CN113966395A - 工程化的生产细胞系及其制备和使用方法 - Google Patents

工程化的生产细胞系及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113966395A
CN113966395A CN202080028310.8A CN202080028310A CN113966395A CN 113966395 A CN113966395 A CN 113966395A CN 202080028310 A CN202080028310 A CN 202080028310A CN 113966395 A CN113966395 A CN 113966395A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell line
raav
expression
seq
packaging
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080028310.8A
Other languages
English (en)
Inventor
奥布里·R·蒂尔南
尼古拉斯·里查兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Altraginx Pharmaceuticals
Original Assignee
Altraginx Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Altraginx Pharmaceuticals filed Critical Altraginx Pharmaceuticals
Publication of CN113966395A publication Critical patent/CN113966395A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Abstract

本申请涉及重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其已经被工程化以降低一种或多种基因和/或蛋白的表达和/或活性以增加rAAV滴度。本文还描述了产生工程化的细胞系的方法。

Description

工程化的生产细胞系及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月12日提交的美国临时专利申请号62/833,548；于2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,207；以及于2020年2月21日提交的美国临时专利申请号62/979,483的权益和优先权，出于所有目的，其公开内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2020年4月9日，名为ULP-005WO_SL.txt，大小为113kb字节。
技术领域
本申请总体上涉及工程化的生产细胞系和/或包装细胞系以及产生用于增加重组腺相关病毒(rAAV)滴度的工程化的生产细胞系和/或包装细胞系的方法。
背景技术
基于rAAV的载体是用于人基因治疗的最有希望的载体之一。rAAV载体被考虑用于广泛多种基因治疗应用。具体地讲，rAAV载体可将治疗性基因递送至分裂和非分裂细胞，并且这些基因可持续较长时间而不整合到靶细胞的基因组中。尽管用于产生rAAV的系统在过去二十年中已经发展，但仍有几个问题有待解决。rAAV生产系统的一个限制是rAAV颗粒的低滴度产量。基于rAAV的基因产物在临床前阶段的药物开发需要大量rAAV载体用于在较大物种中的研究，以实现有助于预测人类剂量的完全毒理学和生物分布研究。此外，因为目前的rAAV生产系统导致低滴度产量，所以制造用于人体试验和商业应用的足够水平的rAAV是有挑战性的。研究人员已经探索了许多方法来产生足够高滴度的rAAV颗粒，但是仍然非常需要解决这个问题。特别地，需要能够以高滴度产率产生高质量rAAV的有效细胞系。通过本文所述的工程化细胞系产生高滴度rAAV加速了这种载体系统用于体内基因治疗用途的应用。
发明内容
本公开通过提供包含其中一种或多种基因和/或蛋白已被修饰的细胞的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系解决了获得用于基因治疗应用的改善的rAAV滴度的需要。本文还描述了鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因和/或蛋白的方法，以及产生工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的方法。
本文描述了产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的组合物和方法，所述rAAV包装细胞系和/或生产细胞系包含与对照亲本细胞相比可产生更高滴度的rAAV的细胞。更具体地，本文提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中一种或多种基因和/或蛋白的表达被调节，导致与对照亲本细胞相比更高的rAAV滴度的细胞。在一个方面，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含与对照亲本细胞相比一种或多种基因和/或蛋白的表达降低的细胞。例如，与对照亲本细胞相比，ATP5EP2(ATP合酶F1亚基ε假基因2)、LINC00319(长基因间非蛋白编码RNA319)、CYP3A7(细胞色素P450家族3亚家族A成员7)、ABCA10(ATP结合盒亚家族A成员10)、NOG(Noggin)、RGMA(排斥性引导分子BMP共受体A)、SPANXN3(SPANX家族成员N3)、PGA5(胃蛋白酶原A5)、MYRIP(肌球蛋白VIIA和Rab相互作用蛋白)、KCNN2(钾钙激活通道亚家族N成员2)和/或NALCN-AS1(NALCN反义RNA1)的表达降低。
在一些实施方案中，本公开提供了包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系。
在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含经工程化以与相应未修饰的亲本细胞相比降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其与相应的亲本细胞系相比，表现出由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达和/或活性降低。
在一个方面，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中使用核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义RNA寡核苷酸(ASO)降低一种或多种基因的表达。
在某些实施方案中，用包含选自序列SEQ ID NO：1-11中任一个的核苷酸序列的siRNA降低一种或多种基因的表达。例如，在一些实施方案中，ATP5EP2的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。在一些实施方案中，LINC00319的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。在一些实施方案中，CYP3A7的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQID NO：34的核苷酸序列。在一些实施方案中，NOG的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。在一些实施方案中，SPANXN3的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。在一些实施方案中，MYRIP的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。在一些实施方案中，KCNN2的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。在一些实施方案中，NALCN-AS1的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一些实施方案中，RGMA的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ IDNO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。在一些实施方案中，PGA5的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的序列和在反义链中包含SEQID NO：41的序列。在一些实施方案中，ABCA10的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQID NO：11的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：42的序列。
在某些实施方案中，用于降低一种或多种基因表达的核酸酶选自由锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白组成的组。
在某些实施方案中，使用CRISPR基因组编辑降低一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，指导RNA对用于靶向基因以减少和/或消除该基因的表达。在某些实施方案中，使用指导RNA对降低一种或多种基因的表达，其中每个指导RNA：(a)包含选自SEQ ID NO：12-15的核苷酸序列的序列，和/或(b)靶向选自SEQ ID NO：16-31的任一核苷酸序列的靶DNA序列。例如，在一些实施方案中，gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子。在一些实施方案中，gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：14的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：15的序列的第二gRNA分子。在一些实施方案中，每个gRNA分子是2′O-甲基类似物，其在其5′和3′末端的任一者或两者上的末端三个核苷酸中包含3′硫代磷酸酯核苷酸间键。
在某些实施方案中，一对指导RNA用于降低一种基因的表达。在某些其他实施方案中，使用多对指导RNA来降低一种或多种基因的表达。在某些实施方案中，与对照亲本细胞系相比，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因的基因表达和/或一种或多种基因和/或蛋白的活性降低和/或消除。在某些实施方案中，与对照亲本细胞相比，rAAV包装和/或生产细胞中的基因表达和/或活性消除。
在本文所述的一些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是人细胞系。在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是昆虫细胞系。在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是HeLa细胞系。在某些其他实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是人胚肾(HEK)293细胞系。
在本文所述的一些实施方案中，本公开的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系产生比对照亲本细胞系更高的rAAV滴度。在某些实施方案中，与从包含对照亲本细胞的细胞系产生的rAAV的滴度相比，由本公开的rAAV生产细胞系的细胞产生的rAAV的滴度增加约1.5至约7倍。本文还描述了工程化细胞系的裂解物。在某些实施方案中，从裂解物中收获较高滴度的rAAV。本文还描述了来自工程化细胞系的细胞培养物上清液。在某些实施方案中，从细胞培养物上清液中收获较高滴度的rAAV。
本文还描述了产生生产细胞系的方法，其中所述方法包括将rAAV载体递送至包装细胞系的细胞，其中与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。在某些实施方案中，本公开提供了产生生产细胞系的方法，其中所述方法包括将rAAV载体递送至包装细胞系的细胞，其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低。
本文还描述了通过用辅助病毒感染由包装细胞系产生的生产细胞系的细胞来产生rAAV的方法，其中与对照亲本细胞相比，包装细胞系中ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。在某些实施方案中，与对照亲本细胞相比，包装细胞系中KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低。
在一个方面，本公开提供了通过用辅助病毒感染生产细胞系的细胞来产生rAAV的方法，其中与对照亲本细胞相比，生产细胞系中ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。在某些实施方案中，本公开提供了通过用辅助病毒感染生产细胞系的细胞来产生rAAV的方法，其中与对照亲本细胞相比，生产细胞系中KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低。
本文还描述了从生产细胞系收获rAAV的方法，其中与对照亲本细胞系相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。还描述了从生产细胞系收获rAAV的方法，其中与对照亲本细胞系相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低。在某些实施方案中，与对照亲本细胞系相比，从本公开的生产细胞系的rAAV产生得到增强。
本文还描述了鉴定与rAAV产生相关的一种或多种基因的方法，其中所述方法包括i.)添加一种或多种增加细胞系中rAAV滴度的补充剂；ii.)在经补充和未经补充的细胞系中测量跨转录组的全局基因表达；iii.)获得在经补充和未经补充的细胞系之间差异表达的基因列表；以及iv.)鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因。在一些实施方案中，一种或多种鉴定的基因负责减少rAAV的产生。
本文还描述了产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系以促进rAAV的产生增加的方法。在一些实施方案中，通过调节从在经补充和未经补充的rAAV生产细胞系之间差异表达的基因列表中鉴定的一种或多种基因和/或蛋白质的表达来增加rAAV产生。在某些实施方案中，通过调节从在经补充和未经补充的rAAV生产细胞系之间差异表达的基因列表中鉴定的一种或多种基因和/或蛋白质的表达来增加rAAV滴度。在一些实施方案中，与未调节的细胞系的rAAV滴度相比，一种或多种基因和/或蛋白的调节增加rAAV滴度至少1.5倍。在某些实施方案中，调节表达是降低一种或多种基因的表达。在某些实施方案中，调节表达包括降低一种或多种蛋白质的表达。在某些实施方案中，调节表达是消除一种或多种基因的表达。在某些实施方案中，调节表达包括消除一种或多种蛋白质的表达。
在一些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，细胞系是人细胞系。在某些实施方案中，细胞系是昆虫细胞系。在某些实施方案中，细胞系是HeLa细胞系。在某些实施方案中，细胞系是人胚肾(HEK)293细胞系。
本文还描述了重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含经工程化以与相应未修饰的亲本细胞相比降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。
在一些实施方案中，由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性被无限期或永久性地降低。
