JP2023503858A - ４－１ｂｂｌアジュバント添加した組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の医学的使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＴＡＡ及び共刺激分子４－１ＢＢＬを発現する組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、（ｉ）固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが腫瘍内に投与される、固形腫瘍の再発の予防、あるいは（ｉｉ）別の固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが腫瘍内に投与される、腫瘍の治療、予防及び／または再発予防、における使用のための組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラに関する。

Description

本発明は、がん免疫療法の分野、特に、腫瘍溶解性ウイルス療法に関する。具体的には、本発明は、腫瘍及び転移の治療、予防及び／または再発予防における使用のための、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び共刺激分子４－１ＢＢＬを発現している組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関し、かかる組み換えＭＶＡが、固形腫瘍に対し腫瘍内に投与される。本発明はまた、それぞれの治療方法にも関する。
ヒトのがんは、腫瘍抗原の発現ならびに免疫の浸潤及び組成の点で極めて不均一である。しかしながら、共通する特徴として、宿主は、腫瘍増殖を効果的に妨げる強力な免疫応答を開始させることができない。多くの場合、固形腫瘍に対して自然にプライミングされたＣＤ８＋ Ｔ細胞は、過酷な腫瘍微小環境のために十分な刺激及び腫瘍組織の効率的な透過が欠如している。
免疫細胞が過酷な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で浸潤するかまたはエフェクター機能を実施する能力が低いことによる、固形腫瘍に対する強力な免疫応答の欠如が、がん免疫療法の大きな課題となっている［１］。腫瘍指向性治療により免疫抑制のＴＭＥを炎症性のものに再プログラミングするという概念が、近年、大きな注目を集めている［２］。目的は、腫瘍及び局所リンパ節にすでにホーミングしている免疫細胞を活性化させること、または新たな免疫細胞をＴＭＥに動員すること、その一方で、残りの免疫系の不適切な活性化を最小限にすることである［３］。これを達成するため、病原体認識及びプログラムされていない細胞破壊に由来する生化学的シグナルの局所での放出及び活性化または免疫刺激性のモノクローナル抗体及びサイトカインの局所投与を利用するいくつかの戦略が、前臨床モデル及び臨床において検討されている［２］。
局所腫瘍溶解性ウイルス療法は、腫瘍細胞の特異的感染及び破壊ならびにＴＭＥの調節による腫瘍標的療法の概念に依存している。Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）が最近、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする改変単純ヘルペスウイルス１であるファーストインクラスの腫瘍溶解性薬剤ＩＭＬＹＧＩＣをＩＩＩ期メラノーマ患者について承認したこと［４］により、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）の大きな可能性が強調された。その腫瘍溶解性効果について検討されているウイルスファミリーは様々あり、中でも、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスが含まれる［５］。
従来、ＯＶウイルスの腫瘍細胞特異的な複製及び直接死滅させる活性が主な作用機序として考えられていたが、現在では、宿主の抗腫瘍免疫応答の開始または増強が腫瘍溶解性ウイルス療法に欠かせないことが知られている［６］。したがって、局所ウイルス療法は、損傷関連または病原体関連の分子パターンの放出及び腫瘍抗原放出を伴う免疫原性細胞死をもたらし、それが最終的に抗腫瘍の自然免疫応答及び適応免疫応答を引き起こす、インサイチュでのワクチンとして考えることができる［７］。
大部分のＯＶの顕著な特徴は、それらの腫瘍特異性であり、また、それらがウイルス複製及び付随する腫瘍細胞溶解によって腫瘍組織を通じて広がる能力である［８］。操作された、それらの腫瘍細胞への組織指向性にもかかわらず、複製能を有するウイルスの患者における使用には、依然として安全性の懸念が生じる。ＭＶＡ－ＢＮは、天然痘及びサル痘に対する非複製性ワクチンとしてＦＤＡにより承認された極めて弱毒化されたワクシニア株である（ＪＹＮＮＥＯＳ（登録商標））［９］。さらに、組み換えＭＶＡ－ＢＮワクチンベクターは、エボラワクチンの一部としてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＭＡ）により最近承認されており、他は、様々な感染因子に対する臨床試験で用いられている［１０］。ＭＶＡは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の強力な誘導因子であり［１１、１２、１３］、ベクターにコードされた異種抗原に対する強い体液性及び細胞性の免疫応答を誘発する［１４、１６］。重要なことには、ＭＶＡは、その複製能力が胚性トリ細胞に制限されているため、ヒト細胞では複製することができない［１５］。したがって、ＭＶＡは、その優れた安全性プロファイル及び免疫刺激特性により、治療介入のための主要候補となる。
ＭＶＡには、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発し、特定の免疫活性化経路を増強させるための異種抗原及び免疫刺激性分子の組み込みを容易にする、大きな導入遺伝子インサートを収容することができる。ＣＤ４０Ｌアジュバント添加ＭＶＡは、ＩＶ注射時、自然免疫応答及び適応免疫応答を著しく増強させた［１６、１７］。さらに、共刺激分子または炎症性サイトカインで遺伝子が改変されたＯＶは、腫瘍内（ＩＴ）治療後、治療効果を増大させた［１８］。したがって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするＭＶＡを共刺激分子と共に用いるＩＴ処置により、ＴＭＥでの抗腫瘍免疫応答が増強される可能性がある。
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーの４－１ＢＢまたはＣＤ１３７は、Ｔ細胞での真正な共刺激分子と定義される。４－１ＢＢは、ＴＣＲ刺激時に一過性に誘導され、それに続くこの共刺激受容体との会合は、サイトカイン分泌レベルの上昇及び抗アポトーシス性分子Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘｌのアップレギュレーションをもたらす。これにより、増殖の増大、及び、免疫記憶の形成にとっても重要な活性化誘導Ｔ細胞死に対する防御がもたらされる［１９、２０］。４－１ＢＢの腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）での発現［２１］は、それが活性化Ｔ細胞の生存、増殖、及びエフェクター機能増強を促進する能力と相まって、がん免疫療法の魅力的な標的となっている。事実、共刺激経路４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬの刺激は、単剤療法または４－１ＢＢアゴニスト抗体もしくは４－１ＢＢＬ－発現ウイルスベクターを用いる併用療法を含め、多くのがん治療の状況において有益である［２２］。４－１ＢＢ共刺激はまた、シグナル伝達を増強させ、その結果として腫瘍細胞を死滅させるよう、内部ドメインが腫瘍結合性キメラ受容体内に組み込まれている第３世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による治療に重要である［２３］。
