CN113874004A - 用于ttr基因编辑和治疗attr淀粉样变性的包括皮质类固醇的组合物和方法或其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在TTR基因内编辑，例如引入双链断裂的与施用皮质类固醇组合的组合物和方法。提供了用于治疗患有与运甲状腺素蛋白相关的淀粉样变性(ATTR)的受试者的组合物和方法，其中施用向导RNA和皮质类固醇。

Description

用于TTR基因编辑和治疗ATTR淀粉样变性的包括皮质类固醇 的组合物和方法或其用途
本专利申请要求于2019年3月28日提交的美国临时申请62/825,676和于2019年3月28日提交的美国临时申请62/825,637的优先权，所述美国临时申请中的每一个的内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且特此以全文引用的方式并入。创建于2020年3月20日的所述ASCII副本命名为2020-03-20_01155-0029-00PCT_ST25.txt并且大小为967KB。
运甲状腺素蛋白(TTR)是一种由TTR基因产生的通常用于将视黄醇和甲状腺素转运到全身的蛋白质。TTR主要在肝脏中合成，其中小部分在脉络丛和视网膜中产生。TTR通常作为可溶性四聚体蛋白在血液中循环。
TTR的可能破坏四聚体稳定性的致病变体可以由TTR基因的突变等位基因编码。突变型TTR可能导致错误折叠的TTR，所述错误折叠的TTR可能产生淀粉样蛋白(即错误折叠的TTR蛋白的聚集体)。在一些情况下，TTR的致病变体可能导致淀粉样变性或由淀粉样蛋白积聚引起的疾病。例如，错误折叠的TTR单体可以在组织，如周围神经、心脏和胃肠道内聚合成淀粉样原纤维。淀粉样斑块也可以包括已经沉积在错误折叠的TTR上的野生型TTR。
也已经在60岁或年龄更大的男性中观察到野生型TTR的错误折叠和沉积，并且所述错误折叠和沉积与心律问题、心力衰竭和腕管相关。
以TTR沉积为特征的淀粉样变性可以称为“ATTR”、“TTR相关淀粉样变性”、“TTR淀粉样变性”或“ATTR淀粉样变性”、“ATTR家族性淀粉样变性”(当与家族中的基因突变相关时)或“ATTRwt”或“野生型ATTR”(当由野生型TTR的错误折叠和沉积引起时)。
ATTR可以表现出广泛的症状，并且患有不同类别的ATTR的患者可能有不同的特性和预后。一些类别的ATTR包含家族性淀粉样多神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)和野生型TTR淀粉样变性(wt-TTR淀粉样变性)。FAP通常表现出感觉运动神经病变，而FAC和wt-TTR淀粉样变性通常表现出充血性心力衰竭。FAP和FAC通常与TTR基因中的基因突变相关，并且TTR基因中超过100个不同的突变与ATTR相关。相比之下，wt-TTR淀粉样变性与衰老相关，而与TTR中的基因突变无关。据估计，全世界大约有50,000名患者可能受到FAP和FAC的影响。
虽然TTR中超过100个突变与ATTR相关，但某些突变与神经病变和/或心肌病更密切地相关。例如，TTR的T60处的突变与心肌病和神经病变两者相关；V30处的突变与神经病变更相关；并且V122处的突变与心肌病更相关。
已经研究了一系列用于治疗ATTR的治疗方法，但是没有可以阻止疾病进展并提高生活质量的经批准的药物。虽然肝脏移植已经被研究用于治疗ATTR，但其使用正在下降，因为其涉及重大风险，并且在移植后疾病进展有时会继续。小分子稳定剂，如二氟尼柳和氯苯唑酸，似乎可减缓ATTR进展，但这些药剂并不能停止疾病进展。
目前也在研究使用小干扰RNA(siRNA)敲低、反义敲低或靶向淀粉样原纤维以进行破坏的单克隆抗体的方法，但是尽管短期抑制TTR表达的结果示出了令人鼓舞的初步数据，但需要可以产生持久TTR抑制的治疗。
外源RNA的施用可能引起在基因编辑和疗法的背景下不期望的先天免疫应答。因此，本公开提供了可以减少炎症或免疫应答的用于基因编辑的组合物和方法。例如，对接受向导RNA的受试者同时施用皮质类固醇可以减少此类炎症或免疫应答。
因此，提供了以下实施例。在一些实施例中，本发明提供了使用皮质类固醇与向导RNA以及任选地RNA引导的DNA结合剂(如CRISPR/Cas系统)的组合显著降低或敲除TTR基因的表达，由此显著降低或消除与ATTR相关的TTR蛋白的产生的组合物和方法。通过改变TTR基因来显著减少或消除与ATTR相关的TTR蛋白的产生可以是长期减少或消除。
发明内容
本文提供了以下实施例。
实施例1是一种治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此治疗ATTR。
实施例2是一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此降低TTR血清浓度。
实施例3是一种用于减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此减少淀粉样蛋白或淀粉样原纤维累积。
实施例4是一种包括向导RNA的组合物，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
实施例5是一种包括对向导RNA进行编码的载体的组合物，其中所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
实施例6是一种组合物，其包括：
(i)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列；以及
(ii)对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA，其中：
所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表1中列出的密码子；
所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
实施例7是一种组合物，其包括：
(i)对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列；以及
(ii)对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA，其中：
所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表1中列出的密码子；
所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
实施例8是根据实施例1到3或5到7中任一项所述的供使用的组合物或方法，其中所述方法包括通过输注施用所述组合物持续超过30分钟，例如超过60分钟或超过120分钟。
实施例9是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
实施例10是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的向导序列。
实施例11是根据实施例4到10中任一项所述的组合物，其用于在细胞或受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)。
实施例12是根据实施例4到11中任一项所述的组合物，其用于对细胞或受试者中的TTR基因进行修饰。
实施例13是根据实施例4到12中任一项所述的组合物，其用于治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)。
实施例14是根据实施例4到13中任一项所述的组合物，其用于降低受试者的TTR血清浓度。
实施例15是根据实施例4到14中任一项所述的组合物，其用于减少或预防受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维累积。
实施例16是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松、倍他米松、强的松、泼尼松龙、甲基强的松龙、可的松、氢化可的松、去炎松或英塞米松(ethamethasoneb)。
实施例17是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
实施例18是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在所述组合物之前施用所述皮质类固醇。
实施例19是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在所述组合物之后施用所述皮质类固醇。
实施例20是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中与所述组合物同时施用所述皮质类固醇。
实施例21是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。
实施例22是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之后约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。
实施例23是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或一周施用所述皮质类固醇。
实施例24是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之后5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或一周施用所述皮质类固醇。
实施例25是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前或之后施用至少两个剂量的所述皮质类固醇。
实施例26是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用至少两个剂量的所述皮质类固醇和至少两个剂量的所述组合物。
实施例27是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中以0.75mg到20mg的剂量向所述受试者施用所述皮质类固醇。
实施例28是根据实施例27所述的方法或供使用的组合物，其中以约0.01-0.4mg/kg的剂量，如0.1-0.35mg/kg或0.25-0.35mg/kg向所述受试者施用所述皮质类固醇。
实施例29是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇经肠胃外或通过注射施用于所述受试者。
实施例30是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇通过静脉内注射施用于所述受试者。
实施例31是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇通过肌肉内或通过输注施用于所述受试者。
实施例32是根据实施例1到31中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中向所述受试者口服施用所述皮质类固醇。
实施例33是根据实施例32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在通过静脉内注射向所述受试者施用所述组合物之前向所述受试者口服施用所述皮质类固醇。
实施例34是根据实施例32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在通过静脉内注射向所述受试者施用所述组合物之后向所述受试者口服施用所述皮质类固醇。
实施例35是根据实施例32和33中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前6到12小时，以20mg的量向所述受试者口服施用所述地塞米松。
实施例36是根据实施例32、33或35中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前6到12小时，以20mg的量向所述受试者静脉内施用所述地塞米松持续30分钟。
实施例37是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟或345-375分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约1.5-6小时。
实施例38是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟或约240分钟。
实施例39是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约120分钟。
实施例40是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
实施例41是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法进一步包括施用输注预防，其中所述输注预防包括对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种，任选地其中所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的所述一种或多种与所述皮质类固醇同时施用和/或在所述组合物之前施用。
实施例42是根据实施例41所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂中的每一种。
实施例42a是根据实施例41或42所述的方法或供使用的组合物，其中所述H1阻断剂和/或所述H2阻断剂是口服施用的。
实施例42b是根据实施例41到42a中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述输注预防包括静脉内皮质类固醇(如地塞米松8-12mg或10mg或等效物)和对乙酰氨基酚(如口服对乙酰氨基酚500mg)。
实施例42c是根据实施例41到42b中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用含向导RNA的组合物，例如LNP组合物之前，所述输注预防作为所需的术前用药施用。
实施例43是根据实施例41到42c中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述H1阻断剂是苯海拉明。
实施例44是根据实施例41到43中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述H2阻断剂是雷尼替丁。
实施例45是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时施用第二剂量的所述皮质类固醇。
实施例46是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前，口服施用第一剂量的所述皮质类固醇并且静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
实施例47是根据实施例45和46中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法进一步包括施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种，任选地其中所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的所述一种或多种与所述第二剂量的所述皮质类固醇同时施用。
实施例48是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
实施例49是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时与施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂同时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
实施例50是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约8-24小时以约6-10mg的量向所述受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约1-2小时与口服施用对乙酰氨基酚和静脉内施用H1阻断剂和H2阻断剂同时以约8-12mg的量向所述受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，任选地其中所述H1阻断剂是苯海拉明并且所述H2阻断剂是雷尼替丁和/或任选地其中所述受试者是人。
实施例51是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约8-24小时以8mg的量向所述受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约1-2小时与口服施用对乙酰氨基酚和静脉内施用H1阻断剂和H2阻断剂同时以10mg的量向所述受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，任选地其中所述H1阻断剂是苯海拉明并且所述H2阻断剂是雷尼替丁。
实施例52是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物以3mg/kg的量通过输注施用持续约1.5-6小时；在输注所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇；并且在输注所述组合物之前约1-2小时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
实施例53是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇提高了包括所述向导RNA的所述组合物的耐受性。
实施例54是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇降低了响应于所述包括所述向导RNA的组合物的炎症、恶心、呕吐、血液中ALT浓度升高、体温过高和/或痛觉过敏中的一种或多种的发生率或严重程度。
实施例55是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇减少或抑制响应于所述包括所述向导RNA的组合物的一种或多种干扰素和/或炎性细胞因子的产生或活性。
实施例56是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物降低血清TTR水平。
实施例57是根据实施例56所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了至少50％。
实施例58是根据实施例56所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-98％、98-99％或99-100％。
实施例59是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物导致TTR基因的编辑。
实施例60是根据实施例59所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑被计算为被编辑的群体的百分比(编辑百分比)。
实施例61是根据实施例60所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30与99％之间。
实施例62是根据实施例61所述的方法或供使用的组合物，所述编辑百分比介于群体的30％与35％之间、35与40％之间、40与45％之间、45与50％之间、50与55％之间、55与60％之间、60与65％之间、65与70％之间、70与75％之间、75与80％之间、80与85％之间、85与90％之间、90与95％之间或95与99％之间。
实施例63是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少至少一个组织中的淀粉样沉积。
实施例64是根据实施例63所述的方法或供使用的组合物，其中所述至少一个组织包括以下中的一个或多个：胃、结肠、坐骨神经或背根神经节。
实施例65是根据实施例63或64中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物后8周测量淀粉样沉积。
实施例66是根据实施例63到65中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中将淀粉样沉积与阴性对照或在施用所述组合物之前测量的水平进行比较。
实施例67是根据实施例63到66中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在活检样品中和/或通过免疫染色测量淀粉样沉积。
实施例68是根据实施例63到67中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在阴性对照中所见的淀粉样沉积。
实施例69是根据实施例63到68中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在施用所述组合物之前所见的淀粉样沉积。
实施例70是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少两次。
实施例71是根据实施例70所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少三次。
实施例72是根据实施例70所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少四次。
实施例73是根据实施例70所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至多五次、六次、七次、八次、九次或十次。
实施例74是根据实施例70到73中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天的间隔发生。
实施例75是根据实施例70到73中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔发生。
实施例76是根据实施例70到73中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月的间隔发生。
实施例77是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导序列选自SEQ ID NO:5-82。
实施例78是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA至少部分地与存在于人TTR基因中的靶序列互补。
实施例79是根据实施例78所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因的外显子1、2、3、或4中。
实施例80是根据实施例78所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因中的外显子1中。
实施例81是根据实施例78所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因中的外显子2中。
实施例82是根据实施例78所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因中的外显子3中。
实施例83是根据实施例78所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因中的外显子4中。
实施例84是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述向导序列与TTR的正链中的靶序列互补。
实施例85是根据实施例1到83中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导序列与TTR的负链中的靶序列互补。
实施例86是根据实施例1到83中任一项所述的方法或组合物，其中第一向导序列与TTR基因的正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物进一步包括与TTR基因的负链中的第二靶序列互补的第二向导序列。
实施例87是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是双向导(dgRNA)。
实施例88是根据实施例1到86中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是单向导(sgRNA)。
实施例89是根据实施例88所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:5-82的向导序列以及SEQ ID NO:3的核苷酸21-100中的任一个。
实施例90是根据实施例88和89中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID NO:87-124的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。
实施例91是根据实施例88所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQ IDNO:87-124的序列。
实施例92是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括至少一个修饰。
实施例93是根据实施例92所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。
实施例94是根据实施例92或93所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
实施例95是根据实施例92到94中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
实施例96是根据实施例92到95中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含5'端修饰、3'端修饰或5'和3'端修饰。
实施例97是根据实施例92到96中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例98是根据实施例92到97中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例99是根据实施例92到98中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含前四个核苷酸之间的PS键。
实施例100是根据实施例92到99中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含后四个核苷酸之间的PS键。
实施例101是根据实施例92到100中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例102是根据实施例92到101中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例103是根据实施例92到102中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括SEQ ID NO:3的经修饰的核苷酸。
实施例104是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
实施例105是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
实施例106是根据实施例105所述的方法或组合物，其中所述LNP包括可电离脂质。
实施例107是根据实施例106所述的方法或组合物，其中所述LNP包括可生物降解的可电离脂质。
实施例108是根据实施例105到017中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括胺脂质，例如CCD脂质。
实施例109是根据实施例105到108中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质。
实施例110是根据实施例105到109中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质，任选地其中：
(i)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(ii)所述LNP包括约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约27-39.5mol％的辅助脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述LNP组合物的N/P比率为约5-7(例如，约6)；
(iii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(iv)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(v)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(vi)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约0-10mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(vii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；小于约1mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(viii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10，并且其中所述LNP组合物基本上不含或不含中性磷脂；或者
(ix)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-7。
实施例111是根据实施例105到110中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括中性脂质。
实施例112是根据实施例105到111中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质以约50mol％存在。
实施例113是根据实施例105到112中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质以约9mol％存在。
实施例114是根据实施例105到113中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质以约3mol％存在。
实施例115是根据实施例105到114中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质以约38mol％存在。
实施例116是根据实施例105到115中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例117是根据实施例105到116中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例118是根据实施例105到117中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A。
实施例119是根据实施例105到118中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
实施例120是根据实施例105到119中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
实施例121是根据实施例105到120中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例122是根据实施例105到121中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例123是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括RNA引导的DNA结合剂。
实施例124是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷酸。
实施例125是根据实施例124所述的方法或组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
实施例126是根据实施例123到125中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶。
实施例127是根据实施例123到126中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
实施例128是根据实施例123到127中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9。
实施例129是根据实施例128所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶。
实施例130是根据实施例124到129中任一项所述的方法或组合物，其中所述多核苷酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表4中列出的密码子；
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％。
实施例131是根据实施例130所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框在其序列的至少前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性。
实施例132是根据实施例130或131所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例133是根据实施例130到132中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表4中列出的密码子。
实施例134是根据实施例130到133中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％。
实施例135是根据实施例130到134中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％。
实施例136是根据实施例124到135中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR。
实施例137是根据实施例124到136中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。
实施例138是根据实施例124到137中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸包括来自相同来源的5'UTR和3'UTR。
实施例139是根据实施例124到138中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸包括选自帽0、帽1和帽2的5'帽。
实施例140是根据实施例124到139中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例141是根据实施例125到140中任一项所述的组合物或方法，其中所述mRNA中至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例142是根据实施例141所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是以下中的一种或多种：N1-甲基假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷。
实施例143是根据实施例141所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷中的一者或两者。
实施例144是根据实施例141所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷。
实施例145是根据实施例141所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。
实施例146是根据实施例141到145中任一项所述的组合物或方法，其中15％到45％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例147是根据实施例141到146中任一项所述的组合物或方法，其中至少20％或至少30％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例148是根据实施例147所述的组合物或方法，其中至少80％或至少90％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例149是根据实施例147所述的组合物或方法，其中100％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例150是根据实施例123到149中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是经修饰的。
实施例151是根据实施例150所述的方法或组合物，其中经修饰的RNA引导的DNA结合剂包括核定位信号(NLS)。
实施例152是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。
实施例153是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维。
实施例154是根据实施例153所述的方法或供使用的组合物，其中所述淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在神经、心脏或胃肠道中。
实施例155是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中非同源末端接合(NHEJ)导致在修复TTR基因中的DSB期间发生突变。
实施例156是根据实施例155所述的方法或供使用的组合物，其中NHEJ导致在修复TTR基因中的DSB期间缺失或插入核苷酸。
实施例157是根据实施例156所述的方法或供使用的组合物，其中所述核苷酸的缺失或插入在TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例158是根据实施例155或156所述的方法或供使用的组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例159是根据实施例158所述的方法或供使用的组合物，其中在50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例160是根据实施例156到159中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的至少50倍或更多倍。
实施例161是根据实施例160所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的50倍到150倍、150倍到500倍、500倍到1500倍、1500倍到5000倍、5000倍到15000倍、15000倍到30000倍或30000倍到60000倍。
实施例162是根据实施例156到161中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中小于或等于3、2、1或0个脱靶位点处，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例163是根据实施例162所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中的多个脱靶位点处，在所述原代人肝细胞中的所述脱靶位点的数量小于在Cas9过表达细胞中发生核苷酸的缺失或插入的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例164是根据实施例163所述的方法或供使用的组合物，其中所述Cas9过表达细胞是稳定表达Cas9的HEK293细胞。
实施例165是根据实施例162到164中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过分析来自用Cas9 mRNA和向导RNA体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例166是根据实施例162到164中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过寡核苷酸插入测定确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，所述寡核苷酸插入测定包括分析来自用Cas9 mRNA、向导RNA以及供体寡核苷酸体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例167是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA的序列是：
a)SEQ ID NO:92或104；
b)SEQ ID NO:87、89、96或113；
c)SEQ ID NO:100、102、106、111或112；或者
d)SEQ ID NO:88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109，
任选地其中所述向导RNA不在原代人肝细胞基因组中的蛋白质编码区中发生的脱靶位点处产生插入缺失。
实施例168是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述组合物降低受试者的TTR的水平。
实施例169是根据实施例168所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低至少50％。
实施例170是根据实施例169所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％。
实施例171是根据实施例168或169所述的方法或供使用的组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量所述TTR的水平。
实施例172是根据实施例168或169所述的方法或供使用的组合物，其中在肝脏、脉络丛和/或视网膜中测量所述TTR的水平。
实施例173是根据实施例168到172中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所述TTR的水平。
实施例174是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR。
实施例175是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人。
实施例176是根据实施例174或175所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTRwt。
实施例177是根据实施例174或175所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有遗传性ATTR。
实施例178是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR家族史。
实施例179是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样多神经病。
实施例180是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的神经症状。
实施例181是根据实施例1到179中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样心肌病。
实施例182是根据实施例1到179或181中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的心脏症状。
实施例183是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V30突变的TTR。
实施例184是根据实施例183所述的方法或供使用的组合物，其中所述V30突变是V30A、V30G、V30L或V30M。
实施例185是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有T60突变的TTR。
实施例186是根据实施例185所述的方法或供使用的组合物，其中所述T60突变是T60A。
实施例187是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V122突变的TTR。
实施例188是根据实施例187所述的方法或供使用的组合物，其中所述V122突变是V122A、V122I或V122(-)。
实施例189是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达野生型TTR。
实施例190是根据实施例1到182或189中任一项所述的方法或供使用的组合物其中所述受试者不表达具有V30、T60或V122突变的TTR。
实施例191是根据实施例1到182或189到190中任一项所述的方法或供使用的组合物其中所述受试者不表达具有病理性突变的TTR。
实施例192是根据实施例190到192中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者对野生型TTR是纯合的。
实施例193是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用后，所述受试者的感觉运动神经病变的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例194是根据实施例193所述的方法或供使用的组合物，其中使用肌电图、神经传导测试或患者报告的结果来测量感觉神经病变变化的改善、稳定或减缓。
实施例195是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者的充血性心力衰竭的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例196是根据实施例195所述的方法或供使用的组合物，其中使用心脏生物标志物测试、肺功能测试、胸部X射线或心电图测量充血性心力衰竭变化的改善、稳定或减缓。
实施例197是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过病毒载体施用。
实施例198是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过脂质纳米颗粒施用。
实施例199是根据前述实施例中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物或调配物之前测试所述受试者的TTR基因中的特异性突变。
实施例200是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:5。
实施例201是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:6。
实施例202是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:7。
实施例203是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:8。
实施例204是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:9。
实施例205是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:10。
实施例206是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:11。
实施例207是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:12。
实施例208是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:13。
实施例209是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:14。
实施例210是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:15。
实施例211是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:16。
实施例212是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:17。
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实施例268是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:73。
实施例269是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:74。
实施例270是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:75。
实施例271是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:76。
实施例272是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:77。
实施例273是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:78。
实施例274是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:79。
实施例275是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:80。
实施例276是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:81。
实施例277是根据实施例1到199中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-82的序列是SEQ ID NO:82。
实施例278是一种根据前述实施例中任一项所述的组合物或调配物的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。
附图说明
图1示出了表1中所提供的向导序列靶向的TTR基因区的染色体18的示意图。
图2示出了靶向TTR的某些双向导RNA的HEK293_Cas9细胞中的脱靶分析。在靶位点由每个被测双向导RNA的实心正方形指定，而实心圆圈代表潜在的脱靶位点。
图3示出了靶向TTR的某些单向导RNA的HEK_Cas9细胞中的脱靶分析。在靶位点由每个被测单向导RNA的实心正方形指定，而空心圆圈代表潜在的脱靶位点。
图4示出了脂质纳米颗粒调配的人TTR特异性sgRNA对原代人肝细胞的剂量反应曲线。
