JP2023504773A - 眼遺伝子送達のためのａａｖベクター変異体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド配列並びに眼及び潜在的に他の組織への治療用導入遺伝子送達におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド配列及び視細胞又は網膜色素上皮細胞を標的にする、眼への治療用導入遺伝子送達におけるそれらの使用に関する。
光感受性の網膜光受容細胞（ＰＲ）の永久的な変性は、失明を引き起こす。視細胞の死は、色素性網膜炎（ＲＰ）においてなど、主にＰＲ若しくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に局在する遺伝性突然変異、又は例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）においてなど、視細胞の健康を冒す多因子性の状態によって誘発され得る。視細胞変性の多くの形態の原因となる遺伝子突然変異は、特定されており、治療用導入遺伝子の投与による介入を可能にしている。現行のＰＲを標的にする核酸ベースの療法は、ＰＲに対する損傷が最小限である初期疾患ステージでのみ有効である。機能し得る網膜内層細胞に光感受性を与える、適した視覚遺伝子タンパク質を用いる遺伝子療法は、より後の疾患ステージでも視覚を回復させる可能性があり得る。医療現場において実用的なこのようなアプローチを行うために、遺伝子送達のためのより良好な網膜浸透力を有する改善されたベクターが必要とされる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとする組換えベクターは、眼における治療用遺伝子導入の候補である。現在、ＡＡＶベクターは、典型的には、網膜下に投薬されている。しかしながら、網膜下投薬は、網膜厚及び視力の減少をもたらすことが示された。加えて、網膜下投薬は、注射液のかたまりに直接隣接する細胞においてのみ遺伝子導入及び発現を果たすが、有効な投与方法は、網膜の幅全体に沿って細胞に到達するべきである。眼のゼリー状の充填物（硝子体液）中への硝子体内注射は、網膜全体にベクターを送達する可能性を有するだけでなく、網膜下注射よりもかなり安全であり、技術的要求の厳しさがはるかに低い。しかしながら、神経網膜を硝子体液から分離する内境界膜（ＩＬＭ）は、多くのＡＡＶ血清型の天然の受容体が豊富にあり、それによりＡＡＶベクターに対して強固なバリアを築いている。硝子体内に送達された場合、ＩＬＭ及び他の網膜のバリアを通してより良好に浸透する操作されたＡＡＶベクターが、眼ＡＡＶ遺伝子療法の有効性及び安全性を増加させるために必要とされる。
当技術分野の上記の状況に基づいて、本発明の目的は、すべての網膜細胞種、詳細には網膜内層細胞及び視細胞を標的にすることを可能にする、網膜中への遺伝子導入のための手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
本発明の第１の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、それぞれ最も高い及び２番目に高いカプシド突出部に位置する、ＡＡＶ血清型２カプシドの４５３若しくは５８７／５８８位又は別の血清型のＡＡＶカプシドにおけるそれに相同な位置（表３：＃１、＃２）にペプチド挿入を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドに関する。ペプチド挿入物は、以下の配列：
ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＤＴＲＰＨＤＱ（Ｃａｐ５；配列番号１１）、ＥＨＹＮＳＴＣ（Ｃａｐ７；配列番号１２）、ＰＮＰＮＣＴＬ（Ｃａｐ９；配列番号１３）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＣＧＥＳＳＹＬ（Ｃａｐ１２；配列番号１５）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）
から選択される。
ペプチドは、他のアミノ酸（１、２、３、４、５又はさらに６ＡＡ）の短いストレッチが側面に位置し得る。カプシド配列内の示される位置の示される配列を埋めるための側面に位置するアミノ酸の特定の例は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒから選択することができる（しかし、これらに限定されない）。
このペプチド挿入物は、少なくとも試験した細胞種及び組織について、Ｉ－５８７の上記に示される位置のカプシド表面にペプチド挿入物を表すアデノ随伴ウイルスの感染効率及び／又はアデノ随伴ベクターの形質導入効率を増加させる。
ペプチド挿入物は、それらの細胞表面露出により、Ｉ－５８８又はＩ－４５３で同様に作用し得る。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、効果の少なくとも一部が、インビボにおけるヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合性がより低いことによるものと考える。
本発明の第２の態様は、第１の態様によるＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列に関する。特定の実施形態は、カプシド操作ＡＡＶベクターの生成のための、ＡＡＶ ｃａｐ配列、詳細にはＡＡＶ血清型２カプシド配列におけるこの核酸配列の包含を含む。
本発明の第３の態様は、網膜又はＲＰＥ細胞を冒す状態の治療のための、ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶベクター及び核酸配列から選択される作用物質に関する。この態様の代替形態は、視細胞又はＲＰＥ細胞を冒す状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に、本発明による作用物質を投与することを含む方法によって実現される。
本発明の作用物質を含む投与形態は、本発明のさらなる態様である。
選択されたカプシド変異体についての発現の網膜層特異性である。 硝子体内注射後のマウス網膜外層全体に及ぶ全網膜導入遺伝子発現の例である。 マウスの眼中への硝子体内注射後の、ＡＡＶ２（Ｍ６）及びＡＡＶ２（７ｍ８）との、新規なカプシドによって送達される導入遺伝子発現の比較である。
用語及び定義
本明細書に関する略語ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルスに関する。
本明細書に関するＡＡＶベクターという用語は、６０ＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシドに包まれたＡＡＶ核酸から構成されるウイルスベクターに関する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶビリオンに由来するが、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムからｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を除去することにより、ヘルパーウイルスの存在下において複製することができないように操作されている。カプシドに包まれたＡＡＶ核酸は、標的細胞に送達される導入遺伝子を含み得る。
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、すべて当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学における）によって通常理解されるものと同じ意味を有する。標準的な技術が分子的、遺伝学的及び生化学的方法（一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）並びに化学的方法に使用される。
