CN108347932A

CN108347932A - 用于治疗遗传性眼病的方法和组合物

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Publication number: CN108347932A
Application number: CN201680022560.4A
Authority: CN
Inventors: B.L.戴维森; Y.H.陈; A.奥里基奥
Original assignee: Teleton Foundation; University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: Teleton Foundation; University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2015-02-20
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: JP2018506980A; CA2977355A1; EP3261440A4; US20180142259A1; SA517382162B1; KR102655319B1; SG11201706755SA; BR112017017867A2; KR20180012734A; JP6873907B2; WO2016134375A1; CN108347932B; AU2016219789A1; US10472650B2; EP3261440A1; AU2016219789B2; EP3261440B1; ES2920850T3

Abstract

本公开提供将药剂递送至眼睛的靶向肽和含有编码靶向肽的序列的载体。本发明人已发现用于将药剂诸如病毒性载体靶向眼部细胞的肽。本公开描述了一种利用这些新型肽来例如指导病毒衣壳到感兴趣细胞类型的方法。在此情况下，眼部细胞(诸如视网膜细胞)被所鉴别的肽靶向。具有被修饰以包括此类肽的衣壳蛋白的载体可用于向眼睛提供治疗剂。

Description

用于治疗遗传性眼病的方法和组合物

相关申请

本申请要求2015年2月20日提交的美国临时申请号62/118,934的优先权，所述临时申请的整个内容以引用方式并入本文。

介绍

基因转移现在被广泛认为是用于在细胞和分子水平下分析生物事件和疾病过程的强力工具。最近，基因疗法用于治疗遗传性(例如腺苷脱氨酶(ADA)缺陷)或获得性(例如癌症或感染性疾病)的人疾病的应用已受到相当多的注意。随着改进的基因转移技术的出现和不断发展的缺陷基因相关疾病文库的鉴别，基因疗法已从治疗理论快速进化到实际的现实。

传统上，基因疗法已被定义为其中外源基因被引入到患者细胞内以便校正先天性遗传误差的程序。尽管超过4500种人疾病目前被分类为遗传性的，但是已鉴别相对少的这些疾病在人基因组中的特异性突变。直到目前，这些罕见遗传性疾病表示基因疗法工作的排他性目标。因此，大部分NIH批准的基因疗法方案迄今为止已涉及将缺陷基因的功能拷贝引入到具有已知先天性遗传误差的个体的体细胞中。仅在最近，有研究者和临床医师开始了解，人癌症、某些形式的心血管疾病和许多缺陷型疾病也具有重要的遗传组分并且出于设计新型基因疗法的目的，应被认为“遗传性病症”。因此，基因疗法最近已广泛定义为通过将新基因信息引入到受影响生物体中来校正疾病表型。

在体内基因疗法中，转移基因被原位引入到接受者生物体的细胞中，即接受者内。体内基因疗法已在若干动物模型中评估。若干最新出版物已报道了指导基因原位转移到器官和组织诸如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统以及肺部中的可行性。还已经报道将DNA直接注射到骨骼肌、心肌中和将DNA-脂质复合物注射到脉管系统中在体内产生了可检测表达水平的插入的基因产物。

治疗眼睛遗传性疾病(例如，遗传性眼睛遗传疾病，诸如导致眼盲的疾病)仍是个问题。此类疾病的实例是色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦(Leber′scongenital amaurosis)、利伯氏遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病(Stargardt disease)、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、脊髓小脑性共济失调7型(SCAT)、色盲以及影响角膜的溶酶体贮积病(诸如黏多糖病(MPS)IV和MPS VII)。因此，需要开发用于眼睛遗传性疾病的疗法。

概述

本发明人已发现用于将药剂诸如病毒性载体靶向眼部细胞的肽。本公开描述了一种利用这些新型肽来例如指导病毒衣壳到感兴趣细胞类型的方法。在此情况下，眼部细胞(诸如视网膜细胞)被所鉴别的肽靶向。具有被修饰来包括此类肽的衣壳蛋白的载体可用于向眼睛提供治疗剂。

如本文所用，术语“靶标”意指病毒诸如腺相关病毒(AAV)的衣壳蛋白相对于另一种类型的组织(例如脑组织)优选结合至一种类型的组织(例如视网膜细胞)。在某些实施方案中，遗传修饰的衣壳蛋白可以通过以高于相当的、未修饰的衣壳蛋白10％至1000％的水平结合来“靶向”眼部细胞。例如，具有遗传修饰的衣壳蛋白的AAV可以大于未修饰AAV病毒50％至100％的水平结合至眼部细胞。

本发明提供一种含有靶向肽的修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述靶向肽的长度是3至10个氨基酸(即3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)并且其中所述靶向肽将AAV靶向至眼部细胞。在某些实施方案中，靶向肽的长度为3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

本发明提供一种含有遗传修饰以编码上文所述的肽的衣壳蛋白的AAV病毒。

本发明提供一种治疗哺乳动物中的疾病(例如眼部疾病)的方法，其通过向所述哺乳动物施用上文所述的病毒载体或上文所述的细胞。在某些实施方案中，哺乳动物为人。在某些实施方案中，疾病是色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、利伯氏遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、SCAT、色盲以及影响角膜的溶酶体贮积病(诸如MPS IV和MPS VII)。

在某些实施方案中，所述疾病为溶酶体贮积疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病为TPP1(三肽基肽酶I)、CLN3(Battenin)、PPT1(棕榈酰基蛋白硫酯酶I)、CLN6(神经元蜡样脂褐质沉积症蛋白6)或CLN8表达或活性的缺乏或缺陷。在某些实施方案中，所述疾病为神经变性疾病，诸如神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)，诸如婴儿NCL、迟发性婴儿NCL、青少年NCL(贝敦氏病(Batten disease))以及成人NCL。

本发明提供一种向受试者的眼睛递送药剂的方法，其通过用上文所述的病毒载体转导眼部细胞，以使得转导的眼部细胞表达治疗剂并将所述药剂递送至所述受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述药剂为共济失调蛋白(Ataxin)7mirRNA(例如以治疗SCA 7)。在某些实施方案中，所述药剂为视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE 65)(例如以治疗利伯氏先天性黑朦)。在某些实施方案中，所述药剂为血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂或可溶性VEGF受体1(sFifl)(例如以治疗年龄相关性黄斑变性)。在某些实施方案中，所述药剂为REP1(例如以治疗无脉络膜)。在某些实施方案中，所述药剂为L-视蛋白(例如以治疗色盲)。表1列出示例性疾病、靶基因和相应编码的蛋白质。

表1

附图简述

图1.肽修饰的AAV(PMAAV)-GST的序列。AAV2/2(AAV2 ITR/AAV2衣壳)衣壳序列(斜体印刷)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)视网膜靶向肽(加黑和加下划线)。

图2.活动物中的荧光成像显示相对感染效率。在AAV2/2注射眼睛中观察到绿色荧光蛋白(GFP)阳性的斑点区域，而在PMAAV-GST眼睛中存在广泛且均匀的GFP信号。

图3.PMAAV-GST.CMV.eGFP靶向视网膜色素上皮(RPE)和外核层(ONL)层，以及神经节细胞层(GCL)中的一些细胞。AAV2/2主要靶向OPL。CMV-巨细胞病毒；eGFP-增强的GFP。

图4.视网膜下注射

图5.未修饰的AAV2-视网膜下注射

图6.未修饰的AAV2-视网膜下注射

图7.20X图像PM修饰的AAV2-视网膜下注射

图8.玻璃体内注射。

图9.AAV2玻璃体内注射。

图10.AAV2玻璃体内注射。

图11.AAV2PM GST玻璃体内注射。

图12.AAV2PM GST玻璃体内注射。

详述

本公开的某些实施方案提供一种包含修饰的衣壳的病毒载体，其中所述修饰的衣壳包含将病毒载体靶向眼部细胞的至少一个氨基酸序列。在某些实施方案中，所述眼部细胞为视网膜细胞。