图5示出了脂质纳米颗粒调配的人TTR特异性sgRNA对原代食蟹猴肝细胞的剂量反应曲线。
图6示出了脂质纳米颗粒调配的食蟹猴TTR特异性sgRNA对原代食蟹猴肝细胞的剂量反应曲线。
图7示出了在HUH7细胞序列中施用X轴上提供的向导后TTR的编辑百分比(编辑％)和分泌TTR的减少。使所述值相对于α-1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的量归一化。
图8示出了在HUH7细胞中施用(表1中列出的)靶向向导后细胞内TTR的蛋白质印迹分析。
图9示出了向具有人源化(G481-G499)或鼠类(G282)TTR的小鼠施用LNP调配物后观察到的TTR的肝脏编辑百分比。注意：图中省略了每个向导ID中的前三个‘0’，例如“G481”是表2和3中的“G000481”。
图10A-B示出了在水平轴上以μg/ml(图10A)或相对于TSS对照的百分比(图10B)指示的给药方案后观察到的血清TTR水平。贯穿全文，MPK＝mg/kg。
图11A-B示出了在水平轴上指示的1mg/kg剂量(图11A)或0.5mg/kg剂量(图11B)的给药方案后观察到的血清TTR水平。单次2mg/kg剂量的数据作为右列包含在两个小图中。
图12A-B示出了在水平轴上指示的1mg/kg剂量(图12A)或0.5mg/kg剂量(图12B)的给药方案后观察到的肝脏编辑百分比。图12C示出了在0.5、1或2mg/kg的单次剂量之后观察到的肝脏编辑百分比。
图13示出了在将LNP调配物施用于关于TTR基因人源化的小鼠之后观察到的肝脏编辑百分比。注意：图中省略了每个向导ID中的前三个‘0’，例如“G481”是表2和3中的“G000481”。
图14A-B示出在将LNP调配物施用于关于TTR基因人源化的小鼠后肝脏编辑(图14A)与血清人TTR水平(图14B)之间存在相关性。注意：图中省略了每个向导ID中的前三个‘0’，例如“G481”是表2和3中的“G000481”。
图15A-B示出在施用包括向导G502的LNP调配物后野生型小鼠中存在关于编辑百分比(图15A)和血清TTR水平(图15B)的剂量反应，所述向导G502在小鼠与食蟹猴之间是交叉同源的。
图16示出了脂质纳米颗粒调配的人TTR特异性sgRNA对原代食蟹猴肝细胞的剂量反应曲线。
图17示出了脂质纳米颗粒调配的食蟹猴TTR特异性sgRNA对原代人肝细胞的剂量反应曲线。
图18示出了脂质纳米颗粒调配的食蟹猴TTR特异性sgRNA对原代食蟹猴肝细胞的剂量反应曲线。
图19A-D示出了以指定比率和量给药LNP调配物后的血清TTR(TSS％；图19A和19C)以及编辑结果(图19B和19D)。
图20示出了对靶向TTR的原代人肝细胞(PHH)中某些单向导RNA的脱靶分析。在图中，实心正方形表示对在靶切割位点的标识，而空心圆圈表示对潜在脱靶位点的标识。
图21A-B示出了在施用脂质纳米颗粒调配的G000480之后原代人肝细胞中的在靶位点(ONT，图21A)和两个脱靶位点(OT2和OT4)的编辑百分比。图21B是图21A中的OT2、OT4和阴性对照(Neg Cont)数据的重新缩放版本。
图22A-B示出了在施用脂质纳米颗粒调配的G000486之后原代人肝细胞中的在靶位点(ONT，图22A)和脱靶位点(OT4)的编辑百分比。图22B是图22A中的OT4和阴性对照(NegCont)数据的重新缩放版本。
图23A-B示出了TTR基因座处的编辑百分比(图23A)以及插入和缺失事件的数量(图23B)。图23A示出了对照和(用脂质纳米颗粒调配的TTR特异性sgRNA给药的)处理组中的TTR基因座处的编辑百分比。图23B示出了当在图23A的处理组中观察到编辑时TTR基因座处的插入和缺失事件的数量。
图24A-B分别示出了对照和(用脂质纳米颗粒调配的TTR特异性sgRNA给药的)处理组的循环血清(图24A)和脑脊液(CSF)(图24B)中的以μg/mL为单位的TTR水平。处理导致血清中的TTR水平敲低>99％。
图25A-D示出了对来自对照和(用脂质纳米颗粒调配的TTR特异性sgRNA给药的)处理小鼠的胃(图25A)、结肠(图25B)、坐骨神经(图25C)和背根神经节(DRG)(图25D)中的TTR进行染色的免疫组织化学图像。在右侧，条形图示出了处理后8周，经处理小鼠中TTR染色的减少，如通过每种组织类型的占据面积百分比测量的。
图26A-C分别示出了来自以一系列剂量的具有向导G000480、G000488、G000489和G000502并且含有与向导的重量比为1:1的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的LNP调配物给药的人源化TTR小鼠的肝脏TTR编辑(图26A)和血清TTR结果(以μg/mL为单位(图26B)以及以相对于TSS处理的对照的百分比形式(图26C))。
图27A-C分别示出了来自以一系列剂量的具有向导G000481、G000482、G000486和G000499并且含有与向导的重量比为1:1的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的LNP调配物给药的人源化TTR小鼠的肝脏TTR编辑(图27A)和血清TTR结果(以μg/mL为单位(图27B))以及以相对于TSS处理的对照的百分比形式(图27C))。
图28A-C分别示出了来自以一系列剂量的具有向导G000480、G000481、G000486、G000499和G000502并且含有与向导的重量比为1:2的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的LNP调配物给药的人源化TTR小鼠的肝脏TTR编辑(图28A)和血清TTR结果(以μg/mL为单位(图28B))以及以相对于TSS处理的对照的百分比形式(图28C)。
图29示出了与阴性(未经处理的)对照相比，在用包括Cas9 mRNA和所指定的gRNA的LNP处理后原代人肝细胞(PHH)中的TTR mRNA的相对表达。
图30示出了与阴性(未经处理的)对照相比，在用包括Cas9 mRNA和所指定的gRNA的LNP处理后原代人肝细胞(PHH)中的TTR mRNA的相对表达。
图31A-C示出了将30'施用LNP与长期给药方案进行比较的非人类灵长类动物体内研究中的血清TTR水平(图31A)、肝脏TTR编辑(图31B)和循环ALT水平(图31C)。
具体实施方式
现在将详细参照本发明的某些实施例，在附图中展示所述实施例的实例。尽管将结合所展示的实施例描述本发明，但应当理解，其并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明旨在覆盖可以包含在由所附权利要求书限定的本发明内的所有替代方案、修改和等效物。
在详细描述本发明的教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a/an)”以及“所述(the)”均包含复数指代物。因此，例如，对“缀合物(conjugate)”的引用包含多个缀合物，并且对“单元(cell)”的引用包含多个单元等。
数值范围包含定义所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测得值和可测量值被理解为近似值。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应当理解，上述的一般描述和详细描述两者均仅是示例性和解释性的，并且不限制本教导。
除非说明书中特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施例也被考虑是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施例也被认为是“包括所述组分”或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“包括所述组分”(这种可互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。术语“或”以开放性意义使用，也就是说，相当于“和/或”，除非上下文另外明确指示。
本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制期望的主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中限定的任何术语或本说明书的任何其它明确的内容矛盾，则以本说明书为准。虽然结合各个实施例对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于这种实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。
I.定义
除非另有说明，否则如本文中所使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
本文中使用“多核苷酸”和“核酸”指代包括核苷或核苷类似物的多聚体化合物，所述核苷或核苷类似物具有沿骨架连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，所述骨架包含常规RNA、DNA、混合的RNA-DNA和其类似物的聚合物。核酸“骨架”可以由多种连接构成，包含以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯连接、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT号：WO 95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖，或具有取代(例如，2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)，其类似物(例如，经修饰的尿苷，如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等等)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂-嘧啶、在5或6位置具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位置具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利第5,378,825号和PCT第WO 93/13121号)。有关一般讨论，参见《核酸的生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)》5-36,Adams等人,编辑,第11版,1992。核酸可以包含一个或多个“无碱基”残基，其中骨架不包含聚合物的一个或多个位置的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包括常规的RNA或DNA糖、碱基和键，或可以包含常规的组分和取代(例如，具有2'甲氧基键的常规碱基，或含有常规碱基和一种或多种碱基类似物两者的聚合物)。核酸包含“锁定核酸”(LNA)，一种含有一种或多种LNA核苷酸单体的类似物，其中二环呋喃糖单元被锁定在模拟糖构型的RNA中，这增强了对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,《生物化学(Biochemistry)》43(42):13233-41)。RNA和DNA具有不同的糖部分并且可以通过其尿嘧啶或类似物在RNA中的存在以及其胸腺嘧啶或类似物在DNA中的存在进行区分。
如本文所使用的，“多肽”是指包括可以采用三维构象的氨基酸残基的多聚体化合物。多肽包含但不限于酶、酶前体蛋白、调节蛋白、结构蛋白、受体、核酸结合蛋白、抗体等。多肽可以但不一定包括翻译后修饰、非天然氨基酸、辅基等。
“向导RNA”、“gRNA”和“向导”在本文中可互换使用以指代crRNA(也被称为CRISPRRNA)或crRNA和trRNA的组合(也被称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可以作为单个RNA分子(单向导RNA、sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双向导RNA、dgRNA)中缔合。“向导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可以是天然存在的序列，或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。向导RNA可以包含如本文所述的经修饰的RNA。
如本文所使用的，“向导序列”是指在向导RNA内与靶序列互补并且用作将向导RNA引导到靶序列以通过RNA引导的DNA结合剂进行结合或修饰(例如，切割)的序列。“向导序列”也可以被称为“靶向序列”或“间隔序列”。向导序列的长度可以是20个碱基对，例如，在酿脓链球菌(即Spy Cas9)和相关的Cas9同源物/直系同源物的情况下。较短或较长的序列还可以用作向导，例如，长度为15个、16个、17个、18个、19个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。例如，在一些实施例中，向导序列包括选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施例中，靶序列例如在基因中或在染色体上，并且与向导序列互补。在一些实施例中，向导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可以为约75％、80％、85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。例如，在一些实施例中，向导序列包括与选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施例中，向导序列和靶区可以100％互补或相同。在其它实施例中，向导序列和靶区可以含有至少一个错配。例如，向导序列和靶序列可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17个、18个、19个、20个或更多个碱基对。在一些实施例中，向导序列和靶区可以含有1-4个错配，其中向导序列包括至少17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，向导序列和靶区可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中向导序列包括20个核苷酸。
Cas蛋白的靶序列包含基因组DNA的正链和负链两者(也就是说，给定的序列和序列的反向互补物)，因为Cas蛋白的核酸底物是双链核酸。因此，在向导序列被称为“与靶序列互补”的情况下，应当理解，向导序列可以将向导RNA引导为与靶序列的反向互补物结合。因此，在一些实施例中，在向导序列结合靶序列的反向互补物的情况下，除了向导序列中的U代替T之外，向导序列与靶序列的某些核苷酸(例如，不包含PAM的靶序列)相同。
如本文所使用的，“RNA引导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并取决于RNA的序列。示例性RNA引导的DNA结合剂包含Cas切割酶/切口酶及其失活形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所使用的，“Cas核酸酶”，也称为“Cas蛋白”涵盖Cas切割酶、Cas切口酶和dCasDNA结合剂。Cas切割酶/切口酶和dCas DNA结合剂包含III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和第2类Cas核酸酶。如本文所使用的，“第2类Cas核酸酶”是具有RNA引导的DNA结合活性的单链多肽，如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。第2类Cas核酸酶包含第2类Cas切割酶和第2类Cas切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，所述切割酶/切口酶进一步具有RNA引导的DNA切割酶/切口酶活性，以及第2类dCas DNA结合剂，其中切割酶/切口酶活性失活。第2类Cas核酸酶包含例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白和其修饰。Cpf1蛋白，Zetsche等人,《细胞(Cell)》,163:1-13(2015)，与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以全文引用的方式并入。参见例如Zetsche,表S1和S3。“Cas9”涵盖Spy Cas9、本文列出的Cas9变体以及其等效物。参见例如Makarova等人,《自然综述：微生物学(Nat RevMicrobiol)》,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,《分子细胞(Molecular Cell)》,60:385-397(2015)。
“经修饰的尿苷”在本文中用于指具有与尿苷相同的氢键受体以及与尿苷的一个或多个结构差异的除胸苷外的核苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如，烷氧基，如甲氧基)代替质子的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的假尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如，烷基，如甲基)代替质子的假尿苷，例如N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的尿苷、假尿苷或经取代的假尿苷中的任何一种。
如本文所使用的，“尿苷位置”是指多核苷酸中被尿苷或经修饰的尿苷占据的位置。因此，例如，其中“100％的尿苷位置是经修饰的尿苷”的多核苷酸在每个位置处都含有经修饰的尿苷，所述经修饰的尿苷将是相同序列的常规RNA中的尿苷(其中所有碱基均为标准A、U、C或G碱基)。除非另有说明，本公开中列出或随附的序列表或序列的多核苷酸序列中的U可以是尿苷或经修饰的尿苷。
如本文所使用的，如果第一序列与第二序列的比对表明第二序列的X％或更多的位置整体上与第一序列匹配，则第一序列被认为“包括与第二序列具有至少X％同一性的序列”。例如，序列AAGA包括与序列AAG具有100％同一性的序列，因为比对将给出100％同一性，因为存在与第二序列的所有三个位置的匹配。只要相关核苷酸(如胸苷、尿苷或经修饰的尿苷)具有相同的互补物(例如，胸苷、尿苷或经修饰的尿苷的全部的腺苷；另一个实例是胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者均具有鸟苷或经修饰的鸟苷作为互补物)，RNA与DNA之间的差异(通常是尿苷代替胸苷或反之亦然)以及如经修饰的尿苷等核苷类似物的存在就不会对多核苷酸之间的同一性或互补性差异有贡献。因此，例如，序列5'-AXG(其中X为任何经修饰的尿苷，如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG 100％相同，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性的比对算法是本领域众所周知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法和尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法。本领域的技术人员将理解，对于要比对的给定的序列对，适当的算法和参数设置选择是什么；对于长度通常类似并且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，具有EBI在www.ebi.ac.uk网站服务器上提供的尼德曼-翁施算法的默认设置的尼德曼-翁施算法通常是适当的。
“mRNA”在本文中用于指代为RNA或经修饰的RNA的多核苷酸并且包括可以被翻译成多肽的开放阅读框(也就是说，可以充当用于由核糖体和氨基酰化的tRNA翻译的底物)。mRNA可以包括包含核糖残基或其类似物(例如，2'-甲氧基核糖残基)的磷酸糖骨架。在一些实施例中，核酸磷酸-糖骨架的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。一般来说，mRNA不含大量的胸苷残基(例如，0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可以在其尿苷位置中的一些或全部处含有经修饰的尿苷。
如本文所使用的，给定ORF的“最小尿苷含量”是ORF的尿苷含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。给定氨基酸的最小尿苷密码子是具有最少尿苷的密码子(通常为0或1，苯丙氨酸密码子除外，其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)。为了评估最小尿苷含量，经修饰的尿苷残基被认为等同于尿苷。
如本文所使用的，给定ORF的“最小尿苷二核苷酸含量”是ORF的最低可能尿苷二核尿苷(UU)含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上所述)并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。尿苷二核苷酸(UU)含量可以用绝对项表示为ORF中UU二核苷酸的枚举，或者以比率为基础表示为尿苷二核苷酸的尿苷占据的位置百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量将为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个位置)。为了评估最小尿苷二核苷酸含量，经修饰的尿苷残基被认为等同于尿苷。
如本文所使用的，给定开放阅读框(ORF)的“最小腺嘌呤含量”是ORF的腺嘌呤含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小腺嘌呤密码子并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。给定氨基酸的最小腺嘌呤密码子是具有最少腺嘌呤的密码子(通常为0或1，赖氨酸和天冬酰胺密码子除外，其中最小腺嘌呤密码子具有2个腺嘌呤)。为了评估最小腺嘌呤含量，经修饰的腺嘌呤残基被认为等同于腺嘌呤。
如本文所使用的，给定开放阅读框(ORF)的“最小腺嘌呤二核苷酸含量”是ORF的最低可能腺嘌呤二核尿苷(AA)含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小腺嘌呤密码子(如上所述)并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。腺嘌呤二核苷酸(AA)含量可以用绝对项表示为ORF中AA二核苷酸的枚举，或者以比率为基础表示为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤占据的位置百分比(例如，UAAUA的腺嘌呤二核苷酸含量将为40％，因为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤占据了5个位置中的2个位置)。为了评估最小腺嘌呤二核苷酸含量，经修饰的腺嘌呤残基被认为等同于腺嘌呤。
如本文所使用的，“TTR”是指作为TTR基因的基因产物的运甲状腺素蛋白。
如本文所使用的，“淀粉样蛋白”是指通常可溶性的蛋白质或肽的异常聚集体。淀粉样蛋白是不溶性的，并且淀粉样蛋白可以在器官和组织中产生蛋白质沉积物。淀粉样蛋白中的蛋白质或肽可能错误折叠成允许许多蛋白质拷贝粘在一起以形成原纤维的形式。虽然一些形式的淀粉样蛋白在人体内可能具有正常功能，但如本文所使用的“淀粉样蛋白”是指蛋白质的异常或病理性聚集体。淀粉样蛋白可以包括单一蛋白质或肽(如TTR)，或者它们可以包括多种蛋白质或肽(如TTR和另外蛋白质)。
如本文所使用的，“淀粉样原纤维”是指抗降解的淀粉样蛋白的不溶性纤维。淀粉样原纤维可以基于特定蛋白质或肽以及所述淀粉样原纤维聚集的组织和细胞类型产生症状。
如本文所使用的，“淀粉样变性”是指以由淀粉样蛋白或淀粉样原纤维沉积引起的症状为特征的疾病。淀粉样变性可能影响许多器官，包含心脏、肾脏、肝脏、脾脏、神经系统和消化道。
如本文所使用的，“ATTR”、“TTR相关淀粉样变性”、“TTR淀粉样变性”、“ATTR淀粉样变性”或“与TTR相关的淀粉样变性”是指与TTR沉积相关的淀粉样变性。
如本文所使用的，“家族性淀粉样心肌病”或“FAC”是指主要以限制性心肌病为特征的遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR)。充血性心力衰竭在FAC中很常见。平均发病年龄为大约60-70岁，其中诊断后预计寿命为4-5年。
如本文所使用的，“家族性淀粉样多神经病”或“FAP”是指主要以感觉运动神经病变为特征的遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR)。自主神经病变在FAP中很常见。虽然神经病变是主要特征，但FAP的症状还可能包含恶病质、肾衰竭和心脏病。FAP的平均发病年龄为大约30-50岁，其中诊断后预计寿命为5-15年。
如本文所使用的，“野生型ATTR”和“ATTRwt”是指与病理性TTR突变，如T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)无关的ATTR。ATTRwt也被称为老年全身性淀粉样变性。发病通常发生在60岁或以上的男性中，其中最常见的症状是充血性心力衰竭和心律不齐，如心房颤动。另外的症状包含心脏功能不良的后果，如呼吸短促、疲劳、头晕、肿胀(尤其是腿部)、恶心、心绞痛、睡眠中断和体重减轻。腕管综合征的病史表明ATTRwt的风险增加，并且在一些情况下可能表明早期疾病。ATTRwt通常会随着时间的推移导致心脏功能下降，但与遗传性ATTR相比具有更好的预后，因为野生型TTR沉积物累积得更慢。现有治疗类似于其它形式的ATTR(除了肝脏移植之外)，并且通常涉及支持或改善心脏功能，范围为从利尿剂和限制性流体以及盐摄入到抗凝血剂，并且在严重的情况下，心脏移植。尽管如此，与FAC一样，ATTRwt可能导致心力衰竭死亡，有时在确诊后3-5年内死亡。
表1和整个申请中示出了可用于本文所述的向导RNA组合物和方法的向导序列。
如本文所使用的，“遗传性ATTR”是指与TTR基因序列中的突变相关的ATTR。与ATTR相关的TTR基因中的已知突变包含导致TTR被T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)取代的那些突变。
如本文所使用的，“插入缺失”是指由在靶核酸中的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的许多核苷酸组成的插入/缺失突变。
如本文所使用的，“敲低”是指特定基因产物(例如，蛋白质、mRNA或两者)表达的降低。可以通过检测组织或细胞群体(例如，在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质或通过检测来自所关注的组织或细胞群体的蛋白质的总细胞量来测量蛋白质的敲低。用于测量mRNA敲低的方法是已知的并且包含对从所关注的组织或细胞群体中分离的mRNA进行测序。在一些实施例中，“敲低”可以是指特定基因产物表达的一些丧失，例如转录的mRNA量的减少或细胞群体(包含体内群体，如组织中发现的那些群体)表达或分泌的蛋白质量的减少。
如本文所使用的，“敲除”是指细胞中特定蛋白质表达的丧失。可以通过检测来自组织或细胞群体(例如，在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质的量或通过检测组织或细胞群体的蛋白质的总细胞量来测量敲除。在一些实施例中，提供了用于“敲除”一个或多个细胞中(例如包含体内群体的细胞群体中，如在组织中发现的那些细胞群体中)的TTR的方法。在一些实施例中，敲除不是形成例如通过插入缺失产生的突变型TTR蛋白，而是所述TTR蛋白在细胞中表达的完全丧失。
如本文所使用的，“突变型TTR”是指与TTR的野生型氨基酸序列相比，TTR的氨基酸序列发生变化的TTR的基因产物(即，TTR蛋白)。人野生型TTR序列可在NCBI Gene ID:7276；Ensembl:Ensembl:ENSG00000118271获得。与ATTR相关的TTR的突变体形式，例如在人中，包含T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)。
如本文所使用的，“突变型TTR”或“突变型TTR等位基因”是指与野生型序列(NCBI基因ID：7276；Ensembl:ENSG00000118271)相比具有TTR的核苷酸序列中的变化的TTR序列。
如本文所使用的，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指引导RNA以及RNA引导的DNA结合剂，如Cas核酸酶、例如Cas切割酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施例中，向导RNA将如Cas9等RNA引导的DNA结合剂引导到靶序列，并且向导RNA与靶序列杂交并且所述试剂与靶序列结合；在试剂是切割酶或切口酶的情况下，结合之后可以是切割或切口。
如本文所使用的，“靶序列”是指靶基因中的与gRNA的向导序列互补的核酸序列。靶序列和向导序列的相互作用引导RNA引导的DNA结合剂在靶序列内结合并潜在地切口或切割(取决于试剂的活性)。
如本文所使用的，“治疗”是指针对受试者的疾病或病症的治疗剂的任何施用或应用，并且包含抑制疾病、阻止其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一种或多种症状的复发。例如，对ATTR的治疗可以包括减轻ATTR的症状。
如本文所使用的，术语“病理性突变”是指使基因产物(如TTR)更可能引起、促进、促成或未能抑制疾病(如ATTR)发展的突变。
如本文所使用的，术语“脂质纳米颗粒”(LNP)是指包括多个(即，多于一个)通过分子间作用力物理地相互关联的脂质分子的颗粒。所述LNP可以是例如微球(包含单层和多层囊泡，例如“脂质体”-层状相脂质双层，所述层状相脂质双层在一些实施例中基本上是球形的，并且在更具体的实施例中可以包括水核，例如包括RNA分子的很大一部分)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。乳液、胶束和悬浮液可以是适合于局部(local/topical)递送的组合物。也请参见例如WO 2017173054A1和WO 2019067992A1，其内容特此以全文引用的方式并入。本领域技术人员已知能够向受试者递送核苷酸的任何LNP可以与本文所述的向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸一起使用。
如本文所使用的，术语“供体寡核苷酸”或“供体模板”是指包含要插入到靶位点中(例如，基因组DNA的靶位点)的期望核酸序列的寡核苷酸。供体寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。在一些实施例中，供体寡核苷酸可以通过使用LNP或转染与向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码(例如，Cas9)的核酸序列一起递送。
如本文所使用的，术语“核定位信号”(NLS)或“核定位序列”是指诱导包括此类序列或与此类序列连接的分子转运到真核细胞的细胞核中的氨基酸序列。核定位信号可以形成待转运的分子的一部分。在一些实施例中，NLS可以通过共价键、氢键或离子相互作用连接到分子的其余部分。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的”意指在制备通常无毒且在生物学上期望的并且在其它方面可用于药物用途的药物组合物中有用的。
术语“约”或“大约”意指如本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这将部分取决于如何测量或确定值。
如本文所使用的，“输注”是指一种或多种药剂的主动施用，输注时间例如介于大约30分钟与12小时之间。在一些实施例中，所述一种或多种药剂包括LNP，所述LNP例如包括对本文所述的RNA引导的DNA结合剂(如Cas9)进行编码的mRNA和本文所述的gRNA。
如本文所使用的，“输注预防”是指在治疗(例如，包括施用LNP)前向受试者施用的方案，所述治疗包括静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松10mg或等效物)、解热剂(例如，口服对乙酰氨基酚或扑热息痛500mg)、静脉内H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和静脉内H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)中的一种或多种或全部。输注预防任选地与口服皮质类固醇(例如，地塞米松8mg或等效物)的提前施用相组合。在一些实施例中，口服皮质类固醇在治疗前8-24小时施用。在一些实施例中，在治疗前1-2小时施用静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松10mg或等效物)、口服对乙酰氨基酚500mg、静脉内H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)、静脉内H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)中的一种或多种或全部。在一些实施例中，H1阻断剂和/或H2阻断剂是口服施用的。
II.靶向TTR基因的方法和组合物
本文公开了用于治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法以及相关组合物，包含用于此类方法中的组合物。还提供了用于本文所公开的方法中的皮质类固醇、向导RNA、RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷酸，如本文所述的任一种。例如，在一些实施例中，所公开的组合物(如LNP组合物)包括靶向TTR的向导RNA以及任选地RNA引导的DNA结合剂或包括对此类RNA引导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)进行编码的开放阅读框的核酸。用此类方法和组合物治疗的受试者可以具有野生型或非野生型TTR基因序列，例如患有ATTR的受试者，所述ATTR可以为ATTR wt或遗传性或家族性形式的ATTR。
可以独立控制施用皮质类固醇、输注预防以及本文所述的含向导RNA的组合物的剂量、频率和方式。
在一些实施例中，所述皮质类固醇在本文所述的含向导RNA的组合物之前施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇在本文所述的含向导RNA的组合物之后施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇与本文所述的含向导RNA的组合物同时施用。在一些实施例中，在施用含向导RNA的组合物之前或之后施用多个剂量的皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述皮质类固醇之前或之后施用多个剂量的含向导RNA的组合物。在一些实施例中，施用多个剂量的皮质类固醇和多个剂量的含向导RNA的组合物。
含向导RNA的组合物(例如，包括向导RNA以及任选地对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷酸的LNP组合物)可以通过输注施用。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过30分钟。在一些实施例中，所述组合物通过30分钟输注施用。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过60分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过90分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过120分钟、超过150分钟、超过180分钟、超过240分钟、超过300分钟或超过360分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时或至少12小时。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续0.5-1.5小时、1.5-2.5小时、2.5-3.5小时、3.5-4.5小时、4.5-5.5小时、5.5-6.5小时、6.5-7.5小时、7.5-8.5小时、8.5-9.5小时、9.5-10.5小时、10.5-11.5小时或11.5-12.5小时。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟或约360分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟或345-375分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约1.5-6小时。
在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时或由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时或由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用所述皮质类固醇。在某些实施例中，在施用含向导RNA的组合物之前约8-24小时递送皮质类固醇，并且在施用含向导RNA的组合物之前1-2小时施用输注预防。所述皮质类固醇可以与施用本文所述的含向导RNA的组合物一起施用或大约在同一时间施用。
如果合适的话，一定剂量的皮质类固醇可以作为至少两个亚剂量以适当的间隔分开施用。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前施用所述皮质类固醇至少两次。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后施用一定剂量的皮质类固醇至少两次。在一些实施例中，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇(例如，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前、同时和/或之后)。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇。
在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少两次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少三次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少四次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至多五次、六次、七次、八次、九次或十次。第一剂量可以是口服的，而第二或后续剂量可以通过肠胃外施用，例如输注。可替代地，第一剂量可以是肠胃外施用，而第二或后续剂量可以通过口服施用。
在一些实施例中，在静脉内施用本文所述的含向导RNA的组合物之前口服施用所述皮质类固醇。在一些实施例中，在静脉内施用本文所述的含向导RNA的组合物时或之后口服施用所述皮质类固醇。
A.皮质类固醇；输注预防
在所公开的方法和组合物中使用的所述皮质类固醇可用于治疗正在经受基因编辑和/或使用基因编辑组合物的疗法的受试者。不希望受到任何特定理论的束缚，皮质类固醇可用于减少对外源RNA(向导RNA或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA)的炎症或免疫应答。在所公开的方法和组合物中使用的所述皮质类固醇可以是任何本领域已知的和/或可从许多来源商购获得的皮质类固醇。
在一些实施例中，在施用所述基因编辑组合物之前(例如，在施用所述基因编辑组合物之前1-2小时)向受试者施用输注预防。在一些实施例中，所述输注预防包括静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松8-12mg，如10mg或等效物，或本文其它地方所述的任何其它皮质类固醇)、解热剂(例如，口服对乙酰氨基酚(也称为扑热息痛)500mg)、H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)、H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)中的一种或多种或全部。在一些实施例中，所述输注预防包括静脉内皮质类固醇(例如地塞米松8-12mg，如10mg或等效物)和解热剂(例如，口服对乙酰氨基酚或扑热息痛500mg)。在一些实施例中，所述H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)是口服施用的。在一些实施例中，所述H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)是静脉内施用的。在一些实施例中，静脉内H1阻断剂和/或静脉内H2阻断剂被等效物取代，例如口服施用等效物。另外地或可替代地，可以在例如治疗前8-24小时施用口服皮质类固醇(例如，地塞米松6-10mg，如8mg或等效物，或本文其它地方所述的任何其它皮质类固醇)。例如，当所述受试者是人(例如，成年人)时，可以使用这些剂量。在一些实施例中，所述输注预防由以下组成：可以减轻炎症严重程度的静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松10mg或等效物)、可以减轻疼痛和发热和/或抑制COX酶和/或前列腺素的口服对乙酰氨基酚500mg、静脉内H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和静脉内H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)，其分别在H1和H2受体处起阻断组胺的作用并且可以任选地在例如施用基因编辑组合物之前8-24小时施用口服地塞米松(如以8mg的量或等效物)。所述输注预防可以起到减少与施用含向导RNA的组合物(例如，LNP组合物)相关的不良反应的作用。在一些实施例中，在施用含向导RNA的组合物，例如LNP组合物之前，将所述皮质类固醇和/或输注预防作为所需的术前用药施用。
在一些实施例中，所述皮质类固醇与对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种同时施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇与对乙酰氨基酚和H1阻断剂同时施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇与对乙酰氨基酚和H2阻断剂同时施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇与H1阻断剂或H2阻断剂同时施用。在一些实施例中，H1阻断剂和/或H2阻断剂是口服施用的。在一些实施例中，所述组合物与对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂同时施用。
许多H1和H2阻断剂是本领域已知的。在一些实施例中，H1阻断剂是苯海拉明、氯马斯汀、西替利嗪、特非那定、抗敏安、米氮平、右溴苯那敏、曲普立定、赛庚啶、氯雷他定、羟嗪、桂利嗪、阿司咪唑、阿扎他定、氯苯甲嗪、卡比沙明、依匹斯汀、奥洛他定、曲吡那敏、溴苯那敏、酮替芬、非索非那定、地氯雷他定、氮卓斯汀、茶苯海明、异丙嗪、美喹他嗪、依美斯汀、左卡巴斯汀、氯苯那敏、赛克力嗪、阿利马嗪、抗敏胺、苯吡胺、美沙吡林、氟桂利嗪、米安色林、左西替利嗪、艾斯莫塔泽平(esmirtazapine)、美吡拉敏、阿卡他定、安他心、氯吡拉敏、二甲茚定、二甲替嗪、阿伐斯汀、马来酸右氯苯那敏、依巴斯汀、咪唑斯汀、gsk-1004723、奥沙米特、右氯苯那敏、贝托斯汀、布克力嗪、利培酮、甲地嗪、马普替林、二苯拉林、溴马秦、齐拉西酮、再普乐、氯氮平、丙嗪、曲唑酮、多塞平、去郁敏、奥芬那君、左美丙嗪、氯苯达诺、氯普噻吨、喹硫平、阿塞那平、苯扎托品、阿立哌唑、阿米替林、丙咪嗪、去甲氨基比林、曲米帕明、异西喷地、氯丙嗪、伊潘立酮、珠氯噻醇、氯环利嗪、阿莫沙平、丁替林、卡利拉嗪、比拉斯汀、度硫平、卢帕他定、苯噻啶、松齐拉敏、苯喹胺、丙酰马嗪、醋异丙嗪、月桂酰阿立派唑或地普托品。
在一些实施例中，所述H2阻断剂是雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替丁或法莫替丁。例如，可以在Liu等人,《过敏、哮喘和临床免疫学(Allergy,Asthma&Clinical Immunology)》,2013,9:30中找到等效的皮质类固醇和剂量。等效抗组胺药(H1阻断剂和/或H2阻断剂)和剂量包含本领域已知的此类合适成员的常规剂量。
在一些实施例中，在施用所述组合物之前施用至少两个剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前施用第一剂量的所述皮质类固醇，之后施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内施用第一剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内口服施用第一剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前1-2小时内施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前1-2小时内静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前1-2小时内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
在一些实施例中，在施用所述组合物之前，口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前1-2小时内静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
在一些实施例中，在施用所述组合物之前，口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且与对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种同时施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前，口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且与对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂同时施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前1-2小时内与施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂中的一种或多种同时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前1-2小时内与施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂同时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述组合物之前8-24小时内口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前1-2小时内与施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂同时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇，其中所述对乙酰氨基酚口服施用，而所述H1阻断剂和H2阻断剂静脉内施用。
在一些实施例中，施用所述皮质类固醇提高了所述包括所述向导RNA的组合物的耐受性。例如，与施用不含所述皮质类固醇的包括向导RNA的组合物相比，施用所述皮质类固醇可以降低一个或多个不良反应(如炎症、恶心、呕吐、血液中ALT浓度升高、体温过高和/或痛觉过敏)的发生率或严重程度。在一些实施例中，施用所述皮质类固醇减少或抑制响应于所述包括所述向导RNA的组合物的一种或多种干扰素和/或炎性细胞因子的产生或活性。
示例性皮质类固醇包含但不限于地塞米松、倍他米松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、可的松、氢化可的松、去炎松或英塞米松(ethamethasone)或其药学上可接受的盐。示例性皮质类固醇包含但不限于地塞米松、倍他米松、强的松(
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地平线制药公司(Horizon Pharma))、强的松龙(
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Allergan；OmnipredTM，诺华公司(Novartis))、甲基强的松龙(
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法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn)；Solu
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法玛西亚普强公司)、可的松、氢化可的松、去炎松、英塞米松、布地奈德(
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百利高制药公司(Perrigo Pharma Intl)；
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阿斯利康制药有限公司(Astrazeneca Pharms)；
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威朗制药(Valeant Pharms))、帕拉米松和地夫可特。在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松。
所公开的方法中使用的皮质类固醇可以根据本领域已知的方案(例如，美国FDA批准的方案)施用。合适的施用方式包含但不限于肠内施用、局部施用和肠胃外施用。如本文所使用的，短语“肠胃外施用(parenteral administration和administeredparenterally)”意指除了肠内(包含口服)施用和局部施用以外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内以及胸骨内注射和输注。在一些实施例中，将所述皮质类固醇经肠胃外地或通过注射施用于受试者。在一些实施例中，将所述皮质类固醇通过静脉内注射施用于受试者。在一些实施例中，将所述皮质类固醇口服或肠内施用于受试者。在一些实施例中，向受试者局部地施用皮质类固醇。
在例如包括向人类受试者施用或用于人类受试者中的一些实施例中，所述皮质类固醇可以以范围为约0.75mg到约25mg的量施用。在例如包括向人类受试者施用或用于人类受试者中的一些实施例中，所述皮质类固醇可以以范围为约0.01-0.5mg/kg(如0.1-0.40mg/kg或0.25-0.40mg/kg)的量施用。