それでもやはり、これまでのところ注目すべき進歩が遂げられてはいるものの、腫瘍溶解性ウイルス療法のさらなる医学的使用におけるニーズが依然としてある。
腫瘍溶解性ウイルスを使用する局所の、すなわち、腫瘍指向性のウイルス療法のさらなる医学的使用を提供することが本発明の目的である。
簡潔に述べると、本発明の目的は、以下における使用のための、ＴＡＡ及び共刺激分子４－１ＢＢＬを発現する組み換えＭＶＡにより解決される：
（ｉ）固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが腫瘍内に投与される、固形腫瘍の再発の予防、あるいは
（ｉｉ）別の固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが腫瘍内に投与される、腫瘍の治療、予防及び／または再発予防。
特に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって、また、以下の態様及びそれらの実施形態によって定義される。
一態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での固形腫瘍の治療及び再発予防における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での固形腫瘍の、その寛解中または寛解後の再発予防における使用のためのものであり、寛解が、固形腫瘍に対する組み換えＭＶＡの局所の、好ましくは腫瘍内への投与によって誘導されるかまたはそれに続く、組み換えＭＶＡを提供する。
別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での二次腫瘍の治療、予防及び／または再発予防における使用のためのものであり、関連する原発固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、二次腫瘍には投与されない、あるいは
対象での原発固形腫瘍の治療及び／または再発予防における使用のためのものであり、関連する二次性固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、原発固形腫瘍には投与されない、あるいは
対象での二次腫瘍の治療、予防及び／または再発予防における使用のためのものであり、別の関連する二次性固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、最初に言及した二次腫瘍には投与されない、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での腫瘍の治療、予防及び／または再発予防における使用のためのものであり、腫瘍が、郭清できないかもしくは手術によるアクセスが困難であり、別の関連する固形腫瘍に対しては組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、最初に言及した腫瘍には局所的、好ましくは腫瘍内に投与されない、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での全身性抗腫瘍免疫応答の誘導における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、全身性抗腫瘍療法における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、術前補助抗腫瘍療法における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での抗腫瘍免疫記憶の誘導における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
を含む、組み換えＭＶＡであって、対象での複数の腫瘍の治療における使用のためのものであり、前記複数の腫瘍のうち、すべてにではなく少なくとも１つに対して組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、組み換えＭＶＡを提供する。
本発明はまた、複数の腫瘍を有する患者のための治療方法であって、前記複数の腫瘍のうち、すべてにではなく少なくとも１つに対して組み換えＭＶＡを局所に（好ましくは腫瘍内に）投与することを含み、組み換えＭＶＡが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸及び４－１－ＢＢリガンド（４－１－ＢＢＬ）をコードする第２の核酸を含む、治療方法も提供する。
これらの態様及びそれらの実施形態は、本発明の説明に関連してさらに詳細に記載される。
関連しない大きな腫瘍のモデルにおけるＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬの腫瘍内投与の治療効果は、抗原の選択とは無関係であることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ａ～Ｄ）またはＢａｌｂ／ｃマウス（Ｅ～Ｆ）に、５×１０５のＢ１６．ＯＶＡ細胞（Ａ～Ｂ）、５×１０５のＢ１６．Ｆ１０細胞（Ｃ～Ｄ）または５×１０５のＣＴ２６．ＷＴ細胞（Ｅ～Ｆ）を側腹部に皮下投与（ＳＣ）した。７～１４日後、腫瘍が６０ｍｍ３を上回ったら、マウスをＰＢＳによるかまたは示されているＭＶＡコンストラクトのいずれかにより腫瘍内（ＩＴ）免疫した。初回免疫（破線）後、４日目または５日目及び８日目にＩＴ免疫を繰り返した。（Ａ）腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス５匹／群）及び（Ｂ）ＰＢＳ、２×１０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡまたは２×１０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのいずれかを注射されたＢ１６．ＯＶＡ担持マウスの全生存率（ｎ＝マウス２０匹／群）、（Ｃ）腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス５匹／群）及び（Ｄ）ＰＢＳ、５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０または５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのいずれかを注射されたＢ１６．Ｆ１０担持マウスの全生存率（ｎ＝マウス１５匹／群）、（Ｅ）腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス５匹／群）及び（Ｆ）ＰＢＳ、５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０または５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのいずれかを注射されたＣＴ２６．ＷＴ担持マウスの全生存率（ｎ＝マウス１０匹／群）。（Ａ、Ｃ及びＥ）データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。（Ｂ、Ｄ及びＦ）統合された少なくとも２つの独立した実験の全生存率を表す。図Ｂ、Ｄ及びＦでは、マウス生存のＬｏｇ ｒａｎｋ検定を実施した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。 ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで免疫された腫瘍担持マウスにおける末梢血のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を示す。Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウス（ｎ＝マウス５匹／群）のＰＢＳ、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの最終ＩＴ免疫から３日後の、末梢血のＣＤ４４＋ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の代表的ドットプロット及び頻度。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。データは平均±ＳＥＭとして表されている。一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで免疫された腫瘍担持マウスにおける末梢血のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を示す。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍担持マウス（ｎ＝マウス５匹／群）のＰＢＳ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬでの最終ＩＴ免疫から３日後の、ｐ１５Ｅ６０４－６１１ペプチドで再刺激された末梢血のＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の代表的ドットプロット及び頻度。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。データは平均±ＳＥＭとして表されている。一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで免疫された腫瘍担持マウスにおける末梢血のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を示す。ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウス（ｎ＝マウス５匹／群）のＰＢＳ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬでの最終ＩＴ免疫から３日後の、ＡＨ１６－１４ペプチドで再刺激された末梢血のＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の代表的ドットプロット及び頻度。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。データは平均±ＳＥＭとして表されている。一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで免疫された腫瘍担持マウスにおける末梢血のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を示す。ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで治癒したＣ５７ＢＬ／６マウスでの白斑発症の代表的写真。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。 ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで免疫された腫瘍担持マウスにおける末梢血のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を示す。ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ（ＭＶＡ－ＯＶＡとＭＶＡ－Ｇｐ７０を併せたデータ）及びＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ（ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬとＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬを併せたデータ）それぞれで治癒したＣ５７ＢＬ／６マウスの白斑発生率を表す円グラフ。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。 ＩＴ ＭＶＡ注射時のＭＶＡの局在化ならびにＭＶＡ－ＯＶＡ及びＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１－ＢＢＬによる炎症性サイトカインの誘導を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を皮下投与した。腫瘍が６０ｍｍ３に達したら、マウスを群分けし（ｎ＝マウス３匹／群）、ＰＢＳまたは２×１０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ（ＴＡＡまたは４－１－ＢＢＬをコードしないＭＶＡ）をＩＴ投与した。ＩＴ注射から６時間後、腫瘍、ＴｄＬＮ、ＮｄＬＮ、脾臓及び血液を瞬間凍結し、組織ライセートからウイルスＤＮＡを抽出した。異なる器官におけるＭＶＡ遺伝子ＭＶＡ０８２Ｌの遺伝子コピー（ｇｃｓ）が示されている。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を投与した。腫瘍が６０ｍｍ３に達したら、マウスを群分けし（ｎ＝マウス３匹／群）、ＰＢＳまたは２×１０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ、ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬをＩＴ投与した。ＩＴ注射から６時間後、腫瘍を摘出し、腫瘍溶解液を処理した。腫瘍溶解液中の、示されているサイトカイン／ケモカインの濃度（ｐｇ／ｍｌ）が示されている。データは平均±ＳＥＭとして表されている。一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。 腫瘍内ＭＶＡ－免疫療法は、未処置病変の拒絶を誘導することを示す。（Ａ～Ｄ）両側腫瘍モデル。（Ａ）実験レイアウト。Ｂａｌｂ／ｃマウスに５×１０５及び１×１０５のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍細胞をそれぞれ、右及び左の側腹部に皮下投与した。５日後、右側腹部腫瘍を、ＰＢＳまたは示されているＭＶＡコンストラクトのいずれかでＩＴ免疫した。初回免疫（矢印）後、５日目及び８日目にＩＴ免疫を繰り返した。（Ｂ）ＰＢＳのＩＴ注射後の、処置及び未処置の腫瘍の腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス１０匹／群）。（Ｃ）５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｇｐ７０のＩＴ注射後の、処置及び未処置の腫瘍の腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス１０匹／群）。（Ｄ）５×１０７ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのＩＴ注射後の、処置及び未処置の腫瘍の腫瘍サイズの経過観察（ｎ＝マウス１０匹／群）。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。実験レイアウト。図１のＡ及びＢのナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスまたは長期生存（腫瘍消失後、１２～３６週間）マウスに、５×１０５のＢ１６．ＯＶＡ細胞を、治癒マウスの腫瘍ナイーブの側腹部皮下に再投与した。再投与の前（－６日目）及び後（７日目）に、末梢血をフローサイトメトリーで分析した。