在某些实施方案中，所述病毒载体为腺相关病毒载体(AAV)。在某些实施方案中，AAV为AAV2，尽管向性被修改使得它将遵循此类修改将改变任何AAV的向性。

在某些实施方案中，靶向肽包含长度高达10个氨基酸且其中具有GSTPPPM(SEQ IDNO：1)或氨基酸序列GETRAPL(SEQ ID NO：4)(或由其组成)的序列，如以氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表示的。应注意序列的取向并不重要。例如，肽可从所述肽的氨基末端至羧基末端取向以成为GSTPPPM(SEQ ID NO：1)或者可以从所述肽的氨基末端至羧基末端取向以成为MPPPTSG(SEQ ID NO：5)。

在某些实施方案中，靶向肽插入在位置P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588和/或R588-Q589的AAV2衣壳残基之间。示例性野生型参考AAV2衣壳蛋白序列提供于SEQ ID NO：10中。

在某些实施方案中，靶向肽插入在位置D384、G385、I560、T561、N562、E563、E564、E565、N704和/或Y705的AAV9衣壳残基之后。示例性野生型参考AAV9衣壳蛋白序列提供于SEQ ID NO：11中。

在某些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或由其组成。

本发明提供一种病毒载体，其包含编码如上文所述的衣壳蛋白的核酸。在某些实施方案中，病毒载体还含有编码感兴趣核酸的核酸序列。在某些实施方案中，感兴趣核酸为治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂为酶或RNAi分子(例如siRNA、shRNA或miRNA分子)。在某些实施方案中，治疗剂为共济失调蛋白7mirRNA、RPE65、VEGF抑制剂或可溶性VEGF受体1(sFifl)、REP1、L-视蛋白、Rho、PDE6β、ABCA4、LRAT、RDS/外周蛋白、MERTK、IMPDH1、GUCY2D、RDS/外周蛋白、AIPL1、ABCA4、RPGRIP1、IMPDH1、AIPL1、GUCY2D、LRAT、MERTK、RPGRIP1、RPE65、ABCA4、GNAT2、CNGB3、Rs1、OA1、(OCAI)酪氨酸酶、P21 WAF-1/Cip1、PDGF、内皮抑素、血管抑素、芳基硫酸酯酶B或β-葡萄糖醛酸酶。

本公开的某些实施方案提供一种编码如本文所述的病毒载体的核酸序列。

本公开的某些实施方案提供一种编码如本文所述的修饰衣壳的核酸序列。本公开的某些实施方案提供一种包含SEQ ID NO：2(GGGTCGACGCCGCCTCCTATG)或由其组成的核酸序列。本公开的某些实施方案提供一种由本文所述的核酸序列所编码的修饰衣壳。

本公开的某些实施方案提供一种包含如本文所述的病毒载体的细胞。

本公开的某些实施方案提供一种由如本文所述的病毒载体所转导的细胞。

在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞为人细胞。在某些实施方案中，所述细胞为非人细胞。在某些实施方案中，所述细胞为体外的。在某些实施方案中，所述细胞为体内的。在某些实施方案中，所述细胞为眼部细胞，诸如视网膜细胞。

本公开的某些实施方案提供一种治疗哺乳动物中的疾病的方法，其包括向所述哺乳动物施用如本文所述的病毒载体或细胞。在某些实施方案中，靶向肽靶向患病眼部细胞。在某些实施方案中，靶向肽靶向患有以下疾病的受试者中的眼部细胞：色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、利伯氏遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、SCAT、色盲或影响角膜的溶酶体贮积病(诸如MPS IV和MPS VII)。

在某些实施方案中，所述受试者患有溶酶体贮积疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病为TPP1(三肽基肽酶I)、CLN3(Battenin)、PPT1(棕榈酰基蛋白硫酯酶I)、CLN6(神经元蜡样脂褐质沉积症蛋白6)或CLN8表达或活性的缺乏或缺陷。所述疾病包括神经变性疾病，诸如神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)，诸如婴儿NCL、迟发性婴儿NCL、青少年NCL(贝敦氏病)以及成人NCL。

在某些实施方案中，哺乳动物为人。

本公开的某些实施方案提供一种向受试者的眼睛递送药剂的方法，其包括用本文所述的病毒载体转导眼部细胞，以使得转导的眼部细胞表达治疗剂并将所述药剂递送至所述受试者的眼睛。

在某些实施方案中，所述病毒载体转导眼部细胞。

在某些实施方案中，所转导的眼部细胞是在视网膜外网状层(OPL)内或者包含所述视网膜外网状层。

本公开的某些实施方案提供如本文所述的用于医学治疗或诊断的病毒载体或细胞。

本公开的某些实施方案提供如本文所述的病毒载体或细胞制备用于治疗哺乳动物中的眼部疾病(例如遗传性眼病)的药物的用途。

本公开的某些实施方案提供一种用于鉴别靶向眼部组织的肽的方法，其包括使用噬菌体展示生物淘选以便鉴别此类肽。

所述载体还可包含酶、分泌性蛋白、核蛋白或胞质蛋白。如本文所用，术语“分泌性蛋白”包括无论是天然分泌还是修饰来含有信号序列以使得它可以分泌的任何分泌性蛋白。例如，分泌性蛋白可以是β-葡萄糖醛酸酶。

当核酸与另一种核酸序列处于功能关系中时，所述核酸为“可操作地连接的”。通常，“可操作地连接”意味着所连接的DNA序列为连续的。然而，增强子并不需要为连续的。连接通过在常规限制性位点处连接来实现。如果此类位点并不存在，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。另外，编码酶的核酸的多个拷贝可以在表达载体中连接一起。此类多个核酸可通过接头分隔开。

载体可以是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、基于人免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒的逆转录病毒或慢病毒载体。此类AAV的实例可见于Davidson等人，PNAS(2000)97∶3428-3432。AAV和慢病毒可赋予持续性表达，而腺病毒可提供瞬时表达。

本公开还提供含有本文所述的载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的，并且可以是来自眼睛的。细胞类型可以是干细胞群或祖细胞群。

本公开提供一种治疗哺乳动物中的疾病诸如遗传性眼病或癌症的方法，其通过施用本文所述的多核苷酸、多肽、表达载体或细胞。遗传性眼病或癌症可以是色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、利伯氏遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、SCAT、色盲以及影响角膜的溶酶体贮积病(诸如MPS IV和MPS VII)。

遗传性疾病可以是溶酶体贮积疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病为TPP1(三肽基肽酶I)、CLN3(Battenin)、PPT1(棕榈酰基蛋白硫酯酶I)、CLN6(神经元蜡样脂褐质沉积症蛋白6)或CLN8表达或活性的缺乏或缺陷。遗传性疾病可以是神经变性疾病，例如神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)，诸如婴儿NCL、迟发性婴儿NCL、青少年NCL(贝敦氏病)以及成人NCL。

本公开的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和遗传工程化细胞(体内修饰的细胞)及其用途。具体地说，本公开涉及一种能够局部递送治疗有效剂量的治疗剂的基因或蛋白质疗法的方法。

根据一个方面，提供一种用于在哺乳动物接受者中表达治疗剂的细胞表达系统。表达系统(在本文中也称为“遗传修饰的细胞”)包含用于表达治疗剂的细胞和表达载体。表达载体包括但不限于用于向细胞递送异源遗传性物质的病毒、质粒和其他媒介物。因此，如本文所用的术语“表达载体”是指用于向细胞递送异源遗传性物质的媒介物。具体地说，表达载体为重组腺病毒、腺相关病毒或慢病毒或逆转录病毒载体。

表达载体还包含用于控制异源基因的转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子(在下文中描述)。表达载体适于施用至哺乳动物接受者。表达载体可包含多个非永生化遗传修饰的细胞，每个细胞含有编码至少一种治疗剂的至少一种重组基因。

细胞表达系统可以在体内形成。根据另一个方面，提供一种用于在体内治疗哺乳动物接受者的方法。所述方法包括诸如经由眼内施用将用于表达异源基因产物的表达载体原位引入到患者的细胞中。为了在体内形成表达系统，将用于表达治疗剂的表达载体引入到哺乳动物接受者体内。