在一个实例中，在静脉内施用向导RNA之前6到12小时以20mg或25mg的量口服施用地塞米松。在另一个实例中，在静脉内施用向导RNA之前6到12小时以20mg或25mg的量静脉内施用地塞米松持续30分钟。在另一个实例中，在输注向导RNA组合物之前8到24小时以8-12mg(如10mg)的量口服施用地塞米松。在另一个实例中，在输注向导RNA组合物之前1-2小时以8-12mg(如10mg)的量静脉内施用地塞米松。在另一个实例中，在输注向导RNA组合物之前8到24小时以8-12mg(如10mg)的量口服施用地塞米松，并且在输注向导RNA组合物之前1-2小时以8-12mg(如10mg)的量静脉内施用地塞米松。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用地塞米松。在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用地塞米松。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用地塞米松。在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用地塞米松。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，其中所述第二剂量的皮质类固醇与对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种同时施用。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，其中所述第二剂量的皮质类固醇与对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂同时施用。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，同时口服施用对乙酰氨基酚并且静脉内施用H1阻断剂和H2阻断剂。
在一些实施例中，所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前8-24小时以8mg的量向受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向受试者施用所述组合物之前1-2小时以10mg的量向受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，同时口服施用量为500mg的对乙酰氨基酚并且静脉内施用量为50mg的H1阻断剂和量为50mg的H2阻断剂。
另外，本领域普通技术人员认识到，根据特定皮质类固醇的选择，可以容易地调整皮质类固醇的剂量。例如，出于比较的目的，以下是皮质类固醇的近似等效mg剂量：氢化可的松20mg；可的松25mg；强的松或强的松龙5mg；地夫可特6mg；甲基强的松龙4mg；地塞米松或倍他米松0.75mg；去炎松4mg。因此，虽然上述实例中呈现的皮质类固醇的剂量是基于地塞米松的，但是当另一种皮质类固醇被施用于患者时，本领域普通技术人员将使用上述转换信息来计算另一种皮质类固醇的等效剂量。
B.向导RNA(gRNA)
在所公开的方法和组合物中使用的向导RNA包括靶向TTR基因的向导序列。表1中的SEQ ID NO:5-82处示出了靶向TTR基因的示例性向导序列。
表1：TTR靶向的向导序列、命名法、染色体坐标和序列。
Figure BDA0003377190340000451
Figure BDA0003377190340000461
Figure BDA0003377190340000471
Figure BDA0003377190340000481
Figure BDA0003377190340000491
上述向导序列中的每个向导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与在3'端处的向导序列之后的以下示例性核苷酸序列形成crRNA：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ IDNO:126)。在sgRNA的情况下，上述向导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与向导序列的3'端之后的以下示例性核苷酸序列形成sgRNA：在5'到3'朝向上的GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:125)。
在一些实施例中，所述sgRNA是经修饰的。在一些实施例中，所述sgRNA包括以下SEQ ID NO:3中所示的修饰模式，其中N是任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的全部包括如本文所述的向导序列，并且经修饰的sgRNA包括以下序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:3)，其中“N”可以是任何天然或非天然核苷酸。例如，本文涵盖的是SEQ ID NO:3，其中N被本文公开的任何向导序列替换。尽管用N取代了向导的核苷酸，但所述修饰仍如SEQ ID NO:3所示。也就是说，尽管向导的核苷酸置换“N”，但前三个核苷酸是经2'OMe修饰的，并且在第一核苷酸与第二核苷酸、第二核苷酸与第三核苷酸以及第三核苷酸与第四核苷酸之间存在硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，涵盖表2中所述的任何一个序列。
表2：TTR靶向的sgRNA序列
Figure BDA0003377190340000501
Figure BDA0003377190340000511
Figure BDA0003377190340000521
Figure BDA0003377190340000531
Figure BDA0003377190340000541
Figure BDA0003377190340000551
Figure BDA0003377190340000561
*＝PS连接；“m”＝2'-O-Me核苷酸
表3提供了向导ID与对应sgRNA ID的比对映射以及与食蟹猴基因组和食蟹猴匹配的向导ID的同源性。
表3：TTR靶向的向导序列ID映射和食蟹猴同源性
Figure BDA0003377190340000562
Figure BDA0003377190340000571
在一些实施例中，所述gRNA包括向导序列，所述向导序列将RNA引导的DNA结合剂(其可以是核酸酶(例如，Cas核酸酶，如Cas9))引导到TTR中的靶DNA序列中。所述gRNA可以包括包含表1中示出的向导序列的crRNA。所述gRNA可以包括包含表1中示出的向导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸的crRNA。在一些实施例中，所述gRNA包括包含与表1中示出的向导序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。在一些实施例中，所述gRNA包括包含与表1中示出的向导序列具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。所述gRNA可以进一步包括trRNA。在本文描述的每个组合物和方法实施例中，crRNA和trRNA可以作为单个RNA(sgRNA)缔合，或可以位于单独的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的上下文下，可以例如经磷酸二酯键或其它共价键共价连接crRNA组分和trRNA组分。
在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括两个RNA分子作为“双引导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包括第一RNA分子和第二RNA分子，所述第一RNA分子包括包含例如表1中示出的引导序列的crRNA，所述第二RNA分子包括trRNA。第一RNA分子和第二RNA分子可以不共价连接，但可以经crRNA部分与trRNA部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括单个RNA分子作为“单引导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可以包括包含表1中示出的与trRNA共价连接的引导序列的crRNA(或其一部分)。sgRNA可以包括表1中示出的引导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施例中，crRNA和trRNA通过连接子共价连接。在一些实施例中，sgRNA通过crRNA部分与trRNA部分之间的碱基配对形成茎环结构。在一些实施例中，crRNA和trRNA通过一个或多个非磷酸二酯键的键共价连接。
在一些实施例中，trRNA可以包括源自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或部分。在一些实施例中，trRNA包括截短的或经修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，trRNA包括或由5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或100个以上的核苷酸组成。在一些实施例中，trRNA可以包括某些次级结构，例如一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个凸起结构。
在一些实施例中，所述组合物包括一个或多个包括选自SEQ ID NO:5-82的向导序列的向导RNA。
在一些实施例中，所述组合物包括gRNA，所述sgRNA包括与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。
在一些实施例中，所述组合物包括一个或多个向导RNA，所述一个或多个向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。在一些实施例中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA包括与选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。在一些实施例中，选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69。
在其它实施例中，所述组合物包括至少一个，例如至少两个包括选自SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何两个或更多个的向导序列的gRNA。在一些实施例中，所述组合物包括至少两个gRNA，所述gRNA各自包括与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。
在其它实施例中，所述组合物包括至少一个，例如至少两个包括选自从SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82中选择的向导序列中的任何两个或更多个的向导序列的gRNA。在一些实施例中，所述组合物包括至少两个各自包括与选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列中的任何序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列的gRNA。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列包括选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的一个或两个序列。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列包括选自SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69的一个或两个序列。
在一些实施例中，所述gRNA是包括表2中所示的序列(SEQ ID No.87-124)中的任一个的sgRNA。在一些实施例中，所述gRNA是包括表2中所示的序列(SEQ ID No.87-124)中的任一个的sgRNA，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-124)。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-124)。在一些实施例中，在有或没有修饰的情况下，所述sgRNA包括表1中所示的代替表2的SEQ ID NO:87-124处的sgRNA序列所示的向导序列的向导序列中的任何一个。
在一些实施例中，所述gRNA是包括SEQ ID No.87-113、115-120或122-124中的任一个的sgRNA。在一些实施例中，所述gRNA是包括SEQ ID No.87-113、115-120或122-124中的任一个的sgRNA，但没有如表2中所示的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124)。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-113、115-120或122-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-113、115-120或122-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124)。在一些实施例中，在有或没有修饰的情况下，所述sgRNA包括表1中所示的代替表2的SEQ ID NO:87-113、115-120或122-124处的sgRNA序列中所示的向导序列的向导序列中的任何一个。
本文所提供的向导RNA可以用于识别(例如，杂交)TTR基因中的靶序列。例如，TTR靶序列可以被提供的包括引导RNA的Cas切割酶识别和切割。因此，可以由引导RNA将RNA引导的DNA结合剂(如Cas切割酶)引导到TTR基因的靶序列，其中向导RNA的向导序列与靶序列杂交，并且RNA引导的DNA结合剂(如Cas切割酶)切割靶序列。
在一些实施例中，基于TTR基因内的靶序列确定对所述一个或多个引导RNA的选择。
在不受任何特定理论束缚的情况下，基因的某些区中的突变(例如，由于作为核酸酶介导的DSB的结果而发生的插入缺失导致的移码突变)可能比基因的其它区中的突变更不耐受，因此DSB的位置是可能导致的蛋白质敲除的数量或类型的重要因素。在一些实施例中，与TTR内的靶序列互补或具有互补性的gRNA用于将RNA引导的DNA结合剂引导到TTR基因中的特定位置。在一些实施例中，gRNA被设计为具有与TTR的外显子1、外显子2、外显子3或外显子4中的靶序列互补或具有互补性的引导序列。
在一些实施例中，向导序列与人TTR基因中存在的靶序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同。在一些实施例中，靶序列可以与向导RNA的向导序列互补。在一些实施例中，向导RNA的向导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可以为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，gRNA的靶序列和向导序列可以是100％互补或相同的。在其它实施例中，gRNA的靶序列和向导序列可以含有至少一个错配。例如，gRNA的靶序列和向导序列可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中向导序列的总长度为20。在一些实施例中，gRNA的靶序列和向导序列可以含有1-4个错配，其中向导序列为20个核苷酸。
C.gRNA的修饰
在一些实施例中，所述gRNA是经化学修饰的。包括一个或多个经修饰的核苷或核苷酸的gRNA被称为“经修饰的”gRNA或“经化学修饰的”gRNA，以描述一个或多个非天然和/或天然存在的用于替代或除了规范的A、G、C和U残基之外的组分或构型。在一些实施例中，经修饰的gRNA是用非规范核苷或核苷酸合成的，这里称为“经修饰的”。经修饰的核苷和核苷酸可以包含以下中的一种或多种：(i)磷酸二酯骨架连接中的非连接磷酸氧中的一个或两个和/或连接磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替代(示例性骨架修饰)；(ii)核糖成分(例如，核糖上的2'羟基)的改变，例如替代(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷”连接子大规模替代磷酸部分(示例性骨架修饰)；(iv)天然存在的核碱基(包含用非规范的核碱基进行)的修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)核糖磷酸骨架的替代或修饰(示例性骨架修饰)；(vi)寡核苷酸3'端或5'端的修饰，例如末端磷酸基的去除、修饰或替代或部分、帽或连接子的缀合(此类3'或5'帽修饰可以包括糖和/或骨架修饰)；以及(vii)糖的修饰或替代(示例性糖修饰)。
化学修饰(如以上列出的那些化学修饰)可以组合以提供包括可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)的经修饰的gRNA。例如，经修饰的残基可以具有经修饰的糖和经修饰的核碱基。在一些实施例中，修饰gRNA的每个碱基，例如所有碱基都具有经修饰的磷酸基，如硫代磷酸酯基。在某些实施例中，gRNA分子的磷酸基中的所有或基本上所有的磷酸基都用硫代磷酸酯基替代。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的5'端处或附近的至少一个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的3'端处或附近的至少一个经修饰的残基。
在一些实施例中，gRNA包括一个、两个、三个或更多个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA中的至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的位置是经修饰的核苷或核苷酸。
未经修饰的核酸可能易于被例如细胞内核酸酶或在血清中发现的核酸酶降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可以含有一种或多种经修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞内或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施例中，在被体内和体外两方面引入到细胞群体中，本文所述的经修饰的gRNA分子可以表现出降低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包含对外源性核酸的细胞应答，所述外源性核酸包含单链核酸，所述细胞应答涉及细胞因子表达和释放的诱导，特别是干扰素和细胞死亡。
在骨架修饰的一些实施例中，经修饰的残基的磷酸基可以通过用不同的取代基替代氧中的一个或多个氧来修饰。进一步地，经修饰的残基(例如经修饰的核酸中存在的经修饰的残基)可以包含用本文所述的经修饰的磷酸基大规模替代未经修饰的磷酸部分。在一些实施例中，磷酸骨架的骨架修饰可以包含导致不带电荷的连接子或具有不对称电荷分布的带电荷的连接子的改变。
经修饰的磷酸基的实例包含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢磷酸酯、磷酰胺酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未经修饰的磷酸基中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团中的一个替代非桥氧中的一个可以使磷原子手性。立构磷原子可以具有“R”构型(本文为Rp)或“S”构型(本文为Sp)。骨架还可以通过用氮(桥接的磷酰胺酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替代桥氧(也就是说，连接磷酸酯和核苷的氧)来修饰。替换可以发生在连接氧处或连接氧中的两个连接氧处。
在某些骨架修饰中，磷酸基可以被不含磷的接头替代。在一些实施例中，带电荷的磷酸基可以被中性部分替代。可以替代磷酸基的部分的实例可以包含但不限于，例如甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸盐、磺酰胺、硫代甲缩醛化物、甲缩醛化物、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲亚氨基、亚甲基亚肼基(methylenehydrazo)、亚甲基二甲亚肼基(methylenedimethylhydrazo)和亚甲基氧甲亚氨基。
还可以构建模拟核酸的支架，其中磷酸连接子和核糖被耐核酸酶的核苷或核苷酸替代物替代。此类修饰可以包括骨架修饰和糖修饰。在一些实施例中，核碱基可以被替代骨架拴系。实例可以包含但不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含对糖基的一个或多个修饰，也就是说，糖修饰。例如，2'羟基(OH)可以被修饰，例如被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替代。在一些实施例中，对2'羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基不再能去质子化以形成2'-醇盐离子。
2'羟基修饰的实例可以包含：烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可以是例如H或任选地经取代的烷基，并且n可以是0到20的整数(例如，0到4、0到8、0到10、0到16、1到4、1到8、1到10、1到16、1到20、2到4、2到8、2到10、2到16、2到20、4到8、4到10、4到16和4到20)。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以是2'-O-Me。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以是2'-氟修饰，所述修饰用氟化物替代2'羟基。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以包含“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基可以例如通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接到同一核糖的4'碳，其中示例性桥可以包含亚甲基桥、丙烯桥、醚桥或氨基桥；邻氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以包含“解锁”核酸(UNA)，其中核糖环缺少C2'-C3'键。在一些实施例中，2'羟基修饰可以包含甲氧基乙基(MOE)，(OCH2CH2OCH3，例如PEG衍生物)。
“脱氧”2'修饰可以包含氢(即，脱氧核糖，例如部分dsRNA的突出部分)；卤素(例如，溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可以是例如如本文所述的)、-NHC(O)R(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地例如被如本文所述的氨基取代。
糖修饰可以包括还可以含有具有与核糖中对应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的一个或多个碳的糖基。因此，经修饰的核酸可以包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。经修饰的核酸还可以包含无碱基糖。这些无碱基糖也可以进一步在组成糖原子中的一个或多个糖原子处修饰。经修饰的核酸还可以包含一种或多种呈L形式的糖，例如，L-核苷。
本文所述的可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含经修饰的碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包含但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可以被修饰或完全替代，以提供可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的残基。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施例中，核碱基可以包含例如天然存在的和合成的碱基衍生物。
在采用双引导RNA的实施例中，crRNA和tracr RNA中的每一个都可以含有修饰。此类修饰可以在crRNA和/或tracr RNA的一端或两端处。在包括sgRNA的实施例中，可以化学修饰sgRNA的一端或两端处的一个或多个残基，或者可以化学修饰整个sgRNA。某些实施例包括5'端修饰。某些实施例包括3'端修饰。在某些实施例中，向导RNA分子的单链突出部中的核苷酸中的一个或多个或全部是脱氧核苷酸。
在一些实施例中，本文公开的向导RNA包括在于2016年12月8日提交的题为“经化学修饰的向导RNA(Chemically Modified Guide RNA)”的US 62/431,756中公开的修饰谱式之一，其内容特此以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，本发明包括包含一个或多个修饰的gRNA。在一些实施例中，所述修饰包括经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，所述修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可以用于表示已经用2'-O-Me修饰的核苷酸。
2'-O-甲基的修饰可以描绘如下：
Figure BDA0003377190340000641
已经被示出影响核苷酸糖环的另一个化学修饰是卤素取代。例如，核苷酸糖环上的2'-氟(2'-F)取代可以增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。
在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”可以用于表示已经被2'-F取代的核苷酸。
2'-F的取代可以描绘如下：
Figure BDA0003377190340000651
硫代磷酸酯(PS)连接或键是指在磷酸二酯连接中，例如在核苷酸碱基之间的键中，硫取代一个非桥连磷酸氧的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可以被称为硫寡核苷酸。
“*”可以用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可以用于表示通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可以用于表示已经被2'-O-Me取代并通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。
下图示出了S-取代为非桥连磷酸氧，从而生成代替磷酸二酯键的PS键：
Figure BDA0003377190340000652
无碱基核苷酸是指缺少含氮碱基的那些核苷酸。下图描述了无碱基(也被称为无嘌呤)位点缺少碱基的寡核苷酸：
Figure BDA0003377190340000661
反向碱基是指具有从正常的5'到3'连接开始(也就是说，5'到5'连接或3'到3'连接)反向的连接的那些反向碱基。例如：
Figure BDA0003377190340000662
无碱基核苷酸可以与反向连接进行连接。例如，无碱基核苷酸可以通过5'到5'连接与末端5'核苷酸连接，或者无碱基核苷酸可以通过3'到3'连接与末端3'核苷酸连接。末端5'或3'核苷酸处的反向无碱基核苷酸也可以被称为反向无碱基端帽。
在一些实施例中，修饰5'端处的前三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸，以及3'端处的最后三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸。在一些实施例中，修饰是2'-O-Me、2'-F、反向无碱基核苷酸、PS键或本领域公知的用于增加稳定性和/或性能的其它核苷酸修饰。
在一些实施例中，5'端处的前四个核苷酸和3'端处的最后四个核苷酸用硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸以及3'端处的最后三个核苷酸包括经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包括经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包括反向的无碱基核苷酸。
在一些实施例中，所述向导RNA包括经修饰的sgRNA。在一些实施例中，所述sgRNA包括SEQ ID NO:3中所示的修饰模式，其中N是任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的全部包括将核酸酶引导到靶序列的向导序列。
在一些实施例中，所述向导RNA包括SEQ ID NO:87-124中的任何一个所示的gRNA。在一些实施例中，所述向导RNA包括包含SEQ ID NO:5-82的向导序列以及SEQ ID NO:125的核苷酸中的任一个的sgRNA，其中SEQ ID NO:125的核苷酸位于向导序列的3'端上，并且其中所述向导序列可以如SEQ ID NO:3所示进行修饰。
在一些实施例中，所述向导RNA包括包含选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列以及SEQ ID NO:3的核苷酸21-100的sgRNA，其中SEQ ID NO:3的核苷酸位于向导序列的3'端上，并且其中所述向导序列可以如SEQ ID NO:3所示进行修饰。
D.RNA引导的DNA结合剂
在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是第2类Cas核酸酶。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有也可以被称为双链核酸内切酶活性的切割酶活性。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶，如第2类Cas核酸酶(其可以是例如II、V或VI型Cas核酸酶)。第2类Cas核酸酶包含例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白及其修饰。Cas9核酸酶的实例包含酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其它原核生物的II型CRISPR系统(参见例如，下一段中的列表)及其经修饰(例如，工程化或突变型)型式中的那些实例。参见，例如US 2016/0312198 A1；US2016/0312199A1。Cas核酸酶的其它实例包含III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；以及I型CRISPR系统的级联复合物或其Cas3亚基。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自IIA型、IIB型或IIC型系统。关于各种CRISPR系统和Cas核酸酶的讨论，参见例如Makarova等人,《自然综述：微生物学》9:467-477(2011)；Makarova等人,《自然综述：微生物学》,13:722-36(2015)；Shmakov等人,《分子细胞》,60:385-397(2015)。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶，例如Cas9切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切口酶，例如Cas9切口酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9核酸酶，如切割酶或切口酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是酿脓链球菌Cas9核酸酶，例如切割酶。
Cas核酸酶可以源自的非限制性示例性物种包含酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌、无害利斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形杆菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒化芽孢杆菌(Bacillusselenitireducens)、戟叶鹅绒藤微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸降解菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、最大节螺藻(Arthrospira maxima)、节旋藻(Arthrospirasp.)、林氏藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseriacinerea)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施例中，Cas核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌的Cpf1核酸酶在一些实施例中，Cas核酸酶是来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpf1核酸酶。在另外的实施例中，Cas核酸酶是来自以下的Cpf1核酸酶：土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)、丙酸氧化菌(Smithella)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)、候选白蚁甲烷枝原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、良吉氏钩端螺旋体(Leptospirainadai)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域切割非靶DNA链，并且HNH结构域切割靶DNA链。在一些实施例中，Cas9核酸酶包括多于一个RuvC结构域和/或多于一个HNH结构域。在一些实施例中，Cas9核酸酶是野生型Cas9。在一些实施例中，Cas9能够在靶DNA中诱导双链断裂。在某些实施例中，Cas核酸酶可以切割dsDNA，所述Cas核酸酶可以切割一条dsDNA链，或者所述Cas核酸酶可能不具有DNA切割酶或切口酶活性。示例性Cas9氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:203。包含起始密码子和终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列被提供为SEQ ID NO:311。适于包含在融合蛋白中的示例性Cas9 mRNA编码序列被提供为SEQ ID NO:210。
在一些实施例中，使用嵌合型Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区被不同蛋白质的部分替代。在一些实施例中，Cas核酸酶结构域可以被来自如Fok1等不同核酸酶的结构域替代。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是经修饰的核酸酶。
在其它实施例中，Cas核酸酶可以来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可以具有RNA切割活性。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，也就是说，可以切割一条DNA链以产生单链断裂，也被称为“切口”。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包括Cas切口酶。切口酶是在dsDNA中产生切口的酶，也就是说，切割DNA双螺旋的一条链而不是另一条链。在一些实施例中，Cas切口酶是Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的型式，其中核酸内切酶活性位点例如通过催化结构域中的一种或多种改变(例如，点突变)而失活。参见例如美国专利第8,889,356号有关Cas切口酶和示例性催化结构域改变的讨论。在一些实施例中，Cas切口酶(如Cas9切口酶)具有失活的RuvC或HNH结构域。示例性Cas9切口酶氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:206。包含起始密码子和终止密码子的示例性Cas9切口酶mRNA ORF序列被提供为SEQ ID NO:207。适于包含在融合蛋白中的示例性Cas9切口酶mRNA编码序列被提供为SEQ ID NO:211。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂被修饰为仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，可以修饰试剂蛋白，使得核酸酶结构域之一发生突变或完全或部分缺失，以降低其核酸切割活性。在一些实施例中，使用具有降低活性的RuvC结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有降低活性的HNH结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施例中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施例中，Cas核酸酶可以包括RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包含D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人,(2015)《细胞(Cell)》10月22:163(3):759-771。在一些实施例中，Cas核酸酶可以包括HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包含E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人,(2015)。另外的示例性氨基酸取代包含D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施例中，结合分别与靶序列的有义链和反义链互补的一对向导RNA提供对切口酶进行编码的核酸。在此实施例中，引导RNA将切口酶引导到靶序列并且通过在靶序列的相反链上产生切口(也就是说，双切口)引入DSB。在一些实施例中，使用双切口可以改善特异性并减少脱靶效应。在一些实施例中，切口酶与两个单独的靶向DNA的相反链的向导RNA一起使用以在靶DNA中产生双切口。在一些实施例中，切口酶与两个单独的被选择成非常接近的向导RNA一起使用以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂缺少切割酶和切口酶活性。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包括dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，但基本上缺少催化(切割酶/切口酶)活性。在一些实施例中，dCas多肽是dCas9多肽。在一些实施例中，缺少切割酶和切口酶活性的RNA引导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽是Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的型式，其中所述核酸酶的核酸内切酶活性位点例如通过其催化结构域中的一种或多种改变(例如，点突变)而失活。参见例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。示例性dCas9氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:208。包含起始密码子和终止密码子的示例性dCas9 mRNA ORF序列被提供为SEQ ID NO:209。适于包含在融合蛋白中的示例性dCas9 mRNA编码序列被提供为SEQ ID NO:346。
a)异源功能性结构域；核定位信号
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)包括一个或多个异源功能性结构域(例如，是或包括融合多肽)。
在一些实施例中，异源功能性结构域可以促进RNA引导的DNA结合剂运输到细胞核中。例如，异源功能性结构域可以是核定位信号(NLS)。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-10个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与一个NLS融合。当使用一个NLS时，NLS可以连接在RNA引导的DNA结合剂序列的N末端或C末端处。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂可以在C末端与至少一个NLS融合。NLS还可以插在RNA引导的DNA结合剂序列中。在其它实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与多于一个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与2个、3个、4个或5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与两个NLS融合。在某些情况下，所述两个NLS可以是相同的(例如，两个SV40 NLS)或不同的。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂与羧基末端处连接的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与两个NLS融合，一个在N末端处连接并且一个在C末端处连接。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与3个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以不与NLS融合。在一些实施例中，NLS可以是单分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV(SEQ ID NO:278)或PKKKRRV(SEQ ID NO:290)。在一些实施例中，NLS可以是二分序列，如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:91)。在一些实施例中，所述NLS序列可以包括LAAKRSRTT(SEQ ID NO:279)、QAAKRSRTT(SEQ ID NO:280)、PAPAKRERTT(SEQ IDNO:281)、QAAKRPRTT(SEQ ID NO:282)、RAAKRPRTT(SEQ ID NO:283)、AAAKRSWSMAA(SEQ IDNO:284)、AAAKRVWSMAF(SEQ ID NO:285)、AAAKRSWSMAF(SEQ ID NO:286)、AAAKRKYFAA(SEQID NO:287)、RAAKRKAFAA(SEQ ID NO:288)或RAAKRKYFAV(SEQ ID NO:289)。在具体实施例中，单个PKKKRKV(SEQ ID NO:278)NLS可以在RNA引导的DNA结合剂的C端处连接。在融合位点处任选地包含一个或多个连接子。在一些实施例中，根据前述实施例中任一项所述的一个或多个NLS与一个或多个另外的异源功能性结构域(如下文所述的任何异源功能性结构域)组合存在于RNA引导的DNA结合剂中。
在一些实施例中，异源功能性结构域能够修饰RNA引导的DNA结合剂的细胞内半衰期。在一些实施例中，可以增加RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，可以减少RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，异源功能性结构域能够增加RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域能够减少RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域可以充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施例中，蛋白质降解可以由蛋白水解酶介导，所述蛋白水解酶例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶。在一些实施例中，异源功能性结构域可以包括PEST序列。在一些实施例中，可以通过添加泛素或多泛素链来修饰RNA引导的DNA结合剂。在一些实施例中，泛素可以是泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白的非限制性实例包含小泛素样修饰物(SUMO)、泛素交叉反应型蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰物-1(URM1)、神经元前体细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母中也称为Rub1)、人白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰物-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。
在一些实施例中，异源功能性结构域可以是标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包含荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施例中，标志物结构域可以是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包含绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母绿、Azami绿、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、柠檬黄、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、石青、mKalamal、GFPuv、天蓝色、T-天蓝色(T-sapphire))、青色荧光蛋白(例如，ECFP、蔚蓝色(Cerulean)、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-青色)、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(例如，mOrange、mKO、Kusabira-橙色、单体Kusabira-橙色、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。在其它实施例中，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、poly(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、多His和钙调蛋白。非限制性示例性报告基因包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在另外的实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂靶向特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂靶向线粒体。
在另外的实施例中，异源功能性结构域可以是效应结构域。当将RNA引导的DNA结合剂引导到其靶序列时，例如，当通过gRNA将Cas核酸酶引导到靶序列时，效应结构域可以修饰或影响靶序列。在一些实施例中，效应结构域可以选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如，非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域。在一些实施例中，异源功能性结构域是核酸酶，如FokI核酸酶。参见例如美国专利第9,023,649号。在一些实施例中，异源功能性结构域是转录活化剂或阻遏物。参见例如Qi等人,“改变CRISPR用途作为用于基因表达的序列特异性控制的RNA引导的平台(RepurposingCRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of geneexpression)”，《细胞》152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人,“通过基于CRISPR-Cas9的转录因子的RNA引导的基因激活(RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-basedtranscription factors)”《自然方法(Nat.Methods)》10:973-6(2013)；Mali等人,“用于靶特异性筛选的CAS9转录激活因子和用于合作基因组工程的配对切口酶(CAS9transcriptional activators for target specificity screening and pairednickases for cooperative genome engineering)”,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》31:833-8(2013)；Gilbert等人,“真核生物中CRISPR介导的模块化RNA引导的转录调节(CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes)”,《细胞》154:442-51(2013)。如此，RNA引导的DNA结合剂基本上成为可以使用向导RNA引导以结合期望的靶序列的转录因子。在某些实施例中，DNA修饰结构域是甲基化结构域，如去甲基化或甲基转移酶结构域。在某些实施例中，效应子结构域是DNA修饰结构域，如碱基编辑结构域。在具体实施例中，所述DNA修饰结构域是将特定修饰引入到DNA中的核酸编辑结构域，例如脱氨酶结构域。参见例如WO 2015/089406；US2016/0304846。WO2015/089406和US 2016/0304846中描述的核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体特此通过引用并入。
E.包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸
包括对本文所公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的任何核酸可以与本文所公开的任何gRNA组合在组合物或方法中。在本文所述的任何实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸可以是mRNA。
1.腺嘌呤含量低的ORF
