CN104797261A - 使用杆状病毒载体的膀胱癌治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用杆状病毒载体将核酸分子递送至膀胱细胞的方法和用途。将膀胱细胞与杆状病毒载体接触，后者还可包含转基因。

Description

使用杆状病毒载体的膀胱癌治疗方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请第61/622,376号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及使用杆状病毒载体治疗或预防膀胱癌的方法。

发明背景

膀胱癌是尿道中最常见的恶性肿瘤形式。在美国，2011年预计有69,000例新增病例和近15,000人死亡(Siegel R等，2011)。在新加坡，膀胱癌是男性中第9大常见癌症。

几乎所有膀胱癌都是从变移上皮产生的且因此称为变移细胞癌(TCC)。大部分的膀胱TCC在初始诊断中是浅表性的、非肌肉浸润性的。然而，尿道切除后表面TCC的复发率可以高达70％，必需进行辅助治疗以控制复发和进展。

辅助治疗通常使用卡介苗(BCG)以膀胱内免疫治疗的形式给予具有中度或高度癌症复发风险的患者。BCG由减毒的活牛结核菌生成并可激活CD4+Th1细胞因子(如白介素2(IL-2)、IL-12、IL-18和干扰素γ(INF-γ))介导的先天免疫应答。然而，由于BCG难治性、耐药性、复发或不耐受，多达40％的患者会在第一年中发生BCG免疫治疗失败(Zlotta AR等，2009；Chiong和Esuvaranathan，2010)。因此，存在开发新的辅助疗法以提高浅表性膀胱癌患者治疗结果的需要。

已被开发作为可能的膀胱癌辅助治疗的基于病毒载体的基因治疗包括疫苗病毒(Lee SS等，1994；Gomella LG等，2001；Siemens DR等，2003；Fodor I等，2005)、腺病毒(Morris BD等，1994；Sutton MA等，2007；Kuball J等，2002；Siemens DR等，2003；Pagliaro LC等，2003；PU等，2010)、金丝雀痘病毒(Siemens DR等，2003)、呼肠孤病毒(Hanel EG等，2004)、逆转录病毒(Shiau AL等，2001；Kimura T等，2003；Dumey N等，2005；Kikuchi E等，2007)、慢病毒(Kikuchi E等，2004)和水泡性口炎病毒(Hadaschik BA等，2008)。已报道了至少5个临床实验，其涉及使用复制型疫苗病毒和腺病毒载体治疗膀胱癌(Gomella LG等，2001；Kuball J等，2002；Pagliaro LC等，2003；Burke J，2010；PU等，2010)。

经测试用于癌症基因治疗的多种类型病毒载体中有反转录病毒。反转录病毒的生命周期包括宿主基因组中的整合状态，从而允许治疗基因的长期、稳定表达。关于反转录病毒使用的一个主要问题是这些载体优先整合至基因组的转录活跃区域，这会导致插入突变、癌基因激活和细胞转化。进行SCID-X1的基因治疗后法国和英国数名儿童发生白血病(Hacein-Bey-Abina等，2003)使得病毒载体相关的潜在风险受到严格审查。

腺病毒和腺相关病毒(AAV)来源的病毒载体具有低得多的插入突变风险且已经过癌症基因治疗的测试(Cross和Burmester，2006；Palmer等，2006)。还在动物模型和至少4个早期临床试验中对腺病毒载体进行了膀胱癌基因治疗的广泛测试(Kuball J等，2002；Pagliaro LC等，2003；Burke J，2010；PU等，2010)。然而，作为感染性人病毒，腺病毒和AAV激活人免疫系统(CalcedoR等，2009；Huang和Yang，2009；Nayak和Herzog，2010)。AAV载体有效地激活B细胞(Huang和Yang，2009)且根据年龄组和地理位置，在35至80％的个体中检测到了针对AAV2的特异性抗体(Calcedo R等，2009)。虽然处于非常低的频率，AAV衣壳特异性CD8+记忆T细胞存在于人中并可在AAV转导后被重新激活(Nayak和Herzog，2010)。针对腺病毒的预存免疫甚至是更普遍的(BessisN等，2004；Nayak和Herzog，2010)。在超过97％的人中检测到了针对C群腺病毒的预存抗体，并在约50％的人中检测到了通常用于产生腺病毒载体的针对血清型2腺病毒的预存抗体(Nayak和Herzog，2010)。对于T细胞介导的免疫，在人外周血中检测到了针对不同腺病毒血清型的CD4+和CD8+交叉反应性T细胞(Nayak和Herzog，2010)。

鉴于可能的不希望发生的排斥反应，对于在基因治疗中使用人感染性病毒来源的载体，预存免疫是一个问题。在预存抗病毒免疫不会引起严重病理变化的情况下，仍能够使病毒载体失活，从而影响转导效率。在没有预存免疫的患者中，由于腺病毒是高度免疫原性的，腺病毒载体会在第一次给药后迅速发挥强的抗病毒免疫性。该反应会阻止载体的进一步使用或使得后续使用的有效性较低。

发明内容

已在肿瘤模型中对病毒(复制型病毒或复制缺陷型重组病毒载体)进行了膀胱癌治疗的测试。然而，作为膀胱疗法的人感染性病毒具有显著的缺点，包括预存免疫和强免疫原性相关的问题。相反地，发明人发现基于昆虫杆状病毒的载体可为膀胱癌治疗提供合适的载体。

因此，本文所述复发涉及使用杆状病毒治疗膀胱癌，包括作为辅助治疗以在浅表性肿瘤切除后防止或降低膀胱癌的复发风险。由于目前病毒载体系统的有效性和安全性方面的限制，杆状病毒载体提供了一种可行的替代方案，用于作为辅助治疗以诱导免疫或作为载体以递送治疗性核酸。

发明人证明，经膀胱内递送的杆状病毒载体能够有效地转导正常的(非癌症携带的)小鼠膀胱。在病毒基因组中整合有哺乳动物表达盒(包含人巨细胞病毒即时早期基因启动子)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件以及来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和一部分U5序列的杆状病毒载体可提供高水平的体内转导效率。

而且，发明人发现单独的杆状病毒转导(杆状病毒载体中不包括任何治疗性转基因)可刺激抗肿瘤免疫。通过使用鼠细胞因子/趋化因子抗体阵列以分析收集自接受膀胱内给予不含任何转基因的杆状病毒的小鼠的膀胱组织提取物，阵列中59％的蛋白显示超过2倍的表达增加，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子和皮肤T细胞虏获趋化因子的上调。发现使用杆状病毒治疗能够延长具有原位膀胱癌小鼠的存活，50％的动物存活了超过6个月。