本明細書に関するＡＡＶカプシドという用語は、本発明者らによって生成され、且つ本明細書において下記に掲げられる操作されたカプシド（ｃａｐ）遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本明細書において開示されるＡＡＶカプシドは、遺伝子療法のための組換えアデノ随伴ウイルスベクターを組み立てるために使用され得る。
本明細書に関するＡＡＶカプシドにおけるアミノ酸位置に対する参照は、配列番号１の配列を有するアデノ随伴ウイルス２カプシドタンパク質ＶＰ１のカプシドアミノ酸配列に関するものである（表２）（対応する核酸配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、Ｊ０１９０１．１である）。他の相同なアデノ随伴ウイルス血清型についての対応するアミノ酸位置は、表３に示される。
本明細書に関する相同なという用語は、ＡＡＶの様々な血清型に由来する核酸配列又はアミノ酸配列に関するものである。様々なアデノ随伴ウイルス血清型の対応する位置は、表３に示される。
本明細書に関する導入遺伝子という用語は、ある生物から別の生物に移動した遺伝子又は遺伝的物質に関するものである。本明細書に関して、この用語は、それが欠失している患者の組織中への、遺伝子配列の自然の変異体又は生理学的に損なわれていない変異体の移動も指し得る。この用語は、自然のコード配列の移動をさらに指し得、発現は、標的組織において存在しないか又は発現が停止しているプロモーターによって駆動される。
本明細書に関する組換えという用語は、クローニング、制限及び／又はライゲーションの１回又は数回のステップの産物であり、且つ天然に存在する核酸と異なる核酸に関する。組換えウイルス粒子は、組換え核酸を含む。
本明細書に関する硝子体内投与という用語は、医薬作用物質、例えばウイルスベクターの投与経路に関し、作用物質は、眼の硝子体中に送達される。硝子体内投与は、硝子体ゲルと呼ばれるゼリー状の液で満たされている、硝子体腔と呼ばれる眼の後部のスペースに直接医薬品を入れる手順である。
本明細書に関する網膜下投与という用語は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞と視細胞との間のスペースへの、医薬作用物質、詳細には本明細書に関するウイルスベクターの投与経路に関する。
本明細書に関するポリペプチドという用語は、線状の鎖を形成する５０以上のアミノ酸からなる分子に関し、アミノ酸は、ペプチド結合によってつながっている。ポリペプチドのアミノ酸配列は、全体的な（生理学的に見られるような）タンパク質のアミノ酸配列又はその断片を示し得る。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において区別なく使用され、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基の配列として本明細書において開示される。
アミノ酸残基の配列は、アミノ末端からカルボキシル末端に示される。配列位置にある大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄｅｄ．ｐ．２１）。アミノ酸配列位置にある小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を指す。配列は、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で記される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基配列は、以下の通りに示されるように３文字又は単一文字コードによって称される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
変異体という用語は、参照ポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持するポリペプチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、参照として使用される別のポリペプチドとその一次アミノ酸配列が異なる。一般に、差は、限られており、参照ポリペプチド及び変異体の配列は、全体的に密接に類似しており、多くの領域において同一である。変異体及び参照ポリペプチドは、１つ以上の修飾（例えば置換、追加及び／又は欠失）によってアミノ酸配列が異なり得る。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などのように天然に存在し得るか、又は天然に存在することが知られていない変異体であり得る
本明細書に関する生物学的活性という用語は、本明細書において含まれるポリペプチドのある変異体によって表される詳細に測定可能な数量に関する。例えば、網膜細胞中への遺伝子導入を促進するウイルスベクターの能力に関して、カプシド変異体の生物学的活性は、標準的なアッセイにおいて、インビボにおいて、培養細胞への又はモデル生物への導入遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ）の発現を測定することによってアッセイされ得る。
本明細書に関して、配列同一性及び配列同一性のパーセンテージという用語は、２つのアラインメントされた配列を比較することによって決定される値を指す。比較のための配列のアラインメントのための方法は、当技術分野においてよく知られている。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法又はＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されないこれらのアルゴリズムのコンピューターでの実装によって行われ得る。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。
アミノ酸配列の比較のための１つの例は、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ。核酸配列の比較のための１つのこのような例は、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：２８；Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ：１．－２；Ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：Ｌｉｎｅａｒ。特記されない限り、本明細書において提供される配列同一性の値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較のための上記に特定されるデフォルトパラメーターを使用し、プログラムのＢＬＡＳＴスイートを使用して得られる値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。
本明細書に関して、アミノ酸リンカーという用語は、単鎖ポリペプチドを生成するため、２つのポリペプチドをつなぐために使用される可変長のオリゴペプチドを指す。本明細書において明記される本発明を実施するのに有用なリンカーの例示的な実施形態は、１～６アミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、下記に例示されるようにＡＡＡ又はＡＡである。