腫瘍細胞接種後４１日目に、血液、脾臓、非ｄＬＮ及びＴｄＬＮにおける単核球を分析した。ｎ＝マウス５～１１匹／群。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。腫瘍のないマウスの経時的パーセンテージが示されている（ｎ＝マウス５～１１匹／群）。角括弧内には、群あたりの腫瘍のないマウスの数が示されている。ｎ＝マウス５～１１匹／群。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。ＩＴ ＭＶＡ－ＯＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬでの処置後のナイーブマウス及び長期生存マウスの、Ｂ１６．ＯＶＡ再投与前後の末梢血ＣＤ４４＋ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋ ＣＤ８＋の頻度。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ４４＋ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋ ＣＤ８＋ Ｔの頻度。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドでの再刺激後の脾臓のＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋ ＩＬ２＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ１２７＋ ＣＤ６９－ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋細胞（ＴＥＭ）の頻度（左）。血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ１２７＋ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋細胞（ＴＣＭ）の頻度（中央）。Ｂ１６．ＯＶＡ細胞投与後４１日目の、血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ１２７＋ ＣＤ６９＋ ＯＶＡ２５７－２６４ Ｄｅｘ＋（ＴＲＭ）の頻度（右）。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。腫瘍の全身再投与。実験レイアウト。図１のＣのナイーブＢａｌｂ／ｃマウスまたは長期生存マウスに、２×１０５のＣＴ２６．ＷＴ細胞をＩＶで再投与した。腫瘍細胞注射後１９日目に脾臓及び肺を分析した。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。腫瘍の全身再投与。ナイーブマウスまたは治癒マウスへの腫瘍細胞導入後１９日目のブアン液に固定後の肺の代表的写真。肉眼的肺転移の総数を評価した（ｎ＝マウス２～９匹／群）。ｎ＝マウス５～１１匹／群。データは平均±ＳＥＭとして表されている。二元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５。 腫瘍内ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置マウスは、その後の局所及び全身の腫瘍再投与に対して抵抗性であることを示す。腫瘍の全身再投与。再投与から１９日後のＡＨ１６－１４ペプチドでの再刺激後の、脾臓のＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋ ＴＮＦα＋ ＩＬ２＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度。データは平均±ＳＥＭとして表されている。一元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００５。 腫瘍内ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ免疫療法は、局所的腫瘍再投与からの防御を付与することを示す。図１のＣ及びＤのナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスまたは長期生存マウスに５×１０５のＢ１６．Ｆ１０細胞を、治癒マウスの腫瘍ナイーブの側腹部皮下に再投与した。再投与の前（－６日目）及び後（７日目）に、末梢血をフローサイトメトリーで分析した。腫瘍細胞接種後４２日目に血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮを分析した。（Ａ）腫瘍のないマウスの経時的パーセンテージが示されている（ｎ＝マウス５～１１匹／群）。角括弧内には、群あたりの腫瘍のないマウスの数が示されている。（Ｂ）Ｂ１６．Ｆ１０細胞再投与前後の、末梢血のＣＤ４４＋ ｐ１５Ｅ６０４－６１１ Ｐｅｎｔ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度。（Ｃ）血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ１２７＋ ｐ１５Ｅ６０４－６１１ Ｐｅｎｔ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＴＣＭ）の頻度。（Ｄ）血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ１２７＋ ｐ１５Ｅ６０４－６１１ Ｐｅｎｔ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＴＥＭ）の頻度。（Ｅ）血液、脾臓、ＮｄＬＮ及びＴｄＬＮにおけるＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ１２７＋ ＣＤ６９＋ ｐ１５Ｅ６０４－６１１ Ｐｅｎｔ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＴＥＭ）の頻度。（Ａ～Ｅ）ｎ＝マウス５～１１匹／群。（Ｂ～Ｅ）データは平均±ＳＥＭとして表されている。（Ｃ～Ｅ）一元配置ＡＮＯＶＡを実施した：＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００５。 複製型ウイルスは、感染した腫瘍細胞及び免疫細胞の死を誘導することを示す［３３～３５］。ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＴＡＡまたはＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬによる感染は、インビトロでＢ１６．ＯＶＡ及びＣＴ２６．ＷＴの腫瘍細胞の死を増強させた（Ａ）。ＭＶＡに選択的に感染することが示されているマクロファージ［３６］は効果的に死滅し、それにより、この効果が４－１ＢＢＬアジュバントによって顕著に増大した（Ａ）。細胞死は、自然免疫細胞により感知されて免疫応答の開始に寄与する高移動度ボックス１（ＨＭＧＢ１）等の細胞内タンパク質の放出をもたらす［３７、３８］。４－１ＢＢＬとは関係なく、腫瘍細胞またはマクロファージのＭＶＡ感染後にＨＭＧＢ１の顕著な増大が検出された（Ｂ）。 ＭＶＡに基づくベクターであるＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４」または「ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ」）を示す。詳細については、実施例７を参照のこと。 ベクターが、感染細胞のＨＬＡ内にＴＡＡを取り込ませる能力を示す。詳細については、実施例７を参照のこと。 ｈ４－１－ＢＢＬを機能性形態、すなわち、ｈ４－１－ＢＢ受容体と結合する形態で発現させる能力を示す。詳細については、実施例７を参照のこと。 ＭＶＡに基づくベクター「ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２」（Ｃ）を示し、さらに、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（Ａ；ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４で使用する場合）及びＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（Ｂ；ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２で使用する場合）の概略マップを示す。
