KR20180012734A - 유전적 안 질환 치료용 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 눈에 제제를 전달하는 표적화 펩타이드를 인코딩하는 서열을 함유한 벡터 및 표적화 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들은 안구 세포에 제제, 예컨대 바이러스성 벡터를 표적하기 위해 기능하는 펩타이드를 발견하였다. 본 개시내용은 관심 세포 유형에, 예를 들어, 바이러스성 캡시드를 유도하기 위해 이들 신규 펩타이드를 유도하는 방법을 기재한다. 상기 사례에서, 안구 세포 (예컨대 망막 세포)는 확인된 펩타이드에 의해 표적화된다. 상기 펩타이드를 포함하기 위해 변형된 벡터 잠복 캡시드 단백질은 눈에 대한 치료제를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

Description

유전적 안 질환 치료용 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 하기 우선권을 주장한다: 미국 가출원 번호 62/118,934 (2015년 2월 20일 출원, 이의 전체는 본 명세서에 참고로 편입됨).
도입
유전자 전달은 세포 및 분자 수준 모두에서 생물학적 사건 및 질환 과정의 강력한 분석 도구로서 이제 널리 기술적으로 인식된다. 최근에, 선천적인 (예를 들면, 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍) 또는 후천적인 (예를 들면, 암 또는 감염성 질환), 인간 질환의 치료용 유전자 요법의 응용이 상당한 주목을 받았다. 개선된 유전자 전달 기술의 출현 및 불량성 유전자-관련된 질환의 지금까지 확장하는 라이브러리의 확인으로, 유전자 요법은 치료 이론에서 실제적인 현실로 빠르게 도입되었다.
종래에, 유전자 요법은 외인성 유전자가 선천적인 유전적 오류를 정정하기 위해 환자의 세포 속에 도입되는 절차로서 정의되었다. 4500 초과의 인간 질환이 유전적으로서 현재 분류되어도, 인간 게놈에서 특이적 돌연변이는 이들 질환의 상대적으로 소수에 대하여 확인되었다. 최근까지, 이들 희귀 유전적 질환은 유전자 요법 노력의 독점적인 표적을 나타냈다. 따라서, 현재까지 대부분의 NIH 승인된 유전자 요법 프로토콜은 공지된 선천적인 유전적 오류를 갖는 개체의 체세포 속에 불량성 유전자의 기능성 카피의 도입에 대하여 관련되어 왔다. 겨우 최근에, 연구자 및 임상의는 대부분의 인간 암, 특정 형태의 심혈관 질환, 및 많은 퇴행성 질환이 또한 중요한 유전적 구성요소를 갖고, 신규 유전자 요법의 설계의 목적을 위하여, “유전적 장애”로 고려되어야 한다는 것을 인식하기 시작했다. 따라서, 유전자 요법은 감염된 유기체 속에 신규한 유전적 정보의 도입을 통해 질환 표현형의 정정으로서 더욱 최근에 광범위하게 정의되었다.
생체내 유전자 요법에서, 전달된 유전자는 제자리 즉, 수령체 내에서 수령체 유기체의 세포에 도입된다. 생체내 유전자 요법은 몇 개의 동물 모델에서 조사되었다. 몇 개의 최근 출판물은 기관 및 조직 예컨대 근육, 조혈 줄기 세포, 동맥 벽, 신경 시스템, 및 폐에 제자리 직접적인 유전자 전달의 실행성을 보고하였다. 골격 근육, 심장 근육 속에 DNA의 직접적인 주사 및 맥관구조 속에 DNA-지질 복합체의 주사는 또한 생체내 삽입된 유전자 생성물(들)의 검출가능한 발현 수준을 산출한다고 보고되었다.
눈의 유전적 질환, 예를 들면, 눈의 선천적 유전적 질환, 예컨대 시각상실을 야기하는 질환의 치료는 문제가 있다. 상기의 예는 하기이다: 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 레버 선천성 시신경병증, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, 척수소뇌 운동실조증 유형 7 (SCAT), 색상 시각상실, 및 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 점액다당류증 (MPS) IV 및 MPS VII. 따라서, 눈의 유전적 질환에 대한 요법이 개발될 필요가 있다.
요약
본 발명자들은 안구 세포에 제제, 예컨대 바이러스성 벡터를 표적하기 위해 기능하는 펩타이드를 발견하였다. 본 개시내용은 관심 세포 유형에, 예를 들어, 바이러스성 캡시드를 유도하기 위해 이들 신규 펩타이드를 유도하는 방법을 기재한다. 상기 사례에서, 안구 세포 (예컨대 망막 세포)는 확인된 펩타이드에 의해 표적화된다. 상기 펩타이드를 포함하기 위해 변형된 벡터 잠복 캡시드 단백질은 눈에 대한 치료제를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “표적”은 바이러스, 예컨대 아데노-관련 바이러스 (AAV)의 캡시드 단백질이 특정 구현예에서 또 다른 유형의 조직 (예를 들면, 뇌 조직)보다 한 유형의 조직 (예를 들면, 망막 세포)에 우선적으로 결합하는 것을 의미하고, 유전적으로 변형된 캡시드 단백질은 비교할만한, 비변형된 캡시드 단백질보다 10% 내지 1000% 더 높은 수준으로 결합에 의해 안구 세포를 “표적”할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로-변형된 캡시드 단백질을 갖는 AAV는 비변형된 AAV 바이러스보다 50% 내지 100% 더 큰 수준에서 안구 세포에 결합할 수 있다.
본 발명은 표적화 펩타이드를 함유한 변형된 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 제공하고, 여기서 표적화 펩타이드는 하기이고: 3 내지 10개의 아미노산 (즉, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산) 길이 그리고 여기서 표적화 펩타이드는 안구 세포에 AAV를 표적한다. 특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이이다.
본 발명은 본원에서 상기 기재된 펩타이드를 인코딩하기 위해 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 함유한 AAV 바이러스를 제공한다.
본 발명은 본원에서 상기 기재된 바이러스성 벡터 또는 본원에서 상기 기재된 세포를 포유동물에 투여함으로써 포유동물에서 질환 (예를 들면, 안구 질환)의 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 특정 구현예에서, 질환은 하기이다: 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 레버 선천성 시신경병증, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, SCAT, 색상 시각상실, 및 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 MPS IV 및 MPS VII.
특정 구현예에서, 질환은 리소좀 축적 질환 또는 장애이다. 특정 구현예에서, 질환은 TPP1 (트리펩티딜 펩티다아제 I), CLN3 (바테닌), PPT1 (팔미토일 단백질 티오에스테라제 I), CLN6 (신경 세로이드 지질갈색소증 단백질 6) 또는 CLN8 발현 또는 활성에서 결핍 또는 결함이다. 특정 구현예에서, 질환은 신경퇴행성 질환 예컨대 신경 세로이드 지질갈색소증 (NCL), 예컨대 유아의 NCL, 후기 유아의 NCL, 유년성 NCL (바텐병) 및 성인 NCL이다.
본 발명은, 형질도입된 안구 세포가 치료제를 발현하고 대상체의 눈에 제제를 전달하도록 본원에서 상기 기재된 바이러스성 벡터로 안구 세포를 형질도입함으로써, 대상체의 눈에 제제를 전달하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 제제는 (예를 들어 SCA 7을 치료하기 위한) 아탁신 7 mirRNA이다. 특정 구현예에서, 제제는 (예를 들어 레버 선천성 흑내장을 치료하기 위한) 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE 65)이다. 특정 구현예에서, 제제는 (예를 들어 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위한) 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 저해제 또는 용해성 VEGF 수용체 1 (sFifl)이다. 특정 구현예에서, 제제는 (예를 들어 맥락막결여를 치료하기 위한) REP1이다. 특정 구현예에서, 제제는 (예를 들어 색상 시각상실을 치료하기 위한) L-옵신이다. 표 1은 예시적인 질환, 표적 유전자 및 대응하는 인코딩된 단백질을 제시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
도면의 간단한 설명
도 1. 펩타이드 변형된 AAV (PMAAV)-GST의 서열. AAV2/2 (AAV2 ITR/AAV2 캡시드) 캡시드 서열 (이탤릭체) 및 글루타티온 S-전달효소 (GST) 망막 표적 펩타이드 (볼드체 및 밑줄).
도 2. 상대적 감염 효율성을 보여준 살아있는 동물의 형광 화상형성.녹색 형광 단백질 (GFP) 양성율의 반점된 영역은 AAV2/2 주사 눈에서 관측되고, 반면에 PMAAV-GST 눈에서 넓은 및 균일한 GFP 신호가 있었다.
도 3. PMAAV-GST. CMV.eGFP는 망막 색소 상피 (RPE) 및 외부 핵 층 (ONL) 층, 및 신경절 세포 층 (GCL)에서 일부 세포를 표적화하였다. AAV2/2는 주로 OPL을 표적화하였다. CMV - 사이토메갈로바이러스; eGFP - 향상된 GFP.
도 4. 망막하 주사.
도 5. 비변형된 AAV2 - 망막하 주사.
도 6. 비변형된 AAV2 - 망막하 주사.
도 7. 20X 이미지 PM 변형된 AAV2 - 망막하 주사.
도 8. 초자체내 주사.
도 9. AAV2 초자체내 주사.
도 10. AAV2 초자체내 주사.
도 11. AAV2 PM GST 초자체내 주사.
도 12. AAV2 PM GST 초자체내 주사.
상세한 설명
본 개시내용의 특정 구현예는 변형된 캡시드를 포함한 바이러스성 벡터를 제공하고, 여기서 상기 변형된 캡시드는 안구 세포에 바이러스성 벡터를 표적으로 하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 안구 세포는 망막 세포이다.
특정 구현예에서, 바이러스성 벡터는 아데노 관련된 바이러스성 벡터 (AAV)이다. 특정 구현예에서, 굴성이 변형되어 상기 변형이 임의의 AAV의 굴성을 변화시키도록 하여도, AAV는 AAV2이다.
특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 하기의 그안에 갖는 (또는 이루어지는) 최대 10개의 아미노산 길이의 서열을 포함한다: GSTPPPM (서열식별번호: 1) 또는 아미노산 서열 GETRAPL (서열식별번호: 4) (아미노에서 카복시 배향으로 또는 카복시에서 아미노 배향으로 발현된 경우). 서열의 배향이 중요하지 않다는 것이 유의되어야 한다. 예를 들어, 펩타이드는 GSTPPPM (서열식별번호: 1)이도록 펩타이드의 아미노-말단부터 카복시 말단으로 배향될 수 있거나 또는 MPPPTSG (서열식별번호: 5)이도록 펩타이드의 아미노-말단부터 카복시-말단으로 배향될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 위치 P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588, 및/또는 R588-Q589에서 AAV2 캡시드 잔기 사이 삽입된다. 예시적인 야생형 참조 AAV2 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 10에서 제공된다.
특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 위치 D384, G385, I560, T561, N562, E563, E564, E565, N704, 및/또는 Y705에서 AAV9 캡시드 잔기 뒤에 삽입된다. 예시적인 야생형 참조 AAV9 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 11에서 제공된다.
