KR101154374B1 - 표적화된 유전자 전달을 위한 아데노-부속 바이러스 혈청형5 벡터를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 바이러스 벡터의 캡시드 단백질 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터 및 상기 벡터로 종양 치료 유전자 등과 같은 외래 유전자가 삽입된 벡터 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 종양 등의 다양한 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

재조합 아데노-부속 바이러스 혈청형 5(Recombinant adeno-associated virus serotype 5), 캡시드 수식, 바이러스 향성, 인간 암 세포

Description

표적화된 유전자 전달을 위한 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 벡터를 포함하는 조성물{Composition Comprising Adeno-Associated Virus Serotype 5 Vector for Targeted Gene Delivery}

본 발명은 바이러스 벡터의 캡시드 단백질 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터 및 상기 벡터로 종양 치료 유전자 등과 같은 외래 유전자가 삽입된 벡터 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

재조합 아데노-부속 바이러스 (Recombinant adeno-associated virus: rAAV)는 목적유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 특성을 가지고 있다. rAAV는 분열하거나 비분열하는 다양한 세포를 모두 감염할 수 있고, 최소의 면역 반역을 유도하면서 이식유전자(transgene)를 지속적으로 발현시킨다[Wu, Z. et al., 2006, Mol Ther 14: 316-327; Warrington, K. H. et al., 2006, Hum Genet 119: 571-603]. 목적유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 AAV의 혈청형들 중에서, 가장 널리 연구된 벡터는 아데노-부속 바이러스 혈청형 2 (Adeno-associated virus serotype 2)로, 낭포성섬유증 [Moss, R. B., et al., 2007, Hum Gene Ther 18: 726-732], 혈우병 [Wu, Z., et al., 2007, Mol Ther.; Sabatino, D. E., et al.,2007, Mol Ther 15: 1677-1685; Wiwanitkit, V.,2007, Hum Gene Ther 18: 89-92] 및 카나반 병 [McPhee, S. W., et al.,2006, J Gene Med 8: 577-588]의 임상적 유전자 전달에 현재 사용되고 있다. 또한, 최근에는 암 유전자 치료 분야 (cancer gene therapy) 에서 rAAV의 잠재성이 증가하고 있다 [Li, C. et al., 200Cancer gene therapy 12: 913-925; Hacker, U. T., et al., 2005, J Gene Med 7: 1429-1438.].

그럼에도 불구하고, 목적한 조직에서는 매우 낮은 수준으로 유도되고, 목적한 조직 외에서 이식유전자의 예측하지 못한 발현 때문에, 광범위한 숙주 범위를 가지는 rAAV의 사용이 제한 받고 있다. 세포/조직에 대한 향성(tropism)의 일차적 결정인자는 세포 수용체에 대한 rAAV 캡시드의 결합 특이성에 의존한다 [Berns, K. I. et al., 2001, Field's Virology, Lippincott-Raven, Philadelphia]. 이 사실에 기반하여, 여러 연구자들이 수용체 특이성을 변형시키고자, rAAV 캡시드 영역을 유전적으로 조작하였다. rAAV2 캡시드 단백질에 삽입 돌연변이를 유발(14-아미노산 표적화 펩타이드가 삽입된)하여, 그로드(Girod) 등은 rAAV2 감염에 저항성을 나타내는 세포로 rAAV를 표적화 시키는 성공적 시도를 첫번째로 하였다[Girod, A., et al., 1999, Nat Med 5: 1438]. 그 이후, 비슷한 전략으로 rAAV2를 변형하여 인 비트로 (in vitro) 뿐만 아니라 인 비보 (in vivo) 에서도, 표적화시킨 유전자 전 달을 지지하는 연구들이 있었다 [Work, L. M., et al., 2006, Mol Ther 13: 683-693; Grifman, M., et al., 2001, Mol Ther 3: 964-975; White, K., et al., 2007, Gene therapy; Lieber, A., 2003, Nature biotechnology 21: 1011-1013]. 지금까지의 rAAV의 재표적화 연구는 백본(backbone)으로 rAAV2를 사용하였다.

그리프만(Grifman) 등은 AAV1에서 AAV15의 캡시드 서열을 카닌 파보바이러스의 대응하는 영역과 정렬하였고[Grifman, M., et al., 2001, Mol Ther 3: 964-975], 그는 각각 rAAV2의 아미노산 447번과 587번에서의 아르기닌(Arg)를 각각 포함하는 루프 GH12-13과 루프 HI가 바이러스 복제능의 상실없이 자유롭게 변경될 수 있음을 지적하였다. 이런 위치들은 지로드(Girod) 등에 의하여, 변경 표적화 영역으로 동정되었으며, 루프 IV는 rAAV2의 향성 변경에 빈번하게 사용되었다[Girod, A., et al., 1999, Nat Med 5: 1438]. rAAV1 혈청형의 경우에도 혈관내피세포를 목표로 하고 향성 변경을 위해 rAAV2 캡시드 아미노산 587번 위치에 대응하는 rAAV1 캡시드 단백질의 아미노산 590번에다 RGD-4C 모티프를 넣은 연구 사례가 있다[MD Stachler, MD. et al., 2006, Gene Therapy 13:926-931]. 그러나 현재까지 향성 변경을 위해 그 외 다른 rAAV 혈청형들의 캡시드 단백질에 유전적 돌연변이를 일으킨 연구가 거의 없는 상황이다.

전체돌연변이(systemic mutation) 연구와 함께[Wu, P., et al., 2000, J Virol 74: 8635-864], AAV2의 원자구조분석에 따르면 아미노산 587번 내의 주요 수용체 결합 모티브(루프 IV)가 3-기단부 피크(threefold-proximal peak)내에 위치하였다[Xie, Q., et al., 2002, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 10405-10410]. 수용체를 인지하는 역할을 하는 다른 루프 (loop III)는, 반대로, 피크의 말단부(distal floor)에 위치하였다. rAAV2 캡시드와 약 55%의 동일성을 보이는 rAAV5는 헤파린 설페이트(heparin sulfate)을 필요로 하는 AAV2와 구별되게 숙주세포의 α2,3-결합된 시알릭산(α2,3-linked sialic acid)을 필요로 하였다[Walters, R. W., et al., 2001, The Journal of biological chemistry 276: 20610-20616].

rAAV5 캡시드와 CPV(canine parvovirus) 캡시드는 모두 시알릭산에 결합하는 것으로 알려졌지만, 이들 캡시드의 구조를 비교한 결과, rAAV5의 표면 특성이 CPV의 수용체 표면형과 아주 일치하지 않음을 시사하였다. 월터(Walter) 등에 의한 AAV2 및 AAV5의 CPV와의 모델-기반 비교는 2축에서 억제되는 벽(wall in the depression at the twofold axis)에 위치하는 3개의 아미노산(I528, N546, M547)이 rAAV5의 수용체 결합에 관련되어 있음을 암시하였다[Walters, R. W., et al., 2004, J Virol 78: 3361-3371]. 578번 아미노산에 호밍 펩타이드를 도입하면 rAAV5에 의한 TE가 급격이 감소되는 본 발명의 데이터는, 본래의 rAAV5 향성이 녹다운(knock-down) 되는 것임을 시사한다. 따라서, 2축내의 내부 표면에 있는 영역이 아니라 3축-기단부 피크에 존재하는 578번 아미노산 근처의 영역이 rAAV5가 시알릭산에 결합하도록 하는 영역으로 보인다. 그러나, rAAV5 수용체 결합시의 상세 특징을 결론내기 위해서는 연구가 더 필요하다.