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量等于所述ORF的最小腺嘌呤含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的200％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到腺嘌呤二核苷酸含量，所述腺嘌呤二核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为0个腺嘌呤三核苷酸到1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个或50个腺嘌呤三核苷酸(其中腺嘌呤的较长运行按其内独特的三个腺嘌呤片段的数量计数，例如，一个腺嘌呤四核苷酸含有两个腺嘌呤三核苷酸，一个腺嘌呤五核苷酸含有三个腺嘌呤三核苷酸等)。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为0％腺嘌呤三核苷酸到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％腺嘌呤三核苷酸，其中腺嘌呤三核苷酸的含量百分比被计算为形成腺嘌呤三核苷酸的一部分(或腺嘌呤的较长运行)的腺嘌呤在序列中占据的位置的百分比，使得序列UUUAAA和UUUUAAAA各自将具有50％的腺嘌呤三核苷酸含量。例如，在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，提供了一种核酸，所述核酸对包括不含腺嘌呤三核苷酸的ORF的RNA引导的DNA结合剂进行编码。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤三核苷酸含量到腺嘌呤三核苷酸含量，所述腺嘌呤三核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
给定ORF可以降低腺嘌呤含量或腺嘌呤二核苷酸含量或腺嘌呤三核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小腺嘌呤密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小腺嘌呤密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表4中列出的密码子。
表4.示例性最小腺嘌呤密码子
Figure BDA0003377190340000771
Figure BDA0003377190340000781
在一些实施例中，提供了对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的核酸，所述核酸包括由密码子集合组成的ORF，所述密码子集合中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表4中列出的密码子。在一些实施例中，所述ORF具有最小核苷酸均聚物，例如相同核苷酸的重复串。例如，在一些实施例中，当从表4中列出的密码子中选择最小尿苷密码子时，通过选择减少核苷酸均聚物的数量和长度的最小腺嘌呤密码子来构建核酸，例如选择GCG而不是GCC用于丙氨酸或选择GGC而不是GGG用于甘氨酸。
在任何前述实施例中，所述核酸可以是mRNA。
2.增加翻译和/或对应于高表达tRNA的密码子；示例性密码子集合
在一些实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(如人类)中的翻译的密码子。在另外的实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(例如，人类)的器官(如肝脏)中的翻译的密码子。在另外的实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(例如，人类)的细胞类型(如肝细胞)中的翻译的密码子。可以相对于所述ORF的野生型序列的翻译程度或相对于密码子分布与所述ORF源自的生物体或在氨基酸水平上含有最类似ORF的生物体的密码子分布相匹配的ORF来确定哺乳动物、细胞类型、哺乳动物器官、人类、人类器官等中翻译的增加，如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或另一个原核生物(视原核生物源自的Cas核酸酶的情况而定)，如以下描述的来自其它原核生物的Cas核酸酶。可替代地，在一些实施例中，相对于在其它所有相等的具有SEQ ID NO:205的序列中的翻译(包含任何适用的点突变、异源结构域等)的ORF来确定Cas9序列在哺乳动物、细胞类型、哺乳动物器官、人类、人类器官等中翻译的增加。可用于增加人类(包含人类肝脏和人类肝细胞)表达的密码子可以是与人类肝脏/肝细胞中高表达的tRNA相对应的密码子，这在Dittmar KA,《公共科学图书馆遗传学(PLos Genetics)》2(12):e221(2006)中有所讨论。在一些实施例中，ORF中至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物(如人类)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物器官(如人类器官)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物肝脏(如人类肝脏)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物肝细胞(如人类肝细胞)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。
可替代地，通常可以使用与生物体(例如，人类)中高表达的tRNA相对应的密码子。
上述密码子选择方法中的任何一种方法都可以与上面所示的最小腺嘌呤密码子组合，例如，从表4的密码子开始，并且然后在多于一个选项可用的情况下，使用对应于更高表达的tRNA的密码子，无论是在生物体(例如，人类)中，还是在所关注的器官或细胞类型(如肝脏或肝细胞)中(例如，人类肝脏或人类肝细胞)。
在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的密码子集合(例如，低U1、低A或低A/U密码子集合)的密码子。低U1、低G、低C、低A和低A/U集合中的密码子使用使指定核苷酸最小化的密码子，同时还使用对应于高表达的tRNA的密码子，其中多于一个选项是可用的。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低U1密码子集合的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低A密码子集合的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低A/U密码子集合的密码子。
表5.示例性密码子集合
Figure BDA0003377190340000791
Figure BDA0003377190340000801
3.示例性序列
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或所述ORF在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或所述ORF由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表1中列出的密码子；和/或所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的123％；和/或所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷酸包括与SEQ ID NO:377具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF包括与SEQ ID NO:201、204、207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述mRNA包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF，其中RNA引导的DNA结合剂包括与SEQID NO:203、206、208、213、216、219、222、225、228、268或386-396中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的150％，和/或所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％。在一些实施例中，经编码的RNA引导的DNA结合剂包括与SEQ ID NO:203、206、208、213、216、219、222、225、228、268或386-396中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述最小尿苷含量的150％，和/或所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到所述最小尿苷二核苷酸含量的150％。在一些此类实施例中，腺嘌呤核苷酸含量和尿苷核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，腺嘌呤二核苷酸含量和尿苷二核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，所述mRNA包括与SEQ ID NO:243、244、251、253、255-261或267中的任一个具有至少90％同一性的序列，其中所述序列包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF。在一些实施例中，所述mRNA包括与SEQ ID NO:243、244、251、253、255-261或267中的任一个具有至少90％同一性的序列，其中所述序列包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF，其中省略了SEQ ID NO:243、244、251、253、255-261或267的前三个核苷酸。在一些实施例中，上述同一性水平中的任一个为至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:201、204、207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个具有至少90％的同一性。前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸是从起始密码子(通常是ATG)的第一个核苷酸开始测量的，使得A是核苷酸1，T是核苷酸2等。在一些实施例中，所述开放阅读框在其序列的至少前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上与SEQ ID NO:201、204、207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个具有至少90％的同一性。所述ORF的序列长度是从起始密码子开始到终止密码子结束的核苷酸的数量，并且其序列的前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％对应于从起始密码子的第一个核苷酸开始的核苷酸数量，所述核苷酸数量构成总序列长度的指定百分比。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:243具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:243(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:244具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:244(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:256具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:256(即SEQ ID NO:204的ORF被SEQID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的替代性ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:257具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:257(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:258具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:258(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:259具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:259(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:260具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:260(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:261具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:261(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:376具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:376(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:377具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:377(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:378具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:378(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:379具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:379(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:380具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:380(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:381具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:381(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:382具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:382(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:383具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:383(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:384具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:384(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:385具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:385(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:207、209、210、211、212、214、215、217、218、220、221、223、224、226、227、229、230、250、252、254、265、266或307-375中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:243、244、256-61或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少95％。在一些实施例中，与SEQ ID NO:243、244、256-61或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少98％。在一些实施例中，与SEQ ID NO:243、244、256-61或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少99％。在一些实施例中，与SEQ ID NO:243、244、256-61或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为100％。
4.核酸、mRNA和ORF的另外特征
本文所述的任何另外特征可以在可行的程度上与上述任何实施例组合。
a)低尿苷含量
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述ORF的最小尿苷含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量等于所述ORF的最小尿苷含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的200％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到尿苷二核苷酸含量，所述尿苷二核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为0个尿苷三核苷酸到1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个或50个尿苷三核苷酸(其中尿苷的较长运行按其内独特的三个尿苷片段的数量计数，例如，一个尿苷四核苷酸含有两个尿苷三核苷酸，一个尿苷五核苷酸含有三个尿苷三核苷酸等)。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为0％尿苷三核苷酸到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％尿苷三核苷酸，其中尿苷三核苷酸的含量百分比被计算为形成尿苷三核苷酸的一部分(或尿苷的较长运行)的尿苷在序列中占据的位置的百分比，使得序列UUUAAA和UUUUAAAA各自将具有50％的尿苷三核苷酸含量。例如，在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，所述ORF不含尿苷三核苷酸。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷三核苷酸含量到尿苷三核苷酸含量，所述尿苷三核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
给定ORF可以降低尿苷含量或尿苷二核苷酸含量或尿苷三核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小尿苷密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小尿苷密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表6中列出的密码子。
表6.示例性最小尿苷密码子
Figure BDA0003377190340000871
Figure BDA0003377190340000881
在一些实施例中，所述ORF由密码子的集合组成，其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表6中列出的密码子。
b)低腺嘌呤和尿苷含量
在可行的范围内，本文所述的关于低腺嘌呤含量的任何特征可以与本文所述的关于低尿苷含量的任何特征组合。例如，可以提供对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸(例如mRNA)，所述核酸包括ORF，所述ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述ORF的最小尿苷含量的约150％(例如，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)，并且所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述ORF的最小腺嘌呤含量的约150％(例如，小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)。尿苷和腺嘌呤二核苷酸也是如此。类似地，所述ORF中尿苷核苷酸和腺嘌呤二核苷酸的含量可以如上所述。类似地，所述ORF中尿苷二核苷酸和腺嘌呤核苷酸的含量可以如上所述。
给定ORF可以降低尿苷和腺嘌呤核苷酸和/或二核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小尿苷和腺嘌呤密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小尿苷和腺嘌呤密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表7中列出的密码子。
表7.示例性最小尿苷和腺嘌呤密码子
氨基酸 最小尿苷密码子
A 丙氨酸 GCC或GCG
G 甘氨酸 GGC或GGG
V 缬氨酸 GUC或GUG
D 天冬氨酸 GAC
E 谷氨酸 GAG
I 异亮氨酸 AUC
T 苏氨酸 ACC或ACG
N 天冬酰胺 AAC
K 赖氨酸 AAG
S 丝氨酸 AGC或UCC或UCG
R 精氨酸 CGC或CGG
L 亮氨酸 CUG或CUC
P 脯氨酸 CCG或CCC
H 组氨酸 CAC
Q 谷氨酰胺 CAG
F 苯丙氨酸 UUC
Y 酪氨酸 UAC
C 半胱氨酸 UGC
W 色氨酸 UGG
M 甲硫氨酸 AUG
在一些实施例中，所述ORF由密码子的集合组成，其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表7中列出的密码子。从表7中可以看出，三个所列丝氨酸密码子中的每一个都含有一个A或一个U。在一些实施例中，通过使用丝氨酸的AGC密码子来优先化尿苷最小化。在一些实施例中，通过使用丝氨酸的UCC和/或UCG密码子来优先化腺嘌呤最小化。
c)UTR；Kozak序列
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括至少一个来自珠蛋白多核苷酸(例如，mRNA)，例如人α珠蛋白(HBA)多核苷酸(例如，mRNA)、人β珠蛋白(HBB)多核苷酸(例如，mRNA)或非洲爪蟾β珠蛋白(XBG)多核苷酸(例如，mRNA)的UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自珠蛋白多核苷酸(例如，mRNA)(如HBA、HBB或XBG)的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β肌动蛋白、α微管蛋白、肿瘤蛋白(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5'和3'UTR。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自相同来源(例如，组成性表达的多核苷酸(例如，mRNA)，如肌动蛋白、白蛋白或珠蛋白，如HBA、HBB或XBG)的5'和3'UTR。
在一些实施例中，本文公开的核酸包括与SEQ ID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR。在一些实施例中，本文公开的核酸包括与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。在一些实施例中，上述同一性水平中的任一个为至少95％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，本文公开的核酸包括具有SEQ ID NO:232、234、236、238或241中的任一个的序列的5'UTR。在一些实施例中，本文公开的核酸包括具有SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个的序列的3'UTR。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)不包括5'UTR，例如，在5'帽与起始密码子之间不存在另外的核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括在5'帽与起始密码子之间的Kozak序列(如下所述)，但是不具有任何另外的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)不包括3'UTR，例如，在终止密码子与poly-A尾之间不存在另外的核苷酸。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括Kozak序列。Kozak序列可能影响翻译起始和从核酸翻译的多肽的总产率。Kozak序列包含可以作为起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下中的至少一项为真：第一个N是A或G，并且第二个N是G。在核苷酸序列的上下文中，R表示嘌呤(A或G)。在一些实施例中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个或两个错配到小写位置的rccRUGg。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个或两个错配到小写位置的rccAUGg。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个或三个错配到小写位置的gccRccAUGG(SEQ ID NO:305的核苷酸4-13)。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个、三个或四个错配到小写位置的gccAccAUG。在一些实施例中，Kozak序列是GCCACCAUG。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个、三个或四个错配到小写位置的gccgccRccAUGG(SEQ ID NO:305)。
d)Poly-A尾
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)进一步包括多腺苷酸化(poly-A)尾。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾内的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚定”所“中断”。poly-A尾可以包括至少8个连续的腺嘌呤核苷酸，但也包括一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所使用的，“非腺嘌呤核苷酸”指代不包括腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸是示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的多核苷酸(例如，mRNA)上的poly-A尾可以包括位于对RNA引导的DNA结合剂和所关注的序列进行编码的核苷酸的3'处的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，多核苷酸(例如，mRNA)上的poly-A尾包括位于对RNA引导的DNA结合剂或所关注的序列进行编码的核苷酸的3'处的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔开的间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，poly-A尾在用于对mRNA进行体外转录的质粒中编码并成为转录物的一部分。在质粒中编码的poly-A序列，即poly-A序列中连续腺嘌呤核苷酸的数量可能不准确，例如，质粒中的100个poly-A序列可能不会导致转录的mRNA中精确的100个poly-A序列。在一些实施例中，poly-A尾不在质粒中编码，而是通过PCR加尾或酶加尾(例如，使用大肠杆菌(E.coli)poly(A)聚合酶)添加。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸被定位成中断连续腺嘌呤核苷酸，使得poly(A)结合蛋白可以与一段连续的腺嘌呤核苷酸结合。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-100个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸在一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个腺嘌呤核苷酸之后，并且随后是至少8个连续腺嘌呤核苷酸。
本公开的poly-A尾可以包括一个连续腺嘌呤核苷酸序列，随后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸，任选地随后是另外的腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，poly-A尾包括或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一段连续的2-10个非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些情况下，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况下，所述非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在一些情况下，当存在多于一个非腺嘌呤核苷酸时，所述非腺嘌呤核苷酸可以选自：a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。包括非腺嘌呤核苷酸的示例性poly-A尾提供为SEQ ID NO:262。
e)经修饰的核苷酸
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸在一些或所有尿苷位置处包括经修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在5位置处例如用卤素或C1-C3烷氧基修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在1位置处例如用C1-C3烷基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可以是例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施例中，所述核酸中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置是经修饰的尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是经修饰的尿苷，例如，5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或其组合。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-碘尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-甲氧基尿苷，并且其余是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-碘尿苷，并且其余是N1-甲基假尿苷。
f)5'帽
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸(例如，mRNA)包括5'帽，如帽0、帽1或帽2。5'帽通常是通过5'-三磷酸与核酸的5'到3'链的第一核苷酸(也就是说，第一帽近端核苷酸)的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可以被进一步修饰，如下文例如关于ARCA所讨论的)。在帽0中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者均包括2'-羟基。在帽1中，mRNA的第一转录核苷酸和第二转录核苷酸的核糖分别包括2'-甲氧基和2'-羟基。在帽2中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者均包括2'-甲氧基。参见例如Katibah等人,(2014)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》111(33):12025-30；Abbas等人,(2017)《美国国家科学院院刊》114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核mRNA(包含哺乳动物核酸，如人核酸)包括帽1或帽2。帽0和其它不同于帽1和帽2的帽结构在如人等哺乳动物中可能是免疫原性的，因为先天免疫系统的组分(如IFIT-1和IFIT-5)将其识别为“非自身”，这可能导致包含I型干扰素的细胞因子水平升高。先天免疫系统的组分(如IFIT-1和IFIT-5)还可以与eIF4E竞争与除了帽1或帽2之外的帽结合核酸，从而潜在地抑制mRNA的翻译。
帽可以共转录地包含在RNA中。例如，ARCA(抗反向帽类似物；赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，目录号：AM8045)是包括与可以在开始时在体外掺入转录物中的鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物。ARCA产生帽0帽，其中第一个帽近端核苷酸的2'位置是羟基。参见例如，Stepinski等人,(2001)“含有新颖“抗反向”帽类似物7-甲基(3'-O-甲基)GpppG和7-甲基(3'脱氧)GpppG的mRNA的合成和性质(Synthesis and properties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and7-methyl(3'deoxy)GpppG)”,RNA 7:1486-1495。ARCA结构如下所示。
Figure BDA0003377190340000941
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink生物技术有限公司(TriLinkBiotechnologies),目录号：N-7113或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink生物技术有限公司,目录号：N-7133可以用于共转录地提供帽1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化型式还可以分别从TriLink生物技术有限公司，目录号N-7413和N-7433获得。CleanCapTM AG结构如下所示。CleanCapTM结构有时在本文中使用上面列出的目录号的最后三位数字来表示(例如，“CleanCapTM 113”代表TriLink生物技术有限公司，目录号：N-7113)。
Figure BDA0003377190340000942
可替代地，可以在转录后向RNA添加帽。例如，牛痘封端酶可商购(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，目录号：M2080S)并且具有由其D1亚基提供的RNA三磷酸酶和尿苷转移酶活性及其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶。如此，所述牛痘封端酶可以在存在S-腺苷甲硫氨酸和GTP的情况下向RNA添加7-甲基鸟嘌呤，以提供帽0。参见例如：Guo,P.和Moss,B.(1990)《美国国家科学院院刊》,,87,4023-4027；Mao,X.和Shuman,S.(1994)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269,24472-24479。有关帽和封端方法的另外讨论，参见例如WO2017/053297和Ishikawa等人,《核酸研讨会系列(Nucl.Acid.Symp.Ser.)》(2009)第53期,129-A130。
F.测定RNA的功效
在一些实施例中，当与其它组分(例如，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，如本文所述的任何组分)一起递送时测定gRNA的功效。在一些实施例中，测定了皮质类固醇和gRNA以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的组合的功效。
如本文所述，使用本文公开的RNA引导的DNA结合剂和向导RNA可能导致DNA中的双链断裂，这可以在通过细胞机制进行修复时产生插入/缺失(插入缺失)突变形式的错误。许多由于插入缺失造成的突变改变开放阅读框或引入提前终止密码子，并且因此产生非功能性蛋白。
在一些实施例中，基于体外模型测定了特定gRNA、组合物或包括施用gRNA、皮质类固醇以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的治疗的功效。在一些实施例中，所述体外模型是HEK293细胞。在一些实施例中，所述体外模型是HUH7人肝癌细胞。在一些实施例中，体外模型是HepG2细胞。在一些实施例中，体外模型是原代人肝细胞。在一些实施例中，体外模型是原代食蟹猴肝细胞。关于使用原代人肝细胞，可以使用可商购的原代人肝细胞以在实验之间提供更大的一致性。在一些实施例中，例如通过分析来自用Cas9 mRNA和引导RNA在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来测定缺失或插入在体外模型中(例如，在原代人肝细胞中)发生的脱靶位点的数量。在一些实施例中，此类测定包括分析来自用Cas9 mRNA、引导RNA和供体寡核苷酸在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA。以下工作实例中提供了用于此类测定的示例性程序。
在一些实施例中，通过用于gRNA选择过程的多个体外细胞模型测定特定gRNA、组合物或包括施用gRNA、皮质类固醇以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的治疗的功效。在一些实施例中，执行数据与所选gRNA的细胞系比较。在一些实施例中，执行跨多个细胞模型中的交叉筛选。
在一些实施例中，基于体内模型测定了特定gRNA、组合物或包括施用gRNA、皮质类固醇以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的治疗的功效。在一些实施例中，体内模型是啮齿动物模型。在一些实施例中，啮齿动物模型是表达人TTR基因的小鼠，所述人TTR基因可以是突变人TTR基因。在一些实施例中，体内模型是非人灵长类动物，例如食蟹猴。
在一些实施例中，通过TTR编辑百分比测量向导RNA、组合物或包括施用gRNA、皮质类固醇以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的治疗的功效。在一些实施例中，将TTR的编辑百分比与实现TTR蛋白的敲低所必需的编辑百分比进行比较，例如，在体外模型的情况下在细胞培养基中或在体内模型的情况下在血清或组织中。
在一些实施例中，通过靶细胞类型的基因组内的脱靶序列处的插入缺失的数量和/或频率测量gRNA、组合物或包括施用gRNA、皮质类固醇以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对此类药剂进行编码的核酸的治疗的功效。在一些实施例中，提供了在细胞群体中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率以非常低的频率(例如，<5％)在脱靶位点处产生插入缺失的有效向导RNA。因此，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出脱靶插入缺失形成或在细胞群体中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率产生<5％的脱靶插入缺失形成的频率的引导RNA。在一些实施例中，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出任何脱靶插入缺失形成的向导RNA。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于5个脱靶位点处产生插入缺失的向导RNA。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于或等于4个、3个、2个或1个脱靶位点处产生插入缺失的向导RNA。在一些实施例中，一个或多个脱靶位点不出现在靶细胞(例如，肝细胞)基因组中的蛋白质编码区中。
在一些实施例中，检测基因编辑事件(如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件)利用使用标记引物进行的线性扩增并使标记的扩增产物分离(本文此后称为“LAM-PCR”，或“线性扩增(LA)”方法)，如WO2018/067447或Schmidt等人,《自然方法》4:1051-1057(2007)中所述。
在一些实施例中，所述方法包括：从已被诱导具有双链断裂(DSB)并且任选地已提供HDR模板来修复DSB的细胞中分离细胞DNA；用标记引物对DNA进行至少一个周期的线性扩增；分离包括标签的线性扩增产物，由此丢弃用无标记引物扩增的任何扩增产物；任选地进一步扩增分离的产物；以及分析线性扩增产物或进一步扩增的产物，以测定编辑事件的存在或不存在，例如靶DNA中的双链断裂、插入、缺失或HDR模板序列。在一些情况下，编辑事件可以被定量。本文使用的定量等(包含在HDR和非HDR编辑事件(如插入缺失)的上下文中)包含检测群体中的编辑事件的频率和/或类型。
在一些实施例中，仅进行一个周期的线性扩增。
在一些情况下，所述标记引物包括分子条形码。在一些实施例中，所述标记引物包括分子条形码，并且仅进行一个周期的线性扩增。
在一些实施例中，检测基因编辑事件，如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，进一步包括对线性扩增的产物或进一步扩增的产物进行测序。测序可以包括本领域技术人员已知的任何方法，包含下一代测序以及将线性扩增产物或进一步扩增的产物克隆到质粒中并对质粒或质粒的一部分进行测序。示例性下一代测序方法在例如Shendure等人,《自然(Nature)》26:1135-1145(2008)中进行了讨论。在其它方面，检测基因编辑事件，如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，进一步包括对线性扩增的产物或进一步扩增的产物执行数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)，或者使线性扩增的产物或进一步扩增的产物与被设计成鉴定包括HDR模板序列的DNA的核酸探针接触，并检测已与线性扩增的产物或进一步扩增的产物结合的探针。在一些实施例中，所述方法进一步包括测定HDR模板在靶DNA中的位置。
在某些实施例中，所述方法进一步包括测定靶DNA中插入位点的序列，其中所述插入位点是HDR模板并入到靶DNA中的位置，并且其中所述插入位点可以包含一些靶DNA序列和一些HDR模板序列。
在一些实施例中，向导RNA或组合的功效是通过TTR的分泌来测量的。在一些实施例中，使用利用细胞培养基或血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定测量TTR的分泌。在一些实施例中，在用于测量编辑的相同体外或体内系统或模型中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在原代人肝细胞中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在HUH7细胞中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在HepG2细胞中测量TTR的分泌。
本领域技术人员通常已知ELISA测定，并且可以设计用于测定血清TTR水平。在一个示例性实施例中，收集血液并分离血清。可以使用小鼠前白蛋白(运甲状腺素蛋白)ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司(Aviva Systems Biology)，目录OKIA00111)或用于测量人TTR的类似试剂盒来测定总TTR血清水平。如果没有可用的试剂盒，则可以使用预先涂有对正在测量的TTR具有特异性的捕获抗体的板来开发ELISA。接下来将板在室温下温育一段时间，之后进行洗涤。添加酶-抗TTR抗体缀合物并温育。去除未结合的抗体缀合物并洗涤板，之后添加与酶反应的显色底物溶液。在对所使用的酶和底物具有特异性的吸光度下在适当的读板仪上读取所述板。
在一些实施例中，细胞(包含来自组织的细胞)中的TTR的量测量gRNA或组合的功效。在一些实施例中，使用蛋白质印迹测量细胞中的TTR的量。在一些实施例中，所使用的细胞是HUH7细胞。在一些实施例中，所使用的细胞是原代人肝细胞。在一些实施例中，所使用的细胞是从动物获得的原代细胞。在一些实施例中，将TTR的量与甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPDH(管家基因)的量进行比较以控制细胞数量的变化。
III.LNP调配物和ATTR的治疗
在一些实施例中，提供了一种治疗ATTR的方法，所述方法包括施用皮质类固醇和包括本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以治疗ATTR。所述向导RNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如Cas9))或本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸或载体一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种治疗ATTR的方法，所述方法包括施用皮质类固醇和包括本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以治疗ATTR。所述向导RNA可以任选地与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如Cas9))或本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸或载体一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括施用本文所述的皮质类固醇和向导RNA，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括施用如本文所述的向导RNA，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述向导RNA可以任选地与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如Cas9))或本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸或载体一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用皮质类固醇和包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用皮质类固醇和包括SEQ IDNO:87-113的sgRNA中的任何一个或多个的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA任选地与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体任选地一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID NO:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述向导RNA可以任选地与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如Cas9))或本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸或载体一起施用。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是Cas切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，包括表1的向导序列的gRNA或来自表2中的一个或多个sgRNA与RNA引导的DNA核酸酶(如从核酸翻译的Cas核酸酶)一起诱导DSB，并且修复期间的非同源端接合(NHEJ)导致TTR基因中的突变。在一些实施例中，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入，这在TTR基因中诱导移码或无义突变。
在一些实施例中，施用皮质类固醇和向导RNA(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)(例如，本文提供的组合物中)降低受试者的TTR的水平(例如，血清水平)，并且因此预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集。
在一些实施例中，减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积包括减少或预防TTR在受试者的一个或多个组织(如胃、结肠或神经组织)中沉积。在一些实施例中，神经组织包括坐骨神经或背根神经节。在一些实施例中，在胃、结肠、背根神经节和坐骨神经中的两个、三个或四个中的TTR沉积减少。给定组织中的沉积水平可以使用活检样本(例如使用免疫染色)测定。在一些实施例中，基于降低血清TTR水平持续一段时间来推断减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和/或减少或预防TTR沉积。如在实例中所讨论的，已经发现，根据本文所提供的方法和用途降低血清TTR水平可能导致从组织(如上文和实例中所讨论的组织)中清除沉积的TTR，例如，如在施用所述组合物后8周测量的。
在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是牛、猪、猴、羊、狗、猫、鱼或家禽。
在一些实施例中，提供了如本文所述的一个或多个例如包括(例如，在本文所提供的组合物中的)表1中的向导序列中的任何一个或多个或来自表2的一个或多个sgRNA的向导RNA和本文所述的对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸(例如，mRNA)的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是Cas9，例如酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。