根据另一个方面，提供一种用于在体内治疗哺乳动物接受者的方法。所述方法包括将靶蛋白引入到患者体内。

用于表达异源基因的表达载体可包含用于控制异源基因产物的转录的诱导型启动子。因此，治疗剂的原位递送通过使细胞原位暴露于病状来控制，这诱导了异源基因的转录。

哺乳动物接受者可患有适于基因替代疗法的病状。如本文所用，“基因替代疗法”是指向接受者施用编码治疗剂的外源遗传物质并随后原位表达所施用的遗传物质。因此，短语“适于基因替代疗法的病状”包括诸如以下的病状：遗传性疾病(即可归因于一种或多种基因缺陷的疾病病状)、获得性病理(即不可归因于先天性缺陷的病理病状)、癌症以及预防性过程(即预防疾病或不希望的医学病状)。因此，如本文所用，术语“治疗剂”是指对哺乳动物接受者具有有利作用的任何药剂或物质。因此，“治疗剂”包括具有核酸或蛋白质组分的治疗性和预防性分子。

根据一个实施方案，哺乳动物接受者患有遗传性疾病并且外源遗传物质包含编码用于治疗所述疾病的治疗剂的异源基因。根据另一个实施方案，哺乳动物接受者患有获得性病理并且外源遗传物质包含编码用于治疗所述病理的治疗剂的异源基因。根据另一个实施方案，患者患有癌症并且外源遗传物质包含编码抗肿瘤剂的异源基因。根据另一个实施方案，患者患有不希望的医学病状并且外源遗传物质包含编码用于治疗所述病状的治疗剂的异源基因。

根据另一个实施方案，公开一种药物组合物。所述药物组合物包含多个上述遗传修饰的细胞或多肽以及药学上可接受的载剂。药物组合物可用于治疗适于基因替代疗法的病状并且外源遗传物质包含编码用于治疗所述病状的治疗剂的异源基因。药物组合物可含有足以将治疗有效剂量的治疗剂递送至所述患者的量的遗传修饰细胞或多肽。在下文中描述适于基因替代疗法的示例性病状。

根据另一个方面，提供一种用于形成上述药物组合物的方法。所述方法包括将用于表达异源基因产物的表达载体引入到细胞中以形成遗传修饰细胞并将所述遗传修饰细胞置于药学上可接受的载剂中。

这些方面和其他方面以及各种优点和实用性参考详述和附图将更清楚。

如本文所用，术语“酶”、“分泌性蛋白”、“核蛋白”或“胞质蛋白”包括这些多肽的变体或生物活性片段或无活性片段。所述多肽之一的“变体”是与天然蛋白不完全相同的多肽。此变体蛋白可通过经由插入、缺失或取代一个或多个氨基酸改变氨基酸序列来获得。蛋白质的氨基酸序列例如通过取代进行修饰，以产生与天然多肽相比具有基本上相同的或改进的品质的多肽。取代可以是保守性取代。“保守性取代”为氨基酸被具有类似侧链的另一种氨基酸取代。保守性取代将是使用以下氨基酸的取代：所述氨基酸使得氨基酸电荷或氨基酸侧链大小(或者侧链内的化学基团的大小、电荷或类型)变化可能最小，以使得总体肽保留其空间构象但具有改变的生物活性。例如，常见保守性变化可能是Asp至Glu、Asn或Gln；His至Lys、Arg或Phe；Asn至Gln、Asp或Glu；以及Ser至Cys、Thr或Gly。丙氨酸(Aline)常用于取代其他氨基酸。20种必需氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；具有不带电极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；以及具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

氨基酸变化通过改变相应核酸序列的密码子来实现。已知此类多肽可基于在多肽结构中用其他氨基酸取代某些氨基酸以便修改或改进生物活性来获得。例如，通过取代替代性氨基酸，可对导致活性增加的多肽赋予小构象改变。或者，某些多肽中的氨基酸取代可用于提供残基，所述残基然后可连接至其他分子以提供保留足够的起始多肽特性以用于其他目的的肽-分子缀合物。

可在赋予对多肽的交互式生物功能中使用氨基酸的亲水性指数，其中发现某些氨基酸可取代具有类似亲水性指数的其他氨基酸并且仍保留类似的生物活性。或者，可基于亲水性进行类似氨基酸的取代，具体地其中待生成的多肽中希望的生物功能预期用于免疫学实施方案中。如通过其相邻氨基酸的亲水性管控的“蛋白质”最大局部平均亲水性与其免疫原性相关。因此，应注意可基于分配给每个氨基酸的亲水性进行取代。

在使用亲水性指数或亲水指数(其将值分配给每个氨基酸)时，优选地进行氨基酸取代，其中这些值是±2，其中±1是特别优选的，并且具有±0.5的那些是最优选的取代。

变体蛋白与相应天然蛋白的氨基酸序列具有至少50％、至少约80％或甚至至少约90％但少于100％的连续氨基酸序列同源性或同一性。

变体多肽的氨基酸序列大致上对应于天然多肽的氨基酸序列。如本文所用，“大致上对应于”是指将引起与天然蛋白所生成的生物反应基本上相同的反应的多肽序列。此反应可以是天然蛋白所生成的水平的至少60％，并且可甚至是天然蛋白所生成的水平的至少80％。

变体可包含不存在于相应天然蛋白中或者相对于相应天然蛋白缺失的氨基酸残基。变体也可以是与相应天然蛋白相比的截短“片段”，即仅全长蛋白质的一部分。蛋白质变体还包括具有至少一个D-氨基酸的肽。

变体蛋白可由编码所述变体蛋白的分离DNA序列表达。“重组”被定义为通过遗传工程化方法产生的肽或核酸。应注意本领域中已熟知的，由于遗传密码的冗余，个别核苷酸可容易在密码子中交换，并且仍产生相同的氨基酸序列。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。

本公开提供治疗哺乳动物中的疾病的方法，其通过向细胞或患者施用表达载体。对于基因治疗方法，分子生物学和基因治疗领域的普通技术人员将能够确定用于本公开的新型方法中的表达载体的适当剂量和施用路径而无需过度实验。

根据一个实施方案，所述细胞在体内转化或另外遗传修饰。来自哺乳动物接受者的细胞在体内使用含有外源遗传物质的载体转化(即转导或转染)，所述外源遗传物质用于表达编码治疗剂的异源(例如重组)基因，并且原位递送所述治疗剂。

如本文所用，“外源遗传物质”是指并非天然存在于细胞中的天然或合成的核酸或寡核苷酸；或者如果其天然存在于细胞中，则细胞不能以生物学显著水平转录或表达它。因此，“外源遗传物质”包括例如可转录成反义RNA的非天然存在的核酸以及“异源基因”(即编码在相同类型的天然存在的细胞中不表达或以生物学不显著的水平表达的蛋白质的基因)。

在某些实施方案中，哺乳动物接受者患有适于基因替代疗法的病状。如本文所用，“基因替代疗法”是指向接受者施用编码治疗剂的外源遗传物质并随后原位表达所施用的遗传物质。因此，短语“适于基因替代疗法的病状”包括诸如以下的病状：遗传性疾病(即可归因于一种或多种基因缺陷的疾病病状)、获得性病理(即不可归因于先天性缺陷的病理病状)、癌症以及预防性过程(即预防疾病或不希望的医学病状)。因此，如本文所用，术语“治疗剂”是指对哺乳动物接受者具有有利作用的任何药剂或物质。因此，“治疗剂”包括具有核酸(例如反义RNA)和/或蛋白质组分的治疗性和预防性分子。

许多遗传性眼病为已知的。针对这些疾病有效的治疗剂也为已知的，因为它是已知在这些病症中缺乏的蛋白质/酶。在某些实施方案中，疾病或病状是色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、利伯氏遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、SCAT、色盲以及影响角膜的溶酶体贮积病(诸如MPS IV和MPS VII)。

在某些实施方案中，所述疾病或病状可为溶酶体贮积疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病为TPP1(三肽基肽酶I)、CLN3(Battenin)、PPT1(棕榈酰基蛋白硫酯酶I)、CLN6(神经元蜡样脂褐质沉积症蛋白6)或CLN8表达或活性的缺乏或缺陷。所述疾病可以是神经变性疾病，诸如神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)，诸如婴儿NCL、迟发性婴儿NCL、青少年NCL(贝敦氏病)以及成人NCL。