알파 브이 인테그린 (alpha V integrin)은 광범위한 종류의 종양세포와 혈관구조에서 자주 과발현된다[Bello, L., et al., 2001, Neurosurgery49: 380-389; discussion 390; Brooks, P. C., et al., 1994, Science 264: 569-571]. 알파 브이 인테그린-결합 RGD 모티프 (RGD-4C)는 원래는 유전적으로 아데노바이러스를 표적화하기 위하여 도입하였으며 이들 돌연변이체는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 모두에서 인간 암 세포를 현저하게 이식유전자 발현을 강화시켰다 [Kanerva, A., et al., 2004, International journal of cancer 110: 475-480; Niu, G., et al., 2007, Mol Imaging Biol]. RGD 모티프를 노출시킨 rAAV2는 성공적으로 rAAV2를 재표적화하였다[Girod, A., et al. 1999, Nat Med 5: 1438 Shi, W., etal., 2006, Gynecologic oncology 103: 1054-1062]. sLeX(Sialyl Lewis X)는 다양한 암 세포 표면에서 발견되는데, sLeX 결합 모티브는 펩타이드-AHWIPRYSSPAT-결합 분석(peptide-AHWIPRYSSPAT-binding analysis)으로 동정되었다[Kwon, M., et al., 2002, J Am Chem Soc 124: 13996-13997]. TnC(Tenascin C)는 상이한 종류의 인간 종양에서 빈번하게 과발현되었다[Wiksten, J. P., et al., 2003, Oncology 64: 245-250]. TnC-호밍 펩타이드는 sLeX와 같은 전략으로 페이지 디스플레이(phage display)로 동정되었다

항종양 효과에 대한 기대는, 암의 유전자 치료 분야까지 지속적으로 증대되고 있다[Li, C., et al., 2005, Cancer gene therapy12: 913-925; Bazan-Peregrino, M., et al., 2007, Cancer gene therapy 14: 117-127]. 종양 혈관구조의 형성을 표적화하는 항신생혈관형성 치료(anti-angiogenesis theraphy)는 일차 종양 형성과 전이된 종양 모두에서 암 치료의 매력적인 전략으로 여겨졌다[Folkman, J. et al., 1989, Nature 339: 58-61]. 항종양 효능을 위해서는, 지 속적 수준의 신생혈관 억제제가 요구된다는 것을 제시하는 증거들과 함께, rAAV는 장기간의 항종양 효과를 획득하기 위한 적절한 벡터로 확인되었다 [Davidoff, A. M., et al., 2002, Cancer research 62: 3077-3083]. 그러나, 생체내로 rAAV를 전신 투여하면, 대부분의 바이러스는 간과 비장에 분포하게 되어, 그 적용이 제한받았다[Nathwani, A. C., et al., 2007, Blood 109: 1414-1421]. 베이크(Baker)와 공동 연구자들은 원하는 향성을 가지는 rAAV2를 이용하여 혈관 조직 (vascular tissue)으로의 표적화된 전달을 달성하였다[Work, L. M., et al., 2006, ,Mol Ther 13: 683-693; White, K., et al., 2007, Gene therapy White, S. J., et al. 2004, Circulation 109: 513-519].

그러나, rAAV에 의해 매개된 형질도입 효율 (Transduction efficiency: TE)은 존재하는 중화항체들에 의하여 부정적인 영향을 받게 되는데, rAAV2에 대한 항체가 일반의 인간 집단에 매우 광범위하게 퍼져 있음을 시사하는 여러 발표들이 있었다 [Boissier, M. C., et al., 2007, Hum Gene Ther 18: 525-535; Blacklow, N. R., et al., 1968, Journal of the National Cancer Institute 40: 319-327; Blacklow, N. R., et al., 1971, American journal of epidemiology 94: 359-366; Halbert, C. L., et al., 2006, Hum Gene Ther 17: 440-447]. 따라서, 유전자 전달체로서의 rAAV2의 잠재성은 생체내 적용, 특히 전신 투여시에는 심각하게 방해 받을 수 있다.

AAV2, 5 및 6에 대한 중화 항체를 측정한 최근 연구에 의하면, AAV5에 대해서는 최소 집단만이 혈청 양성을 보이므로, 천연의 향성을 유전적으로 조작하여 변 경된 향성을 제공하기 위한 백본(backbone)으로서 rAAV5가 rAAV2의 유망한 대안이 될 수 있다는 것을 시사한다[Halbert, C. L., et al., 2006, Hum Gene Ther 17: 440-447]. rAAV2는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 세포 면역을 유발하는 경향이 있는데 비하여 [Vandenberghe, L. H., et al., 2006, ,Nat Med 12: 967-971; Mingozzi, F., et al., 2007, Nat Med 13: 419-422], 일반적인 인간 개체는 rAAV5에 대하여 보다 적은 혈청-양성을 보였다[Blacklow, N. R., et al., 1971, American journal of epidemiology 94: 359-366; Halbert, C. L., et al., 2006, Hum Gene Ther 17: 440-447]. 또한, 다양한 rAAV 혈청형의 생산을 최적화하는 동안, 그림(Grimm) 등은 rAAV5가 rAAV2보다 더 효율적임을 밝혔다 [Grimm, D., et al., 2003, Mol Ther 7: 839-850].

지금까지 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 대중적인 유전자 전달 벡터로 사용되어 왔지만 중화항체에 의한 심각한 면역반응이 유도되는 아데노-부속 바이러스 혈청형 2를 대신하여 상대적으로 안전한 혈청형 5를 유전자 전달 벡터로 사용하되, 보다 효율적으로 유전자 전달(gene delivery)에 사용하기 위하여, 특정 세포 또는 조직으로 표적화가 가능하게 하도록 하는 것이다.

이를 위하여, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5를 둘러싸고 있는 외피를 구성하는 캡시드 단백질의 특성과 기능을 개조시키는 방법으로 바이러스가 특정 세포로 표적화 되도록 하였다. 구체적으로, 바이러스 벡터의 캡시드 단백질 내부에 표적화 모티프 펩타이드를 삽입하여, 표적 분자를 인지하고 결합할 수 있는 개조된 표면 특성을 가지는 바이러스를 생성하는 벡터를 제작하였다.

본 발명은 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 바이러스 벡터로서, 캡시드 단백질의 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 표적화된 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다.