ＡＡＶは、ヒト及び他の霊長目の種に感染する小さい非病原性ウイルスである。
ＡＡＶ２感染は、細胞表面受容体ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）へのドッキングによって始まる。グリカンに対するその低結合親和力は、共受容体αｖβ５又はα５β１インテグリンへの結合を促進するカプシドの可逆的な構造の再編成を誘発し、クラスリン被覆ピットの形成を誘発する。クラスリン被覆ピットは、エンドサイトーシスを介して内部移行され、ウイルス粒子は、核に運搬される。ｐＨは、エンドソームコンパートメントの酸性化により下がるが、これは、エンドソーム小胞の成熟の特徴である。酸性化によって引き起こされる立体構造の変化がカプシドにおいて生じ、ウイルスは、脂肪分解性ポア形成によって後期エンドソームから脱出する。
野生型ＡＡＶにおいて、ゲノムは、ポジティブセンス又はネガティブセンスの４．７キロベース長の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）でできている。ゲノムは、末端逆位配列（ＩＴＲ）が側面に位置する３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの５’及び３’端の自己相補的、ＣＧリッチ、Ｔ字型ヘアピンであり、組換えベクターゲノム中に存在する唯一の必要なウイルス構成成分である。ＩＴＲは、末端解離部位（ＴＲＳ）及びＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、これらは、ウイルスゲノムの複製及びカプシド形成を促進する。ＯＲＦは、遺伝子ｒｅｐ、ｃａｐ、ＡＡＰをコードする。ｒｅｐによってコードされる４つの多機能性非構造的Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ生活環に必要とされる。Ｃａｐは、共に相互作用して、正二十面体対称のカプシドを形成するカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びに新たに産生されたＶＰタンパク質を安定化し、細胞質から細胞核に運搬するために必要とされる組み立て活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。３つのＶＰは、すべて１つのｍＲＮＡから翻訳されるが、スプライシングが異なる。最も大きい９０ｋＤａのＶＰ１は、スプライシングされていない転写物であり、７２ｋＤａのＶＰ２は、一般的ではないＡＣＧ開始コドンから翻訳されるのに対して、最も小さい６０ｋＤａのＶＰ３は、ＡＵＧコドンから翻訳される。３つのＶＰは、すべて重複するＣ末端を有する。
ＶＰ３は、カプシドの９０％を構成し、ＶＰ１及びＶＰ２は、ＶＰ３と共通のＣ末端アミノ酸配列を共有するが、カプシドの内側に埋まった状態のＮ末端延長部を有する。ＶＰ１のユニークなＮ末端配列は、感染に必要とされるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性及び核移行シグナルを含有する。３つのＶＰモノマーは、２回、３回及び５回軸対称性に組み立てられ、６０サブユニットのＡＡＶカプシドを作り出す。本発明の第１の態様は、ＡＡＶ血清型２カプシドの４５３位又は５８７位のピーク又はスパイク状の突出部にペプチド挿入物を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドに関する。ペプチド挿入物は、以下の配列：
ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＤＴＲＰＨＤＱ（Ｃａｐ５；配列番号１１）、ＥＨＹＮＳＴＣ（Ｃａｐ７；配列番号１２）、ＰＮＰＮＣＴＬ（Ｃａｐ９；配列番号１３）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＣＧＥＳＳＹＬ（Ｃａｐ１２；配列番号１５）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）
から選択され、詳細には、挿入物は、ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）から選択される。
上記に説明されるペプチド挿入物は、７～１３ｍｅｒ中に含まれ、前の段落において示される挿入配列のＮ及び／又はＣ末端に挿入される、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒから選択されるが、これらに限定されない０～６のリンカーアミノ酸が側面に位置する（６は、Ｎ及びＣ末端で側面に位置するアミノ酸の総数の最大数である）、上記の配列の１つからなり得る。
本明細書において示されるＡＡＶ２配列について示されるいかなる位置も、ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｊ０１９０１．１（アデノ随伴ウイルス２、完全なゲノム）で入手できる参照配列に関するものである。対応するアミノ酸配列は、表２において配列番号１として示される。
スパイク状の突出部（ピーク）は、カプシドの最も露出している領域に相当する。最も高いピークは、ＡＡＶ２カプシドアミノ酸４５３位に位置し、２番目に高いピークは、５８７位に位置する。これらのピークは、カプシドの組み立てを妨害することなくペプチド挿入を受け入れ、非許容細胞を標的にする機会を提供する。同様に、突出部は、ＡＡＶ宿主相互作用、受容体結合及び免疫原性の重要な部位に相当する。注目すべきことに、ある実施形態において、Ｒ５８５及び５８８は、挿入物が４５３位に挿入される場合、最適な効力を獲得するために突然変異される。
ペプチド挿入物が導入される、あるピーク又はスパイク状の突出部の位置に言及する場合、ペプチド挿入物は、この位置の直後（Ｃ末端方向に）又はＣ末端方向にさらに１～６アミノ酸にあり得ることが理解されるべきである。例えば、５８７位になるように定められたペプチド挿入物（事前の挿入位置５８７及び５８８間として定められた挿入）は、５８８位若しくは５８９位（Ｃ末端方向にさらに１若しくは２アミノ酸）又は５９０位（Ｃ末端方向にさらに３アミノ酸）から始まり得る。これらの挿入位置は、すべて全体的なカプシド構造を妨害せず、むしろ形質導入効率を増加させ得るペプチド挿入物を想定したものである。
このペプチド挿入物は、硝子体内送達後のウイルスの網膜浸透力及び形質導入効率を増加させる。
ある実施形態において、ペプチド挿入物は、ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＤＴＲＰＨＤＱ（Ｃａｐ５；配列番号１１）、ＥＨＹＮＳＴＣ（Ｃａｐ７；配列番号１２）、ＰＮＰＮＣＴＬ（Ｃａｐ９；配列番号１３）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＣＧＥＳＳＹＬ（Ｃａｐ１２；配列番号１５）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）から選択される。
ある実施形態において、ペプチド挿入物は、ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）から選択される。
ペプチド挿入物は、ＡＡＶカプシドポリペプチド中にそのままで又はアミノ末端及び／若しくはカルボキシル末端に１、２、３若しくは４の側面に位置するスペーサーアミノ酸がある状況で存在することができる。適したスペーサーＡＡは、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン及びセリンを含むが、これらに限定されない。