通过使用杆状病毒载体以将CD40配体基因递送至具有侵略性原位膀胱癌发展的小鼠的膀胱中，观察到肿瘤的优先转导以及随后肿瘤生长和平均膀胱重量的降低。

因此，直接经膀胱内灌注杆状病毒和杆状病毒基因转移载体能为膀胱癌提供全新的治疗方案。

在一个方面，本发明提供了一种向膀胱细胞递送核酸分子的方法，包括使膀胱细胞接触杆状病毒载体。

该细胞可以是膀胱癌细胞或健康的非癌膀胱细胞，并且可以是体外或体内细胞，包括在需要膀胱癌治疗的对象中。当该细胞是对象中的细胞时，接触可包括通过膀胱内灌注向该对象给予杆状病毒载体。

该杆状病毒载体还包括用于在膀胱癌细胞中表达的转基因，其可操作地连接至驱动该转基因在膀胱细胞中表达的启动子。例如，该转基因可以是用于治疗膀胱癌的治疗性转基因，包括例如编码CD40L或IL-15的治疗性转基因。

在该杆状病毒载体中，启动子可包括人巨细胞病毒立即早期启动子，包括SEQID NO:1所列序列。

杆状病毒载体还可包括来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件，位于转基因的3’非翻译区，包括例如SEQ ID NO:2所列序列。

杆状病毒载体还可包括来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列，位于转基因的5’非翻译区，包括例如SEQ ID NO:3所列序列。

该方法还可包括在使膀胱细胞接触杆状病毒载体之前或同时加入转染试剂。所述转染试剂可以是例如聚L-赖氨酸、Clorpaction WCS-90、十二烷基-B-dd-麦芽苷(DDM)或十二烷基硫酸钠(SDS)或其任何组合。

为与本文所述方法保持一致，本发明提供了杆状病毒载体的多种用法。

因此，在另一个方面，本发明提供了用于治疗需要这类治疗的对象中膀胱癌的杆状病毒载体，其中用法包括在对象内经膀胱内灌注杆状病毒载体。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在对象的膀胱中经膀胱内灌注的杆状病毒载体。

在另一个方面，本发明提供了用于通过经膀胱内灌注杆状病毒载体来治疗需要这类治疗的对象中膀胱癌的杆状病毒载体的用途。

在另一个方面，本发明提供了杆状病毒载体的用途，该杆状病毒载体用于制造通过经膀胱内灌注该杆状病毒载体来治疗需要这类治疗的对象中膀胱癌的药物。

在另一个方面，本发明提供了用于在对象的膀胱中经膀胱内灌注的杆状病毒载体的用途。

在另一个方面，本发明提供了杆状病毒载体的用法，该杆状病毒载体用于制造用于在对象的膀胱中经膀胱内灌注的药物。

本领域技术人员根据本发明下面的具体实施方式的描述以及附图和表将会明白本发明的其它方面和特征。

附图简要说明

下列显示的附图和表仅仅是以举例方式说明了本发明的实施方式。

图1.在balb/c裸小鼠中经膀胱内灌注后小鼠膀胱的杆状病毒转导。(A).使用3种不同杆状病毒载体转导的代表性动物中荧光素酶报告基因表达的生物发光图像。热图代表转基因表达区域且颜色代表强度。左侧显示了杆状病毒载体表达盒的示意性结构。缩写：CMV：人巨细胞病毒立即早期基因启动子和增强子；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；RU5：来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和部分U5序列。(B).荧光素酶报告基因表达的时程分析。通过测量生物发光信号对体内基因表达进行定量。数据以平均值+偏差的形式显示，每组n＝3。

图2.在C57L/B6小鼠中经膀胱内灌注后小鼠膀胱的杆状病毒转导。(A)代表性动物中荧光素酶报告基因表达的生物发光图像。使用杆状病毒载体BV-RU5-Luc-WPRE以每只小鼠10⁸或10⁷个病毒颗粒的剂量转导小鼠。(B)荧光素酶报告基因表达的时程分析。通过测量生物发光信号对体内基因表达水平进行定量。数据以平均值+偏差的形式显示，每组n＝3。(C)使用针对荧光素酶蛋白的抗体进行免疫染色以显示膀胱内的杆状病毒转导。在杆状病毒转导后24小时收集组织切片。显示了低放大倍数图像和高放大倍数图像。包括苏木精和伊红的染色以显示杆状病毒转导后正常膀胱的结构。

图3.杆状病毒转导使膀胱内细胞因子/趋化因子表达上调。(A)收集自C57L/B6小鼠的样品的代表性印迹图像，所述小鼠不接受膀胱内灌注(正常)、分别接受膀胱内PBS和BacPAK6灌注。在灌注后48小时收获膀胱并进行匀浆。上清液用于探测细胞因子/趋化因子抗体阵列。(B)杆状病毒转导后小鼠膀胱内细胞因子和趋化因子的相对上调。使用分析工具分析密度计量数据。显示了倍数变化(平均信号强度差异)。数据以平均值+偏差的形式显示，每组n＝3。

图4.杆状病毒转导的抗肿瘤效果。(A)膀胱内接种小鼠膀胱癌细胞后膀胱中的肿瘤发展。以每只动物10⁵个癌细胞测试了两种类型的小鼠膀胱癌细胞MB49和MB49S1(MB49细胞的亚克隆)。在接种后14天收获膀胱。H&E染色显示与亲本MB49细胞接种所形成的肿瘤相比，MB49S1肿瘤具有缓慢的生长速率。(B)BacPAK6转导延长了具有膀胱癌的小鼠的存活。在接种10⁵个MB49S1细胞后7天进行了BacPAK6(一种不具有哺乳动物基因表达盒的杆状病毒载体)的膀胱内灌注。显示了直至第95天的存活曲线。每组n＝10。使用对数秩检验进行统计学分析。

图5.杆状病毒载体调节膀胱癌细胞中的CD40L表达。膀胱癌模型中杆状病毒载体的转导效率。(A)杆状病毒能够在体外和体内转导膀胱癌细胞。使用杆状病毒载体BV-RU5-Luc-WPRE以转导小鼠MB49膀胱癌细胞、人T24膀胱癌细胞和通过接种MB49细胞形成的小鼠原位膀胱肿瘤。通过使用针对荧光素酶蛋白的抗体进行的免疫染色显示杆状病毒转导后24小时收集的细胞和组织切片中荧光素酶报告基因表达。H&E染色显示了膀胱肿瘤生长。(B)CD40L的杆状病毒载体表达盒的示意性结构。(C)RT-PCR显示体外BV-CD40L转导后24小时MB49细胞中的CD40L表达。(D)通过Western印迹显示的小鼠MB49膀胱肿瘤中的CD40L表达。在接种10⁵个MB49细胞后3天进行BV-CD40L的膀胱内灌注。在BV-CD40L转导后24小时收集膀胱。