如本文所用，“获得性病理”是指显示异常生理学、生物化学、细胞、结构或分子生物学状态的疾病或综合征。示例性获得性病理提供于表2中。还给出了针对这些疾病有效的治疗剂。

表2.用于获得性病理的潜在基因疗法。由基因编码的相应蛋白质列出在表1中。

或者，适于基因替代疗法的病状为预防性方法，即用于预防疾病或不希望的医学病状的方法。因此，本公开包括一种用于递送对哺乳动物接受者具有预防性功能的治疗剂(即预防剂)的细胞表达系统。

总之，术语“治疗剂”包括但不限于以上表中列出的药剂以及其功能等效物。如本文所用，术语“功能等效物”是指对哺乳动物接受者具有与认为是功能等效物的治疗剂相同或改进的有利作用的分子(例如肽或蛋白质)。如本领域技术人员将了解的，功能等效性蛋白可通过重组技术，例如通过表达“功能等效性DNA”来产生。如本文所用，术语“功能等效性DNA”是指编码治疗剂的非天然存在的DNA。例如，许多(如果不是所有的话)表1-2所公开的药剂具有已知的氨基酸序列，其由天然存在的核酸编码。然而，由于遗传密码子的简并性，超过一个核酸可编码相同治疗剂。因此，本公开包括由天然存在的DNA以及非天然存在的DNA编码的治疗剂，所述非天然存在的DNA编码与由天然存在的DNA编码的相同的蛋白质。

上文公开的治疗剂和适于基因替代疗法的病状仅为说明性的并且不旨在限制本公开的范围。选择适合的治疗剂用于治疗已知的病状被认为是在本领域普通技术人员的范围内而无需过度实验。

筛选方法

本公开提供筛选和鉴别靶向(例如特异性靶向)特定区域(诸如中枢神经系统的脉管系统)的氨基酸序列的方法。此方法可用于鉴别对特定疾病状态具有特异性的靶向序列。换言之，靶向序列可被鉴别并用于治疗特定疾病。

AAV载体

腺相关病毒(AAV)为小的(20nm)、非致病性病毒，其用于治疗人疾病，诸如帕金森病和隐性遗传性疾病。生成一种构建体，其围绕连接至具有AAV反向末端重复(ITR)序列的靶基因的启动子。

在一个实施方案中，本公开的病毒载体为AAV载体。“AAV”载体是指腺相关病毒，并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在的和重组的形式，除了另外需要的情况外。如本文所用，术语“血清型”是指通过限定抗血清鉴别并基于与所述限定抗血清的衣壳蛋白反应性来与其他AAV区分的AAV，例如灵长动物AAV存在许多已知的血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV-Rh74和AAVRh10以及这些血清型的修饰衣壳)。例如，血清型AAV-2用于指一种AAV，其含有由AAV-2的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同AAV-2血清型的5’和3’ITR序列的基因组。假型AAV是指一种AAV，其含有来自一种血清型的衣壳蛋白和包含第二血清型的5’-3’ITR的病毒基因组。预期假型rAAV将具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与ITR血清型一致的遗传特性。假型rAAV使用本领域所述的标准技术产生。如本文所用，例如，rAAV1可用于指具有衣壳蛋白和来自相同血清型的5’-3’ITR的AAV或者它可以指具有来自血清型1的衣壳蛋白和来自不同AAV血清型(例如AAV血清型2)的5’-3’ITR的AAV。对于本文所示出的每个实施例，病毒设计和生产的说明描述了衣壳的血清型和5’-3’ITR序列。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一个AAV衣壳蛋白(优选地为野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳包裹的多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，它通常称为“rAAV”。

在一个实施方案中，AAV表达载体使用已知技术构建以至少提供为在转录方向中的可操作连接的组件、控制元件(包括转录起始区域)、感兴趣的DNA以及转录终止区域。控制元件被选择为在哺乳动物细胞中具有功能。含有可操作地连接的组件的所得构建体侧接(5’和3’)有功能性AAV ITR序列。

“腺相关病毒反向末端重复”或“AAV ITR”意指在AAV基因组每一端可见的本领域公认的区域，其以顺式结构一起作为DNA复制的起点并作为病毒包装信号起作用。AAV ITR连同AAV rep编码区域提供对插入在两个侧接ITR之间的核苷酸序列的有效切除和挽救以及将所述核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中。

AAV ITR区域的核苷酸序列为已知的。参见例如Kotin，R.M.(1994)Human GeneTherapy 5∶793-801；Berns，K.I.“Parvoviridae and their Replication”inFundamental Virology，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)。如本文所用，“AAV ITR”不需要具有所描绘的野生型核苷酸序列，但是可例如通过插入、缺失或取代核苷酸来改变。此外，AAV ITR可来源于若干AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74和AAVRh10以及这些血清型的修饰衣壳。另外，在AAV载体中侧接所选核苷酸序列的5’和3’ITR不一定需要相同或来源于相同AAV血清型或分离物，只要它们按预期起作用，即允许从宿主细胞基因组或载体切除和挽救感兴趣序列，并且允许在AAV Rep基因产物存在于细胞中时将异源序列整合到接受者细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV ITR可来源于若干AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74(恒河猴来源的AAV)以及AAVRh10。另外，在AAV表达载体中侧接所选核苷酸序列的5’和3’ITR不一定需要相同或来源于相同AAV血清型或分离物，只要它们按预期起作用，即允许从宿主细胞基因组或载体切除和挽救感兴趣序列，并且允许在AAV Rep基因产物存在于细胞中时将DNA分子整合到接受者细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV衣壳可来源于若干AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74(恒河猴来源的AAV)以及AAVRh10，并且AAV ITR来源于AAV血清型2。在某些实施方案中，AAV衣壳为AAV2衣壳。用于AAV载体中的适合DNA分子的大小将小于约5千碱基(kb)、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb、小于约2.5kb并且为本领域中已知的。

在本公开的一些实施方案中，用于AAV载体的DNA分子将含有单一siRNA序列的一个或多个拷贝。如本文所用，术语siRNA序列的多个拷贝意指至少2个拷贝、至少3个拷贝、至少4个拷贝、至少5个拷贝、至少6个拷贝、至少7个拷贝、至少8个拷贝、至少9个拷贝以及至少10个拷贝。在一些实施方案中，用于AAV载体的DNA分子将含有多个siRNA序列。如本文所用，术语多个siRNA序列意指至少2个siRNA序列、至少3个siRNA序列、至少4个siRNA序列、至少5个siRNA序列、至少6个siRNA序列、至少7个siRNA序列、至少8个siRNA序列、至少9个siRNA序列以及至少10个siRNA序列。在一些实施方案中，本公开的适合DNA载体将含有编码本公开的siRNA分子的序列和填充片段。本公开的适合填充片段包含本领域已知的序列，包括但不限于并不编码所表达蛋白质分子的序列；编码对其中表达它的细胞类型不具有有害作用的正常细胞蛋白质的序列；以及本身将不会编码功能性siRNA双螺旋分子的序列。

在一个实施方案中，用于AAV载体中的适合DNA分子的大小将小于约5千碱基(kb)并且将包括例如填充序列和编码本公开的siRNA分子的序列。例如，为了防止对含有rep和cap基因的AAV基因组序列的任何包装，含有rep和cap DNA片段的质粒可通过将如本领域已知的填充片段包含到引起DNA超过最佳包装长度的AAV基因组中来修饰。因此，辅助片段并未被包装到AAV病毒体中。这是一种安全特性，能确保仅不超过最佳包装大小的重组AAV载体基因组被包装到病毒体中。并入到填充序列中的AAV辅助片段可超过4.6kb的野生型基因组长度，并且超过野生型的105％的长度通常将不会包装。填充片段可来源于例如此类非病毒来源诸如Lac-Z或β-半乳糖苷酶基因。

在一个实施方案中，所选核苷酸序列可操作地连接至引导其在受试者体内的转录或表达的控制元件。此类控制元件可包含与所选基因正常缔合的控制序列。或者，可采用异源控制序列。适用的异源控制序列通常包括来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV中间早期启动子区域(CMVIE))、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂合启动子等。另外，来源于非病毒基因诸如鼠科金属硫蛋白基因的序列也将用于本文中。此类启动子序列从例如Stratagene(San Diego，Calif.)商购。