この研究では、ＴＡＡをコードするＭＶＡの免疫刺激特性と４－１ＢＢＬの優れたＴ細胞増強能とを組み合わせ、固形腫瘍に対する治療効果を評価した。関連しない様々な腫瘍モデルにおいてＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬのＩＴ注射が強い客観的治療反応を示すことを見出した。治療は、強く再活性化された腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＴＭＥにおける複数の炎症誘発性のケモカイン及びサイトカインの良好な誘導によるものであった。さらに、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ注射は、全身性抗腫瘍免疫応答を誘導して、遠位部位の腫瘍病巣（ｔｕｍｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）の成長を阻害した。重要なことには、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬにより、多様化した腫瘍特異的記憶応答が誘発され、これにより局所及び転移性の再発から防御された。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び免疫刺激アジュバント４－１ＢＢＬを、腫瘍内ウイルス療法用に改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）のゲノムにクローニングした。ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬによる局所治療は、確立された腫瘍の制御をもたらした。腫瘍内注射時、ＭＶＡは主に腫瘍に局在し、腫瘍流入領域リンパ節への漏出は最小限であった。ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬによるインサイチュでの感染により、複数の炎症誘発性分子及び免疫原性細胞死の誘導を含む、腫瘍微小環境の著しい変化が誘発された。これが、抗原を経験した、サイトカインを産生する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の再活性化及び増殖をもたらした。際だったことに、局所的ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置による全身性抗腫瘍免疫応答の誘導は、遠位未処置病変での腫瘍増殖を制御し、局所及び全身の腫瘍再投与に対する防御を付与したことをここで報告する。いずれの場合でも、４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡはＭＶＡよりも優れていた。したがって、腫瘍内４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡ免疫療法は、強力な腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖及び腫瘍微小環境の良好な炎症誘発性変化を誘導し、腫瘍の除去及び防御免疫記憶をもたらした。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で別段の明確な指示がない限り、複数の言及物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「核酸配列（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））」には、１つ以上の核酸配列が含まれる。
本明細書で使用される場合、複数の記述されている要素の間の「及び／または」という接続語は、個々の選択肢と組み合わせの選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が、「及び／または」によって連結されている場合、第１の選択肢では、第１の要素が第２の要素を用いずに適用可能であることを指す。第２の選択肢では、第２の要素が第１の要素を用いずに適用可能であることを指す。第３の選択肢では、第１の要素と第２の要素を併せて適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味の範囲内に入り、したがって、本明細書で使用される「及び／または」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上を同時に適用可能であることも、その意味の範囲内に入り、したがって、「及び／または」という用語の要件を満たすと理解される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記述されている、整数もしくは工程または整数群もしくは工程群の包含であって、他の任意の整数もしくは工程または整数群もしくは工程群の除外ではないことを示唆していることが理解される。本発明の説明中の態様または実施形態との関連において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は修正可能であり、したがって、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置き換えられるかまたは本明細書で使用される場合は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で置き換えられ得る。同様に、前述の用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｈａｖｉｎｇ）のいずれも、本発明の説明中の態様または実施形態との関連において使用される場合はいかなる場合も、それぞれが司法によって異なる、特定の法的意味を表す、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語が含まれる。
本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項の要素で指定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を及ぼさない材料または工程を除外しない。
用語「組み換えＭＶＡ」とは、天然では親ウイルスに存在しない外因性核酸配列がそのゲノム内に挿入されているＭＶＡを指す。したがって、組み換えＭＶＡとは、ＭＶＡ核酸配列と、合成または半合成に由来する核酸配列のセグメントとの人工的な組み合わせによって作製されているＭＶＡであって、その組み合わせが天然では存在しないかまたは配置が異なっているものを指す。人工的な組み合わせは、十分に確立された遺伝子操作技術を使用する、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成されることが多い。一般に、本明細書に記載される「組み換えＭＶＡ」とは、標準の遺伝子操作方法によって製造されているＭＶＡを指し、したがって、例えば、組み換えＭＶＡは、遺伝子が操作されている、または遺伝子が改変されているＭＶＡである。したがって、用語「組み換えＭＶＡ」には、少なくとも１つの組み換え核酸が、好ましくは転写単位の形態でそのゲノムに組み込まれているＭＶＡ（例えば、ＭＶＡ－ＢＮ）が含まれる。転写単位としては、プロモーター、エンハンサー、終結因子及び／またはサイレンサーを挙げてよい。本発明の組み換えＭＶＡは、調節エレメント、例えば、プロモーターの誘導時、異種抗原決定基、ポリペプチドまたはタンパク質（抗原）を発現するよう設計されている。
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、典型的には、哺乳類、例えば、非霊長類または霊長類（例えば、サルまたはヒト）であり、好ましくはヒトである、組み換えＭＶＡのレシピエントを指す。用語には、ヒトまたは動物の「患者」及び実験動物が含まれる。用語「対象」及び「患者」は同じ意味で使用される。
用語「固形腫瘍」とは、例えば、白血病または血液がんとは対照的に、特定可能であるかまたは定着した腫瘍性組織を指す。
用語「原発腫瘍」とは、そこから腫瘍細胞が、体の他の部分に広がる場合があり、また新たな（「二次」）腫瘍を形成する場合がある、初期または第１の腫瘍を指す。
本明細書で使用される場合、用語「二次腫瘍」とは、「原発腫瘍」から、または別の「二次腫瘍」から広がった腫瘍細胞により形成された腫瘍を指す。特に、用語には「転移」が含まれる。
用語「転移」とは、がん性の原発または二次性の腫瘍に由来する腫瘍病巣を指す。
本明細書で使用される場合、「関連する」という表現は、２つの腫瘍が、同じ組み換えＭＶＡまたはＴＡＡに応答性であると考えられていることを意味する。それらは、例えば、同じ腫瘍タイプである。
本明細書で使用される場合、用語「空間的に遠位にある」は、個々の腫瘍として、例えば光学的手段によって、明確に識別可能であり、別の腫瘍から間隔が空いている腫瘍に関する。
用語「局所（ｌｏｃａｌ）」投与には、例えば、固形腫瘍に対する腫瘍内投与または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与が含まれる。したがって、局所（ｌｏｃａｌ）とは、部位上を意味する。投与は、組み換えＭＶＡの、例えば、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）の適用によるか、または腫瘍内注射によって達成することができる。いくつかの実施形態では、例えば、皮膚に近い腫瘍またはメラノーマ等の皮膚細胞の腫瘍では、局所投与は、腫瘍のごく近傍での皮下注射により達成することができる。対照的に、「遠位」または「全身」のような用語は、部位上ではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「全身」とは、「局所（ｌｏｃａｌ）」、の反対を意味する。したがって、全身とは、効果が局所に限局されていない、すなわち、むしろ体全体に関することを意味し得る。
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍指向性ウイルス療法」とは、全身腫瘍ウイルス療法と対照的な局所ウイルス療法を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「全身性抗腫瘍療法」とは、組み換えＭＶＡは固形腫瘍に対して局所的に投与されるが、抗腫瘍活性が、局所的に処置されていない他の腫瘍まで及ぶことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「全身性抗腫瘍免疫応答」とは、体内のどこでも生じる可能性のある抗腫瘍免疫応答を指す。
本明細書で使用される場合、用語「再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」とは、腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）または再発（ｒｅｔｕｒｎ）を指す。
本明細書で使用される場合、用語「再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）予防」は、寛解した腫瘍、すなわち、寛解中または寛解後の腫瘍、例えば、根絶された腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）が、予防または阻害されることを意味する。少なくとも、腫瘍の完全再発は阻害され、例えば、少なくとも５０％阻害される。
対照的に、用語「予防」は、腫瘍の最初の出現が予防されることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「寛解」は、例えば、減少するかまたは根絶された腫瘍に関する。より一般的には、「寛解」は、腫瘍等の疾患の徴候及び症状の縮小または消失である。寛解は、部分寛解または完全解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）もしくは完全（ｆｕｌｌ）寛解が考えられ得る。例えば、腫瘍の部分寛解は、身体診察、放射線学的検査、または血液検査もしくは尿検査からのバイオマーカーレベルで見出され得る、腫瘍増殖についての測定可能なパラメータにおける５０％以上の減少と定義され得る。一方、完全寛解とは、再発の可能性にかかわらず、腫瘍の完全消失である。
用語「術前補助療法」とは、主要な治療法の前の治療を指す。ここでは、組み換えＭＶＡを使用する術前補助療法は、腫瘍のサイズまたは範囲を、例えば、外科的切除の前に縮小することを目的とする。
選択略語 ＩＴ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ（ｉ．ｔ．） 腫瘍内
ＭＶＡ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ
（ＭＶＡ） 改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
ＯＶ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ 腫瘍溶解性ウイルス
ＴＡＡ ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ 腫瘍関連抗原
ＴＭＥ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ 腫瘍微小環境
実施形態
一実施形態では、組み換えＭＶＡは、非複製性または複製欠損性ＭＶＡである。好ましくは、組み換えＭＶＡは、ヒト細胞株では生殖複製不能である。
一実施形態では、組み換えＭＶＡは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ－ＢＮに由来するか、またはＭＶＡ－ＢＮ派生物に由来する。
一実施形態では、組み換えＭＶＡは、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸、
（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸、及び
（ｃ）ＴＡＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸、を含む。
一実施形態では、ＴＡＡをコードする第１の核酸及びＴＡＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸は、同じであるかまたは異なる。
一実施形態では組み換えＭＶＡは、それぞれが異なるＴＡＡをコードする２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の核酸を含む。
一実施形態では、ＴＡＡは、ネオアンチゲンまたは内在性自己抗原である。
一実施形態では、ＴＡＡは、転位因子（ＴＥ）である。
一実施形態では、ＴＡＡは、内在性レトロウイルスタンパク質（ＨＥＲＶ）である。
一実施形態では、ＴＡＡは、長い散在反復配列（ＬＩＮＥ）である。
一実施形態では、ＴＡＡは、短い散在反復配列（ＳＩＮＥ）である。
一実施形態では、ＴＡＡは、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチド、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、及び内在性レトロウイルスペプチドＭＥＬ、ならびにそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。既知の腫瘍または治療される患者の腫瘍と関連しており、かつ、発現された際に、免疫応答を生じさせるかまたは刺激する能力のある抗原である限り、どのＴＡＡでも本発明の組成物及び／または方法における使用に好適である。
一実施形態では、ＥＲＶタンパク質は、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリー由来であり、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択される。
一実施形態では、ＥＲＶペプチドは、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリー由来であり、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択される。
一実施形態では、組み換えＭＶＡは、
（ｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする核酸、
（ｉｉ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇをコードする核酸、
（ｉｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードし、好ましくは、融合タンパク質として発現される核酸、及び
（ｉｖ）４－１ＢＢＬをコードする核酸、を含む。
一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ表面（ＳＵ）ユニットとＨＥＲＶ－Ｋ膜貫通（ＴＭ）ユニットとを含むＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＨＥＲＶ－Ｋ ＴＭユニットは変異しており、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋ ＴＭユニットは、免疫抑制ドメインが不活性化されるよう変異している。好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬは、変異ＨＥＲＶ－Ｋ ＴＭユニット内に挿入される。より好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬが、ＨＥＲＶ－Ｋ ＴＭの免疫抑制ドメインの一部に取って代わる。
一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号７に示されているようなアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号８に示されているような核酸配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ表面（ＳＵ）ユニットとＨＥＲＶ－Ｋ膜貫通（ＴＭ）ユニットとを含むＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＨＥＲＶ－Ｋ ＴＭユニットは、２０アミノ酸未満、好ましくは１０アミノ酸未満、より好ましくは８アミノ酸未満、最も好ましくは６アミノ酸に短縮される。
一実施形態では、（ｉ）の核酸は、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ表面（ＳＵ）ユニットを含むＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードし、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ ＳＵユニットのＲＳＫＲフューリン切断部位が欠失している。好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬは、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ ＳＵユニットのＣ末端に結合している。
一実施形態では、（ｉ）の核酸は、異種膜アンカー、好ましくは、ヒトＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体に由来するものを含むＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬをコードする。
一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号１１に示されているようなアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、（ｉ）の核酸配列は、配列番号１２に示されているような核酸配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、固形腫瘍、原発固形腫瘍及び／または二次腫瘍は、がん性または悪性の腫瘍である。
一実施形態では、固形腫瘍、原発固形腫瘍及び／または二次腫瘍は、メラノーマまたは悪性乳房腫瘍、結腸腫瘍もしくは卵巣腫瘍である。
一実施形態では、二次腫瘍は、転移である。
一実施形態では、二次腫瘍は、固形腫瘍である。あるいは、二次腫瘍は、例えば、血液リンパ等の体液中に浮遊している腫瘍細胞の集合であるか、または体腔、例えば、腹腔内に存在している。ただし、組み換えＭＶＡが局所的または腫瘍内に投与される原発腫瘍または二次腫瘍は、常に固形腫瘍である。
一実施形態では、組み換えＭＶＡが局所的または腫瘍内に投与されない腫瘍は、郭清できないかまたは手術によるアクセスが困難である。
一実施形態では、原発腫瘍及び二次腫瘍は、互いに空間的に遠位にある。
一実施形態では、二次腫瘍及び別の二次腫瘍は、互いに空間的に遠位にある。
一実施形態では、原発腫瘍及び二次腫瘍は、対象の体の同じ組織または器官内に位置する。
一実施形態では、二次腫瘍及び別の二次腫瘍は、対象の同じ組織または器官内に位置する。
一実施形態では、原発腫瘍及び二次腫瘍は、対象の体の異なる組織または器官内に位置する。
一実施形態では、二次腫瘍及び別の二次腫瘍は、対象の体の異なる組織または器官内に位置する。一実施形態では、二次腫瘍はナイーブである、すなわち、以前に組み換えＭＶＡにより局所に、好ましくは腫瘍内に処置されなかった。
一実施形態では、腫瘍は、少なくとも部分寛解にあり、例えば、少なくとも５０％超の寛解にあり、好ましくは、完全寛解にある。
一実施形態では、組み換えＭＶＡは、局所、好ましくは腫瘍内以外に投与されない。したがって、組み換えＭＶＡは、対象に、例えば、全身、静脈内、腹腔、非経口、皮下、または鼻腔内に投与されない。
一実施形態では、抗腫瘍免疫記憶は、長期である、すなわち、数日、数週間、数か月、数年または数十年持続する。
治療方法
本発明は、２つ以上の腫瘍を有する対象のための治療方法であって、対象の全腫瘍数よりも少ない腫瘍が組み換えＭＶＡの局所投与によって治療される、方法を提供する。すなわち、本発明は、複数の腫瘍を有する対象のための治療方法であって、前記複数の腫瘍のうち、すべてにではなく少なくとも１つに対して組み換えＭＶＡを局所的に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組み換えＭＶＡを局所的に投与する工程は、腫瘍内注射を含む。このようにして、治療方法は、組み換えＭＶＡが局所的または腫瘍内に投与または注射された「治療腫瘍」または「注射腫瘍」、及び組み換えＭＶＡが局所に投与されなかったかまたは組み換えＭＶＡが注射されなかった「未治療腫瘍」または「未注射腫瘍」を生じさせると言うことができる。治療方法はまた、前記対象の少なくとも１つの他の腫瘍に組み換えＭＶＡを局所に投与するかまたは腫瘍内に注射することによって、対象での未注射腫瘍を治療する方法を提供すると言うこともできる。本発明の方法のいくつかの実施形態では、対象は、ヒト患者である。
