로스(Sepharose) 친화성 수지 (지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 에이비(GE Healthcare Bio-Sciences AB), 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 달성될 수도 있다. AVB 세파로스 친화성 수지를 사용한 AAV 정제 방법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 2:15040 (2015)]에 기재되어 있다. 정제 후, rAAV 입자는 여과되고, ≤-60℃에서 저장될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 세포가 2종의 상이한 아데노바이러스로 공동-감염된 후 조작된 rAAV 패키징 세포주로부터 생산되는 rAAV 입자를 수확하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 rAAV 패키징 세포주로부터 생성된 rAAV 생산자 세포주의 감염 후 생산되는 rAAV 입자를 수확하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 헬퍼 바이러스에 의한 조작된 rAAV 생산자 세포주의 감염 후 생산되는 rAAV 입자를 수확하는 방법을 제공한다.
rAAV 입자의 정량화
AAV 감염이 시험관 내에서 세포변성 효과를 초래하지 않으며 그에 따라 감염 역가를 결정하는데 플라크 검정이 사용될 수 없다는 사실로 인하여, rAAV 입자의 정량화는 복잡하다. 그러나, rAAV 입자는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther. 10, 1031-1039 (1999)]), 도트-블롯 혼성화 (문헌 [Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828 (1989)]) 및 고도로 정제된 벡터 조제물의 광학 밀도 (문헌 [Sommer et al., Mol. Ther. 7, 122-128 (2003)])를 포함한 수많은 방법들을 사용하여 정량화될 수 있다. 써모사이클러에서의 실시간 정량적 유전자 발현 감소 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (DRP-qPCR) (예를 들어, 아이사이클러(iCycler) iQ 96-웰 블록 포맷 써모사이클러 (바이오-래드(Bio-Rad), 캘리포니아주 허큘리스 소재))에 의하면, DNase-내성 입자 (DRP)가 정량화될 수 있다. rAAV 입자를 함유하는 샘플은 37℃에서 60분 동안 DNase I (100 U/ml; 위스콘신주 매디슨 소재 프로메가(Promega))의 존재 하에 인큐베이팅 된 후, 이어서 50℃에서 60분 동안 프로테이나제 K (인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드 소재) 소화 (10 U/ml)된 다음, 95℃에서 30분 동안 변성될 수 있다. 사용되는 프라이머-프로브 세트는 rAAV 벡터 게놈의 비-자연 부분, 예를 들어, 관심 단백질의 폴리(A) 서열에 대하여 특이적이어야 한다. PCR 산물은 프라이머, 프로브 및 증폭되는 서열의 길이 및 조성을 기준으로 하는 임의의 적절한 주기 파라미터 세트를 사용하여 증폭될 수 있다. 대안적인 프로토콜은, 예를 들어, 문헌 [Lock et al., Human Gene Therapy Methods 25(2): 115-125 (2014)]에 개시되어 있다.
바이러스 게놈 증폭은 또한 qPCR 기술을 사용하여 상기한 것과 유사하게 측정될 수 있다. 그러나, 생산자 세포 내에서의 총 게놈 증폭을 정량화하기 위하여 세포내 샘플만이 수집되며, 샘플은 패키징된 및 비패키징된 바이러스 게놈 둘 다를 측정하기 위하여 DNase I으로 처리되지 않는다. 바이러스 게놈 증폭은 숙주 세포 하우스키핑 유전자, 예를 들어, RNase P를 동시에 측정하는 것에 의해 숙주-세포-당 기준으로 계산될 수 있다.
rAAV 입자의 감염성은, 예를 들어, 문헌 [Zhen et al., Human Gene Therapy 15:709-715 (2004)]에 기재되어 있는 바와 같이 TCID50 (50%에서의 조직 배양 감염 용량) 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 이와 같은 검정에서, rAAV 벡터 입자는 연속 희석된 후, 96-웰 플레이트에서 AV 입자와 함께 Rep/Cap-발현 세포주를 공동-감염시키는데 사용된다. 감염 48시간-후, 감염 및 대조군 웰로부터의 총 세포 DNA가 추출된다. 다음에, 트랜스진-특이적 프로브 및 프라이머를 사용하는 qPCR을 사용하여 rAAV 벡터 복제가 측정된다. 밀리리터당 TCID50 감염성 (TCID50/ml)은 10-배 연속 희석에서 AAV에 대하여 양성인 웰의 비를 사용하여 카버(Karber) 방정식에 의해 계산된다.
치료 적용분야
본원에서 기재되는 조작된 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 생산되는 rAAV는 ,예를 들어, 포유동물에서의 유전자 요법에 사용될 수 있다. 본원에서 기재되는 조작된 세포로부터 생산되는 rAAV는 생체외 및/또는 생체내 유전자 요법 적용분야에 사용될 수 있다. 본원에서 기재되는 조작된 세포로부터 생산되는 rAAV는, 예를 들어, 소형 분자 (예를 들어, siRNA 또는 sgRNA), 펩티드 및/또는 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재되는 조작된 세포주로부터 생성되는 rAAV는 필요로 하는 인간 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 기재되는 조작된 세포주로부터 생성되는 rAAV는 제약상 허용되는 캐리어와 연계되어 투여될 수 있다.
어떠한 적합한 방법 또는 경로도 본원에서 기재되는 조작된 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 생산되는 rAAV 또는 rAAV-함유 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 투여 경로에는, 예를 들어, 전신, 경구, 흡입, 비내, 기관내, 동맥내, 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 및 다른 비경구 투여 경로가 포함된다. 일부 실시양태에서, 조작된 패키징 및/또는 생산자 세포주로부터 생산되는 rAAV 또는 rAAV를 포함하는 조성물은 정맥내로 투여된다.
오로지 예시 목적으로 본원에서 제공되는 전기 예들로부터 본 개시내용의 실시가 더 완전하게 이해될 것인 바, 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 녹다운 프로토콜의 개발
하우스키핑 유전자인 HPRT1을 녹다운시키는 것에 의해, 6-웰 및 24-웰 포맷에 대하여 siRNA 녹다운 실험을 최적화하여 개발하였다. 시딩 밀도, 세포 배양 조건 (예를 들어, 퍼센트 이산화탄소 (CO2), 소 태아 혈청 (FBS)의 퍼센트), 형질감염 반응물 (리포펙타민(Lipofectamine)® RNAiMax)과 siRNA 사이의 비 ("비"), 인큐베이션 시간 및 siRNA 농도와 같은 수많은 인자들을 기준으로 하여, 24-웰 에서 수행된 실험을 평가하였다. 실험 조건을 최적화하는데 HPRT1 유전자 녹다운용으로 설계된 시중에서 구입가능한 siRNA를 사용하였다. 리포펙타민® RNAiMax를 사용하여 제조자의 지침에 따라 가변 농도의 siRNA로 HeLa 생산자 세포를 형질감염시켰다. HPRT1 발현의 퍼센트 감소는 실시간 PCR에 의해 결정하였다. 최적화된 24-웰 siRNA 녹다운 방법은 기준선 대조군에 비해 80% 초과까지 고도로 발현되는 유전자 HPRT1을 녹다운시킬 수 있었다. 도 2A-D에 제시된 바와 같이, 웰당 1 x 105개 세포, 1:5인 형질감염 반응물과 siRNA 사이의 비, 8 nM의 siRNA로 시딩된 세포가 최고의 녹다운 효율을 제시하였다. 도 2A는 HPRT1의 퍼센트 녹다운에 대한 사용된 가변적인 siRNA 농도/비의 효과를 제시한다. 도 2B는 HPRT1의 퍼센트 발현에 대한 가변적인 siRNA 농도/비의 효과를 제시한다. 6-웰 프로토콜 최적화에는, 두 가지 상이한 siRNA 농도를 시험하였다. 도 2A 및 2B에 플롯팅되어 있는 데이터를 위하여, 5 x 104개, 8 x 104개 및 1 x 105개의 시딩 밀도를 시험하였다. 도 2C는 HPRT1의 퍼센트 녹다운에 대한 가변적인 siRNA 농도의 효과를 제시한다. 도 2D는 HPRT1의 퍼센트 발현에 대한 가변적인 siRNA 농도의 효과를 제시한다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
실시예 2: RNA 서열분석
2종의 상이한 HeLaS3 생산자 세포주에 걸쳐 8개의 3-리터 생물반응기를 보충 및 비-보충 생산 조건으로 가동하였다. 비감염 대조군으로서, 아데노바이러스5 (Ad5) 없이 2개의 추가적인 생물반응기를 가동하였다. 하기 표 3에, 생물반응기 조건 및 생산 수준에 대한 세부사항을 목록화하였다.