在一个实施方案中，异源启动子和其他控制元件诸如视网膜特异性和诱导型启动子、增强子等将具有特定用途。异源启动子的实例包括CMV启动子。视网膜特异性启动子的实例包括IRBP(光感受器间类视色素结合蛋白)启动子、hGRK1(人视紫红质激酶)启动子、IRBPe/GNAT2(光感受器间类视色素结合蛋白启动子的增强子元件)以及人转导蛋白α亚基启动子的最小序列为视网膜特异性启动子的实例。

在一个实施方案中，具有由AAV ITR结合的感兴趣DNA分子的AAV表达载体可通过将所选序列直接插入到使主要AAV开放阅读框(“ORF”)从中切除的AAV基因组中来构建。也可删除AAV基因组的其他部分，只要ITR的足够部分仍允许复制和包装功能。此类构建体可使用本领域已熟知的技术来设计。

或者，AAV ITR可从病毒基因组或从含有所述病毒基因组的AAV载体切除并且使用标准连接技术融合存在于另一个载体内的所选核酸构建体的5’和3’。例如，连接可在20mMTris-ClpH 7.5、10mM MgC12、10mM DTT、33gg/ml BSA、10mM-50mM NaCl以及任一40μM ATP、0.01-0.02(外斯)单位T4DNA连接酶中在0℃下(用于“粘性末端”连接)或1mM ATP、0.3-0.6(外斯)单位T4DNA连接酶在14℃下(用于“平整末端”连接)实现。分子间“粘性末端”连接通常在30-100μg/ml总DNA浓度(5-100nM总最终浓度)下进行。AAV载体含有ITR。具体地说，其中描述了若干种AAV载体，其可以登录号53222、53223、53224、53225和53226获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(“ATCC”)。

另外，嵌合基因可合成产生以包含一个或多个所选核酸序列的5’和3’排列的AAVITR序列。完全嵌合序列自通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装。

为了产生rAAV病毒体，使用已知技术诸如通过转染将AAV表达载体引入到适合的宿主细胞中。许多转染技术通常为本领域中已知的。参见例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork。特别适合的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接微量注射到培养细胞中、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导以及使用高速微粒子的核酸递送。

在一个实施方案中，用于产生rAAV病毒体的适合宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，所述宿主细胞可以或者已经用作异源DNA分子的接受者。术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定人细胞系293的细胞(通过例如美国模式培养物保藏所以登录号ATCCCRL1573容易获得)可用于实践本公开。具体地说，人细胞系293为已用腺病毒5型DNA片段转化并且表达腺病毒Ela和Elb基因的人胚肾细胞系。293细胞系容易转染，并且提供特别方便的平台，以在所述平台中产生rAAV病毒体。

在一个实施方案中，含有上述AAV表达载体的宿主细胞使得能够提供AAV辅助功能，以便复制和衣壳包裹由AAV ITR侧接的核苷酸序列以产生rAAV病毒体。AAV辅助功能通常为AAV来源的编码序列，其可表达来提供AAV基因产物，所述基因产物进而以反式形式起作用以用于生产性AAV复制。在本文中使用AAV辅助功能以补充从AAV表达载体丧失的必需AAV功能。因此，AAV辅助功能包括主要AAV ORF(开放阅读框)即rep和cap编码区域之一或两者或其功能同源物。

Rep表达产物已显示具有许多功能，包括其他功能：DNA复制的AAV起点的识别、结合和切刻；DNA解螺旋酶活性；以及AAV(或其他异源)启动子对转录的调节。Cap表达产物供应必需包装功能。在本文中使用AAV辅助功能以补充从AAV载体丧失的反式AAV功能。

在一个实施方案中，AAV辅助功能通过在AAV表达载体转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞来引入到宿主细胞。术语“AAV辅助构建体”通常是指一种核酸分子，其包含提供从AAV载体缺失的AAV功能的核苷酸序列，所述AAV载体将用于产生用于递送感兴趣核苷酸序列的转导载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充对裂解AAV复制所必需的丧失的AAV功能；然而，辅助构建体缺乏AAV ITR并且可能既不能复制也不能包装它们本身。AAV辅助构建体可以是呈质粒、噬菌体、转位子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已描述许多AAV辅助构建体，诸如编码Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。已描述许多其他载体，其编码Rep和/或Cap表达产物。

“AAV rep编码区”意指AAV基因组中编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep40的本领域公认区域。Rep表达产物已显示具有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合和切刻、DNA解螺旋酶活性以及AAV(或其他异源)启动子对转录的调节。Rep表达产物为复制AAV基因组所共同需要的。AAV rep编码区的适合同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，所述基因也已知介导AAV-2 DNA复制。

“AAV cap编码区”意指AAV基因组中编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能同源物的本领域公认区域。这些Cap表达产物供应包装功能，所述包装功能为包装所述病毒基因组所共同需要的。在某些实施方案中，在AAV2衣壳蛋白中的P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588和/或R588-Q589处进行修饰，诸如插入。在某些实施方案中，在AAV9的D384、G385、I560、T561、N562、E563、E564、E565、N704和/或Y705处进行插入。

在一个实施方案中，AAV表达载体和AAV辅助构建体可被构建来含有一个或多个任选的可选择标记。适合标记包括当已用含有可选择标记的核酸构建体转染的那些细胞在适当选择培养基中生长时给予对所述细胞的抗生素抗性或敏感性、赋予所述细胞颜色或改变所述细胞的抗原特征的基因。用于实践本公开的若干可选择标记基因包括允许通过赋予对G418(可获自Sigma，St.Louis，Mo.)的抗性来在哺乳动物细胞中进行选择的潮霉素B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))。其他适合的标记为本领域技术人员所已知的。

在一个实施方案中，使得宿主细胞(或包装细胞)能够提供非AAV来源的功能或“辅助功能”，以便产生rAAV病毒体。辅助功能为非AAV来源的病毒和/或细胞功能，AAV的复制依赖于这些功能。因此，辅助功能包括AAV复制中所需要的至少那些非AAV蛋白质和RNA，包括参与AAV基因转录活化、阶段性特异性AAV mRNA拼接、AAV DNA复制、Cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些。基于病毒的辅助功能可以来源于任何已知的辅助病毒。

在一个实施方案中，辅助功能可以使用本领域技术人员已知的方法引入到宿主细胞并且然后在所述宿主细胞内表达。通常，通过用不相关辅助病毒感染宿主细胞来提供辅助功能。许多适合的辅助病毒为已知的，包括：腺病毒；疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒1型和2型；以及牛痘病毒。非病毒辅助功能也将用于本文中，诸如通过细胞同化使用各种已知药剂中的任一种提供的那些非病毒辅助功能。

在一个实施方案中，使用辅助功能载体提供辅助功能。辅助功能载体包含提供一种或多种辅助功能的核苷酸序列。辅助功能载体能够引入到适合的宿主细胞中，以便支持宿主细胞中的有效AAV病毒体产生。辅助功能载体可以是呈质粒、噬菌体、转位子或粘粒的形式。辅助载体也可以是呈一个或多个线性化DNA或RNA片段的形式，所述片段当与控制元件和酶缔合时可以在宿主细胞中转录或表达以提供辅助功能。

在一个实施方案中，提供辅助功能的核酸序列可由天然来源获得，诸如由腺病毒颗粒的基因组获得，或者使用本领域已知的重组或合成方法构建。在此方面，腺病毒来源的辅助功能已得到广泛研究，并且参与辅助功能的许多腺病毒基因已得到鉴别和部分表征。确切地说，早期腺病毒基因区域E1a、E2a、E4、VAI RNA以及可能的E1b被认为参与辅助过程。已描述疱疹病毒来源的辅助功能。也已描述牛痘病毒来源的辅助功能。

在一个实施方案中，由于用辅助病毒感染宿主细胞或者用辅助功能载体转染宿主细胞，表达反式活化AAV辅助构建体以产生AAV Rep和/或Cap蛋白的辅助功能。Rep表达产物从AAV表达载体切除重组DNA(包括感兴趣的DNA)。Rep蛋白也用于复制AAV基因组。所表达的Cap蛋白质组装成衣壳，并且重组AAV基因组包装到衣壳中。因此，生产性AAV复制随之发生，并且DNA包装到rAAV病毒体中。