在一些实施方案中，细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏或部分或完全基因缺失。
在一些实施方案中，细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏。
在一些实施方案中，细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的至少两种基因中包含基因破坏。
在一些实施方案中，细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含部分或完全基因缺失。
在一些实施方案中，细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的至少两种基因中包含部分或完全基因缺失。
还提供了包装细胞系和/或生产细胞系，其中与相应的亲本细胞系相比，所述细胞系表现出由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达和/或活性降低。
从以下具体实施方式和权利要求中，本公开的其他特征和优点将是显而易见的。
除非有相反的说明，否则本文引用的所有出版物、参考文献、专利和/或专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
附图说明
参考以下附图可以更全面地理解本公开。
图1是产生本文所述的rAAV包装细胞和生产细胞的方法的示意图。
图2A-2D显示从HPRT1 siRNA敲除实验的优化和开发产生的实验数据。图2A-2B显示了在24孔中进行的HPRT1 siRNA敲低实验产生的敲低百分比(图2A)和蛋白质表达(图2B)数据。图2C-2D显示了在6孔中进行的HPRT1 siRNA敲低实验产生的敲低百分比(图2C)和蛋白质表达(图2D)数据。
图3A-3B显示从PGA5(图3A)和SPANXN3(图3B)的RNA-Seq数据的生物信息学分析获得的基因表达的对数倍数变化值，表示为在未经补充的细胞培养基中培养的细胞相对于未感染的细胞(未用辅助病毒感染的细胞)的基因表达的对数倍数变化，和在经补充的细胞培养基中培养的细胞相对于在未经补充的细胞培养基中培养的细胞的基因表达的对数倍数变化。图3C-3D显示相对于未感染的细胞，在未经补充和经补充的细胞培养基中培养的细胞中PGA5(图3C)和SPANXN3(图3D)的表达的RT-qPCR倍数变化值。
图4A-4B显示了相对于未感染细胞(未用辅助病毒感染的细胞)，在未经补充的细胞培养基和经补充的细胞培养基中培养的生产细胞系克隆中PGA5(图4A)和SPANXN3(图4B)表达的倍数变化值，如RT-qPCR确定。21C5、3C6、2B6代表HeLa生产细胞系的不同克隆。图4C-4D显示与在未经补充的细胞培养基中培养的克隆相比，在经补充的细胞培养基中培养的生产细胞系克隆21C5、3C6、2B6中PGA5(图4C)和SPANXN3(图4D)表达的相对倍数增加。
图5A-5F显示降低不同生产细胞系中单个基因的表达对rAAV滴度的影响。这些图显示了生产细胞系#1(图5A)、生产细胞系#2(图5B)和生产细胞系#3(图5C)以基因组拷贝(GC)/毫升(mL)产生的rAAV基因组的滴度。图5D-5F显示由生产细胞系#1(图5D)、生产细胞系#2(图5E)和生产细胞系#3(图5F)产生的rAAV的滴度的倍数变化。图5A-5B显示3个生物重复的平均值。图5C-5F显示4个生物重复的平均值。
图6是示出示例性基因过滤方法的说明性流程图。
图7A显示了前19个2H5敲除克隆的24深孔滴度。滴度报告为基因组拷贝数/mL。对照样品是未修饰的2H5。图7B显示了与2H5对照相比滴度的倍数变化。2H5滴度设为1，其他滴度显示为高于2H5对照的倍数增加。图7C显示了前19个7B12敲除克隆的24深孔滴度。滴度报告为基因组拷贝数/mL。对照样品是未修饰的7B12。图7D显示了与7B12对照相比滴度的倍数变化。7B12滴度设为1，其他滴度显示为高于7B12对照的倍数增加。
图8A显示了前五个2H5敲除克隆的
Figure BDA0003299768330000071
15滴度。滴度报告为基因组拷贝数/mL。对照样品是未修饰的2H5。图8B显示了与2H5对照相比滴度的倍数变化。2H5滴度设为1，其他滴度显示为高于2H5对照的倍数增加。图8C显示了前四个7B12敲除克隆的
Figure BDA0003299768330000072
15滴度。滴度报告为基因组拷贝数/mL。对照样品是未修饰的7B12。图8D显示了与7B12对照相比滴度的倍数变化。7B12滴度设为1，其他滴度显示为高于7B12对照的倍数增加。
图9A-9B显示了通过降低两种生产细胞系中各种基因组合的表达而产生的对rAAV滴度的影响。该图显示与用错义siRNA处理的对照相比，rAAV滴度的倍数变化。图9A显示了与2H5错义对照相比，滴度的倍数变化。2H5错义滴度设为1，其他滴度显示为高于2H5错义对照的倍数增加。图9B显示了与7B12错义对照相比，滴度的倍数变化。7B12错义滴度设定为1，其他滴度显示为高于7B12错义对照的倍数增加。
具体实施方式
本公开描述了重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中一种或多种基因和/或蛋白的表达被调节的细胞。与其中一种或多种基因和/或蛋白质的表达未被调节的细胞系相比，基因表达的调节导致增加的滴度产率。
除非另有说明，技术术语均按惯例使用。分子生物学中常用术语的定义可以在以下中找到：Benjamin Lewin，Genes V[基因V]，由Oxford University Press[牛津大学出版社出版]出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑.)，The Encyclopedia ofMolecular Biology[分子生物学百科全书]，由Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学公司]出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biologyand Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference[分子生物学和生物技术：综合案头参考]，由VCH Publishers[VCH出版公司]出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
包括以下定义是为了理解本主题和构建所附专利权利要求。本文所用的缩写具有其在化学和生物领域内的常规含义。
定义
如本文所用，“调节(modulation或modulate)”是指基因和/或蛋白质的调控、表达或活性的改变。调节可以是增加、减少(降低)或消除一种或多种基因和/或蛋白质的表达和/或活性。在调节多个基因和/或蛋白的情况下，基因和/或蛋白的所有表达和/或活性可以增加，或基因和/或蛋白的所有表达和/或活性可以降低，或一种或多种基因和/或蛋白可以增加而其他基因和/或蛋白可以降低。
本文所用的术语“细胞”是指能够产生重组腺相关病毒(rAAV)的任一种或多种细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如HeLa细胞、COS细胞、HEK293细胞、A549细胞、BHK细胞或Vero细胞。在其他实施方案中，细胞是昆虫细胞，例如Sf9细胞、Sf-21细胞、Tn-368细胞或BTI-Tn-5B1-4(High-Five)细胞。术语“细胞系”是指能够继续分裂而不经历衰老的克隆细胞群。除非另有说明，术语“细胞”或“细胞系”应理解为包括所示细胞或细胞系的经修饰或工程化变体。
如本文所用，术语“工程化的细胞系”是指已通过一种或多种方式修饰以降低一种或多种内源表达基因和/或蛋白质(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1)的表达或其他特性(例如生物活性)从而增加rAAV产生的细胞系。
如本文所用，术语“对照亲本细胞”是指未通过一种或多种方式修饰以降低一种或多种内源表达基因和/或蛋白质(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1)的表达或其他特性(例如生物活性)从而增加rAAV产生的细胞。
如本文所用，术语“对照亲本细胞系”是指能够继续分裂并且不经历衰老的对照亲本细胞的克隆群体。
“裂解”是指细胞的分解，通常通过损害其完整性的病毒、酶或渗透机制。“裂解的细胞”是已经经历实质裂解的细胞。如本文所用，术语“裂解物”是指含有裂解的细胞的内容物的流体。
如本文所用，术语“较高滴度”表示与未修饰的对照亲本细胞系和/或对照亲本细胞产生的滴度相比增加的滴度。
如本文所用，术语“细胞培养上清液”是指其中悬浮和/或培养细胞的细胞培养基。
如本文所用，术语“基因”是指转录单元和与所述转录单元相邻(例如，位于上游和下游)且可操作地连接的调控区。转录单元是一系列转录成RNA分子的核苷酸。转录单元可以包括编码区。“编码区”是编码未加工的前体RNA(即，包括外显子和内含子的RNA分子)的核苷酸序列，前体RNA随后被加工成mRNA。转录单元可以编码非编码RNA。非编码RNA是不翻译成蛋白质的RNA分子。非编码RNA的实例包括微RNA。转录单元的边界通常由其5′端的起始位点和其3′端的转录终止子决定。“调控区”是调节与其可操作连接的转录单元的表达的核苷酸序列。调节序列的非限制性实例包括启动子、增强子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点、转录终止子和聚(A)信号。位于转录单元上游的调控区可称为5′UTR，位于转录单元下游的调控区可称为3′UTR。调控区可以被转录并且是未加工的前体RNA的一部分。
在本文的上下文中，术语“靶”或“靶基因”是指任何基因，包括编码蛋白质的基因和编码非编码RNA(例如miRNA)的基因，其在被调节时改变病毒产生的某些方面。靶基因包括内源基因、病毒基因和转基因。
关于基因名称，单个基因通常用多个符号表示。在本文的上下文中，基因符号，无论是人类的还是非人类的，都可以用大写或小写字母来表示。在这些公开的上下文中，使用一个特定符号或采用小写或大写符号都不旨在限制基因的范围。除非另有说明，本文中鉴定的所有基因标识号(GeneID)均来自国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)“Entrez Gene”或KEGG网站。
本文所用的术语“约”是指大约、在区域内、大致或周围。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过在允许的数值范围内扩展高于和/或低于所述数值的边界来修饰该范围。
如本公开中所使用的，无论是在过渡性短语中还是在权利要求的主体中，术语“包含(comprise(s)和comprising)”应被解释为具有开放式含义。即，该术语应被解释为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的上下文中使用时，术语“包含”是指该方法至少包括所述的步骤，但可以包括另外的步骤。当在组合物的上下文中使用时，术语“包含”是指组合物至少包括所述的特征或组分，但也可包括另外的特征或组分。
为了促进对文中描述的实施方案的理解，使用对优选实施方案和特定语言的引用来描述它们。本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本公开的范围。如整个本公开使用的，单数形式“一(a，an)”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外清楚地指明。除非另外指明，否则本文所用的所有百分比和比率均按重量计。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本披露内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然与本文描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。此外材料、方法和实施例仅为说明性的并且不旨在是限制性的。所有的公开物、专利申请、专利、以及本文提及的其他参考文献通过引用并入。
腺相关病毒(AAV)：
AAV是一种小的、复制缺陷的、无包膜的病毒，其感染人类和一些其他灵长类物种。AAV已知不会引起疾病并引发非常温和的免疫应答。利用AAV的基因疗法载体可以感染分裂细胞和休眠细胞，并且能以染色体外状态持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使AAV成为一种有吸引力的基因疗法病毒载体。AAV包括许多血清学上可区分的类型，包括血清型AAV-1至AAV-12，以及来自非人灵长类的超过100种血清型(参见，例如，Srivastava，J.Cell Biochem.[细胞生物化学杂志]，105(1)：17-24(2008)，以及Gao等人，J.Virol.[病毒学杂志]，78(12)，6381-6388(2004))。AAV是非自主复制的，并且具有包含潜伏期和感染期的生命周期。在潜伏期，细胞被AAV感染后，AAV作为前病毒位点特异性地整合到宿主基因组中。除非细胞也被允许AAV复制的辅助病毒(例如，腺病毒(AV)或单纯疱疹病毒)感染，否则不会发生感染阶段。
野生型AAV基因组含有两个具有145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)，其含有指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号序列。除ITR外，三种AAV启动子p5、p19和p40驱动编码rep和cap基因的两个开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接偶联的两个rep启动子导致从rep基因产生四种rep蛋白(Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)。Rep蛋白负责基因组复制。cap基因由p40启动子表达，并编码三个衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)，它们是cap基因的剪接变体。这些蛋白质形成AAV颗粒的衣壳。
因为用于复制、衣壳化和整合的顺式作用信号包含在ITR内，所以4.3kb内部基因组的一些或全部可以被外源DNA，例如用于感兴趣的外源蛋白质的表达盒代替。在这种情况下，rep和cap蛋白反式提供在例如质粒上。为了产生AAV载体，允许AAV复制的细胞系必须表达rep和cap基因、ITR侧翼表达盒和由辅助病毒提供的辅助功能，例如AV基因E1a、E1b55K、E2a、E4orf6和VA(Weitzman等人，Adeno-associated virus biology[腺相关病毒生物学].Adeno-Associated Virus：Methods and Protocols[腺相关病毒：方法和方案]，第1-23页，2011)。AAV载体的产生也可导致辅助病毒颗粒的产生，辅助病毒颗粒必须在使用AAV载体之前除去或灭活。许多细胞类型适于产生AAV载体，包括HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、BHK细胞、Vero细胞以及昆虫细胞(参见例如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、5,688,676、8,163,543、美国公开号20020081721、PCT公开号WO 00/47757、WO00/24916和WO 96/17947)。AAV载体通常在这些细胞类型中由一种含有ITR侧翼表达盒的质粒和一种或多种提供另外AAV和辅助病毒基因的另外质粒产生。
任何血清型的AAV可用于本发明。类似地，预期可以使用任何AV类型，并且本领域技术人员将能够鉴定适于产生其期望的重组AAV载体(rAAV)的AAV和AV类型。AAV和AV颗粒可以例如通过亲和层析、碘克沙醇梯度或CsCl梯度纯化。
野生型AAV的基因组是单链DNA，为4.7kb。AAV载体可具有大小为4.7kb或大于或小于4.7kb的单链基因组，包括大至5.2kb或小至3.0kb的超大基因组。此外，载体基因组可以基本上是自身互补的，使得在病毒内基因组基本上是双链的。含有所有类型基因组的AAV载体适用于本公开的方法。