표 3: 생물반응기 조건 및 생산 수준
Figure pct00006
표 3에서 사용된 약어: 1종 이상의 보충제의 첨가는 (+)로 나타냄; 1종 이상의 보충제의 부재는 (-)로 나타냄; MOI- 감염 다중도.
Ad5로의 감염 30시간 후, RNA-Seq용으로 샘플을 회수하였다. 샘플을 PBS로 1회 세척한 후, 수송 준비될 때까지 세포 펠렛을 -80℃로 저장하였다. 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 RNA 추출 및 추출된 RNA의 cDNA 합성을 수행하였다. 서열분석 전에, 시중에서 구입가능한 RNA-Seq 라이브러리 준비 키트를 사용하여, 라이브러리 준비를 수행하였다. 시중에서 구입가능한 일루미나(Illumina) 서열분석 플랫폼을 사용하여, RNA 서열분석을 수행하였다. 생성된 판독물들을 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 맵핑 방법을 사용하여, 인간 게놈, Ad5 게놈 및 AAV2 게놈에 대해 맵핑하였다. Ad5 게놈으로 맵핑된 모든 판독물은 폐기하였다. 인간 게놈에 대하여 맵핑되는 판독물을 보강하기 위하여, 또 다른 서열분석 라운드를 수행하였다. RNA 서열분석에 의해 생성된 데이터를 사용하여, 차등 분석을 수행하였다 (표 4 참조).
표 4: 차등 분석
Figure pct00007
* PCL1- 생산자 세포주 1; PCL2- 생산자 세포주 2; 생산 없음- 비감염 대조군 세포; 생산 (N.S.)- 비-보충 조건 하에서 배양된 Ad5 감염 세포; 생산 (S)- 보충 조건 하에서 배양된 Ad5 감염 세포.
본 실시예에서, 차등 발현 분석은 대조군 조건에 비교한 실험 조건의 mRNA 농도에서의 log 배수 변화 (LogFC)로 계산하였다. 상향조절되는 유전자는 양의 LogFC로 표현되었으며, 하향조절되는 유전자는 음의 LogFC로 표현되었다. ≤ 0.05의 p-값을 갖는 차등적으로 발현되는 유전자를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 각각의 차등 분석 내에서, 수백 내지 수천개의 유전자가 유의하게 상향 또는 하향 조절되었다. 필터 기준을 설정하고 (예를 들어, 도 6 참조) 적용함으로써, 데이터 세트를 평가를 위한 관리가능한 수의 유전자로 감축하였다. 유전자 세트를 정렬하고, 실시예 6에 기재되어 있는 바와 같은 필터 기준으로 이전하였다.
실시예 3: RT- qPCR에 의한 RNA 서열분석으로부터 수득된 결과의 평가
소형 유전자 세트를 RNA 서열분석 데이터 평가용으로 선택하였다. 관련 기술분야에 널리 알려져 있는 방법에 따라 RT-qPCR 검정을 사용하여 RNA-Seq 결과를 확인하였다. 데이터를 분석하는데 ΔΔCt 방법을 사용하였다. RT-qPCR로써 RNA-Seq 데이터에서 관찰된 경향을 독립적으로 확인하였다. 도 3A-B는 PGA5 (도 3A) 및 SPANXN3 (도 3B)에 대한 RNA-Seq 데이터의 생물정보공학 분석으로부터 수득된 유전자 발현의 log 배수 변화 값을 제시한다. x-축은 생산자 세포주가 성장된 조건 (보충 (표 4에 기재되어 있는 바와 같은 차등 분석 #5) 대 비-보충 (표 4에 기재되어 있는 바와 같은 차등 분석 #1))을 제시하며, y-축은 유전자 발현의 log 배수 변화 (LogFC)를 제시한다. 비보충 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 PGA5 (도 3A) 및 SPANXN3 (도 3B) 발현의 log 배수 변화는 비감염 세포 (헬퍼 바이러스로 감염되지 않은 세포)에서의 상응하는 유전자 발현에 대비하여 플롯팅하였다. 보충된 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 PGA5 (도 3A) 및 SPANXN3 (도 3B) 발현의 log 배수 변화는 비보충 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 상응하는 유전자 발현에 대비하여 플롯팅하였다.
보충 및 비-보충 조건 하에서 성장된 생산자 세포주에서의 PGA5 및 SPANXN3 유전자 발현도 관련 기술분야에 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 RT-qPCR에 의해 평가하였다. 도 3C-D는 비감염 세포 (헬퍼 바이러스로 감염되지 않은 세포)에 대비한 비보충 및 보충 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서의 PGA5 (도 3C) 및 SPANXN3 (도 3D) 발현의 RT-qPCR 배수 변화 값을 제시한다. 도 3A-D는 qPCR 및 RNA 서열분석으로부터 수득되는 데이터가 동일한 경향을 따른다는 것을 제시한다.
실시예 4: 상이한 생산자 세포주 클론에서의 RT- qPCR에 의한 RNA 서열분석으로부터 수득되는 결과의 평가
HeLa S3 생산자 세포주의 상이한 클론으로부터 추출된 RNA에 대하여 RT-qPCR 실험을 전개하는 것에 의해 RNA 서열분석 결과를 추가적으로 평가하였다. 도 4A-B는 RT-qPCR에서 결정 시, 비감염 세포 (헬퍼 바이러스로 감염되지 않은 세포)에 대비한 비보충 세포 배양 배지 및 보충된 세포 배양 배지에서 배양된 생산자 세포주 클론에서의 PGA5 (도 4A) 및 SPANXN3 (도 4B) 발현의 배수 변화 값을 제시한다. 21C5, 3C6 및 2B6는 HeLa 생산자 세포주의 상이한 클론을 나타낸다. 도 4C-D는 비-보충 세포 배양 배지에서 배양된 클론에 비교한 보충 세포 배양 배지에서 배양된 생산자 세포주 클론 21C5, 3C6 및 2B6에서의 PGA5 (도 4C) 및 SPANXN3 (도 4D) 발현의 상대적 배수 증가를 제시한다. 이러한 결과는 실시예 3에서 기재된 생물정보공학 RNA 서열분석 및 RT-qPCR 데이터를 추가적으로 확인해 준다.
