KR20190080819A - 마이크로 ｒｎａ 기반 헤어핀 ｒｎａ - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이크로 RNA 기반 헤어핀 RNA에 관한 것으로, 종양 선택적인 Pol II 프로모터를 통해 발현하는 microRNA 기반의 shRNA(mshRNA)를 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 적용하여 치료 유전자의 과발현에 의한 독성 문제를 해결하고 바이러스를 이용한 유전자 치료의 효율성 증대에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 마이크로 RNA 기반 헤어핀 RNA에 관한 것이다.
복잡하고 다각적 질병인 암은 매년 약 800만 명의 사망자를 발생시킨다. 지난 수십 년 동안 암 치료법에서 주목할만한 진보가 이루어졌음에도 불구하고 화학 요법, 방사선 치료 및 수술과 같은 기존의 치료법은 암 특이적이지 않으며 정상 조직에서 원치 않은 부작용을 일으킨다. 이를 위해, 번역 또는 전사 조절을 통해 표적 세포에서 치료 유전자의 발현을 유도하는 유전자 요법은 최소한의 표적 부작용으로 인해 유망한 대안이 될 수 있다.
다양한 유전자 전달 벡터 중에서, 종양 선택적 살상 아데노바이러스(oncolytic adenovirus)는 분할 세포와 비분할 세포 둘 다로의 높은 유전자 전달 효율, 삽입 돌연변이 유발의 위험이 없고, 암세포에서의 선택적 증식 및 바이러스 복제에 의해 매개되는 효율적인 종양 용해와 같은 몇몇 이점으로 인해 암 유전자 치료에 특히 유망하다. 이러한 치료적으로 유리한 특성에도 불구하고, 임상시험에서 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 짧은 기간의 치료 유전자 발현 및 표적 조직에서 아데노바이러스의 지속성이 낮기 때문에 단일 요법으로서 제한된 효능을 나타내었고 궁극적으로 반복 투여와 높은 용량이 요구된다. 결과적으로 암 환자를 위한 개선된 치료법의 개발이 필요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 치료적 도입유전자로 "무력화 (arming)"하는 것을 포함하여 효능을 증가시키기 위한 몇 가지 접근법이 개발되고 있다. 종양 성장 억제를 향상시키기 위해 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 다양한 항암 특성들(항증식, 전-세포사멸 또는 항-혈관형성)을 갖는 강력한 치료 유전자가 삽입되었다. 이는 간세포 성장 인자 수용체(HGFR, c-Met), 인터루킨-8 및 암세포에서 과발현되는 혈관 내피 성장 인자와 같은 암유발 인자를 억제하거나 상기 언급된 특성들을 갖는 세포성 단백질을 발현함으로써 달성될 수 있다.
c-Met는 암에 대한 바이오마커이자 유망한 치료 표적이다. 정상적인 조건에서 c-Met는 증가된 세포 성장 속도, 침입, 세포사멸, 혈관형성, 기관발생 등으로 부 보호한다. 대조적으로, c-Met의 부적절한 활성화는 종양 세포의 생존, 전이 및 증식 능력을 유도할 수 있다. 폐암, 위암, 유방암 등과 같은 많은 암 유형에서 c-Met 과발현이 보고되었다. 무엇보다 폐암 환자의 약 절반이 c-Met의 높은 발현을 보였다. 이러한 이유로 c-Met 저해제는 다양한 암에서 사용되어 폐암, 난소암 등에서 유망한 결과를 보여주었다. 그럼에도 불구하고, EGFR-티로신 키나아제 억제제(TKIs)로 치료되는 상피 세포 성장 인자 수용체(EGFR)-돌연변이 비소세포성 폐암(NSCLC) 환자의 대부분은 9-14 개월 내에 내성을 보인다. c-Met 증폭은 Engelman의 보고에 의해 입증된 EGFR-TKI에 대한 내성으로 이끄는 메커니즘 중 하나이다. 이러한 이유로, c-Met의 억제는 폐암 환자에서 TKI 내성을 극복할 수 있다.
종양 세포에서 바이러스의 암 특이적 복제를 통해 이 도입유전자의 발현 수준이 증폭되어 표적화 된 항종양 효과를 유발할 수 있다는 점이 종양 선택적 살상 아데노바이러스 매개 유전자 발현의 주요 이점 중 하나이다. 그러나 short-hairpin RNA(shRNA)와 같은 치료용 유전자의 발현은 바이러스 벡터로부터 정상 세포에서의 잘못된 표적(off-target) 효과를 유도할 수 있다. 이는 유전자 발현이 바이러스 복제와는 독립적으로 발생하고, U6 또는 H1과 같은 RNA 중합 효소(Pol) 프로모터를 이용하는 대부분의 현재 shRNA 발현 시스템이 여러 가지 세포 유형에 걸쳐 지나치게 견고하고 구성적으로 활성적이기 때문이다. 또한, Pol 프로모터는 표적외 독성을 최소화하기 위해 필요한 수준의 공간적 또는 일시적 조절을 제공하지 않는다. 대조적으로, 서바이빈, 성 결정 영역 Y-박스 2(sex determining region Y-box 2, SOX2) 및 α-페토프로테인 프로모터와 같은 Pol 프로모터는 잘 특성화되어 있으며, 이들 구조물 중 일부는 임상적으로 암-특이적인 유전자 발현을 추진하기 위해 실험되었다. 이러한 발견 대신에 다양한 그룹이 Pol 프로모터로 shRNA 발현을 조절하는 발현 벡터를 만들려고 시도하였다. 보다 유망한 접근법 중 하나는 microRNA(miRNA) 기반 shRNA 발현 시스템을 사용하는 것이다. 일차 miRNA(pri-miRNA)의 구조를 모방함으로써 Pol 프로모터에 의해 구동되는 miRNA 기반 shRNA(shRNA와 유사한 pri-miRNA, mshRNA)를 설계할 수 있는 문이 열리게 되었다.
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본 발명의 목적은 암 특이적인 유전자 사일런싱을 유도할 수 있는 miRNA 기반 shRNA 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 shRNA 발현 카세트의 암 특이적인 발현을 유도하는 유전자 전달 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달 시스템을 이용하여 표적 유전자의 사일런싱을 유도하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달 시스템을 포함하는 항암제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 유전자에 특이적인 shRNA(short hairpin RNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 종결 신호 서열이 순차적으로 연결되고, 상기 shRNA는 스템 구조의 5'- 및 3'-오버행에 miRNA 골격을 포함하는 mshRNA이며, 하기의 조건을 만족하는 shRNA 발현 카세트를 제공한다:
(i) Pol II 프로모터;
(ii) 상기 프로모터와 mshRNA 구조 간의 거리는 1 내지 100 nt; 및
(iii) mshRNA의 루프 및 스템의 길이는 각각 15 내지 30 nt
본 발명은 또한 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자 전달 시스템으로 형질도입된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자 전달 시스템을 포함하는 표적 유전자 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 c-Met에 특이적인 shRNA를 발현하는 상기의 shRNA 발현 카세트를 함유하는 재조합 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor)-티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 대한 약제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 프로모터, 프로모터와 miRNA 기반 shRNA(mshRNA)의 사이(갭) 등의 shRNA 발현 카세트의 특성을 제어하여 표적 유전자의 사일런싱을 효율적으로 제어하는 효과가 있고, 상기 shRNA 발현 카세트의 발현 벡터로 재조합 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 사용하여 암 특이적인 발현을 통해 종양 유전자를 효과적으로 사일런싱함으로써 항암제 민감도를 높이고, 항암제의 상승적 치료적 효과를 높이는 효과가 있다.