특정 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
본 발명은 본원에서 상기 기재된 바와 같이 캡시드 단백질을 인코딩한 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 바이러스성 벡터는 추가로 관심 핵산을 인코딩한 핵산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 관심 핵산은 치료제이다. 특정 구현예에서, 치료제는 효소 또는 RNAi 분자 (예를 들면, siRNA, shRNA 또는 miRNA 분자)이다. 특정 구현예에서, 치료제는 하기이다: 아탁신 7 mirRNA, RPE65, VEGF 저해제 또는 용해성 VEGF 수용체 1 (sFifl), REP1, L-옵신, Rho, PDE6ß, ABCA4, LRAT, RDS/페리페린, MERTK, IMPDH1, GUCY2D, RDS/페리페린, AIPL1, ABCA4, RPGRIP1, IMPDH1, AIPL1, GUCY2D, LRAT, MERTK, RPGRIP1, RPE65, ABCA4, GNAT2, CNGB3, Rsl, OA1, (OCAI) 티로시나제, P21 WAF-1/Cipl, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아릴설파타제 B, 또는 ß - 글루쿠로니다제.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터를 인코딩한 핵산 서열을 제공한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 바와 같이 변형된 캡시드를 인코딩한 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용의 특정 구현예는 서열식별번호: 2 (GGGTCGACGCCGCCTCCTATG)를 포함한 또는 상기로 이루어진 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 핵산 서열에 의해 인코딩된 변형된 캡시드를 제공한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터를 포함한 세포를 제공한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터에 의해 형질도입된 세포를 제공한다.
특정 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 비-인간 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 시험관내이다. 특정 구현예에서, 세포는 생체내이다. 특정 구현예에서, 세포는 안구 세포, 예컨대 망막 세포이다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터 또는 세포를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 질환의 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 이환 안구 세포를 표적한다. 특정 구현예에서, 표적화 펩타이드는 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 레버 선천성 시신경병증, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, SCAT, 색상 시각상실, 또는 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 MPS IV 및 MPS VII을 갖는 대상체에서 안구 세포를 표적한다.
특정 구현예에서, 상기 대상체는 리소좀 축적 질환 또는 장애를 갖는다. 특정 구현예에서, 질환은 TPP1 (트리펩티딜 펩티다아제 I), CLN3 (바테닌), PPT1 (팔미토일 단백질 티오에스테라제 I), CLN6 (신경 세로이드 지질갈색소증 단백질 6) 또는 CLN8 발현 또는 활성에서 결핍 또는 결함이다. 질환은 신경퇴행성 질환 예컨대 신경 세로이드 지질갈색소증 (NCL), 예컨대 유아의 NCL, 후기 유아의 NCL, 유년성 NCL (바텐병) 및 성인 NCL을 포함한다.
특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 특정 구현예는, 형질도입된 안구 세포가 치료제를 발현시키고 대상체의 눈에 제제를 전달하도록 본원에서 개시된 바이러스성 벡터로 안구 세포를 형질도입하는 것을 포함하는, 대상체의 눈에 제제를 전달하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 바이러스성 벡터는 안구 세포를 형질도입한다.
특정 구현예에서, 형질도입된 안구 세포는 망막 외부 총상층 (OPL)내이거나 상기를 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 의료 치료 또는 진단에서 사용을 위하여 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터 또는 세포를 제공한다.
본 개시내용의 특정 구현예는, 포유동물에서, 안구 질환, 예를 들면, 유전적 안 질환 치료에 유용한 약제를 제조하기 위해 본원에서 개시된 바와 같이 바이러스성 벡터 또는 세포의 사용을 제공한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 상기 펩타이드를 확인하기 위해 파아지 디스플레이 바이오패닝 이용을 포함하는 안구 조직을 표적으로 하는 펩타이드 확인 방법을 제공한다.
벡터는 추가로 효소, 분비된 단백질, 핵 단백질, 또는 세포질 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “분비된 단백질”은, 분비될 수 있도록 신호 서열을 함유하기 위해 자연적으로 분비되든 또는 변형되든, 임의의 분비된 단백질을 포함한다. 예를 들어, 분비된 단백질은 베타-글루쿠로니다제일 수 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능성 관계로 배치되는 경우 “작동가능하게 연결된다”. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 인접한 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되지 않아야 한다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 종래의 실시에 따라 사용된다. 추가로, 핵산 인코딩 효소의 다중 카피는 발현 벡터에서 함께 연결될 수 있다. 상기 다중 핵산은 링커에 의해 분리될 수 있다.
벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스, 또는 인간 면역결핍 바이러스 또는 고양이 면역결핍 바이러스에 기반된 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 상기 AAVs의 예는 하기에서 찾아진다: Davidson 등, PNAS (2000) 97: 3428-3432. AAV 및 렌티바이러스는 지속성 발현을 부여할 수 있고 반면에 아데노바이러스는 일시적 발현을 제공할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에서 개시된 벡터를 함유한 포유류 세포를 제공한다. 세포는 인간의 것일 수 있고, 눈으로부터일 수 있다. 세포 유형은 줄기 또는 전구 세포 집단일 수 있다.
본 개시내용은 본원에서 개시된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 발현 벡터, 또는 세포 투여에 의한 포유동물에서 질환 예컨대 유전적 안 질환 또는 암의 치료 방법을 제공한다. 유전적 안 질환 또는 암은 하기일 수 있다: 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 레버 선천성 시신경병증, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, SCAT, 색상 시각상실, 및 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 MPS IV 및 MPS VII.
유전적 질환은 리소좀 축적 질환 또는 장애일 수 있다. 특정 구현예에서, 질환은 TPP1 (트리펩티딜 펩티다아제 I), CLN3 (바테닌), PPT1 (팔미토일 단백질 티오에스테라제 I), CLN6 (신경 세로이드 지질갈색소증 단백질 6) 또는 CLN8 발현 또는 활성에서 결핍 또는 결함이다. 유전적 질환은 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 신경 세로이드 지질갈색소증 (NCL), 예컨대 유아의 NCL, 후기 유아의 NCL, 유년성 NCL (바텐병) 및 성인 NCL일 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 및 (생체내 변형된) 유전적으로 조작된 세포, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 치료제의 치료적으로 유효한 용량의 국부 전달이 가능한 유전자 또는 단백질 요법용 방법에 관한 것이다.
일 측면에 있어서, 포유류 수령체에서 치료제 발현용 세포 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템 (또한 본 명세서에서 일명 “유전적으로 변형된 세포”)는 치료제 발현용 세포 및 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는, 비제한적으로, 바이러스, 플라스미드, 및 세포에 이종성 유전적 물질용 다른 비히클을 포함한다. 따라서, 용어 “발현 벡터”는 본원에서 사용된 바와 같이 세포에 이종성 유전적 물질 전달용 비히클을 지칭한다. 특히, 발현 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.
발현 벡터는 추가로, 이종성 유전자의 전사 제어용 프로모터를 포함한다. 프로모터는 (아래 기재된) 유도성 프로모터일 수 있다. 발현 시스템은 포유류 수령체에 투여에 적합하다. 발현 시스템은 복수의 비-불멸화된 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있고, 각 세포는 적어도 하나의 치료제를 인코딩한 적어도 하나의 재조합 유전자를 함유한다.
세포 발현 시스템은 생체내 형성될 수 있다. 또 다른 측면에 따르면, 생체내 포유류 수령체의 치료 방법이 제공된다. 방법은 제자리, 예컨대 안구내 투여를 통해 환자의 세포 속에 이종성 유전자 생성물 발현용 발현 벡터 도입을 포함한다. 생체내 발현 시스템을 형성하기 위해, 치료제 발현용 발현 벡터는 포유류 수령체 속에 생체내 도입된다.
또 다른 측면에 따르면, 생체내 포유류 수령체의 치료 방법이 제공된다. 방법은 생체내 환자 속에 표적 단백질의 도입을 포함한다.
이종성 유전자 발현용 발현 벡터는 이종성 유전자 생성물의 전사 제어용 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 제자리 치료제의 전달은, 이종성 유전자의 전사를 유도하는, 조건에 제자리 세포 노출에 의해 제어된다.
포유류 수령체는 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 상태를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, “유전자 대체 요법”은 치료제를 인코딩한 외인성 유전적 물질의 수령체에 투여 및 제자리 투여된 유전적 물질의 후속의 발현을 지칭한다. 따라서, 어구 “유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태”는 병태 예컨대 유전적 질환 (즉, 하나 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 병태), 후천적 병리 (즉, 선천적인 결함에 기인하지 않는 병태), 암 및 예방적 절차 (즉, 질환 또는 요망되지 않는 의료 병태의 예방)을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “치료제”는, 포유류 수령체에 유익한 효과를 갖는, 임의의 제제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, “치료제”는 치료 및 핵산 또는 단백질 구성요소를 갖는 예방적 분자 둘 모두를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 포유류 수령체는 유전적 질환을 갖고 외인성 유전적 물질은 질환 치료용 치료제를 인코딩한 이종성 유전자를 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 포유류 수령체는 후천적인 병리를 갖고 외인성 유전적 물질은 병리 치료용 치료제를 인코딩한 이종성 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 환자는 암을 갖고 외인성 유전적 물질은 항-신생물성 제제를 인코딩한 이종성 유전자를 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서 환자는 요망되지 않는 의료 병태를 갖고 외인성 유전적 물질은 병태 치료용 치료제를 인코딩한 이종성 유전자를 포함한다.
더욱 또 다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물이 개시된다. 약학적 조성물은 복수의 상기-기재된 유전적으로 변형된 세포 또는 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함한다. 약학적 조성물은 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태의 치료용일 수 있고 외인성 유전적 물질은 병태 치료용 치료제를 인코딩한 이종성 유전자를 포함한다. 약학적 조성물은 환자에 치료제의 치료적으로 유효한 용량을 전달하기에 충분한 유전적으로 변형된 세포 또는 폴리펩타이드의 양을 함유할 수 있다. 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 예시적인 병태는 아래에 기재되어 있다.
또 다른 측면에 있어서, 상기-기재된 약학적 조성물의 형성 방법이 제공된다. 방법은 유전적으로 변형된 세포를 형성하기 위해 세포 속에 이종성 유전자 생성물 발현용 발현 벡터의 도입 및 약학적으로 허용가능한 캐리어에서 유전적으로 변형된 세포의 배치를 포함한다.