실시예 5: rAAV 역가에 대한 유전자 녹다운의 효과
실시예 1에서 논의된 최적화된 프로토콜에 기반하여 HeLa 생산자 세포주에서 유전자를 개별적으로 녹다운시키는 것에 의해 녹다운 실험을 수행하였다. 각각의 유전자에 대하여 siRNA 뉴클레오티드 서열을 설계하였다 (표 1 참조).
8 nM의 siRNA 및 1:5의 siRNA:RNAiMAX 비를 동반한 1 x 105개의 시딩 밀도로서 조건을 설정하였다. 유전자 발현의 감소 24시간 후에 AAV 생산을 유도하고, 감염 72시간 후에 rAAV를 수확하였다. 각각의 샘플에 대하여 역가를 결정하고, 비-표적화 미스센스 siRNA 대조군과 비교하였다. 이와 같은 실험을 독립적으로 3회 수행하고, 결과를 평균한 후, 통계 분석을 수행하였다. 도 5A-5C는 절대 rAAV 역가 (GC/mL; GC = 게놈 카피)에 대한 각각 생산자 세포주 1-3에서의 개별 유전자의 siRNA 결과를 제시한다. 도 5D-5F는 각각 상이한 생산자 세포주 1-3에서의 개별 유전자의 siRNA에 의한 rAAV 역가의 배수 증가를 제시한다.
도 5A-5F에 제시된 바와 같이, 생산자 세포주에서의 KCNN2, LINC00319, RGMA 또는 SPANXN3 발현의 감소는 미스센스 대조군에 비해 통계적으로 유의한 2-4-배 더 높은 rAAV 역가를 초래하였다. 3종의 생산자 세포주 전체에 걸쳐, 이들 4종의 유전자는 녹다운되었을 때 역가에 대하여 통계적으로 관련성이 있는 긍정적인 영향을 제시한다. 이러한 결과는 해당 유전자들이 CRISPR/Cas9 녹아웃과 같은 더 영구적인 변형을 위한 뛰어난 표적이 된다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 유전자 필터링 방법론
필터 1의 경우, (표 3에 기재되어 있는 바와 같은) 차등 분석 1 및 7로부터의 유전자를 정렬하였다. 1 및 7의 차등 분석은 비-보충 조건에서 아데노바이러스 5의 첨가 시 상향 또는 하향-조절되는 유전자를 한정하였다. 분석 1은 21C5 생산자 세포주 (생산자 세포주 1, PCL1)로부터의 세포를 조사하였다. 분석 7은 2B6 (생산자 세포주 2, PCL2)로부터의 세포를 조사하였다. 이와 같은 필터 1 후의 유전자 목록은 세포주 특이적이 아니었던 유전자를 식별해주는데, 이와 같은 정렬은 2종의 생산자 세포주 사이에 공통으로 존재하는 총 9149종의 유전자를 제공하였다.
필터 2의 경우, 필터 1로부터의 유전자를 차등 분석 5에서 제시되는 유전자와 정렬시켰다. 분석 5는 비-보충 조건에 비해 보충 조건에서 21C5 생산자 세포주 (PCL1)로부터의 세포에서 상향 및 하향 조절된 유전자를 조사하였다. 이와 같은 차등 분석의 목적은 비-보충 조건 하에서의 생산에 대비한 보충 조건 하에서의 생산의 효과를 한정하는 것이었다. 필터 1로부터의 유전자 세트를 차등 분석 5와 정렬시키는 것의 목적은 1) 개선된 생산 조건의 부산물이 아니며 2) 2종의 상이한 세포주와 잠재적으로 관련성이 있는 개선된 생산성 조건에서 유전자를 식별하는 것이었다. 정렬 후, 374종의 유전자를 전진 이전하였다.
필터 3의 경우, >2 LogFC ±의 큰 LogFc 임계치를 갖는 유전자만을 전진 이전하였다. 이는 전진 이전되는 유전자에서의 높은 수준의 상향/하향 조절을 확인하기 위하여, 그리고 선택된 유전자가 RNA-Seq의 가공물이 아니었다는 정도의 신뢰를 제공하기 위하여 수행된 것이다. 필터 후, 77종의 유전자를 전진 이전하였다.
필터 4의 경우, 차등 분석 1 및 차등 분석 5에서의 상향-조절, 또는 차등 분석 1 및 차등 분석 5에서의 하향-조절 둘 다를 나타낸 유전자만을 유지하였다. 예를 들어, 77종의 유전자 중 1종은 차등 분석 1로부터의 상향-조절 및 차등 분석 5에서의 추가적인 상향-조절, 또는 차등 분석 1에서의 하향-조절 및 차등 분석 5에서의 추가적인 하향-조절을 나타내어야 한다. 이와 같은 필터의 목적은 평가되는 유전자에 있어서 높은 역가 조건이 낮은 역가 조건에 비해 그 특정한 유전자의 조절에 대한 길항 효과를 갖는 것은 아니라는 것을 확인하는 것이었다. 필터 11 후, 유전자를 평가용으로 유지하였다. 대표적인 유전자 필터링 방법론을 제시하는 예시적인 흐름도가 도 6에 제시되어 있다 (사용된 약어: LogFC = Log 배수 변화).
하기 표 5는 생산성에 중요한 유전자를 필터링해 내는 과정 동안의 각각의 비교로부터의 Log2FC 데이터를 제공한다.
표 5: Log2FC 데이터
Figure pct00008
실시예 7: KCNN2의 유전자 녹아웃
본 실시예에서는, 기존의 고도로 최적화된 단일클론 HeLa 생산자 세포주 (PCL) 2종 - 2H5 및 7B12 -을 칼슘-활성화 칼륨 채널 단백질인 SK2를 코딩하는 KCNN2 유전자 (이전에 본원에서 기재되는 RNA-seq 스크린에서 식별되었음)가 녹아웃되도록 유전적으로 변형시켰다.
eGFP 선택가능 마커를 사용하여 2H5 또는 7B12 HeLa 세포에서 KCNN2를 녹아웃시켰다. 추정상 KCNN2 녹아웃을 eGFP 발현에 대하여 보강하고, 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 집락을 형성시키고, 게놈 DNA를 수확한 후, PCR을 수행하여 녹아웃을 포함하는 영역을 증폭하였다. PCR 산물을 생어(Sanger) 서열분석하고, 서열분석 파일을 삽입/결실의 존재에 대하여 분석하였다. 높은 녹아웃 가능성을 갖는 2H5 및 7B12 클론을 추가 시험용으로 규모-증대하였다.