또한, 상기 벡터로 외래 유전자가 삽입된,(i) 캡시드 단백질의 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 외래 유전자를 코딩하는 핵산서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 “바이러스 벡터”는 표적분자에 대하여 특이적 향성을 가지도록 기능과 특성이 개조된 캡시드 단백질을 발현하는, 따라서, 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전 물질을 특이적으로 전달할 수 있는 특이성과 효율성이 개선된 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 바이러스 벡터이다. 본 발명의 벡터는 바이러스 구조 단백질인 캡시드 단백질 중간에 표적화 모티프 펩타이드가 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한 가닥의 폴리펩타이드로 연결되어 있는 키메릭(chimeric) 형태의 캡시드 단백질을 발현한다. 따라서, 본 발명의 벡 터로부터 생성된 바이러스는, 삽입되는 펩타이드 종류와 특성에 따라 표적 물질에 대한 향성을 가지는 외피를 가지게 되고, 펩타이드 종류와 특성에 따라 특정 세포를 선택적으로 형질 도입시킬 수 있는 특성도 가지게 된다. 본 발명의 벡터는, 벡터에 삽입하는 표적화 모티프 펩타이드의 종류를 조절하여 목적한 바에 맞도록 바이러스의 향성과 표적화 특성을 손쉽게 조작할 수 있다.

본 발명의 벡터는, 유전적 수준에서 재조합된 캡시드 단백질과 모티프 펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현이 되도록 펩타이드를 코딩하는 핵산서열이 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산서열 내에 삽입되어 있다.

본 발명의 “표적화 모티프 펩타이드”는 특정 세포의 막 등에 존재하는 특이적으로 존재하거나 과량으로 존재하는 표적 분자를 특이적으로 인지 및/또는 결합할 수 있는 펩타이드로, 본 발명의 벡터에 삽입 가능한 표적화 모티프 펩타이드는 바이러스 생산능을 상실시키지 않고, 바이러스에 표적화 기능을 부여할 수 있는 모든 펩타이드를 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 표적화 모티프 펩타이드는 종양 세포에서 발현되는 분자, 예를 들어 시알릴 루이스 X (sialic Lewis X), 인테그린 (integrin) 또는 테나신 C (Tenascin C)를 특이적으로 인지 및/또는 결합하는 펩타이드다. 보다 구체적으로, 시알릴 루이스 X를 특이적으로 인지하는 표적화 모티프 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열, 인테그린을 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 테나신 C를 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진다.

상기 표적화 모티프 펩타이드의 크기는, 벡터에 삽입되어 바이러스로 생성될 때, 바이러스 복제능과 조립능의 상실없이 바이러스를 생성할 수 있는 크기로 제한된다. 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 7 내지 20개의 아미노산를 포함한다. 7 내지 20개의 아미노산 범위에 있는 다양한 크기의 펩타이드는 바이러스 복제능과 조립능의 상실없이 현저한 입자의 부유밀도를 가지면서 캡시드 단백질에 삽입이 가능하였다. 또한, 이 범위내에서는 삽입되는 크기와 바이러스 입자를 생성하는 효율성 사이에는 상관관계가 없었다. 본 발명의 이 결과는 이전에 측정되어 밝혀진 17개의 아미노산을 가지는 rAAV2보다 더 긴 크기이다 [Blacklow, N. R., et al., 1968, Journal of the National Cancer Institute 40: 319-327].

본 발명의 모티프 펩타이드는 바이러스 복제능과 조립능을 영향을 주지 않고 유전적으로 변경을 가할 수 있는 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 부위에 삽입된다. 본 발명자들은 아데노-부속 바이러스 혈청형 5의 아미노산 444번과 578번 잔기의 양 루프가 바이러스 복제능과 조립능에 영향을 미치지 않고, 유전적으로 변경을 가할 수 있는 부위임을 밝혔다. 구체적으로, 본 발명자들은 rAAV5는 캡시드 영역, 444 또는 578 아미노산 잔기 부위가 외부 펩타이드의 삽입이 가능한 유전적으로 변형이 가능한 위치이고, 상기 위치로 제한된 크기의 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 돌연변이체는 야생형 바이러스 수준의 바이러스 생산능을 가지며, 펩타이드 삽입에 의해 유전적으로 변이된 바이러스는 재표적화되는 수용체의 특성에 따라 인간 암 세포를 형질 유도할 수 있음을 밝혔다.

또한, 벡터는, 당 벡터 제조 분야에서 통상적인 이루어지고 있는 수정, 변형, 및 응용이 가능하다.

본 발명의 벡터는, 세포, 조직 및 기관으로 전달 및 발현하고자 하는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 핵산을 벡터에 삽입하여 의학적, 수의학적 분야에서 다양한 질병의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있다. 벡터와 외래 유전자의 삽입, 작동적 연결 등은 당 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

예를 들어, 혈우병, 경상적혈구빈혈, 화학요법에 의한 빈혈 등의 혈액이상 질환, 알츠하이머, 파킨스씨병, 다발성경화증, 헌팅턴병 및 유전자결함 정신질환 등의 중추신경계 질환, 낭포성섬유증, 당뇨병, 성장호르몬결핍증 및 골다공증 등의 대사이상 질환, 다발성경화증, 건선 및 류마티스성 질환 등의 자가면역 질환, HIV감염, 인플루앤자, 단순포진, 유두종바이러스 및 마이코박테리아 등의 감염증과 종양 등의 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있으나, 바람직하게는 종양 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터에 삽입될 수 있는 종양 치료 유전자는, 종양 억제인자 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자, 항-신생 혈관 생성 유전자, 항체, 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 약제감수성 유전자, 약제 내성 유전자, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질 등을 예로 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 표적 세포에서 유전자 발현을 조절하는 안티센스 핵산 또는 siRNA를 발현하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 바이러스 벡터의 캡시드 단백질 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또한, (i) 바이러스 벡터의 캡시드 단백질의 내부 아미노산 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 외래 유전자를 코딩하는 핵산서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 허용 가능한 약제학적 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로, 예를 들어, 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 바이러스 벡터로서, 캡시드 단백질의 내부 아미노산 부위에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 표적 세포 특이적으로 유전자를 전달하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기에서 언급한 세포, 조직 및/또는 기관으로 전달 및 발현하고자 하는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 본 발명의 조성물은 당업계에서 아데노-부속 바이러스를 복제하는 방법, 예를 들어 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 허피스 바이러스 등의 헬퍼 바이러스(helper virus) 등을 이용하여 순도, 안정성, 형태 및 감염력 등을 고려한 조건에서 바이러스로 증식시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은, 개체에서 분리한 세포에 이입한 후 개체에게 세포를 재이식하는 방법의 엑스 비보(ex vivo)적 방법과 개체에게 직접 주사하는 인 비보(in vivo)적 방법으로 인간뿐만 아니라 바이러스에 의해 감염능을 가지는 동물에게도 유전자 전달체로 사용가능하다.