이들 및 다른 측면, 뿐만 아니라 다양한 이점 및 유용성은 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조로 더욱 분명해질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “효소”, “분비된 단백질”, “핵 단백질”, 또는 “세포질 단백질”은 이들 폴리펩타이드의 변이체 또는 생물학적 활성 또는 불활성 단편을 포함한다. 폴리펩타이드 중 하나의 “변이체”는 원상태 단백질과 완전히 동일하지 않은 폴리펩타이드이다. 상기 변이체 단백질은 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의한 아미노산 서열의 변경에 의해 수득될 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어 치환에 의해, 원상태 폴리펩타이드와 비교된 경우 실질적으로 동일한 또는 개선된 품질을 갖는 폴리펩타이드를 창출하기 위해 변형된다. 치환은 보존된 치환일 수 있다. “보존된 치환”은 아미노산의 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 보존된 치환은 전체 펩타이드가 그의 공간 형태를 보유하지만 변경된 생물학적 활성을 갖는 정도로 아미노산의 양 또는 아미노산의 측쇄의 크기에서 (대안적으로, 측쇄내 화학기의 크기, 양 또는 종류에서) 최소 변화를 가능하게 하는 아미노산을 이용한 치환일 것이다. 예를 들어, 통상 보존된 변화는 Asp 내지 Glu, Asn 또는 Gln; His 내지 Lys, Arg 또는 Phe; Asn 내지 Gln, Asp 또는 Glu 및 Ser 내지 Cys, Thr 또는 Gly일 수 있다. 얼라인은 다른 아미노산으로 치환하기 위해 통상적으로 사용된다. 20종의 필수 아미노산은 아래와 같이 그룹화될 수 있다: 무극성 측쇄를 갖는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 무전하 극성 측쇄를 갖는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 산성 측쇄를 갖는 아스파르테이트 및 글루타메이트; 및 염기성 측쇄를 갖는 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘.
아미노산 변화는 대응하는 핵산 서열의 코돈 변화에 의해 달성된다. 상기 폴리펩타이드는 생물학적 활성을 변형 또는 개선하기 위해 폴리펩타이드 구조에서 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환에 기반하여 수득될 수 있다는 것이 공지된다. 예를 들어, 대안적인 아미노산의 치환을 통해, 작은 형태적 변화는 증가된 활성을 초래하는 폴리펩타이드에서 부여될 수 있다. 대안적으로, 특정 폴리펩타이드에서 아미노산 치환은 잔기를 제공하기 위해 사용될 수 있고, 그 다음 다른 목적에 유용해지기 위해 개시 폴리펩타이드의 충분한 특성을 보유하는 펩타이드-분자 콘주게이트를 제공하기 위해 다른 분자에 연결될 수 있다.
폴리펩타이드에서 상호작용 생물학적 기능의 부여에서 아미노산의 소수성 지수를 사용할 수 있고, 여기서 특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것이 찾아진다. 대안적으로, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 실시될 수 있고, 특히 생성되는 폴리펩타이드에서 요망된 생물학적 기능이 면역학적 구현예에서 사용을 위하여 의도된다. 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, “단백질”의 가장 큰 국부 평균 친수성은 그의 면역원성과 상관한다. 따라서, 치환이 각 아미노산에 배정된 친수성에 기반하여 실시될 수 있는 것이 주목된다.
각 아미노산에 값을 배정하는, 어느 하나의 친수성 지수 또는 소수성 지수 사용에서, 이들 값이 ±2이고, ±1이 특히 바람직한 아미노산의 치환을 수행하는 것이 바람직하고, ±0.5로 갖는 것이 가장 바람직한 치환이다.
변이체 단백질은 대응하는 원상태 단백질의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 적어도 약 90% 그러나 100% 미만, 인접 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.
변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 원상태 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 본질적으로 대응한다. 본원에서 사용된 바와 같이 “에 본질적으로 대응한다”는 원상태 단백질에 의해 생성된 반응과 실질적으로 동일한 생물학적 반응을 유도할 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 그와 같은 반응은 원상태 단백질에 의해 생성된 수준의 적어도 60%일 수 있고, 원상태 단백질에 의해 생성된 수준의 심지어 적어도 80%일 수 있다.
변이체는 대응하는 원상태 단백질에서 존재하지 않는 아미노산 잔기 또는 대응하는 원상태 단백질에 대한 결실을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 대응하는 원상태 단백질에 비교된 경우 절단된 “단편”, 즉, 전장 단백질의 단지 일 부분일 수 있다. 단백질 변이체는 또한 적어도 하나의 D-아미노산을 갖는 펩타이드를 포함한다.
변이체 단백질은 변이체 단백질을 인코딩한 단리된 DNA 서열로부터 발현될 수 있다. “재조합”은 유전적 엔지니어링의 과정에 의해 생산된 펩타이드 또는 핵산으로서 정의된다. 유전적 암호의 반복 때문에, 개별적인 뉴클레오타이드가 코돈에서 쉽게 교환될 수 있고, 동일한 아미노산 서열을 여전히 초래할 수 있는 당해 기술 에서 공지된 것이 유의되어야 한다. 용어 “단백질”, “펩타이드” 및 “폴리펩타이드”는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 개시내용은 세포 또는 환자에 발현 벡터를 투여함으로써 포유동물에서 질환의 치료 방법을 제공한다. 유전자 요법 방법을 위하여, 분자 생물학 및 유전자 요법의 당해 분야의 숙련가는, 과도한 실험과정 없이, 본 개시내용의 신규 방법에서 사용된 발현 벡터의 투여 경로 및 적절한 복용량을 결정할 수 있을 것이다.
하나의 구현예에 있어서, 세포는 생체내 전환되거나 달리 유전적으로 변형된다. 포유류 수령체로부터 세포는 치료제를 인코딩한 이종성 (예를 들면, 재조합) 유전자 발현용 외인성 유전적 물질을 함유한 벡터로 생체내 전환 (즉, 형질도입 또는 형질감염)되고 치료제는 제자리 전달된다.
본원에서 사용된 바와 같이, “외인성 유전적 물질”은, 세포에서 자연적으로 발견되지 않는, 천연 또는 합성의, 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하거나; 또는 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 경우, 세포에 의해 생물학적으로 상당한 수준에서 전사 또는 발현되지 않는다. 따라서, “외인성 유전적 물질”은 안티-센스 RNA, 뿐만 아니라 “이종성 유전자” (즉, 발현되지 않거나 또는 동일한 유형의 천연 발생 세포에서 생물학적으로 무의미한 수준으로 발현되는 단백질을 인코딩한 유전자)로 전사될 수 있는 비-천연 발생 핵산을, 예를 들어, 포함한다.
특정 구현예에서, 포유류 수령체는 유전자 대체 요법에 잘 받아들이는 상태를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, “유전자 대체 요법”은 치료제를 인코딩한 외인성 유전적 물질의 수령체에 투여 및 제자리 투여된 유전적 물질의 후속의 발현을 지칭한다. 따라서, 어구 “유전자 대체 요법에 잘 받아들이는 병태”는 병태 예컨대 유전적 질환 (즉, 하나 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 병태), 후천적 병리 (즉, 선천적인 결함에 기인하지 않는 병태), 암 및 예방적 과정 (즉, 질환 또는 요망되지 않는 의료 병태의 예방)을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “치료제”는, 포유류 수령체에 유익한 효과를 갖는, 임의의 제제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, “치료제”는 핵산 (예를 들면, 안티센스 RNA) 및/또는 단백질 구성요소를 갖는 예방적 분자 및 치료 둘 모두를 포함한다.
수많은 유전적 안 질환은 공지되어 있다. 이들 장애에서 결핍된다고 공지된 단백질/효소이기 때문에, 이들 질환에 대해 유효한 치료제는 또한 공지된다. 특정 구현예에서, 질환 또는 병태는 하기이다: 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 레버 선천성 시신경병증, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, SCAT, 색상 시각상실, 및 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 MPS IV 및 MPS VII.
특정 구현예에서, 질환 또는 병태는 리소좀 축적 질환 또는 장애일 수 있다. 특정 구현예에서, 질환은 TPP1 (트리펩티딜 펩티다아제 I), CLN3 (바테닌), PPT1 (팔미토일 단백질 티오에스테라제 I), CLN6 (신경 세로이드 지질갈색소증 단백질 6) 또는 CLN8 발현 또는 활성에서 결핍 또는 결함이다. 질환은 신경퇴행성 질환 예컨대 신경 세로이드 지질갈색소증 (NCL), 예컨대 유아의 NCL, 후기 유아의 NCL, 유년성 NCL (바텐병) 및 성인 NCL일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, “획득된 병리”는 비정상 생리적, 생화학적, 세포성, 구조적, 또는 분자 생물학적 상태에 의해 명시된 질환 또는 증후군을 지칭한다. 예시적인 후천적인 병리는 표 2에서 제공된다. 이들 질환에 대해 유효한 치료제가 또한 주어진다.
표 2. 후천적인 병리에 대한 잠재적인 유전자 요법.유전자에 의해 인코딩된 대응하는 단백질은 표 1에서 제시된다.
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대안적으로, 유전자 대체 요법에 잘 받아들이는 병태는 예방적 과정, 즉, 질환 또는 요망되지 않는 의료 병태의 예방 과정이다. 따라서, 본 개시내용은 포유류 수령체에 예방적 기능을 갖는 치료제 (즉, 예방적 제제) 전달용 세포 발현 시스템을 포함한다.
요약하면, 용어 “치료제”는, 비제한적으로, 상기 표에서 열거된 제제, 뿐만 아니라 그의 기능적 등가물을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “기능적 등가물”은 기능적 등가물로 간주되는 치료제로서 포유류 수령체에서 동일한 또는 개선된 유익한 효과를 갖는 분자 (예를 들면, 펩타이드 또는 단백질) 을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되는 바와 같이, 기능적으로 동등한 단백질은, 예를 들면, “기능적으로 동등한 DNA”를 발현시킴으로써 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “기능적으로 동등한 DNA”는, 치료제를 인코딩하는, 비-천연 발생 DNA를 지칭한다. 예를 들어, 표 1-2에서 개시된 제제의, 전부는 아니더라도, 다수가, 천연 발생 핵산에 의해 인코딩되는, 공지된 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 유전적 암호의 축중으로 인해, 1 초과 핵산이 동일한 치료제를 인코딩할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은, 천연 발생 DNA에 의해 인코딩된, 동일한 단백질을 인코딩하는, 천연 발생 DNAs에 의해, 뿐만 아니라 비-천연 발생 DNAs에 의해 인코딩된 치료제를 포함한다.
유전자 대체 요법에 잘 받아들이는 병태 및 상기-개시된 치료제는 단지 예시적이고 본 개시내용의 범위 제한하기 위해 의도되지 않는다. 공지된 병태 치료를 위하여 적합한 치료제의 선택은 과도한 실험과정 없이 기술분야의 숙련가의 범위내인 것으로 간주된다.
선별 방법
본 개시내용은 특정 구역, 예컨대 중추신경 시스템의 맥관구조를 표적으로 하는, 예를 들면, 구체적으로 표적으로 하는 아미노산 서열을 위한 선별 방법 및 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은 특이적 질환 병태에 대하여 특이적인 표적화 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 환언하면, 표적화 서열은 특이적 질환의 치료에서 확인 및 사용될 수 있다.