在一个实施方案中，在重组AAV复制之后，可使用各种常规纯化方法诸如CsCl梯度从宿主细胞中纯化rAAV病毒体。另外，如果采用感染来表达辅助功能，可以使用已知方法灭活残余辅助病毒。例如，可通过加热至大约60℃的温度持续例如20分钟或更长时间来灭活腺病毒。此处理仅有效地灭活辅助病毒，因为AAV是极端热稳定的，而辅助腺病毒为热不稳定的。所得rAAV病毒体然后准备好用于DNA递送至受试者的眼睛。

递送病毒载体的方法包括但不限于眼内、视网膜下和玻璃体内路径。通常，rAAV病毒体可使用体内或体外转导技术来引入到眼睛的细胞中。如果在体外转导，所需接受者细胞将从受试者移除，用rAAV病毒体转导并重新引入到受试者中。或者，可以使用同基因或异基因细胞，其中那些细胞将不会在受试者中生成不适当的免疫反应。

已描述用于将转导细胞递送和引入到受试者中的适合方法。例如，细胞可在体外通过例如在适当培养基中将重组AAV病毒体与眼部细胞组合来转导，并且筛选具有感兴趣DNA的那些细胞可以使用常规技术诸如DNA印迹和/或PCR或者通过使用可选择标记来筛选。转导细胞然后可配制成下文更充分描述的药物组合物，并且所述组合物通过各种技术，诸如通过移植、肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射来引入到受试者中。

在一个实施方案中，对于体内递送，rAAV病毒体被配制成药物组合物并且通常将眼内施用，例如通过视网膜下注射来施用。

在一个实施方案中，药物组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的感兴趣的核酸，即足以减少或减轻讨论中的疾病状态的症状的量或足以赋予所需益处的量。药物组合物也将含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括自身并不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生的任何药剂，并且所述药剂可在无过量毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨醇、吐温80以及液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。其中可包含药学上可接受的盐，例如无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯酸盐等等。此外，辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等等可存在于此类媒介物中。药学上可接受的赋形剂的充分讨论可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

如本领域技术人员根据本说明书的教导将清楚的是，可凭经验确定必须添加的有效量的病毒载体。施用可在整个治疗过程中连续地或间歇地以一个剂量实现。确定最有效的施用装置和施用剂量的方法为本领域技术人员已熟知的并且将随病毒载体、治疗组合物、靶细胞和正治疗受试者而变化。单次和多次施用可使用治疗医师所选择的剂量水平和模式来进行。

应理解超过一个转基因可由所递送病毒载体表达。或者，各自表达一个或多个不同转基因的单独载体也可递送至眼睛，如本文所述的。另外，还预期通过本公开的方法递送的病毒载体与其他适合的组合物和疗法组合。

用于将遗传物质引入到细胞中的方法

外源遗传物质(例如编码一种或多种治疗蛋白的cDNA)通过遗传转移方法诸如转染或转导引入到离体或体内细胞中，以提供遗传修饰的细胞。各种表达载体(即用于帮助将外源遗传物质递送到靶细胞中的媒介物)为本领域普通技术人员所已知的。

如本文所用，“细胞转染”是指细胞通过并入所添加的DNA获取新遗传物质。因此，转染是指使用物理或化学方法将核酸插入到细胞中。若干转染技术为本领域普通技术人员所已知的，所述技术包括：磷酸钙DNA共同沉淀；DEAE-右旋糖酐；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；以及钨颗粒促进的微粒轰击法。磷酸锶DNA共同沉淀为另一种可能的转染方法。

相比之下，“细胞转导”是指使用DNA或RNA病毒将核酸转移到细胞中的过程。用于将核酸转移到细胞中的RNA病毒(即逆转录病毒)在本文中称为转导嵌合逆转录病毒。逆转录病毒内含有的外源遗传物质并入到所转导细胞的基因组内。已用嵌合DNA病毒(例如携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒)的细胞将不具有并入到其基因组中的外源遗传物质，但将能够表达保留在细胞内的染色体外的外源遗传物质。

通常，外源遗传物质包含异源基因(通常为包含编码治疗蛋白的外显子的cDNA形式)连同控制新基因转录的启动子。启动子在特征上具有引发转录所需要的特定核苷酸序列。任选地，外源遗传物质还包含获得所需基因转录活性所需要的另外的序列(即增强子)。出于此讨论的目的，“增强子”为简单的任一非翻译DNA序列，其与编码序列(顺式)连续起作用以改变由启动子控制的基础转录水平。外源遗传物质可引入到细胞基因组中的启动子紧接下游，以使得启动子和编码序列可操作地连接，以便允许编码序列转录。逆转录病毒表达载体可包含控制所插入外源基因转录的外源启动子元件。此类外源启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。

天然存在的组成型启动子控制必需细胞功能的表达。因此，在组成型启动子的控制下的基因在所有细胞生长条件下表达。示例性组成型启动子包括用于以下基因的启动子，所述基因编码某些组成型或“管家”功能：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子，以及本领域技术人员已知的其他组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地起作用。这些启动子包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和逆转录病毒的长末端重复(LTR)；以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子，以及其他启动子。因此，可使用任何上文提及的组成型启动子来控制异源基因插入物的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅仅或者较大程度上在诱导剂存在下表达(例如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子存在下极大地增加)。诱导型启动子包括当结合其诱导因子时刺激转录的反应性元件(RE)。例如，对于血清因子、甾类激素、视黄酸和环AMP存在RE。可以选择含有特定RE的启动子，以便获得诱导型反应，并且在一些情况下，RE本身可附接至不同启动子，从而赋予重组基因可诱导性。因此，通过选择适当启动子(组成型对比诱导型；强对比弱)，可以控制治疗剂在遗传修饰细胞中的存在和表达水平。如果编码治疗剂的基因处于诱导型启动子的控制下，则治疗剂的原位递送通过将原位遗传修饰细胞暴露于允许治疗剂转录的条件下来引发，例如通过腹膜内注射控制药剂转录的诱导型启动子的特定诱导剂。例如，遗传修饰细胞对在金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的治疗剂的原位表达通过将遗传修饰细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触来增强。

因此，原位递送的治疗剂的量通过控制诸如以下因素来调节：(1)用于引导所插入基因的转录的启动子的性质(即无论启动子是组成型还是诱导型，是强还是弱)；(2)插入到细胞中的外源基因的拷贝数目；(3)施用(例如植入)至患者的所转导/转染细胞的数目；(4)植入物(例如，移植或包封的表达系统)的大小；(5)植入物的数目；(6)所转导/转染细胞或植入物保留在原处的时间长度；以及(7)遗传修饰细胞对治疗剂的产生速率。用于递送治疗有效剂量的特定治疗剂的这些因素的选择和优化被认为是处于本领域普通技术人员的范围内而无需过度实验，应考虑到以上公开的因素和患者的临床曲线。

除了至少一个启动子和编码治疗剂的至少一个异源核酸，表达载体可包含用于促进选择已用表达载体转染或转导的细胞的选择基因，例如新霉素抗性基因。或者，细胞用两个或更多个表达载体转染，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，另一个载体含有选择基因。选择适合的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列(下文描述)被认为是本领域普通技术人员的范围内而无需过度实验。

治疗剂可以靶向递送至细胞外、细胞内或膜位置处。如果希望基因产物从细胞分泌，则表达载体被设计为包含用于将治疗基因产物从细胞分泌至细胞外环境的适当分泌“信号”序列。如果希望基因产物保留在细胞内，则省略此分泌信号序列。以类似方式，表达载体可被构建来包含用于将治疗剂锚定在细胞质膜内的“保留”信号序列。例如，所有膜蛋白均具有疏水性跨膜区域，其终止蛋白质在膜中的转位并不允许蛋白质分泌。包含用于将基因产物靶向特定位置的信号序列的表达载体的构建被认为是在本领域普通技术人员的范围内而不需要过度实验。