本発明者らの実施例において、使用されるクローニング戦略のために、ＡＡＶ２ ＶＰ１のＮ５８７とＲ５８８との間の挿入は、形態Ｒ５８５ＧＮＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７－ＡＡＲ５８８ＱＡＡの１２ｍｅｒであり、Ｘ１～Ｘ７は、挿入された七量体オリゴを示し、Ａは、側面に位置するリンカーを示す。これは、例にすぎず、本発明は、まさにこれらの側面に位置する配列を有する、まさにこの位置にある挿入物に限定されないことが理解されるべきである。
ＡＡＶ２において５８７に指定される挿入位置に関する実施形態において、オリゴは、常にＡＡＶ２のＶＰ１の５８７位と５８８位との間に挿入される。それは、挿入であり、したがって、ＶＰ１ ＡＡＶ２ナンバリングは、変化せず、後続の位置は、置換及び同様のものに関して「挿入物なしで」カウントされる。挿入されるペプチドは、本明細書において明記されるように、七量体を含有するが、潜在的に機能するのにより短いか又はより長いこともできる。実施例において示される実施形態において、本発明者らは、ＡＡＡ－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ７－ＡＡの形態の１２ｍｅｒを挿入したが、リンカーアミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから自由に選択することができる。Ｎ末端及びＣ末端リンカーは、０～５のＡＡ長であり得る。ある実施形態において、挿入ペプチドは、０～６のリンカーアミノ酸を含む５～１３のアミノ酸長であり得る。
ある実施形態において、ペプチド挿入（本明細書の他の部分では「オリゴ」と称される）は、さらにＣ末端に１～５ＡＡ動かすことができる。ＡＡＶ２について、挿入部位は、アミノ酸４５３（例えば、そのすぐＣ末端側）でもあり得る。
本発明のこの第１の態様の代替形態によれば、上記に詳述されるペプチド配列のいずれも、５８７位の代わりに配列番号００１の４５３位に挿入される。さらに、挿入の位置は、変動し得、ペプチド配列は、上記に示される挿入物が側面に位置し得、５～１３ＡＡからなり得る。４５３位のペプチド挿入に加えて、Ｒ５８７Ａ及びＲ５８８Ａ突然変異がＡＡＶ２のＶＰ１中に導入され得る（Ｂｏｕｃａｓ Ｊｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００９ Ｄｅｃ；１１（１２）：１１０３－１３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｇｍ．１３９２）。
本発明のこの態様の別の代替形態によれば、ＡＡＶ血清型２における５８７位／５８８位又は４５３位に相同な位置は、上記に詳述される挿入されるペプチド配列の１つを有する別の血清型のＡＡＶを構築するために選択することができる（表３：＃１、＃２）。
ある実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、チロシン残基の１つ又はいくつかのチロシンからフェニルアラニンへの置換によって特徴付けられ、チロシン残基は、野生型カプシド配列において２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び７３０位に存在する。
本明細書におけるカプシド変異体のいくらかは、チロシン修飾カプシドに関して進化的方法によって選択された。
ある実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、２５２、２７２、４４４、５００、７０４及び７３０位における１つ又はいくつかのチロシンからフェニルアラニンへの置換によって特徴付けられる。
あるさらに特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、２５２、２７２、４４４、５００、７００及び７３０位のすべてにおけるいくつかのチロシンからフェニルアラニンへの置換によって特徴付けられる。
本発明のこの態様の別の代替形態によれば、ＡＡＶ血清型２における２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び７３０位のいずれかに相同なチロシンの位置は、チロシンからフェニルアラニンへの置換を有する別の血清型のＡＡＶを構築するために、フェニルアラニンへの置換のために選択することができる（表３：＃３～＃９）。さらに、他のチロシンの位置がフェニルアラニンに置換され得る。
ある実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、１つ又はいくつかのトレオニンからバリンへの置換、詳細にはＴ４９１Ｖによって特徴付けられる。
本発明のこの態様の別の代替形態によれば、ＡＡＶ血清型２における４９１位に相同なトレオニンの位置は、トレオニンからバリンへの置換を有する別の血清型のＡＡＶを構築するために、バリンへの置換のために選択することができる（表３：＃１０）。
ある実施形態において、上記に述べられるチロシンからフェニルアラニンへの置換は、トレオニンからバリンへの置換、詳細にはＴ４９１Ｖと組み合わせられる。
Ｙ－Ｆ及びＴ－Ｖ突然変異は、ユビキチン化を減少させ、したがって細胞によって一度内部移行されたウイルス粒子のプロテアソーム分解を減少させ、それにより形質導入効率を増加させる。
ある実施形態において、アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドは、配列番号２～配列番号９から選択されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８５％の同一性及び配列番号２～配列番号９から選択される配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有する配列を含む。
生物学的活性アッセイ：
「（参照）配列の生物学的活性の少なくともあるパーセンテージを有する」ポリペプチドが本明細書において参照される場合には常に、この生物学的活性は、以下の通りに測定することができる。
ＨＥＫ２９３細胞は、試験又は参照ポリペプチドをコードするプラスミド、ヘルパーアデノウイルス遺伝子を有するプラスミド及びレポーターとしてｓｃＣＭＶ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｓｃＥｆ１ａ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｓｃＣＭＶ－ＥＧＦＰ、ｓｃＥｆ１ａ－ＥＧＦＰから選択される導入遺伝子プラスミドにより、リン酸カルシウム沈殿法を使用してコトランスフェクトされる。導入遺伝子を含有するベクターは、イオジキサノール勾配に対する密度精製によって濃縮し（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ、Ｏｓｌｏ）、４０％イオジキサノール画分は、その後、例えばアミコンろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってバッファーを交換する。ＡＡＶ画分は、リアルタイムＰＣＲによってＤＮａｓｅ抵抗性ベクターゲノムについて力価を測定し、標準ベクターと比べる。３μｌのウイルスベクターを、麻酔をかけた（１００ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジン）野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの硝子体内に注射する。注射について、ウイルスは、Ｅ１１ ＧＣ／ｍｌと力価が同等であり、その３ｕｌ、すなわち１目当たり３×Ｅ８ｖｇを注射する。マウス網膜は、免疫組織化学的分析のために注射の３週間後に取り出す。