在一些实施例中，包括向导RNA和核酸的组合物是静脉内施用的。在一些实施例中，将包括向导RNA和核酸的组合物施用于肝循环中。
在一些实施例中，单次施用包括本文提供的向导RNA(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)的组合物足以敲低突变型蛋白的表达。在一些实施例中，单次施用包括本文提供的向导RNA(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)的组合物足以敲除突变型蛋白在细胞群体中的表达。在其它实施例中，多于一次施用包括本文提供的向导RNA(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)的组合物可能有益于通过累积效应使编辑最大化。例如，本文提供的组合物可以施用2次、3次、4次、5次或更多次，如2次。施用可以间隔范围为例如1天到2年，如1到7天、7到14天、14天到30天、30天到60天、60天到120天、120天到183天、183天到274天、274天到366天或366天到2年的时间段。
在一些实施例中，以范围为0.01到10mg/kg(mpk)，例如0.01到0.1mpk、0.1到0.3mpk、0.3到0.5mpk、0.5到1mpk、1到2mpk、2到3mpk、3到5mpk、5到10mpk或0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5或10mpk的有效量施用组合物。在一些实施例中，以2-4mpk(如2.5-3.5mpk)的量施用组合物。在一些实施例中，以约3mpk的量施用组合物。如本文所报告的，对于LNP组合物，剂量或有效量通过所施用的总RNA来评估。
在一些实施例中，在递送后1年、2年、3年、4年、5年或10年看到用本发明的组合物治疗的功效。在一些实施例中，通过测量治疗前后TTR的血清水平来评估用本发明的组合物治疗的功效。在一些实施例中，在1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月时看到通过降低TTR的血清水平评估的用组合物治疗的功效。
在一些实施例中，治疗减缓或停止疾病进展。
在一些实施例中，治疗减缓或停止FAP的进展。在一些实施例中，治疗使感觉运动神经病变或自主神经病变的症状变化改善、稳定或减缓。
在一些实施例中，治疗使FAC的症状变化改善、稳定或减缓。在一些实施例中，治疗使限制性心肌病或充血性心力衰竭的症状变化改善、稳定或减缓。
在一些实施例中，治疗功效是通过增加受试者的存活时间来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过增加治疗的耐受性来测量的。在一些实施例中，测量增加的耐受性，例如细胞因子、补体或其它免疫应答。
在一些实施例中，治疗功效是通过感觉运动或自主神经病变的症状进展的改善或减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过移动身体部位或感觉任何身体部位的能力的增加或降低的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过以下能力的改善或降低的减缓来测量的：吞咽；呼吸；使用手臂、手、腿或脚；或行走；在一些实施例中，治疗功效是通过神经痛的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，神经痛的特征在于疼痛、灼伤、刺痛或异常感觉。在一些实施例中，治疗功效是通过体位性低血压、头晕、胃肠动力障碍、膀胱功能障碍或性功能障碍的改善或增加的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过虚弱的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过使用肌电图、神经传导测试或患者报告的结果来测量的。
在一些实施例中，治疗功效是通过充血性心力衰竭或CHF的症状的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过呼吸短促、呼吸困难、疲劳或脚踝、脚、腿、腹部或颈部静脉的肿胀的减少或增加的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过体内积液的改善或进展的减缓来测量的，这可以通过如体重增加、尿频或夜间咳嗽等量度来评估。在一些实施例中，治疗功效是使用心脏生物标志物测试(如B型利钠肽[BNP]或N端前b型利钠肽[NT-proBNP])、肺功能测试、胸部X光片或心电图来测量的。
A.组合疗法
在一些实施例中，本发明包括包含施用皮质类固醇和包括表1中公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导DNA结合剂进行编码的核酸，如本文所述的对酿脓链球菌Cas9进行编码的核酸(例如，mRNA)或载体)(例如，在本文所提供的组合物中)的组合疗法连同适于缓解ATTR的症状的额外疗法。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，ATTR的额外疗法是对感觉运动或自主神经病变的治疗。在一些实施例中，对感觉运动或自主神经病变的治疗是非甾体抗炎药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗心律失常药或麻醉剂。在一些实施例中，抗抑郁药是三环剂或血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂。在一些实施例中，抗抑郁药是阿米替林、度洛西汀或文拉法辛。在一些实施例中，抗惊厥剂是加巴喷丁、普瑞巴林、托吡酯或卡马西平。在一些实施例中，对感觉运动神经病变的额外治疗是经皮电神经刺激。
在一些实施例中，ATTR的额外疗法是对限制性心肌病或充血性心力衰竭(CHF)的治疗。在一些实施例中，对CHF的治疗是ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂、血管紧张素受体阻断剂、β阻断剂、地高辛、利尿剂或硝酸异山梨酯/盐酸肼苯哒嗪。在一些实施例中，所述ACE抑制剂是依那普利、卡托普利、雷米普利、培哚普利、咪达普利或喹那普利。在一些实施例中，所述醛固酮拮抗剂是依普利酮或螺内酯。在一些实施例中，所述血管紧张素受体阻断剂是阿齐沙坦、卡沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦。在一些实施例中，所述β受体阻断剂是醋丁洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈比洛尔或普萘洛尔。在一些实施例中，所述利尿剂是氯噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪、吲达帕胺、美托拉宗、布美他尼、呋塞米、托拉塞米、阿米洛利或氨苯喋啶。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用皮质类固醇和包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的任何一个gRNA或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或本文所述的对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)(例如，在本文所提供的组合物中)连同靶向TTR或突变型TTR的siRNA。在一些实施例中，所述siRNA是能够进一步减少或消除野生型或突变型TTR表达的任何siRNA。在一些实施例中，所述siRNA是药物帕替西朗(Patisiran)(ALN-TTR02)或ALN-TTRsc02。在一些实施例中，在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(例如，在本文所提供的组合物中)之后施用siRNA。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何组合物治疗后，定期施用siRNA。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用皮质类固醇和包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或本文所述的对RNA引导DNA结合剂进行编码的核酸)(例如，在本文所提供的组合物中)连同靶向TTR或突变型TTR的反义核苷酸。在一些实施例中，所述反义核苷酸是能够进一步减少或消除野生型或突变型TTR表达的任何反义核苷酸。在一些实施例中，所述反义核苷酸是药物Inotersen(IONS-TTRRx)。在一些实施例中，在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及对RNA引导的DNA结合剂(例如，在本文所提供的组合物中)进行编码的核酸之后施用所述反义核苷酸。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何gRNA组合物治疗后，定期施用反义核苷酸。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用皮质类固醇和包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(以及任选地RNA引导的DNA结合剂或本文所述的对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸)(例如，在本文所提供的组合物中)连同促进正确折叠的四聚体形式的TTR的动力学稳定的小分子稳定剂。在一些实施例中，所述小分子稳定剂是药物塔发米蒂斯(tafamidis)
Figure BDA0003377190340001051
或二氟尼柳。在一些实施例中，所述小分子稳定剂是在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(例如，在本文所提供的组合物中)之后施用的。在一些实施例中，在用本文所提供的任何组合物治疗后，定期施用小分子稳定剂。
在上述任一实施例中，表1中所公开的向导序列可以选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82，和/或表2中的sgRNA可以选自SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124，和/或向导RNA可以是经化学修饰的向导RNA。
B.核酸组合物的递送
在一些实施例中，本文所述的包括gRNA以及任选地本文所述的将RNA引导的DNA结合剂编码为RNA或编码在一个或多个载体上的核酸的核酸组合物在脂质纳米颗粒中调配或通过脂质纳米颗粒施用；参见例如于2017年10月5日公开的WO2017173054A1和于2019年4月4日公开的WO 2019067992A1，其内容特此以全文引用的方式并入。本领域技术人员已知能够向受试者递送核苷酸的任何脂质纳米颗粒(LNP)可以与本文所述的向导RNA以及任选地对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸一起使用。
本文公开了用于RNA的LNP调配物的各个实施例，包含CRISPR/Cas货物。此类LNP调配物可以包含：(i)CCD脂质，如胺脂质；(ii)中性脂质；(iii)辅助脂质；以及(iv)隐形脂质，如PEG脂质。LNP调配物的一些实施例包含“胺脂质”以及辅助脂质、中性脂质和隐形脂质(如PEG脂质)。在一些实施例中，所述LNP调配物包含少于1％的中性磷脂。在一些实施例中，所述LNP调配物包含少于0.5％的中性磷脂。“脂质纳米颗粒”意指包括多个(即，多于一个)通过分子间作用力物理地相互关联的脂质分子的颗粒。
CCD脂质
用于向靶细胞(如肝脏细胞)递送CRISPR/Cas mRNA和向导RNA组分的脂质组合物包括CCD脂质。
在一些实施例中，CCD脂质是脂质A，所述脂质A为十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可以描述为：
Figure BDA0003377190340001061
可以根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成脂质A。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质B，所述脂质B为((5-((二甲基氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,1-二基)双(癸酸酯)，也被称为((5-((二甲基氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,1-二基)双(癸酸酯)。脂质B可以描述为：
Figure BDA0003377190340001062
可以根据WO2014/136086(例如，第107-09页)合成脂质B。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质C，所述脂质C为2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八烷基-9,12-二烯酸酯)。脂质C可以描述为：
Figure BDA0003377190340001063
在一些实施例中，CCD脂质为脂质D，所述脂质D为3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯。
脂质D可以描述为：
Figure BDA0003377190340001071
可以根据WO2015/095340合成脂质C和脂质D。
CCD脂质也可以是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D的等效物。在某些实施例中，CCD脂质是脂质A的等效物、脂质B的等效物、脂质C的等效物或脂质D的等效物。
胺脂质
在一些实施例中，用于递送生物活性剂的LNP组合物包括“胺脂质”，所述胺脂质被定义为脂质A、脂质B、脂质C、脂质D或脂质A的等效物(包含脂质A的缩醛类似物)、脂质B的等效物、脂质C的等效物和脂质D的等效物。
在一些实施例中，胺脂质是脂质A，所述脂质A为十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可以描述为：
Figure BDA0003377190340001072
可以根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成脂质A。在某些实施例中，所述胺脂质是脂质A的等效物。
在某些实施例中，胺脂质是脂质A的类似物。在某些实施例中，脂质A类似物是脂质A的缩醛类似物。在特定的LNP组合物中，所述缩醛类似物是C4-C12缩醛类似物。在一些实施例中，所述缩醛类似物是C5-C12缩醛类似物。在另外的实施例中，所述缩醛类似物是C5-C10缩醛类似物。在另外的实施例中，所述缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12缩醛类似物。
适用于在本文所述的LNP中使用的胺脂质在体内是可生物降解的并且适于将生物活性剂(如RNA)递送到细胞。所述胺脂质具有低毒性(例如，以大于或等于10mg/kg的RNA货物的量在动物模型中可耐受，而无副作用)。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少75％的胺脂质在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少50％的mRNA或gRNA在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少50％的LNP在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP，例如通过测量脂质(例如，胺脂质)、RNA(例如，mRNA)或另一组分。在某些实施例中，测量LNP的脂质包封相对于游离脂质、RNA或核酸组分。
脂质清除率可以按文献所述进行测量。参见Maier,M.A.等人,可生物降解的脂质使得能够快速消除脂质纳米颗粒以进行RNAi治疗剂的全身递送(Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics),《分子疗法(Mol.Ther.)》2013,21(8),1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，含有荧光素酶靶向性siRNA的LNP-siRNA系统以0.3mg/kg通过侧尾静脉以静脉内团注注射的方式施用于六到八周大的雄性C57Bl/6小鼠。在给药后0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时和168小时采集血液、肝脏和脾脏样品。在组织采集前向小鼠灌注生理盐水，并处理血液样品以获得血浆。所有样品均通过LC-MS进行处理和分析。此外，Maier描述了评估LNP-siRNA调配物施用后毒性的程序。例如，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)通过单次静脉内团注注射向雄性斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley rat)施用剂量体积为5mL/kg的荧光素酶靶向性siRNA。24小时后，从有意识的动物的颈静脉抽取约1mL血液并分离血清。在给药后72小时，对所有动物实施安乐死以进行尸检。执行对临床体征、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评估。尽管Maier描述了用于评估siRNALNP调配物的方法，但这些方法可以用于评估本公开的LNP组合物的清除率、药代动力学和施用毒性。
所述胺脂质可能导致清除率增加。在一些实施例中，所述清除率是脂质清除率，例如从血液、血清或血浆中清除脂质的速率。在一些实施例中，所述清除率是RNA清除率，例如从血液、血清或血浆中清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施例中，所述清除率是从血液、血清或血浆中清除LNP的速率。在一些实施例中，所述清除率是从组织(如肝脏组织或脾脏组织)中清除LNP的速率。在某些实施例中，高清除率导致没有实质性不良影响的安全特性。所述胺脂质可以减少循环和组织中LNP的累积。在一些实施例中，循环和组织中LNP累积的减少导致没有实质性不良影响的安全特性。
本公开的胺脂质是可电离的(例如，可以形成盐)，这取决于它们所处介质的pH值。例如，在微酸介质中，所述胺脂质可能被质子化并且因此带正电荷。相反，在弱碱性介质中，例如在pH为大约7.35的血液中，所述胺脂质可能不会被质子化并且因此不带电荷。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约10的pH下质子化。
胺脂质主要质子化时的pH值与其固有的pKa有关。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.1到约7.4。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.5到约6.6。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.6到约6.4。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.8到约6.2。例如，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.8到约6.5。胺脂质的pKa可以是调配LNP的重要考虑因素，因为已经发现范围为约5.1到约7.4的pKa的阳离子脂质可以有效地在体内递送货物，例如递送到肝脏。此外，已经发现，范围为约5.3到约6.4的pKa的阳离子脂质可以有效地在体内递送，例如递送到肿瘤。参见例如WO 2014/136086。
另外的脂质
适用于本公开的脂质组合物的“中性脂质”包含例如多种中性、不带电荷或两性离子脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包含但不限于5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二二十碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺和其组合。在一个实施例中，中性磷脂可以选自由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)组成的组。在另一个实施例中，中性磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。在另一个实施例中，中性磷脂可以是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
“辅助脂质”包含类固醇、甾醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包含但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施例中，所述辅助脂质可以是胆固醇。在一个实施例中，辅助脂质可以是胆固醇半琥珀酸酯。
“隐形脂质”是改变纳米颗粒在体内(例如在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制粒度来帮助调配过程。本文所使用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学性质。适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质包含但不限于具有连接到脂质部分的亲水性头基的隐形脂质。可以在Romberg等人,《药学研究(PharmaceuticalResearch)》,第25卷第1期,2008,第55-71页以及Hoekstra等人,《生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)》1660(2004)41-52中找到适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质以及关于此类脂质的生物化学的信息。例如，在WO 2006/007712中公开了另外的合适的PEG脂质。
在一个实施例中，所述隐形脂质的亲水性头基包括选自基于PEG的聚合物的聚合物部分。隐形脂质可以包括脂质部分。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG脂质。PEG脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制粒径来帮助调配过程。本文所使用的PEG脂质可以调节LNP的药代动力学性质。通常，PEG脂质包括脂质部分和基于PEG的聚合物部分。
在一个实施例中，隐形脂质包括选自以下的聚合物部分：基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。
在一个实施例中，所述PEG脂质包括基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物部分。
所述PEG脂质进一步包括脂质部分。在一些实施例中，脂质部分可以源自二酰基甘油或二烷基甘酰胺，其包含包括二烷基甘油或二烷基甘酰胺基团的那些，所述二烷基甘油或二烷基甘酰胺基团具有独立地包括约C4到约C40个饱和或不饱和碳原子的烷基链长度，其中链可以包括一个或多个官能团，例如酰胺或酯。在一些实施例中，烷基链长度包括约C10到C20。二酰基甘油或二烷基甘酰胺基团可以进一步包括一个或多个经取代的烷基。链长度可以是对称的或不对称的。
除非另有说明，本文所使用的，术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其它聚亚烷基醚聚合物。在一个实施例中，PEG是乙二醇或环氧乙烷的任选地经取代的线性或支化聚合物。在一个实施例中，PEG是未经取代的。在一个实施例中，所述PEG例如被一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一个实施例中，所述术语包含PEG共聚物，如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,聚(乙二醇)化学：生物技术和生物医学应用(Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications)(1992))；在另一个实施例中，所述术语不包含PEG共聚物。在一个实施例中，所述PEG的分子量为约130到约50,000，在子实施例中为约150到约30,000，在子实施例中为约150到约20,000，在子实施例中为约150到约15,000，在子实施例中为约150到约10,000，在子实施例中为约150到约6,000，在子实施例中为约150到约5,000，在子实施例中为约150到约4,000，在子实施例中为约150到约3,000，在子实施例中为约300到约3,000，在子实施例中为约1,000到约3,000，并且在子实施例中为约1,500到约2,500。
在某些实施例中，所述PEG(其例如与脂质部分或脂质，如隐形脂质缀合)是“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，所述PEG的平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n为45，这意味着数均聚合度包括约45个亚基。然而，可以使用本领域已知的其它PEG实施例，包含例如其中数均聚合度包括约23个亚基(n＝23)和/或68个亚基(n＝68)的那些实施例。在一些实施例中，n可以在约30到约60的范围内。在一些实施例中，n可以在约35到约55的范围内。在一些实施例中，n可以在约40到约50的范围内。在一些实施例中，n可以在约42到约48的范围内。在一些实施例中，n可以为45。在一些实施例中，R可以选自H、经取代的烷基和未经取代的烷基。在一些实施例中，R可以是未经取代的烷基。在一些实施例中，R可以是甲基。
在本文所述的任一实施例中，所述PEG脂质可以选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(来自日本东京NOF的目录号GM-020)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(日本东京NOF的目录号DSPE-020CN)、PEG-二月桂酰甘氨酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘氨酰胺、PEG-二棕榈甘氨酰胺和PEG-二硬脂酰甘氨酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺-3',6'-二氧杂辛酰]氨甲酰-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二十四碳烯氧基苄基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(来自美国阿拉巴马州阿拉巴斯特AvantiPolar Lipids公司(Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)的目录号880120C)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，日本东京NOF)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DMG。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSG。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSPE。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DMA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C-DMA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是在WO2016/010840(第[00240]段到[00244]段)中公开的化合物S027。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C11。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C14。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C16。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C18。
LNP调配物
LNP可以含有：(i)用于包封和用于内体逃逸的胺脂质；(ii)用于稳定的中性脂质；(iii)也用于稳定的辅助脂质；以及(iv)隐形脂质，如PEG脂质。所述中性脂质可以省略。
在一些实施例中，LNP组合物可以包括RNA组分，所述RNA组分包含以下中的一种或多种：RNA引导的DNA结合剂、Cas核酸酶mRNA、第2类Cas核酸酶mRNA、Cas9 mRNA和gRNA。在一些实施例中，LNP组合物包含对第2类Cas核酸酶(例如，酿脓链球菌Cas9)进行编码的mRNA和作为RNA组分的gRNA。在某些实施例中，LNP组合物可以包括RNA组分、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些LNP组合物中，所述辅助脂质是胆固醇。在其它组合物中，所述中性脂质是DSPC。在另外的实施例中，所述隐形脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，所述LNP组合物包括脂质A或脂质A的等效物；辅助脂质；中性脂质；隐形脂质；以及向导RNA。在某些组合物中，所述胺脂质是脂质A。在某些组合物中，所述胺脂质是脂质A或其缩醛类似物；所述辅助脂质是胆固醇；所述中性脂质是DSPC；并且所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
在某些实施例中，根据调配物中的组分脂质的相应摩尔比描述脂质组合物。本公开的实施例提供根据调配物中的组分脂质的相应摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约30mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约40mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约45mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约55mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％到约55mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约55mol％。在一些实施例中，LNP批次的胺脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次的胺脂质mol％将为目标mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。所有mol％数均作为所述LNP组合物的脂质组分的分数给出。在某些实施例中，胺脂质mol％的LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％到约15mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约7mol％到约12mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％到约5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约8mol％到约10mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％或约15mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约9mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约1mol％到约5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质的mol％可以为约0.1mol％到约1mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(如中性磷脂)的mol％可以为约0.1mol％、约0.2mol％、约0.5mol％,1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％或约5mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以小于约1mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以小于约0.5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％、约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％或约1mol％。在一些实施例中，本文公开的调配物不含中性脂质(即，0mol％中性脂质)。在一些实施例中，本文公开的调配物基本上不含中性脂质(即，约0mol％中性脂质)。在一些实施例中，本文公开的调配物不含中性磷脂(即，0mol％中性磷脂)。在一些实施例中，本文公开的调配物基本上不含中性磷脂(即，约0mol％中性磷脂)。
在一些实施例中，LNP批次的中性脂质mol％将为目标中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约20mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约55mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约50mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约40mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约30mol％到约50mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约30mol％到约40mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质、中性脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到100mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到100mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到至少99mol％。在一些实施例中，LNP批次的辅助mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约1mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约8mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约4mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2.5mol％到约4mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约3mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2.5mol％。在一些实施例中，LNP批次的PEG脂质mol％将为目标PEG脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在某些实施例中，货物包含对RNA引导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶、第2类Cas核酸酶或Cas9)进行编码的核酸和gRNA或对gRNA进行编码的核酸或mRNA和gRNA的组合。在一个实施例中，LNP组合物可以包括脂质A或其等效物。在一些方面，所述胺脂质是脂质A。在一些方面，所述胺脂质是脂质A等效物，例如脂质A的类似物。在某些方面，所述胺脂质是脂质A的缩醛类似物。在各个实施例中，所述LNP组合物包括胺脂质、中性脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在特定实施例中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，LNP组合物可以包括脂质A、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括胺脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括包含DMG的PEG脂质。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和脂质A的等效物，包含脂质A的缩醛类似物。在另外的实施例中，LNP组合物包括脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质、中性磷脂和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括由以下组成的脂质组分：胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施例中，LNP组合物不包括中性脂质，如中性磷脂。在各个实施例中，LNP组合物包括由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成的脂质组分。在某些实施例中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：DSPC、DPPC、DAPC、DMPC、DOPC、DOPE和DSPE。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DPPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DAPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DMPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DOPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DOPE。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPE。在某些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在特定实施例中，所述PEG脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，LNP组合物可以包括脂质A、辅助脂质和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物可以包括由脂质A、辅助脂质和PEG脂质组成的脂质组分。在一些实施例中，LNP组合物包括胺脂质、胆固醇和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括由胺脂质、胆固醇和PEG脂质组成的脂质组分。在一些实施例中，LNP组合物包括包含DMG的PEG脂质。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和脂质A的等效物，包含脂质A的缩醛类似物。在某些实施例中，所述胺脂质是脂质A的C5-C12或C4-C12缩醛类似物。在另外的实施例中，LNP组合物包括脂质A、胆固醇和PEG2k-DMG。
本公开的实施例还提供了根据胺脂质的带正电荷的胺基团(N)与待包封的核酸的带负电荷的磷酸酯基团(P)之间的摩尔比描述的脂质组合物。这可以由等式N/P在数学上表示。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的脂质组分；以及核酸组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质的脂质组分；以及核酸组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括：脂质组分，所述脂质组分包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和辅助脂质；以及RNA组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质的脂质组分；以及RNA组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约5到7。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约3到7。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约4.5到8。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6±1。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6±0.5。在一些实施例中，所述N/P比率将为目标N/P比率的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一些实施例中，所述RNA组分可以包括核酸，如本文公开的核酸，例如对Cas核酸酶进行编码的核酸。在一个实施例中，RNA组分可以包括Cas9 mRNA。在包括对Cas核酸酶进行编码的核酸的一些组合物中，所述LNP进一步包括gRNA核酸，如gRNA。在一些实施例中，所述RNA组分包括Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施例中，所述RNA组分包括第2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。在上述任一实施例中，所述gRNA可以是本文所述的sgRNA，如本文所述的经化学修饰的sgRNA。
在某些实施例中，LNP组合物可以包括本文公开的例如对Cas核酸酶(如第2类Cas核酸酶、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质)进行编码的核酸。在某些LNP组合物中，所述辅助脂质是胆固醇；所述中性脂质是DSPC；和/或所述PEG脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在特定组合物中，所述胺脂质选自脂质A和其等效物，如脂质A的缩醛类似物。在一个实施例中，所述LNP组合物的脂质组分由以下组成：胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一个实施例中，所述LNP组合物的脂质组分由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物中，所述辅助脂质是胆固醇。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的一些组合物中，所述中性脂质是DSPC。包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物包括小于约1mol％的中性脂质，例如中性磷脂。包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物包括小于约0.5mol％的中性脂质，例如中性磷脂。在某些组合物中，所述LNP不包括中性脂质，例如中性磷脂。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的另外实施例中，所述PEG脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和其等效物(如脂质A的缩醛类似物)。
在一个实施例中，LNP组合物可以包括sgRNA。在一个实施例中，LNP组合物可以包括Cas9 sgRNA。在一个实施例中，LNP组合物可以包括Cpf1 sgRNA。在包括sgRNA的一些组合物中，所述LNP包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包括sgRNA的组合物中，所述辅助脂质是胆固醇。在其它包括sgRNA的组合物中，所述中性脂质是DSPC。在另外的包括sgRNA的实施例中，所述PEG脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和其等效物(如脂质A的缩醛类似物)。
在某些实施例中，所述LNP组合物包含Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas mRNA)和至少一个gRNA。在某些实施例中，所述LNP组合物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约25:1到约1:25。在某些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约10:1到约1:10。在某些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约8:1到约1:8。如本文所测量的，所述比率是按重量计算的。在一些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas mRNA)的比率为约5:1到约1:5。在一些实施例中，比率范围为约3:1到1:3、约2:1到1:2、约5:1到1:2、约5:1到1:1、约3:1到1:2、约3:1到1:1、约3:1、约2:1到1:1。在一些实施例中，gRNA与mRNA的比率为约3:1或约2:1。在一些实施例中，gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶)的比率为约1:1。比率可以为25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。
在一些实施例中，LNP通过将RNA水溶液与基于有机溶剂的脂质溶液(例如，100％乙醇)混合而形成。合适的溶液或溶剂包含或可能含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可以使用药学上可接受的缓冲液，例如用于体内施用LNP。在某些实施例中，缓冲液用于将包括LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施例中，缓冲液用于将包括LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施例中，所述组合物的pH的范围为约7.2到约7.7。在另外的实施例中，所述组合物的pH的范围为约7.3到约7.7或约7.4到约7.6。在另外的实施例中，所述组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。可以使用微型pH探针测量组合物的pH。在某些实施例中，所述组合物中包含冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包含蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可以包含高达10％的冷冻保护剂，例如蔗糖。在某些实施例中，所述LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％的冷冻保护剂。在某些实施例中，所述LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％的蔗糖。在一些实施例中，所述LNP组合物可以包含缓冲液。在一些实施例中，所述缓冲液可以包括磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液以及其混合物。在某些示例性实施例中，所述缓冲液包括NaCl。在某些实施例中，省略了NaCl。NaCl的示例性量可以在约20mM到约45mM的范围内。NaCl的示例性量可以在约40mM到约50mM的范围内。在一些实施例中，NaCl的量为约45mM。在一些实施例中，所述缓冲液是Tris缓冲液。Tris的示例性量可以在约20mM到约60mM的范围内。Tris的示例性量可以在约40mM到约60mM的范围内。在一些实施例中，Tris的量为约50mM。在一些实施例中，所述缓冲液包括NaCl和Tris。所述LNP组合物的某些示例性实施例含有含5％蔗糖和45mM NaCl的Tris缓冲液。在其它示例性实施例中，组合物含有在pH 7.5下量为约5％w/v的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris。盐、缓冲液和冷冻保护剂的量可以改变，使得维持整体调配物的渗透压。例如，最终渗透压可以维持在450mOsm/L以下。在另外的实施例中，渗透压介于350与250mOsm/L之间。某些实施例具有300+/-20mOsm/L的最终渗透压。
在一些实施例中，使用微流体混合、T混合或交叉混合。在某些方面，流速、结尺寸、结几何形状、结形状、管直径、溶液和/或RNA和脂质浓度可以变化。LNP或LNP组合物可以被浓缩或纯化，例如通过透析、切向流过滤或色谱法。例如，所述LNP可以以悬浮液、乳液或冻干粉的形式储存。在一些实施例中，所述LNP组合物储存在2-8℃下，在某些方面，所述LNP组合物储存在室温下。在另外的实施例中，LNP组合物被冷冻储存，例如储存在-20℃或-80℃下。在其它实施例中，LNP组合物储存在范围为约0℃到约-80℃的温度下。冷冻的LNP组合物可以在使用前解冻，例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
所述LNP可以是例如微球(包含单层和多层囊泡，例如“脂质体”-层状相脂质双层，所述层状相脂质双层在一些实施例中基本上是球形的，并且在更具体的实施例中可以包括水核，例如包括RNA分子的很大一部分)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
此外，所述LNP组合物是可生物降解的，因为它们在治疗有效剂量下不会在体内累积到细胞毒性水平。在一些实施例中，所述LNP组合物不会引起在治疗剂量水平下导致实质性不良反应的先天免疫应答。在一些实施例中，本文所提供的LNP组合物在治疗剂量水平下不会引起毒性。
在一些实施例中，pdi的范围可以为约0.005到约0.75。在一些实施例中，pdi的范围可以为约0.01到约0.5。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.4。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.3。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.25。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.2。在一些实施例中，pdi可以小于约0.08、0.1、0.15、0.2或0.4。