본 발명의 벡터로부터 생성된 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 돌연변이체는 바이러스 생산능이 상실되지 않은 채 야생형 바이러스 수준의 바이러스 생산능과 이식 유전자의 발현으로 인한 기능을 보였으며, 삽입된 모티프 펩타이드의 종류와 특성에 따라 특정 세포에 대한 특이적인 형질유도능을 보였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 좀더 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1 세포 배양 및 rAAV 감염

293T 와 인간 뇌종양 U251 세포는 각각, 하버드 메디칼 스쿨의 닥터 정(Dr. Jung)과 피츠버그 대학의 닥터 이(Dr. Lee)로부터 제공받았다. 다른 인간 암 세포 (hepatocellular SK-Hep1, cervical HeLa, breast MDA-MB-231 및 MDA-MD-435S, glioblastoma U-251, U87-MG, U118-MG, colon HCT-116)는 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA) 로부터 구입하였다. 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), L-글루타맥스 (L-glutamax) (2 mM), 페니실린(penicillin) (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(streptomycin) (50 μg/ml)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 5% CO₂, 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 유전자 전달을 위하여, 세포를 다양한 MOI(multiplicities of infection)의 rAAV로 처리하였다. 대조구로 사용된 Mock-처리 세포는 rAAV를 처리하지 않은 세포이다. GFP 발현은 도립 형광 현미경 (inverted fluorescent microscope: Leica DMIRB, Leica, Germany) 으로 관찰하고 사진을 찍었다.

1-2 캡시드 단백질 및 rAAV의 컴퓨터-모델링

RGD-4C 삽입된 rAAV5-RGD1 캡시드의 상동성 모델 (homology model)은 상동성 모델링 프로그램, MODELLER 9v2, 을 이용하여 AAV2 캡시드 (PDB ID code: 1LP3) 의 3.0 Å 결정 구조 및 AAV4 캡시드 (PDB ID code: 2G8G)의 3.2 Å 결정구조에 기반하여 설계되었다 [Sali, A. et al., (1993). J. Mol. Biol.234: 779-815]. 단일 캡시드 모델에서 전체 비리온의 생성은 CNSsolve program v1.1을 이용하여 수행하였다 [Brunger, A. T., et al. (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 54: 905-921]. 모든 구조 형태는 PyMol v0.98를 이용하여 만들었다 (www.pymol.org).

1-3 바이러스 플라스미드 제조

pR2C5와 pHpa-trs-SK는 닥터 하이(Dr. High)로부터 획득하였으며 아데노바이러스 pXX6 헬퍼플라스미드(adenoviral pXX6 helper plasmid)는 Stratagene (La jolla, CA, USA)으로부터 획득하였다. pcDNA3.1(+)-sc39TK는 도날드 비 콘 (Donald B Kohn: University of Southern California, Keck School of Medicine, University of Los Angeles)으로부터 제공받았다. pHpa-trs-SK는 scAAV2 (self-complementary AAV2) 게놈 내에 EGFP 발현 카셋트로 구성되어 있다.

pSp72-R2C5 플라스미드는 pR2C5의 4.2-kb의 KpnI-XbaI 단편을 pSp72 벡터의 KpnI-XbaI 부위로 서브클로닝하여 제조되었다. 그리고, 서브클로닝을 쉽게 하기 위하여, pSp72-R2C5의 rAAV5 VP1-인코딩 서열 코돈의 교체 없이 1210 bp 에서 1215 bp 의 SnaBI 부위를 제조사(Stratagene, La Jolla, California)에서 기술한 바와 같이 QuikChange^® 멀티 부위-특이적 돌연변이새성 키트를 이용하여 생성하였고, 이 플라스미드를 pSp72-R2C5-SnaBI으로 명명하였다. PCR 생성물의 1.0-kb의 XbaI-SnaBI 단편은 서열번호 9의 Cap5 XbaI 프라이머와 서열번호 10의 Cap5 SnaBI 프라이머를 이용하여 pSp72-R2C5에서 획득되었다.

플라스미드 pGEM-T easy-Cap5은 pR2C5의 1.0 kb XbaI-SnaBI 단편을 pGEM-T^® Easy 벡터(Promega, Madison, WI)의 삽입 부위의 3’ T 오버핸지(overhangs)로 TA 클로닝하여 획득하였다. 각 돌연변이체를 위한, QuikChange^® 멀티 부위-특이적 돌연변이생성 (mutagenesis)의 PCR 단편은 주형으로 pGEM T-easy-Cap5 플라스미드를 이용하고 각각의 두 프라이머를 이용하여 제조하였다. 15 뉴클레오타이드 이상을 포함하는 하나의 정방향 (forward) 프라이머는 VP1 유전자 상류(upstream) 및 모티프 펩타이드의 5’ 말단을 코딩하는 일부 뉴클레오타이드를 포함되고, 15 뉴클레오타이드 이상을 포함하는 다른 하나의 역방향 (Reverse) 프라이머는 삽입부위의 캡(cap) 유전자 하류(downstream) 및 모티프 펩타이드의 3’ 말단을 코딩하는 일부 뉴클레오타이드를 포함한다. pGEM-Cap5-sLeX1에 서열번호 11의 sLeX1-정방향 프라이머와 서열번호 12의 sLeX1-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-sLeX2에 서열번호 13의 sLeX2-정방향 프리어머와 서열번호 14의 sLeX2-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-RGD1에 서열번호 15의 RGD1-정방향 프라이머와 서열번호 16의 RGD1-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-RGD2에 서열번호 17의 RGD2-정방향 프라이머와 서열번호 18의 RGD2-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-TnC1에 서열번호 19의 TnC1-정방향 프라이머와 서열번호 20의 TnC1-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-TnC2에 서열번호 21의 TnC2-정방향 프라이 머와 서열번호 22의 TnC2-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-TnC3에 서열번호 23의 TnC3-정방향 프라이머와 서열번호 24의 TnC3-역방향 프라이머, pGEM-Cap5-TnC4에 서열번호 25의 TnC4-정방향 프라이머와 서열번호 26의 TnC4-역방향 프라이머들이 각각 사용되었다. 1.0-kb의 TnC3 PCR 단편은 주형 pGEM-Cap5-TnC1에서 획득하였다. PCR 산물은 연결되어, XL-Blue 이.콜라이(Strategene, La Jolla, California)에서 증폭하여 서열 분석을 하였다.

각각의 pSp72-R2C5 돌연변이 플라스미드는 각 pGEM-Cap5 돌연변이 플라스미드의 모티프 펩타이드-인코딩 서열을 포함하는 1.0-kb의 SnaBI-XbaI 단편을 pSp72-R2C5-SnaBI의 XbaI 과 SnaBI 부위로 서브클로닝하여 제조되었다.

pSp72-scAAV2-eGFP는 pHpa-trs-SK의 2.3-kb의 PvuII-PvuII 단편을 pSp72 벡터의 BglII 와 HindIII 부위로 평활-말단 서브클로닝(blunt-end subcloning)하여 제조되었고, 따라서, EGFP 단백질을 코딩하는 전장의 scAAV2(self-complementary AAV2) 게놈을 포함한다.

pSp72-scAAV2-sc39TK는 pcDNA3.1(+)-sc39TK에서 sc39TK 유전자의 BamHI-SalI PCR 단편을, 대응하는 단편이 제거되어진 pSp72-scAAV2-eGFP의 BamHI-SalI 부위로 서브클로닝하여 제조되었다.