AAV 벡터
아데노 관련된 바이러스 (AAV)는 인간 질환, 예컨대 파킨슨병 및 열성 유전적 질환 치료에서 유용한 작은 (20 nm), 비병원성 바이러스이다. AAV 역전된 말단 반복 (ITR) 서열로 표적 유전자에 연결된 프로모터를 둘러싸는 작제물이 생성된다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스성 벡터는 AAV 벡터이다. “AAV” 벡터는 아데노-관련 바이러스를 지칭하고, 천연 발생 야생형 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 용어는, 달리 요구된 것을 제외하고, 모든 하위유형, 혈청형 및 위형, 및 양쪽 천연 발생 및 재조합 형태를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “혈청형”은 정의된 면역혈청으로 캡시드 단백질 반응성에 기반하여 다른 AAVs에 의해 확인되고 상기로부터 식별되는 AAV를 지칭하고, 예를 들면, 하기의 많은 공지된 혈청형이 있다: 영장류 AAVs (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV-Rh74, 및 AAVRh10, 및 이들 혈청형의 변형된 캡시드). 예를 들어, 혈청형 AAV-2는 AAV-2의 cap 유전자로부터 인코딩된 캡시드 단백질 및 동일한 AAV-2 혈청형으로부터 5’ 및 3’ ITR 서열을 함유한 게놈을 함유하는 AAV를 지칭하기 위해 사용된다. 위형화된 AAV는 한 혈청형으로부터 캡시드 단백질 및 제2 혈청형의 5’-3’ ITRs를 포함한 바이러스성 게놈을 함유하는 AAV를 지칭한다. 위형화된 rAAV는 캡시드 혈청형의 세포 표면 결합 특성 및 ITR 혈청형과 일치한 유전적 특성을 갖는 것으로 예상될 것이다. 위형화된 rAAV는 당해 기술에서 기재된 표준 기술을 이용하여 생산된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, rAAV1은 동일한 혈청형으로부터 캡시드 단백질 및 5’-3’ ITRs 둘 모두를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용될 수 있거나 혈청형 1로부터 캡시드 단백질 및 하기로부터 5’-3’ ITRs를 갖는 AAV를 지칭할 수 있다: 상이한 AAV 혈청형, 예를 들면, AAV 혈청형 2. 본원에서 예시된 각 예에 대하여 벡터 설계 및 생산의 설명은 캡시드의 혈청형 및 5’-3’ ITR 서열을 기재한다. 약어 “rAAV”는, 또한 재조합 AAV 벡터 (또는 “rAAV 벡터”)로 지칭된, 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭한다.
“AAV 바이러스” 또는 “AAV 바이러스성 입자”는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (바람직하게는 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의한) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드로 구성된 바이러스성 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드 예컨대 포유류 세포에 전달된 이식유전자)를 포함하면, 전형적으로 “rAAV”로 지칭된다.
하나의 구현예에서, AAV 발현 벡터는, 전사 개시 영역, 관심 DNA 및 전사 종료 영역을 포함한 조절 요소를, 전사의 방향에서 작동가능하게 연결된 구성요소로서 적어도 제공하기 위해 공지된 기술을 이용하여 작제된다. 조절 요소는 포유류 세포에서 기능성이도록 선택된다. 작동가능하게 연결된 구성요소를 함유하는 수득한 작제물은 기능성 AAV ITR 서열로 측접된다 (5’ 및 3’).
“아데노-관련 바이러스 역전된 말단 반복” 또는 “AAV ITRs”는 DNA 복제의 기원으로서 및 바이러스용 패키징 신호로서 시스로 함께 기능하는 AAV 게놈의 각 말단에서 발견된 기술적으로 인식된 영역으로 의미된다. AAV ITRs는, AAV 렙 코딩 영역과 함께, 효율적인 절개, 및 포유류 세포 게놈 속에 2개의 측접하는 ITRs 사이 개재된 뉴클레오타이드 서열의 통합 및, 이로부터 구조를 제공한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다. 참고 예를 들어 Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns, K.I.“Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.). 본원에서 사용된 바와 같이, “AAV ITR”은 묘사된 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없지만, 예를 들면, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은, 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74, 및 AAVRh10, 및 이들 혈청형의 변형된 캡시드를 포함하여, 임의의 몇 개의 AAV 혈청형으로부터 유도될 수 있다. 더욱이, AAV 벡터에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 측접하는 5’ 및 3’ ITRs는, 이들이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열의 절개 및 상기로부터 구조를 허용하도록, 및 AAV Rep 유전자 생성물이 세포에서 존재하는 경우 수령체 세포 게놈 속에 이종성 서열의 통합을 허용하도록 의도된 것으로 기능하는 한, 필연적으로 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유도될 필요가 없거나 또는 동일할 필요가 없다.
하나의 구현예에서, AAV ITRs는, 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (히말라야 원숭이-유도된 AAV), 및 AAVRh10을 포함하여, 임의의 몇 개의 AAV 혈청형으로부터 유도될 수 있다. 더욱이, AAV 발현 벡터에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 측접하는 5’ 및 3’ ITRs는, 이들이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열의 절개 및 상기로부터 구조를 허용하도록, 및 AAV Rep 유전자 생성물이 세포에서 존재하는 경우 수령체 세포 게놈 속에 DNA 분자의 통합을 허용하도록 의도된 것으로 기능하는 한, 필연적으로 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유도될 필요가 없거나 또는 동일할 필요가 없다.
하나의 구현예에서, AAV 캡시드는, 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (히말라야 원숭이-유도된 AAV), 및 AAVRh10을 포함하여, 임의의 몇 개의 AAV 혈청형으로부터 유도될 수 있고, AAV ITRs는 AAV 혈청형 2로부터 유도된다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV2 캡시드이다. AAV 벡터에서 사용을 위한 적합한 DNA 분자는 약 5 킬로베이스 (kb) 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2.5 kb 미만 크기일 것이고 당해 기술에 공지되어 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서 AAV 벡터에서 사용을 위한 DNA 분자는 단일 siRNA 서열의 하나 이상의 카피르 함유할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 siRNA 서열의 다중 카피는 적어도 2 카피, 적어도 3 카피, 적어도 4 카피, 적어도 5 카피, 적어도 6 카피, 적어도 7 카피, 적어도 8 카피, 적어도 9 카피, 및 적어도 10 카피를 의미한다. 일부 구현예에서 AAV 벡터에서 사용을 위한 DNA 분자는 다중 siRNA 서열을 함유할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 다중 siRNA 서열은 적어도 2 siRNA 서열, 적어도 3 siRNA 서열, 적어도 4 siRNA 서열, 적어도 5 siRNA 서열, 적어도 6 siRNA 서열, 적어도 7 siRNA 서열, 적어도 8 siRNA 서열, 적어도 9 siRNA 서열, 및 적어도 10 siRNA 서열을 의미한다. 일부 구현예에서 본 개시내용의 적합한 DNA 벡터는 본 개시내용의 siRNA 분자를 인코딩한 서열 및 스터퍼 단편을 함유할 것이다. 본 개시내용의 적합한 스터퍼 단편은 비제한적으로 발현된 단백질 분자를 인코딩하지 않는 서열; 발현된 세포 유형에서 유해한 효과를 갖지 않는 정상 세포 단백질을 인코딩하는 서열; 및 기능성 siRNA 듀플렉스 분자를 자체 인코딩하지 않는 서열을 포함하여 당해 기술에서 공지된 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터에서 사용을 위한 적합한 DNA 분자는 약 5 킬로베이스 (kb) 미만 크기일 것이고, 예를 들어, 스터퍼 서열 및 본 개시내용의 siRNA 분자를 인코딩한 서열을 포함할 것이다. 예를 들어, rep 및 cap 유전자를 함유한 AAV 게놈 서열의 임의의 패키징을 예방하기 위해, rep 및 cap DNA 단편을 함유한 플라스미드는 DNA를 최적의 패키징용 길이를 초과하게 하는 AAV 게놈 속에 당해 기술에 공지된 바와 같이 스터퍼 단편의 포함에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 헬퍼 단편은 AAV 비리온 속에 패키징되지 않는다. 이는, 최적의 패키징 크기를 초과하지 않는 재조합 AAV 벡터 게놈만이 비리온 속에 패키징되는 것을 확보하는, 안전성 특징이다. 스터퍼 서열을 편입하는 AAV 헬퍼 단편은 4.6 kb의 야생형 게놈 길이를 초과할 수 있고, 야생형의 105% 초과 길이는 일반적으로 패키징되지 않을 것이다. 스터퍼 단편은, 예를 들어, Lac-Z 또는 베타-갈락토시다아제 유전자로서 상기 비-바이러스성 공급원으로부터 유도될 수 있다.
하나의 구현예에서, 선택된 뉴클레오타이드 서열은 생체내 대상체에서 이의 전사 또는 발현을 유도하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 상기 조절 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 관련된 제어 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 제어 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 제어 서열은 일반적으로 포유류 또는 바이러스성 유전자를 인코딩한 서열로부터 유도된 것을 포함한다. 예는, 비제한적으로, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 예컨대 CMV 전초기 프로모터 영역 (CMVIE), 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 혼성 프로모터, 등등을 포함한다. 또한, 비바이러스 유전자, 예컨대 쥣과 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 서열은 또한 본원에서 용도를 찾을 것이다. 상기 프로모터 서열은 하기로부터 상업적으로 입수가능하다: 예를 들면, 스트라타진 (San Diego, Calif.).
하나의 구현예에서, 양쪽 이종성 프로모터 및 다른 조절 요소, 예컨대 망막-특이적 및 유도성 프로모터, 인핸서 등등은 특정 용도일 것이다. 이종성 프로모터의 예는 CMV 프로모터를 포함한다. 망막-특이적 프로모터의 예는 IRBP (인터포토리셉터 레티노이드-결합 단백질) 프로모터, hGRK1 (인간 로돕신 키나제) 프로모터, IRBPe/GNAT2 (인터- 광수용체 레티노이드-결합 단백질 프로모터의 인핸서 요소)를 포함하고 인간 트랜스듀신 알파-소단위 프로모터의 최소 서열은 망막-특이적 프로모터의 예이다.
하나의 구현예에서, AAV ITRs에 의해 한정된 관심 DNA 분자를 잠복시키는 AAV 발현 벡터는 거기로부터 절개된 주요 AAV 열린 해독틀 (“ORFs”)을 갖는 AAV 게놈 속에 선택된 서열(들)을 직접적으로 삽입시킴으로써 작제될 수 있다. ITRs의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 남아 있는 한, AAV 게놈의 다른 부분은 또한 결실될 수 있다. 상기 작제물은 당해 기술에서 잘 알려진 기술을 이용하여 설계될 수 있다.
대안적으로, AAV ITRs는 표준 결찰 기술을 이용하여 또 다른 벡터에서 존재하는 선택된 핵산 작제물의 동일한 및 융합된 5’ 및 3’를 함유한 AAV 벡터로부터 또는 바이러스성 게놈으로부터 절개될 수 있다. 예를 들어, 결찰은 20 mM 트리스-Cl pH 7.5, 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 33 gg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl에서, 및 0 ℃에서 40 μM ATP, 0.01-0.02 (Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제 (“점성 말단” 결찰용) 또는 14°C에서 1 mM ATP, 0.3-0.6 (Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제 (“무딘 말단” 결찰용)에서 달성될 수 있다. 분자간 “점성 말단” 결찰은 30-100 μg/ml 총 DNA 농도 (5-100 nM 총 최종 농도)에서 보통 수행된다. ITRs를 함유하는 AAV 벡터. 특히, 수탁 번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226으로 미국 종균 협회 (“ATCC”)로부터 이용가능한 몇 개의 AAV 벡터는 거기에 기재된다.