以下讨论涉及本公开的各种实用性。例如，本公开具有作为用于使细胞内和/或细胞外毒素原位解毒的表达系统的实用性。通过附接或者省略适当信号序列至编码能够使毒素解毒的治疗剂的基因，治疗剂可被靶向以递送至细胞外环境、细胞质膜或细胞内位置。在一个实施方案中，含有编码细胞内解毒治疗剂的基因的外源遗传物质还包含编码用于促进细胞外毒素转运到细胞内的表面受体的序列，在所述细胞内所述毒素可通过治疗剂进行细胞内解毒。或者，细胞可被遗传修饰来表达锚定于细胞质膜内的解毒治疗剂，以使得活性部分延伸到细胞外环境中。膜结合治疗剂的活性部分使存在于细胞外环境中的毒素解毒。

除了上述治疗剂(一些治疗剂被靶向以细胞内保留)之外，本公开还包括意图递送至细胞外环境的药剂和/或意图锚定在细胞质膜内的药剂。

用于在分离细胞内表达特定基因产物的特定表达载体的选择和优化通过获得潜在地具有一个或多个适当控制区域(例如启动子、插入序列)的基因；制备包含所述基因所插入的载体的载体构建体；用所述载体构建体在体外转染或转导所培养细胞；以及确定基因产物是否存在于所培养细胞内来完成。在某些实施方案中，使用来自腺相关病毒家族的病毒。在某些实施方案中，使用用于基于AAV2、AAV4和/或AAV5的基因疗法的表达载体。

因此，如本领域普通技术人员将清楚的，各种适合的病毒表达载体可用于将外源遗传物质转移到细胞中。表达用于适于基因替代疗法的特定病状的治疗剂的适当表达载体的选择和用于将所选表达载体插入到细胞中的条件的优化是在本领域普通技术人员的范围内而不需要过度实验。

在一个替代实施方案中，表达载体为质粒形式，其通过各种方法之一转移到靶细胞中：物理(例如显微注射、电穿孔、划痕负载、微粒轰击)或通过作为化学复合物进行细胞摄取(例如钙或锶共同沉淀、与脂质复合、与配体复合)。若干商业产品可用于阳离子脂质体复合，包括Lipofectin^TM(Gibco-BRL，Gaithersburg，Md.)和Transfectam^TM(ProMega，Madison，Wis.)。然而，通过这些方法转染的效率高度依赖于靶细胞的性质，并且因此必须优化使用上述程序将核酸最佳转染到细胞中的条件。此类优化是在本领域普通技术人员的范围内而不需要过度实验。

本公开还提供各种用于制备和使用上述遗传修饰细胞的方法。如本文所用，术语“分离”意指已从其天然存在的体内位置移出的一个或多个细胞。用于从患者中去除细胞的方法以及用于维持培养物中分离的细胞的方法为本领域普通技术人员所已知的。

本公开还提供用于遗传修饰哺乳动物接受者体内细胞的方法。根据一个实施方案，所述方法包括例如通过将载体注射到接受者来将用于表达异源基因产物的表达载体原位引入到哺乳动物接受者的细胞中。

在一个实施方案中，遗传修饰细胞的制剂含有足以将治疗有效剂量的治疗剂原位递送至接受者的量的细胞。用于已知病状的特定治疗剂的治疗有效剂量的确定是在本领域普通技术人员的范围内而不需要过度实验。因此，在确定有效剂量时，普通技术人员将考虑患者的病状、病状的严重性以及所施用的特定治疗剂的临床研究结果。

如果遗传修饰细胞还未存在于药学上可接受的载剂中，则它们在施用于接受者之前置于此载剂中。此药学上可接受的载剂包括例如对患者和疗法适合的等渗盐水和其他缓冲液。

超过一个重组基因可以相同或不同载体引入到每个遗传修饰细胞，从而允许单个细胞表达多个治疗剂。

实施例1

靶向眼部细胞的修饰AAV的制备

本发明人设计了被修饰来在局部递送之后靶向眼部细胞的AAV。为了生成靶向眼部细胞的腺相关病毒(AAV)，发明人首先使用体内噬菌体展示淘选以鉴别优先结合至眼部细胞的肽基序。将噬菌体展示文库注射到小鼠的眼睛，并且随后分离带有结合噬菌体的眼睛细胞。然后扩增和重新注射分离的噬菌体，并且在五轮此体内淘选之后，回收的噬菌体的DNA测序揭示了不同肽基序从初始噬菌体文库的富集。

在小鼠中，鉴别肽基序GSTPPPM(SEQ ID NO：1)和GETRAPL(SEQ ID NO：4)。为了验证这些噬菌体对眼部细胞的亲和力，将每个噬菌体单独静脉内重新注射到小鼠中，并且使其可视化。与淘选结果一致，每个所选噬菌体在眼睛中累积量超过对于对照观察到背景水平。

通过将由噬菌体展示淘选鉴别的肽插入到AAV2衣壳中来生成肽修饰AAV。将肽插入在VP3衣壳蛋白的位置587与588之间以产生克隆。AAV-WT(野生型，无插入物)用作对照病毒。587/588位点位于参与AAV2与其主要受体肝素蛋白聚糖(HSPG)的结合的VP3衣壳蛋白的结构域中，并且肽在此位点的插入可改变AAV的向性而不累及病毒活力。修饰的衣壳蛋白包装具有与野生型病毒的那些相当的基因组滴度的AAV载体基因组。

AAV2野生型衣壳的序列

587 588

5′-AGA GGC AAC AGA CAA GCA-3′ (SEQ ID NO：6)

R G N R Q A (SEQ ID NO：7)

AAV2野生型衣壳的序列描绘于以下SEQ ID NO：8中。

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*(SEQ IDNO：8)

在以下实施例中，具有靶向眼部细胞的插入基序(SEQ ID NO：1)的AAV2野生型衣壳的序列是斜体的，并且加下划线氨基酸为间隔区。

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNAAAGSTPPMAARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*(SEQ IDNO：9)

具有SEQ ID NO：4插入基序的AAV2野生型衣壳的序列描绘于以下SEQ ID NO：10中。靶向眼部细胞的氨基酸基序是斜体的，并且加下划线的氨基酸为间隔区。

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AAV9野生型衣壳的序列描绘于以下SEQ ID NO：11中。

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材料和方法：

体内生物淘选：将1μl Ph.D.^TM 7噬菌体文库(滴度2.0x 10¹³ pfu/ml，来自NEB)注射到小鼠眼睛的视网膜下空间。在30分钟之后，分离来自注射眼睛的视网膜和RPE，用5ml冷PBS洗涤3-5次。在500ul PBS中使视网膜和RPE均质化。滴定所回收的噬菌体，将其扩增，纯化并重新注射到另外的眼睛中以进行下一轮体内淘选。将整个程序重复四轮。此后，对50个随机选择的克隆进行测序以确定富集的基序。

肽修饰的AAV2衣壳的构建：由含有野生型AAV2Rep和Cap的pXX2开发用于克隆修饰衣壳的质粒。将具有编码氨基酸AAA终止A和插入在AAV2Cap氨基酸位置587和588之间的限制性位点NotI和AscI的DNA片段的质粒构建为主链质粒。将编码的所选肽的dsDNA插入物作为肽修饰的pXX2克隆到NotI和AscI位点中。

AAV2产生和滴度：将293T细胞的板用三种质粒共同转染：pXX2或肽修饰的pXX2，其供应AAV2的Rep和Cap蛋白质；pHelper，其含有腺病毒辅助功能；以及载体质粒，其含有AAV2ITR和感兴趣的转基因。将二十个150mm直径板用1∶1∶1摩尔比的质粒pXX2、pHelper和载体的90μg DNA共同转染。在孵育60小时后，使用碘克沙醇梯度和进一步通过mustang Q膜纯化来纯化病毒。通过实时PCR确定重组AAV的滴度。