도 1은 short-hairpin RNA(shRNA) 구조 및 복제-불능 아데노바이러스의 개략도를 나타낸 것으로, (a)는 본 발명에 따른 3개의 GFP 특이적인 shRNA(shGFP) 구조, 즉, 9 nt 루프(9L) shGFP, 19 nt 루프(19L) shGFP 및 19 nt GFP 특이적인 표적 서열이 9L 또는 19L로 구분된 miRNA 기반 shGFP(mshGFP의 도식적 표현이다. (b)는 본 발명에 사용된 아데노바이러스의 게놈 구조의 도식적 표현이다.
도 2는 다양한 GFP 특이적인 shRNA 구조물의 유전자 사일런싱 효율을 나타낸 것이다. (a)는 복제-불능 아데노바이러스(Ad)(dE1), dE1/U6-shGFP(9L), dE1/CMV-shGFP-SV40(9L), dE1/U6-shGFP(19L), dE1/CMV-shGFP-SV40(19L), dE1/U6-mshGFP-SV40, 또는 dE1/CMV-mshGFP-SV40으로 형질도입된 GFP-발현 HeLa(HeLa-GFP) 세포의 형질도입 후 0, 24 및 48시간에서의 GFP 형질도입 효율을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과이다. (b)는 50 MOI의 바이러스로 형질도입된 세포들에 대한 플로우 사이토메트리 분석 결과이다. 데이터는 3반복으로 수행된 3회 독립 실험의 대표값이다. 막대(bar)는 평균±표준편차(SD)를 나타낸다. **P < 0.01, ***P < 0.001 대 dE1/U6-shGFP(19L).
도 3은 아데노바이러스의 게놈 구조 및 다른 종결 신호(시미안 바이러스 40(SV40), 5A, 최소 폴리 A(mpA) 및 U3B)와 갭 길이(53nt 또는 6nt)를 갖는 mshRNA의 개략도이다.
도 4는 상이한 종결 신호 또는 갭 길이의 mshGFP 구조물의 유전자 사일런싱 효율을 나타낸 것이다. (a)는 dE1, dE1/U6-shScramble, dE1/CMV-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/CMV-6-mshGFP-mpA, 또는 dE1/CMV-6-mshGFP-5A로 형질도입된 HeLa-GFP의 형질도입 후 0, 24 및 48시간에서의 GFP 형질도입 효율을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과이다. (b)는 50 MOI의 바이러스로 형질도입된 세포들에 대한 플로우 사이토메트리 분석 결과이다. 데이터는 3반복으로 수행된 3회 독립 실험의 대표값이다. 막대(bar)는 평균±표준편차(SD)를 나타낸다. ***P < 0.001 versus dE1, ###P < 0.001 대 dE1/CMV-mshGFP-SV40.
도 5는 아데노바이러스의 게놈 구조 및 상이한 프로모터(CMV, 서바이빈 및 변형된 sex determining region Y-box 2 {SOX2(3)} 프로모터)와 갭 길이(53 또는 6nt)를 갖는 복제-불능 아데노바이러스를 발현하는 mshRNA의 개략도를 나타낸 것이다.
도 6은 상이한 Pol type 프로모터의 조절 하에서 c-Met 특이적인 mshRNA-발현 아데노바이러스로 형질도입된 다양한 암세포주 및 정상세포주에서의 총 c-Met의 발현을 나타낸 것이다. 다양한 인간 암세포주 및 정상세포주는 dE1/LacZ, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)- mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B로 형질도입되었다(U251N에 대해 200 MOI, U343, H1975, H460 및 MDA-MB-231에 대해 300 MOI, HDF에 대해 1000 MOI). 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*; 대 dE1/LacZ, #; 대 dE1/LacZ/Promoter-6-mshRNA Ad, 및 +; 대dE1/LacZ/U6-shRNA 및 ***, ###, +++P < 0.001, **, ##, ++P < 0.01, #P < 0.05).
도 7은 PC-9/GR 세포가 PC-9 세포와 비교하여 제피티닙 내성 및 c-Met의 상향 조절을 보여주는 결과이다. PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 총 c-Met의 발현은 서로 다른 Pol type 프로모터의 조절 하에서 c-Met 특이적인 mshRNA-발현 아데노바이러스로 형질도입되었다. (a)는 PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 제피티닙 처리 후 세포 생존력 분석 결과이다. 이를 위해, PC-9 및 PC-9/GR 세포를 5% 혈청 함유 RPMI-1640에서 72시간 동안 제피티닙으로 처리하였다. 세포 생존력을 MTT 분석으로 3회 측정하였다. 72시간에서의 세포 생존률은 제피티닙 농도에 대해 플롯되었다. 3회 시험을 수행하여 PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 제피티닙 IC50을 수행하였다. (b)는 PC-9 및 PC-9/GR 세포의 형질도입 후 ELISA 분석에 의한 c-Met 농도 측정 결과이다. 이를 위해, PC-9 및 PC-9/GR 세포는 dE1/LacZ, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)- mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B (600 MOI)로 형질도입되었다. 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA에 의해 측정되었다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*; 대 dE1/LacZ, #; 대 dE1/LacZ/Promoter-6-mshRNA Ad, 및 +; 대 dE1/LacZ/U6-shRNA 및 ***, ###, +++P < 0.001, ##, ++P < 0.01, #P < 0.05).
도 8은 본 발명에서 mshMet-발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 구조물 및 상기 종양 선택적 살상 아데노바이러스가 인 비트로에서 PC-9/GR의 제피티닙-민감성을 향상시킴을 보여주는 결과이다. (a)는 본 발명에서 사용된 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 게놈 구조의 도식적 표현이다. (b)는 골격 바이러스와의 암 세포 살상 및 유전자-사일런싱 효과의 비교 결과이고, (c)는 PC-9/GR 세포에서 종양 선택적 살상 Ad 및 제피티닙의 비교이다. 이를 위해, PC-9 세포에 종양 선택적 살상 Ad(H5cmT-Rd19 또는 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B) 및/또는 제피티닙을 처리하였다. 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA에 의해 측정되었다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 측정되었다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*P < 0.05, ***P < 0.001).
도 2는 다양한 GFP 특이적인 shRNA 구조물의 유전자 사일런싱 효율을 나타낸 것이다. (a)는 복제-불능 아데노바이러스(Ad)(dE1), dE1/U6-shGFP(9L), dE1/CMV-shGFP-SV40(9L), dE1/U6-shGFP(19L), dE1/CMV-shGFP-SV40(19L), dE1/U6-mshGFP-SV40, 또는 dE1/CMV-mshGFP-SV40으로 형질도입된 GFP-발현 HeLa(HeLa-GFP) 세포의 형질도입 후 0, 24 및 48시간에서의 GFP 형질도입 효율을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과이다. (b)는 50 MOI의 바이러스로 형질도입된 세포들에 대한 플로우 사이토메트리 분석 결과이다. 데이터는 3반복으로 수행된 3회 독립 실험의 대표값이다. 막대(bar)는 평균±표준편차(SD)를 나타낸다. **P < 0.01, ***P < 0.001 대 dE1/U6-shGFP(19L).
도 3은 아데노바이러스의 게놈 구조 및 다른 종결 신호(시미안 바이러스 40(SV40), 5A, 최소 폴리 A(mpA) 및 U3B)와 갭 길이(53nt 또는 6nt)를 갖는 mshRNA의 개략도이다.