本文公开的LNP的尺寸(例如，Z-平均直径)为约1到约250nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约10到约200nm。在另外的实施例中，所述LNP的尺寸为约20到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约60到约100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约100nm。除非另有说明，本文所指的所有尺寸均为完全形成的纳米颗粒的平均尺寸(直径)，如通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射测量的。纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数率为大约200-400kcps。数据表示为强度量度的加权平均值(Z-平均直径)。
在一些实施例中，所述LNP以范围为约50％到约100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约50％到约70％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约70％到约90％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约90％到约100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约75％到约95％的平均包封效率形成。
在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+05g/mol到约1.00E+10g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约5.00E+05g/mol到约7.00E+07g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+06g/mol到约1.00E+10g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+07g/mol到约1.00E+09g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约5.00E+06g/mol到约5.00E+09g/mol的平均分子量形成。
在一些实施例中，多分散性(Mw/Mn；加权平均摩尔质量(Mw)与数均摩尔质量(Mn)的比率))的范围可以为约1.000到约2.000。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.00到约1.500。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.020到约1.400。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.010到约1.100。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.100到约1.350。
动态光散射(“DLS”)可以用于表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量使样品经受光源产生的光散射。如根据DLS测量结果测定的，PDI代表群体中粒径(围绕平均粒径)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.005到0.75。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.01到0.5。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.02到0.4。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.03到0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.1到0.35。
在一些实施例中，本文公开的LNP的尺寸为1到250nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为10到200nm。在另外的实施例中，所述LNP的尺寸为20到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为75到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为30到200nm。除非另有说明，本文所指的所有尺寸均为完全形成的纳米颗粒的平均尺寸(直径)，如通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射测量的。纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数率为大约200-400kcts。数据表示为强度量度的加权平均值。在一些实施例中，所述LNP以范围为50％到100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为50％到70％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为70％到90％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为90％到100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为75％到95％的平均包封效率形成。
在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于制备用于治疗ATTR的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于制备用于减少或预防TTR在患有ATTR的受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于制备用于降低血清TTR浓度的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于治疗受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的ATTR。在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于减少或预防TTR在患有ATTR的受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集。在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于降低受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的血清TTR浓度。在任何上述实施例中，所述LNP可以与本文公开的gRNA以及对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关。
电穿孔也是众所周知的用于递送货物的方法，并且可以使用任何电穿孔方法来递送本文公开的gRNA中的任何一种。在一些实施例中，电穿孔可以用于递送本文公开的gRNA中的任何一个以及任选地RNA引导的DNA核酸酶(如Cas9)或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas9)进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明包括一种用于将本文公开的gRNA中的任何一个递送到离体细胞的方法，其中gRNA与LNP相关或与LNP不相关。在一些实施例中，gRNA/LNP或gRNA还任选地与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas9)或对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸(例如，对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如，Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA))相关。
在某些实施例中，本发明包括对包括本文描述的向导序列中的任何一个或多个的向导RNA中的任何一个进行编码的DNA或RNA载体。在一些实施例中，除了引导RNA序列，载体还进一步包括不对引导RNA进行编码的核酸。不对向导RNA进行编码的核酸包含但不限于启动子、增强子、调节序列以及任选地本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸是如Cas9等核酸酶。在一些实施例中，载体包括对crRNA、trRNA或crRNA和trRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，所述载体包括对sgRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列以及任选地本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸可以是Cas核酸酶，如Cas9或Cpf1。在一些实施例中，所述载体包括对crRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列、trRNA以及任选地本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸可以是Cas蛋白，如Cas9。在一个实施例中，所述Cas9来自酿脓链球菌(即，SpyCas9)。在一些实施例中，对crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可以是sgRNA)进行编码的核苷酸序列包括或由两侧是来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或部分的引导序列组成。包括或由crRNA、trRNA或crRNA和trRNA组成的核酸可以进一步包括载体序列，其中载体序列包括或由与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起的非天然发现的核酸组成。
在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由一个载体内的非连续核酸编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由连续核酸编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由单个核酸的相反链编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由单个核酸的相同链编码。
在一些实施例中，所述载体可以是圆形的。在其它实施例中，所述载体可以是线性的。在一些实施例中，所述载体可以被包裹在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制性示例性载体包含质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、微染色体、转座子、病毒载体和表达载体。
在一些实施例中，所述载体可以是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体可以从其野生型对应物进行基因修饰。例如，所述病毒载体可以包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代以促进克隆或使得所述载体的一个或多个特性被改变。此类特性可以包含包装能力、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录和翻译。在一些实施例中，可以使病毒基因组的一部分缺失，使得病毒能够包装具有更大尺寸的外源序列。在一些实施例中，所述病毒载体可以具有增强的转导效率。在一些实施例中，由病毒在宿主中诱导的免疫应答可以被降低。在一些实施例中，促进病毒序列整合到宿主基因组中的病毒基因(如整合酶)可能发生突变，使得病毒变得非整合。在一些实施例中，所述病毒载体可以是复制缺陷型的。在一些实施例中，所述病毒载体可以包括外源转录或翻译控制序列以驱动所述载体上编码序列的表达。在一些实施例中，病毒可以是辅助依赖性的。例如，病毒可能需要一种或多种辅助病毒来供应使载体扩增和将载体包装到病毒颗粒中所需的病毒组分(例如，病毒蛋白)。在此类情况下，一种或多种辅助组分(包含一个或多个对病毒组分进行编码的载体)可以与本文所述的载体系统一起被引入到宿主细胞中。在其它实施例中，病毒可以是无辅助的。例如，病毒可能能够在没有任何辅助病毒的情况下扩增和包装所述载体。在一些实施例中，本文所述的载体系统还可以对病毒扩增和包装所需的病毒组分进行编码。
非限制性示例性病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体可以是AAV载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV2、AAV3、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAVLK03。在其它实施例中，所述病毒载体可以是慢病毒载体。
在一些实施例中，所述慢病毒可以是非整合的。在一些实施例中，所述病毒载体可以是腺病毒载体。在一些实施例中，所述腺病毒可以是高克隆能力或“无肠”腺病毒，其中除5'和3'反向末端重复序列(ITR)和包装信号(“I”)之外的所有编码病毒区都从病毒中缺失，以提高其包装能力。在又其它实施例中，所述病毒载体可以是HSV-1载体。在一些实施例中，基于HSV-1的载体是辅助依赖性的，并且在其它实施例中其是辅助非依赖性的。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有用于包装的结构组分的辅助病毒，而去除非必需病毒功能的30kb-缺失HSV-1载体则不需要辅助病毒。在另外的实施例中，所述病毒载体可以是噬菌体T4。在一些实施例中，当病毒头部被清空时，所述噬菌体T4可能能够包装任何线性或圆形DNA或RNA分子。在另外的实施例中，所述病毒载体可以是杆状病毒载体。在又另外的实施例中，所述病毒载体可以是逆转录病毒载体。在使用具有较小克隆能力的AAV或慢病毒载体的实施例中，可能需要使用多于一种载体来递送本文公开的载体系统的所有组分。例如，一个AAV载体可能含有对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶)进行编码的序列，而第二个AAV载体可能含有一个或多个向导序列。
在一些实施例中，所述载体可能能够驱动一个或多个编码序列在细胞中的表达。在一些实施例中，所述细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。在一些实施例中，所述细胞可以是真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是人细胞。驱动在不同类型的细胞中表达的合适启动子是本领域已知的。在一些实施例中，所述启动子可以是野生型的。在其它实施例中，所述启动子可以被修饰以进行更有效或更高效的表达。在又其它实施例中，所述启动子可以被截短但仍保留其功能。例如，所述启动子可以具有适合于将所述载体适当包装到病毒中的正常大小或减小的大小。
在一些实施例中，所述启动子可以是组成型的、诱导型的或组织特异型的。在一些情况下，所述启动子可以是组成型启动子。非限制性示例性组成型启动子包含巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段或上述任何一种的组合。在一些实施例中，所述启动子可以是CMV启动子。在一些实施例中，所述启动子可以是截短的CMV启动子。在其它实施例中，所述启动子可以是EF1a启动子。在一些实施例中，所述启动子可以是诱导型启动子。非限制性示例性诱导型启动子包含可通过热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的启动子。在一些实施例中，所述诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如
Figure BDA0003377190340001231
启动子(Clontech)。
在一些实施例中，所述启动子可以是组织特异型启动子，例如对在肝脏中表达具有特异性的启动子。
所述载体可以进一步包括对本文所述的向导RNA进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，所述载体包括所述向导RNA的一个拷贝。在一些实施例中，所述载体包括所述向导RNA的多于一个拷贝。在具有多于一个向导RNA的实施例中，所述向导RNA可以是不同的，使得所述向导RNA靶向不同的靶序列，或者可以是相同，因为所述向导RNA靶向相同的靶序列。在所述载体包括多于一个向导RNA的一些实施例中，每个向导RNA可以具有其它不同的特性，如在具有RNA引导的DNA核酸酶的复合物(如Cas RNP复合物)内的活性或稳定性。在一些实施例中，对向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列，如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实施例中，所述启动子可以是tRNA启动子(例如，tRNALys3)或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,《RNA》2015 21:1683-9；Scherer等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2007 35:2620-2628。在一些实施例中，所述启动子可以由RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包含U6和H1启动子。在一些实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人U6启动子。在其它实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人H1启动子。在具有多于一个向导RNA的实施例中，用于驱动表达的启动子可以相同或不同。在一些实施例中，对向导RNA的crRNA进行编码的核苷酸和对向导RNA的trRNA进行编码的核苷酸可以提供在同一载体上。在一些实施例中，对crRNA进行编码的核苷酸和对trRNA进行编码的核苷酸可以由相同的启动子驱动。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以转录成单一转录物。例如，所述crRNA和所述trRNA可以由单一转录物加工以形成双分子向导RNA。可替代地，所述crRNA和trRNA可以转录成单分子向导RNA(sgRNA)。在其它实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由其在同一载体上的对应启动子驱动。在又其它实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由不同的载体编码。
在一些实施例中，所述载体可以任选地进一步包括对RNA引导的DNA核酸酶(如本文所述的核酸酶)进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，由所述载体编码的核酸酶可以是Cas蛋白。在一些实施例中，所述载体系统可以包括对核酸酶进行编码的核苷酸序列的一个拷贝。在其它实施例中，所述载体系统可以包括对核酸酶进行编码的核苷酸序列的多于一个拷贝。在一些实施例中，对核酸酶进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施例中，对核酸酶进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个启动子。
在一些实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以位于包括对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶)进行编码的核苷酸序列的相同载体上。在一些实施例中，所述向导RNA和所述RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)的表达可以由其自身对应的启动子驱动。在一些实施例中，所述向导RNA的表达可以由驱动RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)表达的相同启动子驱动。在一些实施例中，所述向导RNA和所述RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白转录物)可以包含在单个转录物内。例如，所述向导RNA可以在RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白转录物)的非翻译区(UTR)内。在一些实施例中，所述向导RNA可以在转录物的5'UTR内。在其它实施例中，所述向导RNA可以在转录物的3'UTR内。在一些实施例中，转录物的细胞内半衰期可以通过在其3'UTR内含有向导RNA并由此缩短其3'UTR的长度来减少。在另外实施例中，所述向导RNA可以在转录物的内含子内。在一些实施例中，可以在向导RNA所在的内含子处添加合适的剪接位点，使得所述向导RNA从转录物中正确剪接出来。在一些实施例中，来自同一载体的RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)和向导RNA在时间上紧密地表达可以促进更有效地形成CRISPR RNP复合物。
在一些实施例中，所述组合物包括载体系统。在一些实施例中，所述载体系统可以包括一个单一载体。在其它实施例中，所述载体系统可以包括两个载体。在另外的实施例中，所述载体系统可以包括三个载体。当不同的向导RNA用于多路复用时，或者当所述向导RNA的多个拷贝被使用时，所述载体系统可以包括多于三个载体。
在一些实施例中，所述载体系统可以包括诱导型启动子，以仅在将其递送到靶细胞后才开始表达。非限制性示例性诱导型启动子包含可通过热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的启动子。在一些实施例中，所述诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如
Figure BDA0003377190340001251
启动子(Clontech)。
在另外的实施例中，所述载体系统可以包括组织特异型启动子，以仅在将其递送到特定组织中之后才开始表达。
所述载体可以通过脂质体、纳米颗粒、外来体或囊泡递送。所述载体也可以通过脂质纳米颗粒(LNP)递送；参见例如于2017年10月5日公开的标题为“用于CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒调配物(LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CASCOMPONENTS)”的WO2017/173054以及于2019年4月4日公开的标题为“调配物(FORMULATIONS)”的WO 2019067992A1，其各自的内容特此以全文引用的方式并入。本文所述的任何LNP和LNP调配物都适于单独或与cas核酸酶或对cas核酸酶进行编码的核酸一起递送向导序列。在一些实施例中，涵盖一种LNP组合物，其包括：RNA组分和脂质组分，其中所述脂质组分包括胺脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质；并且其中所述N/P比率为约1-10。
在一些情况下，所述脂质组分包括脂质A或其缩醛类似物、胆固醇、DSPC和PEG-DMG；并且其中所述N/P比率为约1-10。在一些实施例中，所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10。在一些实施例中，所述脂质组分包括约50-60mol％的胺脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-8。在一些情况，所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质；约5-15mol％的DSPC；以及约2.5-4mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-8。在一些情况，所述脂质组分包括：48-53mol％的脂质A；约8-10mol％的DSPC；以及约1.5-10mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为3-8±0.2。
在一些实施例中，所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。在一些实施例中，所述胺脂质是脂质A。在一些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG脂质。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在一些实施例中，所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
在一些实施例中，可以全身递送所述载体。在一些实施例中，所述载体可以被递送到肝循环中。
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则在所有情况下，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其它数值理解为由术语“约”修饰(如果尚未对其进行修改)。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中列出的数字参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的期望特性而变化。至少，并且并非试图将等效原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数量并且通过应用常规的舍入技术来解释。
注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所使用的，术语“包含(include)”和其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中列举的项目并不排除可以被替代或添加到所列项目的其它相似项目。
实例
提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例1.材料与方法
核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)
使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶通过体外转录产生含有N1-甲基假-U的封端和聚腺苷酸化酿脓链球菌(“Spy”)Cas9 mRNA。通过在以下条件下与XbaI在37℃下温育持续2小时使含有T7启动子、根据SEQ ID NO:1、2的转录序列或本文公开的另一序列的质粒DNA以及90-100nt聚(A/T)区线性化：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)以及1×反应缓冲液。通过在65℃下加热反应持续20分钟使XbaI失活。线性化的质粒从酶和缓冲盐中纯化。产生经Cas9修饰的mRNA的IVT反应通过在以下条件下在37℃下温育持续1.5-4小时进行：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假-UTP(Trilink)中的每一种各2-5mM；10-25mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNase抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；以及1×反应缓冲液。添加TURBO DNase(赛默飞世尔科技公司)到最终浓度为0.01U/μL，并且使反应温育另外的30分钟以去除DNA模板。根据制造商的方案，使用MegaClear Transcription Clean-up试剂盒(赛默飞世尔科技公司)或RNeasy Maxi试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化Cas9 mRNA。可替代地，通过沉淀方案纯化mRNA，在某些情况下，随后进行基于HPLC的纯化。可替代地，在DNase消化之后，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀纯化mRNA。对于HPLC纯化的mRNA，在LiCl沉淀和重构后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见例如Kariko等人,《核酸研究》,2011,第39卷,第21e142期)。如上所述，通过乙酸钠/乙醇沉淀将选择用于汇集的级分合并并进行脱盐。在另外的替代性方法中，用LiCl沉淀纯化mRNA，随后通过切向流过滤进一步纯化。通过测量260nm(纳米滴(Nanodrop))处的吸光度来测定RNA浓度，并通过借助于生物分析仪(安捷伦(Agilent))的毛细管电泳来分析转录物。
当下文提及关于RNA的SEQ ID NO:1和2时，应理解Ts应替换为Us(如上所述为N1-甲基假尿苷)。实例中使用的Cas9 mRNAs包含5'帽和3'poly-A尾，例如至多100nt，并且通过SEQ ID NO进行鉴定。
人TTR向导设计和具有食蟹猴同源向导设计的人TTR
使用人参考基因组(例如，hg38)和用户定义的所关注基因组区(例如，TTR蛋白编码外显子)在生物信息学上进行初始向导选择，以鉴定所关注区中的PAM。对于每个经鉴定的PAM，执行分析并报告统计数据。基于许多标准(例如，GC含量、预测的在靶活性以及潜在的脱靶活性)进一步选择gRNA分子并对其进行排序。
针对靶向外显子1、2、3和4内的蛋白质编码区的TTR(ENSG00000118271)设计共计68个向导RNA。在总共68个向导中，33个与食蟹猴(“cyno”)100％同源。此外，对于在食蟹猴中不完全同源的人TTR向导中的10个，设计并并行制作“替代”向导以完美匹配对应的食蟹猴靶序列。这些“替代”或“工具”向导可以在食蟹猴中进行筛选，例如以近似同源人向导序列的活动和功能。提供了向导序列和对应基因组坐标(表1)。所有向导RNA均制成双向导RNA，并且向导序列的子集制成经修饰的单向导RNA(表2)。提供了双向导RNA(dgRNA)ID、经修饰的单向导RNA(sgRNA)ID、食蟹猴基因组错配数量以及食蟹猴精确匹配ID的向导ID比对(表3)。在整个实例中详述的实验中使用dgRNA时，使用了SEQ ID NO:270。
以下实例中的sgRNA是通过已知方法使用亚磷酰胺化学合成的。
Cas9 mRNA和向导RNA在体外递送
HEK293_Cas9细胞系：在补充有10％胎牛血清和500μg/ml G418的DMEM培养基中培养组成性地表达Spy Cas9(“HEK293_Cas9”)的人胚胎肾腺癌细胞系HEK293。转染前24小时，以10,000个细胞/孔的密度将细胞平板接种于96孔板中。根据制造商的方案，用脂质体转染RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有单独crRNA(25nM)、trRNA(25nM)、脂质体转染RNAiMAX(0.3μL/孔)和OptiMem的脂质复合物转染细胞。
HUH7细胞系：在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养人肝细胞癌细胞系HUH7(日本研究生物资源细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources CellBank)，目录JCRB0403)。转染前20小时，以15,000个细胞/孔的密度将细胞平板接种于96孔板中。根据制造商的方案，用脂质体转染MessengerMAX(赛默飞世尔科技公司，目录LMRNA003)转染细胞。用含有Spy Cas9 mRNA(100ng)、MessengerMAX(0.3μL/孔)和OptiMem的脂质复合物，随后用含有单独crRNA(25nM)、示踪剂RNA(25nM)、MessengerMAX(0.3μL/孔)和OptiMem的单独的脂质复合物依次转染细胞。
HepG2细胞系：在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养人肝细胞癌细胞系HepG2(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，目录HB-8065)。对细胞进行计数，并且在96孔板中，在转染前24小时以10,000个细胞/孔的密度平板接种于生物涂层胶原蛋白I涂覆的96孔板(赛默飞世尔科技公司，目录877272)中。根据制造商的方案，用脂质体转染2000(赛默飞世尔科技公司，目录11668019)转染细胞。用含有Spy Cas9mRNA(100ng)、脂质体转染2000(0.2μL/孔)和OptiMem的脂质复合物，随后用含有单独crRNA(25nM)、示踪剂RNA(25nM)、脂质体转染2000(0.2μL/孔)和OptiMem的单独的脂质复合物依次转染细胞。
原代肝脏肝细胞：根据制造商的方案((英杰公司(Invitrogen))，方案11.28.2012)培养原代人肝脏肝细胞(PHH)和原代食蟹猴肝脏肝细胞(PCH)(吉博公司(Gibco))。简而言之，将细胞解冻并重新悬浮于含有补充剂的肝细胞解冻培养基(吉博公司，目录CM7000)中，随后以100g离心10分钟(对于人)并以80g离心4分钟(对于食蟹猴)。丢弃上清液，并且将沉淀的细胞重新悬浮于肝细胞平板接种培养基加补充剂包(英杰公司，目录A1217601和CM3000)中。对细胞进行计数并以33,000个细胞/孔的密度(对于人)或60,000个细胞/孔的密度(对于食蟹猴)(下文进一步描述的在测定对TTR蛋白的影响时，65,000个细胞/孔)平板接种于生物涂层胶原蛋白I涂覆的96孔板(赛默飞世尔科技公司，目录877272)上。使平板接种的细胞在37℃和5％CO2气氛下在组织温育箱中沉淀和粘附持续6或24小时。在温育后，检查细胞的单层形成，并将培养基替换为具有无血清补充包(英杰公司，目录A1217601和CM4000)的肝细胞培养基。
根据制造商的方案进行基于脂质体转染RNAiMax(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)的转染。用含有Spy Cas9 mRNA(100ng)、脂质体转染RNAiMax(0.4μL/孔)和OptiMem的脂质复合物，随后用含有crRNA(25nM)、示踪剂RNA(25nM)、或sgRNA(25nM)、脂质体转染RNAiMax(0.4μL/孔)和OptiMem的单独的脂质复合物依次转染细胞。
在电穿孔或将载有向导RNA(RNP)的Spy Cas9蛋白转染到细胞上之前进行核糖核苷酸的形成。对于双向导(dgRNA)，通过将等量的试剂混合并在95℃下温育2分钟并冷却到室温来对单独的crRNA和trRNA进行预退火。在95℃下煮沸单向导(sgRNA)持续2分钟并冷却到室温。将煮沸的dgRNA或sgRNA与Optimem中的Spy Cas9蛋白在室温下温育10分钟，以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
对于RNP电穿孔到原代人和食蟹猴肝细胞中，将细胞解冻并重新悬浮于Lonza电穿孔原代细胞P3缓冲液中，人肝细胞的浓度为2500个细胞/μL，并且食蟹猴肝细胞的浓度为3500个细胞/μL。按照向导将体积为20μL的重悬浮细胞和5μL RNP混合在一起。将20μL混合物置于Lonza电穿孔板中。使用Lonza细胞核转染仪和预设方案EX-147对细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到含有预温热的维持培养基的生物涂层板中，并在37℃和5％CO2下放置在组织培养温育箱中。
对于RNP脂质复合物转染，根据制造商的方案，用脂质体转染RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有Spy Cas9(10nM)、单独向导(10nM)、示踪剂RNA(10nM)、脂质体转染RNAiMAX(1.0μL/孔)和OptiMem的RNP转染细胞。如上所述进行RNP形成。
根据制造商的方案，LNP是通过使用精密纳米系统NanoAssemblrTM台式仪器对脂质和RNA溶液进行微流体混合或错流混合形成的。
LNP调配物-NanoAssemblr
通常，脂质纳米颗粒组分溶解在100％乙醇中，其脂质组分具有不同的摩尔比。将RNA货物溶解在pH为5.0的25mM柠檬酸盐、100mM NaCl中，从而导致RNA货物的浓度为大约0.45mg/mL。LNP被调配成脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比为约4.5或约6，其中mRNA与gRNA的重量比为1:1。
根据制造商的方案，LNP是通过使用精密纳米系统NanoAssemblrTM台式仪器对脂质和RNA溶液进行微流体混合形成的。在混合过程中，使用不同的流速维持水与有机溶剂的2:1比率。混合后，收集LNP，将其稀释在水中(大约1:1v/v)，在室温下保持1小时，并在最终缓冲液交换之前用水进一步稀释(大约1:1v/v)。用PD-10脱盐柱(GE)完成将最终缓冲液交换到50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖、pH 7.5(TSS)中。如果需要，通过使用Amicon100kDa离心过滤器(密理博(Millipore))离心浓缩调配物。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在-80℃下直到进一步使用。
LNP调配物-错流
对于使用错流技术制备的LNP，所述LNP是通过将含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液和一个体积的水进行冲击射流混合而形成的。通过混合交叉将乙醇中的脂质与所述两个体积的RNA溶液混合。通过内联三通将第四水流与交叉的出口流混合。(参见WO2016010840，图2)将LNP在室温下保持1小时，并用水进一步稀释(大约1:1v/v)在平板盒(赛多利斯(Sartorius)，100kD MWCO)上使用切向流过滤将经稀释的LNP浓缩，并且然后通过渗滤将缓冲液交换到pH为7.5的50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖(TSS)中。可替代地，使用PD-10脱盐柱(GE)将最终缓冲液交换到TSS中。如果需要，通过使用Amicon 100kDa离心过滤器(密理博)离心浓缩调配物。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直到进一步使用。
调配物分析
动态光散射(“DLS”)用于表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量使样品经受光源产生的光散射。如根据DLS测量结果测定的，PDI代表群体中粒径(围绕平均粒径)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。使用Malvern Zetasizer DLS仪器通过动态光散射(DLS)测量平均粒径和多分散性。在通过DLS测量之前，将LNP样品在PBS中稀释30倍。Z-平均直径(即平均粒径的基于强度的测量结果)与数均直径和pdi一起报告。MalvernZetasizer仪器也用于测量所述LNP的ζ电位。测量前，将样品在pH为7.4的0.1×PBS中按1:17(50uL至800uL)稀释。
电泳光散射用于表征所述LNP在特定pH值下的表面电荷。表面电荷或ζ电位是LNP悬浮液中颗粒之间静电排斥/吸引力的量值。
非对称流场流动分级-多角度光散射(AF4-MALS)用于通过流体动力学半径分离组合物中的颗粒，并且然后测量碎裂颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。这允许能够评估分子量和尺寸分布以及次级特性，如Burchard-Stockmeyer图(随时间推移变化的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径之比表明颗粒的内部核密度)和rms构象图(rms半径对数对分子量对数，其中所得线性拟合的斜率给出一定程度的紧密度对伸长率)。
纳米颗粒跟踪分析(NTA，Malvern Nanosight)可以用于测定颗粒大小分布以及颗粒浓度。适当地稀释LNP样品并将其注射到显微镜载玻片上。当颗粒缓慢地注入视野时，相机会记录所散射的光。在捕捉到影片后，纳米颗粒跟踪分析通过跟踪像素和计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可以转化为颗粒的流体动力学半径。仪器还对在分析中计数的单独颗粒的数量进行计数以给出颗粒浓度。
低温电子显微镜(“cryo-EM”)可以用于测定LNP的粒径、形态和结构特性。
LNP的脂质成分分析可以通过液相色谱法，随后是带电气溶胶检测(LC-CAD)测定。此分析可以提供实际脂质含量与理论脂质含量的比较。
分析LNP组合物的平均粒径、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA的包封效率和ζ电位。LNP组合物可以进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征。使用MalvernZetasizer DLS仪器通过动态光散射(DLS)测量平均粒径和多分散性。LNP样品在通过DLS测量之前用PBS缓冲液稀释。Z-平均直径(即平均粒径的基于强度的测量结果)与数均直径和pdi一起报告。Malvern Zetasizer仪器也用于测量所述LNP的ζ电位。测量前，将样品在pH为7.4的0.1×PBS中按1:17(50μL至800μL)稀释。
基于荧光的测定(
Figure BDA0003377190340001311
赛默飞世尔科技公司)用于测定总RNA浓度和游离RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1×TE缓冲液适当稀释LNP样品，以测定总RNA，或者用1×TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制备组合物的起始RNA溶液制备标准曲线，并在1×TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释。然后将稀释的
Figure BDA0003377190340001312
染料(根据制造商的说明)添加到标准品和样品中的每一个中，并允许在室温下在无光的情况下温育大约10分钟。使用SpectraMax M5酶标仪(分子装置)读取样品，其中激发、自动截止和发射波长分别设置为488nm、515nm和525nm。根据适当的标准曲线测定总RNA和游离RNA。
包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。相同的程序可以用于测定基于DNA的货物组分的包封效率。在基于荧光的测定中，对于单链DNA，可以使用Oligreen染料，对于双链DNA，可以使用Picogreen染料。可替代地，所述总RNA浓度可以通过反相离子配对(RP-IP)HPLC方法测定。Triton X-100用于分裂所述LNP，从而释放所述RNA。然后通过RP-IP HPLC色谱法将RNA与脂质组分分离，并使用260nm处的UV吸光度对标准曲线进行定量。
AF4-MALS用于查看分子量和尺寸分布以及从这些计算得出的次级统计数据。适当稀释LNP，并且使用HPLC自动进样器注入到AF4分离通道中，在所述通道中聚焦所述LNP，并且然后通过通道交叉流的指数梯度进行洗脱。所有流体均由HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。从AF4通道洗脱的颗粒流经紫外检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和示差折光率检测器。通过使用Debeye模型处理原始数据，以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
LNP中的脂质组分通过与带电气溶胶检测器(CAD)耦合的HPLC进行定量分析。4种脂质组分的色谱分离是通过反相HPLC实现的。CAD是一种基于质量的破坏性检测器，所述检测器可以检测所有非挥发性化合物，并且无论分析物结构如何，信号都是一致的。
通常，在制备LNP时，包封>80％，粒径<120nm并且pdi<0.2。
LNP在体内的递送
除非另有说明，在每项研究中使用范围为6-10周龄的CD-1雌性小鼠。根据体重对动物进行称重和分组，以制备基于组平均重量的给药溶液。以每只动物0.2mL的量(每千克体重大约10mL)通过侧尾静脉给药LNP。在给药后大约6小时观察动物的不良反应。在施用后二十四小时测量体重，并在不同时间点在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺放血对动物实施安乐死。将血液收集到血清分离管中或收集到如本文所述的含有用于血浆的缓冲柠檬酸钠的管中。对于涉及体内编辑的研究，通常从每只动物的中叶或三个独立的叶(例如，右中叶、左中叶和左侧叶)中收集肝脏组织以进行DNA提取和分析。
用于动物研究的运甲状腺素蛋白(TTR)ELISA分析
收集血液并按指示分离血清。使用小鼠前白蛋白(运甲状腺素蛋白)ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司(Aviva Systems Biology)，OKIA00111)测定小鼠TTR血清总水平；使用大鼠特异性ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司，目录号OKIA00159)测量大鼠TTR血清水平；使用人特异性ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司，目录号OKIA00081)测量人TTR血清水平；每个都根据制造商的方案进行。简而言之，当测量小鼠血清中的人TTR时，用试剂盒样品稀释剂连续稀释血清达到10,000倍或5,000倍的最终稀释度。将100ul制备的标准曲线或稀释的血清样品添加到ELISA板中，在室温下温育30分钟，然后用所提供的洗涤缓冲液洗涤3次。向每个孔中添加100uL的检测抗体并在室温下温育20分钟，随后洗涤3次。添加100uL底物，然后在添加100uL终止溶液之前在室温下温育10分钟。在使用SoftmaxPro 7.0版软件进行分析的情况下，在Spectramax M5读板仪上测量内容物的吸光度。血清TTR水平使用4参数逻辑拟合的标准曲线进行定量，并以ug/mL的血清或相对对照(经媒剂处理的)动物的敲低百分比表示。
基因组DNA分离
在转染后24小时、48小时或72小时采集经转染的细胞。根据制造商的方案，使用50μL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，QE09050)从96孔板中的每个孔中提取基因组DNA。如本文所述，使所有DNA样品经受PCR和后续NGS分析。
下一代测序(“NGS”)分析
为了定量地测定基因组中的靶位置处的编辑效率，利用测序来鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在所关注的基因(例如，TTR)内的靶位点周围设计引物，并扩增所关注的基因组区。
根据制造商的方案(Illumina)执行另外的PCR以添加化学物质进行测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与参考基因组(例如，人参考基因组(hg38)、食蟹猴参考基因组(mf5)、大鼠参考基因组(rn6)或小鼠参考基因组(mm10))进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入、取代或缺失的读段数。
将编辑百分比(例如，“编辑效率”或“编辑百分比”或“插入缺失频率”)定义为具有插入/缺失(“插入缺失”)或取代的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。
通过蛋白质印迹分析分泌型运甲状腺素蛋白(“TTR”)
使用蛋白质印迹方法测定培养基中TTR蛋白的分泌水平。如前所述使用表1中的选择向导转染HepG2细胞。转染后每3天更换一次培养基。转染后六天，去除培养基，并且用不含胎牛血清(FBS)的培养基洗涤细胞一次。向细胞中添加不含血清的培养基并在37℃下温育。4小时后，去除培养基并离心以沉淀任何碎片；基于从对剩余细胞进行CTG测定获得的值以及与板平均值的比较来估计每个孔的细胞数。离心后，将培养基转移到新板中并储存在-20℃下。进行培养基的丙酮沉淀以沉淀已分泌到培养基中的任何蛋白质。将四体积的冰冷丙酮添加到一体积的培养基中。将溶液充分混合并在-20℃下保持90分钟。丙酮：将培养基混合物在15,000xg和4℃下离心15分钟。丢弃上清液，并将保留的沉淀物风干以清除任何残留丙酮。将沉淀物重新悬浮于15μL RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司(Boston BioProducts)，目录BP-115)以及由完整蛋白酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma)，目录11697498001)和1mM DTT组成的新添加的蛋白酶抑制剂混合物中。将裂解物与莱姆利(Laemmli)缓冲液混合并在95℃下变性持续10分钟。根据制造商的方案，使用NuPage系统在12％Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔科技公司)上运行蛋白质印迹，随后湿转移到0.45μm硝酸纤维素膜(伯乐公司(Bio-Rad)，目录1620115)上。在室温下，在实验室摇杆上使用含5％干牛奶的TBS将印迹封闭30分钟。用TBST冲洗印迹并在TBST中以1:1000用兔α-TTR单克隆抗体(艾博抗公司(Abcam)，目录Ab75815)进行探测。在TBST中以1:1000使用α-1抗胰蛋白酶作为加载对照(西格玛，目录HPA001292)，并将其与TTR初级抗体同时温育。将印迹密封在袋中，并在实验室摇杆上在4℃下保持过夜。温育后，在TBST中冲洗印迹3次，每次5分钟，并在室温下在TBST中以1:25,000用兔次级抗体(赛默飞世尔科技公司，目录PISA535571)探测30分钟。温育后，将印迹在TBST中冲洗3次，每次5分钟，并用PBS冲洗2次。使用Licor Odyssey系统对印迹进行可视化和分析。
通过蛋白质印迹分析细胞内TTR
肝细胞癌细胞系HUH7如前所述用表1中的选择向导进行转染。转染后六天，去除培养基，并且用50μL/孔的RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司，目录BP-115)以及由完整蛋白酶抑制剂混合物(西格玛，目录11697498001)、1mM DTT和250U/ml Benzonase(默克密理博公司(EMD Millipore)，目录71206-3)组成的新添加的蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞。将细胞在冰上保持30分钟，此时添加NaCl(最终浓度为1M)。将细胞裂解物充分混合并在冰上保留30分钟。将全细胞提取物(“WCE”)转移到PCR板并离心以沉淀碎片。布拉德福德测定(伯乐公司，目录500-0001)用于评估裂解物的蛋白质含量。根据制造商的方案完成布拉德福德测定程序。在使用前将提取物储存在-20℃下。执行蛋白质印迹以评估细胞内TTR蛋白水平。将裂解物与莱姆利缓冲液混合并在95℃下变性持续10分钟。根据制造商的方案，使用NuPage系统在12％Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔科技公司)上运行蛋白质印迹，随后湿转移到0.45μm硝酸纤维素膜(伯乐公司，目录1620115)上。在转移之后，用水彻底冲洗膜并用Ponceau S溶液(波士顿生物制品公司，目录ST-180)染色以确认完全和均匀转移。在室温下，在实验室摇杆上使用含5％干牛奶的TBS将印迹封闭30分钟。用TBST冲洗印迹并在TBST中以1:1000用兔α-TTR单克隆抗体(艾博抗公司，目录Ab75815)探测。在TBST中以1:2500使用β-肌动蛋白作为加载对照(赛默飞世尔科技公司，目录AM4302)，并将其与TTR初级抗体同时温育。将印迹密封在袋中，并在实验室摇杆上在4℃下保持过夜。温育后，在TBST中冲洗印迹3次，每次5分钟，并在室温下在TBST中每次以1:25,000用小鼠和兔初级抗体(赛默飞世尔科技公司，目录PI35518和PISA535571)探测30分钟。温育后，将印迹在TBST中冲洗3次，每次5分钟，并用PBS冲洗2次。使用Licor Odyssey系统对印迹进行可视化和分析。
实例2.dgRNA序列的筛选
多个细胞类型的TTR dgRNA的交叉筛选
如实例1中所述，将靶向人TTR和食蟹猴匹配序列的呈dgRNA格式的向导递送到HEK293_Cas9、HUH7和HepG2细胞系以及原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞。测定跨每种细胞类型包括每个向导序列的crRNA的编辑百分比，并且然后基于最高编辑％对向导序列进行排序。以下列出了表1中的所有五种细胞系中的向导序列的筛选数据(表4到11)。
表6示出了组成性地过度表达Spy Cas9蛋白的人肾腺癌细胞系(即HEK293_Cas9)中的TTR crRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表6：用dgRNA转染的Hek_Cas9细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001351
Figure BDA0003377190340001361
表7示出了在人肝细胞癌细胞系HUH7中用Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)共转染的被测TTR crRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表7：用Spy Cas9 mRNA和dgRNA转染的HUH7细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001371
Figure BDA0003377190340001381
表8示出了在人肝细胞癌细胞系HepG2中用Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)共转染的被测TTR和对照crRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表8：用Spy Cas9 mRNA和dgRNA转染的HepG2细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001382
Figure BDA0003377190340001391
表9示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)电穿孔的被测TTR dgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表9：用载有dgRNA的Spy Cas9蛋白电穿孔的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001401
Figure BDA0003377190340001411
表10示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)转染的被测TTR和对照dgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表10：用载有dgRNA的Spy Cas9转染的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001412
Figure BDA0003377190340001421
Figure BDA0003377190340001431
表11示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)共转染的被测TTR和对照dgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表11：用Spy Cas9 mRNA和dgRNA转染的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001432
Figure BDA0003377190340001441
表12示出了在原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)电穿孔的被测TTRdgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表12：用Spy Cas9蛋白和dgRNA电穿孔的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001442
Figure BDA0003377190340001451
表13示出了在原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)电穿孔的被测食蟹猴特异性TTR dgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表13：用Spy Cas9蛋白和食蟹猴特异性dgRNA电穿孔的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001452
Figure BDA0003377190340001461
实例3.sgRNA序列的筛选
多个细胞类型中TTR sgRNA的交叉筛选
如实例1中所述，将靶向人和/或食蟹猴TTR的呈经修饰的sgRNA格式的向导递送到原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞。测定跨每种细胞类型包括每个向导序列的crRNA的编辑百分比，并且然后基于最高编辑％对向导序列进行排序。以下列出了表2中的两种细胞系中的向导序列的筛选数据(表14到16)。
表14示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)转染的被测TTR sgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表14：用Spy Cas9蛋白和sgRNA转染的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001462
表15示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)共转染的被测TTRsgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％在12.5nM处的平均值和标准偏差。
表15：用Spy Cas9 mRNA和sgRNA转染的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001471
表16示出了在原代食蟹猴肝细胞上用Spy Cas9蛋白(RNP)电穿孔的被测TTRsgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。请注意，向导G000480和G000488与食蟹猴具有一个错配，这可能会影响其在食蟹猴细胞中的编辑效率。
表16：用Spy Cas9蛋白和sgRNA电穿孔的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
Figure BDA0003377190340001472
Figure BDA0003377190340001481
表17示出了在原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9蛋白(RNP)电穿孔的被测食蟹猴特异性TTR sgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。
表17：用Spy Cas9蛋白和食蟹猴特异性sgRNA电穿孔的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据(例如，具有类似人gRNA的那些TTR编辑数据，参见表3)
Figure BDA0003377190340001482
实例4.筛选含有Spy Ca9 mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒(LNP)调配物
在原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9 mRNA交叉筛选LNP调配的TTRsgRNA。
在剂量反应曲线中，在原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞上测试靶向人TTR和食蟹猴匹配的sgRNA序列的经修饰的sgRNA的脂质纳米颗粒调配物。如实例1所述，对原代人和食蟹猴肝细胞进行平板接种。在用LNP处理之前，将两种细胞系在37℃、5％CO2下温育24小时。表18-21中详述的实验中使用的LNP是使用NanoassemblrTM程序制备的，每个LNP均含有指定的sgRNA和Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)，每个LNP均含有脂质。LNP分别含有摩尔比为45:44:9:2的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG，并且N:P比率为4.5。在37℃下在含有6％食蟹猴血清的肝细胞维持培养基中温育LNP持续5分钟。在温育后，在从100ng mRNA开始的8点2倍剂量反应曲线中，将LNP添加到原代人或食蟹猴肝细胞上。如实例1所述，在处理后72小时裂解细胞以进行NGS分析。测定跨每种细胞类型包括每个向导序列的crRNA的编辑百分比，并且然后基于在12.5ng mRNA输入和3.9nM向导浓度下的最高编辑％对向导序列进行排序。图4到7中示出了两种细胞系中的向导序列的剂量反应曲线数据。下面列出了在12.5ng mRNA输入和3.9nM向导浓度下的编辑％(表16到18)。
表18示出了在原代人肝细胞上用Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％在cas9 mRNA的12.5ng下的平均值和标准偏差。与其它sgRNA相比，G000570表现出无特征的剂量反应曲线，这可能是实验的假象。图4中以图形方式示出了所述数据。
表18：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)和sgRNA处理的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID 12.5ng mRNA，3.9nM sgRNA，编辑％平均值 编辑％标准偏差
G000480 59.33 0.73
G000481 24.37 0.37
G000482 19.10 2.64
G000483 7.37 0.67
G000484 16.67 1.23
G000485 14.23 2.36
G000486 61.33 2.59
G000487 17.37 0.95
G000488 44.80 3.00
G000489 16.85 0.06
G000490 10.53 1.90
G000491 31.60 2.33
G000492 15.87 0.44
G000493 7.33 0.73
G000494 6.37 1.07
G000495 23.97 1.66
G000496 30.73 3.76
G000497 15.10 3.30
G000498 24.43 1.30
G000499 16.07 1.67
G000500 23.57 2.44
G000501 32.30 2.49
G000567 48.95 1.06
G000568 54.60 3.68
G000570 88.30 1.84
G000572 55.45 1.20
表19示出了在原代食蟹猴肝细胞上用Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％在12.5ng mNRA和3.9nM向导浓度下的平均值和标准偏差。图5中以图形方式示出了所述数据。
表19：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)和sgRNA处理的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID 12.5ng mRNA，3.9nM sgRNA，编辑％平均值 编辑％标准偏差
G000480 0.73 0.15
G000481 49.20 1.39
G000482 26.13 5.33
G000483 0.73 0.60
G000484 0.10 0.00
G000485 1.43 1.02
G000489 31.87 2.40
G000490 15.23 1.08
G000491 6.37 0.38
G000492 0.70 0.28
G000493 7.63 1.14
G000494 14.30 1.06
G000495 0.73 0.06
G000497 0.23 0.06
G000498 37.90 1.42
G000499 14.63 0.70
G000500 10.47 0.32
G000501 1.37 0.31
G000567 0.10 0.00
G000568 9.25 0.21
G000570 17.30 0.85
G000571 20.20 2.26
G000572 30.60 0.42
表20示出了在原代食蟹猴肝细胞上用Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测食蟹猴特异性TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％在12.5ng mRNA和3.9nM向导浓度下的平均值和标准偏差。图6中以图形方式示出了所述数据。
表20：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)和食蟹猴匹配的sgRNA处理的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID 12.5ng mRNA，3.9nM sgRNA，编辑％ 编辑％标准偏差
G000502 80.70 0.14
G000506 60.13 0.70
G000509 74.47 7.28
G000510 61.87 2.54
在原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9 mRNA交叉筛选LNP调配的TTRsgRNA
在剂量反应曲线中，在原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞上测试靶向人TTR和食蟹猴匹配的sgRNA序列的经修饰的sgRNA的脂质纳米颗粒调配物。如实例1所述，对原代人和食蟹猴肝细胞进行平板接种。在用LNP处理之前，将两种细胞系在37℃、5％CO2下温育24小时。表20-22中详述的实验中使用的LNP使用上述错流程序制备，但使用PD-10柱(GE医疗集团生命科学部门(GE Healthcare Life Sciences))进行纯化并使用Amicon离心过滤器单元(密理博西格玛(Millipore Sigma))进行浓缩，每个LNP均含有特定的sgRNA和Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)。LNP分别含有摩尔比为50:38:9:3的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG，并且N:P比率为6.0。在37℃、5％CO2下在含有6％食蟹猴血清的肝细胞维持培养基中温育LNP持续5分钟。在温育后，在从300ng mRNA开始的8点3倍剂量反应曲线中，将LNP添加到原代人或食蟹猴肝细胞上。如实例1所述，在处理后72小时裂解细胞以进行NGS分析。测定跨每种细胞类型包括每个向导序列的crRNA的编辑百分比，并且然后基于EC50值和最大编辑百分比对向导序列进行排序。图4到7中示出了两种细胞系中的向导序列的剂量反应曲线数据。EC50值和最大编辑百分比在以下列出(表19到22)。
表21示出了在原代人肝细胞上用U-耗竭的Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测人特异性TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的EC50和最大编辑。图4中以图形方式示出了所述数据。
表21：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA和人特异性sgRNA处理的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID EC50 最大编辑
G000480 0.10 98.69
G000481 1.43 87.05
G000482 0.65 97.02
G000483 1.88 77.39
G000484 0.95 94.14
G000488 0.72 95.83
G000489 1.38 86.33
G000490 1.52 94.16
G000493 2.42 63.95
G000494 1.28 75.70
G000499 0.63 96.31
G000500 0.39 88.70
G000568 0.78 95.72
G000570 0.23 98.22
G000571 2.21 71.28
G000572 0.42 97.94
表22示出了在原代食蟹猴肝细胞上用U-耗竭的Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测食蟹猴特异性TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的EC50和最大编辑。图16中以图形方式示出了所述数据。
表22：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA和人特异性sgRNA处理的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID EC50 最大编辑
G000480 5.28 20.32
G000481 0.93 95.07
G000482 0.89 97.47
G000483 4.40 56.52
G000484 3.47 0.22
G000488 11.56 21.63
G000489 1.79 89.21
G000490 3.09 90.76
G000493 4.97 61.15
G000494 2.77 60.84
G000499 2.00 74.94
G000500 4.42 58.04
G000567 1.76 97.06
G000568 1.87 87.93
G000570 2.00 96.73
G000571 1.55 97.03
G000572 0.79 100.31
表23示出了在原代人肝细胞上用U-耗竭的Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测食蟹猴匹配的TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的EC50和最大编辑。图17中以图形方式示出了所述数据。
表23：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA和食蟹猴特异性sgRNA处理的原代人肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID EC50 最大编辑
G000502 0.70 91.50
G000504 5.16 7.16
G000505 3.57 13.48
G000506 1.26 89.49
表24示出了在原代食蟹猴肝细胞上用U-耗竭的Spy Cas9 mRNA在脂质纳米颗粒中调配的被测食蟹猴匹配的TTR sgRNA的作为剂量反应曲线的EC50和最大编辑。图18中以图形方式示出了所述数据。
表24：用LNP调配的Spy Cas9 mRNA和食蟹猴特异性sgRNA处理的原代食蟹猴肝细胞中的TTR编辑数据
向导ID EC50 最大编辑
G000502 0.26 100.05
G000503 2.26 83.41
G000504 1.42 98.04
G000505 1.10 99.97
G000506 0.66 99.18
实例5.TTR dgRNA和sgRNA的脱靶分析
TTR向导的脱靶分析
使用基于寡核苷酸插入的测定(参见例如Tsai等人,《自然生物技术(NatureBiotechnology)》33,187-197；2015)测定通过靶向TTR的Cas9切割的潜在的脱靶基因组位点。在HEK293_Cas9细胞中筛选了来自表1的四十五个dgRNA(以及两个具有已知脱靶特性的对照向导)。在补充有10％胎牛血清和500μg/ml G418的DMEM培养基中培养组成性地表达Spy Cas9(“HEK293_Cas9”)的人胚胎肾腺癌细胞系HEK293。转染前24小时，以30,000个细胞/孔的密度将细胞平板接种于96孔板中。根据制造商的方案，用脂质体转染RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有单独crRNA(15nM)、trRNA(15nM)以及具有(10nM)脂质体转染RNAiMAX(0.3μL/孔)和OptiMem的供体寡核苷酸的脂质复合物转染细胞。转染后24小时裂解细胞，并使用Zymo的Quick gDNA 96提取试剂盒(目录号D3012)按照制造商推荐的方案提取基因组DNA。使用量子比特高灵敏度dsDNA试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))对gDNA进行定量。文库是按照Tsai等人,2015中先前描述的方法制备的，并稍作修改。在Illumina的MiSeq和HiSeq 2500上进行测序。所述测定鉴定在图2中绘制的crRNA中的一些的潜在脱靶位点。
表25示出了在用TTR dgRNA以及双链DNA寡核苷酸供体序列转染的HekCas9细胞中检测到的脱靶整合位点的数量。
表25：通过基于寡核苷酸插入的测定检测到的TTR dgRNA的脱靶整合位点的数量
Figure BDA0003377190340001531
Figure BDA0003377190340001541
此外，通过上述基于寡核苷酸的插入方法评估Hek_Cas9细胞中作为经修饰的sgRNA的向导子集的脱靶潜力。图4中绘制了脱靶结果。
表26示出了在用TTR sgRNA以及双链DNA寡核苷酸供体序列转染的HekCas9细胞中检测到的脱靶整合位点的数量。
表26：通过插入检测方法检测到的TTR sgRNA的脱靶整合位点的数量
Figure BDA0003377190340001542
Figure BDA0003377190340001551
实例6.用于验证潜在脱靶位点的靶向测序
用于检测潜在脱靶的实例5中使用的HEK293_Cas9细胞组成性地过表达Cas9，从而导致与各种细胞类型的瞬时递送范例相比，潜在脱靶“命中”的数量更高。此外，在递送sgRNA(与dgRNA相反)时，潜在脱靶命中数量可能会进一步增加，因为sgRNA分子比dgRNA更稳定(尤其是在被化学修饰时)。因此，可以使用对所鉴定的潜在脱靶位点进行靶向测序来验证通过实例5中使用的寡核苷酸插入方法鉴定的潜在脱靶位点。
在一种方法中，用包括所关注的Cas9 mRNA和sgRNA(例如，具有用于评估的潜在脱靶位点的sgRNA)的LNP处理原代肝细胞。然后对原代肝细胞进行裂解，并且使用侧接潜在脱靶位点的引物产生扩增子以进行NGS分析。在一定水平上鉴定插入缺失可以验证潜在脱靶位点，而缺少在潜在脱靶位点处发现的插入缺失可能指示HEK293_Cas9细胞测定中的假阳性。
实例7.表型分析
分泌型TTR的蛋白质印迹分析
肝细胞癌细胞系HepG2如实例1中所述用表1中的选择向导一式三份地转染。转染后两天，采集一个复制品用于基因组DNA并通过NGS测序分析编辑效率。转染后五天，在一个复制品上更换不含血清的培养基。如前所述，4小时后，采集培养基以通过WB分析分泌的TTR。图7中提供了每个向导的编辑％和细胞外TTR减少的数据。
细胞内TTR的蛋白质印迹分析
肝细胞癌细胞系HUH7如实例1中所述用包括来自表1的向导的crRNA进行转染。将经转染的细胞池保留在组织培养物中并传代以进一步分析。在转染后七天，采集细胞，并且制备全细胞提取物(WCE)，并通过如前所述的蛋白质印迹进行分析。
通过蛋白质印迹分析WCE以减少TTR蛋白。全长TTR蛋白的预测分子量为约16kD。在蛋白质印迹的对照通道中观察到此分子量的带。
使用Licor Odyssey图像工作室5.2版软件计算TTR蛋白的减少百分比。使用GAPDH作为加载对照物，并与TTR同时探测。计算将每个样品内的GAPDH的密度测定值与涵盖TTR带的总区的密度测定值进行比较的比率。在使比率相对于对照通道归一化后，测定TTR蛋白的减少百分比。图8中示出了结果。
实例8.向人源化TTR小鼠和具有wt(鼠类)TTR的小鼠递送LNP：
向关于TTR基因人源化的小鼠给药含有表27中指定的向导的LNP调配物701-704(每种调配物5只小鼠)。对这些人源化TTR小鼠进行工程化，使得内源性鼠类TTR基因座区被缺失并替换为直系同源人TTR序列，以便所述基因座对人TTR蛋白进行编码。为了进行比较，向6只具有鼠类TTR的小鼠给药含有靶向鼠类TTR的向导(G000282)的LNP700。表27中调配物编号为1-5的LNP使用如上所述的NanoassemblrTM程序制备，而调配物编号为6-16的LNP使用如上所述的错流程序制备，但使用PD-10柱(GE医疗集团生命科学部门)进行纯化并使用Amicon离心过滤器单元(密理博西格玛)进行浓缩。作为阴性对照，向对应基因型的小鼠单独给药媒剂(Tris盐水蔗糖缓冲液(TSS))。施用表27中的调配物编号为2-5的LNP的人源化TTR小鼠的背景是50％129S6/SvEvTac 50％C57BL/6NTac；施用表25中的调配物编号为6-16的LNP的人源化TTR小鼠以及具有鼠类TTR的小鼠(施用LNP700，调配物编号1)的背景是75％C57BL/6NTac 25％129S6/SvEvTac。
表27.用于给药人源化TTR小鼠的LNP调配物：
Figure BDA0003377190340001561
Figure BDA0003377190340001571
调配物编号为1-5的LNP含有SEQ ID NO:2的Cas9 mRNA，并且调配物编号为6-16的LNP含有SEQ ID NO:1的Cas9 mRNA，全部与向导的重量比为1:1。LNP分别含有表27中所述的摩尔比的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。调配物编号为1-5的LNP的剂量为2mg/kg(总RNA含量)，并且调配物编号为6-16的LNP的剂量为1mg/kg(总RNA含量)。使用设计用于扩增所关注区以进行NGS分析的引物来测定肝脏编辑结果。图9中示出了调配物编号为1-5的肝脏编辑结果，并指示人TTR序列的编辑，其中四个向导中的每一个在>35％编辑水平(平均值)下测试，G000494和G000499提供接近60％的值。图13和表28中示出了调配物编号为6-8、10-13和15-16的肝脏编辑结果，所述结果示出了用被测调配物中的每一种对人TTR序列的有效编辑。所有调配物的编辑率均大于38％，其中若干种调配物的编辑值大于60％。由于PCR扩增子的设计以及所产生的低测序读段数量，未示出调配物9和14。
在提供调配物编号为6-8、10-13和15-16的小鼠中测量血清中的人TTR水平。参见图14B。图14A是为比较目的而提供的图13的重复。检测到每种被测调配物的血清人TTR敲低，这与在肝脏中检测到的编辑量相关(参见图14A与14B，表28)。
表28
Figure BDA0003377190340001572
Figure BDA0003377190340001581
在另一组实验中，向人源化TTR小鼠给药一系列剂量的具有向导G000480、G000488、G000489和G000502的LNP调配物。含有Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的调配物与向导的重量比为1:1。LNP分别含有摩尔比为50:38:9:3并且N:P比率为6的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。剂量为1、0.3、0.1或0.03mg/kg(n＝5/组)。使用上述错流程序制备LNP，并分别使用PD-10柱和Amicon离心过滤器单元进行纯化和浓缩。使用设计用于扩增所关注区以进行NGS分析的引物来测定肝脏编辑结果，并且如上所述测量血清人TTR水平。图26A中示出了肝脏编辑结果，并且图26B-C中示出了血清人TTR水平。编辑和血清TTR水平的剂量反应是明显的。
在另一组实验中，向人源化TTR小鼠给药一系列剂量的具有向导G000481、G000482、G000486和G000499的LNP调配物。含有Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的调配物与向导的重量比为1:1。LNP分别含有摩尔比为50:38:9:3的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG，并且N:P比率为6。剂量为1、0.3或0.1mg/kg(n＝5/组)。使用上述错流程序制备LNP，并分别使用PD-10柱和Amicon离心过滤器单元进行纯化和浓缩。使用设计用于扩增所关注区以进行NGS分析的引物来测定肝脏编辑结果，并且如上所述测量血清人TTR水平。图27A中示出了肝脏编辑结果，并且图27B-C中示出了血清人TTR水平。编辑和血清TTR水平的剂量反应是明显的。
在另一组实验中，向人源化TTR小鼠给药一系列剂量的具有向导G000480、G000481、G000486、G000499和G000502的LNP调配物。含有Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)的调配物与向导的重量比为1:2。LNP分别含有摩尔比为50:38:9:3的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG，并且N:P比率为6。剂量为1、0.3或0.1mg/kg(n＝5/组)。使用上述错流程序制备LNP，并分别使用PD-10柱和Amicon离心过滤器单元进行纯化和浓缩。使用设计用于扩增所关注区以进行NGS分析的引物来测定肝脏编辑结果，并且如上所述测量血清人TTR水平。图28A中示出了肝脏编辑结果，并且图28B-C中示出了血清人TTR水平。编辑和血清TTR水平的剂量反应是明显的。
在使用野生型CD-1小鼠的单独实验中，在剂量反应研究中测试了包括向导G000502的LNP调配物，所述向导在小鼠与食蟹猴之间交叉同源。含有Cas9 mRNA(SEQ IDNO:1)的调配物与向导的重量比为1:1。LNP分别含有摩尔比为45:44:9:2并且N:P比率为6的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。剂量为1、0.3、0.1、0.03或0.01mg/kg(n＝5/组)。使用设计用于扩增所关注区以进行NGS分析的引物来测定肝脏编辑结果。图15A示出了肝脏编辑结果，并且图15B中示出了血清小鼠TTR水平。编辑和血清TTR水平的剂量反应是明显的。
实例9.以多剂量向小鼠递送LNP
向小鼠(来自查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)的雌性小鼠，大约6-7周龄)给药LNP调配物LNP705，所述调配物使用如上所述的含有按重量比计1:1的G000282(“G282”)和Cas9 mRNA(SEQ ID NO:2)以及总RNA浓度为0.5mg/ml的错流和TFF程序制备。LNP的N:P比率为4.5，并且分别含有摩尔比为45:44:9:2的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。各组每周给药一次，至多一周、两周、三周或四周(QWx1-4)给药一次，或者每月给药一次，至多两个月或三个月(QMx2-3)给药一次。剂量为0.5mg/kg或1mg/kg(总RNA含量)。对照组在第1天接受0.5、1或2mg/kg的单剂量。每个组含有5只小鼠。通过ELISA分析血清TTR，并在尸检时分别收集肝脏、脾脏和肌肉以进行NGS编辑分析。表29中示出各组。X＝处死和尸检。MPK＝mg/kg。
表29.研究小组
Figure BDA0003377190340001591
表30和图10A-11B示出了血清TTR水平结果(KD％＝敲低％)。表30和图12A-C示出了肝脏编辑结果。
表30.血清TTR结果.
Figure BDA0003377190340001592
Figure BDA0003377190340001601
表31.肝脏编辑结果：
时间方案 剂量 肝脏编辑(％)
QWx4 TSS 0.38
QMx3 0.5 48.18
QMx2 0.5 36.66
QWx4 0.5 56.03
QWx3 0.5 51.35
QWx2 0.5 34.77
QWx1 0.5 24.16
QMx3 1 63.40
QMx2 1 57.37
QWx4 1 62.89
QWx3 1 59.22
QWx2 1 60.12
QWx1 1 35.16
QWx1 2 60.57
结果表明，随着时间的推移(包含每周或每月间隔)多次施用，有可能建立累积剂量和效果，以实现不断提高的编辑水平和TTR的KD％。
实例10.RNA货物：不同的mRNA和gRNA比率
此研究评估了gRNA与mRNA的不同比率在小鼠体内的功效。如实例1中所指定的，用N1-甲基假尿苷三磷酸代替尿苷三磷酸，通过IVT合成制备具有SEQ ID NO:4的ORF、HSD 5'UTR、人白蛋白3'UTR、Kozak序列和poly-A尾的CleanCapTM加帽的Cas9 mRNA。
LNP调配物由来自所描述的mRNA和实例1中所述的G282(SEQ ID NO:124)以及摩尔比为50:38:9:3并且N:P比率为6的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG制备。调配物的gRNA:Cas9 mRNA重量比如在图19A和19B中所示。
为了体内表征，将LNP以0.1mg总RNA(mg向导RNA +mg mRNA)/kg(每组n＝5只)施用于小鼠。给药后7-9天，处死动物，收集血液和肝脏，并如实例1中所述测量血清TTR和肝脏编辑。图19A和19B中示出了血清TTR和肝脏编辑结果。向阴性对照小鼠给药TSS媒剂。
此外，以0.05mg/kg的恒定mRNA剂量(每组n＝5只)向小鼠施用上述LNP，同时将gRNA剂量从0.06mg/kg逐步变至0.4mg/kg。给药后7-9天，处死动物，收集血液和肝脏，并测量血清TTR和肝脏编辑。图19C和图19D中示出了血清TTR和肝脏编辑结果。向阴性对照小鼠给药TSS媒剂。
实例11.原代人肝细胞中的TTR sgRNA的脱靶分析
如实例5所述，在以下修饰的情况下，在原代人肝细胞(PHH)中进行靶向TTR的sgRNA的脱靶分析。如实例1中所述，以33,000个细胞每孔的密度将PHH平板接种于胶原蛋白涂覆的96孔板上。如实例1中所述，平板接种后二十四小时，用培养基洗涤细胞并使用脂质体转染RNAiMax(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有100ng Cas9 mRNA的脂质复合物转染细胞，随后立即添加另一种含有25nM sgRNA和12.5nM供体寡核苷酸(0.3μL/孔)的脂质复合物。如实例5中进一步所述，转染后48小时裂解细胞并提取和分析gDNA。图20中以图形方式表示了所述数据。
表32示出了在PHH中检测到的脱靶整合位点的数量，并将其与在实例5中使用的HekCas9细胞中检测到的位点的数量进行比较。与HekCas9细胞系相比，在PHH中检测到每个被测向导的位点较少，其中单独在PHH中未检测到独特的位点。
表32.通过基于寡核苷酸插入的测定检测到的PHH中的TTR sgRNA的脱靶整合位点的数量
Figure BDA0003377190340001611
Figure BDA0003377190340001621
在通过寡核苷酸插入测定鉴定PHH中的潜在脱靶位点后，通过靶向扩增子测序进一步评估某些潜在位点，例如，如实例6中所述。除了通过寡核苷酸插入策略鉴定的潜在脱靶位点外，分析中包含通过生物信息学预测(in silico prediction)鉴定的另外的潜在脱靶位点。
为此，如实例4中所述，用包括100ng Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)和14.68nM处(重量比为1:1)的所关注gRNA的LNP处理PHH。使用上述错流程序制备LNP，并分别使用PD-10柱和Amicon离心过滤器单元进行纯化和浓缩。LNP以N:P比率为6.0调配，并且分别含有摩尔比为50:38:9:2的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。LNP处理后，通过NGS分析分离的基因组DNA(例如，如实例1和6中所述)以测定是否可以在潜在脱靶位点处检测到插入缺失，这将指示Cas9介导的切割事件。表33和34分别示出了对gRNA G000480和G000486进行评估的潜在脱靶位点。
如以下图21A-B和22A-B以及表35所示，对于G000480的通过寡核苷酸插入测定鉴定的潜在脱靶位点中的仅两个潜在脱靶位点以及对于G000486鉴定到仅一个潜在脱靶位点，在低水平下检测到插入缺失。未在任一向导的任何一个生物信息学预测位点处检测到插入缺失。此外，仅使用接近饱和剂量的LNP在这些位点处检测到插入缺失，因为在G000480和G000486的在靶位点处观察到的插入缺失比率分别为约97％和约91％(参见表35)。表33和34中也报告了这些位点的基因组坐标，并且每个对应于不对任何蛋白质进行编码的序列。
然后进行剂量反应测定以确定最高剂量的LNP，其中未检测到脱靶。如实例4中所述，用包括G000480或G000486的LNP处理PHH。关于gRNA浓度，剂量范围跨越11个点(0.001nM、0.002nM、0.007nM、0.02nM、0.06nM、0.19nM、0.57nM、1.72nM、5.17nM、15.51nM和46.55nM)。如图21A-B和22A-B中的垂直虚线所表示的，不再检测到G000480和G000486的潜在脱靶位点的最高浓度(相对于gRNA的浓度)分别为0.57nM和15.51nM，这导致在靶插入缺失率分别为84.60％和89.50％。
表33.通过插入检测鉴定的潜在脱靶位点和通过靶向扩增子测序评估的G000480的生物信息学预测：
向导ID 脱靶(OT)位点ID 所使用的测定 染色体坐标(hg38) 链
G000480 INS-OT.1 插入缺失 chr7:94767406-94767426 +
G000480 INS-OT.2 插入缺失 chr2:192658562-192658582 +
G000480 INS-OT.3 插入缺失 chr7:4834390-4834410 +
G000480 INS-OT.4 插入缺失 chr20:9216118-9216138 -
G000480 INS-OT.5 插入缺失 chr10:12547071-12547091 +
G000480 INS-OT.6 插入缺失 chr6:168377978-168377998 -
G000480 INS-OT.7 插入缺失 chr12:114144669-114144689 -
G000480 INS-OT.8 插入缺失 chr10:7376755-7376775 +
G000480 INS-OT.9 插入缺失 chr2:52950299-52950319 +
G000480 INS-OT.10 插入缺失 chr8:56579165-56579185 -
G000480 INS-OT.11 插入缺失 chr1:189992255-189992275 +
G000480 PRED-OT.1 生物信息学预测 chr10:12547071-12547091 +
G000480 PRE-DOT.2 生物信息学预测 chrX:119702782-119702802 +
G000480 PRED-OT.3 生物信息学预测 chr1:116544586-116544606 +
G000480 PRED-OT.4 生物信息学预测 chr6:88282884-88282904 +
G000480 PRED-OT.6 生物信息学预测 chr5:121891868-121891888 +
G000480 PRED-OT.7 生物信息学预测 chr3:52544945-52544965 +
G000480 PRED-OT.8 生物信息学预测 chr15:36949639-36949659 +
G000480 PRED-OT.9 生物信息学预测 chr5:33866486-33866506 +
G000480 PRED-OT.10 生物信息学预测 chr5:159755754-159755774 +
G000480 PRED-OT.11 生物信息学预测 chr5:31349859-31349879 +
G000480 PRED-OT.12 生物信息学预测 chr11:79485652-79485672 +
G000480 PRED-OT.13 生物信息学预测 chr15:29448864-29448884 +
G000480 PRED-OT.14 生物信息学预测 chr5:171153565-171153585 +
G000480 PRED-OT.15 生物信息学预测 chr9:84855273-84855293 +
G000480 PRED-OT.16 生物信息学预测 chr6:159953060-159953080 +
G000480 PRED-OT.17 生物信息学预测 chr16:51849024-51849044 +
G000480 PRED-OT.18 生物信息学预测 chr3:24108809-24108829 +
G000480 PRED-OT.19 生物信息学预测 chr18:41118310-41118330 +
G000480 PRED-OT.20 生物信息学预测 chr10:108975241-108975261 +
G000480 PREDO-T.21 生物信息学预测 chr1:44683633-44683653 +
G000480 PRED-OT.22 生物信息学预测 chr2:196214849-196214869 +
G000480 PRED-OT.23 生物信息学预测 chr9:117353544-117353564 +
G000480 PRED-OT.24 生物信息学预测 chr1:55583322-55583342 +
G000480 PRED-OT.25 生物信息学预测 chr12:28246827-28246847 +
G000480 PRED-OT.26 生物信息学预测 chr4:54545361-54545381 +
G000480 PRED-OT.27 生物信息学预测 chr13:22364836-22364856 +
G000480 PRED-OT.28 生物信息学预测 chr13:80816049-80816069 +
G000480 PRED-OT.29 生物信息学预测 chr7:39078622-39078642 +
G000480 PRED-OT.30 生物信息学预测 chr2:59944386-59944406 +
“INS-OT.N”是指寡核苷酸插入检测到的脱靶位点ID，其中N为上述指定的整数；“PRED-OT.N”是指通过生物信息学方法预测的脱靶位点ID，其中N为上述指定的整数。
表34.通过插入检测鉴定的潜在脱靶位点和通过靶向扩增子测序评估的G000486的生物信息学预测：
Figure BDA0003377190340001641
Figure BDA0003377190340001651
“INS-OT.N”是指寡核苷酸插入检测到的脱靶位点ID，其中N为上述指定的整数；“PRED-OT.N”是指通过生物信息学方法预测的脱靶位点ID，其中N为指定的整数。
表35.在用含有100ng mRNA和31.03nM gRNA的LNP处理的PHH中检测到脱靶位点
Figure BDA0003377190340001652
实例12.将LNP递送到ATTR的人源化小鼠模型中
此实例中使用了遗传性ATTR淀粉样变性的众所周知的人源化转基因小鼠模型，所述模型表达人TTR蛋白的V30M致病突变形式。此小鼠模型概括了在ATTR患者中观察到的组织中的TTR沉积表型，所述沉积表型包含在周围神经系统和胃肠(GI)道内(参见Santos等人,《衰老神经生物学(Neurobiol Aging.)》2010年2月；31(2):280-9)。
向小鼠(年龄为大约4-5个月)给药使用如实例1中所述的错流和TFF程序制备的LNP调配物。LNP以N:P比率为6.0调配，并且分别含有摩尔比为50:38:9:2的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。LNP含有Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)和G000481(“G481”)或非靶向对照向导G000395(“G395”；SEQ ID NO:273)，gRNA:mRNA的重量比为1:1。
如实例1中所述，通过侧尾静脉向小鼠注射单剂量(占总RNA含量的)1mg/kg的LNP，n＝10只/组。在处理后8周，对小鼠实施安乐死以收集样品。通过ELISA测量血清和脑脊液(CSF)中的人TTR蛋白水平，如Butler等人,《淀粉样蛋白(Amyloid)》,2016年6月；23(2):109-18先前所描述的。如实例1中所述，测定肝脏组织的编辑水平。收集其它组织(胃、结肠、坐骨神经、背根神经节(DRG))并进行半定量免疫组织化学处理，如
Figure BDA0003377190340001653
等人,《淀粉样蛋白》,2014年9月；21(3):175-184先前描述的。使用曼-惠特尼检验(Mann Whitney Test)对免疫组织化学数据进行统计分析，其中p值<0.0001。
如图23A-B所示，在单剂量包括G481的LNP后，在人源化小鼠的肝脏中观察到TTR的强大编辑(49.4％)，而在对照组中未检测到编辑。对编辑事件的分析表明，96.8％的事件是插入，其余是缺失。
如图24A-B所示，来自经处理的小鼠的血浆中的TTR蛋白水平降低，但在CSF中没有降低，其中观察到TTR血浆水平的敲低大于99％(p<0.001)。
在经处理的动物的血浆中观察到的TTR几乎完全敲低与所测定组织中的TTR蛋白淀粉样沉积的清除率相关。如图25所示，对照小鼠在组织中表现出淀粉样蛋白染色，这类似于在患有ATTR的人类受试者中观察到的病理生理学。通过编辑HuTTR V30M基因座降低循环TTR导致组织中的淀粉样沉积的显著减少。在处理后8周的经处理的组织中观察到大约85％或更高的TTR染色减少(图25)。
实例13.原代人肝细胞(PHH)中的TTR mRNA敲低
在一个实验中，如实例4中所述，培养PHH并用包括Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)和所关注的gRNA(参见图29，表36)的LNP处理。使用上述错流程序制备LNP，并分别使用PD-10柱和Amicon离心过滤器单元进行纯化和浓缩。LNP以N:P比率为6.0调配，并且分别含有摩尔比为50:38:9:2的脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。LNP的gRNA:mRNA比率为1:2，并且以300ng的剂量(相对于所递送的mRNA货物的量)处理细胞。
在LNP处理后九十六(96)小时(每种条件的生物学一式三份)，使用DynabeadsmRNADIRECT试剂盒(赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案从PHH细胞中纯化mRNA。用Maxima逆转录酶(赛默飞世尔科技公司)和poly-dT引物进行逆转录(RT)。用Ampure XPBeads(Agencourt)纯化所得cDNA。对于定量PCR，用Taqman Fast Advanced Mastermix和3个Taqman探针组、TTR(测定ID：Hs00174914_m1)、GAPDH(测定ID：Hs02786624_g1)和PPIB(测定ID：Hs00168719_m1)扩增2％的经纯化的cDNA。根据制造商的说明书(生命技术公司)，在QuantStudio7挠曲实时PCR系统上运行测定。通过单独使内源性对照(GAPDH和PPIB)归一化计算TTR mRNA的相对表达，并且然后求平均值。
如图29所示并在下表36中以数字方式再现，与阴性(未经处理的)对照相比，被测LNP调配物中的每种调配物导致TTR mRNA的敲低。通过在每种LNP制剂中使用的gRNA ID来鉴定图29和表36中的组。图29中绘制了TTR mRNA的相对表达，而表36中提供了TTR mRNA的敲低百分比。
表36.
向导ID 敲低％平均值 标准偏差
G000480 95.19 1.68
G000481 91.39 2.39
G000482 82.31 4.51
G000483 68.78 13.45
G000484 75.22 9.05
G000488 92.77 3.76
G000489 91.85 2.77
G000490 78.34 5.76
G000493 87.53 4.54
G000494 91.15 3.63
G000499 91.38 1.71
G000500 92.90 3.15
G000567 90.89 5.39
G000568 53.44 20.20
G000570 93.38 2.66
G000571 96.17 2.07
G000572 55.92 24.53
在单独的实验中，在用包括G000480、G000486和G000502的LNP处理后评估TTRmRNA敲低。调配LNP，并且培养PHH并用LNP进行处理，每种LNP都如此实例中以上实验中所述，不同之处在于以100ng的剂量处理细胞(相对于所递送的mRNA货物的量)。
在LNP处理后九十六(96)小时(每种条件的单次处理)，使用Dynabeads mRNADIRECT试剂盒(赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案从PHH细胞中纯化mRNA。根据制造商的说明书，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行逆转录(RT)。对于定量PCR，用Taqman Fast Advanced Mastermix和3个Taqman探针组、TTR(测定ID：Hs00174914_m1)、GAPDH(测定ID：Hs02786624_g1)和PPIB(测定ID：Hs00168719_m1)扩增2％的cDNA。根据制造商的说明书(生命技术公司)，在QuantStudio7挠曲实时PCR系统上运行测定。通过单独使内源性对照(GAPDH和PPIB)归一化计算TTR mRNA的相对表达，并且然后求平均值。
如图30并在下表37中以数字方式再现，与阴性(未经处理的)对照相比，被测LNP调配物中的每种调配物导致TTR mRNA的敲低。通过在每种LNP制剂中使用的gRNA ID来鉴定图30和表37中的组。图30中绘制了TTR mRNA的相对表达，而表37中提供了TTR mRNA的敲低百分比。
表37.