추가로, 키메라성 유전자는 하나 이상의 선택된 핵산 서열의 AAV ITR 서열 배열된 5’ 및 3’를 포함하기 위해 합성으로 생산될 수 있다. 완전한 키메라성 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오타이드로부터 조립된다.
rAAV 비리온을 생산하기 위해, AAV 발현 벡터는 공지된 기술을 이용하여, 예컨대 형질감염에 의해, 적합한 숙주 세포 속에 도입된다. 수많은 형질감염 기술은 당해 기술에서 일반적으로 공지된다. 참고, 예를 들면, Sambrook 등(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York. 특히 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘 공동침전, 배양된 세포 속에 직접 마이크로-주사, 전기천공, 리포좀 매개된 유전자 전달, 지질-매개된 형질도입, 및 고속 미세투사물을 이용한 핵산 전달을 포함한다.
하나의 구현예에서, rAAV 비리온 생산용 적합한 숙주 세포는, 이종성 DNA 분자의 수령체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된, 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함한다. 용어는 형질감염된 최초 세포의 자손을 포함한다. 따라서, “숙주 세포”는 본원에서 사용된 바와 같이 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 일반적으로 지칭한다. (예를 들면, 수탁 번호 ATCC CRL1573으로 미국 종균 협회를 통해 쉽게 이용가능한) 안정적인 인간 세포주, 293으로부터 세포는 본 개시내용의 실시에서 사용될 수 있다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 유형-5 DNA 단편으로 전환된 인간 배아 신장 세포주이고, 아데노바이러스 Ela 및 Elb 유전자를 발현한다. 293 세포주는 쉽게 형질감염되고, rAAV 비리온을 생산하기 위해 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
하나의 구현예에서, 상기-기재된 AAV 발현 벡터를 함유한 숙주 세포는 rAAV 비리온을 생산하기 위한 AAV ITRs에 의해 측접된 뉴클레오타이드 서열을 캡시드화하기 위해 및 복제하기 위해 AAV 헬퍼 기능을 제공할 수 있게 만들어진다. AAV 헬퍼 기능은, 이어서, 생산적인 AAV 복제에 대하여 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 생성물을 제공하기 위해 발현될 수 있는 일반적으로 AAV-유도된 코딩 서열이다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터로부터 누락하는 필요한 AAV 기능을 보충하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 한쪽, 또는 양쪽 주요 AAV ORFs (열린 해독틀), 즉 rep 및 cap 코딩 영역, 또는 이의 기능성 동족체를 포함한다.
Rep 발현 생성물은, 다른 것 중에서, 하기를 포함하여, 많은 기능을 보유한다고 보여진다: DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉킹; DNA 헬리카제 활성; 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터 전사의 조절.Cap 발현 생성물은 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터로부터 누락인 트랜스로 AAV 기능을 보충하기 위해 본원에서 사용된다.
하나의 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염에 앞서 또는 상기와 동반하여 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 숙주 세포 속에 도입된다. 용어 “AAV 헬퍼 작제물”은 관심 뉴클레오타이드 서열의 전달용 형질도입 벡터를 생산하기 위해 사용되는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 일반적으로 지칭한다. AAV 헬퍼 작제물은 용해성 AAV 복제에 필요한 누락 AAV 기능을 보충하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적 발현을 제공하는데 통상적으로 사용되지만; 그러나, 헬퍼 작제물은 AAV ITRs이 부족하고 자체를 복제할 수 없고 패키징할 수 없다. AAV 헬퍼 작제물은 플라스미드, 파아지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태일 수 있다. 수많은 AAV 헬퍼 작제물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 모두를 인코딩하는 통상적으로 사용된 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45는 기재되어 있다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 수많은 다른 벡터가 기재되어 있다.
“AAV rep 코딩 영역”은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 인코딩하는 AAV 게놈의 기술적으로 인식된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은, DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉킹, DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터 전사의 조절을 포함하여, 많은 기능을 소유한다고 보여지고 있다. Rep 발현 생성물은 AAV 게놈의 복제를 위하여 집합적으로 요구된다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 동족체는 AAV-2 DNA 복제를 매개한다고 또한 공지되는 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자를 포함한다.
“AAV cap 코딩 영역”은 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3, 또는 이들의 작용성 동족체를 인코딩하는 AAV 게놈의 기술적으로 인식된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 바이러스성 게놈의 패키징을 위하여 집합적으로 요구되는 패키징 기능을 공급한다. 특정 구현예에서, 변형, 예컨대 삽입은 P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588, 및/또는 R588-Q589에서 AAV2 캡시드 단백질내 실시된다. 특정 구현예에서, 삽입은 D384, G385, I560, T561, N562, E563, E564, E565, N704, 및/또는 Y705 of AAV9에서 실시된다.
하나의 구현예에서, AAV 발현 벡터 및 AAV 헬퍼 작제물 둘 모두는 하나 이상의 선택적인 선택가능한 마커를 함유하기 위해 작제될 수 있다. 적합한 마커는 세포가 적절한 선택적 배지에서 성장되는 경우 선택가능한 마커를 함유한 핵산 작제물로 형질감염된 그들 세포의 항원성 특징을 변화시키기 위해, 또는 상기에 색상을 부여하기 위해 항생제 내성 또는 감수성을 제공하는 유전자를 포함한다. 본 개시내용의 실시에서 유용한 몇 개의 선택가능한 마커 유전자는 하기에 내성을 제공함으로써 포유류 세포내 선택을 허용하는 (아미노글리코시드 포스포트랜페라제 (APH)를 인코딩한) 하이그로마이신 B 내성 유전자를 포함한다: 하기로부터 이용가능함: G418 (Sigma, St. Louis, Mo.). 다른 적합한 마커는 당해 분야의 숙련가에 공지된다.
하나의 구현예에서, 숙주 세포 (또는 패키징 세포)는, rAAV 비리온을 생산하기 위해, 비 AAV 유도된 기능, 또는 “부속 기능”을 제공할 수 있게 된다. 부속 기능은 AAV가 그의 복제에 의존적인 비 AAV 유도된 바이러스성 및/또는 세포성 기능이다. 따라서, 부속 기능은, AAV 유전자 전사의 활성화에 관여된 것, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리를 포함하여, AAV 복제에서 요구되는 비 AAV 단백질 및 RNAs를 적어도 포함한다. 바이러스성-기반된 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유도될 수 있다.
하나의 구현예에서, 부속 기능은 도입될 수 있고 그 다음 당해 분야의 숙련가에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 통상적으로, 부속 기능은 관련없는 헬퍼 바이러스로 숙주 세포의 감염에 의해 제공된다. 아데노바이러스; 헤르페스바이러스 예컨대 단순 포진 바이러스 유형 1 및 2; 및 백시니아 바이러스를 포함하여, 수많은 적합한 헬퍼 바이러스는 공지된다. 비바이러스 부속 기능, 예컨대 임의의 다양한 공지된 제제를 이용한 세포 동기화에 의해 제공된 것은 또한 본원에서 용도를 찾을 것이다.
하나의 구현예에서, 부속 기능은 부속 기능 벡터를 이용하여 제공된다. 부속 기능 벡터는 하나 이상의 부속 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 부속 기능 벡터는 숙주 세포에서 효율적인 AAV 비리온 생산을 뒷받침하기 위해 적합한 숙주 세포 속에 도입될 수 있다. 부속 기능 벡터는 플라스미드, 파아지, 트랜스포존 또는 코스미드의 형태일 수 있다. 부속 벡터는 또한, 적절한 제어 요소 및 효소와 관련된 경우, 하나 이상의 선형화된 DNA 또는 RNA 단편의 형태일 수 있고, 부속 기능을 제공하기 위해 숙주 세포에서 전사 또는 발현될 수 있다.
하나의 구현예에서, 부속 기능을 제공하는 핵산 서열은 천연 공급원으로부터, 예컨대 아데노바이러스 입자의 게놈으로부터 수득될 수 있거나, 또는 당해 기술에서 공지된 재조합 또는 합성 방법을 이용하여 작제될 수 있다. 이와 관련하여, 아데노바이러스-유도된 부속 기능은 널리 연구되었고, 부속 기능에 관여된 수많은 아데노바이러스 유전자는 확인되었고 부분적으로 특성규명되었다. 구체적으로, 초기 아데노바이러스 유전자 영역 E1a, E2a, E4, VAI RNA 및, 가능하게는, E1b는 부속 과정에서 참여한다고 생각된다. 헤르페스바이러스-유도된 부속 기능은 기재되어 있다. 백시니아 바이러스-유도된 부속 기능은 또한 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 헬퍼 바이러스로 숙주 세포의 감염, 또는 부속 기능 벡터로 숙주 세포의 형질감염의 결과로서, AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 생산하기 위해 AAV 헬퍼 작제물을 전사활성화하는 부속 기능이 발현된다. Rep 발현 생성물은 AAV 발현 벡터로부터 (관심 DNA를 포함한) 재조합 DNA를 절개한다. Rep 단백질은 또한 AAV 게놈을 2중으로 만드는 작용을 한다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드 속으로 조립되고, 재조합 AAV 게놈은 캡시드 속으로 패키징된다. 따라서, 생산적인 AAV 복제가 일어나고, DNA는 rAAV 비리온 속으로 패키징된다.
하나의 구현예에서, 재조합 AAV 복제 이후, rAAV 비리온은 다양한 종래의 정제 방법, 예컨대 CsC1 구배를 이용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 또한, 감염이 부속 기능을 발현하는데 이용되면, 잔류 헬퍼 바이러스는 공지된 방법을 이용하여 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 하기 동안 대략 60°C의 온도로 가열에 의해 불활성화될 수 있다: 예를 들면, 20 분 이상. AAV가 극도로 열 안정적인 반면 헬퍼 아데노바이러스가 열 불안정적이기 때문에 상기 치료는 단지 헬퍼 바이러스를 효과적으로 불활성화한다. 수득한 rAAV 비리온은 그 다음 대상체의 눈에 DNA 전달을 위하여 즉시 사용가능하다.
바이러스성 벡터의 전달 방법은, 비제한적으로, 안구내, 망막하, 및 유리체내 경로를 포함한다. 일반적으로, rAAV 비리온은 어느 하나의 생체내 또는 시험관내 형질도입 기술을 이용하여 눈의 세포에 도입될 수 있다. 시험관내 형질도입되면, 요망된 수령체 세포는 대상체로부터 제거될 것이고, rAAV 비리온으로 형질도입될 것이고 대상체 속으로 재도입될 것이다. 대안적으로, 동계의 또는 이종발생성 세포는 그들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 발생하지 않을 경우 사용될 수 있다.