实施例2

借助于基因疗法治疗遗传性眼病

对两种将病毒载体施用到眼睛的方法进行测试以便测试基因治疗剂的体内递送。施用模式是通过经由视网膜下(图A-D)和玻璃体内(图E-I)注射病毒载体。

此研究中使用的病毒为AAV2/2。作为对照，使用野生型AAV2/2.CMV.eGFP，并且测试试剂为PMAAV-GST.CMV.eGFP。将所述病毒注射到五周大的C57BL/6雌性小鼠中。用病毒(2.26x 109vg/眼睛)视网膜下注射小鼠。三周后，使小鼠麻醉并扩大瞳孔。将小鼠置于立体定向平台上，并且获取动态荧光眼底照片。四周后，处死小鼠并将眼睛去核并在4％多聚甲醛中固定。切割并固定组织切片。在荧光显微镜下观察eGFP的表达。

视网膜下注射野生型AAV2/2.CMV.eGFP和PMAAV-GST.CMV.eGFP之后三周，活动物中的荧光成像显示相对感染效率。在此实验中使用的靶向肽为GSTPPPM(SEQ ID NO：1)。在AAV2/2注射眼睛中观察到GFP阳性的斑点区域，而在PMAAV-GST眼睛中存在广泛且均匀的GFP信号(图2)。在其他实验中，靶向肽为GETRAPL(SEQ ID NO：4)。

在视网膜下注射之后四周，PMAAV-GST.CMV.eGFP靶向视网膜色素上皮(RPE)和外核层(ONL)层，以及神经节细胞层(GCL)中的一些细胞。AAV2/2主要靶向外网织层(OPL)(图3)。

所有出版物、专利和专利申请以引用方式并入本文中。尽管在上述说明书中，已经就本发明的某些优选实施方案对其进行了描述，并且出于说明目的已经提出了许多细节，但是对本领域普通技术人员显而易见的是本发明易受另外的实施例的影响并且在此所描述的某些细节可以在不偏离本发明的基本原则的情况下进行明显的改变。

在描述本发明的上下文中，术语“一个/一种(a/an)”、“所述(the)”以及相似指代词的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非在此另外指示或明显地与上下文矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)，除非另外标注。在此叙述值的范围仅旨在用作个别参考该范围内的每个单独数值的简写方法，除非在此另外指示，并且将每个单独数值结合在说明书中，就好像它在此个别引用一样。在此描述的所有方法可以任何适合的顺序进行，除非在此另外指示或明显地与上下文矛盾。在此提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另外指示。本说明书中的任何语言均不应解释为指示任何未要求权利保护的特征作为实施本发明的必要特征。

本文中描述了本发明的实施方案，其包括为发明人所知用来执行本发明的最佳模式。阅读上述说明后那些实施方案的变体对于本领域的普通技术人员而言可为显而易见的。发明人希望技术人员视情况采用此类变体，并且发明人意图以不同于如本文所特别描述的方式来实践本发明。因此，只要适用法律允许，本发明包括此处所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变体中的上述元素的任意组合。

Claims

1.一种包含眼部细胞靶向肽的修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述靶向肽的长度是3至10个氨基酸并且其中所述靶向肽将AAV靶向至眼部细胞。

2.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽的长度为3、4、5、6或7个氨基酸。

3.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽包含长度高达10个氨基酸且其中具有氨基酸序列GSTPPPM(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列GETRAPL(SEQ ID NO：4)的序列，如以氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表示的。

4.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽由氨基酸序列GSTPPPM(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列GETRAPL(SEQ ID NO：4)组成，如以氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表示的。

5.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽插入在SEQ ID NO：8的位置P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588和/或R588-Q589的所述AAV2衣壳残基之间。

6.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽插入在SEQ ID NO：11的位置D384、G385、I560、T561、N562、E563、E564、E565、N704和/或Y705的所述AAV9衣壳残基之后。

7.如权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其组成。

8.如权利要求1或2所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽靶向患病眼部细胞。

9.如权利要求8所述的衣壳蛋白，其中所述靶向肽靶向患有以下疾病的受试者中的眼部细胞：色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、脊髓小脑性共济失调7型(SCAT)、色盲或影响角膜的溶酶体贮积病，诸如黏多糖病(MPS)IV和MPS VII。

10.如权利要求1-9中任一项所述的衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74(恒河猴来源的AAV)、AAVRh10或这些血清型的修饰衣壳。

11.如权利要求10所述的衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳为AAV2衣壳。

12.一种核酸序列，其编码如权利要求1-11中任一项所述的修饰衣壳。

13.如权利要求12所述的核酸序列，其包含核酸序列GGGTCGACGCCGCCTCCTATG(SEQ IDNO：2)。

14.一种AAV病毒，其含有如权利要求1-11中任一项所述的衣壳蛋白。

15.一种病毒载体，其包含如权利要求1-11中任一项所述的衣壳蛋白。

16.如权利要求15所述的病毒载体，其中所述病毒载体还包含编码感兴趣核酸的核酸序列。

17.如权利要求16所述的病毒载体，其中所述感兴趣核酸为治疗剂。

18.如权利要求17所述的病毒载体，其中所述治疗剂为酶或RNAi分子。

19.如权利要求17所述的病毒载体，其中所述治疗剂为共济失调蛋白7mirRNA、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白质(RPE 65)、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂或可溶性VEGF受体1(sFifl)、(Rab护卫蛋白-1)REP1、L-视蛋白、视紫红质(Rho)、磷酸二酯酶6(3(PDE6I3)、ATP-结合盒，子家族A，成员4(ABCA4)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、视网膜变性，缓慢/外周蛋白(RDS/外周蛋白)、酪氨酸蛋白激酶聚体(MERTK)、肌苷-5引物-单磷酸脱氢酶I型(IMPDHI)、鸟苷酸环化酶2D(GUCY2D)、芳基烃相互作用蛋白样1(AIPL 1)、色素性视网膜炎GTP酶调节剂相互作用蛋白1(RPGRIPI)、肌苷-5-引物-单磷酸脱氢酶I型(IMPDH1鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α转导活性多肽2(GNAT2)、环核苷酸门控通道β3(CNGB3)、视网膜劈裂蛋白1(Rs1)、眼白化病1型(OA1)、眼皮肤白化病1型(OCA1)酪氨酸酶、P21 WAF-1/Cip1、血小板衍生的生长因子(PDGF)、内皮抑素、血管抑素、芳基硫酸酯酶B或13-葡萄糖醛酸酶。

20.一种组合物，其包含如权利要求14所述的AAV病毒或如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体和载剂。

21.一种药物组合物，其包含如权利要求14所述的AAV病毒或如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体和药学上可接受的载剂。

22.一种细胞，其通过如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体转导或者包含所述病毒载体。

23.如权利要求22所述的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。

24.如权利要求23所述的细胞，其中所述细胞为人细胞。

25.如权利要求23所述的细胞，其中所述细胞为非人细胞。

26.如权利要求22-25中任一项所述的细胞，其中所述细胞为体外的，任选地其中所述细胞为眼部细胞。

27.如权利要求22-25中任一项所述的细胞，其中所述细胞为体内的，任选地其中所述细胞为眼部细胞。

28.一种治疗哺乳动物中的眼部疾病的方法，其包括向所述哺乳动物施用如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体或如权利要求22-27中任一项所述的细胞。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述疾病是色素性视网膜炎、黄斑病、利伯氏先天性黑朦、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、青光眼、斯特格氏病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、SCAT、色盲或影响角膜的溶酶体贮积病，诸如MPS IV和MPS VII。

31.一种向受试者的眼睛递送药剂的方法，其包括用权利要求15-19中任一项所述的病毒载体转导眼部细胞，以使得所转导的眼部细胞表达所述治疗剂并将所述药剂递送至所述受试者的眼睛。

32.如权利要求28所述的方法，其中所转导的眼部细胞是在视网膜外网状层(OPL)内或者包含所述视网膜外网状层。

33.一种如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体，其用于医学治疗或诊断。

34.如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体的用途，其用以制备用于治疗哺乳动物中的眼部疾病的药物。

35.如权利要求22-25中任一项所述的细胞，其用于医学治疗或诊断。

36.如权利要求22-25中任一项所述的细胞的用途，其用以制备用于治疗哺乳动物中的眼部疾病的药物。

37.如权利要求15-19中任一项所述的病毒载体，其用于预防性或治疗性治疗哺乳动物中的眼部疾病。