如上所述，AAV需要用辅助病毒共感染以进入其生命周期的感染阶段。辅助病毒包括腺病毒(AV)和单纯疱疹病毒(HSV)，并且存在使用杆状病毒在昆虫细胞中产生AAV的系统。也已经提出乳头状瘤病毒也可以为AAV提供辅助功能(参见，例如，Hermonat等人，Molecular Therapy[分子疗法]9，S289-S290(2004))。辅助病毒包括能够产生和允许AAV复制的任何病毒。AV是一种无包膜的核DNA病毒，其双链DNA基因组为约36kb。AV能够通过提供E1a、E1b55K、E2a、E4orf6和VA基因并允许AAV复制和衣壳化来拯救细胞中潜伏的AAV前病毒。HSV是具有包裹在二十面体衣壳中的相对大的双链线性DNA基因组的病毒家族，所述二十面体衣壳包裹在脂双层包膜中。HSV具有感染性和高传染性。以下HSV-1复制蛋白被鉴定为AAV复制所必需的：解旋酶/引发酶复合物(UL5、UL8和UL52)和由UL29基因编码的DNA结合蛋白ICP8，以及增强辅助功能的其他蛋白。AAV包装系统具有两个目的：它避免了转染方法的问题，并提供了基于使用一种或几种辅助功能的生产技术。
rAAV的产生
rAAV的一般原理可以在别处综述(参见，例如，Carter，1992，Current Opinionsin Biotechnology[生物技术的最新观点]，3：533-539；以及Muzyczka，1992，Curr.Topicsin Microbiol.and Immunol.[微生物学和免疫学的当前主题]，158：97-129)。一般而言，为了允许产生rAAV，必须给细胞提供AAVITR(其可以例如侧接感兴趣的异源核苷酸序列)、AAVrep和cap基因功能、以及另外的辅助功能。这些可以使用任何数量的合适质粒或载体提供给细胞。另外的辅助功能可以由例如腺病毒(AV)感染、携带所有所需AV辅助功能基因的质粒或其他病毒如HSV或杆状病毒提供。细胞产生rAAV所必需的任何基因、基因功能或遗传物质可瞬时存在于细胞内，或稳定插入细胞基因组中。适用于本公开方法使用的rAAV生产方法包括以下中披露的那些：Clark等人，Human Gene Therapy[人基因疗法]6：1329-1341(1995)，Martin等人，Human Gene Therapy Methods[人基因疗法方法]24：253-269(2013)，Thorne等人，Human Gene Therapy[人基因疗法]20：707-714(2009)，Fraser Wright，HumanGene Therapy[人基因疗法]20：698-706(2009)，和Virag等人，Human Gene Therapy[人基因疗法]20：807-817(2009)。AAV产生系统的两种主要方法是重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和腺相关病毒(rAAV)生产细胞系。
重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系
rAAV包装细胞系可通过允许本文所述AAV遗传元件的细胞表达来产生。用编码AAVrep和cap基因的质粒稳定转染细胞系(例如HEK293、HeLa)可产生包装细胞系。该rAAV包装细胞系可以用两种不同的腺病毒(辅助病毒和含有AAV基因治疗元件的杂合病毒)共感染以产生rAAV颗粒。可替代地，用含有rAAV载体的质粒稳定转染包装细胞或用rAAV载体感染它们产生rAAV生产细胞系。用辅助病毒感染产生细胞导致rAAV的产生。图1说明包装细胞系和生产细胞系。
在本公开的某些实施方案中，将包含AAV rep和cap基因功能的rAAV包装细胞系工程化以增加rAAV滴度。
在一个方面，本公开提供了rAAV包装细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，一种或多种基因和/或蛋白的表达降低的细胞。例如，与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。
在一些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞。
在其他实施方案中，本公开提供了rAAV生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，一种或多种基因和/或蛋白的表达降低的细胞。例如，与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低。在一些实施方案中，本公开的rAAV生产细胞系已被工程化以减少KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的基因表达。
在某些实施方案中，本公开的细胞系可以是粘附或悬浮形式。
在某些实施方案中，本公开的细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)是哺乳动物细胞系(例如HeLa、人胚肾(HEK)293、COS、A549或Vero细胞系)。在某些实施方案中，细胞系是昆虫细胞系(例如Sf9、Sf-21、Tn-368、或BTI-Tn-5B1-4)。
产生rAAV生产细胞系的方法
在一些实施方案中，本公开提供了通过将rAAV载体递送至包含其中与对照细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低的细胞的工程化rAAV包装细胞系来产生生产细胞系的方法。
在某些实施方案中，本公开提供了通过将rAAV载体递送至包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞的工程化rAAV包装细胞系来产生生产细胞系的方法。
补充剂
如本文所用，术语“补充剂”是指任何化学或生物来源的化合物或其他材料，其可用于细胞培养的培养基中以增加rAAV滴度或测定rAAV滴度的增加。补充剂的非限制性实例包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质、酶、核苷、代谢物、表面活性剂、乳化剂、无机盐和聚合物。在某些实施方案中，添加到本公开的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中的一种或多种补充剂是糖皮质激素类似物。在某些实施方案中，加入rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的一种或多种补充剂包括地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松、可的松、泼尼松、布地奈德和/或曲安西龙。
在某些实施方案中，用于增加rAAV滴度的溶液中糖皮质激素类似物的浓度可以大于或等于1μM、大于或等于0.1μM、大于或等于0.01μM、在0和1μM之间、在0和0.1μM之间、在0和0.01μM之间、在0.01和1μM之间、或在0.01和0.1μM之间。
如本文所用，“经补充的细胞系”是指其中已添加一种或多种补充剂(例如糖皮质激素类似物)以增加rAAV滴度的细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)。如本文所用，“未经补充的细胞系”是指未暴露于用于增加rAAV滴度的一种或多种补充剂的细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)。如本文所用，术语“未经补充的”和“非经补充的”可互换使用，是指其中细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)不暴露于用于增加rAAV滴度的一种或多种补充剂的培养条件。
鉴定与rAAV产生相联的一种或多种基因的方法
本公开部分地涉及通过比较经补充和未经补充的细胞系中的全局基因表达模式来鉴定与rAAV产生相关的一种或多种基因的方法。
术语“全局基因表达”是本领域熟知的(参见Wang Z等人，Nature ReviewsGenetics[遗传学自然评论]，10(1)，57-63(2009))。术语“全局基因表达”是指包含关于基因表达的不同方面的信息的一组或多组数据。数据集任选地包括关于以下的信息：细胞或细胞来源样品中靶转录物的存在；靶转录物的相对和绝对丰度水平；各种处理(例如添加补充剂)调节特定基因表达的能力；以及各种处理(例如添加补充剂)将特定基因的表达改变至不同水平的能力。
术语“差异表达”是本领域公知的(参见Wang Z.等人，Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]，10(1)，57-63(2009)、Ozsolak，F.等人Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]，12(2)，87-98(2011)、Han，Y.等人Bioinformatics andBiology Insights[生物信息学和生物学见解]，9，29-46(2015))。
在某些实施方案中，本公开的细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)补充有一种或多种增加rAAV产生的补充剂。在一些实施方案中，使用任何公知的程序从一种或多种细胞系(经补充的和未经补充的)中提取RNA样品。例如，可以使用基于二氧化硅的分离以自动化兼容的96孔格式从细胞中纯化总RNA，例如
Figure BDA0003299768330000141
纯化平台(凯杰公司(Qiagen，Inc.)；瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)。
表达的RNA样品中的基因表达模式可以通过定性和定量测量中的任一种(或两种)来评价。在一些实施方案中，相对于其他表达产物和/或相对于对照序列定量基因的表达水平是有用的。确定相对表达的一种方便且广泛适用的方法是将一种或多种感兴趣的基因的表达与对照基因(例如管家基因(例如HPRT1、HSP70或β-肌动蛋白))的表达进行比较。
为了确定观察到的表达数据，例如，响应于生物样品(例如，经补充的和未经补充的细胞系)的一种或多种处理(例如，添加补充剂)的基因表达谱的变化是否显著，例如，不仅仅是实验噪声或群体异质性的产物，还可以为每个生物样品中的每个遗传和表型终点构建概率分布的估计值。估计的群体分布的构建包括对每种处理进行多个独立实验，例如，所有实验以一式两份、一式三份、一式四份等进行。可以使用多变量统计将来自多个生物样品(例如，经补充的和未经补充的细胞系)的表达数据分组或聚类。对数据的分析可以产生一系列例如在经补充的和未经补充的细胞系之间响应于处理而差异表达的基因。可使用各种基因过滤方法过滤差异表达基因的列表，以鉴定可用于增加rAAV产生的一种或多种基因。
在一些实施方案中，本公开涉及从经补充和未经补充的细胞系之间差异表达的基因列表中鉴定与rAAV产生相关的一种或多种基因的方法。在某些实施方案中，细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，细胞系是人细胞系。在某些实施方案中，细胞系是HeLa细胞系或HEK293细胞系。在某些实施方案中，在不同细胞系中(例如，在未经补充的HeLa和经补充的HeLa细胞系之间、在未经补充的HEK293和经补充的HEK293细胞系之间、在未经补充的HeLa和经补充的HEK 293细胞系之间、在未经补充的HeLa和未经补充的HEK 293细胞系之间、在经补充的HeLa和经补充的HEK 293细胞系之间)测量全局基因表达以鉴定与rAAV产生相关的一种或多种基因。在某些实施方案中，可以将来自经补充的HEK 293和经补充的HeLa的全局基因表达数据合并，并与来自未经补充的HEK293和未经补充的HeLa细胞系的合并的全局基因表达数据进行比较，以鉴定与rAAV产生相关的一种或多种基因。
在某些实施方案中，本公开提供了产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系以促进增加rAAV产生的方法。在一些实施方案中，通过调节从在经补充和未经补充的rAAV生产细胞系之间差异表达的基因列表中鉴定的一种或多种基因和/或蛋白质的表达来增加rAAV产生。在某些实施方案中，通过对从经补充和未经补充rAAV生产细胞系之间差异表达的基因列表中鉴定的一种或多种基因和/或蛋白质的表达进行调节来增加rAAV滴度。在一些实施方案中，与由不调节相应一种或多种基因和/或一种或多种蛋白质的表达的细胞系产生的rAAV滴度相比，rAAV滴度增加至少1.5倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍或30倍)。
受调节的基齿和/或蛋白质
在某些实施方案中，本公开提供了当在rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中被调节(单独或组合)时增强rAAV产生的基因列表。
ATP合酶F1亚基ε假基因2(也称为ATP5EP2)编码线粒体ATP合酶亚基ε样蛋白。ATP5EP2是线粒体膜ATP合酶，其在跨膜质子梯度的存在下从ADP产生ATP，所述跨膜质子梯度由呼吸链的电子传递复合物产生。人ATP5EP2序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_006886.4(SEQ ID NO：43)或NG_053163.1(SEQ ID NO：44)获得。
长基因间非蛋白编码RNA 319(也称为LINC00319)是RNA基因，并与非编码RNA类相关。长非编码RNA(lncRNA)已显示在多种癌症的发病机理和进展中起重要的调节作用。LINC00319序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_194309(SEQID NO：45)或NR_026960.1(SEQ ID NO：46)获得。
细胞色素P450家族3亚家族A成员7(也称为CYP3A7)是编码参与药物代谢和胆固醇、类固醇和其他脂质合成的酶的细胞色素P450超家族成员的基因。该酶羟基化睾酮和脱氢表雄酮3-硫酸盐，其涉及妊娠期间雌三醇的形成。该基因是染色体7q21.1上相关基因的簇的一部分。CYP3A7序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_000765(SEQ ID NO：47)获得。
ATP结合盒亚家族A成员10(也称为ABCA10)编码属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族成员的膜相关蛋白。ABC蛋白转运各种分子穿过胞外膜和胞内膜。ABC基因分为7个不同的亚家族(ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20和White)。ABCA10是ABC1亚家族成员。ABC1亚家族成员包括唯一在多细胞真核生物中发现的仅有主要ABC亚家族。该基因聚簇在17q24上的其他四个ABC1家族成员中。ABCA10序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_080282.3(SEQ ID NO：48)获得。
Noggin(也称为NOG)编码分泌性多肽，其结合并灭活转化生长因子-β(TGF-β)超家族信号传导蛋白的成员，例如骨形态发生蛋白-4(BMP4)。不受理论的束缚，据信通过比TGF-β超家族的成员更有效地扩散通过细胞外基质，该蛋白质可在产生形态发生梯度中具有主要作用。NOG似乎在发育早期和后期都具有多效性作用。NOG序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_005450.4(SEQ ID NO：49)获得。
排斥性引导分子BMP共受体A(也称为RGMA)是编码排斥性引导分子家族成员的基因。编码的蛋白质是糖基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，其在发育和成人中枢神经系统中起轴突引导蛋白的作用。该蛋白还可以在一些癌症中起肿瘤抑制剂的作用。RGMA序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_020211.2(SEQ ID NO：50)或NM_001166283.1(SEQ ID NO：51)获得。