도 4는 상이한 종결 신호 또는 갭 길이의 mshGFP 구조물의 유전자 사일런싱 효율을 나타낸 것이다. (a)는 dE1, dE1/U6-shScramble, dE1/CMV-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/CMV-6-mshGFP-mpA, 또는 dE1/CMV-6-mshGFP-5A로 형질도입된 HeLa-GFP의 형질도입 후 0, 24 및 48시간에서의 GFP 형질도입 효율을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과이다. (b)는 50 MOI의 바이러스로 형질도입된 세포들에 대한 플로우 사이토메트리 분석 결과이다. 데이터는 3반복으로 수행된 3회 독립 실험의 대표값이다. 막대(bar)는 평균±표준편차(SD)를 나타낸다. ***P < 0.001 versus dE1, ###P < 0.001 대 dE1/CMV-mshGFP-SV40.
도 5는 아데노바이러스의 게놈 구조 및 상이한 프로모터(CMV, 서바이빈 및 변형된 sex determining region Y-box 2 {SOX2(3)} 프로모터)와 갭 길이(53 또는 6nt)를 갖는 복제-불능 아데노바이러스를 발현하는 mshRNA의 개략도를 나타낸 것이다.
도 6은 상이한 Pol type 프로모터의 조절 하에서 c-Met 특이적인 mshRNA-발현 아데노바이러스로 형질도입된 다양한 암세포주 및 정상세포주에서의 총 c-Met의 발현을 나타낸 것이다. 다양한 인간 암세포주 및 정상세포주는 dE1/LacZ, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)- mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B로 형질도입되었다(U251N에 대해 200 MOI, U343, H1975, H460 및 MDA-MB-231에 대해 300 MOI, HDF에 대해 1000 MOI). 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*; 대 dE1/LacZ, #; 대 dE1/LacZ/Promoter-6-mshRNA Ad, 및 +; 대dE1/LacZ/U6-shRNA 및 ***, ###, +++P < 0.001, **, ##, ++P < 0.01, #P < 0.05).
도 7은 PC-9/GR 세포가 PC-9 세포와 비교하여 제피티닙 내성 및 c-Met의 상향 조절을 보여주는 결과이다. PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 총 c-Met의 발현은 서로 다른 Pol type 프로모터의 조절 하에서 c-Met 특이적인 mshRNA-발현 아데노바이러스로 형질도입되었다. (a)는 PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 제피티닙 처리 후 세포 생존력 분석 결과이다. 이를 위해, PC-9 및 PC-9/GR 세포를 5% 혈청 함유 RPMI-1640에서 72시간 동안 제피티닙으로 처리하였다. 세포 생존력을 MTT 분석으로 3회 측정하였다. 72시간에서의 세포 생존률은 제피티닙 농도에 대해 플롯되었다. 3회 시험을 수행하여 PC-9 및 PC-9/GR 세포에서 제피티닙 IC50을 수행하였다. (b)는 PC-9 및 PC-9/GR 세포의 형질도입 후 ELISA 분석에 의한 c-Met 농도 측정 결과이다. 이를 위해, PC-9 및 PC-9/GR 세포는 dE1/LacZ, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)- mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B (600 MOI)로 형질도입되었다. 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA에 의해 측정되었다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*; 대 dE1/LacZ, #; 대 dE1/LacZ/Promoter-6-mshRNA Ad, 및 +; 대 dE1/LacZ/U6-shRNA 및 ***, ###, +++P < 0.001, ##, ++P < 0.01, #P < 0.05).
도 8은 본 발명에서 mshMet-발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 구조물 및 상기 종양 선택적 살상 아데노바이러스가 인 비트로에서 PC-9/GR의 제피티닙-민감성을 향상시킴을 보여주는 결과이다. (a)는 본 발명에서 사용된 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 게놈 구조의 도식적 표현이다. (b)는 골격 바이러스와의 암 세포 살상 및 유전자-사일런싱 효과의 비교 결과이고, (c)는 PC-9/GR 세포에서 종양 선택적 살상 Ad 및 제피티닙의 비교이다. 이를 위해, PC-9 세포에 종양 선택적 살상 Ad(H5cmT-Rd19 또는 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B) 및/또는 제피티닙을 처리하였다. 배양 상등액에서 c-Met 농도는 형질도입 후 72시간에 c-Met ELISA에 의해 측정되었다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 측정되었다. 데이터는 평균±표준편차(SD)(n=3)으로 표현되고, 적어도 3회 독립 실험의 대표값이다(*P < 0.05, ***P < 0.001).
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 프로모터, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 유전자에 특이적인 shRNA(short hairpin RNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 종결 신호 서열이 순차적으로 연결되고, 상기 shRNA는 스템 구조의 5'- 및 3'-오버행에 miRNA 골격을 포함하는 mshRNA이며, 하기의 조건을 만족하는 shRNA 발현 카세트에 관한 것이다:
(i) Pol II 프로모터;
(ii) 상기 프로모터와 mshRNA 구조 간의 거리는 1 내지 100 nt; 및
(iii) mshRNA의 루프 및 스템의 길이는 각각 15 내지 30 nt
본 발명자들은 Pol 프로모터에 의한 shRNA의 암 특이적 발현을 유도하고 동시에 Pol III 프로모터에 의해 구동되는 shRNA 발현 벡터 시스템과 유사한 수준의 사일런싱을 얻도록 mshRNA를 발현하는 아데노바이러스를 개발하고 최적화하고자 하였다. 비-표적 조직에서 shRNA 과발현의 부작용을 줄이기 위해 mshRNA 발현 카세트는 암-특이적인 Pol 프로모터에 의한 표적 유전자의 사일런싱을 유도하기 위해 설계되었다. 본 발명의 shRNA 발현 카세트는 암-특이적이며, 암-특이적인 종양 선택적 살상 바이러스 벡터의 커플링에 의해, 이중 종양 표적화가 달성될 수 있다. 또한, 바이러스 복제 및 인접한 종양 세포의 2차 감염은 질병 유전자 좌위에서 표적 유전자의 장기간 사일런싱을 허용할 수 있어 이 접근법은 잘못된 표적의 사일런싱 및 비특이적인 세포 독성의 가능성을 증가시키는 벡터에 의한 siRNA 발현의 과도하게 높은 수준인 shRNA 시스템의 기존 함정을 극복할 수 있다.
본 발명의 shRNA 발현 카세트는 스템/루프 길이, 프로모터와 mshRNA 구조물 사이의 갭을 특정함으로써 Pol 프로모터에 의해 효과적으로 표적 유전자의 사일런싱이 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 miRNA 기반의 shRNA 발현 카세트는 다이서에 의한 shRNA의 프로세싱에 있어 shRNA의 인식에 중요한 루프 서열의 길이를 15 내지 30 nt, 구체적으로 16 내지 25 nt, 더 구체적으로 18 내지 25 nt, 가장 구체적으로 19 nt(19L)로 특정함으로써 종래의 9L 대비 효과적인 사일런싱이 유도될 수 있다. 상기 루프 서열이 19L로 특정된 mshRNA는 내인성 miRNA 구조를 유사하게 모방할 가능성이 있다.
또한, 뉴클레오티드 거리(프로모터 및 mshRNA 구조 사이)는 발현된 헤어핀의 5' 및 3' 오버행의 길이 및 서열 조성을 결정할 수 있다. 양 말단은 다이서에 의한 인식 및 적당한 프로세싱을 위한 기준점으로 작용하므로 갭 길이(프로모터 및 mshRNA 구조 사이)는 mshRNA의 유전자 사일런싱 효과에 중요한 인자일 수 있다.