图6.杆状病毒介导的CD40L表达的抗肿瘤效果。在接种2x 10⁴个DiR标记的MB49细胞后3天进行BV-CD40L的膀胱内灌注。包括膀胱内灌注BackPAK6以作为转导对照。在杆状病毒转导后1周收集膀胱用于分析。(A)CD40L表达延缓肿瘤生长。DiR荧光图像显示各动物中最初的肿瘤负担，H&E染色显示肿瘤发展。(B)膀胱重量差异。数据以平均值+偏差的形式显示，每组n＝5。*通过斯氏t检验相对BacPAK6组p<0.05。

图7.共同递送CD40L和IL-15对于具有膀胱癌小鼠存活的影响。(A)通过杆状病毒载体共同递送CD40L和IL-15延长了具有膀胱癌小鼠的存活。在接种10⁵个MB49细胞后2天进行杆状病毒载体的膀胱内灌注。显示了直至第100天的存活曲线。(B)H&E染色显示使用表达CD40L和IL-15的杆状病毒载体治疗的一只小鼠中MB49肿瘤完全停止了。

发明详述

本文所述方法和用法涉及杆状病毒载体可用于膀胱癌治疗的发现，包括在已患有膀胱癌的对象中降低或防止癌症复发。杆状病毒载体可不含任何转基因插入，用于刺激抗肿瘤免疫应答。可在杆状病毒载体中包括治疗性核酸以加强或补充抗肿瘤应答。在某些条件下，包括在膀胱内递送的情况下，杆状病毒载体可优先转导膀胱肿瘤细胞而不转导健康的非癌膀胱细胞。

因此，提供了一种使用杆状病毒载体将核酸分子递送至膀胱细胞的方法。所述方法包括使膀胱细胞接触杆状病毒载体，导致膀胱细胞被杆状病毒载体转导。

应理解，通过病毒或病毒载体进行细胞转导指将病毒载体或病毒基因组递送至细胞内，即由病毒核酸材料感染细胞。在由杆状病毒载体进行哺乳动物细胞转导的情况下，转导并不指产物感染或病毒基因组在细胞内复制的能力。

进行接触的膀胱细胞可以是任何膀胱细胞。所述膀胱细胞可以是体外膀胱细胞，包括组织培养物中的细胞，如来自已建立的膀胱细胞系的细胞、组织培养物中的原代膀胱细胞、来自对象的外植的膀胱细胞、转化或永生化的膀胱细胞。所述膀胱细胞可以是对象中的体内膀胱细胞，包括哺乳动物对象中，包括人对象。例如，所述膀胱细胞可以是在需要膀胱癌治疗的对象中。所述膀胱细胞可以是转基因膀胱细胞，包括体外或体内环境中，包括例如包含转基因膀胱细胞的动物模型。

所述膀胱细胞可以是健康的，即非癌膀胱细胞，或者其可以是膀胱癌细胞，包括肿瘤中或从肿瘤上切下的膀胱癌细胞，或者其可以是倾向于成为癌细胞的膀胱细胞，包括例如携带倾向于使膀胱细胞成为癌细胞的突变的膀胱细胞。

与膀胱细胞接触的杆状病毒载体可以是任何杆状病毒载体。杆状病毒载体是本领域已知的，且最常使用的杆状病毒载体来源于苜蓿银纹夜蛾多重核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)。杆状病毒是一种昆虫DNA病毒，其具有进入哺乳动物细胞的能力但不复制或对所转导细胞产生毒性。杆状病毒在增殖的和非增殖的、静息的细胞中都具有广泛的趋向性，在哺乳动物活性启动子的支持下能够在体外和体内有效地将感兴趣的基因转移至多种哺乳动物细胞类型中。该病毒可进入哺乳动物细胞但不能通过昆虫特异性启动子表达其自身基因；因此，杆状病毒无法复制并在脊椎动物细胞中表达病毒蛋白，因此不会引起作为病毒编码基因体内表达结果的免疫应答、不会与预存的病毒材料重新结合，也不会协助人体中其他病毒的复制。哺乳动物细胞中杆状病毒的感染引起不可见的细胞病变效应，甚至在高MOI时也是如此(Shoji等，1997)。

使用杆状病毒AcMNPV例如作为基因递送载体的另一个吸引人的优势是其130kb病毒基因组赋予的大克隆容量，优选用于从单个载体递送大的功能基因或多个基因。在人细胞中，携带哺乳动物表达盒的杆状病毒载体能够有效地调节瞬时表达，因为转基因载体通常不会整合至所转导细胞的基因组中。因此，理想情况下，杆状病毒载体适用于需要短期、高水平转基因表达的应用并具有低的插入突变风险。

杆状病毒转导的另一个重要优势是人体中不存在针对昆虫表达的预存免疫(Wang S等，2010)，因为该表达并不对人传染。Strauss等报道了人血清样品中针对5型腺病毒的中和抗体的普遍程度为65％，而无一血清样品对杆状病毒中和抗体呈阳性(Strauss R等，2007)。在同一研究中，在人体中可检测到预存的腺病毒特异性T细胞，但没有预存的杆状病毒特异性T细胞。与腺病毒相比，杆状病毒具有较低的免疫原性，这可以由较少数目的病毒特异性T细胞得到诱导证明(Strauss R等，2007)。

而且，与许多其他基因治疗病毒载体不同，杆状病毒载体可在无血清细胞培养基中产生，这就消除了来自贡献血清的动物的病毒和朊病毒物质所造成的潜在血清污染危险。

不含任何转基因，杆状病毒自身可以是待递送至膀胱细胞的核酸。即，递送可导致细胞被杆状病毒载体核酸物质转导或将其吸收。

在其他实施方式中，杆状病毒载体可包括编码将在膀胱细胞中表达的表达产物的转基因编码序列。应理解，编码表达产物的转基因编码序列将可操作地连接至所有必需的调控序列，包括启动子区域，以在膀胱细胞中产生所需的表达产物的表达概况。当序列以功能关系设置时，第一核酸序列可操作地连接至第二核酸序列。例如，编码序列可操作地连接至启动子，前提是所述启动子激活并驱动该编码序列的转录。因此，与膀胱细胞接触的杆状病毒载体还可包括用于在膀胱细胞中表达的转基因，其可操作地连接至驱动该转基因在膀胱细胞中表达的启动子。