SPANX(与X染色体上的细胞核相关的精子蛋白)家族成员N3(也称为SPANXN3)是蛋白质编码基因。SPANXN3序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_001009609(SEQ ID NO：52)获得。
胃蛋白酶原-5，组I(也称为PGA5或胃蛋白酶原A)编码消化酶胃蛋白酶的蛋白质前体，胃蛋白酶是内肽酶的肽酶A1家族的成员。编码的前体由胃主细胞分泌并在酸性条件下经历自催化切割以形成活性酶，其在饮食蛋白质的消化中起作用。该基因存在于染色体11上的相关基因簇中，每个基因编码多个胃蛋白酶原中的一个。PGA5序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_014224.4(SEQ ID NO：53)获得。
肌球蛋白VIIA和Rab相互作用蛋白(也称为MYRIP)编码参与黑素体转运的Rab效应蛋白，其用作黑素体结合的RAB27A与运动蛋白MYO5A和MYO7A之间的连接。该Rab效应蛋白起蛋白激酶A锚定蛋白(AKAP)的作用，并且可以作为支架蛋白，该支架蛋白将PKA连接到胞吐机制的组分，从而促进胞吐，包括胰岛素释放。MYRIP序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_015460(SEQ ID NO：54)或NM_001284423.1(SEQ ID NO：55)获得。
钾钙激活通道亚家族N成员2(也称为KCNN2)基因是钾通道基因的KCNN家族成员。所编码的蛋白质是与三个其他钙调素结合亚基形成电压非依赖性钙激活通道的整合膜蛋白。该基因的交替剪接产生多个转录变体。KCNN2序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NM_170775.2(SEQ ID NO：56)或NM_001278204.1(SEQ ID NO：57)获得。
NALCN反义RNA 1(也称为NALCN-AS1)是RNA基因，并且与非编码RNA类相关。NALCN-AS1序列的实例可在NCBI核苷酸数据库(核苷酸序列)中以参考序列NW_011332700.1(SEQID NO：58)或NR_047687.1(SEQ ID NO：59)获得。
在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS 1的表达降低的细胞。
在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞。
在某些实施方案中，本公开提供了当在rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中被单独调节时与对照亲本细胞系相比提高rAAV产生的基因列表。在一些方面，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中不同基因组合的调节增加rAAV产生。在一些方面，调节rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或至少11种基因的表达导致与对照亲本细胞系相比增加rAAV产生。
调节一种或多种基因和/或蛋白质的方法
调节(例如，降低)基因(例如，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2或NALCN-AS1)的表达或活性可以通过不同的机制实现，包括但不限于改变以下的一种或多种：1)基因拷贝数，2)基因的转录或翻译，3)转录物稳定性或寿命，4)mRNA或miRNA的拷贝数，5)非编码RNA或非编码RNA靶位点的可用性，6)蛋白质上翻译后修饰的位置或程度，或7)蛋白质的活性。可用于调节基因表达的工具包括但不限于核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、反义RNA寡核苷酸(ASO)、基因破坏或部分或完全基因缺失。
核酸酶
在某些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)实现基因调节。合成的ZFN由与例如FokI DNA切割结构域融合的锌指结合结构域构成。可以设计/工程化ZFN用于编辑细胞的基因组，包括但不限于在多种生物体中敲除或敲入基因表达。大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(例如Cas核酸酶)和三链体也可用于多种细胞类型的基因组工程化。所述试剂可用于靶向启动子、蛋白编码区(外显子)、内含子、5′和3′UTR等。
用于调节的双链RNA(dsRNA)分子
在某些实施方案中，双链RNA(dsRNA)分子可用于调节本文所述细胞系(例如rAAV包装细胞系和/或生产细胞系)中一种或多种基因的表达。可以设计dsRNA分子以通过相应RNA序列的基于序列同源性的靶向来拮抗一种或多种基因。这种dsRNA可以是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微RNA(miRNA)。这种dsRNA的序列将包含编码一种或多种待调节基因的mRNA的互补部分。该部分可与mRNA内的靶部分100％互补，但也可使用较低水平的互补性(例如，90％或更高或95％或更高)。典型地，互补百分比在一段连续核酸残基上确定。本公开的dsRNA分子可例如与mRNA内的靶部分具有至少80％互补性，这在至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或更多个核酸残基上测量。在一些情况下，dsRNA分子在dsRNA分子的整个长度上与mRNA的靶部分具有至少80％互补性。
使用RNA干扰(RNAi)途径的另一种基因靶向试剂是小发夹RNA，也称为shRNA。通过例如表达构建体(例如质粒、慢病毒)递送至细胞的shRNA具有以组成型或调节型方式提供基因表达的长期降低的能力，这取决于所用启动子的类型。在一个实施方案中，慢病毒颗粒的基因组被修饰成包括一种或多种靶向一种或多种感兴趣基因的shRNA表达盒。这种慢病毒可以感染细胞，将其病毒基因组稳定地整合到宿主基因组中，并以组成型、调节型或(在表达多个shRNA的情况下)组成型和调节型方式表达shRNA。因此，在一些实施方案中，可以设计shRNA以靶向单个基因或多个密切相关的基因家族成员的个体变体。个体shRNA可以调节具有相似或冗余功能或序列基序的靶集合。本领域技术人员将认识到慢病毒构建体也可掺入克隆的DNA或ORF表达构建体。
在本文所述的实施方案中，包括小干扰RNA(siRNA)以及微RNA(miRNA)的基因靶向试剂可用于调节基因功能。siRNA和miRNA可掺入宽范围的化学修饰，与感兴趣的靶转录物的互补水平和设计(参见美国专利号8,188,060)以增强稳定性、细胞递送、特异性和功能性。另外，此类试剂可以被设计成靶向基因的不同区域(包括mRNA的5′UTR、开放阅读框、3′UTR)或(在一些情况下)编码感兴趣的基因的基因组DNA的启动子/增强子区域。基因调节(例如，降低基因表达、敲除)可以通过将靶向相同mRNA转录物的不同区域的单个siRNA或miRNA或多个siRNA或miRNA库引入(至细胞中)来实现。合成的siRNA/miRNA递送可通过许多方法实现，包括但不限于1)自我递送、2)脂质介导的递送、3)电穿孔、或4)基于载体/质粒的表达系统。导入的RNA分子可称为外源核苷酸序列或多核苷酸。在一些实施方案中，siRNA可以被设计成靶向单个基因或多个密切相关的基因家族成员的个体变体。
siRNA可用于降低一种或多种基因(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1)的表达。在一些实施方案中，包含选自SEQ ID NO：1至11的核苷酸序列或其变体的siRNA用于降低靶基因的表达。
表1：用于降低基因表达的siRNA序列。
Figure BDA0003299768330000191
Figure BDA0003299768330000201
Figure BDA0003299768330000211
*用于降低基因表达的siRNA序列(有义和反义)。序列中小写核苷酸代表3`突出端。
在一些实施方案中，用于降低ATP5EP2表达的siRNA包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低LINC00319表达的siRNA包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低CYP3A7表达的siRNA包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低NOG表达的siRNA包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低SPANXN3表达的siRNA包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低MYRIP表达的siRNA包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低KCNN2表达的siRNA包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低NALCN-AS1表达的siRNA包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低RGMA表达的siRNA包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低PGA5表达的siRNA包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：41的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低ABCA10表达的siRNA包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列或其变体。例如，在一些实施方案中，siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列。
反义RNA寡核苷酸(ASO)
反义RNA寡核苷酸(ASO)可用于调节rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因的表达。通常，ASO用于降低一种或多种基因的表达。使用已知技术并基于待调节的一种或多种基因的序列的了解，可以设计ASO分子以通过相应RNA的基于序列同源性的靶向来拮抗一种或多种基因。ASO序列可包含与由一种或多种基因产生的mRNA或lncRNA的靶部分互补的核苷酸序列。该部分可与mRNA或lncRNA内的靶部分100％互补，但也可使用较低水平的互补性(例如，90％或更高或95％或更高)。
在一些实施方案中，ASO可以是反义RNA寡核苷酸，其中序列的至少一个核苷键是硫代磷酸酯键，二硫代磷酸酯键，磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，氨基烷基磷酸三酯键，亚烷基膦酸酯键，亚膦酸酯键，氨基磷酸酯键和氨基烷基氨基磷酸酯键，硫代氨基磷酸酯键，硫代烷基膦酸酯键，硫代烷基磷酸三酯键，硫代磷酸酯键，硒代磷酸酯键或硼磷酸酯键。在特定的实施方案中，反义RNA寡核苷酸序列的至少一个核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义RNA寡核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
CRISPR基因组编辑
在一些实施方案中，使用CRISPR基因组编辑来调节rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中的基因表达。CRISPR基因组编辑通常包含两种不同的组分：(1)指导RNA和(2)内切核酸酶，特别是CRISPR相关(Cas)核酸酶(例如Cas9)。指导RNA是内源细菌crRNA和tracrRNA组合成单个嵌合指导RNA(gRNA)转录物。不受理论束缚，据信当gRNA和Cas在细胞中表达时，基因组靶序列可被修饰或永久破坏。
通过gRNA序列与待降低基因(例如，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2或NALCN-AS1)中靶DNA序列的互补序列之间的碱基配对将gRNA/Cas复合物募集到靶序列。为了成功结合Cas，基因组靶序列还必须包含紧随靶序列的正确原型间隔区相邻基序(PAM)序列。gRNA/Cas复合物的结合将Cas定位于本公开的一种或多种基因中的基因组靶序列，使得野生型Cas可切割DNA的两条链，引起双链断裂。这可以通过以下两种一般修复途径中的一种进行修复：(1)非同源末端连接DNA修复途径或(2)同源定向修复途径。非同源修复途径可导致双链断裂处的插入/缺失，其可导致移码和/或过早终止密码子，有效地破坏靶基因的开放阅读框。同源定向修复途径需要存在修复模板，其用于修复双链断裂。
任何适当的gRNA对可以用于CRISPR基因组编辑。通常，gRNA对用于降低一种或多种基因(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1)的表达。在本文描述的一些实施方案中，gRNA对用于调节(例如，降低或消除/敲除)ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达。
gRNA对可使用已知技术并基于待调节的一种或多种基因的序列的了解来设计，通常使用任何公众可获得的适当计算机程序。敲除包装细胞和/或生产细胞可以使用任何合适的技术产生，其中标准技术是本领域已知的并且合适的试剂盒是可商购的。
可以通过任何合适的方式将gRNA对递送到本公开的生产细胞系。合适的技术是本领域已知的，包括使用质粒、病毒和细菌载体以将gRNA对递送至生产细胞系。通常，使用质粒DNA递送gRNA对。
gRNA对可用于降低一种或多种基因(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1)的表达。多个gRNA对可用于调节基因的表达。在本文描述的一些实施方案中，gRNA对用于降低ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2或NALCN-AS1中的至少一种的表达。多个gRNA对可用于调节KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达。在一些实施方案中，可以修饰gRNA以通过增加与靶位点的结合和抑制核酸酶降解来增强编辑效率。在某些实施方案中，这些修饰可以是gRNA的5′和3′端上的末端三个核苷酸中的2′O-甲基类似物和3′硫代磷酸酯核苷酸间键。用于调节一种或多种基因的基因表达的gRNA对所靶向的示例性靶DNA序列可包含选自表2中所列的SEQ ID NO：16-31中的任一个核苷酸序列或其变体。
表2：gRNA对的示例性靶区域序列(SEQ ID NO：12-15)和靶DNA序列(SEQ ID NO：16-31)
Figure BDA0003299768330000241
Figure BDA0003299768330000251
例如，用于靶向KCNN2的gRNA对可包含选自SEQ ID NO：12-15的核苷酸序列的序列(示于表2中)。在一些实施方案中，用于靶向KCNN2的gRNA对包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子。在一些实施方案中，用于靶向KCNN2的gRNA对包含含有或具有SEQ ID NO：14的序列的第一gRNA分子和含有或具有SEQID NO：15的序列的第二gRNA分子。
在一些实施方案中，用于靶向KCNN2的gRNA分子是2′O-甲基类似物，其在其5′和3′端的任一者或两者上的末端三个核苷酸中包含3′硫代磷酸酯核苷酸间键并且包含SEQ IDNO：12、13、14或15的序列。