최고 클론을 무혈청 현탁 배양물로 전달하였다. 24 심층 웰 rAAV 생산을 통하여, 모체 세포주에 비교한 클론 생산성을 평가하였다. 클론을 2 x 105개 세포/mL로 3 mL의 배양물 중에 시딩하고, 50의 감염 다중도 (MOI)로 Ad5로 감염시켰다. 감염 4일 후, rAAV를 수확하고, 역가에 대해 평가하였다. 역가의 배수 증가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였다. 최고 클론은 대조군 샘플에 비해 역가의 1.5-2.7배 증가를 나타내었다. 2H5 역가는 2.46 x 109 - 4.98 x 1010 GC/mL 범위였다 (도 7A). 역가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였을 때, 배수 증가는 1.2-2.7배 범위로 보였다 (도 7B). 7B12 역가는 4.33 x 108 - 1.88 x 1010 GC/mL 범위였다 (도 7C). 역가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였을 때, 배수 증가는 1.5-2.6배 범위로 보였다 (도 7D). 다음에, 최소 1.5배 증가를 나타내는 클론을 진탕 플라스크 배양으로 규모화하고, 고도 시딩 밀도의 보충된 rAAV 생산을 위하여 ambr® 15에 접종하였다. 세포를 1.5 x 106 세포/mL로 시딩하고, 50의 MOI로 Ad5로 감염시켰다. 감염 4일 후 rAAV를 수확하고, 역가에 대하여 평가하였다. 역가의 배수 증가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였다. 최고 클론은 대조군 샘플에 비해 역가의 1.5-2.3배 증가를 나타내었다. 2H5 역가는 1.5 x 1011 - 3.82 x 1011 GC/mL 범위였다 (도 8A). 역가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였을 때, 배수 증가는 1.3-2.3배 범위로 보였다 (도 8B). 7B12 역가는 2.62 x 1010 - 1.35 x 1011 GC/mL 범위였다 (도 8C). 역가를 모체 대조군에 대하여 정규화하였을 때, 배수 증가는 1.2-1.5배 범위로 보였다 (도 8D).
이러한 데이터는 AAV-생산 세포에서 (예를 들어, 유전자 녹아웃을 통해) 본원에서 기재되는 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 조작된 세포로부터의 rAAV의 생산을 증가시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8: 다중-조합 siRNA 녹다운
본 실시예에서는, siRNA를 사용하여 본원에서 기재되는 RNA-seq 스크린에서 이전에 식별된 유전자의 다중-조합 녹다운을 수행함으로써, 다수의 유전자를 동시에 표적화하는 것이 역가에 대한 추가적인 효과를 생산하게 되는지를 결정하였다.
다중-조합 녹다운은 실시예 5에서 기재된 방법의 변형을 사용하여 수행하였다. 간단하게 말하자면, 8 nM의 각각의 siRNA를 사용하고 1:5의 siRNA:RNAiMAX 비를 유지함으로써, 세포를 형질감염시켰다. 유전자 발현의 감소 24시간 후 AAV 생산을 유도하고, 감염 72시간 후 rAAV를 수확하였다. 각각의 샘플에 대하여 역가를 결정하고, 비-표적화 미스센스 siRNA 대조군과 비교하였다.
본 실시예에서는, 이전에 기재된 다른 siRNA 패널과의 조합으로써 KCNN2를 녹다운시켰다. 또한, RGMA 및 SPANXN3를 서로와의 조합으로써 녹다운시켰다. 2H5에서, 조합 녹다운은 미스센스 대조군에 비해 4.6-11.4배 범위의 역가 증가를 나타내었다 (도 9A). 7B12에서는, 조합 녹다운이 미스센스 대조군에 비해 3.4-9.7배 범위의 역가 증가를 나타내었다 (도 9B). 모든 조합이 역가의 증가를 나타내기는 하였으나; 모든 조합이 KCNN2 단독을 녹다운시키는 것에 비해 개선된 것은 아니었다. KCNN2 녹다운은 2H5에서는 5.3배 증가 (도 9A)로, 그리고 7B12에서는 5.1배 증가 (도 9B)로 이어졌다.
이러한 데이터는 알려져 있는 고도 rAAV 역가 생산 단일클론 PCL에서의 다중 게놈 영역의 직접적인 표적화를 통하여, rAAV 생산의 추가적인 증가가 수득될 수 있다는 것을 입증한다.
넘버링된 실시양태
1. ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
2. 실시양태 1에 있어서, KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 발현이 뉴클레아제, 이중 가닥 RNA (dsRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA) 또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 발현이 서열식별번호: 1-11 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA를 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
5. 실시양태 4에 있어서, ATP5EP2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
6. 실시양태 4에 있어서, LINC00319의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
7. 실시양태 4에 있어서, CYP3A7의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
8. 실시양태 4에 있어서, NOG의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
9. 실시양태 4에 있어서, SPANXN3의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
10. 실시양태 4에 있어서, MYRIP의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
11. 실시양태 4에 있어서, KCNN2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 38의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
12. 실시양태 4에 있어서, NALCN-AS1의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
13. 실시양태 4에 있어서, RGMA의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 40의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
14. 실시양태 4에 있어서, PGA5의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 10의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 41의 서열을 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
15. 실시양태 4에 있어서, ABCA10의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 11의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 42의 서열을 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
16. 실시양태 3에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 된클러스터링 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 연관 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 발현이 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
18. 실시양태 17에 있어서, 발현이 가이드 RNA 쌍을 사용하여 감소되며, 여기서 각각의 가이드 RNA는
(a) 서열식별번호: 12-15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고/거나,
(b) 서열식별번호: 16-31의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 선택된 표적 DNA 서열을 표적화하는 것인
패키징 및/또는 생산자 세포주.
19. 실시양태 18에 있어서, gRNA 쌍이 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
20. 실시양태 18에 있어서, gRNA 쌍이 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 15의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 각각의 gRNA 분자가 그의 5' 및 3' 단부 중 어느 하나 또는 둘 다 상의 말단 3개 뉴클레오티드에 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 2' O-메틸 유사체인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 유전자 발현이 대조군 모체 세포에 비해 제거되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 인간 세포주인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
24. 실시양태 23에 있어서, 인간 세포주가 HeLa 세포주 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
25. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 rAAV 패키징 세포주인 세포주.
26. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 rAAV 생산자 세포주인 세포주.
27. 실시양태 26에 있어서, rAAV의 역가가 대조군 모체 세포를 포함하는 세포주로부터 생산되는 rAAV 역가에 비해 약 1.5 내지 약 7배 증가되는 것인 세포주.
28. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 따른 세포주의 용해물.
29. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 따른 세포주로부터의 세포 배양 상청액.
30. 실시양태 25에 따른 패키징 세포주의 세포에 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 전달하는 것을 포함하는, 생산자 세포주를 생성시키는 방법.
31. 실시양태 30에 따른 방법에 의해 생산되는 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법.
32. 실시양태 26에 따른 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법.
33. 실시양태 31 또는 32에 있어서, rAAV가 생산자 세포주로부터 수확되는 것인 방법.
34. 실시양태 31-33 중 어느 하나에 있어서, rAAV의 생산이 대조군 모체 세포주와 비교 시 향상되는 것인 방법.
35. 하기를 포함하는, rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법:
세포주에서 rAAV 역가를 증가시키는 1종 이상의 보충제를 첨가하는 것;
보충 및 비-보충 세포주에서 트랜스크립톰에 대하여 전체 유전자 발현을 측정하는 것;
보충 및 비-보충 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 목록을 수득하는 것; 및
rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 것.
36. 실시양태 35에 있어서, 세포주에 첨가되는 1종 이상의 보충제가 덱사메타손, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 코르티손, 프레드니손, 부데소니드 또는 트리암시놀론을 포함하는 것인 방법.
37. 실시양태 35에 따른 방법을 사용하여 식별된 1종 이상의 유전자의 발현을 조정하는 것을 포함하는, rAAV의 증가된 생산을 촉진하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생산하는 방법.
38. 실시양태 35-37 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 rAAV 패키징 세포주인 방법.
39. 실시양태 35-37 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 rAAV 생산자 세포주인 방법.
40. 실시양태 39에 있어서, rAAV 생산자 세포주가 상응하는 1종 이상의 유전자 발현의 조정이 없는 rAAV 생산자 세포주에 의해 생산되는 rAAV 역가에 비해 적어도 1.5배 더 크게 rAAV 역가를 증가시키는 것인 방법.
41. 실시양태 37-40 중 어느 하나에 있어서, 발현을 조정하는 것이 1종 이상의 유전자 발현의 감소를 포함하는 것인 방법.
42. 실시양태 37-40 중 어느 하나에 있어서, 발현을 조정하는 것이 1종 이상의 유전자 발현의 제거를 포함하는 것인 방법.
43. 실시양태 30-42 중 어느 하나에 있어서, 세포주가 인간 세포주인 방법.
44. 실시양태 43에 있어서, 인간 세포주가 HeLa 세포주 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주인 방법.
45. 상응하는 비변형 모체 세포와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
46. 실시양태 45에 있어서, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 무기한으로 또는 영구적으로 감소되는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
47. 실시양태 46에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴 또는 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
48. 실시양태 47에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
49. 실시양태 47에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
50. 실시양태 47에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
51. 실시양태 47에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
52. 상응하는 모체 세포주와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 감소된 발현 및/또는 활성을 나타내는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
참조로 포함
본원에서 언급되는 특허 문서 및 과학 논문 각각의 전체 개시내용은 모든 목적에 있어어 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적 특징에서 벗어나지 않으면서 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에 있어서 본원에서 기재되는 본 발명을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 이에 따라, 본 발명의 범주는 상기 기재에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지는 것으로서 청구범위 등가물의 의미 및 영역에 속하게 되는 모든 변화를 거기에 포괄되는 것으로 하고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ULTRAGENYX PHARMACEUTICAL INC. <120> ENGINEERED PRODUCER CELL LINES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> ULP-005WO <140> PCT/US20/27489 <141> 2020-04-09 <150> 62/979,483 <151> 2020-02-21 <150> 62/839,207 <151> 2019-04-26 <150> 62/833,548 <151> 2019-04-12 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 gcaacagcgu aaaaauugut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 cgguguccac aguccuugat t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 caagaaaagu uauaaguuut t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 cggaggaagu uacagaugut t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 agaugcaaga gguaccaaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<400> 25 gttcttcaaa ctctgttcgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gaaggcgtag acttatctga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 agccaacttc cagcaccaat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gggcaatgga ccttctgcct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggctgcgggg cagagggcaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cgggcaggct gcggggcaga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 acgggcaggc tgcggggcag 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 acaauuuuua cgcuguugcc a 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 ucaaggacug uggacaccgg t 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 aaacuuauaa cuuuucuugg a 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide 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ctgaaccgcc cggctgagcc gacattgccg gcgtcttggc gattcggccc 60 gacgagctcc gctttcgcta cagcatggtg gcctactgga gacaggctgg actcagctac 120 atccgatact cccagatctg tgcaaaagca gtgagagatg cactgaagac agaattcaaa 180 gcaaatgctg agaagacttc tggcagcaac gtaaaaattg tgaaagtaaa gaaggaataa 240 tctaccctga ctaaagcttg aaatgctaca tttccaaggt gaagatgtgt gggcacatgt 300 tatggcagat tgaaaaggat ctcattccat gggaaaaaaa aaaatcctgt cttgttcata 360 aattgacaat gtcaataaat tgaaatatgg ttcactgtta ctcttgattt tagtttgtga 420 gactttttca ttttctttaa aggaactgtc tgcacagctg catgattatg gccatgtgaa 480 ccagggtttc ttaaaagcag gggaagccag atttaatatt tagtgaccaa agggatacag 540 aaagcatttt gaaaatgtct caaaatagtt gtttcatgac attaattggt gatcaaaatt 600 atctgctgtc attgaggctt cgtagtccct tatttttgaa ttgttgtcat gtcagaataa 660 tgacatggtt atcagtaaca aatggaaata attattaaat actaaaagtg tagattagaa 720 gaagaaatac taaattgtac ttgttttgta ttgtgcactt aaagcctata gataagaacg 780 gttacagaat ttaagcacaa agtgtttttc acattgtttt gtaaatgaat ctttatactc 840 tggtagcatt tctcatagga aatgaggcaa 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tgttaaggag gcagatgggg tattactggt 1740 atatagatgg tatggtagat tggtagtata ttggcagatt attggtatat ggtatgttga 1800 ggcagatggg gtattactgg tatatagatg gcatagtaga ttggtagtat attggtagat 1860 tattggtata gagatggtat attattaagg aggcagatgg ggtaattaga ggtgagactt 1920 agggacaggg cttgtgatat ggaaaggagt gaagtcactg agtaaaagac aagtttactg 1980 tcagcagaga ttcttagagg ctcttttctc cgtgattaaa aaaaaatcct aaaccagtag 2040 tataataaac ttcctgcctc cagcagtgct gggtagctgg caggatgact gtgcccagtg 2100 atgaggtgac cccagtcaga ccaacttaat gagtatccca ctaattagtt ggatgatgtt 2160 tgaagctgtc agttaatctc ttagttcaca tcgttcttgt gagcaaagtg aaggaatcgg 2220 ataagctcta aatttcggtg atgctgctgc tctgagagac caaggtcgct ggagcaaccg 2280 tactgctaaa ggataagctc ttcaaaatca aaagggacag atttcttaag tttctagttt 2340 gttttgtgtt tttacatcta tttctaccat acgaaagagt aggatggtga gatgcatttc 2400 taaatatttt taactactca gtctggatgg ttaggcttca agaaaaggaa tttatttagt 2460 ctgaaataaa gcaattttgc catttaaaat tgaattactt tgtagtttaa tgattactat 2520 tgagcaaaca aatctttaca gtaatataag 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gtcactctgg actttgttct ttctctcaaa ttgtcagtca acaactctgt 27420 cggccctgcc tttgaaataa attcatctag gatcctgccc ctcttcacca ctgccaccac 27480 catgctggct aaagccactg ttatttctcg taggttagga caacaccttc tgtctggtgt 27540 tgcctctact gtctagtctc cacacatagc cagaatactc ttaaaacata catcagatac 27600 catcatttct tagcttgcca ttctctaatg atgtcccaca attcttagag taacatctca 27660 aaatgtgacc atgccctgtg tattagtcgt cctcatcctc ctcctcctcc tccccttctt 27720 cttcttcttc ttctttatca tcattaaact ttaagttctg ggatagatgt gcagaatatg 27780 caggtttatt acataggtat acatgtgcca tgtggttttc tgcacccgtc aacccattgt 27840 ctaggatttg agtgctgcat gcattaggta tttgtcctaa tgctctccct ccccttgtcc 27900 cccatcccct gagaggcccc agtgtgtgat gttcccttct ctgtgtccat gtgttctcat 27960 tgttcaactc tcacttatga gtgaaaacat gtggtgtttg gttttctgtt cctgtgttag 28020 tttgctgaga ataatggttt ccagattcat ccatgtccct gcaaaggaca tgaattcatt 28080 cttttttatg gctgcatagt attccatggt gtatatgtgc catattttct atatccagtc 28140 tatcattgat gggcatttgg gttggttcca agcctttgcg attgtgaata gcactgcaat 28200 aaacatacat gtgcatgtat ctttacagta gaatgattta tcatcctttg ggtgtttata 28260 cccagtaatg ggattgttgg gtcaaatggt atttctggtt ctagatcttg aggaatcgcc 28320 acactgtctt ccacaatggc tgaactaatt tacactgaca cagtgtaaaa gctttcctat 28380 ttctcgacat cctctccagc atctgttgtt tcctgacttt ttaatatttg ccattctaac 28440 tggcatgaga tggtatctca ctgcggtttt gatttgcatt tctctaacga ccagtgatga 28500 gctttttttt tcatgtttgt aggctgcata aatgccttct ttagagaagt gtctgttcat 28560 atccttcacc cactttttga tggggttgtt tttttcttgt aaatttgttt aagttccttg 28620 tagattctgg atgttagacc tttgtcagat ggagagattg caaaaaattt ctcccattct 28680 gtaggttgcc tgttcactct gatgatagtt tcttttacta tgcagaagct ccttagttta 28740 agtagatccc atctgtcaat tttggctttt gttgccattg cttttggtgt ttttgtcatg 28800 aagtctttgc ccatgcctat gtcctgaggg gtattgccta ggttttcttc tagggttttt 28860 atggttttag gttttatgtt taaatcttta ggcaatcttg tgttaatttt tgtataaggt 28920 gtaaggaagg ggtccagttt cagttttctg catatgctta gccagtgtcc ccagcaccac 28980 ttattaaata gggaatcctc tccccattgc ttatttttgt caggtttgtt gaagatcaga 29040 tggttgtaga tgtgtggtgt tatttctgtg gcctttgttc tgttccattg gtctatatat 29100 ctgttttggt accagtacca tgctgttttg gttgctgtag ccttgtagta tagtttgaag 29160 ccagggagtg tgatgcctcc agctttgttc tttttgctta ggattgtcat ggctatacag 29220 gctcttttct ggttccacat aaaatttaaa gtagtttttt ctagttctgt gaagaaaatc 29280 aatggtagct tgatgggaat agcactgaat ctataaatta ctttgggcag tatggccatt 29340 ttcacaatat cgattcttcc tatccatgag gatggaatgt ttttccattt gtttgtgtcc 29400 tctcttattt ccttgagcag tggtttgtag ttcttgaaga ggttcttcgc gtcccttgta 29460 agttgtattc ctaggtattt tatttccttt gtagcaattg tgaatgagag ttcactcatg 29520 atttggctct cttttcatct gttattggtg tttaggaatg cttgtgggtt ttgcacattg 29580 attttgtatc ctgagacttt gctgaaggtt cttatcagct taaggagatt ttgggcagag 29640 atgatggggt tttctaaata tataatcaca tcatctggaa atagacaatt tgacttcccc 29700 tcttcctatc tgaatactct ttctttctct tgcctgattg ccctagccag aacttccaat 29760 actatgttga ataggagtgg tgagagaggg catccttgtc ttgtgccagt tttcaaaggg 29820 aatgcttcca gcttttgccc attcagtatg atattggctg tgggtttgtc ataaataggc 29880 ctcattattt tgacatatgt tccataaatc cctagtttat tgagtgtttt tagcatgaag 29940 ggatgttgaa ttttattgaa ggccttttct gcatctattg agataatcat gtggtttttg 30000 tcattggttc tgtttatgtg atggattatg tttattgatt tgcatatgtt tgaaccagct 30060 ttgtatccca gggatgaagc cgacttgatc gtggtggata agccttttga tgtgctcttg 30120 gattcgcttt gccagtattt tattgaggat tttcgcagcg atgttcatca gggatattgg 30180 cttgaaattt tatttttttg ttgtgtctct gctaggtttt ggtatcagga tgatgctggc 30240 cttataaaat tagggaggat tccctctttt cctattgttt ggagtagctt caggaggaat 30300 ggaaccaact cctctttgta cctctggtag aatttggctg tgaatccatc tggtcctggg 30360 ctttttttgg ttcgtaggct attaattact gcctcaattt cagaacttgt tattagtgta 30420 tatggggatt caacttcttc ctgggttagt cttgggaggg tgtatgtatc caagaattta 30480 tccatttctt ctacattttc tagtttactt gcatagaggt tttcatagca gtctctgatg 30540 gtagttttta tttctgtggg atcagtggtg atattccctt tatcattttt ttattgtgtc 30600 tatttgattc ttctctcttt tcttctttat tagtctggct agcagtctat ctattttgtt 30660 aatcttttca aaaaaccagc tcctggattc attgattttt tgaagggttt ttcatgtctc 30720 tgtctccttc agttctgctg ttagtgtgtt ggttttagat ctttcctgct ttctgatgtg 30780 ggcattatag tgctataaat ttccctctta acactgcttt agctgtgtcc cacagattct 30840 ggcatgttgt gtctttattc tcattggttt caaagaactt atttatttct gcctcaattt 30900 tgttatttac ccagtagtca ttcaggagca ggttgttcag tttccatgta gttgtgtggt 30960 tttgaatgag tttcttaatc ctgagttcta atttgattgc actatggtct gagagactgt 31020 ttgttacgat ttccattctt ttgcaattgc tgaggagtgt tttactttca attacgtggt 31080 caattttaga ataactgcta cgtggtgaag agaagaatgt atattctatt gatttggggt 31140 agagagttct gtagatgtct attaggtctg cttggtccag agctgagttt aagtcctgaa 31200 tatccttgtt aattttctgt ctcattgttc tgcctaatac tgacagtggg gtgttaaagt 31260 ctcctactat tattgtgttg gagactaagt ctctttgtag gtctctaaga acttgcttta 31320 tgaatctggg tgctcccgta ctgggtacat atatatttag gaaagttagc tcttcttgtt 31380 gcattgatcc ctttaccatt atgtaatgcc cttctttgtc tttttttcat ctttgttggt 31440 ttaaagtctg ttttatcaga gactaggatt gcaacacctg ctgtttttat ttatttattt 31500 atttatttat ttttattttt ttagctttcc atttgcttgg taactattcc tccatctctt 31560 tattttgagc gtatgtgtgt ctttgcatgt gagttgggtc tcctaaatac agcacaccaa 31620 tgggtcttga ctctatccaa tttgccagtc tgtgtctttt aattggggca tttagtccat 31680 ttacttaaag gtaatatcat tatgtgtgaa tttgttcctg tcatcatgac gctagctgtt 31740 tattttgcac attagttgat gcagtttctt catagtgtca atggtcttta catttcggtt 31800 tgtttttgca gtggctggta ccagtttttt ctttccatgt ttagtgcttc cttcaggaac 31860 tcttgtaagg caggcctggt gttgacaaaa tccctcagca tttgcttgtc tataaaggat 31920 ttttttctcc ttaacttatg aagcttagtt tggctggata taaaattatg ggtcgaaaat 31980 tcttttcttt aagaatgttg aatattggcc cccactctct tctggcttgt agggtttctg 32040 cagagagatc cactgttagt ctaatgggct tccctttgta ggtaacctga cctttctctc 32100 tggctgtgct taacactttt tccttgtttt caaccttgga