マウスの眼の網膜組織片（形質導入の７日後）を室温（ＲＴ）で４０分間、ＰＢＳ中４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドにより固定し、段階的なスクロース溶液（ＰＢＳ中１０％、２０％及び３０％スクロース）において４℃で３夜続けて凍結保護し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドによりクリオモルド中に包埋し（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）、液体窒素で冷却した２－メチルブタン中で凍結させる。１０μｍの厚さの垂直方向の切片をクリオスタットでカットし、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔガラススライド（Ｍｅｎｚｅｌ）にマウントし、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ又はＴｕｒｂｏ６３５蛍光及び特異的な網膜細胞種を検出するのに適した一次及び二次抗体により免疫組織化学的に標識する。標的細胞種におけるレポーターの発現は、典型的には、蛍光によって定量化し、操作されたウイルスカプシドの生物学的活性を評価するために、残りの組織におけるレポーターの量と比較する。操作されたウイルスカプシドの生物学的活性のための別の判断基準は、形質導入された標的細胞のパーセンテージ及び発現している組織の面積である。疑義を避けるために、標的細胞種におけるレポーター発現を定量化し、残りの組織におけるレポーターの量と比較するアッセイは、生物学的活性を測定する場合に用いられる。
本発明の第２の態様は、第１の態様によるＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
特定の実施形態において、本発明によるＡＡＶ配列は、宿主ゲノムへの統合に必要とされるＲｅｐエレメントを含有しない。非統合ウイルスは、ヒトにおける投薬にとってより安全である。ある実施形態において、核酸配列は、自己相補的ＡＡＶベクターゲノム構想に従って設計される。すべての場合において、一本鎖ＤＮＡ配列が使用される。
ある実施形態において、核酸配列は、調節配列を有する又は有しない導入遺伝子を含む。
ある実施形態において、導入遺伝子は、適切なタンパク質（すなわちＲＰＥ６５）、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ（有力な病原性遺伝子の野生型及び突然変異型ＲＮＡを分解するためにｍＲＮＡの領域を標的にするように設計された）又は遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｇＲＮＡカセットの配列をコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、無脊椎動物又は脊椎動物のオプシン又はその変異体などの光感受性タンパク質をコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、チャネルロドプシン－２又はその変異体をコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、例えば、ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ）又はアーチロドプシン（ＡｒｃｈＴ）などの微生物光開閉性阻害性イオンポンプをコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、例えば、ヒトロドプシン、メラノプシン又は錐体オプシンなどのＧＰＣＲオプシンをコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、光スイッチ可能なリガンドに対する受容体タンパク質をコードする。
ある実施形態において、導入遺伝子は、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下にある。ある実施形態において、プロモーター配列は、ヒト網膜細胞において作動可能である。
ある実施形態において、プロモーターは、ユビキタスプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、細胞特異的プロモーターである。
ある実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、ヒトＥｆ１ａプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、視細胞特異的プロモーターである。
本発明の第３の態様は、医療において／薬剤として使用するための、第１の態様によるＡＡＶカプシドポリペプチド、第１の態様によるカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター及び第２の態様による核酸配列から選択される作用物質に関する。
ある実施形態において、ＡＡＶベクターは、眼の細胞を形質導入するために使用される。
眼は、種々の解剖学的構造から構成される３つの層からできている。線維膜は、最外側層であり、角膜及び強膜から構成される。血管膜又はブドウ膜は、中間層であり、脈絡膜、毛様体、色素上皮及び虹彩からなる。網膜は、最内側層であり、脈絡膜の血管（後方）及び網膜血管（前方）から酸素供給を受ける。
角膜と水晶体との間のスペースは、房水により満たされており、水晶体の後ろの後方の腔全体は、ゼリー状の物質である硝子体により満たされている。硝子体は、水、コラーゲン、原線維、ヒアルロン酸及びイオンから構成される。ニューロンも血管も占めていない網膜における空間は、網膜細胞層のすべてにわたるミュラーグリア細胞の突起によって満たされている。
網膜の外境界膜（ＯＬＭ）は、ミュラー細胞（ＭＣ）と光受容細胞の内節との間の接合部から形成され、網膜下のスペース間で代謝的なバリアとして作用し、大きい分子の通過を制限している。網膜の内境界膜（ＩＬＭ）は、ＭＣエンドフィートと基底膜との間の隣接接合によって形成され、硝子体液と神経網膜との間の拡散バリアとして作用する。
網膜は、黄斑、視神経乳頭、中心窩及び周辺部網膜から構成される。光受容細胞は、網膜において見られる特殊なタイプの神経上皮細胞である。３つのタイプの光受容細胞が知られている：杆体、錐体及び光感受性網膜神経節細胞。杆体は、網膜の周辺領域に分布するのに対して、黄斑と呼ばれる中心の色素性の領域は、錐体光受容細胞が豊富である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、栄養を提供し、光受容細胞の健康を維持する。光受容細胞の核は、外顆粒層（ＯＮＬ）を構成するのに対して、双極細胞、アマクリン細胞及び水平細胞の核は、内顆粒層（ＩＮＬ）中に位置する。
ある実施形態において、第１の態様によるＡＡＶカプシドポリペプチド、第１の態様によるカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター及び第２の態様による核酸配列から選択される作用物質は、
ａ．網膜細胞又は網膜色素上皮細胞、及び／又は
ｂ．網膜の視細胞、双極細胞、アマクリン細胞又は神経節細胞
を冒す状態の治療において使用するためのものである。
ある実施形態において、作用物質は、緑内障、色素性網膜炎、黄斑変性症、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、色盲又は色覚異常、黒色腫関連網膜症、先天性停在夜盲症、錐体杆体ジストロフィー、末期加齢性黄斑変性、黄斑症、早発性重度網膜ジストロフィー、色盲、眼白子症、眼皮膚白皮症、シュタルガルト病、コロイデレミア、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡＴ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩなど、角膜を冒すリソソーム蓄積症、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫、高血圧性網膜症の治療において使用するためのものである。