变体gRNA序列可以与本公开的序列具有至少80％序列一致性，这是在任何适当长度的序列上测量。典型地，序列同一性百分比是在一段连续核酸上确定的。本公开的变体gRNA序列可例如与本公开的序列具有至少80％序列同一性，这在至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或更多个核酸残基上测量。在一些实施方案中，变体gRNA分子在变体gRNA分子的整个长度上与本公开的gRNA分子具有至少80％序列同一性。在一些实施方案中，本公开的变体gRNA分子可以是其靶区域与SEQ ID NO：16至30中的一个的靶序列互补的一种或多种gRNA分子的变体。本公开的gRNA对可以包含靶向基因(例如，选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1的基因)的对中的两种gRNA序列中的一种或两种的变体。例如，包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子的gRNA对的变体可以包含1)含有SEQ ID NO：12的序列的变体的第一gRNA分子，2)含有SEQ ID NO：13的序列的变体的第二gRNA分子，或3)两者。
在蛋白质水平的调节
在另一个实施方案中，基因的表达和/或活性的调节在蛋白质(例如，多肽)水平发生。例如，可以通过包括但不限于用小分子、肽、适体、去稳定结构域靶向蛋白质的方法或可以例如下调基因产物活性或提高基因产物降解速率的其他方法来实现蛋白质水平上的基因功能降低。可替代地，可以通过定点诱变和/或引入错义或无义突变来修饰表达的蛋白质以降低或消除生物活性。在一些实施方案中，可以将结合例如活性位点并抑制靶蛋白功能的小分子加入例如细胞培养基中，并由此引入包装细胞和/或生产细胞中。可替代地，可通过向细胞(例如包装细胞和/或生产细胞)中引入例如肽来调节靶蛋白功能，所述肽例如防止蛋白-蛋白相互作用(参见Shangary等人，(2009)Annual Review of PharmacologyandToxicology[药理学与毒理学年度评论]49：223)。可通过例如转染或电穿孔或经由表达构建体将此类肽引入细胞(例如包装和/或生产细胞)中。可替代地，可通过添加(例如，通过缀合)一种或多种促进细胞递送的部分或增压分子以增强自身递送来将肽引入细胞(例如，包装细胞和/或生产细胞)。用于表达肽的技术包括但不限于肽与支架的融合、或信号序列的附着，以分别将肽稳定或引导至感兴趣的位置或区室。在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系包含已使用前述方法中的任一种工程化以降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。
调节对一种或多种基因和/或蛋白质的表达的影响
在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可用于生成产生高滴度rAAV的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系。在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可导致一种或多种基因(例如ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1)的表达的显著降低和/或由一种或多种基因表达的蛋白质的活性的显著降低(例如降低至少5％、至少10％、至少20％或更大)。在某些实施方案中，靶基因的表达降低约40％至约100％(例如，约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％；或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％)。
在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可导致由靶基因(例如，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1)表达的蛋白质或RNA的活性显著降低。例如，本文所述的方法可导致由靶基因表达的蛋白质或RNA的活性降低至少5％、至少10％、至少20％或更多。在某些实施方案中，靶基因蛋白或RNA活性降低约40％至约100％(例如，约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％；或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％)。此外，一种或多种基因的调节可导致多种基因的调节(例如，通过miRNA)。
在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可导致基因产物(例如，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的基因产物)的表达显著降低(例如降低至少5％、至少10％、至少20％或更多)。在某些实施方案中，基因产物的表达降低约40％至约100％(例如，约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％；或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％)。
在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可导致由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达显著降低(例如，降低至少5％、至少10％、至少20％或更多)。在某些实施方案中，多肽或多核糖核苷酸的表达降低约40％至约100％(例如，约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％；或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％)。
在某些实施方案中，本公开中描述的调节方法可导致由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的活性显著降低(例如，降低至少5％、至少10％、至少20％或更多)。在某些实施方案中，表达的多肽或多核糖核苷酸的活性降低约40％至约100％(例如，约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％；或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％)。
在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因、蛋白质或RNA的表达和/或活性的降低维持约5天(例如，约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或更长时间)。
在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因、蛋白质或RNA的表达和/或活性的降低旨在无限期或永久地维持，例如通过使用基因破坏或部分或完全基因缺失。
在某些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因、蛋白质或RNA的表达和/或活性的降低在培养物中维持rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的至少一代、至少二代、至少三代、至少四代、至少五代、至少十代、至少二十代、至少三十代、至少四十代或更多代。
调节对rAAV产生的影响
rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因和/或蛋白的调节可导致rAAV滴度的增加。在一些实施方案中，调节导致由rAAV包装细胞系和/或生产细胞系产生的rAAV的滴度增加至约1.5至约7倍(例如，约1.5至约6.5、约1.5至约6、约1.5至约5.5、约1.5至约5、约1.5至约4.5、约1.5至约4、约1.5至约3.5、约1.5至约3.0、约1.5至约2.5、约1.5至约2.0、约2至约7、约2.5至约7、约3至约7、约3.5至约7、约4至约7、约4.5至约7、约5至约7、约5.5至约7、约6至约7、约6.5至约7、或约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、或约7.0)。在一些实施方案中，由rAAV包装细胞系和/或生产细胞系产生的rAAV的滴度增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多。由一种或多种基因和/或蛋白质的调节引起的rAAV滴度的任何增加可以与由对照亲本细胞系产生的rAAV滴度进行比较。
在一些实施方案中，rAAV包装细胞系和/或生产细胞系中一种或多种基因和/或蛋白的调节可增加rAAV滴度产生至少2天、至少5天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更长时间。
产生rAAV的方法
在某些实施方案中，本公开描述了从已被工程化以调节一种或多种基因、蛋白质或非编码RNA的表达的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系产生rAAV的方法。在某些实施方案中，rAAV是通过对通过将rAAV载体递送至工程化的rAAV包装细胞系而产生的rAAV生产细胞系的细胞进行感染而产生的。在某些实施方案中，rAAV通过感染其中一种或多种基因、蛋白质或非编码RNA的表达已被调节的rAAV生产细胞系的细胞而产生。在某些实施方案中，与对照亲本细胞系相比，来自工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的rAAV的产生得到增强。
在某些实施方案中，工程化的包装细胞系的细胞用辅助病毒(例如腺病毒(AV)或单纯疱疹病毒)感染，其允许rAAV复制。在一些实施方案中，工程化的生产细胞系的细胞用辅助病毒(例如腺病毒(AV)或单纯疱疹病毒)感染。
收获rAAV的方法
可以通过裂解细胞从工程化的rAAV包装和/或生产细胞获得rAAV颗粒。工程化的rAAV包装和/或生产细胞的裂解可通过化学或酶处理细胞以释放感染性病毒颗粒的方法实现。这些方法包括使用核酸酶(例如全能核酸酶(benzonase)或DNA酶)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)或去污剂或表面活性剂。也可以使用物理破坏，例如均质化或研磨，或通过微流化器压力单元施加压力，或冻融循环。在某些实施方案中，来自工程化的rAAV包装和/或生产细胞的裂解物可用于收获rAAV颗粒。
在某些实施方案中，可以从工程化的rAAV包装和/或生产细胞中收集细胞培养上清液而不需要细胞裂解。在本公开的某些实施方案中，工程化的rAAV包装和/或生产细胞分泌rAAV颗粒，其可从细胞培养上清液中收集而无需细胞裂解。在某些实施方案中，工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系具有比对照亲本细胞系更高的rAAV滴度，使得与对照亲本细胞系相比，从工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系收获更多的rAAV。
收获rAAV颗粒后，可能需要纯化含有rAAV的样品，以除去例如由细胞裂解产生的细胞碎片。AAV颗粒的最小纯化的方法是本领域已知的。两种示例性纯化方法是基于氯化铯(CsCl)和基于碘克沙醇的密度梯度纯化。Strobel等人，Human Gene Therapy Methods[人基因疗法方法]，26(4)：147-157(2015)中描述了这两种方法。也可以使用亲和色谱法，使用例如AVB琼脂糖凝胶亲和树脂(通用健康医疗集团生物科学部(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)实现最小纯化。使用AVB琼脂糖凝胶亲和树脂的AAV纯化方法描述于，例如，Wang等人，Mol Ther Methods Clin Dev.[分子疗法-方法与临床开发]，2：15040(2015)。纯化后，可将rAAV颗粒过滤并储存在≤-60℃。
在某些实施方案中，本公开提供了一种收获在细胞用两种不同的腺病毒共感染之后从工程化的rAAV包装细胞系产生的rAAV颗粒的方法。
在某些实施方案中，本公开提供了一种收获在感染由工程化的rAAV包装细胞系产生的rAAV生产细胞系后产生的rAAV颗粒的方法。
在某些实施方案中，本公开提供了一种收获在用辅助病毒感染工程化的rAAV生产细胞系后产生的rAAV颗粒的方法。
rAAV颗粒的定量
由于AAV感染在体外不会导致细胞病变效应，因此不能使用斑块测定来确定感染滴度，因此rAAV颗粒的定量是复杂的。然而，rAAV颗粒可使用多种方法定量，包括定量聚合酶链式反应(qPCR)(Clark等人，Hum.Gene Ther.[人类基因治疗]10，1031-1039(1999))、斑点杂交(Samulski等人，J.Virol.[病毒学杂志卷]63，3822-3828(1989))、以及通过高度纯化的载体制剂的光密度(Sommer等人，Mol.Ther.[分子治疗]7，122-128(2003))。可通过热循环仪(例如，iCycler iQ96孔模块式热循环仪(伯乐公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)中的实时定量的基因表达减少的聚合酶链反应(qPCR)(DRP-qPCR)对DNA酶抗性颗粒(DRP)进行定量。在DNA酶I(100U/ml；普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)存在的情况下，可将含有rAAV颗粒的样品在37℃下温育60分钟，然后在50℃进行蛋白酶K(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)消化(10U/ml)60分钟，然后在95℃变性30分钟。所使用的引物-探针组应特异于rAAV载体基因组的非天然部分，例如目的蛋白质的聚(A)序列。基于引物、探针和扩增序列的长度和组成，可以使用任何合适的循环参数组来扩增PCR产物。替代方案披露于例如Lock等人，Human GeneTherapy Methods[人基因疗法方法]25(2)：115-125(2014)。
也可以使用类似于上述的qPCR技术测量病毒基因组扩增。然而，为了定量生产细胞内的总基因组扩增，仅收集细胞内样品并且样品不经DNA酶I处理以测量包装的和未包装的病毒基因组。病毒基因组扩增可以在每个宿主细胞的基础上通过同时测量宿主细胞管家基因例如RNA酶P来计算。
可以使用TCID50(50％的组织培养感染剂量)测定来确定rAAV颗粒的感染性，例如在Zhen等人，Human Gene Therapy[人基因疗法]15：709-715(2004)中描述。在该测定中，rAAV载体颗粒被连续稀释并用于在96孔板中与AV颗粒一起共感染表达Rep/Cap的细胞系。感染后48小时，从感染孔和对照孔中提取总细胞DNA。然后使用qPCR，用转基因特异性探针和引物测量rAAV载体复制。TCID50感染性/毫升(TCID50/ml)使用
Figure BDA0003299768330000313
方程计算，使用10倍连续稀释的AAV阳性孔的比率。
治疗应用
由本文所述的工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系产生的rAAV可用于例如哺乳动物的基因治疗。由本文所述的工程化的细胞产生的rAAV可用于离体和/或体内基因治疗应用。由本文所述的工程化的细胞产生的rAAV可用于例如递送小分子(例如siRNA或sgRNA)、肽和/或蛋白质。
在一些实施方案中，由本文所述的工程化的细胞系产生的rAAV可用于治疗有需要的人类受试者的疾病或障碍。在某些实施方案中，由本文所述的工程化的细胞系产生的rAAV可与药学上可接受的载剂联合施用。
任何合适的方法或途径可用于施用由本文所述的工程化的包装细胞系和/或生产细胞系产生的rAAV或含有rAAV的组合物。施用途径包括例如全身、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其他肠胃外施用途径。在一些实施方案中，静脉内施用由工程化的包装细胞系和/或生产细胞系产生的rAAV或包含rAAV的组合物。
从前述实例将更充分地理解本公开的实践，所述实例在本文中仅出于说明性目的而给出，并且不应解释为以任何方式限制本公开。
实施例
实施例1：敲低方案的开发
通过敲低管家基因HPRT1，针对6孔和24孔形式优化并开发siRNA敲低实验。基于多种因素评估在24孔中进行的实验，所述因素例如接种密度、细胞培养条件(例如，二氧化碳百分比(CO2))、胎牛血清(FBS)百分比)、转染试剂(