aaatctgatg attatgtgtc 32160 ttggggttgc tcttctcgag gagtatcttt ttggtgttct ctatatttcc tgaatttgaa 32220 tgttgacctg tcttgttagg ctgtggaagt tctcttggaa aatatcctga agtatgtttc 32280 ttggaaaata tcctgaagta tgtttggaaa atatcctgaa gtatactttc caacttggtt 32340 ccgttctccc 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aggtgtctcc ctgtcaggag gcatgagggt cagggacccc cttaaggaga cagtctgtct 33240 cttagcagag cttggacact gtgctgggag atccgctgct ctcttcagag ctgacaggca 33300 gaacgtttaa gtctgctgaa gctggatcca cagccgcccc ttcccccagg tgctctgtcc 33360 caggcagatg ggaattttac ctatcagccc ctggctgggg ctgctgcctt tctttcagag 33420 atgccctgcc cagagaggag gaatctggag aggcagtctg gccccaggta ctttgccatg 33480 ctgcggtgag ttctgcagtc agagttaaca ctgtaagggg aaaagcacct actcaagcct 33540 cagtaatggt ggacgcccct cccccaacaa gctcaattgt cccaggttga cttcatactg 33600 ctgtgctggc agcgagaatt tcaagccagt ggattttagc ttgctggact ttgtgggaat 33660 gggacccgct gtgcgagaag acttggcttc ctggcttcag ccccctttcc aggggagtga 33720 gtggttctgt ctcactgggg ttccaggcac tgctggtgta tgaaaaaaaa ctcctgcagc 33780 tgtttatctg cccagagagt tgcctagttt tgtgcttgaa acccagggcc ctggtagtgt 33840 aggcacacga gggaatctcc tggtctgtgg gtggcaaaaa ccatggaaaa agcatagtat 33900 ctgggctgga tagcacagtc cctcacagta gagtccctca gggcttccct tggctaggag 33960 agggaggtcc atgacccctt gcacttcctg ggtgaggcga taccccaccc tgcttctgtt 34020 ccccctccat gggctgcacc cactgtctaa ccagtcccag tgagataaac cgggcacctc 34080 agttggaaat gcaataatca cccaccttct gcgttggtct tgctgggagc tgcagactga 34140 agctgttcct attcagccat cttgccaact ctcttgtatt agttttctat tgctgccata 34200 acgaatagtc tccatcttag cagctaaaaa caacacccat ttatcaactc acagttctgc 34260 aggtcagagt ctcgtaggct tggctagttt ctctgtcctg agtctcatca gattgacagc 34320 aaggggctga caaggctgta ttcccttttg aaaattttgg agatggatgt gtgtctttgt 34380 tcattcaggt tattcactga attcagttcc tgtggttgta gcaatgagat ctccgtttcc 34440 tttctggcgg tcagcccagg gtagcctttg ctcctagatg ctgcttgcat ccctcaatct 34500 ttccaggtgg cccctccacc cacagcaggt agggtccagg tccctctctt gctttagatc 34560 tttcctcctt actcttctca ctccagccac atttctctca ctccagccag agacatttct 34620 ctaattttag atgggttcca ctccctggtt taaggtctgc tatcttaatt gcatctgcca 34680 aatctcatca tagcagtacc caggttaata tttgattgaa ttactgggag ataggaatag 34740 tgagggacta ccacagccta ggaagtcttg aatgatatga ttcctgtgac ttctctgact 34800 tcatgtcatc cctctttccc ttttaatatc tagactccaa 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tgtttgacag aaaacattat ctgtccatca tttccatgga ttcctgggtc tcacgggcag 360 aaggacaagg cagatatgag gcggatctgg taaaaccata aacaccatga gatcagagca 420 tccatctgta gactcacaga gcaagaagcg tgactgcccc aatcttgaat ggatgagtaa 480 gatgaaaatc aatttataaa catcttgtga caagctggaa ttcagttata gatcaattac 540 agattgctca ctggacaatc aaggacatta ttagaaaacg gtttccacca ctagaaattc 600 atctacattg acatccacct aaatatccag aaggtcatcc ccactttcgt cgctctccac 660 agtcagctgc cgggtccacc acttcttaac ttcagaaccg caggaagccg cgtcagtcat 720 ggggttcatt ttgcacacga cagatttcat ggttgtcctt cctccaaacc gaggaaccta 780 gatcttctct gatctctgaa aaataagttc ctggatatga aaggggatac tttccttggt 840 ggtagtccca gtgaagaccc actgaacatc gtcagcctca aaatgtaagc tgtgctgtca 900 tctgctttgt ggaacacata tgctacacat cttctccttt caattgggct gaagttgggg 960 cacagttaaa gagcattata aagctcctgc tttagcatga acttagttat ctatagaaaa 1020 aaacatgtac aaggacactg ggctgtgggg agcattgctc tccctccatt cctgagtgct 1080 cttaatggga ttatcctggc tttccaaaac cctatagaga agaagctcat agaagaaaat 1140 tctcttactg aatcagtaaa atatggaaaa taatgggact gtttattaaa ggattgaatg 1200 agagaacaca agtaatgcac ttagaagagt gactggcata cagtgagtac tacgtgctgg 1260 cttctcaacc atgatagcct gaaatgtacc cggaaaatgg gggctaatgt aagtcatatt 1320 tagagaagtt attttggggg acaatgtttt tgacaagact acatttttca ttatgttgct 1380 gtctgtaaac aactgtagat gcagacttgc attttgaaag gcaagaccca aaacacacaa 1440 acagagtaaa tacctttaaa atgcctcgat cgctggagaa atgcctggat ggacctacct 1500 gagggcagac gccactgccc aaatttcctc tggggtttcc ctgcgtcggc tgcatcttgc 1560 cgacttcctc ctcgatccga cagcgtgggg ctcaggagct gctgctggct gcttgtctgc 1620 atgggaggag aagcacacag ttaccgtctt tttaaccctg cgctctcctc cttttactat 1680 aagaaaggaa aacacatggc aggaggacaa gtgggaagaa caacatggac tcagagtgtc 1740 cacaatgggg aaaagtgaaa atgggtataa agggtcacag aagaaaaaga gccaccactg 1800 cacgccctgc tgaaggagac accactcttc ctgggacatc ttgtcctggg taacccccac 1860 tgcttcgttc ccctccatgc ctgagaatgt cattgtttcc cttcatatct tcgctggcaa 1920 accagggggt aaggaagggg aactgcagga aggaaggtgg ggcagtgggg acgggctggg 1980 cgggggcagt ctactgtcac cagcctggag atccacactt agagcttcag ggaaagagtt 2040 ctctgcaggc aaagctgtat gatgggccct ggtggaggat ggagctgata acaatctaag 2100 ctacagtgaa agaaagagag atgccaagac ttcccacaca tttcacctgt tctcaggttc 2160 acctgtcacc tctccctttc ctaacaaaag ccttggtctt cacatctctt tagtatcctt 2220 tttttttttt ttttgtcacc tctttctttc ttaggctttt tcatctaaaa acagagggct 2280 ctgaaatcat cactttcccc aacctcatta gccctgtctc actgtctgtc ctgacttcag 2340 cctgcctccc tctcccatgc gagacattgc caaccatctt cagggtgacc agtggcaagg 2400 ccactgcaga tgcctcccct tgccccttgg ttgactaact ccgcagaagt ccctgcagtc 2460 ggtggcagat gatttctaaa ggctggggag cccaaaacat gagatctact gaaaactgag 2520 ctatggcacc agtgggcctc ctggagcacc ctgctgggcc gtggagcctt aggcttccaa 2580 aggtactctg gcccctggct gcgttgctgc acaccatgga gcctggtgct gctgggggct 2640 ctgcacagag cacgggatca gctccacgtt gttaacctca aatcgtaatt gctgcctcat 2700 aaaggggcag gtcctcccag ccagctgctt ctcacagcac aggactctcc aggacgctga 2760 taactccttg tactttttta tatagacaca tacatagagt ttgaaaatga aaatatgctg 2820 tgacttaata aatagaaact cctcaaaaaa aaaaaaaaaa a 2861

Claims (52)