1-4 rAAV의 생성과 적정

scrAAV(self-complementary rAAV) 벡터 제조는[Wiksten, J. P., et al., 2003, Oncology 64: 245-250], 간략히, 293T 세포로 DNA 플라스미드 (야생형 rAAV5 와 AAV5-sLeX1, -sLeX2, - RGD1, -RGD2, -TnC1, -TnC2, -TnC3, -TnC4의 돌연변이체 바이러스 제조를 위하여, 각 pSp72-R2C5, pSp72-R2C5-sLeX1, -sLeX2, - RGD1, -RGD2, -TnC1,-TnC2, -TnC3, -TnC4 각각과 pSp72-scAA2-eGFP AAV2 게놈 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드)를 형질전환시켰다. 연속적으로 2번 CsCl 구배 초원심분리하여 rAAV 순수 개체를 준비하였다. 1 mM MgCl₂ 와 10% 솔비톨을 포함하는 50 mM Tris buffer (pH 7.8) 로 투석한 후, 정제된 rAAV를 분취하여 -80 ℃에 보관하였다. rAAV 입자 총수는 TaqMan-기반 실시간 PCR 분석(iQ^TM supermix, Bio-Rad, Hercules, CA)을 서열번호 27와 28의 프라이머와 CMV(cytomegalovirus) 프로모터를 표적화하는 서열번호 29의 TaqMan 프로브 (5'-FAM CCTGGCTGAC CGCCCAACGAC TAMRA-3': 프로브의 5' 말단은 형광물질(FAM)로 3' 말단은 퀸쳐물질(TAMRA)가 결합된 형태로 사용)를 사용하여 실시하여 계산되었다[Moon, M. S., et al., 2005, Intervirology 48: 153-160].

1-5 유세포측정법 (Flow cytometric analysis)

세포 표면 마커를 분석하기 위하여, 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 FITC (Chemicon, Temecula, CA)로 콘쥬게이트된 αVβ3와 αVβ5에 대한 일차 항체로 실온에서 30 분 배양하고, 세포를 PBS 버퍼로 3번 세척하였다. 세포 표면의 알파2,3-시알릭산(a2,3-sialic acids)을 분석하기 위하여, 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 비오틴 (Vector laboratories, Burlingame, CA)으로 콘쥬게 이트된 일차 MAL II 렉틴(lectin)으로 실온에서 30분간 염색하고, PBS로 3번 세척한 후, 2차 스트렙타비딘-FITC (Vector laboratories, Burlingame, CA)로 실온에서 30분간 배양하였다.

형질도입효율(transduction efficiency: TE)와 형광강도평균(means of fluorescence intensity: MFI)를 측정하기 위하여, GFP 유전자를 가지는 rAAV로 형질도입된 세포와 면역-복합체 세포(immune-complexed cell)를 모우고 원심분리하는 방법으로 PBS에서 세척하고 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 차가운(ice-cold) PBS로 고정하였다. 형광-양성 세포 비율과 MFI는 유세포측정법과 CellQuest Plus program (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA)을 이용하여 측정하였다. GFP 양성 세포의 백분율은 비-감염 대조구 세포의 99.9% 영역 이상인 분획으로 정의되었다.

1-6 투과전자현미경 (Transmission electron microscope)

모든 정제된 바이러스 입자는 2 mM MgCl₂ 및 2% 솔비톨(sorbitol)을 포함하는 10mM 트리스 버퍼 (pH 7.9)에서 우라닐 아세테이트로 음성으로 착색된 Formvar-carbon-코팅된 쿠퍼 그리드(copper grid)로 흡수시켜 투과전자현미경으로 분석하였다.

1-7 RGD 펩타이드 경쟁 분석 (RGD peptide competition assay)

펩타이드 배양전에 HeLa. SK-Hep1, 및 U87-MG 세포를 48-웰 플레이트에서 24시간 배양하였다. 세포들은 2% FBS와 200, 100, 50, 20, 10 uM의 활성 RGDS (active RGDS)(Sigma, Steinheim, Germany)와 비활성 RGES 펩타이드 (sham RGES) (Sigma, Steinheim, Germany)를 함유한 신선 배지들에서 30분간 실온에서 배양하였다. 그 후, rAAV5-GFP 또는 GFP 발현 카셋트(약 50% 형질도입에서의 바이러스 역가)를 가지는 돌연변이체를 세포에 4시간 동안 처리하였다. 세포에서 GFP 발현을 최대화시키기 위하여, 아데노바이러스 타입5 (세포당 PFU 2 또는 PFU 5) 를 rAAV5 벡터와 함께 추가하였다. 세포를 PBS로 3번 세척하였다. 형질도입으로부터 48시간 후에, 처리구 또는비처리구의 그룹의 각 세포는 펠렛으로 되고, 200㎕ PBS 또는 4% 파라포르알데하이드를 포함하는 PBS 200 ㎕에서 재현탁시켰다. GFP-양성 세포는 유세포측정법로 측정하였다.

1-8 항-TnC 항체 경쟁 분석

U87-MG 세포를 항체 배양전에 96-웰 플레이트에서 24hr 배양하였다. 세포를 2% FBS로 1:50, 1:20, 및 1:10 으로 희석된 1 mg/ml 항-Tenascin C IgG (R&D systems, MAB2138,Minneapolis, USA)가 포함된 신선 배지에서 30분간 실온에서 배양하였다. GFP 발현 카세트를 포함하는 AAV5-GFP 또는 rAAV5-TnC4 (약 20~50% 형질도입의 바이러스 역가)를 세포에 3시간 첨가하였다. 세포에서 GFP 발현을 최대화하기 위하여, 아데노바이러스 타입 5 (세포당 PFU 2 )를 rAAV5 벡터에 첨가하고, 감염 부피를 50 ㎕로 제한하였다. 형질도입 48h 후에 세포를 PBS로 세 번 세 척하였다. 광학 현미경 및 형광 현미경 사진 후에, 전체 세포와 GFP-형질도입 세포를 ImageJ 프로그램 (NIH : http://rsb.info.nih.gov/ij/)을 이용하여 가시적으로 계산하였다. 모든 경쟁 분석은 세 번 분석하였다.

1-9 TnC의 RT-PCR

제조사의 설명서에 기재된 바와 같은 방법으로 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 HCT-116, U251, U87-MG, 및 U118-MG에서 RNA를 분리하였다. TnC 선택적 스프라이싱 형태 (alternative splicing form)의 발현을 검출하고자, 서열번호 30의 TNfn 5 정방향 프라이머와 서열번호 31의 TNfn A1 역방향 프라이머로 RT-PCR을 하였고, TNC C-말단 형태의 발현을 검출하고자 서열번호 32의 TNfbg 정방향 프라이머와 서열번호 33의 TNfbg 역방향 프라이머를 RT-PCR에 사용하였다. 각 RT-PCR 반응에는 2㎍의 RNA가 사용되었고, 역전사 반응은 역전사효사(1U/μl; Qiagen, Crawley, West Sussex, UK)로 37 ℃에서 1시간 수행하였다.