Figure BDA0003299768330000311
RNAiMax)和siRNA之间的比率(“比率”)、温育时间和siRNA浓度。为HPRT1基因敲低设计的市售siRNA用于优化实验条件。根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0003299768330000312
RNAiMax，用不同浓度的siRNA转染HeLa生产细胞。通过实时PCR测定HPRT1表达的减少百分比。与基线对照相比，优化的24孔siRNA敲低方法能够将高表达基因HPRT1敲低80％以上。如图2A-D所示，细胞以1x105个细胞/孔接种、转染试剂和siRNA之间的比率为1：5、8nM siRNA显示出最高的敲低效率。图2A显示了使用的不同siRNA浓度/比率对HPRT1敲低百分比的影响。图2B显示不同siRNA浓度/比率对HPRT1表达百分比的影响。对于6孔方案优化，测试两种不同的siRNA浓度。针对图2A和2B中绘制的数据，测试5x104、8x104和1x 105的接种密度。图2C显示了不同siRNA浓度对HPRT1敲低百分比的影响。图2I)显示了不同浓度的siRNA对HPRT1表达百分比的影响。所有实验重复三次。
实施例2：RNA测序
在两种不同的HeLaS3生产细胞系中，在补充和非补充生产条件下运行八个三升生物反应器。在没有腺病毒5(Ad5)的情况下运行两个另外的生物反应器作为未感染对照。表3列出了关于生物反应器条件和产生水平的详细信息。
表3：生物反应器条件和产生水平。
Figure BDA0003299768330000321
Figure BDA0003299768330000331
表3中使用的缩写：添加一种或多种补充剂用(+)表示；缺少一种或多种补充剂用(-)表示；MOI-感染复数。
用Ad5感染后三十小时，取出样品用于RNA-Seq。将样品用PBS洗涤一次并将细胞沉淀储存在-80℃直至准备运输。通过本领域熟知的方法进行RNA提取和提取的RNA的cDNA合成。在测序之前，使用市售RNA-Seq文库制备试剂盒进行文库制备。使用市售Illumina测序平台进行RNA测序。使用本领域熟知的映射方法将产生的读段映射到人基因组、Ad5基因组和AAV2基因组。丢弃映射到Ad5基因组的任何读段。进行另一轮测序以富集映射到人基因组的读段。使用RNA测序产生的数据进行差异分析(参见表4)。
表4：差异分析
差异分析# 对照条件 实验条件
1 PCL1；无产生 PCL1*；产生(N.S.)
2 PCL1；无产生 PCL2；无产生
3 PCL1；无产生 PCL1；产生(S)
4 PCL1；产生(N.S.) PCL1；产生(S)
5 PCL1；产生(N.S.) PCL1；产生(S)
6 PCL1；产生(N.S.) PCL2；产生(N.S.)
7 PCL2；无产生 PCL2；产生(N.S.)
8 PCL2；无产生 PCL2；产生(S)
9 PCL2；无产生 PCL2；产生(S)
10 PCL1；产生(S) PCL2；产生(S)
11 PCL2；产生(S) PCL2；产生(S)
12 PCL1；产生(S) PCL1；产生(S)
13 PCL1；产生(S) PCL1；产生(S)
*PCL1-生产细胞系1；PCL2-生产细胞系2；无产生-未感染的对照细胞；产生(N.S.)-在未经补充条件下培养的Ad5感染细胞；产生(S)-在经补充条件下培养的Ad5感染细胞。
在该实例中，差异表达分析计算为实验条件与对照条件相比的mRNA水平的对数倍数变化(LogFC)。上调基因表达为正LogFC，下调基因表达为负LogFC。p值≤0.05的差异表达基因被认为是统计学上显著的。在每个差异分析中，成百上千个基因被显著上调或下调。建立过滤标准(参见例如图6)，并将其用于将数据集减少到可管理的基因数目以进行评估。如实例6所述，将基因集比对并移向过滤标准。
实施例3：通过RT-qPCR验证从RNA测序获得的结果
选择一小组基因用于验证RNA测序数据。按照本领域熟知的方法，使用RT-qPCR测定证实RNA-Seq结果。使用ΔΔCt方法分析数据。RT-qPCR独立地证实了在RNA-Seq数据中观察到的趋势。图3A-B显示了从PGA5(图3A)和SPANXN3(图3B)的RNA-Seq数据的生物信息学分析获得的基因表达的对数倍数变化值。X轴显示生产细胞系生长的条件(经补充(如表4所述的差异分析#5)相对于未经补充(如表4所述的差异分析#1))，y轴显示基因表达的对数倍数变化(LogFC)。将在未经补充的细胞培养基中培养的细胞中PGA5(图3A)和SPANXN3(图3B)表达的对数倍数变化相对于未感染细胞(未用辅助病毒感染的细胞)中相应的基因表达作图。将在经补充的细胞培养基中培养的细胞中PGA5(图3A)和SPANXN3(图3B)表达的对数倍数变化相对于在未经经补充的细胞培养基中培养的细胞中相应的基因表达作图。
在经补充和未经补充条件下生长的生产细胞系中的PGA5和SPANXN3基因表达也通过RT-qPCR使用本领域熟知的方法评估。图3C-D显示相对于未感染的细胞(未用辅助病毒感染的细胞)，在未经补充和经补充的细胞培养基中培养的细胞中PGA5(图3C)和SPANXN3(图3D)表达的RT-qPCR倍数变化值。图3A-D显示从qPCR和RNA测序获得的数据遵循相同的趋势。
实施例4：在生产细胞系的不同克隆中通过RT-qPCR验证从RNA测序获得的结果
通过对从HeLa S3生产细胞系的不同克隆中提取的RNA进行RT-qPCR实验进一步验证RNA测序结果。图4A-B显示了相对于未感染细胞(未用辅助病毒感染的细胞)，在未补充的细胞培养基和补充的细胞培养基中培养的生产细胞系克隆中PGA5(图4A)和SPANXN3(图4B)表达的倍数变化值，如RT-qPCR确定。21C5、3C6和2B6代表HeLa生产细胞系的不同克隆。图4C-D显示与在未经补充的细胞培养基中培养的克隆相比，在经补充的细胞培养基中培养的生产细胞系克隆21C5、3C6和2B6中PGA5(图4C)和SPANXN3(图4D)表达的相对倍数增加。这些结果进一步验证了实例3中描述的生物信息学RNA测序和RT-qPCR数据。
实施例5：基因敲低对rAAV滴度的影响
基于实例1中讨论的优化方案，通过单独敲低HeLa生产细胞系中的基因来进行敲低实验。为每个基因设计siRNA核苷酸序列(见表1)。
条件确定为1x105接种密度，8nM siRNA和siRNA：RNAiMAX比率1：5。基因表达降低后24小时诱导AAV产生，感染后72小时收获rAAV。测定每个样品的滴度并与非靶向错义siRNA对照进行比较。该实验独立进行三次，结果取平均值，并进行统计分析。图5A-5C分别显示生产细胞系1-3中单个基因的siRNA对绝对rAAV滴度的结果(GC/mL；GC＝基因组拷贝)。图5D-5F分别显示不同生产细胞系1-3中单个基因的siRNA对rAAV滴度的倍数增加。
如图5A-5F所示，生产细胞系中KCNN2、LINC00319、RGMA或SPANXN3表达的降低导致rAAV滴度比错义对照在统计学上明显高2-4倍。在三个生产细胞系中，这四种基因在被敲低时对滴度显示出统计学上相关的积极影响。这些结果表明，这些基因对于更持久的修饰如CRISPR/Cas9敲除是优异的靶标。
实施例6：基因过滤方法
对于过滤器1，将来自差异分析1和7(如表3所述)的基因进行比对。差异分析1和7确定在未经补充条件下加入腺病毒5后上调或下调的基因。分析1观察来自21C5生产细胞系(生产细胞系1，PCL1)的细胞。分析7观察来自2B6(生产细胞系2，PCL2)的细胞。此过滤器1后的基因列表鉴定了非细胞系特异性基因，并且这种比对提供了在两种生产细胞系之间共有的总共9149个基因。
对于过滤器2，将来自过滤器1的基因与差异分析5中存在的基因进行比对。分析5观察在经补充条件下与未经补充条件相比在来自21C5生产细胞系(PCL1)的细胞中上调和下调的基因。该差异分析的目的是确定在经补充条件下的产生相对于未经补充条件下的产生的影响。将来自过滤器1的基因集与差异分析5比对的目的是鉴定在改进的生产力条件下的基因，这些基因1)不是改进的生产条件的副产物2)可能与两种不同细胞系相关。比对后，374个基因向前移动。
对于过滤器3，只有具有>2LogFC±的大LogFc阈值的基因向前移动。这样做是为了确保向前移动的基因的高水平的上调/下调，并给出所选择的基因不是RNA-Seq的人为现象的置信度。过滤后，77个基因向前移动。
对于过滤器4，仅保留在差异分析1和差异分析5中都显示上调或在差异分析1和差异分析5中显示下调的基因。例如，77个基因中的一个必须显示差异分析1中的上调和差异分析5中的进一步上调或差异分析1中的下调和差异分析5中的进一步下调。该过滤器的目的是确保对于被评价的基因，与低滴度条件相比，高滴度条件对该特定基因的调节没有拮抗作用。过滤后，留下11个基因进行评价。显示示例性基因过滤方法的说明性流程图在图6中显示(使用缩写：LogFC＝对数倍数变化)。
表5提供了在针对生产力过滤重要基因的过程中来自每次比较的Log2FC数据。
表5：Log2FC数据
Figure BDA0003299768330000361
实施例7：KCNN2的基因敲除
在该实例中，对两个现有的高度优化的单克隆HeLa生产细胞系(PCL)-2H5和7B12-进行遗传修饰以敲除KCNN2基因(先前在本文所述的RNA-seq筛选中鉴定的)，其编码钙激活的钾通道蛋白SK2。
使用eGFP选择标记敲除2H5或7B12 HeLa细胞中的KCNN2。疑似的KCNN2敲除富集eGFP表达并接种在96孔板中。使细胞集落形成，收获基因组DNA，并进行PCR以扩增含有敲除的区域。对PCR产物进行桑格测序，并分析测序文件中是否存在插入/缺失。将具有高敲除可能性的2H5和7B12克隆扩大用于进一步测试。
将靠前的克隆转移到无血清的悬浮培养物中。通过24深孔rAAV产生来评估与亲本系相比的克隆生产力。将克隆以2x105个细胞/mL接种于3mL培养物中，并用Ad5以50的感染复数(MOI)感染。感染后四天，收获rAAV并评估滴度。将滴度倍数增加归一化为亲本对照。与对照样品相比，最佳克隆显示滴度增加1.5-2.7倍。2H5滴度为2.46x109-4.98x1010GC/mL(图7A)。当将滴度归一化为亲本对照时，观察到倍数增加，范围为1.2-2.7倍(图7B)。7B12滴度范围为4.33x108-1.88x1010 GC/mL(图7C)。当将滴度归一化为亲本对照时，观察到倍数增加，范围为1.5-2.6倍(图7D)。然后将具有最小1.5倍增加的克隆扩大到摇瓶培养物中，并接种到
Figure BDA0003299768330000371
15中进行高接种密度的经补充的rAAV产生。将细胞以1.5x106个细胞/mL接种并用Ad5以50的MOI感染。感染后四天收获rAAV并评估滴度。将滴度倍数增加归一化为亲本对照。与对照样品相比，最佳克隆显示滴度增加1.5-2.3倍。2H5滴度为1.5x1011-3.82x1011GC/mL(图8A)。当将滴度归一化为亲本对照时，观察到倍数增加，范围为1.3-2.3倍(图8B)。7B12滴度范围为2.62x1010-1.35x1011GC/mL(图8C)。当将滴度归一化为亲本对照时，观察到倍数增加，范围为1.2-1.5倍(图8D)。
这些数据表明，减少或消除AAV生产细胞中本文所述的一种或多种基因的表达(例如，通过基因敲除)可用于增加工程化细胞的rAAV的产生。
实施例8：多组合siRNA敲低
在该实例中，使用siRNA进行先前在本文所述的RNA-seq筛选中鉴定的基因的多组合敲低以确定同时靶向多个基因是否会对滴度产生累加效应。
使用实例5中所述方法的改进进行多组合敲低。简言之，使用8nM的每种siRNA并保持siRNA：RNAiMAX比率为1∶5来转染细胞。基因表达降低后24小时诱导AAV产生，感染后72小时收获rAAV。测定每个样品的滴度并与非靶向错义siRNA对照进行比较。
在该实施例中，KCNN2与先前描述的一组其他siRNA组合地被敲低。另外，RGMA和SPANXN3彼此组合地被敲低。在2H5中，与错义对照相比，组合敲低显示滴度增加4.6-11.4倍(图9A)。在7B12中，与错义对照相比，组合敲低显示滴度增加3.4-9.7倍(图9B)。每种组合显示滴度增加；然而，并非所有组合都比单独敲低KCNN2有所改进。KCNN2敲低导致2H5中增加5.3倍(图9A)和7B12中增加5.1倍(图9B)。
这些数据表明，通过直接靶向已建立的产生高rAAV滴度的单克隆PCL中的多个基因组区域，可以获得rAAV产生的额外增加。
编号的实施方案
1.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低的细胞。
2.根据实施方案1所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞。
3.根据实施方案1或2所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中使用核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义RNA寡核苷酸(ASO)使所述表达降低。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用包含选自序列SEQ ID NO：1-11中任一个的核苷酸序列的siRNA使所述表达降低。
5.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ATP5EP2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。
6.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中LINC00319的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ IDNO：33的核苷酸序列。
7.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中CYP3A7的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列。
8.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NOG的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。
9.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中SPANXN3的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。
10.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中MYRIP的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。
11.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中KCNN2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。
12.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NALCN-AS1的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ IDNO：39的核苷酸序列。
13.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中RGMA的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。
14.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中PGA5的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：41的序列。
15.根据实施方案4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ABCA10的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：11的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：42的序列。