본 발명의 miRNA 기반의 shRNA 발현 카세트는 1 내지 100 nt, 구체적으로 10 내지 90 nt, 더 구체적으로 20 내지 80 nt, 보다 더 구체적으로 40 내지 70 nt, 가장 구체적으로 53 nt의 갭 길이를 갖는 mshRNA 구조를 통해 6 nt의 갭 길이를 갖는 shRNA 대비 효과적인 표적 유전자의 사일런싱을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 miRNA 기반의 shRNA 발현 카세트의 암 특이적인 발현을 위해 표적 유전자로 c-Met를 채택하고, Pol 프로모터의 종류를 CMV, 서바이빈, SOX2(3)를 선택한 경우, U6 프로모터를 채택한 경우에 비해 암세포에서만 사일런싱이 유도됨을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 발현 카세트에 있어서, 상기 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 바람직한 프로모터로, 서바이빈 프로모터, CMV 프로모터, SOX2(3), AFP 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터, 알부민 프로모터, Fos 프로모터, RSV 프로모터, HSV 프로코터, SV40 프로모터, EF1a 프로모터, TERT 프로모터 또는 PSA 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 용어 "표적 유전자"란 억제하고자 하는 유전자를 의미하며, 표적 유전자에 특이적인 shRNA를 발현시켜 그 표적 유전자를 억제할 수 있다. 본 발명에서 표적 유전자는 shRNA를 통해 그 기능을 억제할 수 있는 모든 유전자를 포함하나, 바람직하게는 c-Met, HGFR, IL-8, VEGF 등의 암 유발 인자가 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "shRNA"란 50 내지 100 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA가 세포 내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루며, 5 내지 30 뉴클레오티드의 루프 (loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 15 내지 50 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템(stem)을 형성하며 스템 형성 가닥 각각의 이전과 이후에 1 내지 500 뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는 전체 길이의 RNA를 말한다. shRNA는 일반적으로 세포 내에서 RNA 중합효소에 의해 전사되어 합성되며 이후 shRNA는 핵내의 드로샤(Drosha)에 의해 절단되고, 이렇게 절단된 shRNA는 핵으로부터 세포질로 방출되고, 세포질 내에서 다이서(Dicer)에 의해 추가로 루프가 절단되고, siRNA처럼 표적 mRNA에 염기서열 특이적으로 결합하여 표적 mRNA를 자르고 파괴함으로써 표적 mRNA의 발현을 억제하는 작용을 한다. 본 발명의 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 miRNA 유래의 서열로부터 제조할 수 있으며, 이러한 miRNA는 종류에 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대, miR-129-5p, miR-27a-3p, miR-92b-3p, miR-200a, miR-148, miR-370, miR-409-5p, miR-127-5p, miR-496, miR-633, miR-874, miR-132-3p, miR-128, miR-136-5p, miR-138-5p, miR-145, miR-124-3p, miR-129-5p, miR-487, miR-370, miR-34a, miR-125b, miR-146a, miR-29a, miR-27a-3p, miR-24, miR-16, miR-141, miR-151, miR-181a/c, miR-191, miR-194, miR-195, miR-204, miR-205, miR-214, miR-221, miR-338, miR-30, miR-31, miR-21, miR-125, miR-155, miR-206, miR-125, miR-7, miR-10b 또는 miR-331-3P 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 miRNA의 한 종류인 miR-30 유래의 서열을 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 miR-30 유래의 리더 서열에 억제하고자 하는 표적 유전자의 센스 가닥을 연결하여 제조할 수 있다. 본 발명의 shRNA 발현 카세트 내 shRNA는 상응하는 표적 유전자의 mRNA에 작용한다. 본 발명에서 상기 표적 유전자의 mRNA에 작용하는 shRNA의 작용점 위치는 단일 부위 또는 서로 다른 부위일 수 있다.
본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 통상적으로 이들 각각의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다.
본 발명의 발현 카세트는 전사를 조절하기 위한 임의의 전사 시작 조절 서열 및 전사 종결 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 종결 신호 서열은 U3B일 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "발현 카세트"란, 프로모터와 miRNA의 리더 염기서열에 표적 유전자의 센스 가닥(sense strand)과 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하고 있고, 그 사이에 루프를 형성할 수 있는 서열을 포함하고 있어서, shRNA를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 또한, 본 발명에서 발현 카세트는 발현 구조물과 혼용될 수 있다.
본 발명의 shRNA 발현 카세트를 제작하기 위해, 일 실시예에서, miR-30 유래의 염기서열을 선택하고, 이로부터 PCR을 통해 인간 c-Met 유전자를 표적으로 하는 shRNA의 DNA 염기서열을 제조하였다. 이때, Pol II 프로모터로 SOX2(3)를 선택하고, 상기 프로모터와 mshRNA 구조 간의 거리는 53 nt, mshRNA의 루프 및 스템의 길이는 각각 19 nt 및 종결 신호는 U3B로 선택하였다. 본 발명자는 이들 각각의 상기 DNA 염기서열을 변형된 SOX2(3) 프로모터-구동의 셔틀 벡터(shuttle vector)로 클로닝한 후, 각각 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B로 명명한 상응하는 아데노바이러스를 제조하였다. 본 발명자는 상기 제조한 아데노바이러스로 암세포주(U343, U251N, H1975, H460, PC-9, PC-9/GR, MDA-MB-231) 세포를 감염시키고, c-Met 단백질의 발현 수준을 관찰하여 상기 아데노바이러스의 억제 활성을 평가하였다. 그 결과, H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B는 상응하는 단백질의 발현을 억제하였지만, 대조군인 dE1/LacZ는 억제하지 못하였고, 이를 통해 각각의 shRNA 염기서열이 표적 유전자의 억제에 적절하게 행동하였음을 확인하였다.
본 발명은 또한 상기 shRNA 발현 카세트를 포함하는 유전자 전달 시스템에 관한 것이다.
상기 shRNA 발현 카세트는 세포내로 도입될 수 있는데, 이를 위해 상기 shRNA 발현 카세트는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다.
상기 전달체로, 유전자 치료에 사용할 수 있는 것으로 알려진 어떠한 유전자 전달 시스템이라도 사용 가능하다.
예를 들어, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 (ⅰ) 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터 및 (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태일 수 있다.
통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템이 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드; 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리오바이러스, 폭스바이러스, 셈리키 포리스터 바이러스, 미즐즈 바이러스(Measles virus) 등의 바이러스 벡터; 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀이 사용될 수 있다.
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al.,Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 2 및 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 2 및 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스 (MMLV)의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy , 2:29-37(1995)에 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (세포 내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
이외에도, 바이러스 벡터로는 리오바이러스, 폭스바이러스, 셈리키 포리스터 바이러스 및 미즐즈 바이러스 (Measles virus) 등이 있다.
ⅴ. 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 리포펙타민(Lipofectamine, Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자 전달 시스템은 재조합 아데노바이러스일 수 있다.
유전자 전달 벡터로서 재조합 아데노바이러스의 여러 가지 장점들이 부각되면서 암 유전자 치료에서 그 사용빈도는 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 특히, 유전자 치료제로 암을 치료하고자 할 경우, 장기적이고 지속적인 치료 유전자의 발현이 필요하지 않은 장점이 있다. 또한, 벡터로 사용되는 바이러스에 의해 유도되는 숙주의 면역반응이 크게 문제되지 않거나 오히려 이점으로 작용할 수 있기 때문에 재조합 아데노바이러스는 암 치료용 유전자 전달체로 각광을 받고 있다.