ある実施形態において、本発明の作用物質は、内耳を冒す疾患の治療又は予防のために用いることができる。
ある実施形態において、作用物質は、
ａ．硝子体内投与、詳細には硝子体内注射、又は
ｂ．網膜下投与
によって投与される。
ある実施形態において、作用物質は、後区、前区、強膜、脈絡膜、結膜、虹彩、水晶体又は角膜に送達される。
同様に、色素性網膜炎を含む杆体錐体ジストロフィー、黄斑変性症を含む錐体杆体ジストロフィー及び先天性停在夜盲症（ＣＳＢＮ１）から選択される状態の治療を、それを必要とする患者において行うための方法であって、上記の説明によるＡＡＶカプシド及び／又は核酸配列を含むウイルスベクターを患者に投与することを含む方法は、本発明の範囲内である。
同様に、錐体杆体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー及び先天性停在夜盲症から選択される状態の予防又は治療のための投薬形態であって、本発明の上記の態様の１つによるＡＡＶカプシド及び／又は核酸配列を含む投薬形態が提供される。
本明細書において開示される作用物質及び方法は、ＰＲに対する損傷が小さい初期疾患ステージでも相当な利益をもたらし、本発明によって推進されるベクターは、いかなる既存の代替物もよりも効力がある。
例えば、ＡＡＶ血清型タンパク質若しくはカプシドペプチド挿入物配列又は医学的適応症などの単一の分離可能な特徴に対する代替形態が「実施形態」として本明細書で説明される場合には常に、このような代替形態は、本明細書において開示される本発明の別個の実施形態を形成するために自由に組み合わされ得ることが理解されるべきである。
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに例証され、これらからさらなる実施形態及び利益を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を例証するが、その範囲を限定することを意図するものではない。
図の説明
図１ 以下ＡＡＶ２（Ｍ６）及び最先端の合成カプシドＡＡＶ２（７ｍ８）と称される選択バックボーンＡＡＶ２（Ｙ２５２、２７２、４４４、５００、７００、７３０Ｆ）と比較した、選択されたカプシド変異体についての発現の細胞特異性である。ＡＡＶのすべては、ある網膜細胞種に対する一方のプロモーターのバイアスの可能性を除去するために、２つのユビキタスプロモーターｈＥＦ１ａ及びＣＭＶ下でｅＧＦＰ又はｍＣｉｔｒｉｎｅを発現する自己相補的（ｓｃＡＡＶ）としてパッケージした。視細胞（ＯＮＬ）における発現は、ＡＡＶ２（Ｍ６）及びＡＡＶ２（７ｍ８）とは対照的に、硝子体内注射後、新規な変異体について有意に増強する。硝子体内に注射した２．５μｌは、１Ｅ＋１１ｖｇ／ｍｌと力価が同等である（３Ｅ＋１０のＣａｐ１４を除く）。４つの網膜についてカウントした、平均±ｓ．ｄ．。ＩＮＬ、内顆粒層；ＧＣＬ、神経節細胞層；ＤＡＰＩ、核染色ＤＡＰＩにより染色されたすべての細胞体の数。
図２ 最先端のＡＡＶ２（７ｍ８）と比較した、１００×低下させた機能的力価での示される新規なカプシド変異体についてのＯＮＬ全体に及ぶ全網膜の強力な発現である。注射は、すべて力価が同等であり、７．４Ｅ＋７ｖｇをＣ５７ＢＬ／６マウスの硝子体に送達した。Ａ．ｓｃＣａｐ５－ＣＭＶ－ＥＧＦＰによる形質導入後のマウス網膜ホールマウントのＯＮＬに焦点を合わせた低倍率画像。Ｂ～Ｃ．垂直方向の網膜凍結切片。顕微鏡写真から、ＡＡＶ２（７ｍ８）と比較して低い力価での新規なカプシドの効力が明らかである。
図３ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼への２．５μｌ ｓｃＡＡＶの硝子体内注射後の形質導入の比較である（例えば、ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２０１５．１３（５）：ｐ．ｅ１００２１４３において記載される）。ヒトＥｆ１ａプロモーターの制御下でのｍＣｉｔｒｉｎｅ発現、力価は、１Ｅ＋１１ｖｇ／ｍｌと同等である。垂直方向の免疫標識網膜凍結切片の顕微鏡写真から、ｓｃＡＡＶ２（Ｃａｐ３）及びｓｃＡＡＶ２（Ｃａｐ５）は、ＩＬＭ及び網膜層に良好に浸透し、最先端のＡＡＶ（７ｍ８）又は粗製ライブラリーバックボーンＡＡＶ２（Ｍ６）と比較した場合、ＯＮＬの視細胞において他に類のない発現効率を示すことが明らかである。
実施例１：ペプチドディスプレイライブラリーの生成
ＡＡＶカプシドは、６０サブユニットを有する正二十面体である。カプシドサブユニットが組み立てられた場合に形成されるＡＡＶカプシドの３回軸において、カプシドの最も露出する領域に相当するスパイク状の突出部（ピーク）が形成される。ＡＡＶ２カプシドでは、最も高いピークは、アミノ酸（ＡＡ）４５３位に位置し、２番目に高いピークは、ＡＡ５８７／５８８位に位置する（ＡＡＶ２－ＶＰ１ナンバリング）。これらのピークは、ウイルスカプシドの組み立てを妨害することなくペプチド挿入を受け入れ、宿主相互作用、受容体結合及び免疫原性の重要な部位に相当する。ペプチドディスプレイライブラリーを生成するために、本発明者らは、ＡＡＶ２（Ｍ６）と称される、６つのチロシンからフェニルアラニンへの突然変異（Ｙ２５２、２７２、４４４、５００、７００、７３０Ｆ）をさらに含有するＡＡＶ２のＶＰ１のオープンリーディングフレームのＮ５８７とＲ５８８との間において、無作為に選択したヘプタペプチドを挿入した（表２）。Ｙ－Ｆ及びＴ－Ｖ突然変異（Ｂｕｅｎｉｎｇ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９ Ｊａｎ ２６；１２：２４８－２６５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１９．０１．００８）は、ユビキチン化を減少させ、したがって細胞によって一度内部移行されたウイルス粒子のプロテアソーム分解を減少させ（Ｐｅｔｒｓ－Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１１．１９：ｐ．２９３－３０１．）、それにより形質導入効率を増加させ、変異体が初期段階において非常に少数である細胞内進化における選択のプロセスに潜在的に好都合であることが以前に示された。無作為の挿入は、表３において示されるように、他のカプシド血清型のＧＨループ（ループＩＶ）における相同な部位でなすことができる。本発明者らがライブラリーを開発した方法に対するアプローチには、Ｐｅｒａｂｏ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｐｅｒａｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００３．８：ｐ．１５１－１５７）を取り入れた。２つのユニークな制限部位、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩをＡＡＶ２（Ｍ６）ゲノムのアミノ酸５８７及び５８８間に導入した（表２）。ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ部位を形成する導入されたＤＮＡ断片は、アラニンリンカーが側面に位置する停止コドンをコードした（ＡＡＡｓｔｏｐＡＡ）。次に、ＮＮＢコドンを有する一本鎖の無作為に選択した７ｍｅｒのプールを、