1-10 세포독성분석

U87-MG 세포를 약 50%의 컨플루언시(confluency)로 6-웰 플레이트로 시딩하였다. 다음 날, 세포는 sc39TK를 트랜스퍼하는 야생형 rAAV5 또는 돌연변이체 rAAV5 벡터로 24시간 감염하였다. 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하였다(2 x 10³). gangciclovir (CYMEVENE, Roche, Germany) 로 5일 처리하였다. 생존 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액으로 1시간 이상 염색하고, 세포를 세척하고 세포에 흡수된 크리스탈 바이올렛을 50 % 메탄올 (200 ㎕/well) 로 가용화시키고 마이클로플레이트 스펙트로포토미터(SpectraMAX 340pc, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 580nm 흡광도로 측정하였다.

1-11 통계

모든 데이터는 스튜던트 언페어드 t 테스트(Student's unpaired t test)를 이용하여 그룹간 분석되었으며 p < 0.05일 때 유의적인 것으로 고려되었다.

실시예 2: 유전학적으로 변형된 캡시드를 가지는 rAAV5의 제조와 생성

rAAV5를 재표적화시키기 위하여, 표1에서 기재된 바와 같이 3개의 호밍 모티프에서 유래한 8개의 다른 펩타이드 서열을 이용하였다. VP1의 아미노산 444 또는 578 위치에서(도 1b. d) 이들 에피토프를 삽입한 연구는, 이전의 연구들, 즉 i) 다양한 펩타이드 모티프를 삽입한 유전적으로 변형된 rAAV2의 제조 (도. 1c) [Huttner, N. A., et al., 2003, Gene therapy 10: 2139-2147], ii) AAV5 크라이오-구조 (AAV5 cryo-structure) 분석[Walters, R. W., et al., 2004, J Virol 78: 3361-3371], 및 iii) ClusterW 프로그램 에서 수행된 AAV 혈청형의 VP1 영역의 정렬에 기반하여 수행하였다. rAAV5 캡시드의 구조 시뮬레이션에 따르면, 표적화 펩타이드를 삽입하여도 지탱될 정도로, 두 아미노산 위치가 다른 도메인에서 튀어나왔으며 유연하다는 것이 밝혀졌다 (도. 1a). 또한, 바이러스 표면에서 삽입 부위의 위치를 컴퓨터-모델링(computer-modeling)으로 예측하였다 (도 1b붉은색 444, 노란색 578).

돌연변이체의 바이러스 입자 증폭능을 분석하였으며, 그 결과, 바이러스 대부분은 생성 정도가 대부분 야생형 rAAV5만큼 효율적이었다(표 1). 바이러스 생산 역가는 1ml당 7.3X10¹⁰ 내지 2.8X10¹¹의 바이러스 게놈 복제수(virus genome copies)의 범위에 있었다. 뉴클레아제 벤조아제 (nuclease benzonase) 처리 후에도, 바이러스 입자는 형질유도능이 손상되지 않은 채로 유지되었다. 이는 바이러스 조립(assembly)이 효율적으로 일어났으며 그에 따른 바이러스 입자가 모체(parental type)와 거의 비슷한 것을 의미한다. CsCl₂ 구배에서 각 바이러스의 부유 밀도는 1.380 내지 1.385 g/ml의 좁은 범위내에 존재하였으며, 야생형 보다는(1.394 ± 0.007 g/ml) 살짝 가벼웠다. 감염성의 바이러스는 오직 이러한 주 피크에서만 검출되었다. 투사전자현미경(transmission electron microscopy) 결과는, 돌연변이체들이 구조적으로 안정성을 유지하고 있음을 암시한다(도 2). rAAV5와 sLeX2 돌연변이체의 평균 직경은 각, 22.2 ± 1.3 nm와 23.0 ± 1.5 nm로 유사하였다. 종합할 때, 짧은 펩타이드를 VP1 아미노산 위치 444 와 578 에 삽입하여 rAAV5를 유전적으로 변형하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.

<야생형과 돌연변이체 바이러스의 바이러스 입자 생산능 비교>

실시예 3 RGD-결합 모티브(RGD-binding motif)를 발현하는 rAAV5에 의한 인간 암 세포의 형질도입

인테그린(αVβ3 또는 αVβ5)에 대한 RGD rAAV5의 향성은 다양한 인간 암 세포를 rAAV5 또는 GFP 이식유전자를 인코딩하는 RGD 바이러스로 감염시키고 TE를 측정함으로써 평가하였다. RGD1 바이러스에 의한 형질도입 특징이 RGD2 보다 월등하였으므로, 나머지 연구는 RGD1으로 수행하였다. MOI=5000에서, 대부분의 Hela와 U87-MG은 형질도입되었으며 TE는 각각 67.51 ± 1.71 % 및 62.90 ± 7.01 %였다 (표 2). MDA-MB-231은 약하게 형질도입 되는 반면에, MDA-MB-435S와 SK-Hep1도 형질도입되었다. 유세포 측정 결과는, 이러한 세포들은 모두 rAAV5의 주된 숙주 수용체로 알려진 알파2,3-시알릭산에 양성을 나타내며, 따라서, 높은 형질도입을 나타내었다. 반대로, 이러한 세포들은 αVβ3 인테그린 또는 αVβ 인테그린 발현 프로파일에서 크게 차이가 났다. MDA-MB-231이 양 타입의 인테그린에 모두 음성인데 비하여, RGD 바이러스로 형질도입된 세포는 하나 또는 양 타입의 인테그린을 발현하였고, 이는 MDA-MB-231 세포가 RGD 바이러스 증식을 허용하지 않는 것을 입증하는 것이다. RGD1 바이러스의 RGD-4C 펩타이드가 인테그린과 결합할 수 있는지 여부를 확인하고자, 세포로 형질도입하기 전에 RGDS 펩타이드로 RGD1 바이러스를 배양하여 경쟁 분석을 수행하였다 (도 3). RGD1 바이러스에 의한 유전자 전달은 펩타이드 농도 의존적으로 RGDS 펩타이드에 의해 현저하게 감소하였지만, 비특이적 RGES 펩타이드(non-specific sham RGES peptide)에 대해서는 감소하지 않았다. Hela, SK-Hep1 및 U87-MG 세포의 형질도입은, RGDS 펩타이드를 처리하지 않았을 때와 비교하여, 200, 50uM에서 각각 63.28 ± 5.37 %, 85.08 ± 8.92 %, 및 52.60 ± 16.83 %로 감소하였다. 비특이적 펩타이드 RGES는 RGD1 바이러스에 의한 TE를 감소시키지 않았다. 예측한 바와 같이, 야생형 바이러스의 TE는 펩타이드에 의해 방해받지 않았다. 종합할 때, RGD1 바이러스가 인테그린-의존적 방식으로 인간 암 세포를 감염한다는 점을 증명하는 것이다.

<rAAV-RGD1 및 rAAV 바이러스의 형질도입과 인간 암세포에서의 인테그린 발현분석>

실시예 4: rAAV5-TnC 변이체에 의한 인간 암 세포의 형질 도입

테나신 C를 통한 4 종류 TnC 바이러스의 형질도입 잠재능을 조사하고자, TnC-양성 또는 TnC-음성 인간 암 세포에서 TE를 측정하였다. TnC3과 TnC4에 의해서 TnC-양성 세포는 형질도입되었다. TnC 바이러스들 중에서, TnC4 바이러스는 다른 바이러스보다 우수하게 세포를 형질도입할 수 있었다. 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, TnC-음성 HCT-116은 야생형 바이러스에 의해 효율적으로 형질도입되는 반면에, TnC 바이러스에 의해서는 형질도입되지 않았다. U87-MG 세포는 TnC4 바이러스에 의해 높은 TE를 나타내었다.