상기 재조합 아데노바이러스는 복제불능 아데노바이러스 또는 종양 살상 아데노바이러스일 수 있다.
복제불능 아데노바이러스는 아데노바이러스의 복제에 필수적인 E1 유전자(전부 또는 일부) 대신에 치료용 유전자를 삽입하여 재조합된 것으로, 아데노바이러스가 도입된 세포 내에서 복제되지 못하도록 만든 것이다.
종양 살상 아데노바이러스는 E1B 55kDa 유전자가 부분적으로 결손된 아데노바이러스로 p53이 기능적으로 비활성화된 세포에서만 증식이 가능하다. p53의 기능이 억제되어 있는 암세포에서는 바이러스의 증식이 활발하게 일어나게 되는 반면 정상세포에서는 바이러스의 증식이 억제된다. 따라서, 종양 살상 아데노바이러스는 정상세포에는 영향을 주지 않고, 암세포만 선택적으로 사멸시킬 수 있어 암 치료에 있어 특히 유리하다.
본 발명의 일 구체예에서, 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19kDa 유전자, E1B 55kDa 유전자 또는 E1B 19kDa/E1B 55kDa 유전자를 가지며, 바람직하게는 비활성화된 E1B 19kDa 및 E1B 55kDa 유전자를 갖는다.
본 명세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 "비활성화"는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 비활성화 E1B 19kDa 유전자는 그 유전자에 변이 (치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19kDa 유전자가 결여되는 경우에는 세포고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55kDa 유전자가 결여된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다 (참조: 대한민국 특허출원 제 2002-0023760 호).
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함할 수 있다. E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 된다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19kDa/E1B 55kDa 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 유전자전달시스템은 E1 부위가 결실된 복제-불능(replication-incompetent) 종양 선택적 살상 아데노바이러스일 수 있다.
또한, 상기 벡터는 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 용어 "선별마커(selection marker)"란 shRNA 발현 카세트가 도입되어 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위한 것이다. 본 발명의 벡터에서 사용할 수 있는 선별마커로는 벡터의 도입 여부를 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자라면, 특별히 한정되지 않으나, 대표적으로 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질), 퓨로마이신(puromycin), 네오마이신(Neomycin: Neo), 하이그로마이신(hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 또는 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자 전달 시스템으로 형질도입된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 바람직하게 형질도입은 PEG, 키토산, PEG-키토산, DEAE-덱스트란, 핵 단백질, 지질 또는 펩타이드와의 복합체로 이루어진 전달체를 통해 이루어질 수 있다.
상기 유전자 전달 시스템을 세포 내로 도입시켜서 형질도입된 세포는 치료적 관점에서는, 억제시키고자 하는 유전자를 선택적으로 억제시키는 shRNA 발현 카세트를 도입시켜서 개인별 맞춤 치료 요법으로 사용할 수 있게 된다.
또한, 세포 유형-특이적인 프로모터를 선택할 경우 하나 또는 다양한 표적 유전자의 세포 유형-특이적인 억제 효과 분석을 용이하게 하여, 상기 형질도입된 세포를 세포-유형 특이적인 억제 효과 분석 모델로 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자 전달 시스템을 포함하는 표적 유전자 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 표적 유전자 억제용 조성물, 즉 shRNA 유전자 전달 시스템은 상기 유전자 전달 시스템을 발현하는 세포일 수 있다. 상기 세포는 상기 표적 유전자 억제용 shRNA 유전자 전달 시스템을 일시적 (transient) 또는 안정적으로 (stable) 발현하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 c-Met에 특이적인 shRNA를 발현하는 상기의 shRNA 발현 카세트를 함유하는 재조합 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor)-티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 대한 약제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 c-Met 과발현 시 TKIs에 대한 약물 내성이 발생한다. c-Met에 특이적인 shRNA를 발현하는 본 발명의 shRNA 발현 카세트를 포함하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 TKI-내성 폐암 세포에 도입한 경우, 상기 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 TKI-내성 폐암세포를 TKI에 대해 화학적으로 민감하게 하고, 상기 종양 선택적 살상 아데노바이러스와 함께 TKI를 병용투여한 경우 암세포에 대해 상승적 살상 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 의약 조성물은 암세포에 대한 상승적 살상 효과를 위해 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 라파티닙 및 제피티닙으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> miRNA 기반 shRNA(mshRNA) 발현 카세트 및 상기 mshRNA를발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 제조
(세포주 및 세포배양)
모든 성장 배지에 10% 우태아혈청(FBS; Gibco BRL, Grand Island, NY), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(최종 농도: 100 U/mL) 및 젠타마이신(50 mg/mL)(Gibco BRL)을 보충하였다. Ad type 5 E1 gene (HEK293)로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주, 섬유아세포주(HDF), 자궁경부암종 세포주(MDA-MB-231), 뇌암세포주(U343 및 U251N), 유방암세포주(MDA-MB-231), 비소세포성 폐암세포주(A549, H460 및 H1975)는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Gibco BRL)에서 유지하였다. 인간 비소세포성 폐암세포주(PC-9) 및 제피티닙-내성 PC-9(PC-9/GR)는 RPMI-1640(Gibco BRL)에서 배양하였다. 모든 세포주는 37℃에서 5% CO2, 가습 하에서 유지하였다. 세포주(HEK293, HDF, Hela, U343, U251N, MDA-MB-231, A549, H460, 및 H1975)는 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA)에서 구입하였다. PC-9 및 PC-9/GR는 항암T2B 기반구축센터(CACT; Asan Medical Center, Seoul, Korea)로부터 친절하게 제공받았다.
(GFP-특이적인 shRNA-발현 아데노바이러스의 생성)
녹색형광단백질(GFP)을 표적으로 하는 shRNA를 발현하는 아데노바이러스를 생성하기 위해, 인간 GFP의 486-504 위치를 표적으로 하는 shRNA의 발현을 위한 DNA 단편은 센스 올리고뉴클레오티드 5'-gatcccCAAGGTGAACTTCAAGATT(ttcaagaga 또는 ctgtgaagccacagatggg) GATCTTGAAGTTCACCTTGtttttggaaa-3' 및 이의 동족관계의 안티센스 올리고뉴클레오티드 5'-agcttttccaaaaaCAAGGTGAACTTCAAGATC(tctcttgaa 또는 cccatctgtggcttcacag) AATCTTGAAGTTCACCTTGgg-3'를 어닐링하여 생성하였다. 19 뉴클레오티드(nt) GFP 표적 서열은 대문자로 표시하고, 9 또는 19 nt 루프(각각 (9L 또는 19L) 및 직접 클로닝에 필수적인 서열들은 소문자로 표시하였다. 또한, mshGFP를 발현하는 아데노바이러스를 생성하기 위해, pPUR/U6-mshGFP(일본 쓰쿠바 연구학원도시의 산업기술종합연구소의 Dr. Yoshio Kato로부터 친절하게 제공받음)의 mshGFP 영역을 PCR로 증폭하였다. 각각 어닐링된 단편 및 PCR 산물을 E3 셔틀 벡터, pSP72dE3/U6(Pol 프로모터) 또는 pSP72dE3/CMV-시미안 바이러스 40(SV40)(Pol II 프로모터)로 삽입하였다. shRNA 발현 시스템의 다양한 구조물은 9L 또는 19L 중 어느 하나로 분리된 19nt GFP-특이적인 표적화 서열을 함유하고, 종결 신호로서 5 티미딘(T5) 또는 SV40 폴리아데닐화 부위 중 어느 하나를 함유한다.
mshRNA를 발현하는 아데노바이러스의 다양한 종결 신호 및 갭(프로모터-mshRNA) 구조물을 생성하기 위해, 센스 및 이의 동족관계의 안티센스 올리고뉴클레오티드(U3B 및 최소 폴리 A(mpA))를 어닐링하여 종결 신호의 중요도를 확인하기 위한 DNA 단편을 생성하였다. 각 어닐링된 단편 및 PCR 산물(pCA14의 CMV 영역 및 PCR에 의해 증폭된 pPUR/U6-mshGFP의 5A 서열을 갖는 mshGFP 영역)을 E3 셔틀 벡터, pSP72dE3/CMV-mshGFP-SV40에 삽입하였다.