대상체에 형질도입된 세포의 전달 및 도입에 적합한 방법은 기재되어 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들면, 적절한 배지에서, 안구 세포와 재조합 AAV 비리온의 조합에 의해 시험관내 형질도입될 수 있고, 관심 DNA를 잠복하는 그들 세포에 대한 선별은 종래의 기술 예컨대 서던 블랏 및/또는 PCR을 이용하여, 또는 선택가능한 마커의 이용에 의해 선별될 수 있다. 형질도입된 세포는 그 다음, 아래 더욱 전체적으로 기재된, 약학적 조성물, 및 다양한 기술에 의해, 예컨대 그라프팅, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 대상체 속으로 도입된 조성물로 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 생체내 전달을 위하여, rAAV 비리온은 약학적 조성물로 제형화되고 일반적으로 안구내로, 예를 들면, 망막하 주사로 투여될 것이다.
하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 관심 핵산의 약학적 유효량, 즉, 문제의 질환 병태의 증상을 감소 또는 완화시키기에 충분한 양 또는 요망된 이점을 제공하기에 충분한 양을 생산하기 위해 충분한 유전적 물질을 포함할 것이다. 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 것이다. 상기 부형제는 조성물을 받는 개체에 유해한 항체의 생산을 자체 유도하지 않는, 및 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는, 비제한적으로, 소르비톨, Tween80, 및 액체 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어, 무기산 염 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트, 등등; 및 유기 산의 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트, 등등은 그안에 포함될 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 등등은 상기 비히클에 존재할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 철저한 논의는 하기에서 이용가능하다: Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
본 명세서의 교시의 관점에서 당해 분야의 숙련가에 분명한 바와 같이, 첨가되어야 하는 유효량의 바이러스성 벡터는 실험적으로 결정될 수 있다. 투여는 치료의 과정 내내 계속해서 또는 간헐적으로 1회 용량으로 영향받을 수 있다. 투여의 가장 유효한 수단 및 복용량의 결정 방법은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려지고 바이러스성 벡터, 요법의 조성물, 표적 세포, 및 치료될 대상체로 다양할 것이다. 단일 및 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
1 초과 이식유전자는 전달된 바이러스성 벡터에 의해 발현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 대안적으로, 하나 이상의 상이한 이식유전자를 각각 발현하는, 별개의 벡터는 또한 본원에서 개시된 바와 같이 눈에 전달될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 방법에 의해 전달된 바이러스성 벡터가 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합되는 것이 또한 의도된다.
세포 속에 유전적 물질의 도입 방법
외인성 유전적 물질 (예를 들면, 하나 이상의 치료 단백질을 인코딩한 cDNA)은, 유전적으로 변형된 세포를 제공하기 위해, 유전적 전달 방법, 예컨대 형질감염 또는 형질도입에 의해 생체외 또는 생체내 세포 속에 도입된다. 다양한 발현 벡터 (즉, 표적 세포 속에 외인성 유전적 물질의 전달 촉진용 비히클)은 당해 분야의 숙련가에 공지된다.
본원에서 사용된 바와 같이, “세포의 형질감염”은 첨가된 DNA의 편입에 의해 신규한 유전적 물질의 세포에 의한 취득을 지칭한다따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 세포 속에 핵산의 삽입을 지칭한다. 하기를 포함한 몇 개의 형질감염 기술은 당해 분야의 숙련가에 공지된다: 인산칼슘 DNA 공동침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포좀-매개된 형질감염; 및 텅스텐 입자-촉진된 극미립자 폭격. 스트론튬 포스페이트 DNA 공동침전은 또 다른 가능한 형질감염 방법이다.
그에 반해서, “세포의 형질도입”은 DNA 또는 RNA 바이러스를 이용하여 세포 속에 핵산의 전달 과정을 지칭한다세포 속에 핵산 전달용 RNA 바이러스 (즉, 레트로바이러스)는 본 명세서에서 일명 형질도입 키메라성 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 내에 함유된 외인성 유전적 물질은 형질도입된 세포의 게놈 속에 편입된다. 키메라성 DNA 바이러스 (예를 들면, 치료제를 인코딩한 cDNA를 운반하는 아데노바이러스)로 형질도입된 세포는, 그의 게놈 속에 편입된 외인성 유전적 물질을 갖지 않을 것이지만 세포 내에 염색체외로 유지되는 외인성 유전적 물질을 발현시킬 수 있을 것이다.
전형적으로, 외인성 유전적 물질은 신규한 유전자의 전사를 제어하기 위해 프로모터와 함께 (보통 치료 단백질용 엑손 코딩을 포함한 cDNA의 형태로) 이종성 유전자를 포함한다. 프로모터는 특징적으로 전사를 개시하는데 필요한 특이적 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 선택적으로, 외인성 유전적 물질은 추가로 요망된 유전자 전사 활성을 수득하는데 필요한 추가의 서열 (즉, 인핸서)를 포함한다. 상기 논의의 목적을 위하여 “인핸서”는 프로모터에 의해 지시된 기저 전사 수준을 변화시키기 위해 (시스로) 코딩 서열과 인접하여 작용하는 단순히 임의의 비-번역된 DNA 서열이다. 외인성 유전적 물질은 프로모터로부터 즉시 다운스트림으로 세포 게놈 속에 도입되어 프로모터 및 코딩 서열이 코딩 서열의 전사를 허용하기 위해 작동가능하게 연결될 수 있다. 레트로바이러스 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하기 위해 외인성 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 상기 외인성 프로모터는 구성적 및 유도성 프로모터 둘 모두를 포함한다.
천연 발생 구성적 프로모터는 필수적인 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과, 구성적 프로모터의 제어 하 유전자는 세포 성장의 모든 조건하에 발현된다. 예시적인 구성적 프로모터는 특정 구성적 또는 “하우스키핑” 기능을 인코딩하는 하기 유전자에 대하여 프로모터를 포함한다: 하이포잔틴 포스포리보실 전달효소 (HPRT), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 당해 분야의 숙련가에 공지된 다른 구성적 프로모터. 또한, 많은 바이러스성 프로모터는 진핵 세포에서 구성적으로 기능한다. 이들은 하기를 포함한다: 많은 다른 것들 중에서, SV40의 초기 및 후기 프로모터; 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복 (LTRs); 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터. 따라서, 임의의 상기-참조된 구성적 프로모터는 이종성 유전자 삽입물의 전사를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는, 유도제의 존재 하에, 단지 또는 더 큰 정도로 발현된다 (예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하의 전사는 특정 금속 이온의 존재 하에 크게 증가된다). 유도성 프로모터는 그의 유도 인자가 결합되는 경우 전사를 자극하는 반응 요소 (REs)를 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 환식 AMP에 대한 REs가 있다. 특정한 RE를 함유한 프로모터는 유도성 반응을 수득하기 위해 선택될 수 있고 일부 경우에서, RE 자체는 상이한 프로모터에 부착되어, 이로써 재조합 유전자에 유도성을 제공할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터 (구성적 대 유도성; 강한 대 약한)를 선택함으로써, 유전적으로 변형된 세포에서 치료제의 발현의 수준 및 존재 둘 모두를 제어하는 것이 가능하다. 치료제를 인코딩한 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있다면, 제자리 치료제의 전달은 치료제의 전사 허용을 위한 조건에 제자리 유전적으로 변형된 세포를 노출시킴으로써, 예를 들면, 제제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특이적 유발제의 복강내 주사에 의해 유발된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에 유전자에 의해 인코딩된 치료제의 유전적으로 변형된 세포의 제자리 발현은 제자리 적절한 (즉, 유도) 금속 이온을 함유한 용액과 유전적으로 변형된 세포를 접촉시킴으로써 향상된다.
따라서, 제자리 전달되는 치료제의 양은 하기와 같은 인자 제어에 의해 조절된다: (1) 삽입된 유전자의 직접적인 전사에 사용된 프로모터의 성질, (즉, 프로모터가 구성적 또는 유도성이거나, 강한 또는 약한지 여부); (2) 세포 속에 삽입되는 외인성 유전자의 카피의 수; (3) 환자에 투여되는 (예를 들면, 이식되는) 형질도입된/형질감염된 세포의 수; (4) 이식물 (예를 들면, 그라프트 또는 캡슐화된 발현 시스템)의 크기; (5) 이식물의 수; (6) 형질도입된/형질감염된 세포 또는 이식물이 적소에 남아있는 기간; 및 (7) 유전적으로 변형된 세포에 의한 치료제의 생산 속도. 특정한 치료제의 치료적으로 유효한 용량의 전달을 위한 이들 인자의 선택 및 최적화는, 상기-개시된 인자 및 환자의 임상 프로파일을 고려하여, 과도한 실험과정 없이 당해 분야의 숙련가의 범위내인 것으로 간주된다.
치료제를 인코딩한 적어도 하나의 이종성 핵산 및 적어도 하나의 프로모터에 더하여, 발현 벡터는, 발현 벡터로 형질감염된 또는 형질도입된 세포의 선택 촉진을 위하여, 선택 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 2 이상의 발현 벡터로 형질감염되고, 적어도 하나의 벡터는 치료제(들)을 인코딩한 유전자(들)을 함유하고, 다른 벡터는 선택 유전자를 함유한다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 유전자 및/또는 (아래 기재된) 신호 서열의 선택은 과도한 실험과정 없이 당해 분야의 숙련가의 범위내인 것으로 간주된다.
치료제는 세포외, 세포내 또는 막 위치에 전달을 위하여 표적화될 수 있다. 유전자 생성물이 세포로부터 분비되는 것이 바람직하면, 발현 벡터는 세포부터 세포외 환경까지 치료 유전자 생성물 분비를 위하여 적절한 분비 “신호” 서열을 포함하도록 설계된다. 유전자 생성물이 세포 내에 유지되는 것이 바람직하면, 상기 분비 신호 서열은 생략된다. 유사한 방식으로, 발현 벡터는 세포 원형질막 내에 치료제의 고착을 위하여 “체류” 신호 서열을 포함하도록 작제될 수 있다. 예를 들어, 모든 막 단백질은, 막에서 단백질의 전좌를 중지시키고 단백질이 분비되도록 하지 않는, 소수성 막관통 영역을 갖는다. 특정한 위치에 유전자 생성물의 표적화를 위하여 신호 서열을 포함한 발현 벡터의 작제는 과도한 실험과정에 대한 필요성 없이 당해 분야의 숙련가의 범위 내인 것으로 간주된다.
하기 논의는 본 개시내용의 다양한 유용성에 관련한다. 예를 들어, 본 개시내용은 제자리 세포내 및/또는 세포외 독소의 확인에 적합한 발현 시스템으로서 유용성을 갖는다. 독소를 해독할 수 있는 치료제를 인코딩한 유전자에 적절한 신호 서열의 부착 또는 생략에 의해, 치료제는 세포외 환경에, 세포 원형질막에 또는 세포내 위치에 전달을 위하여 표적화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포내 해독 치료제를 인코딩한 유전자를 함유한 외인성 유전적 물질은 추가로 이들이 치료제에 의해 세포내로 해독될 수 있는 세포 속에 세포외 독소의 수송 촉진을 위하여 표면 수용체를 인코딩한 서열을 포함한다. 대안적으로, 세포는 활성 부분이 세포외 환경 속으로 확장하는 정도로 세포 원형질막 내에 고정된 해독 치료제를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 막-결합 치료제의 활성 부분은, 세포외 환경에 존재하는, 독소를 해독한다.