<테나신 C-양성 및 테나신 C-음성 암 세포에서 TnC4 바이러스의 형질도입>

TnC4 바이러스의 TnC 결합 펩타이드가 암 표면의 테나신 C를 재표적화할 수 있는지를 조사하고자, 항-TnC IgG를 이용하여 경쟁 분석을 수행하였다 (도 4). TnC4 바이러스에 의한 형질도입은 항체 농도에 의존하여 항체에 의하여 유의적으로 억제되었다. U87-MG 세포에서 TnC4의 TE는 항체를 처리하지 않은 경우와 비교하여 1:50, 1:20, 및 1:10 항체 희석 조건에서, 13.9 ± 10.1 %, 40.9 ± 12.0 %, 및 47.5 ± 10.5 % 감소되었다. 반면, 야생형 rAAV5 바이러스의 TE는 비특이적 1:10 항체 희석 조건에서의 비특이적 감소를 제외하고는, 항-TnC 항체의 의해 차단되지 않았다. 이는, TnC4 바이러스는 테나신 C-의존적 방식으로 인감 암세포를 효율적으로 감염한다는 점을 증명하는 것이다. 따라서, RGD 바이러스와 TnC4 바이러스에 대한 데이터와 함께, 이런 사실들은 rAAV5 VP1의 루프에 새로 삽입된 펩타이드가 돌연변이체 바이러스가 대응하는 표면 수용체를 인지할 수 있도록 인도하는 것을 의미한다.

실시예 4: 돌연체이체 rAAV5-매개된 sc39TK 발현 및 GCV 처리에 의한 세포독성

재표적화된 rAAV5 벡터의 치료 잠재성 분석을 위하여, GCV(ganciclovir)와 결합된 자살유전자(suicide gene) 전략으로 역할을 하는 HSV-TK(Herpes Simplex virus 1-thymidine kinase)-기반 방법을 사용하였다. 따라서, HSV-TK를 코딩하는 재표적화된 rAAV5 가 인간 암세포 (carcinoma cell)에서 번역가능할 것으로 보았다. GCV 처리동안에 세포 독성에 대한 반응을 측정하고자 (도 5), HSV1-TK 돌연변이 형태인 sc39TK를 RGD1 바이러스 및 야생형 rAAV5를 이용하여 U87-MG 세포로 2가지 조건, 완전 발현된 또는 약 20% 발현된,에서 운반하였다. 감염된 세포는 GCV의 다양한 농도의 CGV로 처리하였다. 5일 후에, rAAV5-매개 또는 RGD1-매개 형질도입에 의하여 sc39TK를 완전히 발현한 세포는 GCV 약물 함량 의존하여 동량의 세포독성을 보였다. HSV-TK/GCV 프로약물(prodrug)의 효과를 웰에서 약 20% 세포가 sc39TK를 발현하는 경우에서 예측한 바와 같이, 웰에서 sc39TK 세포독성 효과는 세포가 rAAV5-매개 또는 rAAV5-RGD1-매개된 형질도입에 sc39TK를 완전히 발현할 때와 비슷하였다 (도 5a). 또한, MOI 1,000 및 5,000에서 rAAV5- 및 rAAV5-RGD1-sc39TK의 세포독성을 비교하고, GCV 약물량에 따른 비슷한 정도의 세포독성을 관찰하였다. 이런 결과는 재표적화된 rAAV5 벡터가 세포가 충분한 MOI로 감염될 때, 암치료 유전자를 암 세포로 효율적으로 운반할 수 있다는 것을 의미한다.

안전성과 선택적으로 형질도입능이 우수한 본 발명의 아데노-부속 바이러스 혈청형 5-유래 표적화 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물은, 의학적 및 수의학적 분야에서, 혈액이상 질환, 중추신경계 질환, 대사이상 질환, 자가면역 질환, 감염증과 종양 등의 다양한 질환의 예방 및 치료에 폭넓게 사용될 수 있다.

도 1은 돌연변이 AAV5 캡시드 서브유닛의 구조와 바이러스 표면의 토플로지를 나타내는 것으로, (a) AAV2 REP(rep coding gene)와 VP1 CAP(VP1 capsid coding gene)를 포함하는 pSp72-R2C5 플라스미드의 개략도를 보여주고,(b) 아미노산 444번 위치에서의 rAAV5-sLeX1의 표면(붉은색)과 아미노산 578번 위치에서의 rAAV5-sLeX2 표면(노란색)을 리본으로 보여주며, (c) AAV2 (파란색)와 rAAV5-RGD1(초록색)의 백본을 비교한 것으로, 붉은색 루프 영역은 아미노산 578 부위에 삽입된 RGD-4C 펩타이드 도메인을 나타내며, 이 영역은 색을 가지는 구와 막대 형태로 확대하여 나타내었으며, (d) 60개의 캡시드 서브유닛에 의해 정20면체형으로 조립된 rAAV5-RGD1를 보여주는 삽화로, 표현된 모든 표면은 PyMOL을 사용하여 제작하였고, 붉은색 단편은 578 위치에 있는 RGD-기반 호밍 모티프를 나타낸다.

도 2는 rAAV5 바이러스와 rAAV5-sLeX2 바이러스의 투과 전자 현미경 사진으로, (a) 야생형 rAAV5 입자를 보여주고, (b) 돌연변이 rAAV5-sLeX2 입자를 보여준다. 모든 바이러스 입자는 2 mM MgCl₂과 2% 소비톨을 포함하는 10mM Tris 완충액(pH7.9)에 있었다.

도 3은 인테그린-양성 암 세포에서 rAAV5-RGD1의 형질도입의 RGDS 펩타이드-매개 억제를 보여주는 것으로, HeLa 세포, SK-Hep1 세포 및 U87-MG 세포를 각 MOI 10, 100, 및 200의 rAAV5-eGFP 또는 각 MOI 5,000, 10,000, 및 5,000의 rAAV5-RGD1로 감염시켰다. (a) 48시간 후, U87-MG의 사진이며 (b)유세포 측정법으로 GFP 양성 세포를 측정한 결과이다. (n=3, *p<0.05)

도4는 TnC-양성 U87-MG 세포에서 rAAV5-TnC4의 항-TnC IgG-매개 차단을 나타낸다. U87-MG 세포는 rAAV5-eGFP(MOI 100) 또는 rAAV5-TnC4(MOI 20,000)로 각각 감염되었다. 모든 실험을 세 번 수행하였다. 항-TnC 항체는 U87-MG 세포에서 rAAV5-TnC4의 형질도입을 특이적으로 감소시켰다 (n=3, *P<0.05).