16.根据实施方案3所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述核酸酶选自由锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白组成的组。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用CRISPR基因组编辑使所述表达降低。
18.根据实施方案17所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用指导RNA对使所述表达降低，其中每个指导RNA：
(a)包含选自SEQ ID NO：12-15的核苷酸序列的序列，和/或
(b)靶向选自SEQ ID NO：16-31的任一核苷酸序列的靶DNA序列。
19.根据实施方案18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子。
20.根据实施方案18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：14的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：15的序列的第二gRNA分子。
21.根据实施方案19或20所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中每个gRNA分子是2′O-甲基类似物，其在其5′和3′端的任一者或两者上的末端三个核苷酸中包含3′硫代磷酸酯核苷酸间键。
22.根据实施方案1至21中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中与对照亲本细胞相比，所述基因表达消除。
23.根据实施方案1至22中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系是人细胞系。
24.根据实施方案23所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述人细胞系是HeLa细胞系或人胚肾(HEK)293细胞系。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是rAAV包装细胞系。
26.根据实施方案1至24中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是rAAV生产细胞系。
27.根据实施方案26所述的细胞系，其中与从包含所述对照亲本细胞的细胞系产生的rAAV的滴度相比，rAAV的滴度增加约1.5至约7倍。
28.一种根据实施方案1至27中任一项所述的细胞系的裂解物。
29.一种来自根据实施方案1至27中任一项所述的细胞系的细胞培养物上清液。
30.一种产生生产细胞系的方法，所述方法包括将重组腺相关病毒(rAAV)载体递送至根据实施方案25所述的包装细胞系的细胞。
31.一种产生rAAV的方法，所述方法包括用辅助病毒感染由根据实施方案30所述的方法产生的生产细胞系的细胞。
32.一种产生rAAV的方法，所述方法包括用辅助病毒感染根据实施方案26所述的生产细胞系的细胞。
33.根据实施方案31或32所述的方法，其中所述rAAV从所述生产细胞系收获。
34.根据实施方案31至33中任一项所述的方法，其中与对照亲本细胞系相比，rAAV的产生得到增强。
35.一种鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因的方法，所述方法包括：
添加一种或多种增加细胞系中rAAV滴度的补充剂；
在经补充和未经补充的细胞系中测量跨转录组的全局基因表达；
获得在经补充和未经补充的细胞系之间差异表达的基因列表；以及
鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因。
36.根据实施方案35所述的方法，其中加入所述细胞系的一种或多种补充剂包括地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松、可的松、泼尼松、布地奈德或曲安西龙。
37.一种产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系以促进增加rAAV产生的方法，所述方法包括调节使用根据实施方案35所述的方法鉴定的一种或多种基因的表达。
38.根据实施方案35至37中任一项所述的方法，其中所述细胞系是rAAV包装细胞系。
39.根据实施方案35至37中任一项所述的方法，其中所述细胞系是rAAV生产细胞系。
40.根据实施方案39所述的方法，其中与由不调节相应的一种或多种基因的表达的rAAV生产细胞系产生的rAAV滴度相比，所述rAAV生产细胞系使rAAV滴度增加至少1.5倍。
41.根据实施方案37至40中任一项所述的方法，其中调节所述表达包括降低一种或多种基因的表达。
42.根据实施方案37至40中任一项所述的方法，其中调节所述表达包括消除一种或多种基因的表达。
43.根据实施方案30至42中任一项所述的方法，其中所述细胞系是人细胞系。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述人细胞系是HeLa细胞系或人胚肾(HEK)293细胞系。
45.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含经工程化以与相应未修饰的亲本细胞相比降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。
46.根据实施方案45所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性被无限期或永久性地降低。
47.根据实施方案46所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏或部分或完全基因缺失。
48.根据实施方案47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏。
49.根据实施方案47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少两种基因中包含基因破坏。
50.根据实施方案47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含部分或完全基因缺失。
51.根据实施方案47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少两种基因中包含部分或完全基因缺失。
52.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其中与相应的亲本细胞系相比，所述细胞系表现出由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达和/或活性降低。
通过引用并入
本文提及的每个专利文献和科学文章的全部披露内容出于所有目的通过引用并入。
等同物
在不脱离本披露的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明内容。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书来指示，并且在权利要求的等效含义和范围内的所有变化旨在包含在其中。
Figure IDA0003299768370000011
Figure IDA0003299768370000021
Figure IDA0003299768370000031
Figure IDA0003299768370000041
Figure IDA0003299768370000051
Figure IDA0003299768370000061
Figure IDA0003299768370000071
Figure IDA0003299768370000081
Figure IDA0003299768370000091
Figure IDA0003299768370000101
Figure IDA0003299768370000111
Figure IDA0003299768370000121
Figure IDA0003299768370000131
Figure IDA0003299768370000141
Figure IDA0003299768370000151
Figure IDA0003299768370000161
Figure IDA0003299768370000171
Figure IDA0003299768370000181
Figure IDA0003299768370000191
Figure IDA0003299768370000201
Figure IDA0003299768370000211
Figure IDA0003299768370000221
Figure IDA0003299768370000231
Figure IDA0003299768370000241
Figure IDA0003299768370000251
Figure IDA0003299768370000261
Figure IDA0003299768370000271
Figure IDA0003299768370000281
Figure IDA0003299768370000291
Figure IDA0003299768370000301
Figure IDA0003299768370000311
Figure IDA0003299768370000321
Figure IDA0003299768370000331
Figure IDA0003299768370000341
Figure IDA0003299768370000351
Figure IDA0003299768370000361
Figure IDA0003299768370000371
Figure IDA0003299768370000381
Figure IDA0003299768370000391
Figure IDA0003299768370000401
Figure IDA0003299768370000411
Figure IDA0003299768370000421
Figure IDA0003299768370000431
Figure IDA0003299768370000441
Figure IDA0003299768370000451
Figure IDA0003299768370000461
Figure IDA0003299768370000471
Figure IDA0003299768370000481
Figure IDA0003299768370000491
Figure IDA0003299768370000501
Figure IDA0003299768370000511
Figure IDA0003299768370000521
Figure IDA0003299768370000531
Figure IDA0003299768370000541
Figure IDA0003299768370000551
Figure IDA0003299768370000561
Figure IDA0003299768370000571
Figure IDA0003299768370000581
Figure IDA0003299768370000591
Figure IDA0003299768370000601
Figure IDA0003299768370000611
Figure IDA0003299768370000621
Figure IDA0003299768370000631

Claims (52)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1的表达降低的细胞。
2.根据权利要求1所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中使用核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义RNA寡核苷酸(ASO)使所述表达降低。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用包含选自序列SEQ ID NO：1-11中任一个的核苷酸序列的siRNA使所述表达降低。
5.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ATP5EP2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中LINC00319的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中CYP3A7的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列。
8.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NOG的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。
9.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中SPANXN3的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。
10.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中MYRIP的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。
11.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中KCNN2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。
12.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NALCN-AS1的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。
13.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中RGMA的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。
14.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中PGA5的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：41的序列。
15.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ABCA10的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：11的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：42的序列。
16.根据权利要求3所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述核酸酶选自由锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白组成的组。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用CRISPR基因组编辑使所述表达降低。
18.根据权利要求17所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用指导RNA对使所述表达降低，其中每个指导RNA：
(a)包含选自SEQ ID NO：12-15的核苷酸序列的序列，和/或
(b)靶向选自SEQ ID NO：16-31的任一核苷酸序列的靶DNA序列。
19.根据权利要求18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子。