在一些实施方式中，可操作地连接至转基因编码序列的启动子包括人巨细胞病毒立即早期启动子。在一些实施方式中，该启动子包括具有SEQ ID NO:1所列序列的人巨细胞病毒立即早期启动子。

TTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC[SEQ ID NO:1]

在一些实施方式中，杆状病毒载体包括基本由具有SEQ ID NO:1所列序列的人巨细胞病毒立即早期启动子组成的启动子。在一些实施方式中，所述启动子由具有SEQ ID NO:1所列序列的人巨细胞病毒立即早期启动子组成。

本文中使用的“基本由……组成”指该核酸序列包括一个或多个核苷酸碱基，包括在序列内或序列的一个或两个末端处，但额外的核苷酸碱基不会实质影响核苷酸序列的功能，例如在膀胱细胞中作为启动子以驱动可操作连接的编码序列表达。

在其他实施方式中，所述启动子是与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列相同性，同时仍保留驱动膀胱细胞中基因表达能力的人巨细胞病毒立即早期启动子。

所述杆状病毒载体还可包括转录后调节元件，包括例如来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件，位于转基因的3’非翻译区。在一些实施方式中，所述杆状病毒载体包括包含SEQ ID NO:2所列序列的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。

CGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTG[SEQ ID NO:2]

在一些实施方式中，杆状病毒载体包括基本由SEQ ID NO:2所列序列组成的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。在一些实施方式中，杆状病毒载体包括由SEQ ID NO:2所列序列组成的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。

在其他实施方式中，在一些实施方式中，杆状病毒载体包括与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列相同性，同时仍保留指导膀胱细胞中基因表达能力的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。

杆状病毒载体还可在转基因的5’非翻译区包括来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列，包括例如其中来自包含SEQ ID NO:3所列序列的1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列。

GGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC[SEQ ID NO:3]

在一些实施方式中，杆状病毒载体包含基本由SEQ ID NO:3所列序列组成的来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列的上游5’调控区。在一些实施方式中，所述杆状病毒载体包含由SEQ ID NO:3所列序列组成的来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列的上游5’调控区。

在其他实施方式中，在一些实施方式中，杆状病毒载体包括与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列相同性，同时仍保留指导膀胱细胞中基因表达能力的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。

可使用本领域技术人员已知的标准技术(如PCR和分子克隆技术)对杆状病毒载体进行修饰。例如可使用市售可得的克隆和表达系统，如BAC-TO-BAC^TM杆状病毒表达系统(吉布可BRL公司(Gibco BRL)，生命技术公司(LifeTechnologies)，美国)，容易地对杆状病毒进行修饰。

除调控区外，所述杆状病毒还可包括转基因编码序列。术语转基因指对杆状病毒而言是外源的基因，满足例如，由杆状病毒载体表达转基因指表达对杆状病毒基因组而言是外源的基因。转基因编码序列可编码需要在膀胱细胞中表达的任何表达产物。例如，转基因可编码治疗性蛋白或RNA、选择性蛋白或RNA标记物、可检测的报告蛋白或RNA或者为膀胱细胞对选择性环境调节提供抗性的RNA或蛋白。转基因还可编码调控RNA，例如调控膀胱细胞中基因表达的miRNA。

例如，转基因可编码用于治疗膀胱癌的治疗性表达产物。因此转基因可以是治疗性转基因，包括具有临床用途的任何基因，如编码涉及癌症预防或治疗的基因产物(如RNA或蛋白)的基因，或者涉及癌症预防或治疗的具有细胞调节作用的基因。该基因产物可取代对象中缺陷或缺失的基因产物、蛋白或细胞调节作用，从而实现膀胱癌的预防或治疗。

因此，治疗性表达产物包括在膀胱细胞中表达时对细胞具有治疗作用或在膀胱细胞中产生所需结果的蛋白或肽。

治疗性表达产物可以是RNA分子，例如反义RNA、miRNA或小干扰RNA(siRNA)分子，其导致膀胱细胞中的基因表达调控，提供临床上有用的调节。这些反义RNA、miRNA或siRNA可涉及下调或抑制或降低涉及肿瘤发生或肿瘤生长的基因的表达。

例如但不限于，治疗性转基因可编码CD40L或IL-15蛋白。在一个实施例中，编码CD40L和IL-15的治疗性转基因可在同一对象中联合使用以达到治疗效果。CD40L和IL-15转基因可同时包括在同一杆状病毒载体中，或可包括在不同杆状病毒载体中并随后递送至同一对象。

为将核酸分子递送至膀胱细胞，使膀胱细胞与杆状病毒载体接触。接触可包括例如将杆状病毒载体加入含有膀胱细胞的组织培养基中，使得杆状病毒载体转导膀胱细胞。接触可包括将杆状病毒载体给予对象。

因此，核酸分子将要递送至的膀胱细胞可以是在需要治疗或预防膀胱癌的对象体内，包括哺乳动物，包括人。

因此，该方法可在体内膀胱细胞是癌细胞、是肿瘤的一部分、倾向于成为癌细胞或待预防使之不会变成癌细胞的情况下进行。

因此，使膀胱细胞接触杆状病毒载体包括向对象给予有效量的杆状病毒载体。本文所用术语“有效量”指有效地实现所需结果必需的剂量和持续的时间的量，例如为治疗或预防膀胱癌，包括预防或降低之前已患有膀胱癌(包括浅表性膀胱癌，包括TCC)的患者中膀胱癌的复发风险。

相对于膀胱癌，本文所用“治疗”指用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果可包括但不限于一种或多种症状或病症的改善或缓和、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定、疾病发展的预防、疾病扩散的预防、疾病复发的预防、疾病进展或复发的延迟或延缓、疾病发生的延迟或延缓、疾病状态的缓和或减轻，以及缓解(部分或全部)。“治疗”还可表示将对象的存活期延长至超过不进行治疗的情况下所能预期的存活期。“治疗”还可指抑制疾病的进展或复发、暂时性延缓疾病的进展或复发，但更优选地，其涉及永久性阻止疾病的进展或复发。

已提出将来源于昆虫杆状病毒苜蓿银纹夜蛾多重核型多角体病毒(AcMNPV)的重组载体作为用于基因治疗(包括用于癌症基因治疗)的载体(Hofmann C等，1995；Kost TA等，2005；Hu YC，2008，2010；Wang S等，2010)。Takaku等通过杆状病毒激活NK细胞依赖的抗肿瘤免疫(Kitajima M等，2008a)。杆状病毒诱导的抗肿瘤作用可涉及通过增强肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和肿瘤特异性抗体生成实现的获得性免疫(Kitajima M等，2008b；Suzuki T等，2010)。因此，杆状病毒的免疫刺激特性可用于所述方法以进行癌症免疫治疗。