向导ID 敲低％平均值 标准偏差
G000480 95.61 0.92
G000486 97.36 0.63
G000502 90.94 2.63
实例14.对非人灵长类动物进行皮质类固醇预处理和LNP递送
用地塞米松和不同剂量的LNP处理n＝3队列中的雄性食蟹猴以每个NHP提供1mg/kg、3mg/kg或6mg/kg(RNA)。每种调配物均含有Cas9 mRNA000042(SEQ ID No.377)和向导RNA(gRNA)G000502(SEQ ID No.114)，gRNAmRNA的重量比为1:2。除了用媒剂对照处理的动物外，所有动物在LNP施用之前1-2小时通过静脉内团注注射接受2mg/kg的地塞米松(Dex)预处理。LNP的剂量(以mg/kg为单位，总RNA含量)均通过30分钟静脉内输注施用。
在给药后第15天，使用16号SuperCore活检针，通过靶向肝脏右叶/侧的单次超声引导的经皮穿刺活检来收集肝脏样本。每只动物收集最小1.5cm3的总肝脏活检。每个活检样本在液氮中快速冷冻并储存在-86到-60℃下。如前所述，通过NGS测序对肝脏样本进行编辑分析。肝脏编辑的结果证明，在所有剂量均耐受良好的情况下，编辑率高达70％。使用所描述的LNP治疗预处理的皮质类固醇具有良好的耐受性。
实例14的材料和方法：使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录(IVT)合成mRNA。转录通常由包括T7启动子(SEQ ID NO:231)、本文公开的转录物序列，如SEQ ID NO:377(其对SEQ ID NO:311的RNA ORF进行编码)和在质粒中编码的poly-A尾(SEQID NO:263)的构建体执行。
对于所有方法，通过测量260nm(纳米滴)处的吸光度来测定转录物浓度，并通过借助于生物分析仪(安捷伦)的毛细管电泳来分析转录物。
LNP调配物
将脂质组分溶解在100％乙醇中，其中脂质组分摩尔比如下所述。将经化学修饰的sgRNA和Cas9 mRNA组合并溶解在pH为5.0的25mM柠檬酸盐、100mM NaCl中，从而导致总RNA货物的浓度为约1.5mg/mL。调配的LNP的N/P比率为约6，其中经化学修饰的sgRNA:Cas9mRNA的比率为1:2w/w，如下所述。LNP由50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG调配而成，并且通过如实例1中所述的错流技术形成LNP。在混合过程中，使用不同的流速维持水与有机溶剂的2:1比率。使用切向流过滤浓缩经稀释的LNP，并且然后在过滤和储存之前通过渗滤交换缓冲液。
Cas9 mRNA和gRNA货物
使用实例1中所述的方法，使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录产生加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。
基因组DNA分离
根据制造商的方案，使用50μL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目录QE09050)从肝脏样本中提取基因组DNA。如本文所述，使所有DNA样品经受PCR和后续NGS分析。
NGS测序
简而言之，为了定量地测定基因组中靶位置的编辑效率，分离基因组DNA并利用深度测序来鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如，TTR)周围设计PCR引物，并扩增所关注的基因组区。引物序列如下所示。根据制造商的方案(Illumina)执行另外的PCR以添加所需的化学物质进行测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与食蟹猴参考基因组(例如，macFas5)进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入、取代或缺失的读段数。
将编辑百分比(例如，“编辑效率编辑百分比”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。
实例15：在食蟹猴中通过30分钟和2小时静脉内输注施用的多剂量LNP研究
在LNP或媒剂对照施用之前至少1小时，通过静脉内团注注射以2mg/kg向队列中的n＝3只雄性食蟹猴施用地塞米松(Dex)。每个队列接受不同剂量的LNP以为每个NHP提供3mg/kg或6mg/kg(RNA)。表38中示出了给药组。两个队列接受3mg/kg的LNP剂量以比较输注时间。如下文和实例14中所述制备含有Cas9 mRNA和向导RNA的调配物。LNP调配物如下文和实例14中所述进行制备。接受3mg/kg LNP剂量(总RNA含量)的队列通过30分钟或120分钟静脉内输注施用。所有其它具有不同剂量的LNP(以mg/kg为单位，总RNA含量)的队列均通过120分钟静脉内输注施用。
表38：输注研究给药组
组号 测试材料 剂量水平(mg/kg) 输注时间(分钟) 动物数量
1 TSS对照 0 120 3
2 LNP 3.0 120 3
3 LNP 3.0 30 3
4 LNP 6.0 120 3
表39：编辑％和血清TTR
组号 肝脏编辑(％) TTR减少％
1 0.0(0.0，0.0，0.0) -28(-34，-23，-27)
2 63.3(50.8，69.0，69.9) 85(66，95，94)
3 63.3(65.0，66.0，58.8) 88(90，89,86)
4 74.5(75.3，74.6，73.6) 96(97，96，95)
在给药后第29天，在肌内注射氯胺酮/甲苯噻嗪的情况下，使用16号SuperCore活检针，通过靶向肝脏右叶/侧的单次超声引导的经皮穿刺活检来收集肝脏样本。每只动物收集1.0cm3到1.5cm3的总肝脏活检样本。每个活检样本在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。如前所述通过NGS测序对肝脏样本进行编辑分析并示出于图31B中。肝脏编辑的结果证明了高达约70％的编辑。图31A中描绘了血清TTR水平。使用所描述的LNP治疗预处理的皮质类固醇具有良好的耐受性。
表40：丙氨酸转氨酶(ALT)水平
Figure BDA0003377190340001701
分析样品的编辑数据百分比、血清TTR数据和丙氨酸转氨酶(ALT)水平，如表39和图31A-B以及表40和图31C中分别所示。肝脏编辑和血清TTR数据的结果表明，3mg/kg剂量(30分钟输注时间)和3mg/kg剂量(120分钟输注时间)之间的效力没有显著差异。然而，大于30'输注时间施用表明ALT(一种肝脏损伤生物标志物)水平较低。在3mg/kg剂量(30分钟输注时间)下观察到的ALT水平较高，这表明潜在的肝脏应激。
实例4的材料和方法：使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录(IVT)合成mRNA。转录通常由包括T7启动子(SEQ ID NO:231)、本文公开的转录物序列，如SEQ ID NO:377(其对SEQ ID NO:311的RNA ORF进行编码)和在质粒中编码的poly-A尾(SEQID NO:263)的构建体执行。
对于所有方法，通过测量260nm(纳米滴)处的吸光度来测定转录物浓度，并通过借助于生物分析仪(安捷伦)的毛细管电泳来分析转录物。
LNP调配物
将脂质组分溶解在100％乙醇中，其中脂质组分摩尔比如下所述。将经化学修饰的sgRNA和Cas9 mRNA组合并溶解在pH为5.0的25mM柠檬酸盐、100mM NaCl中，从而导致总RNA货物的浓度为约1.5mg/mL。调配的LNP的N/P比率为约6，其中经化学修饰的sgRNA:Cas9mRNA的比率为1:2w/w，如下所述。LNP由50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG调配而成，并且通过如实例1中所述的错流技术形成LNP。在混合过程中，使用不同的流速维持水与有机溶剂的2:1比率。使用切向流过滤浓缩经稀释的LNP，并且然后在过滤和储存之前通过渗滤交换缓冲液。
Cas9 mRNA和gRNA货物
使用实例1中所述的方法，使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录产生加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。
基因组DNA分离
根据制造商的方案，使用50μL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目录QE09050)从肝脏样本中提取基因组DNA。如本文所述，使所有DNA样品经受PCR和后续NGS分析。
NGS测序
简而言之，为了定量地测定基因组中靶位置的编辑效率，分离基因组DNA并利用深度测序来鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如，TTR)周围设计PCR引物，并扩增所关注的基因组区。引物序列如下所示。根据制造商的方案(Illumina)执行另外的PCR以添加所需的化学物质进行测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与食蟹猴参考基因组(例如，macFas5)进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入、取代或缺失的读段数。
将编辑百分比(例如，“编辑效率编辑百分比”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。
实例16：另外编号的实施例
提供了以下另外的实施例。
实施例A1是一种组合物，其包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
实施例A2是一种对TTR基因进行修饰和/或在TTR基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
实施例A3是一种降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列，由此降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在所述受试者中累积。
实施例A4是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的向导序列。
实施例A5是根据实施例A1或A4所述的组合物，其用于在细胞或受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)。
实施例A6是根据实施例A1、A4或A5所述的组合物，其用于对细胞或受试者中的TTR基因进行修饰。
实施例A7是根据实施例A1、A4、A5或A6所述的组合物，其用于治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)。
实施例A8是根据实施例A1、A4、A5、A6或A7所述的组合物，其用于降低受试者的TTR血清浓度。
实施例A9是根据实施例A1、A4、A5、A6、A7或A8所述的组合物，其用于减少或预防受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维累积。
实施例A10是根据实施例A2到A9中任一项所述的供使用的组合物或方法，其中所述方法包括通过输注施用所述组合物持续超过30分钟。
实施例A11是根据实施例A10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟或345-375分钟。
实施例A12是根据实施例A10或11所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约1.5-6小时。
实施例A13是根据实施例A10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟或约240分钟。
实施例A14是根据实施例A10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约120分钟。
实施例A15是根据实施例A2到A14中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物降低血清TTR水平。
实施例A16是根据实施例A15所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了至少50％。
实施例A17是根据实施例A151所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-98％、98-99％或99-100％。
实施例A18是根据实施例A2到17中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物导致TTR基因的编辑。
实施例A19是根据实施例A18所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑被计算为被编辑的群体的百分比(编辑百分比)。
实施例A20是根据实施例A19所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30与99％之间。
实施例A21是根据实施例A19所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30％与35％之间、35与40％之间、40与45％之间、45与50％之间、50与55％之间、55与60％之间、60与65％之间、65与70％之间、70与75％之间、75与80％之间、80与85％之间、85与90％之间、90与95％之间或95与99％之间。
实施例A22是根据实施例A2到A21中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少至少一个组织中的淀粉样沉积。
实施例A23是根据实施例A22所述的方法或供使用的组合物，其中所述至少一个组织包括以下中的一个或多个：胃、结肠、坐骨神经或背根神经节。
实施例A24是根据实施例A22或23所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物后8周测量淀粉样沉积。
实施例A25是根据实施例A22到A24中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中将淀粉样沉积与阴性对照或在施用所述组合物之前测量的水平进行比较。
实施例A26是根据实施例A22到A25中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在活检样品中和/或通过免疫染色测量淀粉样沉积。
实施例A27是根据实施例A22到A26中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在阴性对照中所见的淀粉样沉积。
实施例A28是根据实施例A22到A27中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在施用所述组合物之前所见的淀粉样沉积。
实施例A29是根据实施例A2到A28中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少两次。
实施例A30是根据实施例A29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少三次。
实施例A31是根据实施例A29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少四次。
实施例A32是根据实施例A29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至多五次、六次、七次、八次、九次或十次。
实施例A33是根据实施例A29到A32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天的间隔发生。
实施例A34是根据实施例A29到A32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔发生。
实施例A35是根据实施例A29到A32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月的间隔发生。
实施例A36是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括crRNA，所述crRNA包括所述向导序列并且进一步包括SEQ ID NO:126的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:126的核苷酸在其3'端处跟随所述向导序列。
实施例A37是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是双向导(dgRNA)。
实施例A38是根据实施例A37所述的方法或组合物，其中所述双向导RNA包括：包括SEQ ID NO:126的核苷酸序列的crRNA，其中SEQ ID NO:126的核苷酸在其3'端处跟随所述向导序列；以及trRNA。
实施例A39是根据实施例A1到A36中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是单向导(sgRNA)。
实施例A40是根据实施例A39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括具有SEQID NO:3的模式的向导序列。
实施例A41是根据实施例A39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ IDNO:3的序列。
实施例A42是根据实施例A39到A41中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列以及SEQ ID NO:126的核苷酸中的任一个。
实施例A43是根据实施例A39到A42中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID NO:87-113、115-120和122-124的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。
实施例A44是根据实施例A39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQID NO:87-113、115-120和122-124的序列。
实施例A45是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括至少一个修饰。
实施例A46是根据实施例A45所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。
实施例A47是根据实施例A45或46所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
实施例A48是根据实施例A45到A47中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
实施例A49是根据实施例A45到A48中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例A50是根据实施例A45到A49中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例A51是根据实施例A45到A50中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含前四个核苷酸之间的PS键。
实施例A52是根据实施例A45到A51中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含后四个核苷酸之间的PS键。
实施例A53是根据实施例A45到A52中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例A54是根据实施例A45到A53中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例A55是根据实施例A45到A54中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括SEQ ID NO:3的经修饰的核苷酸。
实施例A56是根据实施例A1到A55中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
实施例A57是根据实施例A1到A56中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA和所述包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
实施例A58是根据实施例A57所述的方法或组合物，其中所述LNP包括CCD脂质。
实施例A59是根据实施例A58所述的方法或组合物，其中所述CCD脂质是脂质A或脂质B，任选地其中所述CCD脂质是脂质A。
实施例A60是根据实施例A57到A59中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质。
实施例A61是根据实施例A60所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例A62是根据实施例A57到A61中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质(例如，PEG脂质)。
实施例A63是根据实施例A62所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
实施例A64是根据实施例A57到A63中任一项所述的方法或组合物，其中：
(i)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(ii)所述LNP包括约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约27-39.5mol％的辅助脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述LNP组合物的N/P比率为约5-7(例如，约6)；
(iii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(iv)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(v)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(vi)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约0-10mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(vii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；小于约1mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(viii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10，并且其中所述LNP组合物基本上不含或不含中性磷脂；或者
(ix)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-7。
实施例A64a是根据实施例A64所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质的mol％为约3。
实施例A64b是根据实施例A64或A64a所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为约50。
实施例A64c是根据实施例A64到A64b中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为约55。
实施例A64d是根据实施例A64到A64c中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为±3mol％。
实施例A64e是根据实施例A64到A64d中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为±2mol％。
实施例A64f是根据实施例A64到A64e中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为47-53mol％。
实施例A64g是根据实施例A64到A64f中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为48-53mol％。
实施例A64h是根据实施例A64到A64g中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为53-57mol％。
实施例A64i是根据实施例A64到A64h中任一项所述的方法或组合物，其中N/P比率为6±1。
实施例A64j是根据实施例A64到A64i中任一项所述的方法或组合物，其中N/P比率为6±0.5。
实施例A64k是根据实施例A64到A64j中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A。
实施例A64l是根据实施例A64到64l中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A的类似物。
实施例A64m是根据实施例A64l所述的方法或组合物，其中所述类似物是缩醛类似物。
实施例A64n是根据实施例A64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C4-C12缩醛类似物。
实施例A64o是根据实施例A64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C5-C12缩醛类似物。
实施例A64p是根据实施例A64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C5-C10缩醛类似物。
实施例A64q是根据实施例A64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12类似物。
实施例A64r是根据实施例A64到A64q中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例A64s是根据实施例A64到A64r中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
实施例A64t是根据实施例A64到A64s中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DPPC。
实施例A64u是根据实施例A64到A64t中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质包括二肉豆蔻酰甘油(DMG)。
实施例A64v是根据实施例A64到A64u中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质包括PEG-2k。
实施例A64w是根据实施例A64到A64v中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质是PEG-DMG。
实施例A64x是根据实施例A64w所述的方法或组合物，其中所述PEG-DMG是PEG2k-DMG。
实施例A64y是根据实施例A64到A64x中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP组合物基本上不含中性脂质。
实施例A64z是根据实施例A64y所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是磷脂。
实施例A65是根据实施例A57到A64z中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP组合物包括中性脂质，任选地其中所述中性脂质是DSPC。
实施例A66是根据实施例A64到A65中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质以约50mol％存在。
实施例A67是根据实施例A64到A66中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质以约9mol％存在。
实施例A68是根据实施例A62到A67中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质以约3mol％存在。
实施例A69是根据实施例A60到A68中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质以约38mol％存在。
实施例A70是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP的N/P比率为约6。
实施例A71是根据实施例A70所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例A72是根据实施例A64到A71中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A。
实施例A73是根据实施例A64到A72中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
实施例A74是根据实施例A62到A73中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
实施例A75是根据实施例A60到A74中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例A76是根据实施例A70中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例A77是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶。
实施例A78是根据实施例A77所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9。
实施例A79是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是经修饰的。
实施例A80是根据实施例A79所述的方法或组合物，其中经修饰的RNA引导的DNA结合剂包括核定位信号(NLS)。
实施例A81是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
实施例A82是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。
实施例A83是根据实施例A2到A82中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维。
实施例A84是根据实施例A83所述的方法或供使用的组合物，其中所述淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在神经、心脏或胃肠道中。
实施例A85是根据实施例A2到A84中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中非同源末端接合(NHEJ)导致在修复TTR基因中的DSB期间发生突变。
实施例A86是根据实施例A85所述的方法或供使用的组合物，其中NHEJ导致在修复TTR基因中的DSB期间缺失或插入核苷酸。
实施例A87是根据实施例A86所述的方法或供使用的组合物，其中所述核苷酸的缺失或插入在TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例A88是根据实施例A86所述的方法或供使用的组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例A89是根据实施例A88所述的方法或供使用的组合物，其中在50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例A90是根据实施例A86到A89中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的至少50倍或更多倍。
实施例A91是根据实施例A90所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的50倍到150倍、150倍到500倍、500倍到1500倍、1500倍到5000倍、5000倍到15000倍、15000倍到30000倍或30000倍到60000倍。
实施例A92是根据实施例A86到A91中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中小于或等于3、2、1或0个脱靶位点处，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例A93是根据实施例A92所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中的多个脱靶位点处，在所述原代人肝细胞中的所述脱靶位点的数量小于在Cas9过表达细胞中发生核苷酸的缺失或插入的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例A94是根据实施例A93所述的方法或供使用的组合物，其中所述Cas9过表达细胞是稳定表达Cas9的HEK293细胞。
实施例A95是根据实施例A92到A94中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过分析来自用Cas9 mRNA和向导RNA体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例A96是根据实施例A92到A94中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过寡核苷酸插入测定确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，所述寡核苷酸插入测定包括分析来自用Cas9 mRNA、向导RNA以及供体寡核苷酸体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例A97是根据实施例A1到A36或A39到A96中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA的序列是：
a)SEQ ID NO:92或104；
b)SEQ ID NO:87、89、96或113；
c)SEQ ID NO:100、102、106、111或112；或者
d)SEQ ID NO:88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109。
实施例A98是根据实施例A97所述的方法或组合物，其中所述向导RNA不在原代人肝细胞基因组中的蛋白质编码区中发生的脱靶位点处产生插入缺失。
实施例A99是根据实施例A2到98中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述组合物降低受试者的TTR的水平。
实施例A100是根据实施例A99所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低至少50％。
实施例A101是根据实施例A100所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％。
实施例A102是根据实施例A100或A101所述的方法或供使用的组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量所述TTR的水平。
实施例A103是根据实施例A100或A101所述的方法或供使用的组合物，其中在肝脏、脉络丛和/或视网膜中测量所述TTR的水平。
实施例A104是根据实施例A99到A103中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所述TTR的水平。
实施例A105是根据实施例A2到A104中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR。
实施例A106是根据实施例A2到A105中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人。
实施例A107是根据实施例A105或106所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTRwt。
实施例A108是根据实施例A105或106所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有遗传性ATTR。
实施例A109是根据实施例A2到A106或A108中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR家族史。
实施例A110是根据实施例A2到A106或A108到A109中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样多神经病。
实施例A111是根据实施例A2到A110中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的神经症状。
实施例A112是根据实施例A2到A111中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样心肌病。
实施例A113是根据实施例A2到110或112中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的心脏症状。
实施例A114是根据实施例A2到A113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V30突变的TTR。
实施例A115是根据实施例A114所述的方法或供使用的组合物，其中所述V30突变是V30A、V30G、V30L或V30M。
实施例A116是根据实施例A2到A113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有T60突变的TTR。
实施例A117是根据实施例A116所述的方法或供使用的组合物，其中所述T60突变是T60A。
实施例A118是根据实施例A2到A113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V122突变的TTR。
实施例A119是根据实施例A118所述的方法或供使用的组合物，其中所述V122突变是V122A、V122I或V122(-)。
实施例A120是根据实施例A2到A113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达野生型TTR。
实施例A121是根据实施例A2到A107或A120中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者不表达具有V30、T60或V122突变的TTR。
实施例A122是根据实施例A2到A107或A120到A121中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者不表达具有病理性突变的TTR。
实施例A123是根据实施例A122所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者对野生型TTR是纯合的。
实施例A124是根据实施例A2到A123中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用后，所述受试者的感觉运动神经病变的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例A125是根据实施例A124所述的方法或供使用的组合物，其中使用肌电图、神经传导测试或患者报告的结果来测量感觉神经病变变化的改善、稳定或减缓。
实施例A126是根据实施例A2到A125中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者的充血性心力衰竭的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例A127是根据实施例A126所述的方法或供使用的组合物，其中使用心脏生物标志物测试、肺功能测试、胸部X射线或心电图测量充血性心力衰竭变化的改善、稳定或减缓。
实施例A128是根据实施例A2到A127中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过病毒载体施用。
实施例A129是根据实施例A2到A127中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过脂质纳米颗粒施用。
实施例A130是根据实施例A2到A129中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物或调配物之前测试所述受试者的TTR基因中的特异性突变。
实施例A131是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69。
实施例A132是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5。实施例A133是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:6。实施例A134是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:7。实施例A135是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:8。实施例A136是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:9。实施例A137是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:10。实施例A138是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:11。实施例A139是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:12。实施例A140是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:13。实施例A141是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:14。实施例A142是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:15。实施例A143是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:16。实施例A144是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:17。实施例A145是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:18。实施例A146是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:19。实施例A147是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:20。实施例A148是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:21。实施例A149是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:22。实施例A150是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:23。实施例A151是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:24。实施例A152是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQID NO:25。实施例A153是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:26。实施例A154是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ IDNO:27。实施例A155是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:28。实施例A156是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:29。实施例A157是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:30。实施例A158是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:31。实施例A159是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:32。实施例A160是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:33。实施例A161是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:34。实施例A162是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:35。实施例A163是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:36。实施例A164是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:37。实施例A165是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:38。实施例A166是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:39。实施例A167是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:40。实施例A168是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:41。实施例A169是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:42。实施例A170是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:43。实施例A171是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:44。实施例A172是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:45。实施例A173是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:46。实施例A174是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:47。实施例A175是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQID NO:48。实施例A176是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:49。实施例A177是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ IDNO:50。实施例A178是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:51。实施例A179是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:52。实施例A180是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:53。实施例A181是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:54。实施例A182是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:55。实施例A183是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:56。实施例A184是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:57。实施例A185是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:58。实施例A186是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:59。实施例A187是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:60。实施例A188是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:61。实施例A189是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:62。实施例A190是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:63。实施例A191是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:64。实施例A192是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:65。实施例A193是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:66。实施例A194是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:67。实施例A195是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:68。实施例A196是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:69。实施例A197是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:70。实施例A198是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQID NO:71。实施例A199是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:72。实施例A200是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ IDNO:74。实施例A201是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:75。实施例A202是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:76。实施例A203是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:77。实施例A204是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:78。实施例A205是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:80。实施例A206是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:81。实施例A207是根据实施例A1到A130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:82。实施例A208是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框在其序列的至少前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性。
实施例A209是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例A210是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框中至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4、表5或表7中列出的密码子。
实施例A211是根据实施例A210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表4中列出的密码子。
实施例A212是根据实施例A210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低U密码子集合中的密码子。
实施例A213是根据实施例A210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低A密码子集合中的密码子。
实施例A214是根据实施例A210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低A/U密码子集合中的密码子。
实施例A215是根据实施例A210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表7中列出的密码子。
实施例A216是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％或123％。
实施例A217是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％。
实施例A218是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR。
实施例A219是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。
实施例A220是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括来自相同来源的5'UTR和3'UTR。
实施例A221是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸是包括选自帽0、帽1和帽2的5'帽的mRNA。
实施例A222是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:377具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例A223是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸是mRNA，在所述mRNA中，至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例A224是根据实施例A223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是以下中的一种或多种：N1-甲基假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷。
实施例A225是根据实施例A223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷中的一者或两者。
实施例A226是根据实施例A223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷。
实施例A227是根据实施例A223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。
实施例A228是根据实施例A223到A227中任一项所述的组合物或方法，其中所述mRNA中15％到45％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例A229是根据实施例A223到A228中任一项所述的组合物或方法，其中所述mRNA中至少20％或至少30％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例A230是根据实施例A229所述的组合物或方法，其中所述mRNA中至少80％或至少90％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例A231是根据实施例A229所述的组合物或方法，其中所述mRNA中100％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例A232是一种根据实施例A1或A4到A231中任一项所述的组合物或调配物的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。
序列表
以下序列表提供了本文公开的序列列表。应理解的是，如果DNA序列(包括Ts)是相对于RNA引用的，那么Ts应被Us替换(可以根据上下文修改或不修改)，反之亦然。
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*＝PS连接；“m”＝2'-O-Me核苷酸
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Figure IDA0003377190390000211
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Claims (91)

1.一种治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此治疗ATTR。
2.一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此降低TTR血清浓度。
3.一种用于减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用皮质类固醇和组合物，其中所述组合物包括：(i)RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸；以及(ii)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
由此减少淀粉样蛋白或淀粉样原纤维累积。
4.一种包括向导RNA的组合物，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
5.一种包括对向导RNA进行编码的载体的组合物，其中所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列，
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
6.一种组合物，其包括：
(i)向导RNA，所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列；以及
(ii)对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表1中列出的密码子；
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
7.一种组合物，其包括：
(i)对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括：
a.选自SEQ ID NO:5-82的向导序列；
b.选自SEQ ID NO:5-82的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或者
c.与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列；以及
(ii)对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表1中列出的密码子；
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；
所述组合物与皮质类固醇组合用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法中。
8.根据权利要求1到3或5到7中任一项所述的供使用的组合物或方法，其中所述方法包括通过输注施用所述组合物持续超过30分钟，例如超过60分钟或超过120分钟。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的向导序列。
11.根据权利要求4到10中任一项所述的组合物，其用于在细胞或受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、或降低受试者的TTR血清浓度或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松、倍他米松、强的松、泼尼松龙、甲基强的松龙、可的松、氢化可的松、去炎松或英塞米松(ethamethasoneb)。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在所述组合物之前施用所述皮质类固醇。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在所述组合物之后施用所述皮质类固醇。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中与所述组合物同时施用所述皮质类固醇。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之后约5分钟到约168小时内施用所述皮质类固醇。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或一周施用所述皮质类固醇。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前或之后施用至少两个剂量的所述皮质类固醇。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用至少两个剂量的所述皮质类固醇和至少两个剂量的所述组合物。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中以0.75mg到20mg的剂量或以约0.01-0.4mg/kg的剂量，如0.1-0.35mg/kg或0.25-0.35mg/kg向所述受试者施用所述皮质类固醇。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇通过静脉内注射施用于所述受试者。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中向所述受试者口服施用所述皮质类固醇，任选地其中在通过静脉内注射向所述受试者施用所述组合物之前，向所述受试者口服施用所述皮质类固醇。
25.根据权利要求24所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前6到12小时，以20mg的量向所述受试者口服施用所述地塞米松，或者在向所述受试者施用所述组合物之前6到12小时，以20mg的量向所述受试者静脉内施用所述地塞米松持续30分钟。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟或约240分钟。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法进一步包括施用输注预防，其中所述输注预防包括对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种，任选地其中所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的所述一种或多种与所述皮质类固醇同时施用和/或在所述组合物之前施用。
29.根据权利要求28所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂中的每一种。
30.根据权利要求28或29所述的方法或供使用的组合物，其中所述H1阻断剂和/或所述H2阻断剂是口服施用的。
31.根据权利要求28到30中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述输注预防包括静脉内皮质类固醇(如地塞米松8-12mg或10mg或等效物)和对乙酰氨基酚(如口服对乙酰氨基酚500mg)。
32.根据权利要求28到31中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用含向导RNA的组合物，例如LNP组合物之前，所述输注预防作为所需的术前用药施用。
33.根据权利要求28到32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述H1阻断剂是苯海拉明。
34.根据权利要求28到33中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述H2阻断剂是雷尼替丁。
35.根据权利要求1到35中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时施用第二剂量的所述皮质类固醇。
36.根据权利要求35所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法进一步包括施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的一种或多种，任选地其中所述对乙酰氨基酚、H1阻断剂或H2阻断剂中的所述一种或多种与所述第二剂量的所述皮质类固醇同时施用。
37.根据权利要求1到36中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇，并且在施用所述组合物之前约1-2小时与施用对乙酰氨基酚、H1阻断剂和H2阻断剂同时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约8-24小时以约6-10mg的量向所述受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约1-2小时与口服施用对乙酰氨基酚和静脉内施用H1阻断剂和H2阻断剂同时以约8-12mg的量向所述受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，任选地其中所述H1阻断剂是苯海拉明并且所述H2阻断剂是雷尼替丁和/或任选地其中所述受试者是人。
40.根据权利要求1到39中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约8-24小时以8mg的量向所述受试者口服施用第一剂量的地塞米松，并且在向所述受试者施用所述组合物之前约1-2小时与口服施用对乙酰氨基酚和静脉内施用H1阻断剂和H2阻断剂同时以10mg的量向所述受试者静脉内施用第二剂量的地塞米松，任选地其中所述H1阻断剂是苯海拉明并且所述H2阻断剂是雷尼替丁。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物以3mg/kg的量通过输注施用持续约1.5-6小时；在输注所述组合物之前约8-24小时口服施用第一剂量的所述皮质类固醇；并且在输注所述组合物之前约1-2小时静脉内施用第二剂量的所述皮质类固醇。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇提高了所述包括所述向导RNA的组合物的耐受性。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇降低了响应于所述包括所述向导RNA的组合物的炎症、恶心、呕吐、血液中ALT浓度升高、体温过高和/或痛觉过敏中的一种或多种的发生率或严重程度。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述皮质类固醇减少或抑制响应于所述包括所述向导RNA的组合物的一种或多种干扰素和/或炎性细胞因子的产生或活性。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物降低血清TTR水平。
46.根据权利要求45所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了至少50％。
47.根据权利要求1到46中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物导致TTR基因的编辑。
48.根据权利要求47所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑被计算为被编辑的群体的百分比(编辑百分比)，任选地其中所述编辑百分比介于群体的30％与99％之间。
49.根据权利要求1到48所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少至少一个组织中的淀粉样沉积，任选地其中所述至少一个组织包括以下中的一个或多个：胃、结肠、坐骨神经或背根神经节。
50.根据权利要求1到49所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少两次。
51.根据权利要求50所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月的间隔发生。
52.根据权利要求1到51中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导序列选自SEQ IDNO:5-82。
53.根据权利要求1到52中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA至少部分地与存在于人TTR基因中的靶序列互补。
54.根据权利要求53所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于人TTR基因的外显子1、2、3、或4中。
55.根据权利要求1到54中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导序列与TTR基因的正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物进一步包括与TTR基因的负链中的第二靶序列互补的第二向导序列。
56.根据权利要求1到55中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是单引导(sgRNA)。
57.根据权利要求56所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:5-82的向导序列以及SEQ ID NO:3的核苷酸21-100中的任一个。
58.根据权利要求56所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID NO:87-124的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。
59.根据权利要求58所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQ ID NO:87-124的序列。
60.根据权利要求1到59中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括至少一个修饰。
61.根据权利要求60所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键或经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
62.根据权利要求60到61中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含前四个核苷酸之间的PS键、后四个核苷酸之间的PS键、在5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸和/或在3'端处的后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
63.根据权利要求60到62中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括SEQ IDNO:3的经修饰的核苷酸。
64.根据权利要求1到63中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
65.根据权利要求64所述的方法或组合物，其中所述LNP包括可电离脂质。
66.根据权利要求64到65中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括可生物降解的可电离脂质。
67.根据权利要求64到65中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括胺脂质，例如CCD脂质。
68.根据权利要求64到66中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质。
69.根据权利要求64到67中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质，任选地其中：
(i)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(ii)所述LNP包括约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约27-39.5mol％的辅助脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述LNP组合物的N/P比率为约5-7(例如，约6)；
(iii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(iv)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(v)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(vi)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约0-10mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(vii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；小于约1mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(viii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10，并且其中所述LNP组合物基本上不含或不含中性磷脂；或者
(ix)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-7。
70.根据权利要求64到69中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括中性脂质。
71.根据权利要求64到70中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
72.根据权利要求64到71中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
73.根据权利要求1到72中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括RNA引导的DNA结合剂。
74.根据权利要求1到72中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷酸。
75.根据权利要求74所述的方法或组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
76.根据权利要求73到75中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶。
77.根据权利要求74到76中任一项所述的方法或组合物，其中所述多核苷酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少75％的密码子是表4中列出的密码子；
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％。
78.根据权利要求74到77中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸包括与SEQID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR；和/或与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。
79.根据权利要求74到78中任一项所述的组合物或方法，其中所述多核苷酸是mRNA，并且所述mRNA中的至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
80.根据权利要求73到79中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是经修饰的。
81.根据权利要求80所述的方法或组合物，其中经修饰的RNA引导的DNA结合剂包括核定位信号(NLS)。
82.根据权利要求1到81中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。
83.根据权利要求1到82中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维。
84.根据权利要求1到83中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中非同源末端接合(NHEJ)导致在修复TTR基因中的DSB期间发生突变。
85.根据权利要求1到84中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA的序列是：
a)SEQ ID NO:92或104；
b)SEQ ID NO:87、89、96或113；
c)SEQ ID NO:100、102、106、111或112；或者
d)SEQ ID NO:88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109，
任选地其中所述向导RNA不在原代人肝细胞基因组中的蛋白质编码区中发生的脱靶位点处产生插入缺失。
86.根据权利要求1到85中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述组合物降低所述受试者的TTR水平，任选地其中所述TTR水平降低了至少50％。
87.根据权利要求86所述的方法或供使用的组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液、或痰、或肝脏、脉络丛和/或视网膜中测量所述TTR水平，任选地其中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所述TTR水平。
88.根据权利要求1到87所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR、家族性淀粉样多神经病或家族性淀粉样心肌病。
89.根据权利要求1到88所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人。
90.根据权利要求1到89所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物或调配物之前测试所述受试者的TTR基因中的特异性突变。
91.一种根据权利要求1到90中任一项所述的组合物或调配物的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。
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