상기-기재된 치료제에 더하여, 이의 일부는 세포내 체류를 위하여 표적화되고, 본 개시내용은 또한 세포외 환경에 전달을 위하여 의도된 제제 및/또는 세포 원형질막에서 고정되도록 의도된 제제를 포함한다.
단리된 세포에서 특이적 유전자 생성물의 발현을 위하여 특정한 발현 벡터의 선택 및 최적화는, 잠재적으로 하나 이상의 적절한 조절 영역 (예를 들면, 프로모터, 삽입 서열)으로, 유전자의 수득; 유전자가 삽입되는 벡터를 포함한 벡터 작제물의 제조; 벡터 작제물로 시험관내 배양된 세포의 형질감염 또는 형질도입; 및 유전자 생성물이 배양된 세포에서 존재하는지 여부의 결정에 의해 달성된다. 특정 구현예에서, 아데노-관련 바이러스 계열로부터 바이러스가 사용된다. 특정 구현예에서, AAV2, AAV4 및/또는 AAV5에 기반된 유전자 요법용 발현 벡터가 사용된다.
따라서, 당해 분야의 숙련가에 분명할 바와 같이, 다양한 적합한 바이러스성 발현 벡터는 세포 속에 외인성 유전적 물질의 전달을 위하여 이용가능하다. 유전자 대체 요법에 잘 받아들이는 특정한 병태용 치료제를 발현하기 위한 적절한 발현 벡터의 선택 및 세포 속에 선택된 발현 벡터의 삽입용 병태의 최적화는 과도한 실험과정 없이 당해 분야의 숙련가의 범위내이다.
대안적인 구현예에서, 발현 벡터는, 다양한 방법 중 하나에 의해 표적 세포 속에 전달되는, 플라스미드의 형태이다: 물리적 (예를 들면, 미세주입, 전기천공, 스크레이프 장입, 극미립자 폭격) 또는 화학적 착물로서 세포성 흡수 (예를 들면, 칼슘 또는 스트론튬 공동침전, 지질로 착화, 리간드로 착화). 리포펙틴(Lipofectin)TM (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.) 및 트란스펙탐(Transfectam)TM (ProMega, Madison, Wis.)을 포함한 몇 개의 상품이 양이온성 리포좀 착화에 이용가능하다. 그러나, 이들 방법에 의한 형질감염의 효율은 표적 세포의 성질에 고도로 의존적이고 따라서, 상기-언급된 절차를 이용하여 세포 속에 핵산의 최적의 형질감염을 위한 병태는 최적화되어야 한다. 상기 최적화는 과도한 실험과정에 대한 필요성 없이 당해 분야의 숙련가의 범위내이다.
본 개시내용은 또한 상기-기재된 유전적으로-변형된 세포의 다양한 제조 및 이용방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “단리된”은 그의 천연 발생 생체내 위치로부터 제거된 세포 또는 복수의 세포를 의미한다. 환자로부터 세포의 제거 방법, 뿐만 아니라 배양액내 단리된 세포의 유지 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지된다.
본 개시내용은 또한 생체내 포유류 수령체의 세포의 유전적으로 변형 방법을 제공한다. 하나의 구현예에 있어서, 방법은, 예를 들어, 수령체 속에 벡터 주입에 의해, 제자리 포유류 수령체의 세포 속으로 이종성 유전자 생성물의 발현용 발현 벡터 도입을 포함한다.
하나의 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 제조는 제자리 수령체에 치료제의 치료적으로 유효한 용량을 전달하기에 충분한 세포의 양을 함유한다. 공지된 병태에 대한 특이적 치료제의 치료적으로 유효한 용량의 결정은 과도한 실험과정에 대한 필요성 없이 당해 분야의 숙련가의 범위내이다. 따라서, 유효한 용량의 결정에서, 숙련가는 환자의 병태, 병태의 중증도, 뿐만 아니라 투여된 특이적 치료제의 임상 연구의 결과를 고려할 것이다.
유전적으로 변형된 세포가 약학적으로 허용가능한 캐리어에 이미 존재하지 않으면 이들은 수령체에 투여에 앞서 그와 같은 캐리어에서 대체된다. 상기 약학적으로 허용가능한 캐리어는 환자 및 요법에 적절한 경우, 예를 들어, 등장의 염수 및 다른 완충액을 포함한다.
1 초과 재조합 유전자는 동일한 또는 상이한 벡터 상에서 각 유전적으로 변형된 세포 속에 도입될 수 있어서, 이로써 단일 세포에 의해 다중 치료제의 발현을 허용한다.
실시예 1
안구 세포를 표적으로 하는 변형된 AAVs의 제조
본 발명자들은 국부 전달 이후 안구 세포를 표적하도록 변형되는 AAVs를 설계하였다. 안구 세포를 표적으로 하는 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 생성하기 위해, 발명자들은 안구 세포에 우선적으로 결합하는 펩타이드 모티프를 확인하기 위해 생체내 파아지 디스플레이 패닝을 먼저 사용하였다. 파아지-디스플레이 라이브러리는 마우스의 눈에 주사되었고, 눈 세포는 그 뒤에 결합된 파아지를 따라 단리되었다. 단리된 파아지는 그 다음 증폭되었고 재주사되었고, 상기 생체내 패닝의 5 라운드 후, 회수된 파아지의 DNA 서열분석은 초기 파아지 라이브러리로부터 상이한 펩타이드 모티프의 풍부를 드러냈다.
마우스에서, 펩타이드 모티프 GSTPPPM (서열식별번호: 1) 및 GETRAPL (서열식별번호: 4)는 확인되었다. 안구 세포에 대하여 이들 파아지의 친화도를 확정하기 위해, 각 파아지는 마우스에 정맥내로 개별적으로 재-주사되었고 시각화되었다. 패닝 결과와 일치하여, 각각의 선택된 파아지는 대조군에 대하여 관측된 배경 수준 이상으로 눈에 축적하였다.
펩타이드-변형된 AAVs는 AAV2 캡시드 속에 파아지 디스플레이 패닝으로부터 확인된 펩타이드 삽입에 의해 생성되었다. 펩타이드는 클론을 산출하기 위해 VP3 캡시드 단백질의 위치 587과 588 사이 삽입되었다. AAV-WT (야생형, 삽입물 없음)는 대조군 바이러스로서 작용하였다. 587/588 부위는 그의 주요 수용체, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG)과 AAV2의 결합에 관여된 VP3 캡시드 단백질의 도메인에 위치하고, 상기 부위내 펩타이드의 삽입은 타협적인 바이러스 생존력 없이 AAV의 굴성을 변경시킬 수 있다. 변형된 캡시드 단백질은 야생형 바이러스의 것에 비교할만한 게놈 역가로 AAV 벡터 게놈을 패키징하였다.
AAV2 야생형 캡시드의 서열
Figure pct00004
AAV2 야생형 캡시드의 서열은 서열식별번호: 8에서 아래 묘사된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
(서열식별번호: 8)
아래 실시예에서, 안구 세포를 표적으로 하는 삽입된 모티프 (서열식별번호: 1)를 가진 AAV2 야생형 캡시드의 서열은 이탤릭체이고, 밑줄친 아미노산은 스페이서이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
(서열 식별번호: 9)
서열식별번호: 4 삽입된 모티프를 가진 AAV2 야생형 캡시드의 서열은 서열식별번호: 10에서 아래 묘사된다. 안구 세포를 표적으로 하는 아미노산 모티프는 이탤릭체이고, 밑줄친 아미노산은 스페이서이다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
(서열 식별번호: 10)
AAV9 야생형 캡시드의 서열은 서열식별번호: 11에서 아래 묘사된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
(서열식별번호: 11)
물질 및 방법:
생체내 바이오패닝: 1μl의 Ph.D.TM 7 파아지 라이브러리 (NEB로부터 역가 2.0x 1013 pfu/ml)는 마우스 눈의 망막하 공간 속에 주사되었다. 30 분후, 주사된 눈으로부터 망막 및 RPE는 분리되었고, 5 ml 차가운 PBS로 3-5 회 세정되었다. 망막 및 RPE는 500 u1 PBS에서 균질화되었다. 회수된 파아지는 역가처리되었고, 증폭되었고, 정제되었고, 생체내 패닝의 다음 라운드에 대하여 추가의 눈에 재-주사되었다. 전체의 절차는 4 라운드에 대하여 반복되었다. 이 이후, 50 랜덤 선택된 클론은 서열분석되어 풍부한 모티프를 결정하였다.
펩타이드 변형된 AAV2 캡시드의 작제: 변형된 캡시드의 클로닝용 플라스미드는, 야생형 AAV2 Rep 및 Cap를 함유한, pXX2로부터 개발되었다. AAV2 Cap 아미노산 위치 587과 588 사이 삽입된 제한 부위 NotI 및 AscI 그리고 아미노산 AAAstopA를 인코딩한 DNA 단편을 가진 플라스미드는 골격 플라스미드로서 작제되었다. 선택된 펩타이드를 인코딩한 dsDNA 삽입물은 펩타이드 변형된 pXX2로서 NotI 및 AscI 부위 속에 클로닝되었다.
AAV2 생산 및 역가: 293T 세포의 플레이트는 3 플라스미드로 공동형질감염되었다: AAV2의 Rep 및 Cap 단백질을 공급한 pXX2 또는 펩타이드 변형된 pXX2; 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한 p헬퍼; 및 관심 이식유전자 및 AAV2 ITRs를 함유한 벡터 플라스미드. 20 150mm-직경 플레이트는 1:1:1의 몰비로 플라스미드 pXX2, p헬퍼, 및 벡터의 90 μg DNA 공동형질감염되었다. 60 시간 동안 인큐베이팅후, 바이러스는 아이오딕사놀 구배 및 무스탕 Q 막을 통한 추가 정제로 정제되었다. 재조합 AAV의 역가는 실시간 PCR에 의해 결정되었다.
실시예 2
유전자 요법에 의한 유전적 안 질환 치료
눈 속에 바이러스성 벡터 투여의 두 방법은 생체내 유전자 요법 제제의 전달을 시험하기 위해 시험되었다. 투여 방식은 하기를 통한 바이러스성 벡터 주사이었다: 망막하로 (도A-D) 및 초자체내로 (도E-I).
상기 연구에서 사용된 바이러스는 AAV2/2이었다. 대조군으로서, 야생형 AAV2/2.CMV.eGFP가 사용되었고, 시험 제제는 PMAAV-GST이었다. CMV.eGFP. 바이러스는 5 주령 C57BL/6 암컷 마우스 속에 주사되었다. 마우스는 바이러스로 망막하 주사되었다 (2.26 x 109 vg/눈). 3 주후, 마우스는 마취되었고 동공은 팽창되었다. 이들은 뇌정위적 플랫폼 상에 배치되었고, 동적 형광 기저부 사진이 찍어졌다. 4 주후, 마우스는 희생되었고 눈은 제핵되었고 4%의 파라포름알데하이드에 고정되었다. 조직 절편은 절단되었고 실장되었다. eGFP의 발현은 형광 현미경 하에 관측되었다.