可使用本领域已知的标准技术将杆状病毒载体给予对象。该杆状病毒载体可系统性给予，或可通过膀胱内灌注给予至膀胱。

应理解，膀胱是一种空心器官，允许非外科手术的膀胱内给药通过尿道导管并通过内窥镜的方法评估疗效。利用经膀胱内递送的治疗剂在局部起作用，系统性暴露有限，且浅表性膀胱癌易于接近。

通过哺乳动物细胞的体内杆状病毒转导，系统性递送的杆状病毒载体的失活可导致病毒被血清补体蛋白(先天免疫系统的主要组分)识别的后果(Hofmann C等，1998)。在免疫活性动物中，系统性递送的杆状病毒载体可能无法表达。杆状病毒的高效价已被用于克服补体中和病毒的能力；然而，该方法仍无法导致杆状病毒介导的转基因表达(Kitajima M等，2008a)。因此，可通过尿道在膀胱内插入导管进行膀胱癌治疗以避免系统性病毒给予的许多缺陷，如血清补体使病毒失活。

如本文所述方法所示，经膀胱内给予的杆状病毒可显示出强的免疫刺激能力以诱导炎症细胞因子的表达或促进其释放。该发现与先前的研究一致，先前的研究发现注射进动物体后杆状病毒可引起保护性先天免疫应答。杆状病毒还可诱导适应性免疫，其特征是特异性针对病毒基因产物的免疫应答(Pieroni等，2001；Abe等，2005)。

不受理论的限制，可治疗性利用上述免疫刺激作用以抑制肿瘤生长。该假说得到了以下观察的支持，即经膀胱内递送不表达任何转基因的杆状病毒能够延长具有已建立的原位膀胱癌的免疫活性小鼠的存活。该同源模型系统提供了完整的免疫功能，允许进行针对膀胱癌的基于治疗性杆状病毒的治疗的研究。

为提高杆状病毒载体经膀胱内灌注后膀胱细胞的摄取效率，所述方法还包括使用转染试剂。例如，在使杆状病毒载体经由膀胱内灌注接触膀胱细胞前，可首先使用转染试剂处理评估一段给定时间。

转染试剂是本领域已知的；例如，所述转染试剂可以是聚L-赖氨酸、ClorpactionWCS-90、十二烷基-B-dd-麦芽苷(DDM)或十二烷基硫酸钠(SDS)或其任何组合。

然而，我们观察到，在不使用转染试剂对膀胱细胞进行任意预处理的情况下使用所述方法会改变健康(非癌)膀胱细胞相比膀胱癌细胞对杆状病毒载体的摄取。因此，在一些实施方式中，所述方法省去了转染试剂的任意使用，从而与健康膀胱细胞相比优先靶向膀胱癌细胞。

待给予杆状病毒载体的浓度和量可以变化，取决于待治疗的膀胱癌、杆状病毒载体中所包括转基因的类型、给药模式、其他同时进行的治疗以及对象的年龄和健康程度。通过改变膀胱内灌注的频率，可以提高存活和癌症预防或治疗。

如上文所述，可通过在杆状病毒载体中包括治疗性转基因以提高杆状病毒载体的效率。

为帮助给药，杆状病毒载体可配制为药物组合物的成分。

因此，还提供了包含上述杆状病毒载体和可选的药学上可接受的稀释剂的药物组合物。这类药物组合物可用于治疗膀胱癌，如上文所述。

组合物可以常规地包含药学上可接受浓度的盐、缓冲试剂、防腐剂和各种相容性载体。对于所有递送形式，杆状病毒载体都在生理盐水溶液中配制。

药学上可接受稀释剂的比例和特性可由选定的给药途径、与肝细胞和肝病毒颗粒的相容性和标准药学实践所决定。通常，药物组合物可使用不会杀伤或显著损伤杆状病毒载体的生物学特性的组分配制。

可通过适于向对象给药的药学上可接受的组合物制备的已知方法制备该药物组合物，使得有效量的杆状病毒载体和任何其他活性物质混合于具有药学上可接受的载剂的混合物中。例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》，麦克出版公司，美国宾夕法尼亚州伊斯顿，1985)中描述了合适的载剂。基于此，药物组合物可包括但不限于杆状病毒载体溶液，连同一种或多种药学上可接受的载剂或稀释剂，并包含于具有合适pH和使用生理流体等渗的缓冲溶液中。

药物组合物需使用的剂量取决于待治疗的具体病症、病症的严重程度、对象个体参数(包括年龄、身体状况、尺寸和重量)、治疗的持续时间，(若有的话)同时治疗的特性、具体的给药途径和卫生专业人员知识和技能范围内的其它类似因素。这些因素是本领域技术人员已知的，并可用最少的常规实验解决。

还涉及了所述杆状病毒载体的多种用法。因此，提供了用于在需要膀胱癌治疗的对象中进行膀胱内灌注的杆状病毒载体，杆状病毒载体在通过膀胱内灌注杆状病毒载体治疗需要这类治疗的对象中的膀胱癌中的用途，杆状病毒载体在制造用于通过膀胱内灌注杆状病毒载体治疗需要这类治疗的对象中的膀胱癌的药物中的用途，杆状病毒载体在需要膀胱癌治疗的对象中进行膀胱内灌注中的用途，以及杆状病毒载体在制造用于在需要膀胱癌治疗的对象中进行膀胱内灌注的药物中的用途。

本发明的方法和用途用以下非限制性实施例进一步举例说明。

实施例

实施例1

研究了用于膀胱癌治疗的基于昆虫杆状病毒的载体的用途。首先显示了经膀胱内递送的杆状病毒载体可有效地转导正常小鼠膀胱。在测试的3种不同杆状病毒载体中，通过在病毒基因组中整合有哺乳动物表达盒(包含人巨细胞病毒即时早期基因启动子、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件以及来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和一部分U5序列构建)的新的重组杆状病毒载体提供了最高的体内转导效率。随后研究了单独的病毒转导是否能够刺激抗肿瘤免疫。通过使用鼠细胞因子/趋化因子抗体阵列以分析收集自接受膀胱内给予不含任何转基因的杆状病毒的小鼠的膀胱组织提取物，阵列中59％的蛋白(32个中的19个)显示超过2倍的表达增加，其中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子和皮肤T细胞虏获趋化因子是上调最大的三个蛋白。更重要地，治疗显著延长了具有原位膀胱癌小鼠的存活，50％的动物存活了超过6个月。使用杆状病毒载体以将CD40配体基因经膀胱内递送至具有侵略性原位膀胱癌发展的小鼠的膀胱中时，检测到肿瘤的优先转导以及随后肿瘤生长和平均膀胱重量的降低。