５’－ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＶＮＮＶＮＮＶＮＮＶＮＮＶＮＮＶＮＮＶＮＮＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡ－３’（配列番号２５）
（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）として合成し、アンチセンスプライマー５’－ＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣ－３’（配列番号２６）を使用して第２の鎖を合成することによってｄｓＤＮＡ断片のプールに変換した。７ｍｅｒディスプレイライブラリーを生成するために、ｄｓＤＮＡ無作為オリゴヌクレオチドを修飾ＡＡＶ（Ｍ６）ゲノムのＡｓｃＩ－ＮｏｔＩ部位にクローニングし、それにより停止コドンを置き換えた。ウイルスライブラリーは、各ウイルスゲノムが、そのゲノムがコードするカプシドタンパク質変異体内にパッケージされるか又は包まれるように生成した（遺伝子型－表現型カップリング）。加えて、カプシドは、すべて１種類のペプチドのみが６０サブユニットのそれぞれにおいて存在するように産生した。このようにして、選択を通して特定される機能的な改善を、ウイルスカプシド内に含有されるこの改善された機能をコードするゲノム配列に関連付けることができる。
実施例２：ペプチド変異体の選択
このライブラリーを、網膜ＯＮ型双極細胞において赤色蛍光マーカーＦＰ６３５を発現する、本発明者らの研究室が生成したＣ５７ＢＬ／６＿Ｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６マウス内でポジティブ選択にかけた（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２０１５．１３（５）：ｐ．ｅ１００２１４３）。このマウス系は、ＯＮ型双極細胞が網膜内の奥の方に位置し、ＡＡＶ形質導入に許容的でないことが知られており、結果としてＯＮ型双極細胞に形質導入するのに有利な特性を有する、十分に浸透するＡＡＶ及び変異体が好都合に選択されるであろうという理論的根拠に基づいて選択した。手短に言えば、（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２０１５．１３（５）：ｐ．ｅ１００２１４３；ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１：ｐ．１６１）において記載されるように、４～６週齢の５～８匹のトランスジェニックマウスに、およそ５×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌのゲノム力価を有する２．５μｌのイオジキサノール精製ライブラリーを両眼の硝子体内に注射した。
１０日後、眼を摘出し、網膜をパパインプロテアーゼにより軽く処理して引き離し、続けてＯＮ型双極細胞集団について蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を行った。成功したビリオンを次いでＤＮＡ抽出物からＰＣＲ増幅し、さらにクローニングし、後続の注射段階に向けて再びパッケージした。
ＡＡＶ２（Ｍ６）ゲノムへの７ｍｅｒオリゴの各クローニングステップでライゲーションを４つ並行して実行し、各プールの１２のクローンを平板培養し、各インビボ選択ステップ後にライブラリーの収束について判断するために配列決定した。このインビボ指向性進化のプロセスにより、自然進化のプロセスと同様に、ポジティブ選択を適用して、ＯＮ型双極細胞許容的ＡＡＶ変異体を作り出した。
インビボ選択ライブラリーから８１，７３８変異体のカプシド遺伝子を次世代シークエンシングによって特定した。ランクした上位６７に由来する１５のヘプタペプチド配列を、表１において概説されるように、高い全体的な形質導入効率（ＮＧＳにおいて累計）、ＯＮ型双極細胞ターゲティングに対する選好及び選択段階の初期に現れた又はそれらのアミノ酸配列に関して有望に見えた（すなわち負に荷電した残基又はプロリン残基を含有する）モチーフの組み合わせにおいて機能的判定及び特徴付けのために選択した。ライブラリー変異体のすべてについての重要な特徴は、挿入を通したＡＡＶ２のヘパラン硫酸プロテオグリカン結合モチーフの正電荷（Ｒ５８５及びＲ５８８）の分離である。しかしながら、リンカー配列の２つのアラニンが加わったペプチド配列は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する能力を再び備えることができる（Ｕｈｒｉｇ．．．Ｂｕｅｎｉｎｇ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）。７ｍｅｒ挿入配列の中で、中程度の選好が特定の位置、例えば１若しくは２位及び／又は５若しくは６位の荷電アミノ酸並びに７位のＣｙｓ又はＡｌａなどの極性アミノ酸にあった（表１）。
実施例３：新規なカプシド変異体の判定
ＡＡＶ２（Ｍ６）～７ｍｅｒ～の組換え形態を、表１の１５の選択したペプチドのすべてについてクローニングした。本発明者らは、ｓｃＣＭＶ－ＥＧＦＰ導入遺伝子（ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター）と共にパッケージした。２つの変異体（Ｃａｐ８及びＣａｐ１０）を除いて、カプシドは、すべて１０１１～１０１２ｖｇ／ｍｌの力価で適切にパッケージした。成体マウスへの硝子体内注射の３週間後、主に視細胞における強力な発現がＣａｐ３、Ｃａｐ５、Ｃａｐ７、Ｃａｐ９、Ｃａｐ１１、Ｃａｐ１３及びＣａｐ１４について観察された（表１、図１～３）が、さらに双極細胞、アマクリン細胞及びミュラー細胞などの網膜内層の細胞においていくらかの発現が観察され、網膜神経節細胞ではほとんど観察されなかった。進化したＡＡＶ２変異体でもあり（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２０１３．５：ｐ．１８９ｒａ７６．）、硝子体内注射について現在、最先端であると考えられるＡＡＶ２（７ｍ８）の生産力との直接的な比較において、本発明者らの新規な変異体は、有意に良好に網膜に浸透し、有意により多くの視細胞を形質導入したが、神経節細胞は、有意により少なかった（図１、図１～３）。上記の結果は、８つの予め選択した変異体（Ｃａｐ３、Ｃａｐ５、Ｃａｐ７、Ｃａｐ９ Ｃａｐ１１、Ｃａｐ１３及びＣａｐ１４；表１）をさらにｓｃｈＥｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ導入遺伝子（ｈＥｆ１ａ：ヒトＥｆ１ａプロモーター、「強い」天然の哺乳動物のユビキタスプロモーター）と共にパッケージし、同等の力価の１×１０１１ｖｇ／ｍｌを成体マウスに硝子体内注射することによって確認された。
同様に、新たな変異体は、同等の力価のコントロールＡＡＶ２（Ｍ６）及びＡＡＶ（７ｍ８）よりも有意に多い数の視細胞を形質導入した。結果的に、選択された変異体は、ＡＡＶ２（Ｍ６）及びＡＡＶ２（７ｍ８）と比較して優れた内境界膜及び網膜浸透特性を有し、外顆粒層（ＯＮＬ）において視細胞を形質導入するのに有意により有効であると思われる（図１）。
ｓｃＣＭＶ－ＥＧＦＰ及びｓｃｈＥｆ１ａ－ＥＧＦＰと共にパッケージし、３Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌで注射したＣａｐ１４は、同じ低用量で注射したＡＡＶ２（７ｍ８）よりも有意に良好に（図１、２）、１Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌのマウスにおいて典型的に使用される最小限の用量でＡＡＶ２（７ｍ８）よりもさらに良好に機能した。これは、毒性及び免疫反応の問題を低下させるために患者においてより低用量を使用する観点から有望である。