새롭게 구축된 아데노바이러스 E3 셔틀 벡터를 XmnI을 사용하여 선형화하고, 상동 재조합을 위해 복제-불능 아데노바이러스(dE1)과 함께 대장균 BJ5183에 형질전환시켜 각각 dE1/U6-shGFP (9L), dE1/CMV-shGFP-SV40 (9L), dE1/U6-shGFP (19L), dE1/CMV-shGFP-SV40 (19L), dE1/U6-mshGFP 및 dE1/CMV-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/CMV-6-mshGFP-mpA, 또는 dE1/CMV-6-mshGFP-5A Ad 벡터를 생성하였다.
모든 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 증식되었고, CsCl 구배 원심분리에 의해 정제되었다. 바이러스 입자의 수는 260nm에서 흡광도(OD260)를 측정하였다. 흡광도 값 1은 1.1×1012 바이러스 입자(VP)/mL와 같다. 정제된 바이러스는 -80℃에서 보관하였다.
(shRNA-매개된 GFP의 사일런싱의 평가)
GFP-발현 HeLa(HeLa-GFP) 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩한 후 1일 후에 20 또는 50의 MOI에서 dE1/U6-shGFP (9L), dE1/CMV-shGFP (9L), dE1/U6-shGFP (19L), dE1/CMV-shGFP (19L), dE1/U6-mshGFP, 또는 dE1/CMV-mshGFP를 형질도입시켰다. 형질도입 후 0, 24 및 48 시간에, HeLa-GFP 세포의 GFP 발현 수준을 형광현미경(Olympus IX81; Olympus Optical, Tokyo, Japan)으로 평가하였다. 이미징 후, 세포로부터의 GFP 발현을 플로우 사이토메트리(BD Bioscience, San Jose, CA)로 측정하고, CellQuest software (Beckton-Dickinson, Mountainview, CA)로 분석하였다.
(다양한 프로모터에 의해 조절된 c-Met-특이적인 shRNA-발현 아데노바이러스의 생성)
c-Met-발현 아데노바이러스를 표적으로 하는 shRNA를 생성하기 위해, pDRIVE-hSurvivin (Invivogen, SD, CA)의 서바이빈 프로모터 영역 또는 pEZX/SOX2-mCherry (Genecopoeia, SD, CA)의 SOX2 프로모터 451-1308{SOX2(3)} 영역은 53nt 또는 6nt 갭 서열을 갖도록 PCR에 의해 증폭된다. 각 PCR 산물은 E3 셔틀 벡터, pSP72dE3/CMV-mshGFP-U3B에 삽입되었다.
새롭게 구축된 Ad E3 셔틀 벡터는 SmnI을 사용하여 선형화되고, 복제-불능 아데노바이러스 벡터(dE1/LacZ) 또는 복제-능력 아데노바이러스 벡터(H5cmT-Rd19)와 함께 상동 재조합을 위해 대장균 BJ5183에 형질전환되어 각각 dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B, H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshGFP-U3B Ad 벡터를 생성하였다.
종양 선택적 살상 아데노바이러스, H5cmT-Rd19 및 H5cmT-Rd19/SOX2(3)- mshMet-U3B를 본 실험에 사용하였다. H5cmT-Rd19 및 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B의 복제는 변형된 TERT 프로모터에 의해 조절된다. c-Met-특이적인 shRNA-발현 아데노바이러스의 생성 및 정제는 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.
(c-Met 발현의 정량)
U343, U251N, H1975, H460, PC-9, PC-9/GR, MDA-MB-231 및 HDF 세포를 6-웰 플레이트에 5Х104 cells/well 또는 1Х105 cells/well로 플레이팅하고 나서, 무혈청 배지 SFM)(DMEM 또는 RPMI-1640)에서 상이한 MOI에서 dE1/LacZ, dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B, 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B로 48시간 동안 형질도입하였다. 신선한 배지로 교체해주고, 24시간 동안 추가로 성장시켰다. 아데노바이러스로 형질도입된 세포의 상등액을 수확하고, 총 세포 단백질을 추출하고 ELISA 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 인간 c-Met의 수준은 ELISA 키트(c-Met: R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 평가하였다.
(MTT 분석)
PC-9 또는 PC-9/GR 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 제피티닙 0.01 - 100 μM로 처리하거나, 1-10 MOI에서 H5cmT-Rd19 또는 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet-U3B 중 어느 하나로 감염시켰다. 감염 후 72시간에, 인산염-완충된 염수 PBS; 2 mg/mL) 에 녹인 150 ㎕의 3-(4,5-dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 상등액을 버리고, 포마잔을 150 ㎕의 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma Chemical)에 용해시켰다. 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
(통계분석)
모든 통계 분석은 SPSS 13.0 software(Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 표준편차(SD)로 표현한다. 0.05 미만인 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(*, #, +P < 0.05; **, ##, ++P < 0.01; ***, ###, +++P < 0.001).
<실시예 1> 상이한 shGFFP 구조물을 발현하는 복제-불능 아데노바이러스의 구축
Pol 프로모터에 의해 조절되는 shRNA 발현 카세트가 표적 유전자의 사일런싱을 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 인간 U6 또는 CMV 프로모터 중 어느 하나의 조절 하에서 shGFP-발현 복제-불능 아데노바이러스의 6개 구조물을 생성하였다. mshRNA는 자연적으로 발생하는 miR-30 유래의 miRNA 전사체 내에 끼워진 shRNA를 전달한다. miRNA30는 더 큰 전구체 miRNA(pre-miRNA) 전사체를 이의 기능성 miRNA로 프로세싱하는 것이 잘 특성화되어 있기 때문에 선택하였다. 9L 또는 19L(도 1a) 중 어느 하나로 분리된 19nt GFP-특이적인 표적화 서열을 함유하고 종결 신호로 T5 또는 SV40 폴리아데닐화 부위를 함유하는 다양한 발현 구조물들을 dE1에 클로닝하여 dE1/U6-shGFP (9L), dE1/CMV-shGFP-SV40 (9L), dE1/U6-shGFP (19L), dE1/CMV-shGFP-SV40 (19L), dE1-K35/U6-mshGFP 또는 dE1/CMV-mshGFP-SV40를 생성하였다(도 1b).
<실시예 2> 인 비트로에서 shRNA에 의한 GFP 넉다운에서의 shRNA 구조물의 비교
상이한 shRNA 구조물-발현 아데노바이러스에 의해 매개되는 GFP 사일런싱 효과를 비교하기 위해, HeLa-GFP에 음성 대조군으로 SFM 처리와 함께 20 및 50 MOI에서 dE1, dE1/U6-shGFP(9L), dE1/CMV-shGFP-SV40(9L), dE1/U6-shGFP(19L), dE1/CMV-shGFP-SV40(19L), dE1/U6-mshGFP, 또는 dE1/CMV-mshGFP-SV40로 형질도입시켰다.
도 2a에 도시된 바와 같이, GFP 발현 수준은 미처리 세포 및 다른 모든 아데노바이러스로 형질도입된 것들과 비교하여 dE1/U6-shGFP(19L), dE1/U6-mshGFP, 및 dE1/CMV-mshGFP-SV40로 형질도입 후 시간-의존적 방식으로 감쇄되었다. 플로우 사이토메트리 분석에 의해 유사한 경향이 관찰되었다(도 2b). dE1/U6-shGFP(19L)로 형질도입된 세포의 GFP 발현 수준은 dE1/U6-shGFP(9L)로 형질도입된 것들보다 유의적으로 낮아(***P < 0.001), 19L shRNA 구조가 shRNA-매개된 유전자 사일런싱에서 9L보다 유효함을 시사한다. 이들 발견을 기반으로 하여, 이후 모든 shRNA 발현 구조는 19L로 제조하였다. 추가로, dE1/CMV-shGFP-SV40(9L)- 및 dE1/CMV-shGFP-SV40(19L)-형질도입된 세포의 GFP 발현은 감소하지 않았고, 이는 CMV 프로모터와 같은 Pol 프로모터가 효과적으로 shRNA를 발현하지 못함을 입증하는 이전의 보고들과 일치한다. 대조적으로, GFP의 발현 수준은 dE1/U6-shGFP(19L)에 의해 형질도입된 것들과 비교하여 mshGFP 발현 아데노바이러스(dE1/U6-mshGFP 또는 dE1/CMV-mshGFP-SV40)로 형질도입된 세포에서 유의적으로 더 낮아, 이는 mshRNA 발현 벡터 시스템이 Pol 및 Pol III 프로모터-구동된 shRNA 발현에 의한 유전자 사일런싱을 향상시킬 수 있음을 시사한다(*** P < 0.001). 더불어, 이들 결과는 mshRNA 구조물을 통한 아데노바이러스에서 Pol 및 Pol III 프로모터-구동된 shRNA 발현이 기존의 U6 프로모터-구동된 shRNA 구조물보다 표적 유전자의 효과적인 사일런싱을 유도할 수 있음을 보여준다.
<실시예 3> 상이한 종결 또는 갭 길이를 갖는 mshRNA 카세트를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스에 의한 GFP 사일런싱의 비교
mshRNA 구조물의 종결 신호가 표적 유전자의 사일런싱에 영향을 주는지를 조사하기 위해, 클로닝을 통해 상이한 종결 및 갭 길이(프로모터 및 mshRNA 사이)를 갖는 mshGFP-발현 복제-불능 아데노바이러스 4개 추가적인 구조물을 구축하여 최종적으로, dE1/CMV-6-mshGFP-SV40, dE1/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/CMV-6-mshGFP-mpA, 및 dE1/CMV-6-mshGFP-5A를 생성하였다(도 3).
이들 바이러스의 유전자 사일런싱을 확인하기 위해, HeLa-GFP 세포에 음성 대조군으로 SFM 처리 및 dE1와, 양성 대조군으로 dE1/CMV-mshGFP-SV40와 함께 20 또는 50 MOI에서 이들 바이러스 각각을 형질도입시켰다.
도 4a에 도시된 바와 같이, GFP 발현 수준은 미처리 세포 및 모든 다른 아데노바이러스로 형질도입된 것들과 비교하여 dE1/CMV-mshGFP-SV40 또는 dE1/CMV-mshGFP-U3B로 형질도입된 후 시간-의존적 방식으로 감쇄되었다. 플로우 사이토메트리에 의해 유사한 경향이 관찰되었다(도 4b). dE1/CMV-mshGFP-SV40이 형질도입된 세포의 GFP 발현 수준은 dE1/CMV-6-mshGFP-SV40로 형질도입된 것들보다 유의적으로 낮아(###P < 0.001), 이는 갭 길이가 유전자 사일런싱 효과에서 중요한 인자임을 시사한다. 이들 발견을 기반으로 하여, 이후 모든 mshRNA 구조물은 프로모터와 shRNA 사이에 53nt 갭을 갖도록 하였다. 추가로, GFP의 발현 수준은 임의의 다른 종결 신호를 갖는 mshRNA를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스에 의해 형질도입된 것들과 비교하여 dE1/CMV-6-mshGFP-U3B로 형질도입된 세포에서 유의적으로 더 낮아, 이는 U3B 종결 신호가 mshRNA 구조물의 발현에 최적일 수 있음을 시사한다(###P < 0.001). 더불어, 이들 결과는 53 nt 갭 길이 또는 U3B 종결 서열이 아데노바이러스 벡터 시스템에서 mshRNA의 발현에 최적임을 보여준다.
<실시예 4> 암-특이적인 Pol 프로모터를 갖는 mshMet를 발현하는 아데노바이러스에 의한 c-Met 발현의 억제
상이한 Pol II 프로모터의 조절 하에서 상기 몇 개의 상이한 c-Met를 표적으로 하는 mshRNA를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스를 특정 기준을 사용하여 생성하였다. 이들 mshRNA 카세트를 LacZ-발현 dE1(dE1/LacZ)에 클로닝하여 총 6개의 상이한 아데노바이러스를 생성하여, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B 및 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B를 생성하였다(도 5). 가장 암-특이적인 mshRNA 발현 카세트를 결정하기 위해, 다양한 암세포주(U343, U251N, H1975, H460, MDA-MB-231 및 HDF)에 음성 대조군으로 SFM 처리 및 dE1/LacZ, 양성 대조군으로 dE1/LacZ/U6-shMet과 함께 이전에 제조된 바이러스 각각을 (세포주에 따라 다양한 MOI 사용) 형질도입시켰다. 형질도입 후 72시간에, 배양 상등액을 수확하여 이들 세포에서 ELISA에 의해 c-Met 발현 수준을 검출하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, c-Met 발현은 다양한 암세포주에서 dE1/LacZ/U6-shMet, dE1/LacZ/CMV-mshMet-U3B, 및 dE1/LacZ/SOX2(3)-mshMet-U3B의 처리에 의해 극적으로 감소되었다. 대부분의 암세포주에서, CMV, 서바이빈 또는 SOX2(3) 프로모터의 조절 하에서 53 nt 갭 길이를 갖는 mshRNA-발현 아데노바이러스의 처리는 dE1/LacZ(*) 또는 6 nt 갭 길이를 갖는 동족관계의 대조군 mshRNA-발현 아데노바이러스로 형질도입된 것들보다 유의적으로 낮은 c-Met 발현 수준을 유도하였다. 이들 결과는 프로모터 및 mshRNA 사이의 갭 길이가 Pol 프로모터에 의한 mshRNA-매개된 유전자 사일런싱의 주요 조절자임을 보여준다. 추가로, c-Met의 발현 수준은 H1975 세포에서 dE1/LacZ/U6-shMet에 의해 형질도입된 것들과 비교하여 dE1/LacZ/SOX2(3)-mshMet-U3B로 형질도입된 세포에서 유의적으로 더 낮았다(+++P < 0.001). 중요하게는, c-Met 발현은 암-특이적인 Pol II 프로모터(서바이빈 및 SOX2(3))의 조절 하에서 mshRNA를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스에 의해 유의적으로 영향을 받지 않은 반면, dE1/LacZ/U6-shMet에 의해 형질도입된 세포들은 미처리 세포에 대해 유의적으로 억제된 c-Met 발현 수준을 보였다(++P < 0.01). 유사한 결과가 다른 암세포주에서 관찰되었다.
종합적으로, 이들 발견은 아데노바이러스에 의한 최적 암-특이적인 mshRNA 발현은 U3B 종결 신호, 프로모터 및 mshRNA 사이의 53 nt 갭 및 SOX2(3) 프로모터를 필요로 함을 나타낸다.
<실시예 5> 제피티닙-내성 세포주에서 mshMet의 평가
mshRNA 구조물에 의한 c-Met 사일런싱이 제피티닙-내성 폐암 세포를 민감하게 할 수 있는지를 평가하기 위해, 제피티닙에 대한 일차 모 폐암 세포(PC-9) 및 제피티닙-내성 폐암 세포 민감도를 분석하여 병용요법을 위한 최적 제피티닙 투여량 범위를 결정하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, PC-9/GR 세포는 PC-9 모세포보다 제피티닙에 대해 내성을 나타냈다. PC9/GR 세포에서 제피티닙에 대한 IC50는 약 2.33 μM으로, PC-9 세포(0.015 μM)에 비해 155배 높다.
추가로, PC-9/GR 세포의 c-Met 과발현을 PC-9 세포와 비교하였다. 이들 세포주는 음성 및 양성 대조군으로 SFM 처리 및 dE1/LacZ/U6-shMet과 함께, 600 MOI에서 dE1/LacZ, dE1/LacZ/CMV-mshScramble-U3B, dE1/LacZ/CMV-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/SOX2(3)-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/CMV-6-mshGFP-U3B, dE1/LacZ/Survivin-6-mshGFP-U3B 또는 dE1/LacZ/SOX2(3)-6-mshGFP-U3B로 형질도입되었다.
도 7b에 도시된 바와 같이, 모든 아데노바이러스는 도 6으로부터 다른 암세포에서 관찰된 바와 같이 유사한 사일런싱 패턴을 나타내어, 이는 제피티닙-내성이 폐암 세포에서 c-Met의 mshRNA-매개된 사일런싱에 영향을 주지 않음을 시사한다.
<실시예 6> mshMet-발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 PC-9/GR 세포에서 제피티닙 민감도의 향상 효과
mshRNA-발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 c-Met 사일런싱이 제피티닙-내성 세포를 민감하게 하는지를 평가하기 위해, 우선 SOX2(3) 프로모터 조절 하에서 mshMet를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 생성하였다(도 8a).
도 8b에 도시된 바와 같이, mshMet-발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스(H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet4-U3B) 및 이의 동족관계 대조군 종양 선택적 살상 아데노바이러스(H5cmT-Rd19)에 감염된 PC-9/GR 세포는 용량-의존적으로 암세포 살상 효과를 보여주었다. H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet4-U3B는 훨씬 강력한 암세포 살상 효과를 나타냈고 모든 투여량에서 H5cmT-Rd19보다 효과적인 c-Met 사일런싱을 보여주어, 이는 c-Met의 mshRNA-매개된 사일런싱이 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다(***P < 0.001).
다음으로, H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet4-U3B에 의한 c-Met의 효과적인 사일런싱이 제피티닙에 대한 내성 세포를 민감하게 하고, 상승적인 세포 살상 효과를 초래하는 지를 평가하였다.
도 8c에 도시된 바와 같이, PC-9/GR에서 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet4-U3B 및 제피티닙의 조합은 낮은 투여량에서 단독 투여된 처리보다 유의적으로 향상된 세포 살상 효과를 유도하였다(*P < 0.05, ***P < 0.001). 더불어, 이들 결과는 H5cmT-Rd19/SOX2(3)-mshMet4-U3B이 c-Met의 효과적인 사일런싱에 의해 제피티닙-내성 폐암 세포를 민감하게 할 수 있음을 보여준다.
Claims (14)
- 프로모터, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 유전자에 특이적인 shRNA(short hairpin RNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 종결 신호 서열이 순차적으로 연결되고, 상기 shRNA는 스템 구조의 5'- 및 3'-오버행에 miRNA 골격을 포함하는 mshRNA이며, 하기의 조건을 만족하는 shRNA 발현 카세트:
(i) Pol II 프로모터;
(ii) 상기 프로모터와 mshRNA 구조 간의 거리는 1 내지 100 nt; 및
(iii) mshRNA의 루프 및 스템의 길이는 각각 15 내지 30 nt - 제1항에 있어서,
상기 프로모터와 mshRNA 구조 간의 거리는 40 내지 70 nt인, shRNA 발현 카세트. - 제1항에 있어서,
mshRNA의 루프 및 스템의 길이는 각각 18 내지 25 nt인, shRNA 발현 카세트. - 제1항에 있어서,
miRNA는 miR-129-5p, miR-27a-3p, miR-92b-3p, miR-200a, miR-148, miR-370, miR-409-5p, miR-127-5p, miR-496, miR-633, miR-874, miR-132-3p, miR-128, miR-136-5p, miR-138-5p, miR-145, miR-124-3p, miR-129-5p, miR-487, miR-370, miR-34a, miR-125b, miR-146a, miR-29a, miR-27a-3p, miR-24, miR-16, miR-141, miR-151, miR-181a/c, miR-191, miR-194, miR-195, miR-204, miR-205, miR-214, miR-221, miR-338, miR-30, miR-31, miR-21, miR-125, miR-155, miR-206, miR-125, miR-7, miR-10b 및 miR-331-3P로 이루어진 군에서 선택된 것인, shRNA 발현 카세트. - 제1항에 있어서,
Pol II 프로모터는 서바이빈 프로모터, CMV 프로모터, SOX2(3) 프로모터, AFP 프로모터, CEA 프로모터, 알부민 프로모터, E2F 프로모터, Fos 프로모터, RSV 프로모터, HSV 프로코터, SV40 프로모터, EF1a 프로모터, TERT 프로모터 및 PSA 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것인, shRNA 발현 카세트. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 shRNA 발현 카세트를 포함하는 유전자 전달 시스템.
- 제6항에 있어서,
유전자 전달 시스템은 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터 및 (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태인, 유전자 전달 시스템. - 제7항에 있어서,
바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 리오바이러스, 폭스바이러스, 셈리키 포리스터 바이러스 및 미즐즈 바이러스 (Measles virus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 유전자 전달 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 유전자 전달 시스템은 재조합 아데노바이러스인, 유전자 전달 시스템. - 제9항에 있어서,
상기 재조합 아데노바이러스는 복제불능 아데노바이러스 또는 종양 살상 아데노바이러스인, 유전자 전달 시스템. - 제6항의 유전자 전달 시스템으로 형질도입된 숙주 세포.
- 제6항의 유전자 전달 시스템을 포함하는 표적 유전자 억제용 조성물.
- c-Met에 특이적인 shRNA를 발현하는 제1항의 shRNA 발현 카세트를 함유하는 재조합 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor)-티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 대한 약제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물.
- 제13항에 있어서,
의약 조성물은 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 라파티닙 및 제피티닙으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 더 포함하는, EGFR-티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 대한 약제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물.
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Legal Events
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
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| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X601 | Decision of rejection after re-examination |