材料与方法

杆状病毒制备：根据生产商的说明手册，使用BAC-to-BAC^TM杆状病毒表达系统(英杰公司(Invitrogen))构建重组杆状病毒载体CMV-Luc、CMV-Luc-WPRE和CMV-RU5-Luc-WPRE。CMV-Luc包含在人巨细胞病毒(CMV)早期启动子控制下的荧光素酶基因。CMV-Luc-WPRE在3’非翻译区(UTR)处具有额外的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。CMV-RU5-Luc-WPRE在5’UTR处具有另一个调控元件RU5，来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和部分U5序列。使用相应的杆状病毒质粒(bacmid)通过Sf9昆虫细胞的转染生产这些表达荧光素酶的病毒。在用包含表达盒和线性化AcMNPV病毒DNA(克隆泰克公司(Clonetech))的pBacPAK9转移载体共转染Sf9昆虫细胞后，通过同源重组生产BV-CD40L(CD40配体)病毒，该病毒含有CMV启动子(在5’UTR处具有RU5且在3’UTR处具有WPRE)控制下的小鼠CD40L基因(英杰公司)。BV-IL-15(白介素15)病毒的构建方法与BV-CD40L类似，但使用小鼠IL15基因。具有受病毒多角体蛋白启动子驱动的lacZ基因的亲本病毒BacPAK6获自克隆泰克公司。以0.1的MOI在Sf9细胞中扩增重组杆状病毒并在病毒感染后3天收集含病毒的上清液。病毒以28,000g沉淀1小时并重悬于PBS中。

细胞系和体外杆状病毒转导：Sf9昆虫细胞(英杰公司)维持在sf-900III无血清培养基(英杰公司)中。鼠膀胱癌细胞系MB49来自Esuvaranathan博士(国立大学医院，新加坡)的馈赠，并且人膀胱癌细胞系T24购自ATCC。细胞系在37℃和5％CO₂下维持在补充有10％胎牛血清(犹他州洛根的海克隆公司(Hyclone))、2mM L-谷胺酰胺、1％青霉素和链霉素(西格玛公司(Sigma))的RPMI 1640中。为获得具有变化的生长行为的克隆MB49变体以促进我们对于膀胱癌生长的分子机制的理解，使用pRC2/CMV-Luc(一种质粒，具有CMV启动子驱动的荧光素酶基因和SV40启动子控制下的新霉素抗性基因)转染野生型MB49细胞。转染的细胞使用G418在700μg/ml的浓度下选择，持续2周。在当前的研究中还使用了在小鼠膀胱中具有高肿瘤建立率和较低生长速率的亚克隆MB49S1。对于体外杆状病毒转导实验，将肿瘤细胞与杆状病毒载体以100的MOI在37℃下孵育过夜。转基因表达水平在转导后24小时测量。

动物、动物模型和体内杆状病毒转导：使用了成年雌性C57BL/6小鼠和成年雌性balb/c裸小鼠(重20g，5-6周龄)。通过在C57BL/6小鼠中经膀胱内灌注同源MB49细胞，在膀胱的内腔表面上产生原位膀胱肿瘤。肿瘤接种前，使用亲脂性、近红外荧光染料DiR(20ng/ml过夜，卡钳生命科学公司(Caliper Life Sciences))对MB49细胞进行预标记以促进成瘤率的体内监控。将24号导管(BD医疗(BDMedical))通过用于膀胱内灌注的尿道导入麻醉的雌性小鼠膀胱内。挤出残留的尿液后，将100μl的10μg/ml聚L-赖氨酸(PLL，分子量70,000-150,000，西格玛公司)注入膀胱。在挤出前使PLL溶液在膀胱内停留30分钟。随后使用100μl的PBS清洗膀胱。预处理后，灌注含100μl MB49S1或MB49膀胱癌细胞的PBS并在膀胱中停留1小时。在大多数实验中使用每只动物1x 10⁵个癌细胞的剂量，CD40L和/或IL-15治疗研究除外，其中使用了每只动物2x 10⁴个细胞的低剂量。此后，移开导管并通过自发排泄使膀胱排空。在膀胱内灌注后24小时使用与CCD相机和ICG滤光器偶联的IVIS 100体内成像系统(卡钳生命科学公司(Caliper LifeSciences))测量成瘤率。使用Xenogen活体成像软件v2.5获取并分析图像和荧光信号。选择成功植入MB49细胞和具有类似肿瘤负担的动物并在后续实验中使用。对于膀胱内的体内杆状病毒转导，对小鼠进行麻醉和插管。在30分钟的聚L-赖氨酸处理后灌注含杆状病毒载体的PBS(100μl中1x 10⁸pfu病毒颗粒)并停留1小时。

为评估膀胱中的体内转导效率，使用具有荧光素酶报告基因的杆状病毒载体转导具有或没有原位肿瘤植入的小鼠并在腹膜内注射150mg/kg荧光素(普洛麦格公司(Promega))后15分钟将其置于仰卧位使用与冷却CCD相机和560nm激发滤光器偶联的IVIS 100成像系统(卡钳生命科学公司(Caliper Life Sciences))成像。使用Xenogen活体成像软件v2.5获取和分析图像和发光信号并以每秒光子的形式进行定量。

为评估疗效，在原位肿瘤植入后7天进行膀胱的体内杆状病毒转导。将小鼠随机分配至对照或治疗组。对小鼠进行再次麻醉和再次插管后，灌注BacPAK6或BV-CD40L或BV-IL-15病毒。将动物在7天后处死用于组织学分析或者观察6个月以观察膀胱癌的迹象和症状(血尿和体重损失)以及活力状态。

对动物的所有处理和护理都根据新加坡国家实验动物研究咨询委员会(National Advisory Committee for Laboratory Animal Research,Singapore)提出的《用于科学目的的动物护理和使用指南》(Guidelines on the Care and Use of Animalsfor Scientific Purposes)进行。

组织学分析和免疫染色：对于组织学检查，收获膀胱并在4％PFA中固定过夜，将其悬浮于30％蔗糖中并包埋在组织冷冻介质中。制备10μm的低温切片并使用苏木精和伊红(H&E)染色。对于免疫染色，使用Tris缓冲的盐水吐温-20(TBST)清洗组织切片2次并使其在0.025％曲通X-100中孵育10分钟。随后将组织切片在5％BSA中孵育1小时以封闭非特异性结合。使用兔多克隆抗荧光素酶抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)，1:100)4℃过夜。使用TBST清洗3次后，将载玻片与二抗(FITC偶联的山羊抗兔IgG(1:200))在室温下孵育1小时。

细胞因子/趋化因子表达：经膀胱内灌注PBS或BacPAK6后48小时处死小鼠。收获膀胱并称重。以50mg组织/ml的量加入含有蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司(Calbiochem)，默克公司(Merck)，德国达姆施塔特)的组织裂解缓冲液(富酶泰斯公司(Fermentas)，美国马里兰州)并通过超声对膀胱进行匀浆。随后对膀胱匀浆物在4℃下16,000x g离心30分钟并收集上清液。通过伯乐蛋白试验方法(伯乐公司(Biorad)，美国加利福尼亚州)测量上清液的蛋白浓度。将含80μg总蛋白浓度的上清液等分试样加载在小鼠细胞因子阵列2.1(瑞博奥公司(Raybiotech)，佐治亚州诺克罗斯)上以根据生产商的说明书测量细胞因子和趋化因子的表达水平。使用RayBio^TM分析工具(瑞博奥公司)将平均信号强度和细胞因子的相对表达水平进行关联。

结果

经膀胱内灌注后杆状病毒载体有效地转导小鼠膀胱：首先评估杆状病毒是否能够在免疫缺陷的裸小鼠中转导膀胱。在经膀胱内灌注至膀胱后，对三种不同的含萤火虫荧光素酶基因的重组杆状病毒载体进行了测试，并使用IVIS活体动物成像系统监控了体内转导效率(图1A)。所有三种载体都能够在使用聚L-赖氨酸预处理器官后有效地转导小鼠膀胱。含有两种病毒转录调控元件WPRE和RU5的其中一种杆状病毒载体BV-RU5-Luc-WPRE提供了膀胱中最高的转基因表达水平。虽然随时间降低，但三种载体提供的表达水平在至少35天中维持显著高于背景水平(图1B)。

在免疫活性C57BL/6小鼠中(图2A、2B)，虽然BV-RU5-Luc-WPRE提供的初始表达水平与免疫缺陷的裸小鼠中观察到的类似，但该水平迅速下降且可检测的转基因表达仅持续约2周。两种小鼠类型之间转基因表达的差异显示针对杆状病毒转导的强免疫应答。膀胱中杆状病毒介导的转基因表达是剂量依赖的，证据是使用每只小鼠10⁷个病毒颗粒治疗的C57BL/6小鼠中1天时的荧光素酶表达水平为使用每只小鼠10⁸个病毒颗粒治疗时的约1/4(图2A、2B)。使用针对荧光素酶蛋白的抗体的免疫组织学染色确认了杆状病毒介导的转基因表达限于浅表的膀胱上皮(图2C)。

单独的杆状病毒转导能够延缓膀胱肿瘤生长：研究了免疫活性C57BL/6小鼠中杆状病毒转导后器官内细胞因子和趋化因子的表达。BacPAK6是一种不含哺乳动物基因表达盒的杆状病毒载体，用于该目的以避免可能的转基因表达干扰。使用抗体阵列法，与接受PBS灌注的膀胱中的表达水平相比，在两天前接受了膀胱内灌注BacPAK6的膀胱中，鼠阵列中检测到了59％(32个中的19个)细胞因子和趋化因子的上调(定义为大于2倍的表达增加)(图3A、B)。上调最多的5种蛋白是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，升高123倍)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF，升高35倍)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK，升高10倍)、血小板生成素(TPO，升高7倍)和肿瘤坏死因子α(TNFα，升高7倍)。不进行任何治疗的正常小鼠膀胱和接受PBS灌注的膀胱之间的比较显示，细胞因子和趋化因子的表达水平没有显著性差异。

随后研究了杆状病毒转导后细胞因子和趋化因子的表达水平变化是否会影响膀胱肿瘤生长。在建立同源原位小鼠膀胱癌模型以研究效果的过程中，注意到甚至在低接种剂量(每只动物1x 10⁵个癌细胞)下，MB49细胞在2周内快速生长以占据泌尿膀胱的整个内腔(图4A)。由于侵略性肿瘤生长，小鼠也快速死亡，其中第一只小鼠在10至14天死亡且所有小鼠在约4周内死亡(Günther JH等，1991)。MB49细胞的这些特性使进行精确膀胱内灌注和测试靶向已建立膀胱肿瘤的实验治疗剂(尤其是免疫治疗剂)变得困难。MB49S1细胞是MB49小鼠膀胱癌细胞系的亚克隆，显示较慢的生长速率但保持高肿瘤建立率(图4A)，其因此用于在C57BL/6小鼠中通过经膀胱内将细胞灌注至聚L-赖氨酸预处理的膀胱中以建立膀胱癌模型。

接种1x 10⁵个MB49S1细胞后一周，将具有已建立肿瘤的C57BL/6小鼠随机分为两组(每组n＝10)。一组接受10⁸个BacPak6病毒颗粒的单次灌注而另一组接受PBS作为灌注对照。膀胱中杆状病毒刺激后观察到具有膀胱肿瘤小鼠的存活显著延长。对照组中的全部动物在70天内死亡，而治疗组中50％的动物在肿瘤接种后6个月仍存活(图4B，对数秩检验中p<0.01)。该发现显示，膀胱中杆状病毒转导后细胞因子和趋化因子的上调在介导抗肿瘤效果方面是有功能的且可发挥作用以治愈已建立的膀胱肿瘤。

杆状病毒载体可介导至膀胱癌细胞的高效基因转移和针对膀胱癌的CD40L基因治疗：为评估杆状病毒载体是否可用于将转基因递送至膀胱癌，将培养的小鼠MB49膀胱癌细胞和人T24膀胱癌细胞与BV-RU5-Luc-WPRE一起进行体外转导。使用针对荧光素酶蛋白的抗体进行的免疫染色确认了这些肿瘤细胞中高水平的荧光素酶表达(图5A)。在具有原位MB49肿瘤的C57BL/6小鼠中，膀胱内灌注BV-RU5-Luc-WPRE导致肿瘤以及正常膀胱上皮中明显的转基因表达(图5)。在肿瘤中，阳性染色不仅在肿瘤表层而且在内部肿瘤区域中都能观察到，显示肿瘤中病毒的渗透。