Figure 2023504773000001
１５の選択されたクローンのすべては、Ｃ５７ＢＬ／６＿Ｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６マウスの単離ＯＮ型双極細胞画分から配列決定した６０，８８４ペプチドのうちで上位６７にランクした（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２０１５．１３（５）：ｐ．ｅ１００２１４３）。
Figure 2023504773000002
Figure 2023504773000003
Figure 2023504773000004
Figure 2023504773000005
Figure 2023504773000006
Figure 2023504773000007
Figure 2023504773000008
Figure 2023504773000009
ライブラリーのＣａｐ遺伝子は、ＶＰ３（グレーの配列）からなり、チロシンからフェニルアラニンへの（Ｙ－Ｆ）突然変異に下線を引き、塩基対ナンバリングは、全ＶＰ１配列を指す。

Claims (17)

  1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、ＡＡＶ血清型２カプシドの４５３位若しくは５８７～５９２位、詳細には５８７～５９２位、より詳細には５８７位又は別の血清型のＡＡＶにおけるそれに相同な位置にペプチド挿入物を含み、前記ペプチド挿入物は、
    ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＤＴＲＰＨＤＱ（Ｃａｐ５；配列番号１１）、ＥＨＹＮＳＴＣ（Ｃａｐ７；配列番号１２）、ＰＮＰＮＣＴＬ（Ｃａｐ９；配列番号１３）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＣＧＥＳＳＹＬ（Ｃａｐ１２；配列番号１５）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）
    から選択され、詳細には、前記挿入物は、ＳＡＳＥＡＳＴ（Ｃａｐ３；配列番号１０）、ＴＰＰＳＩＴＡ（Ｃａｐ１１；配列番号１４）、ＰＲＴＰＨＴＡ（Ｃａｐ１３；配列番号１６）及びＥＬＣＤＧＦＡ（Ｃａｐ１４；配列番号１７）から選択される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
  2. 配列番号００１に対して少なくとも（≧）８５％の同一性、詳細には≧９０％、より詳細には≧９５％の同一性を有する配列を含むか又はそれから本質的になるアデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドであって、
    ５８７、５８８、５８９、５９０、５９１又は５９２位、詳細には５８７、５８８又は５８９位、より詳細には５８７位の挿入物によって特徴付けられ、及び
    前記挿入物は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７のいずれか１つから選択されるペプチド配列であるか又はそれを含む、アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド。
  3. 配列番号２～配列番号９から選択される配列の生物学的活性の少なくとも９０％によって特徴付けられる、請求項２に記載のアデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド。
  4. 配列番号２～配列番号９から選択される配列であるか又はそれを含む、請求項２又は３に記載のアデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド。
  5. 配列番号２～配列番号９から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になる、請求項１～４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド。
  6. ａ．２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び７３０位、詳細には２５２、２７２、４４４、５００、７０４及び７３０位、より詳細には２５２、２７２、４４４、５００、７００及び７３０位のすべてにおける１つ又はいくつかのチロシンからフェニルアラニンへの置換、及び／又は
    ｂ．１つ又はいくつかのトレオニンからバリンへの置換、詳細にはＴ４９１Ｖ
    によって特徴付けられるＡＡＶ２カプシドであるか、又は
    ＡＡＶ２カプシド以外のカプシドであり、及び前記カプシドは、上記のａ．及びｂ．で述べられているように、前記カプシドの相同な位置における１つ若しくはいくつかのチロシンからフェニルアラニンへの置換及び／又は１つ若しくはいくつかのトレオニンからバリンへの置換によって特徴付けられる、請求項１又は２に記載のアデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチド。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列。
  8. 自己相補的又は一本鎖ベクターゲノム構造、特に自己相補的ベクターゲノムである、請求項７に記載の核酸配列。
  9. 導入遺伝子を含む、請求項７又は８に記載の核酸配列。
  10. 前記導入遺伝子は、適切なタンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｇＲＮＡカセットの配列をコードする、請求項９に記載の核酸配列。
  11. 前記導入遺伝子は、光感受性タンパク質をコードする、請求項９に記載の核酸配列。
  12. 前記導入遺伝子は、哺乳動物細胞、詳細には網膜細胞、より詳細にはヒト網膜細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下にある、請求項９～１１のいずれか一項に記載の核酸配列。
  13. 前記プロモーターは、ユビキタス又は細胞特異的プロモーターである、請求項１２に記載の核酸配列。
  14. 前記プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター又はｈＥｆ１ａプロモーターから選択される、請求項１２に記載の核酸配列。
  15. 医療において／薬剤として使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド及び請求項７～１４のいずれか一項に記載の核酸配列から選択される作用物質。
  16. ａ．網膜細胞又は網膜色素上皮細胞、及び／又は
    ｂ．視細胞、双極細胞、神経節細胞又はアマクリン細胞
    を冒す状態の治療において使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド及び請求項７～１４のいずれか一項に記載の核酸配列から選択される作用物質。
  17. 請求項１５又は１６に記載の使用のいずれかのための、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド及び請求項７～１４のいずれか一項に記載の核酸配列から選択される作用物質であって、
    ａ．硝子体内投与、詳細には硝子体内注射、又は
    ｂ．網膜下投与
    によって投与される作用物質。
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