  1. ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  2. 제1항에 있어서, KCNN2, LINC00319, RGMA 및 SPANXN3의 발현이 대조군 모체 세포에 비해 감소되는 세포를 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현이 뉴클레아제, 이중 가닥 RNA (dsRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA) 또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 서열식별번호: 1-11 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA를 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  5. 제4항에 있어서, ATP5EP2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  6. 제4항에 있어서, LINC00319의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  7. 제4항에 있어서, CYP3A7의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  8. 제4항에 있어서, NOG의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  9. 제4항에 있어서, SPANXN3의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  10. 제4항에 있어서, MYRIP의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  11. 제4항에 있어서, KCNN2의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 38의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  12. 제4항에 있어서, NALCN-AS1의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  13. 제4항에 있어서, RGMA의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 40의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  14. 제4항에 있어서, PGA5의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 10의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 41의 서열을 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  15. 제4항에 있어서, ABCA10의 발현이 감소되며, siRNA가 센스 가닥에는 서열식별번호: 11의 서열을 그리고 안티-센스 가닥에는 서열식별번호: 42의 서열을 포함하는 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  16. 제3항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 된클러스터링 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 연관 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  18. 제17항에 있어서, 발현이 가이드 RNA 쌍을 사용하여 감소되며, 여기서 각각의 가이드 RNA는
    (a) 서열식별번호: 12-15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고/거나,
    (b) 서열식별번호: 16-31의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 선택된 표적 DNA 서열을 표적화하는 것인
    패키징 및/또는 생산자 세포주.
  19. 제18항에 있어서, gRNA 쌍이 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  20. 제18항에 있어서, gRNA 쌍이 KCNN2을 표적화하는데 사용되며, 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 제1 gRNA 분자 및 서열식별번호: 15의 서열을 포함하는 제2 gRNA 분자를 포함하는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 각각의 gRNA 분자가 그의 5' 및 3' 단부 중 어느 하나 또는 둘 다 상의 말단 3개 뉴클레오티드에 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 2' O-메틸 유사체인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현이 대조군 모체 세포에 비해 제거되는 것인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 인간 세포주인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  24. 제23항에 있어서, 인간 세포주가 HeLa 세포주 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주인 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 rAAV 패키징 세포주인 세포주.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 rAAV 생산자 세포주인 세포주.
  27. 제26항에 있어서, rAAV의 역가가 대조군 모체 세포를 포함하는 세포주로부터 생산되는 rAAV 역가에 비해 약 1.5 내지 약 7배 증가되는 것인 세포주.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 세포주의 용해물.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 세포주로부터의 세포 배양 상청액.
  30. 제25항에 따른 패키징 세포주의 세포에 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 전달하는 것을 포함하는, 생산자 세포주를 생성시키는 방법.
  31. 제30항에 따른 방법에 의해 생성되는 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법.
  32. 제26항에 따른 생산자 세포주의 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, rAAV가 생산자 세포주로부터 수확되는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV의 생산이 대조군 모체 세포주와 비교 시 향상되는 것인 방법.
  35. 하기를 포함하는, rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 방법:
    i. 세포주에서 rAAV 역가를 증가시키는 1종 이상의 보충제를 첨가하는 것;
    ii. 보충 및 비-보충 세포주에서 트랜스크립톰에 대하여 전체 유전자 발현을 측정하는 것;
    iii. 보충 및 비-보충 세포주 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 목록을 수득하는 것; 및
    iv. rAAV의 생산과 관련성이 있는 1종 이상의 유전자를 식별하는 것.
  36. 제35항에 있어서, 세포주에 첨가되는 1종 이상의 보충제가 덱사메타손, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 코르티손, 프레드니손, 부데소니드 또는 트리암시놀론을 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 따른 방법을 사용하여 식별된 1종 이상의 유전자의 발현을 조정하는 것을 포함하는, rAAV의 증가된 생산을 촉진하는 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주를 생산하는 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 rAAV 패키징 세포주인 방법.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 rAAV 생산자 세포주인 방법.
  40. 제39항에 있어서, rAAV 생산자 세포주가 상응하는 1종 이상의 유전자 발현의 조정이 없는 rAAV 생산자 세포주에 의해 생산되는 rAAV 역가에 비해 적어도 1.5배 더 크게 rAAV 역가를 증가시키는 것인 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 발현을 조정하는 것이 1종 이상의 유전자 발현의 감소를 포함하는 것인 방법.
  42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 발현을 조정하는 것이 1종 이상의 유전자 발현의 제거를 포함하는 것인 방법.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 인간 세포주인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 인간 세포주가 HeLa 세포주 또는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포주인 방법.
  45. 상응하는 비변형 모체 세포와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 감소되도록 조작되어 있는 세포를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  46. 제45항에 있어서, ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1로부터 발현되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성이 무기한으로 또는 영구적으로 감소되는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  47. 제46항에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴 또는 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  48. 제47항에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  49. 제47항에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 유전자 붕괴를 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  50. 제47항에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및/또는 NALCN-AS1 중 적어도 1종에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  51. 제47항에 있어서, 세포주가 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1로부터 선택된 적어도 2종의 유전자에 부분적이거나 완전한 유전자 결실을 포함하도록 조작되어 있는 것인 rAAV 패키징 및/또는 생산자 세포주.
  52. 상응하는 모체 세포주와 비교 시 ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 및 NALCN-AS1 중 적어도 1종으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리리보뉴클레오티드의 감소된 발현 및/또는 활성을 나타내는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 패키징 및/또는 생산자 세포주.
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