透过使用鼠CD40配体(CD40L)基因(一种编码II型跨膜蛋白的基因，所述蛋白的功能为有效的T辅助1免疫刺激物)代替BV-RU5-Luc-WPRE表达盒中的荧光素酶基因，构建了杆状病毒载体BV-CD40L。在MB49细胞中体外杆状病毒转导和原位MB49肿瘤中体内杆状病毒转导后分别使用RT-PCR(图5C)和Western印迹(图5D)确定CD40L的表达。

为检测BV-CD40L的治疗效果，通过将2x 10⁴个DiR标记的MB49细胞接种至C57BL/6小鼠的膀胱内来建立膀胱肿瘤模型。使用IVIS活体动物成像系统监控DiR红外荧光信号以确认成功的肿瘤建立(图6A)。在肿瘤接种后第4天，将小鼠随机分为两组(每组n＝5)并以每只小鼠10⁸个BV-CD40L病毒颗粒或作为对照的10⁸个BacPAK6病毒颗粒的剂量经膀胱内灌注进行治疗。在治疗接种后第6天和第8天进行两组中的第2和第3次治疗。在第14天处死小鼠并通过检测H&E染色的膀胱组织切片以评估膀胱中的肿瘤发展阶段(图6A)。在对照组中，肿瘤发展至晚期，5只动物中的4只(#1、2、4、5)具有严重的肿瘤坏死且肿瘤侵袭至肌肉层中。这些小鼠中膀胱上皮完全损伤且变得混乱。在治疗组中，肿瘤块相对较小且上皮中没有显著损伤。一些肿瘤(#1和3)还是浅表性的，而其他(#2、4和5)从小鼠膀胱内腔上排列的细胞层生长至下方的结缔组织中，但尚未进入肌肉层。该组的平均膀胱重量在统计学上显著低于治疗组(p<0.05，图6B)。这些发现显示杆状病毒可能能够用作体内基因治疗载体递送治疗性基因以治疗侵略性生长的膀胱癌。

共同递送CD40L和IL-15对于具有膀胱癌小鼠存活的影响：除BV-CMV-RU5-Luc-WPRE和BV-CD40L病毒外，还可通过使用鼠白介素(IL15)基因(一种编码诱导天然杀伤细胞增殖的细胞因子的基因，所述天然杀伤细胞形成先天免疫系统的一部分)代替BV-RU5-Luc-WPRE表达盒中的荧光素酶基因来构建BV-IL-15。分别测试BV-CD40L病毒和BV-IL-15病毒的治疗效果以确认治疗性基因表达并随后共同递送至具有膀胱癌的小鼠的膀胱中。在接种10⁵个MB49细胞后2天进行杆状病毒载体的膀胱内灌注。

结果示于图7。观察到通过杆状病毒载体共同递送的CD40L和IL-15能够延长具有膀胱癌小鼠的存活(图7)。在使用表达CD40L和IL-15的杆状病毒载体联合治疗的一只小鼠中，MB49肿瘤完全停止(图7B)。

讨论

可治疗性利用哺乳动物中杆状病毒的免疫刺激效果以抑制膀胱肿瘤生长。该假说得到了以下观察的支持，即经膀胱内递送不表达任何转基因的杆状病毒能够延长具有已建立的原位膀胱癌的免疫活性小鼠的存活。该同源模型系统提供了完整的免疫功能，允许进行针对膀胱癌的治疗性疫苗的研究。虽然在单独一次注射非转基因杆状病毒载体后只治愈了一半的具有肿瘤的小鼠，但如果膀胱内灌注的频率升高，可以提高存活。还可通过在杆状病毒载体中包括治疗性基因以改善效果。就此而言，在具有侵略性生长膀胱癌的动物模型中显示了杆状病毒载体介导的CD40L表达的抗肿瘤效果。

因此，上述这些结果显示，根据膀胱癌的同源原位动物模型，昆虫杆状病毒可用作膀胱癌治疗的新试剂，其具有治疗性疫苗和治疗性基因递送的双重功能。

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虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式对本发明有所描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以对本发明作出某些改变和修改而不背离所附权利要求书的构思和范围。

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Claims (22)

1.一种将核酸分子递送至膀胱细胞的方法，包括使所述膀胱细胞接触杆状病毒载体。

2.如权利要求1所述的方法，所述膀胱细胞是膀胱癌细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述膀胱细胞是体外的。

4.如权利要求1或2所述的方法，所述膀胱细胞是体内的。

5.如权利要求4所述的方法，所述膀胱细胞在需要进行膀胱癌治疗的对象中，且所述接触包括通过膀胱内灌注向所述对象给予所述杆状病毒载体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述杆状病毒载体还包含用于在所述膀胱癌细胞中表达的转基因，其可操作地连接至驱动所述转基因在所述膀胱细胞中表达的启动子。

7.如权利要求6所述的方法，所述转基因是用于治疗膀胱癌的治疗性转基因。

8.如权利要求7所述的方法，所述治疗性转基因编码CD40L或IL-15。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，所述启动子包括人巨细胞病毒立即早期启动子。

10.如权利要求9所述的方法，所述人巨细胞病毒立即早期启动子包括SEQ ID NO:1所列序列。

11.如权利要求6-10中任一项所述的方法，所述杆状病毒载体还包括位于所述转基因3’非翻译区中的来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。

12.如权利要求11所述的方法，所述来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件包括SEQ ID NO:2所列序列。

13.如权利要求6-12中任一项所述的方法，所述杆状病毒载体还包括位于所述转基因5’非翻译区中的来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列。

14.如权利要求13所述的方法，所述来自1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的R片段和至少一部分U5序列的包括SEQ ID NO:3所列序列。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括在所述接触前或所述接触同时加入转染试剂。

16.如权利要求15所述的方法，所述转染试剂是聚L-赖氨酸、ClorpactionWCS-90、十二烷基-B-dd-麦芽苷(DDM)或十二烷基硫酸钠(SDS)或其任何组合。

17.一种应用于在需要膀胱癌治疗的对象中治疗膀胱癌的杆状病毒载体，其中所述应用包括在所述对象中经膀胱内灌注所述杆状病毒载体。

18.杆状病毒载体在需要膀胱癌治疗的对象中治疗膀胱癌的用途，通过经膀胱内灌注所述杆状病毒载体使用。

19.杆状病毒载体在制造药物中的用途，所述药物通过经膀胱内灌注所述杆状病毒载体来用于在需要膀胱癌治疗的对象中治疗膀胱癌。

20.一种用于在对象的膀胱中进行膀胱内灌注的杆状病毒载体。

21.杆状病毒载体在对象的膀胱中进行膀胱内灌注的用途。

22.杆状病毒载体在制造药物中的用途，所述药物用于在对象的膀胱中进行膀胱内灌注。