도 5는 U87-MG 세포에서 rAAV5 돌연변이-매개 sc39TK 유전자 발현과 GCV 처리에 의한 세포독성을 나타낸다. (A)는 세포 대부분에서 sc39TK의 완전한 발현시 야생형 rAAV5-GFP (MOI 200), rAAV5-sc39TK (MOI 200), rAAV5-RGD1-sc39TK (MOI 10,000), 및 rAAV5TnC4-sc39TK (MOI 50,000) 감염 후에 GCV 세포독성을 보여준다. (B)는 세포 약 20%가 sc39TK 발현시 야생형 rAAV5-GFP (MOI 20), rAAV5-sc39TK (MOI 20), rAAV5-RGD1-sc39TK (MOI 2,000), 및 rAAV5TnC4-sc39TK (MOI 10,000) 감염 후에 GCV 세포독성을 보여준다.

<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Composition Comprising Adeno-Associated Virus Serotype 5 Vector for Targeted Gene Delivery <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sLeX1 <400> 1 Ala His Trp Ile Pro Arg Tyr Ser Ser Pro Ala Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sLeX2 <400> 2 Gly Ala His Trp Ile Pro Arg Tyr Ser Ser Pro Ala Thr Gly Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide RGD1 <400> 3 Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide RGD2 <400> 4 Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide TnC1 <400> 5 Gly Cys Asp Cys Gly Phe His Lys His Lys Ser Cys Phe Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide TnC2 <400> 6 Gly Phe His Lys His Lys Ser 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide TnC3 <400> 7 Gly Cys Asp Cys Gly Phe His Lys His Lys Ser Pro Ala Leu Ser Pro 1 5 10 15 Val Cys Phe Cys 20 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide TnC4 <400> 8 Gly Phe His Lys His Lys Ser Pro Ala Leu Ser Pro Val 1 5 10 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cap5 XbaI primer <400> 9 ggtcgactct agagaccaca agagg 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cap5 SnaBI primer <400> 10 tgagtttacg tacaactttg agg 23 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sLeX1-Forward <400> 11 tacagctccc ccgccaccac tggcggagtc cagttcaac 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sLeX1-Reverse <400> 12 tctggggatc cagtgggcgt tatttgtgct cacgaagcg 39 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sLeX2-Forward <400> 13 agctcccccg ccaccggagg cactgccccc gcgaccggca cgtacaacc 49 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sLeX2-Reverse <400> 14 gtatctgggg atccagtggg ctccggtgga gctctggttg ttggtggc 48 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD1-Forward <400> 15 cgacagtcac agccggtgga gctctggttg tt 32 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD1-Reverse <400> 16 aggcgactgt ttctgtactg cccccgcgac c 31 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD2-Forward <400> 17 tcgcctcgac agtcacagcc ggtggagctc tggttgtt 38 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD2-Reverse <400> 18 ctgtttctgt ggcctgtcaa ctgcccccgc gacc 34 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC1-Forward <400> 19 atgaaagccg caatcgcagc cggtggagct ctggtt 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC1-Reverse <400> 20 aaacataaaa gctgcttttg cactgccccc gcgacc 36 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC2-Forward <400> 21 tatgaaagcc ggtggagctc tggtt 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC2-Reverse <400> 22 aacataaaag cactgccccc gcgacc 26 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC3-Forward <400> 23 cagcgccggg cttttatgtt tatg 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC3-Reverse <400> 24 agcccggtgt gcttttgcac tgcc 24 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC4-Forward <400> 25 cttttatgtt tatgaaagcc ggtggagctc tggtt 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnC4-Reverse <400> 26 cccggcgctg agcccggtga ctgcccccgc gacc 34 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Real-Time PCR <400> 27 cgttacataa cttacggtaa atg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Real-Time PCR <400> 28 atacgtcatt attgacgtca atg 23 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan probe <400> 29 cctggctgac cgcccaacga c 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNfn 5 forward primer <400> 30 ccctgctctg gaagacacc 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNfn A1 reverse primer <400> 31 ataaggcgta gcagccttga 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNfbg forward primer <400> 32 ggtacagtgg gacagcaggt g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNfbg reverse primer <400> 33 aactggattg agtgttcgtg g 21

Claims (28)

1. 바이러스 벡터의 캡시드 단백질 내부 아미노산의 444번 또는 578번 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 5 내지 25의 아미노산 길이를 가지는 것인 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 종양 세포막에 존재하는 분자를 인지하는 것인 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 종양 세포막에 존재하는 분자가 시알릴 루이스 X, 인테그린 또는 테나신 C인 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 시알릴 루이스 X를 특이적으로 인지하는 표적화 모티프 펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
7. 제 5항에 있어서, 인테그린을 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
8. 제 5항에 있어서, 테나신 C를 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
9. (i) 바이러스 벡터의 캡시드 단백질의 내부 아미노산의 444번 또는 578번 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 외래 유전자를 코딩하는 핵산서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터.
10. 삭제
11. 제 9항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 5 내지 25의 아미노산 길이를 가지는 것인 벡터.
12. 제 9항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 종양 세포막에 존재하는 분자를 인지하는 것인 벡터.
13. 제 12항에 있어서, 종양 세포막에 존재하는 분자가 시알릴 루이스 X, 인테그린 또는 테나신 C인 벡터.
14. 제 13항에 있어서, 시알릴 루이스 X를 특이적으로 인지하는 표적화 모티프 펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 벡터.
15. 제 14항에 있어서, 인테그린을 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 벡터.
16. 제 13항에 있어서, 테나신 C를 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 벡터.
17. 제 9항에 있어서, 외래 유전자가 종양 치료 유전자인 벡터.
18. 제 17항에 있어서, 종양 치료 유전자가 종양 억제인자 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자, 항-신생 혈관 생성 유전자, 항체, 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 약제감수성 유전자, 약제 내성 유전자, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 군에서 선택되는 것인 벡터.
19. (i) 바이러스 벡터의 캡시드 단백질의 내부 아미노산의 444번 또는 578번 잔기에 표적화 모티프 펩타이드가 삽입된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 (ii) 외래 유전자를 코딩하는 핵산서열을 포함하는, 아데노-부속 바이러스 혈청형 5 유래의 표적화된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
20. 삭제
21. 제 19항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 5 내지 25의 아미노산 길이를 가지는 것인 조성물.
22. 제 19항에 있어서, 표적화 모티프 펩타이드는 종양 세포막에 존재하는 분자를 인지하는 것인 조성물.
23. 제 22항에 있어서, 종양 세포막에 존재하는 분자가 시알릴 루이스 X, 인테그린 또는 테나신 C인 조성물.
24. 제 23항에 있어서, 시알릴 루이스 X를 특이적으로 인지하는 표적화 모티프 펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
25. 제 23항에 있어서, 인테그린을 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
26. 제 23항에 있어서, 테나신 C를 특이적으로 인지하는 모티프 펩타이드가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 조성물.
27. 제 19항에 있어서, 외래 유전자가 종양 치료 유전자인 조성물.
28. 제 27항에 있어서, 종양 치료 유전자가 종양 억제인자 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자, 항-신생 혈관 생성 유전자, 항체, 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 약제감수성 유전자, 약제 내성 유전자, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.

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