20.根据权利要求18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：14的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：15的序列的第二gRNA分子。
21.根据权利要求19或20所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中每个gRNA分子是2′O-甲基类似物，其在其5′和3′端的任一者或两者上的末端三个核苷酸中包含3′硫代磷酸酯核苷酸间键。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中与对照亲本细胞相比，所述基因表达消除。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系是人细胞系。
24.根据权利要求23所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述人细胞系是HeLa细胞系或人胚肾(HEK)293细胞系。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是rAAV包装细胞系。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是rAAV生产细胞系。
27.根据权利要求26所述的细胞系，其中与从包含所述对照亲本细胞的细胞系产生的rAAV的滴度相比，rAAV的滴度增加约1.5至约7倍。
28.一种根据权利要求1至27中任一项所述的细胞系的裂解物。
29.一种来自根据权利要求1至27中任一项所述的细胞系的细胞培养物上清液。
30.一种产生生产细胞系的方法，所述方法包括将重组腺相关病毒(rAAV)载体递送至根据权利要求25所述的包装细胞系的细胞。
31.一种产生rAAV的方法，所述方法包括用辅助病毒感染由根据权利要求30所述的方法产生的生产细胞系的细胞。
32.一种产生rAAV的方法，所述方法包括用辅助病毒感染根据权利要求26所述的生产细胞系的细胞。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述rAAV从所述生产细胞系收获。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中与对照亲本细胞系相比，rAAV的产生得到增强。
35.一种鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因的方法，所述方法包括：
i.添加一种或多种增加细胞系中rAAV滴度的补充剂；
ii.在经补充和未经补充的细胞系中测量跨转录组的全局基因表达；
iii.获得在经补充和未经补充的细胞系之间差异表达的基因列表；以及
iv.鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因。
36.根据权利要求35所述的方法，其中加入所述细胞系的一种或多种补充剂包括地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松、可的松、泼尼松、布地奈德或曲安西龙。
37.一种产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系以促进增加rAAV产生的方法，所述方法包括调节使用根据权利要求35所述的方法鉴定的一种或多种基因的表达。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述细胞系是rAAV包装细胞系。
39.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述细胞系是rAAV生产细胞系。
40.根据权利要求39所述的方法，其中与由不调节相应的一种或多种基因的表达的rAAV生产细胞系产生的rAAV滴度相比，所述rAAV生产细胞系使rAAV滴度增加至少1.5倍。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中调节所述表达包括降低一种或多种基因的表达。
42.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中调节所述表达包括消除一种或多种基因的表达。
43.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中所述细胞系是人细胞系。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述人细胞系是HeLa细胞系或人胚肾(HEK)293细胞系。
45.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含经工程化以与相应未修饰的亲本细胞相比降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。
46.根据权利要求45所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1表达的基因产物的表达和/或活性被无限期或永久性地降低。
47.根据权利要求46所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏或部分或完全基因缺失。
48.根据权利要求47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含基因破坏。
49.根据权利要求47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少两种基因中包含基因破坏。
50.根据权利要求47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN-AS1中的至少一种中包含部分或完全基因缺失。
51.根据权利要求47所述的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系已被工程化以在选自ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少两种基因中包含部分或完全基因缺失。
52.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其中与相应的亲本细胞系相比，所述细胞系表现出由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN-AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达和/或活性降低。
CN202080028310.8A 2019-04-12 2020-04-09 工程化的生产细胞系及其制备和使用方法 Pending CN113966395A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962833548P 2019-04-12 2019-04-12
US62/833,548 2019-04-12
US201962839207P 2019-04-26 2019-04-26
US62/839,207 2019-04-26
US202062979483P 2020-02-21 2020-02-21
US62/979,483 2020-02-21
PCT/US2020/027489 WO2020210507A1 (en) 2019-04-12 2020-04-09 Engineered producer cell lines and methods of making and using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113966395A true CN113966395A (zh) 2022-01-21

Family

ID=70465550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080028310.8A Pending CN113966395A (zh) 2019-04-12 2020-04-09 工程化的生产细胞系及其制备和使用方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200325455A1 (zh)
EP (1) EP3953458A1 (zh)
JP (1) JP2022526646A (zh)
KR (1) KR20210152514A (zh)
CN (1) CN113966395A (zh)
AU (1) AU2020270960A1 (zh)
BR (1) BR112021020391A2 (zh)
CA (1) CA3136246A1 (zh)
CO (1) CO2021013699A2 (zh)
IL (1) IL287106A (zh)
MX (1) MX2021012489A (zh)
SG (1) SG11202110904PA (zh)
TW (1) TW202104593A (zh)
WO (1) WO2020210507A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023019168A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for treating a muscular dystrophy
WO2023077078A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Engineered cell lines for increased production of recombinant adeno-associated virus (raav)
WO2023172491A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Modified batch aav production systems and methods

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5387484A (en) 1992-07-07 1995-02-07 International Business Machines Corporation Two-sided mask for patterning of materials with electromagnetic radiation
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US5688676A (en) 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
AU764130B2 (en) 1998-10-27 2003-08-14 Crucell Holland B.V. Improved AAV vector production
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
AU2006304997B2 (en) 2005-10-20 2012-03-01 Uniqure Ip B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
GB201401707D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020270960A1 (en) 2021-11-04
MX2021012489A (es) 2021-11-12
KR20210152514A (ko) 2021-12-15
EP3953458A1 (en) 2022-02-16
CA3136246A1 (en) 2020-10-15
TW202104593A (zh) 2021-02-01
SG11202110904PA (en) 2021-10-28
JP2022526646A (ja) 2022-05-25
WO2020210507A1 (en) 2020-10-15
CO2021013699A2 (es) 2021-10-29
BR112021020391A2 (pt) 2022-02-08
IL287106A (en) 2021-12-01
US20200325455A1 (en) 2020-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3021949C (en) Modified aav constructs and uses thereof
JP6663859B2 (ja) ハンチントン病の治療化合物
US11427824B2 (en) Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophy
US20200325455A1 (en) Engineered producer cell lines and methods of making and using the same
JP2022505402A (ja) アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法
CN112639110A (zh) 用于基因递送以在细胞内持续存在的载体
US11492614B2 (en) Stem loop RNA mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria
JP2023503455A (ja) アデノ随伴ウイルスベクター変種
WO2018177244A1 (zh) shRNA表达框、携带其的多核苷酸序列及其应用
US11884926B2 (en) Campaign-ready series of recombinant adeno-associated virus (rAAV) complementing plasmids
US11834659B2 (en) Trans-activated functional RNA by strand displacement and uses thereof
WO2023077078A1 (en) Engineered cell lines for increased production of recombinant adeno-associated virus (raav)
TW202323524A (zh) Ｈｂｂ—調節組合物及方法
JP2023507174A (ja) Ｄｍｄ変異の修正のための方法及び組成物
JP2022545378A (ja) ＳＣＡ１の治療のための、導入遺伝子およびイントロン由来ｍｉＲＮＡを組み合わせた治療法
US20220106609A1 (en) Paravoviral vectors and methods of making and use thereof
Westmoreland Recombinant Adeno-associated Viral Vector Design Influences Genotoxic Potential
TW202345914A (zh) 用於dm-1肌強直性營養不良之靶向基因療法
KR20240055835A (ko) 치료용 단백질의 발현을 위한 간 특이적 발현 카세트, 벡터 및 이들의 용도
CN117980482A (zh) Rbm20突变的基因组编辑
TW202229559A (zh) 藉由肝導向基因替代療法治療pku之人類pah表現匣
TW202329988A (zh) 調節cftr之組合物及方法
WO2023212677A2 (en) Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
Kligman Establishing a stable cell-line for producing Adeno-Associated Virus using CRISPR-Cas9
CN116507731A (zh) 用aav-mir-sod1治疗肌萎缩性侧索硬化症(als)的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination