KR20150009537A - 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 방광암의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 핵산 분자를 방광 세포에 전달함에 관한 방법 및 용도를 제공한다. 상기 방광 세포를, 트랜스유전자를 또한 포함할 수도 있는 바큘로바이러스 벡터와 접촉시킨다.

Description

바큘로바이러스 벡터를 사용하는 방광암의 치료 방법{METHODS FOR BLADDER CANCER THERAPY USING BACULOVIRAL VECTORS}

본 발명은 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 방광암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2012년 4월 10일자로 출원된 미국 가출원 제 61/622,376 호의 이점과 상기 출원으로부터의 우선권을 청구하며, 상기 출원의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.

방광암은 요로에서 가장 흔한 형태의 악성종양이다. 미국에서, 2011년에 69,000 건의 새로운 사례와 15,000 건에 가까운 사망이 예기되었다(문헌[Siegel R et al., 2011]). 싱가포르에서, 방광암은 남성에서 9 번째로 흔한 암이다.

거의 모든 방광암은 이행상피로부터 발생하며 따라서 이행세포암종(TCC)으로서 공지되어 있다. 상기 방광의 TCC의 대부분은 초기 진단시 표재성이고, 비-근육-침습성이다. 그러나, 경요도절제술 후 표재성 TCC의 재발률은 70% 정도로 높을 수 있으며, 이는 재발 및 진행을 억제하기 위한 보조 요법을 필요로 한다.

보조 요법은 종종 암 재발 위험성이 중간이거나 높은 환자에 대해서 바실러스-칼메트-게랑(BCG)을 사용하는 방광내 면역요법의 형태로 제공된다. BCG는 감독된 생 소 결핵균으로부터 생산되며 CD4+ Th1 사이토킨, 예를 들어 인터류킨-2(IL-2), IL-12, IL-18 및 인터페론-감마(IFN-γ)에 의해 매개되는 선천적인 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 그러나, 환자의 40% 이하는 BCG 저항성, 내성, 재발성 또는 불내성으로 인해 첫해 안에 BCG 면역요법이 실패할 것이다(문헌[Zlotta AR et al., 2009]; 문헌[Chiong & Esuvaranathan, 2010]). 따라서, 표재성 방광암이 있는 환자에 대해 치료 성과를 개선시키기 위해서 신규의 보조 요법을 개발할 필요가 있다.

방광암에 가능한 보조 치료로서 연구된 바이러스 벡터-기재 유전자 요법은 우두 바이러스(문헌[Lee SS et al., 1994]; 문헌[Gomella LG et al., 2001]; 문헌[Siemens DR et al., 2003]; 문헌[Fodor I, et al., 2005]), 아데노바이러스(문헌[Morris BD et al., 1994]; 문헌[Sutton MA et al., 2007]; 문헌[Kuball J et al., 2002]; 문헌[Siemens DR et al., 2003]; 문헌[Pagliaro LC et al., 2003]; 문헌[Malmstrom PU et al., 2010]), 카나리폭스 바이러스(문헌[Siemens DR et al., 2003]), 레오바이러스(문헌[Hanel EG et al., 2004]), 레트로바이러스(문헌[Shiau AL et al, 2001]; 문헌[Kimura T et al., 2003]; 문헌[Dumey N et al, 2005]; 문헌[Kikuchi E et al., 2007]), 렌티바이러스(문헌[Kikuchi E et al., 2004]), 및 수포성 구내염 바이러스(문헌[Hadaschik BA et al., 2008])를 포함한다. 방광암의 치료를 위한 복제-가능 우두 바이러스 및 아데노바이러스 벡터의 용도에 대해 5 개 이상의 임상 시험들이 보고되었다(문헌[Gomella LG et al., 2001]; 문헌[Kuball J et al., 2002]; 문헌[Pagliaro LC et al., 2003]; 문헌[Burke J, 2010]; 문헌[Malmstrom PU et al., 2010]).

암 유전자 요법에 대해 시험된 다양한 유형의 바이러스 벡터들 가운데 레트로바이러스가 있다. 상기 레트로바이러스의 생활사는 숙주 게놈 중에 통합된 상태를 포함하며, 따라서 치료 유전자의 장기간 안정한 발현이 허용된다. 레트로바이러스 벡터의 사용에 관한 한 가지 주된 우려는, 상기 벡터에 의한 게놈의 전사 활성 영역내로의 우선적인 통합이 삽입 돌연변이, 발암유전자 활성화 및 세포 형질전환을 유발할 수도 있다는 것이다. SCID-X1에 대한 유전자 요법(문헌[Hacein-Bey-Abina et al., 2003])에 따른 프랑스 및 영국의 다수의 아동들에서의 백혈병의 발생은 상기 바이러스 벡터와 관련된 잠재적인 위험성에 대한 엄중한 조사를 불러왔다.

아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 바이러스 벡터는 삽입 돌연변이의 위험성이 훨씬 더 낮으며 암 유전자 요법에 대해 또한 시험되었다(문헌[Cross & Burmester, 2006]; 문헌[Palmer et al., 2006]). 아데노바이러스 벡터는 또한 동물 모델에서 방광암 유전자 요법에 대해서 및 4 회 이상의 조기 임상 시험으로 광범위하게 시험되었다(문헌[Kuball J et al., 2002]; 문헌[Pagliaro LC et al., 2003]; 문헌[Burke J, 2010]; 문헌[Malmstrom PU et al., 2010]). 그러나, 감염성 인간 바이러스로서, 아데노바이러스 및 AAV는 인간 면역계를 활성화시킨다(문헌[Calcedo R et al., 2009]; 문헌[Huang & Yang, 2009]; 문헌[Nayak & Herzog, 2010]). AAV 벡터는 B 세포 활성화에 효율적이며(문헌[Huang & Yang, 2009]) AAV2에 대한 특이성 항체가 연령 그룹 및 지리학적 위치에 따라 개인의 35 내지 80%에서 검출된다(문헌[Calcedo R et al., 2009]). 매우 낮은 빈도지만, AAV 캡시드-특이성 CD8+ 기억 T 세포가 인간에 존재하며 AAV 형질도입시 재활성화될 수 있다(문헌[Nayak & Herzog, 2010]). 아데노바이러스에 대한 기존의 면역성은 훨씬 더 우세하다(문헌[Bessis N et al., 2004]; 문헌[Nayak & Herzog, 2010]). 그룹 C 아데노바이러스에 대한 기존 항체는 인간의 97% 이상에서 검출되었으며 혈청형 2 아데노바이러스에 대한 것들은 인간의 대략 50%에서 아데노바이러스 벡터를 생성시키는데 통상적으로 사용된다(문헌[Nayak & Herzog, 2010]). T 세포-매개된 면역성에 관하여, 상이한 아데노바이러스 혈청형들에 대한 CD4+ 및 CD8+ 교차-반응성 T 세포가 인간 말초혈액에서 검출되었다(문헌[Nayak & Herzog, 2010]).

기존의 면역성은, 있을 수 있는 원치않는 거부 반응에 비추어 유전자 요법에서 인간 감염성 바이러스로부터 유래된 벡터를 사용함에 있어서 우려일 수 있다. 기존의 항바이러스 면역성이 중증의 병리학적 변화를 촉발시키지 않는 상황 하에서, 상기 면역성은 여전히 상기 바이러스 벡터를 불활성화시킬 수도 있으며, 따라서 형질도입 효율에 영향을 미칠 수도 있다. 기존의 면역성이 없는 환자에서, 아데노바이러스 벡터는, 상기 바이러스가 고도로 면역원성이므로, 최초 투여에 이어서 강한 항바이러스 면역성을 빠르게 이끌어낼 것이다. 상기 반응은 상기 벡터의 추가의 사용을 방해하거나 후속의 사용을 덜 유효하게 할 것이다.

바이러스는, 복제 가능 바이러스든 혹은 복제-결함 재조합 바이러스 벡터든, 종양 모델에서 방광암 요법에 대해 시험되었다. 그러나, 방광 요법으로서 인간 감염성 바이러스는 기존의 면역성 및 강한 면역원성과 관련된 문제들을 포함하여 중대한 결점들을 갖는다. 대조적으로, 본 발명자들은 곤충 바큘로바이러스-기재 벡터가 방광암 요법에 적합한 비히클을 제공할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명에 개시된 방법은 표재성 종양의 절제에 이은 방광암의 재발을 예방하거나 재발 위험성을 감소시키기 위한 보조 요법으로서의 용도를 포함하여, 방광암의 치료를 위한 바큘로바이러스의 용도에 관한 것이다. 현행 바이러스 벡터 시스템의 유효성 및 안전성에 있어서의 제한을 고려하면, 바큘로바이러스 벡터는 면역성을 유도하기 위한 보조 요법으로서, 또는 치료 핵산의 전달을 위한 벡터로서의 용도에 실용 가능한 대안을 제공한다.

본 발명자들은 방광내 전달된 바큘로바이러스 벡터가 정상적인(암을 갖지 않는) 마우스 방광을 유효하게 형질도입시킬 수 있음을 입증하였다. 인간 거대세포바이러스 초기발현 유전자 프로모터, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열 부분을 함유하는 포유동물 발현 카세트를 바이러스 게놈에 통합시키는 바큘로바이러스 벡터는 높은 수준의 생체내 형질도입 효율을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 바큘로바이러스 형질도입이, 상기 바큘로바이러스 벡터 중에 포함된 어떠한 치료학적 트랜스유전자도 없이, 단독으로 종양억제 면역성을 자극할 수 있음을 발견하였다. 어떠한 트랜스유전자도 없는 바큘로바이러스의 방광내 투여를 받은 마우스로부터 수거된 방광 조직 추출물을 분석하기 위해 쥐 사이토킨/케모킨 항체 배열을 사용한 경우, 상기 배열 중 단백질의 59%가 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니-자극 인자 및 피부 T 세포-유인 케모킨의 상향 조절을 포함하여, 2 배 초과의 발현 증가를 보였다. 바큘로바이러스에 의한 치료는 동소(orthotopic) 방광암-함유 마우스의 생존을 연장시키며, 이때 상기 동물의 50%가 6 개월 이상 생존하는 것으로 밝혀졌다.

공격적인 동소 방광 종양 진행을 갖는 마우스의 방광에 CD40 리간드 유전자의 방광내 전달을 위해 바큘로바이러스 벡터를 사용한 경우, 상기 종양의 우선적인 형질도입에 이어서 종양 성장 및 평균 방광 중량의 감소가 관찰되었다.

따라서, 바큘로바이러스 및 바큘로바이러스 유전자 전달 벡터의 직접적인 방광내 주입은 방광암에 대한 신규의 치료 양상을 제공할 수 있다.

하나의 태양에서, 본 발명은 방광 세포를 바큘로바이러스 벡터와 접촉시킴을 포함하는, 상기 방광 세포에 핵산 분자를 전달하는 방법을 제공한다.

상기 세포는 방광암 세포 또는 건강한, 비-암 방광 세포일 수 있으며 방광암 치료가 필요한 환자내를 포함한, 생체내 또는 시험관내 세포일 수 있다. 상기 세포가 환자내의 세포인 경우, 접촉은 상기 바큘로바이러스 벡터를 방광내 주입에 의해 상기 환자에게 투여함을 포함할 수 있다.

상기 바큘로바이러스 벡터는, 상기 방광 세포에서 트랜스유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 방광 세포에서의 발현을 위한 트랜스유전자를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 트랜스유전자는 방광암의 치료를 위한 치료학적 트랜스유전자, 예를 들어 CD40L 또는 IL-15를 암호화하는 치료학적 트랜스유전자일 수 있다.

상기 바큘로바이러스 벡터에서, 상기 프로모터는 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는, 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 바큘로바이러스 벡터는 상기 트랜스유전자의 3' 번역되지 않은 영역 중에, 예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.

상기 바큘로바이러스 벡터는 상기 트랜스유전자의 5' 번역되지 않은 영역 중에, 예를 들어 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 방광 세포를 상기 바큘로바이러스 벡터와 접촉시키기 전에 또는 상기 벡터와 접촉시키면서 동시에 형질감염제를 첨가함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형질감염제는 예를 들어 폴리-L-리신, 클로르팩션(Clorpaction) WCS-90, 도데실-B-dd-말토사이드(DDM), 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본 발명에 개시된 방법과 일치되게, 본 발명은 바큘로바이러스 벡터의 다양한 용도를 제공한다.

따라서, 또 다른 태양에서, 본 발명은 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 상기 방광암의 치료에 사용하기 위한 바큘로바이러스 벡터를 제공하며, 여기에서 상기 용도는 상기 환자에서 상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 환자의 방광에서 방광내 주입에 사용하기 위한 바큘로바이러스 벡터를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의해 상기 방광암을 치료하기 위한 상기 바큘로바이러스의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의해 상기 방광암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 바큘로바이러스의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 환자의 방광에서 방광내 주입을 위한 바큘로바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 환자의 방광에서 방광내 주입을 위한 약제의 제조를 위한 바큘로바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 태양들 및 특징들은 첨부된 도면 및 표와 함께 하기 본 발명의 특정한 실시태양들의 설명을 고찰할 때 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 자명해질 것이다.

하기의 도면 및 표는 본 발명의 실시태양들을 단지 예로서 예시한다.
도 1은 balb/c 누드 마우스에서 방광내 주입 후 마우스 방광의 바큘로바이러스 형질도입을 나타낸다. (A). 3 개의 상이한 바큘로바이러스 벡터에 의해 형질도입된 전형적인 동물에서의 루시페라제 리포터 유전자 발현의 생물발광 상. 열지도는 트랜스유전자 발현 구역을 나타내고 색상은 강도를 나타낸다. 바큘로바이러스 벡터 발현 카세트의 도식적인 구조를 좌측에 나타낸다. 약어: CMV: 인간 거대세포바이러스 초기발현 유전자 프로모터 및 인헨서; WPRE: 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소; RU5: 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열 부분. (B). 루시페라제 리포터 유전자 발현의 시간 경과 분석. 생체내 유전자 발현 수준을 생물발광 신호의 측정에 의해 정량분석한다. 데이터는 평균 + s.d.을 나타내고, n은 그룹당 3이다.
도 2는 C57L/B6 마우스에서 방광내 주입 후 마우스 방광의 바큘로바이러스 형질도입을 나타낸다. (A) 전형적인 동물에서 루시페라제 리포터 유전자 발현의 생물발광 상. 마우스를 상기 바큘로바이러스 벡터 BV-RU5-Luc-WPRE에 의해 마우스당 10⁸ 또는 10⁷ 바이러스 입자의 용량으로 형질도입시켰다. (B) 루시페라제 리포터 유전자 발현의 시간 경과 분석. 생체내 유전자 발현 수준을 생물발광 신호의 측정에 의해 정량분석한다. 데이터는 평균 + s.d.을 나타내고, n은 그룹당 3이다. (C) 방광에서 바큘로바이러스 형질도입을 입증하기 위한 루시페라제 단백질에 대한 항체의 면역염색. 조직 단편을 바큘로바이러스 형질도입 후 24 시간째에 수거하였다. 저-배율 상 및 고-배율 상을 나타낸다. 바큘로바이러스 형질도입 후 정상 방광의 구조를 나타내기 위해서 헤마톡실린-에오신 염색을 포함시켰다.
도 3은 바큘로바이러스 형질도입이 방광에서 사이토킨/케모킨 발현을 상향조절함을 나타낸다. (A) 방광내 주입을 받지 않은(정상), 각각 PBS 및 BacPAK6의 방광내 주입을 수용한 C57L/B6 마우스로부터 수거한 샘플들의 전형적인 블럿 상. 방광을 주입 후 48 시간째에 수확하고 균질화하였다. 사이토킨/케모킨 항체 배열을 탐침조사하기 위해서 상등액을 사용하였다. (B) 바큘로바이러스 형질도입시 마우스 방광에서의 사이토킨 및 케모킨의 상대적인 상향조절. 밀도측정 데이터를 래이바이오(RayBio)(등록상표) 분석 도구로 분석하였다. 변화 배수(평균 신호 강도 차이)를 나타낸다. 데이터는 평균 + s.d.을 나타내고, n은 그룹당 3이다.
도 4는 바큘로바이러스 형질도입의 종양억제 효과를 나타낸다. (A) 마우스 방광암 세포의 방광내 접종 후 상기 방광에서 종양의 발생. 2 가지 유형의 마우스 방광암 세포, MB49 및 MB49S1(MB49 세포의 서브클론)을 동물당 10⁵ 암 세포로 시험하였다. 상기 방광을 접종-후 14일째에 수확하였다. H&E 염색은 MB49S1 종양이 모 MB49 세포의 접종에 의해 형성된 종양에 비해 느린 성장 속도를 가짐을 보인다. (B) BacPAK6 형질도입은 방광 종양-함유 마우스의 생존을 연장시킨다. 포유동물 유전자 발현 카세트가 없는 바큘로바이러스 벡터, BacPAK6의 방광내 주입을 10⁵ MB49S1 세포의 접종 후 7일째에 수행하였다. 95일까지의 생존 곡선을 나타낸다. n은 그룹당 10이다. 통계학적 분석을 로그 순위 시험을 사용하여 수행하였다.
도 5는 방광암 세포에서 바큘로바이러스 벡터가 CD40L 발현을 매개함을 나타낸다. 방광암 모델에서 바큘로바이러스 벡터의 형질도입 효능. (A) 바큘로바이러스는 시험관내 및 생체내에서 방광암 세포를 형질도입시킬 수 있다. 바큘로바이러스 벡터 BV-RU5-Luc-WPRE를 사용하여 마우스 MB49 방광암 세포, 인간 T24 방광암 세포, 및 MB49 세포를 접종하여 형성시킨 마우스 동소 방광 종양을 형질도입시켰다. 바큘로바이러스 형질도입 후 24 시간째에 수거된 세포 및 조직 단편 중의 루시페라제 단백질에 대한 항체에 의한 면역염색에 의해 루시페라제 리포터 유전자 발현이 입증되었다. H&E 염색은 방광 종양 성장을 나타낸다. (B) CD40L에 대한 바큘로바이러스 벡터 발현 카세트의 도식적 구조. (C) RT-PCR은 시험관내 BV-CD40L 형질도입 후 24 시간째에 MB49 세포에서 CD40L 발현을 입증한다. (D) 웨스턴 블럿팅에 의해 입증된 바와 같은 마우스 MB49 방광 종양에서의 CD40L 발현. BV-CD40L의 방광내 주입을 10⁵ MB49 세포의 접종 후 3일째에 수행하였다. 상기 방광을 BV-CD40L 형질도입 후 24 시간째에 수거하였다.
도 6은 바큘로바이러스-매개된 CD40L 발현의 종양 억제 효과를 나타낸다. BV-CD40L의 방광내 주입을 2 x 10⁴ DiR-표지된 MB49 세포의 접종 후 3일째에 수행하였다. BackPAK6의 방광내 주입을 형질도입 대조용으로서 포함시켰다. 방광을 분석을 위해 바큘로바이러스 형질도입 후 1 주일째에 수거하였다. (A) CD40L 발현은 종양 성장을 나타낸다. DiR 형광 상은 각 동물에서의 초기 종양 크기를 나타내며 H&E 염색은 종양 발생을 나타낸다. (B) 방광 중량 차이. 데이터는 평균+s.d.을 나타내고, n은 그룹당 5이다. ^*스튜던트 t-시험에 의해 BacPAK6 그룹에 대해 p<0.05.
도 7은 방광암-함유 마우스의 생존에 대한 CD40L 및 IL-15의 동시-전달 효과를 나타낸다. (A) 바큘로바이러스 벡터에 의한 CD40L 및 IL-15의 동시-전달은 방광 종양-함유 마우스의 생존을 연장시킨다. 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입을 10⁵ MB49 세포의 접종 후 2일째에 수행하였다. 100일까지의 생존 곡선을 나타낸다. (B) H&E 염색은 상기 MB49 종양이, CD40L 및 IL-15를 발현하는 바큘로바이러스 벡터로 처리된 한 마리의 마우스에서 완전히 중지됨을 보인다.

본 발명에 개시된 방법 및 용도는 바큘로바이러스 벡터를, 방광암이 있는 환자에서 재발암을 감소시키거나 예방함을 포함하여, 방광암 요법에 사용할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 상기 바큘로바이러스 벡터는, 어떠한 트랜스유전자의 삽입도 없이, 종양-억제 면역 반응을 자극하는 작용을 할 수 있다. 치료 핵산을, 종양-억제 반응을 증가시키거나 보충하기 위해서, 상기 바큘로바이러스 벡터에 포함시킬 수도 있다. 방광내 전달 하에서를 포함한 몇몇 조건 하에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 건강한 비-암 방광 세포의 형질도입 없이 방광 종양을 우선적으로 형질도입시킬 수 있다.

따라서, 바큘로바이러스 벡터를 사용하는, 핵산 분자의 방광 세포로의 전달 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 방광 세포를 상기 바큘로바이러스 벡터와 접촉시켜, 상기 바큘로바이러스 벡터에 의해 형질도입된 방광 세포를 생성시킴을 포함한다.

인식되는 바와 같이, 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의한 세포의 형질도입은 상기 세포내로의 상기 바이러스 벡터 또는 바이러스 게놈의 전달, 즉 바이러스 핵산 물질에 의한 상기 세포의 감염을 지칭한다. 바큘로바이러스 벡터에 의한 포유동물 세포의 형질도입의 경우에, 형질도입은 생성물 감염 또는 상기 세포내에서 복제되는 바이러스 게놈의 능력을 지칭하는 것은 아니다.

상기 접촉되는 방광 세포는 임의의 방광 세포일 수 있다. 상기 방광 세포는 확립된 방광 세포주로부터의 세포, 조직 배양물 중의 1차 방광 세포, 환자로부터 외식된 방광 세포, 형질전환된 또는 불멸화된 방광 세포와 같은 조직 배양물 중의 세포를 포함한 시험관내 방광 세포일 수 있다. 상기 방광 세포는 환자의, 예를 들어 인간 환자를 포함한 포유동물 환자의 생체내 방광 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 방광 세포는 방광암의 치료가 필요한 환자 중에 있을 수 있다. 상기 방광 세포는 시험관내 또는 생체내 상황 중의, 예를 들어 트랜스제닉 방광 세포를 포함한 동물 모델 중의 트랜스제닉 방광 세포일 수 있다.

상기 방광 세포는 건강한, 즉 비-암성 방광 세포이거나, 또는 종양 중의 또는 종양으로부터 절제된 방광암 세포를 포함한 방광암 세포이거나, 또는 암성으로될 소인이 있는 방광 세포, 예를 들어 상기 방광 세포를 암성으로 되기 쉽게 하는 돌연변이를 수반하는 방광 세포일 수 있다.

상기 방광 세포와 접촉되는 바큘로바이러스 벡터는 임의의 바큘로바이러스 벡터일 수 있다. 바큘로바이러스 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며, 가장 통상적으로 사용되는 바큘로바이러스 벡터는 오토그라파 칼리포르니카 멀티플 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV))로부터 유래한다. 바큘로바이러스는 복제되거나 또는 형질도입된 세포에 독성을 유발하지 않으면서 포유동물 세포에 들어가는 능력을 갖는 곤충 DNA 바이러스이다. 바큘로바이러스는 증식성 및 비-증식성 휴지 세포 모두에서 광범위한 향성을 지니며, 포유동물-활성 프로모터의 지지와 함께 관심 유전자를 시험관내 및 생체내에서 다양한 포유동물 세포 유형들로 효율적으로 전달할 수 있다. 상기 바이러스는 포유동물 세포에 들어갈 수 있지만, 곤충-특이성 프로모터로부터 자신의 유전자를 발현할 수는 없다; 따라서 바큘로바이러스는 척추동물 세포에서 바이러스 단백질을 복제하고 발현할 수 없으며, 따라서 바이러스에 의해 암호화된 유전자의 생체내 발현의 결과로서 면역 반응을 일으켜 기존의 바이러스 물질과 재결합하지도 못하고, 인체에서 다른 바이러스의 복제를 지원하지도 않을 것이다. 포유동물 세포에서 바큘로바이러스의 감염은 심지어 높은 MOI에서조차, 뚜렷한 세포병변효과를 유발하지 않는다(문헌[Shoji et al., 1997]).

예를 들어 유전자 전달 벡터로서 바큘로바이러스 AcMNPV를 사용하는 또 다른 매력적인 이점은 그의 130 kb 바이러스 게놈에 의해 부여되는 큰 클로닝 용량이며, 이는 단일 벡터로부터 큰 기능성 유전자 또는 다수의 유전자를 전달하는데 유리하게 사용될 수 있다. 인간 세포에서, 포유동물 발현 카세트를 수반하는 바큘로바이러스 벡터는, 트랜스제닉 벡터가 전형적으로는 형질도입된 세포의 게놈에 통합되지 않으므로, 일시적인 발현을 매개함에 있어서 유효할 수 있다. 따라서, 바큘로바이러스 벡터는 단기간의 높은 수준의 트랜스유전자 발현을 요하는 용도에 이상적으로 적합하며 낮은 삽입 돌연변이유발 위험성을 제기한다.

바큘로바이러스 형질도입의 또 다른 중요한 이점은 인간에서 곤충 바이러스에 대한 기존 면역성의 부재이며(문헌[Wang S et al., 2010]), 따라서 상기 바이러스는 인간에게 감염성이지 않다. 스트라우스(Strauss) 등은 아데노바이러스 유형 5에 대한 중화 항체의 출현율이 인간 혈청 샘플에서 65%인 반면, 상기 혈청 샘플 중 어느 것도 바큘로바이러스 중화 항체에 대해 양성이지 않음을 보고하였다(문헌[Strauss R, et al., 2007]). 같은 연구에서, 인간에서 기존의 아데노바이러스-특이성 T 세포가 검출될 수 있었지만, 기존의 바큘로바이러스-특이성 T 세포는 존재하지 않았다. 아데노바이러스에 비해, 바큘로바이러스는, 바이러스-특이성 T-세포의 보다 적은 수의 유도가 가리키는 바와 같이(문헌[Strauss R, et al., 2007]), 비교적 낮은 면역원성을 갖는다.

또한, 다수의 다른 유전자 요법 바이러스 벡터와 달리, 바큘로바이러스 벡터는 무혈청 세포 배양 배지에서 생산될 수 있으며, 이는 혈청-제공 동물로부터의 바이러스 및 프리온제에 의한 혈청 오염의 잠재적인 위험을 제거한다.

상기 바큘로바이러스 벡터 자체가, 어떠한 트랜스유전자도 없이, 방광 세포로 전달되는 핵산일 수 있다. 즉, 전달은 상기 바큘로바이러스 벡터 핵산 물질에 의해 또는 상기 물질을 흡수함으로써 형질도입되는 세포를 생성시킬 수 있다.

다른 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 방광 세포에서 발현시켜야 하는 발현 산물을 암호화하는 트랜스유전자 암호화 서열을 포함할 수 있다. 상기 발현 산물을 암호화하는 트랜스유전자 서열이, 상기 방광 세포내에서 상기 발현 산물의 목적하는 발현 프로파일을 수행하기 위해 필요한 모든 조절 서열들에, 예를 들어 프로모터 영역에 작동적으로 연결됨을 알 것이다. 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과, 상기 서열들이 작용성 관계에 놓일 때 작동적으로 연결한다. 예를 들어, 암호화 서열이 프로모터에, 상기 프로모터가 상기 암호화 서열의 전사를 활성화하고 구동시키는 경우 작동적으로 연결한다. 따라서, 상기 방광 세포와 접촉하는 바큘로바이러스 벡터는, 상기 방광 세포에서 트랜스유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 작동적으로 연결된, 상기 방광 세포에서의 발현을 위한 상기 트랜스유전자를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 트랜스유전자 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 프로모터는 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터를 포함한다.

TTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC [서열번호 1]

일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는, 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터로 필수적으로 이루어지는 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 프로모터는 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터로 이루어진다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "로 필수적으로 이루어진다" 또는 "로 필수적으로 이루어지는"은 핵산 서열이 예를 들어 상기 서열내에 또는 상기 서열의 한쪽 또는 양쪽 끝에 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기를 포함하지만, 추가적인 뉴클레오타이드 서열이 상기 핵산 서열의 기능, 예를 들어 방광 세포에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현을 구동하는 프로모터로서 작용하는 상기 서열의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않음을 의미한다.

다른 실시태양에서, 상기 프로모터는 방광 세포에서 유전자 발현을 지시하는 능력을 여전히 유지하면서, 서열번호 1과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터이다.

상기 바큘로바이러스 벡터는 상기 트랜스유전자의 3' 번역되지 않은 영역에, 전사-후 조절 요소, 예를 들어 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 포함한다.

CGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTG [서열번호 2]

일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열로 필수적으로 이루어지는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열로 이루어지는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 포함한다.

다른 실시태양에서, 상기 일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 방광 세포에서 유전자 발현을 지시하는 능력을 여전히 유지하면서, 서열번호 2와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 포함한다.

상기 바큘로바이러스 벡터는 상기 트랜스유전자의 5' 번역되지 않은 영역 중에, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.

GGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC [서열번호 3]

일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 서열로 필수적으로 이루어지는 상기 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부의 상류 5' 조절 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 서열로 이루어지는 상기 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부의 상류 5' 조절 영역을 포함한다.

다른 실시태양에서, 상기 일부 실시태양에서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 방광 세포에서 유전자 발현을 지시하는 능력을 여전히 유지하면서, 서열번호 3과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 포함한다.

상기 바큘로바이러스 벡터를 당해 분야에 공지되는 표준 기법, 예를 들어 PCR 및 분자 클로닝 기법을 사용하여 상기와 같이 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스를 상업적으로 입수할 수있는 클로닝 및 발현 시스템, 예를 들어 BAC-TO-BAC(상표) 바큘로바이러스 발현 시스템(깁코(Gibco) BRL, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 소재)을 사용하여 쉽게 변형시킬 수 있다.

상기 조절 영역 외에, 상기 바큘로바이러스는 트랜스유전자 암호화 서열을 포함할 수도 있다. 상기 트랜스유전자란 용어는 바큘로바이러스에 대해 외래인 유전자를 지칭한다, 예를 들어 바큘로바이러스 벡터에 의한 트랜스유전자의 발현에 대한 언급은 상기 바큘로바이러스 게놈에 대해 외래인 유전자의 발현을 지칭하는 것과 같은 것이다. 상기 트랜스유전자 암호화 서열은 방광 세포에서 발현시키고자 하는 임의의 발현 산물을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스유전자는 치료 단백질 또는 RNA, 선택성 단백질 또는 RNA 마커, 검출성 리포터 단백질 또는 RNA 또는 방광 세포에 선택적인 환경 조건에 대한 내성을 제공하는 단백질을 암호화할 수 있다. 상기 트랜스유전자는 또한 상기 방광 세포의 유전자의 발현을 조절하는 조절 RNA, 예를 들어 miRNA를 암호화할 수 있다.

예를 들어, 상기 트랜스유전자는 방광암의 치료를 위한 치료학적 발현 산물을 암호화할 수 있다. 따라서 상기 트랜스유전자는 임상적인 유용성을 갖는 임의의 유전자, 예를 들어 RNA 또는 암 예방 또는 치료에 관련된 단백질과 같은 유전자 산물을 암호화하는 유전자, 또는 암 예방 또는 치료에 관련된 세포 조절 효과를 갖는 유전자를 포함한, 치료학적 트랜스유전자일 수 있다. 상기 유전자 산물은 환자에서 결함 또는 누락 유전자 산물, 단백질 또는 세포 조절 효과를 대신하여, 방광암의 예방 또는 치료를 가능하게 할 수 있다.

따라서, 치료학적 발현 산물은, 방광 세포에서 발현 시 상기 세포에 대해 치료 효과를 갖거나, 또는 상기 방광 세포내에서 목적하는 결과를 성취하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다.

상기 치료학적 발현 산물은 상기 방광 세포에서 유전자 발현을 조절하여 임상적으로 유용한 조절을 제공하는 RNA 분자, 예를 들어 안티센스 RNA, miRNA 또는 작은 간섭 RNA(siRNA) 분자일 수 있다. 상기 안티센스 RNA, miRNA 또는 siRNA는 종양발생 또는 종양 성장에 관련된 유전자의 발현을 하향조절하거나 억제하거나 감소시키는 것에 관련될 수 있다.

예를 들어, 비제한적으로, 상기 치료학적 트랜스유전자는 CD40L 또는 IL-15인 단백질을 암호화할 수 있다. 일례로, CD40L 및 IL-15를 암호화하는 치료학적 트랜스유전자를 치료 효과를 위해 동일한 환자에서 함께 사용할 수도 있다. 상기 CD40L 및 IL-15 트랜스유전자를 동일한 바큘로바이러스 벡터 중에 함께 포함시키거나, 또는 상이한 바큘로바이러스 벡터 중에 포함시키고 이어서 동일한 환자에 전달할 수도 있다.

상기 방광 세포에 상기 핵산 분자를 전달하기 위해서, 상기 방광 세포를 상기 바큘로바이러스 벡터와 접촉시킨다. 접촉은 예를 들어 상기 바큘로바이러스 벡터를, 상기 방광 세포가 상기 바큘로바이러스 벡터에 의해 형질도입되도록 상기 방광 세포를 함유하는 조직 배양 배지에 첨가함을 포함할 수 있다. 접촉은 상기 바큘로바이러스 벡터를 환자에게 투여함을 포함할 수 있다.

따라서, 상기 핵산 분자를 전달하고자 하는 방광 세포는 방광암의 치료 또는 예방이 필요한 환자, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물 중에 생체내에 있을 수 있다.

따라서 상기 방법을, 암성이거나, 종양의 일부이거나, 암성으로 될 소인이 있거나, 또는 암성으로 되는 것을 예방해야 하는 생체내 방광 세포의 상황에서 수행할 수 있다.

따라서, 상기 방광 세포를 상기 바큘로바이러스 벡터와 접촉시키는 것은 유효량의 상기 바큘로바이러스 벡터를 상기 환자에게 투여함을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "유효량"이란 용어는 목적하는 결과를 성취하기 위해서, 예를 들어 앞서 TCC를 포함한 표재성 방광암을 포함하여, 방광암이 있는 환자에서 방광암을 예방하거나 상기 방광암의 재발 위험성을 감소시킴을 포함하여, 방광암을 치료 또는 예방하기 위해서 필요한 투여량에서 및 상기에 필요한 기간 동안 유효한 양을 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 방광암에 관하여 "치료하다" 또는 "치료"는 임상적인 결과를 포함하여, 이롭거나 목적하는 결과를 획득하기 위한 접근법을 지칭한다. 이롭거나 목적하는 임상 결과는 비제한적으로 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 정도의 감소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 예방, 질병 확산의 예방, 질병 재발의 예방, 질병 진행 또는 재발의 지연 또는 늦춤, 질병 개시의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 진정(부분적이든 전체적이든)을 포함할 수 있다. "치료 중인"은 또한 치료의 부재 하에서 예상되는 것 이상으로 환자의 생존을 연장시킴을 의미할 수 있다. "치료 중인"은 또한 질병의 진행 또는 재발을 억제하거나, 질병의 진행 또는 재발을 일시적으로 늦춤을 의미할 수 있지만, 보다 바람직하게는 상기 질병의 진행 또는 재발을 영구적으로 정지시킴을 포함한다.

곤충 바큘로바이러스 오토그라파 칼리포르니카 멀티플 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)로부터 유래된 재조합 벡터가 암 유전자 요법을 포함한 유전자 요법에 유용한 벡터로서 제시되었다(문헌[Hofmann C et al., 1995]; 문헌[Kost TA et al., 2005]; 문헌[Hu YC, 2008, 2010]; 문헌[Wang S et al., 2010]). 타카쿠(Takaku) 등은 바큘로바이러스에 의한 NK 세포-의존성 종양억제 면역성의 활성화를 알고 있다(문헌[Kitajima M et al., 2008a]). 바큘로바이러스-유도된 종양억제 작용은 가능하게는 종양-특이성 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 및 종양-특이성 항체 생산을 증대시킴으로써 후천적인 면역성을 수반할 수 있다(문헌[Kitajima M et al., 2008b]; [Suzuki T et al., 2010]). 따라서, 바큘로바이러스의 면역자극 성질을 암 면역요법을 위해 개시된 방법에 사용할 수 있다.

상기 바큘로바이러스 벡터를 당해 분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다. 상기 바큘로바이러스 벡터를 전신적으로 투여하거나, 또는 방광에 방광내 주입에 의해 투여할 수도 있다.

이해되는 바와 같이, 상기 방광은 중공 기관으로, 요도 카테터를 통한 비외과적 방광내 약물 투여 및 내시경에 의한 치료 효능의 평가가 허용된다. 방광내로 전달된 치료제가 제한된 전신 노출과 함께 국소적으로 작용하고 표재성 방광암에 쉽게 접근할 수 있다는 이점을 이용한다.

포유동물 세포의 생체내 바큘로바이러스 형질도입과 함께, 전신적으로 전달된 바큘로바이러스 벡터의 불활성화가 선천적인 면역계의 주성분인 혈청 보체 단백질에 의한 바이러스 인식의 결과로서 발생할 수 있다(문헌[Hofmann C et al., 1998]). 면역능력 동물에서, 전신 전달된 바큘로바이러스 벡터는 발현에 실패할 수도 있다. 바큘로바이러스의 높은 역가를 사용하여 상기 바이러스를 중화시키는 상기 보체의 능력을 극복하였지만; 상기 접근법은 여전히 바큘로바이러스-매개된 트랜스유전자 발현을 생성시킬 수 없다(문헌[Kitajima M et al., 2008a]). 따라서, 방광암 요법을 요도를 통한 방광내 카테터설치에 의해 수행하여 혈청 보체에 의한 바이러스 불활성화와 같은 전신 바이러스 투여에 대한 다수의 결점들을 피할 수 있다.

본 발명에 개시된 방법에서 입증된 바와 같이, 방광내 투여된 바큘로바이러스는 상기 발현을 유도하는 강한 면역자극 능력을 나타내거나 또는 염증성 사이토킨의 방출을 촉진할 수 있다. 상기 발견은, 동물체내에 주입 후 바큘로바이러스가 보호성 선천적인 면역 반응을 이끌어낼 수 있음을 발견한 선행의 연구들과 일치한다. 바큘로바이러스는 특이적으로 바이러스 유전자의 산물을 향하는 면역 반응을 특징으로 하는, 적합한 면역성을 또한 유도할 수 있다(문헌[Pieroni et al. 2001]; 문헌[Abe et al. 2005]).

이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 면역자극 효과는 가능하게는 종양 성장을 억제하도록 치료학적으로 견인될 수 있다. 상기 가설은 방광내 전달된 바큘로바이러스가 어떠한 트랜스유전자도 발현하지 않지만 확립된 동소 방광암을 갖는 면역능력 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다는 관찰에 의해 지지된다. 이러한 동계 모델 시스템은 완전한 면역 기능을 제공하여, 방광암에 대한 치료학적 바큘로바이러스 기재 치료의 연구를 허용한다.

상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입시 방광 세포에 의한 흡수 효율을 증가시키기 위해서, 상기 방법은 형질감염제의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방광을 먼저, 방광내 주입을 통해 상기 바큘로바이러스 벡터를 방광 세포와 접촉시키기 전에, 주어진 기간 동안 형질감염제로 처리할 수 있다.

형질감염제는 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어 상기 형질감염제는 폴리-L-리신, 클로르팩션 WCS-90, 도데실-B-dd-말토사이드(DDM), 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

그러나, 상기 방법을 형질감염제에 의한 상기 방광 세포의 어떠한 전처리도 없이 수행하는 것은 방광암 세포에 비해 건강한(비-암성) 방광 세포에 의한 바큘로바이러스 벡터의 흡수를 변경시킬 수도 있음이 관찰되었다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 건강한 방광 세포보다 방광암 세포를 우선적으로 표적화하기 위해서, 형질감염제의 임의의 사용을 생략한다.

상기 투여되는 바큘로바이러스 벡터의 농도 및 양은 치료하려는 방광암, 상기 바큘로바이러스 벡터 중에 포함되는 트랜스유전자의 유형, 투여 방식, 다른 동반되는 치료, 및 환자의 연령 및 건강에 따라 변할 것이다. 생존 및 암 예방 또는 치료를 방광내 주입의 빈도를 변화시킴으로써 개선시킬 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 상기 바큘로바이러스 벡터의 효능을 상기 바큘로바이러스 벡터 중에 치료학적 트랜스유전자의 포함에 의해 개선시킬 수 있다.

투여를 돕기 위해서, 상기 바큘로바이러스 벡터를 약학 조성물 중의 성분으로서 제형화할 수도 있다.

따라서, 상술한 바와 같은 바큘로바이러스 벡터 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 상기와 같은 약학 조성물은 상술한 바와 같이 방광암의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 농도의 염, 완충제, 보존제 및 다양한 적합한 담체를 통상적으로 함유할 수 있다. 모든 형태의 전달을 위해서, 상기 바큘로바이러스 벡터를 생리식염수 중에서 제형화한다.

상기 약학적으로 허용 가능한 희석제의 비율 및 정체를 선택된 투여 경로, 생 세포 및 생 바이러스 입자와의 양립성, 및 표준 약학적 관행에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 상기 약학 조성물을, 상기 바큘로바이러스 벡터의 생물학적 성질을 없애지 않거나 또는 현저하게 손상시키지 않는 성분들과 제형화할 것이다.

상기 약학 조성물을, 유효량의 상기 바큘로바이러스 벡터 및 임의의 추가적인 활성 물질 또는 물질들이 약학적으로 허용 가능한 비히클과의 혼합물로 결합되도록, 환자에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용 가능한 조성물의 제조에 대해 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 적합한 비히클들은 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)]에 개시되어 있다. 이를 토대로, 상기 약학 조성물은, 독점적인 것은 아니지만, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 희석제와 함께 상기 바큘로바이러스 벡터의 용액을 포함하며, 상기 조성물은 적합한 pH 및 생리학적 유체와 등-삼투성인 완충제 용액 중에 함유된다.

상기 사용되는 약학 조성물의 용량은 치료되는 특정 상태, 상기 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 포함한 개인 환자의 매개변수, 치료 지속기간, 동반되는 요법(존재하는 경우)의 성질, 특정한 투여 경로 및 건전한 의사의 지식 및 전문적인 기술내에 있는 다른 유사한 인자들에 따라 변한다. 이들 인자는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 최소한의 통상적인 실험으로 다룰 수 있다.

상기 개시된 바큘로바이러스 벡터의 다양한 용도들이 또한 고려된다. 따라서, 방광암의 치료가 필요한 환자에서 방광내 주입에 사용하기 위한 바큘로바이러스 벡터, 방광암의 치료가 필요한 환자에서 상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의한 상기 방광암의 치료를 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도, 방광암의 치료가 필요한 환자에서 상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의한 상기 방광암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도, 방광암의 치료가 필요한 환자에서 방광내 주입을 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도, 및 방광암의 치료가 필요한 환자에서 방광내 주입을 위한 약제의 제조를 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 방법 및 용도를 하기의 비제한적인 실시예들에 의해 추가로 예시한다.

실시예

실시예 1

방광암 요법을 위한 곤충 바큘로바이러스-기재 벡터의 용도를 조사하였다. 방광내 전달된 바큘로바이러스 벡터가 정상적인 마우스 방광을 유효하게 형질도입시킬 수 있음이 처음으로 입증되었다. 상기 바이러스 게놈에 인간 거대세포바이러스 초기발현 유전자 프로모터, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열 부분을 함유하는 포유동물 발현 카세트를 통합시킴으로써 제작된 신규의 재조합 바큘로바이러스 벡터는 시험된 3 개의 상이한 바큘로바이러스 벡터들 중에서 가장 높은 생체내 형질도입 효율을 제공하였다. 이어서 상기 바이러스 형질도입이 단독으로 종양억제 면역성을 자극할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 어떠한 트랜스유전자도 없는 바큘로바이러스를 방광내 투여받은 마우스로부터 수거한 방광 조직 추출물을 분석하기 위해서 쥐 사이토킨/케모킨 항체 배열을 사용하여, 상기 배열 중의 단백질의 59%(32 개 중 19 개)가 >2배의 발현의 증가를 나타내었으며, 이때 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니-자극 인자, 및 피부 T 세포-유인 케모킨이 상위 3 개의 상향조절된 단백질들이었다. 보다 중요하게, 상기 처리는 동소 방광암-함유 마우스의 생존을 현저하게 연장시켰으며, 이때 상기 동물의 50%가 6 개월 이상 생존하였다. CD40 리간드 유전자를 공격적인 동소 방광 종양 진행을 갖는 마우스의 방광에 방광내 전달하기 위해서 바큘로바이러스 벡터를 사용한 경우, 상기 종양의 우선적인 형질도입에 이어서 종양 성장 및 평균 방광 중량의 감소가 검출되었다.

물질 및 방법

바큘로바이러스 제제: 재조합 바큘로바이러스 벡터, CMV-Luc, CMV-Luc-WPRE 및 CMV-RU5-Luc-WPRE를 제조사의 설명서(인비트로젠(Invitrogen))에 따라 BAC-to-BAC(상표) 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 제작하였다. CMV-Luc는 인간 거대세포바이러스(CMV) 초기 프로모터 조절 하의 루시페라제 유전자를 함유한다. CMV-Luc-WPRE는 3' 번역되지 않은 영역(UTR)에 여분의 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 갖는다. CMV-RU5-Luc-WPRE는 5' UTR에 또 다른 조절 요소 RU5, 즉 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열 부분을 갖는다. 이들 루시페라제-발현 바이러스는 상응하는 bacmid를 사용하는 Sf9 곤충 세포의 형질감염에 의해 생산되었다. BV-CD40L(CD40 리간드) 바이러스(5' UTR에서 RU5 및 3' UTR에서 WPRE를 갖는 CMV 프로모터 조절 하의 마우스 CD40L 유전자(인비트로젠)를 갖는다)는 Sf9 곤충 세포의, 상기 발현 카세트 및 선형화된 AcMNPV 바이러스 DNA(클론테크(Clonetech))를 함유하는 pBacPAK9 전달 벡터에 의한 동시-형질감염 후에 동종 재조합에 의해 생산되었다. BV-IL-15(인터류킨 15) 바이러스는 BV-CD40L과 유사한 방식으로, 그러나 마우스 IL15 유전자를 사용하여 제작되었다. 바이러스 폴리헤드린 프로모터에 의해 구동된 lacZ 유전자를 갖는 모 바이러스, BacPAK6을 클론테크로부터 수득하였다. 재조합 바큘로바이러스를 Sf9 세포에서 0.1의 MOI로 증폭시키고 상기 바이러스-함유 상등액을 바이러스 감염 후 3일 째에 수거하였다. 바이러스를 28,000g에서 1 시간 동안 펠릿화하고 PBS에 재현탁하였다.

세포주 및 시험관내 바큘로바이러스 형질도입: Sf9 곤충 세포(인비트로젠)를 sf-900 III 무혈청 배지(인비트로젠)에서 유지시켰다. 쥐 방광 암종 세포주 MB49는 이수바라나탄 박사(Dr. Esuvaranathan)(싱가포르 국립 대학 병원)의 선물이었으며 인간 방광 암종 세포주 T24는 ATCC로부터 구입하였다. 상기 세포주들을 10% 소 태아 혈청(하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로건 소재), 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(시그마(Sigma))이 보충된 RPMI 1640에서, 37 ℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 방광암 성장에 근원하는 분자 기전에 대한 추가적인 우리의 이해를 위해서 변경된 성장 양상을 갖는 클론성 MB49 변체를 수득하기 위해, 야생형 MB49 세포를, CMV 프로모터에 의해 구동되는 루시페라제 유전자 및 SV40 프로모터의 조절 하의 네오마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드인 pRC2/CMV-Luc로 형질감염시켰다. 상기 형질감염된 세포를 2 주 동안 700 ㎍/㎖ 농도의 G418로 선택하였다. 마우스 방광 중에 높은 종양 확립률 및 비교적 느린 성장 속도를 갖는 서브클론 MB49S1을 또한 본 연구에 사용하였다. 시험관내 바큘로바이러스 형질도입 실험을 위해서, 상기 종양 세포를 바큘로바이러스 벡터와 100의 MOI로 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 트랜스유전자 발현 수준을 형질도입 후 24 시간째에 측정하였다.

동물, 동물 모델 및 생체내 바큘로바이러스 형질도입: 다자란 암컷 C57BL/6 마우스 및 다자란 암컷 balb/c 누드 마우스(중량 20 g, 5 내지 6 주령)를 사용하였다. 동소 방광 종양을 C57BL/6 마우스에서 동계 MB49 세포의 방광내 주입에 의해 상기 방광의 관강 표면상에 발생시켰다. 종양 주입 전에, MB49 세포를, 종양 흡수율의 생체내 모니터링을 용이하게 하기 위해서 친지성, 근-적외선 형광 DiR(20 ng/㎖ 밤새, 캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences))로 사전-표지하였다. 24-게이지 카테터(BD 메디칼)를 방광내 주입을 위해 요도를 통해 마취된 암컷 마우스의 방광에 도입시켰다. 잔뇨를 짜낸 후에, 상기 방광에 100 ㎕의 10 ㎍/㎖ 폴리-L-리신(PLL, 분자량 70,000 내지 150,000, 시그마)을 주입하였다. 상기 PLL 용액을 상기 방광에서 30 분간 유지시킨 후에 짜내었다. 이어서 상기 방광을 100 ㎕의 PBS로 세척하였다. 상기 전-처리 후에, 100 ㎕의 PBS 중의 MB49S1 또는 MB49 방광암 세포주를 주입하고 상기 방광에서 1 시간 동안 유지시켰다. 동물당 1 x 10⁵ 암세포의 용량을, CD40L 및/또는 IL-15 요법 연구를 제외하고(이때는 동물당 2 x 10⁴ 세포의 낮은 용량이 사용되었다), 사용하였다. 그 후에, 상기 카테터를 제거하고 상기 방광을 자발적인 배뇨에 의해 비웠다. 저온 CCD 카메라 및 ICG 필터(캘리퍼 라이프 사이언시즈)와 결합된 IVIS 100 생체내 영상화 시스템을 사용하여 방광내 주입 후 24 시간째에 종양 흡수율을 검사하였다. 상 및 형광 신호를 획득하고 제노젠(Xenogen) 생 영상화 소프트웨어 v2.5로 분석하였다. MB49 세포가 성공적으로 이식되고 유사한 종양 크기를 갖는 동물을 선택하고 하기의 실험에 사용하였다. 상기 방광에 생체내 바큘로바이러스 형질도입을 위해서, 마우스를 마취시키고 카테터를 설치하였다. PBS 중 바큘로바이러스 벡터(100 ㎕ 중 1 x 10⁸ pfu 바이러스 입자)를 30-분 폴리-L-리신 처리 후에 주입하고 1 시간 동안 유지시켰다.

상기 방광 중의 생체내 형질도입 효율을 평가하기 위해서, 동소 종양 이식이 있거나 또는 없는 마우스를 상기 루시페라제 리포터 유전자를 갖는 바큘로바이러스 벡터로 형질도입시키고 150 ㎎/㎏ 루시페린(프로메가)의 i.p. 주사 후 반듯이 누운 자세로, 저온 CCD 카메라 및 560 ㎚의 방출 필터(캘리퍼 라이프 사이언시즈)와 결합된 IVIS 100 영상화 시스템으로 영상화하였다. 상 및 발광 신호를 획득하고 제노젠 생 영상화 소프트웨어 v2.5로 분석하고 초당 광자로서 정량화하였다.

치료 효능을 평가하기 위해서, 상기 방광의 생체내 바큘로바이러스 형질도입을 동소 종양 이식 후 7일째에 수행하였다. 상기 마우스를 대조군 또는 처리 그룹으로 무작위화하였다. 상기 마우스를 재마취시키고 다시 카테터를 설치한 후에, BacPAK6 또는 BV-CD40L 또는 BV-IL-15 바이러스를 주입하였다. 동물들을 조직 분석을 위해 7일 후에 안락사시키거나, 또는 방광암의 징후 및 증상(혈뇨 및 중량 감소) 및 생육 상태에 대해서 6 개월간 관찰하였다.

동물의 모든 취급 및 보호를 싱가포르, 국립 실험 동물 연구 자문 위원회에 의해 발행된 과학 목적의 동물의 보호 및 사용에 관한 지침에 따라 수행하였다.

조직학적 분석 및 면역염색: 조직학적 검사를 위해서, 방광을 수확하고 4% PFA에서 밤새 고정시키고, 30% 슈크로스 중에 현탁시키고, 조직 동결 배지 중에 매몰시켰다. 10 ㎛의 크라이오스탯 조각을 준비하고 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색하였다. 면역염색을 위해서, 상기 조직 조각을 트리스-완충된 염수 트윈-20(TBST)로 2 회 세척하고 0.025% 트리톤 X-100 중에서 10 분 동안 배양하였다. 이어서 상기 조직 조각을 5% BSA 중에서 1 시간 동안 배양하여 비특이적인 결합을 차단하였다. 토끼 다클론 항-루시페라제 항체(아브캠(Abcam), 1:100)를 4 ℃에서 밤새 적용하였다. TBST로 3 회 세척 후에, 슬라이드를 2차 항체, FITC 접합된 염소 항-토끼 IgG(1:200)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다.

사이토킨/케모킨 발현: 마우스를 PBS 또는 BacPAK6의 방광내 주입 후 48 시간째에 안락사시켰다. 방광을 수확하고 칭량하였다. 프로테아제 억제제 칵테일(칼바이오켐(Calbiochem), 메르크(Mecrk), 독일 다름스타트 소재)을 갖는 조직 용해 완충제(페르멘타스(Fermentas), 미국 메릴랜드주 소재)를 ㎖당 50 ㎎ 조직으로 가하고 방광을 초음파 처리에 의해 균질화하였다. 이어서 방광 균질물을 16,000 x g 에서 30 분간 4 ℃에서 원심분리시키고 상등액을 수거하였다. 상기 상등액의 단백질 농도를 바이오래드(Biorad) 단백질 분석 방법(바이오래드, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 측정하였다. 80 ㎍의 총 단백질 농도를 함유하는 상등액의 분액을 제조사의 설명서에 따라 마우스 사이토킨 배열 2.1(래이바이오테크(Raybiotech), 미국 조지아주 노르크로스 소재)상에 로딩하여 사이토킨 및 케모킨의 발현 수준을 측정하였다. 래이바이오(상표) 분석 도구(래이바이오테크)를 사용하여 평균 신호 강도를 사이토킨의 상대적인 발현 수준과 관련시켰다.

결과

바큘로바이러스 벡터는 방광내 주입 후 마우스 방광을 유효하게 형질도입시킨다: 먼저 바큘로바이러스가 면역결핍 누드 마우스에서 방광을 형질도입시킬 수 있는지의 여부에 대해 평가하였다. 개똥벌레 루시페라제 유전자를 함유하는 3 개의 상이한 재조합 바큘로바이러스 벡터를 상기 방광에 방광내 주입 후에 시험하고 생체내 형질도입 효율을 IVIS 생 동물 영상화 시스템을 사용하여 모니터하였다(도 1A). 3 개의 벡터 모두, 상기 마우스 방광의 폴리-L-리신에 의한 전처리 후 상기 기관의 형질도입에 유효하였다. 2 개의 바이러스 전사 조절 요소 WPRE 및 RU5를 함유하는 상기 바큘로바이러스 벡터들 중 하나, BV-RU5-Luc-WPRE가 상기 방광에서 가장 높은 트랜스유전자 발현 수준을 제공하였다. 상기 3 개의 벡터에 의해 제공된 발현 수준은 시간이 지남에 따라 감소하였지만, 적어도 35 일 동안 배경 수준보다 현저하게 더 높게 남아있었다(도 1B).

면역-능력 C57BL/6 마우스에서(도 2A, 2B), BV-RU5-Luc-WPRE에 의해 제공된 초기 발현 수준은 면역결핍 누드 마우스에서 관찰된 것과 유사하지만, 그 수준은 급속히 떨어지고 검출 가능한 트랜스유전자 발현은 단지 대략 2 주 동안 지속되었다. 상기 두 유형의 마우스간의 트랜스유전자 발현의 차이는 바큘로바이러스 형질도입에 대한 강한 면역 반응을 가리킨다. 상기 방광에서 바큘로바이러스-매개된 트랜스유전자 발현은, 마우스당 10⁷ 바이러스 입자로 처리된 C57BL/6 마우스에서 1일째 루시페라제 발현 수준이 동물당 10⁸ 바이러스 입자로 처리된 것의 대략 1/4이라는 관찰에 의해 입증된 바와 같이(도 2A,B), 투여량-의존적이었다. 상기 루시페라제 단백질에 대한 항체에 의한 면역조직학적 염색은 바큘로바이러스-매개된 트랜스유전자 발현이 표재성 방광 상피에 국한됨을 입증하였다(도 2C).

바큘로바이러스 형질도입은 단독으로 방광 종양 성장을 지연시킬 수 있다: 면역-능력 C57BL/6 마우스에서 바큘로바이러스 형질도입시 상기 기관에서 사이토킨 및 케모킨의 발현을 조사하였다. 포유동물 유전자 발현 카세트가 없는 바큘로바이러스 벡터, BacPAK6을, 트랜스유전자 발현에 의한 가능한 간섭을 피하기 위해서 상기 목적에 사용하였다. 항체 배열 방법을 사용하여, 상기 사이토킨 및 케모킨의 59%의 상향 조절(>2 배 발현 증가로서 정의됨)이, PBS 주입된 방광 중 발현 수준에 비해 2일 전에 BacPAK6이 방광내 주입된 방광 중의 쥐 배열에서 검출되었다(32 개 중 19 개)(도 3A,B). 상위 5 개의 상향-조절된 단백질은 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 123-배 증가), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF, 35-배 증가), 피부 T 세포-유인 케모킨(CTACK, 10-배 증가), 트롬보포이에틴(TPO, 7-배 증가), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파, 7-배 증가)이었다. 어떠한 처리도 없는 정상 마우스 방광과 PBS 주입된 방광간의 비교는 상기 사이토킨 및 케모킨의 발현 수준에 있어서 현저한 차이가 없음을 보였다.

이어서 바큘로바이러스 형질도입시 상기 사이토킨 및 케모킨의 발현 수준 변화가 방광 종양 성장에 영향을 미치는지의 여부를 조사하였다. 상기 영향을 연구하기 위해 동계 동소 마우스 방광암 모델을 확립시키는 과정에서, MB49 세포가 낮은 접종 용량(동물당 1 x 10⁵ 암세포)에서조차 2 주 동안 상기 방광의 전체 관강을 차지할 정도로 급속히 성장함을 알았다(도 4A). 상기 마우스는 또한 공?적인 종양 성장으로 인해 급속히 사망하였으며, 이때 최초 동물 사망은 10일 내지 14일 사이였고 모든 동물의 사망은 대략 4 주 후였다(문헌[Gunther JH, et al., 1999]). MB49 세포의 이러한 특징은 정확한 방광내 주입의 수행 및 확립된 방광 종양 치료에 표적화된 실험적인 치료, 특히 면역 치료 모두를 어렵게 만들었다. 따라서, 보다 느린 성장 속도를 나타내었지만 여전히 높은 종양 확립률을 유지하는 MB49 마우스 방광암 계통의 서브클론, MB49S1 세포(도 4A)를 사용하여, C57BL/6 마우스에서 상기 세포의 폴리-L-리신 전처리된 방광에의 방광내 주입에 의해 방광 암 모델을 확립시켰다.

1 x 10⁵ MB49S1 세포의 접종 후 1 주일째에, 확립된 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 2 개의 그룹(동물당 n=10)으로 무작위로 분배하였다. 하나의 그룹에는 10⁸ BacPak6 바이러스 입자의 단일 주입을 제공하였고 또 다른 그룹에는 주입 대조군으로서 PBS를 제공하였다. 상기 방광 종양-함유 마우스의 현저하게 연장된 생존이 상기 방광에서 바큘로바이러스 자극 후 관찰되었다. 상기 대조군의 동물들은 모두 70일 이내에 사망하였지만, 상기 처리 그룹의 동물 중 50%는 종양 접종 후 6 개월째에 살아있었다(도 4B, 로그 순위 시험에서 p<0.01). 이러한 발견은 상기 방광에서 바큘로바이러스 형질도입시 사이토킨 및 케모킨의 상향조절이 종양억제 효과를 매개하는데 작용성이며 확립된 방광 종양을 치유하는 작용을 할 수 있음을 입증한다.

바큘로바이러스 벡터는 방광암 세포로의 고효율 유전자 전달 및 방광암에 대한 CD40L 유전자 요법을 매개할 수 있다: 바큘로바이러스 벡터를, 방광암에 트랜스유전자를 전달하는데 사용할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해서, 배양된 마우스 MB49 방광암 세포 및 인간 T24 방광암 세포를 시험관내에서 BV-RU5-Luc-WPRE로 형질도입시켰다. 상기 루시페라제 단백질에 대한 항체에 의한 면역염색은 상기 종양 세포에서 높은 수준의 루시페라제 발현을 입증하였다(도 5A). 동소 MB49 종양을 갖는 C57LB/6 마우스에서, BV-RU5-Luc-WPRE의 방광내 주입은 정상적인 방광 상피에서뿐만 아니라 상기 종양에서 명백한 트랜스유전자 발현을 생성시켰다(도 5). 상기 종양에서, 상기 종양의 표면층에서뿐만 아니라 내부 종양 구역에서도 양성 염색이 관찰되었으며, 이는 종양 중 상기 바이러스의 침투를 가리킨다.

상기 바큘로바이러스 벡터 BV-CD40L을, 상기 BV-RU5-Luc-WPRE 발현 카세트 중의 루시페라제 유전자를, 효능있는 T 헬퍼 1 면역 자극인자로서 작용하는 II형 막통과 단백질을 암호화하는 유전자, 쥐 CD40 리간드(CD40L) 유전자로 치환시킴으로써 제작하였다. 시험관내에서 MB49 세포 및 생체내에서 동소 MB49 종양에 바큘로바이러스 형질도입 시 CD40L 발현을 각각 RT-PCR(도 5C) 및 웨스턴 블럿팅(도 5D)을 사용하여 확인하였다.

BV-CD40L의 치료 효과를 시험하기 위해서, C57BL/6 마우스의 방광에 2 x 10⁴ DiR-표지된 MB49 세포의 접종에 의해 방광 종양 모델을 확립시켰다. 성공적인 종양 확립을, IVIS 생 동물 영상화 시스템을 사용하여 DiR 적외선 형광 신호를 모니터함으로써 확인하였다(도 6A). 종양 접종-후 4일째에, 마우스를 2 개의 그룹(그룹당 n=5)으로 무작위로 분배하고 동물당 10⁸ BV-CD40L 바이러스 입자 또는 대조용으로서 10⁸ BacPAK6 바이러스 입자의 방광내 주입을 통해 처리하였다. 상기 두 그룹에서 두 번째 및 세 번째 처리를 종양 접종-후 6 및 8일째에 수행하였다. 상기 마우스를 14일째에 죽이고 상기 방광 중 종양 발생 단계를 H&E 염색된 방광 조직 조각을 검사하여 평가하였다(도 6A). 상기 대조군에서, 종양은 5 마리의 동물 중 4 마리에서(# 1, 2, 4, 5) 심한 종양 괴사 및 근육층 내로의 종양 침습과 함께 말기 단계로 진행하였다. 상기 마우스에서 방광 요로상피가 완전히 손상되었으며 조직이 파괴되었다. 상기 처리 그룹에서, 종양 덩어리가 비교적 작았으며 요로상피에서 현저한 손상은 없었다. 일부 종양(#1 및 3)은 여전히 표재성이었고 다른 것들(#2, 4 및 5)은 상기 마우스 방광의 관강 내층의 세포층으로부터 결합 조직 아래로 성장하였으나, 아직 근육층까지는 성장하지 않았다. 상기 그룹의 평균 방광 중량은 대조군의 경우보다 통계학적 유의수준으로 더 낮았다(p<0.05, 도 6B). 이러한 발견은 바큘로바이러스를, 치료학적 유전자를 전달하여 공격적으로 성장하는 방광암을 치료하는 생체내 유전자 요법 벡터로서 사용하는 것이 가능할 수 있음을 가리킨다.

방광암-함유 마우스의 생존에 대한 CD40L 및 IL-15의 동시-전달 효과: 상기 BV-CMV-RU5-Luc-WPRE 및 BV-CD40L 바이러스 외에, BV-IL-15를, 상기 BV-RU5-Luc-WPRE 발현 카세트 중의 루시페라제 유전자를, 선천적인 면역계의 부분을 형성하는 세포인, 천연 살해 세포의 증식을 유도하는 사이토킨을 암호화하는 유전자, 쥐 인터류킨-15(IL-15) 유전자로 치환시킴으로써 제작하였다. BV-CD40L 바이러스 및 BV-IL-15 바이러스의 치료학적 효과를, 치료학적 유전자 발현을 확인하기 위해서 별도로 시험하고, 이어서 방광암-함유 마우스의 방광내로 동시-전달하였다. 상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입을 10⁵ MB49 세포의 접종 후 2일째에 수행하였다.

상기 결과들을 도 7에 나타낸다. 바큘로바이러스 벡터에 의한 CD40L 및 IL-15의 동시-전달은 방광 종양-함유 마우스의 생존을 연장시킬 수 있음이 관찰되었다(도 7A). CD40L 및 IL-15를 발현하는 바큘로바이러스 벡터의 조합에 의해 처리된 한 마리의 마우스에서, 상기 MB49 종양은 완전히 정지하였다(도 7B).

논의

포유동물에서 바큘로바이러스의 면역자극 효과는 가능하게는 방광 종양 성장을 억제하도록 치료학적으로 견인될 수 있다. 상기 가설은, 어떠한 트랜스유전자도 발현하지 않는 방광내 전달된 바큘로바이러스가 확립된 동소 방광암을 갖는 면역능력 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다는 관찰에 의해 지지된다. 이러한 동계 모델 시스템은 완전한 면역 기능을 제공하여, 방광암에 대한 치료 백신의 연구를 허용한다. 상기 종양-함유 동물의 단지 절반만이 비-트랜스제닉 바큘로바이러스 벡터의 단지 한 번의 주입 후에 치유되었지만, 방광내 주입의 횟수를 증가시킨다면 상기 생존은 개선될 수 있다. 상기 효능을 또한 치료 유전자를 상기 바큘로바이러스 벡터내에 포함시킴으로써 개선시킬 수 있다. 이에 관하여, 바큘로바이러스 벡터-매개된 CD40L 발현의 종양 억제 효과가 공격적으로 성장하는 방광암을 갖는 동물 모델에서 입증되었다.

따라서, 이러한 상술한 결과들은, 방광암의 동계 동소 동물 모델을 사용하여, 곤충 바큘로바이러스를 치료학적 백신화 및 치료학적 유전자 전달의 이중 작용과 함께 방광암 요법을 위한 신규의 작용제로서 사용할 수 있음을 입증하였다.

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Claims (22)

1. 핵산 분자를 방광 세포에 전달하는 방법으로, 상기 방광 세포를 바큘로바이러스 벡터와 접촉시킴을 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   방광 세포가 방광암 세포인 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   방광 세포가 시험관내에 있는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   방광 세포가 생체내에 있는 방법.
5. 제 4 항에 있어서,
   방광 세포가 방광암의 치료가 필요한 환자내에 있고, 접촉이 바큘로바이러스 벡터를 방광내 주입에 의해 상기 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   바큘로바이러스 벡터가, 방광 세포에서 트랜스유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 방광 세포에서의 발현을 위한 상기 트랜스유전자를 또한 포함하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   트랜스유전자가 방광암의 치료를 위한 치료학적 트랜스유전자인 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   치료학적 트랜스유전자가 CD40L 또는 IL-15를 암호화하는 방법.
9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   프로모터가 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터를 포함하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,
    인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터가 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 방법.
11. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    바큘로바이러스 벡터가 트랜스유전자의 3' 번역되지 않은 영역 중에 우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소를 또한 포함하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서,
    우드척 간염 바이러스로부터의 전사-후 조절 요소가 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하는 방법.
13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    바큘로바이러스 벡터가 트랜스유전자의 5' 번역되지 않은 영역 중에, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부를 또한 포함하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1로부터의 긴 말단 반복부의 R 단편 및 U5 서열의 적어도 일부가 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    접촉 전에 또는 접촉과 동시에 형질감염제를 첨가함을 또한 포함하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서,
    형질감염제가 폴리-L-리신, 클로르팩션(Clorpaction) WCS-90, 도데실-B-dd-말토사이드(DDM), 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
17. 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 상기 방광암의 치료에 사용하기 위한 바큘로바이러스 벡터로, 상기 용도가 상기 환자에서 상기 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입을 포함하는 벡터.
18. 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의해 상기 방광암을 치료하기 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도.
19. 방광암의 치료가 필요한 환자에게서 바큘로바이러스 벡터의 방광내 주입에 의해 상기 방광암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 바큘로바이러스 벡터의 용도.
20. 환자의 방광에서 방광내 주입에 사용하기 위한 바큘로바이러스 벡터.
21. 환자의 방광에서 방광내 주입을 위한 바큘로바이러스 벡터의 용도.
22. 환자의 방광에서 방광내 주입을 위한 약제의 제조를 위한 바큘로바이러스 벡터의 용도.
    
    

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