야생형 AAV2/2.CMV.eGFP 및 PMAAV-GST. CMV.eGFP의 망막하 주사 3 주후, 살아있는 형광 화상형성은 상대 감염 효율성을 보여주었다. 상기 실험에서 사용된 표적화 펩타이드는 하기이었다: GSTPPPM (서열식별번호: 1). GFP 양성율의 반점된 영역은 AAV2/2 주사 눈에서 관측되었고, 반면에 PMAAV-GST 눈에서 넓은 및 균일한 GFP 신호가 있었다 (도2). 다른 실험에서, 표적화 펩타이드는 하기이었다: GETRAPL (서열식별번호: 4).
망막하 주사 4 주후, PMAAV-GST. CMV.eGFP는 망막 색소 상피 (RPE) 및 외부 핵 층 (ONL) 층, 및 신경절 세포 층 (GCL)에서 일부 세포를 표적화하였다. AAV2/2는 주로 외부 총상층 (OPL)을 표적화하였다 (도3).
모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참고로 편입된다. 전술한 명세서에서 본 발명이 특정 바람직한 그들의 구현예들과 관련하여 기재되었고, 많은 세부사항이 실례의 목적으로 제시되었어도, 본 발명이 추가의 구현예에 잘 받아들인다는 것이 및 본원에서 개시된 특정한 세부사항이 본 발명의 기본 원리로부터 이탈 없이 상당히 다양할 수 있다는 것이 분명할 것이다.
본 발명 기재의 문맥에서 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에서 달리 나타내지 않는 한 또는 맥락에 의해 명확히 반박하지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석된다. 용어 “포함한”, “갖는”, “포함하는”, 및 “함유한”은 달리 지적되지 않는 한 개방형 용어들 (즉, “비제한적으로, 포함하는” 의미)로서 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 설명은 단지, 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 그 범위 내에 해당하는 각 별개의 값을 개별적으로 참조하는 속기 방법으로서 작용하도록 의도되고, 각 별개의 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서 내에 편입된다. 본원에서 개시된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 맥락에 의해 반박되지 않는 한 임의의 적합한 순차로 수행될 수 있다. 임의의 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어의 사용 (예를 들면, “예컨대”) (본원에서 제공됨) 은, 본 발명을 더 양호하게 밝히기 위해 단지 의도되고 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서내 표현은 본 발명의 실시에 필수로서 임의의 비-청구된 요소의 지시로서 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 수행을 위하여 발명자들에 공지된 최상의 방식을 포함하여, 본 발명의 구현예는 본원에서 개시된다. 상기 구현예의 변동은 전술한 설명의 판독시 당해 분야의 숙련가에 분명해질 수 있다. 발명자들은 숙련가가 상기 변동을 적절하게 이용하는 것을 예상하고, 발명자들은 구체적으로 본원에서 개시된 것보다 달리 본 발명이 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 법에 의해 허용된 바와 같이 본원에 첨부된 청구항에서 인용된 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 이들의 모든 가능한 변동에서 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 맥락에 의해 명확히 반박되지 않는 한 본 발명에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION FONDAZIONE TELETHON <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING GENETIC EYE DISEASES <130> 17023.145WO1 <140> PCT/US2016/018970 <141> 2016-02-22 <150> 62/118,934 <151> 2015-02-20 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Ser Thr Pro Pro Pro Met 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggtcgacgc cgcctcctat g 21 <210> 3 <211> 8413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 aattcccatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat aatgaggggg 60 tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt agtctctaga 120 gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat gtggtcacgc 180 tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga ggtttgaacg 240 cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 300 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 360 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 420 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 480 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 540 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 600 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 660 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 720 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 780 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 840 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 900 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 960 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 1020 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 1080 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Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Ala Ala Ala Gly Ser 580 585 590 Thr Pro Pro Pro Met Ala Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn 595 600 605 Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr 610 615 620 Leu Gln Gly Pro 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60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Ala Ala Ala Gly Glu 580 585 590 Thr Arg Ala Pro Leu Ala Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn 595 600 605 Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr 610 615 620 Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe 625 630 635 640 His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro 645 650 655 Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr 660 665 670 Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly 675 680 685 Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys 690 695 700 Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val 705 710 715 720 Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg 725 730 735 Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 740 745 <210> 11 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 9 <400> 11 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims (37)

  1. 펩타이드를 표적한 안구 세포를 포함하는 변형된 아데노-관련 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 표적화 펩타이드가 3 내지 10개의 아미노산 길이이고 상기 표적화 펩타이드가 안구 세포에 AAV를 표적으로 하는, 캡시드 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 3, 4, 5, 6 또는 7 아미노산 길이인, 캡시드 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 그 안에 하기를 갖는 최대 10개의 아미노산 길이의 서열을 포함하는, 캡시드 단백질: 아미노산 서열 GSTPPPM (서열식별번호: 1) 또는 아미노산 서열 GETRAPL (서열식별번호: 4) (아미노에서 카복시 배향으로 또는 카복시에서 아미노 배향으로 발현된 경우).
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 하기로 이루어지는, 캡시드 단백질: 아미노산 서열 GSTPPPM (서열식별번호: 1) 또는 아미노산 서열 GETRAPL (서열식별번호: 4) (아미노에서 카복시 배향으로 또는 카복시에서 아미노 배향으로 발현된 경우).
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 서열식별번호: 8의 위치 P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588, 및/또는 R588-Q589에서 상기 AAV2 캡시드 잔기 사이 삽입되는, 캡시드 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 서열식별번호: 11의 위치 D384, G385, I560, T561, N562, E563, E564, E565, N704, 및/또는 Y705에서 상기 AAV9 캡시드 잔기 뒤에 삽입되는, 캡시드 단백질.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10을 포함하거나 또는 상기로 이루어지는, 캡시드 단백질.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 이환 안구 세포를 표적으로 하는, 캡시드 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 표적 펩타이드가 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, 척수소뇌 운동실조증 유형 7 (SCAT), 색상 시각상실, 및 상기 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 점액다당류증 (MPS) IV 및 MPS VII을 갖는 대상체내 안구 세포를 표적으로 하는, 캡시드 단백질.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (히말라야 원숭이-유도된 AAV), AAVRh10, 또는 이들 혈청형의 변형된 캡시드인, 캡시드 단백질.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 AAV 캡시드가 AAV2 캡시드인, 캡시드 단백질.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 상기 변형된 캡시드를 인코딩한, 핵산 서열.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 핵산 서열 GGGTCGACGCCGCCTCCTATG (서열식별번호: 2)를 포함하는, 핵산 서열.
  14. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 상기 캡시드 단백질을 함유하는, AAV 바이러스.
  15. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 상기 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스성 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 관심 핵산을 인코딩한 핵산 서열을 추가로 포함하는, 바이러스성 벡터.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 관심 핵산이 치료제인, 바이러스성 벡터.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 치료제가 효소 또는 RNAi 분자인, 바이러스성 벡터.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 치료제가 하기인, 바이러스성 벡터: 아탁신 7 mirRNA, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE 65), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 저해제 또는 용해성 VEGF 수용체 1 (sFifl), (Rab 호위 단백질-1) REP1, L-옵신, 로돕신 (Rho), 포스포디에스테라제 6(3 (PDE6I3), ATP-결합 카세트, 아과 A, 구성원 4 (ABCA4), 레시틴 레티놀 아실전달효소 (LRAT), 망막 퇴행, 저속/페리페린 (RDS/페리페린), 티로신-단백질 키나제 Mer (MERTK), 이노신-5 프라임-모노포스페이트 탈수소효소, 유형 I (IMPDHI), 구아닐레이트 사이클라제 2D (GUCY2D), 아릴-탄화수소 상호작용성 단백질-유사 1 (AIPL 1), 색소성 망막염 GTPase 조절물질 상호작용성 단백질 1 (RPGRIPI), 이노신-5-프라임-모노포스페이트 탈수소효소, 유형 I (IMPDH1 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질, 알파 형질도입 활성 폴리펩타이드 2 (GNAT2), 환식 뉴클레오타이드 관문 채널 베타 3 (CNGB3), 레티노쉬신 1 (Rsl), 안구 백피증 1형 (OA1), 안피부 백피증 1형 (OCA1) 티로시나제, P21 WAF-1/Cipl, 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF), 엔도스타틴 안지오스타틴, 아릴설파타제 B, 또는 13 -글루쿠로니다제.
  20. 청구항 14의 상기 AAV 바이러스 또는 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 바이러스성 벡터 및 캐리어를 포함하는, 조성물.
  21. 청구항 14의 상기 AAV 바이러스 또는 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 바이러스성 벡터 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는, 약학적 조성물.
  22. 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 상기 바이러스성 벡터를 포함한 또는 상기에 의해 형질도입된, 세포.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 세포.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 세포.
  25. 청구항 23에 있어서, 상기 세포가 비-인간 세포인, 세포.
  26. 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 시험관내이고, 선택적으로 상기 세포가 안구 세포인, 세포.
  27. 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 생체내이고, 선택적으로 상기 세포가 안구 세포인, 세포.
  28. 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 상기 바이러스성 벡터 또는 청구항 22 내지 27 중 어느 한 항의 상기 세포를 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 안구 질환의 치료 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  30. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 질환이 색소성 망막염, 황반병증, 레버 선천성 흑내장, 조기 발병 중증 망막 이영양증, 색맹, 망막층간분리, 안구 백피증, 안피부 백피증, 녹내장, 스타가르트 질환, 맥락막결여, 연령 관련 황반 변성, SCAT, 색상 시각상실, 또는 상기 각막에 영향을 미치는 리소좀 축적 질환, 예컨대 MPS IV 및 MPS VII인, 방법.
  31. 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 상기 바이러스성 벡터로 안구 세포를 형질도입하여 이로써 상기 형질도입된 안구 세포가 상기 치료제를 발현시키고 상기 제제를 상기 대상체의 상기 눈에 전달하는 것을 포함하는, 대상체의 상기 눈에 제제의 전달 방법.
  32. 청구항 28에 있어서, 상기 형질도입된 안구 세포가 망막 외부 총상층 (OPL)을 포함하거나 또는 상기 이내인, 방법.
  33. 의료 치료 또는 진단에서 사용을 위하여 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항에 의해 기재된 바와 같은, 바이러스성 벡터.
  34. 포유동물에서 안구 질환 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의 상기 바이러스성 벡터의, 용도.
  35. 의료 치료 또는 진단에서 사용을 위하여 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은, 세포.
  36. 포유동물에서 안구 질환 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한 청구항 22 내지 25 중 어느 한 항의 상기 세포의, 용도.
  37. 포유동물에서 안구 질환의 상기 예방적 또는 치료적 치료에서 사용을 위하여 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항의, 바이러스성 벡터.
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