いくつかの実施形態では、治療方法は、第１または原発の腫瘍の転移または再発を、前記第１または原発の腫瘍への組み換えＭＶＡの局所投与によって（いくつかの実施形態では、腫瘍内注射によって）治療することを含む。いくつかの実施形態では、対象における複数の腫瘍のうち、どれが第１に発生したもの（すなわち、「原発腫瘍」）かを決定することが不可能であり、方法は、複数の腫瘍のうちの少なくとも１つを、ＭＶＡの局所投与または腫瘍内注射によって治療することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、「転移」または「二次腫瘍」とは、腫瘍が、「第１の腫瘍」または「原発腫瘍」として示された腫瘍とは異なる位置にあるかまたは異なる境界を有することを意図している。
本発明の方法は、対象における複数の腫瘍のうちの少なくとも１つを、局所投与もしくは腫瘍内注射によって治療すること、または前記腫瘍のうち少なくとも２つの腫瘍、少なくとも３つ、少なくとも４つ、もしくはそれ以上を治療すること、または前記対象における複数の腫瘍のうち１つを除いたすべてを治療することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象の全腫瘍数よりも少ない腫瘍が組み換えＭＶＡの局所投与または腫瘍内注射によって注射または治療される限り、対象におけるいかなる数の腫瘍もそのように注射または治療され得ることを提供する。
本発明は、いかなる特定の機序または作用様式にも拘束されないが、前記対象における少なくとも１つのＴＡＡもしくは腫瘍またはその細胞に対する免疫応答を刺激するか、あるいは少なくとも１つの二次腫瘍または未注射腫瘍の体積もしくはサイズの減少を生み出す限りは、どの方法も本発明の実施において好適である。「免疫応答を刺激する」とは、新規または増大した免疫応答の兆候が、例えば、本明細書での実施例で例示されるような、ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の増加及び／または対象のＣＤ８＋ Ｔ細胞により産生されるＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－２の量の増加のように、対象において特定することができることを意図している。このようにして、本発明はまた、対象に対し本発明の組み換えＭＶＡを腫瘍内に投与する工程を含む、ＴＡＡに対する免疫応答を刺激する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組み換えＭＶＡは、（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸、及び（ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸、を含む。組み換えＭＶＡはさらに、追加のＴＡＡをコードする追加の核酸を含んでよい。本発明の方法は、少なくとも１つのＴＡＡ及び４－１－ＢＢＬの両方をコードする組み換えＭＶＡを用いる使用に好適である。いくつかの実施形態では、組み換えＭＶＡは、少なくとも１つのＴＡＡ及び４－１－ＢＢＬを発現し、これは、当該技術分野で公知の技術を使用して示され得る。
本発明の方法及び組成物において有用な様々なＴＡＡ及び４－１－ＢＢＬの配列は当該技術分野で公知であり、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０８１９４２（ＷＯ２０２０／１０４５３１として公開）及び欧州特許出願第１９２１０３６９．５号に記載されており、それらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的な４－１－ＢＢＬ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１（及び配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び／または配列番号４に記載の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列）に記載されている。本発明の使用及び方法において有用な組み換えＭＶＡはまた、例えば、欧州特許出願第１９２１０３６９．５号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、４－１－ＢＢＬをコードする核酸配列は、配列番号３とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である４－１－ＢＢＬをコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号４に記載の配列であるか、または配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する４－１－ＢＢＬをコードする。
特定の実施形態では、ＴＡＡをコードする核酸配列は、例えば、本明細書で提供されている配列表に記載の配列のような、これまでに既知のＴＡＡとのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるＴＡＡをコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列表に記載のアミノ酸配列を有するＴＡＡ、または当該技術分野で公知のアミノ酸配列を有するＴＡＡをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの個々の腫瘍は、投与後に腫瘍が増殖を続けているのか、またはサイズが増大しているのか減少しているのかを決定するため、の組み換えＭＶＡの局所投与（例えば、腫瘍内注射）の前後に測定される。いくつかの方法では、少なくとも１つの個々の腫瘍の反応を追跡するため、投与後、間隔をおいて追加の測定が行われる場合がある。そのような測定は、任意の好適な技術によるものでよく、それらとして、視覚的評価または外部測定ならびにＸ線、超音波イメージング、生体顕微鏡、または当該技術分野で公知の他の任意の好適な方法を挙げることができる。治療に対する腫瘍の反応及び／または治療の有効性を評価するために用いられる腫瘍測定には、例えば、腫瘍の少なくとも１つの直径及び／または腫瘍体積の推定を含めることができる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の腫瘍を有する対象を治療する方法は、（ａ）前記対象での腫瘍について第１の測定値を取得する、（ｂ）少なくとも１つから１つ以上であるが、全部より少ないＴＡＡを発現する組み換えＭＶＡを前記対象の腫瘍に投与して、治療または注射された腫瘍と未治療または非注射の腫瘍を生じさせる、（ｃ）前記未治療または非注射の腫瘍のうちの少なくとも１つについて第２の測定値を取得する、及び（ｄ）前記第２の測定値を前記未治療または非注射の腫瘍の第１の測定値と比較する、という工程を含み、それにより、前記測定値の低下または前記測定値の上昇の欠如は、腫瘍が退縮したかもしくは体積が減少したこと、または腫瘍増殖が遅延されていることを示す。いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所でさらに考察されているように、これらの方法に使用する組み換えＭＶＡは少なくとも１つのＴＡＡ及び４－１－ＢＢＬを発現する。
いくつかの実施形態では、原発腫瘍及び１つ以上の転移、または転移の可能性を有する（すなわち、悪性腫瘍を有する）対象を治療する方法は、新規または追加の転移を予防することが意図され、これは、（ａ）転移のリスクがある１つ以上の腫瘍を対象において特定する、（ｂ）前記対象の腫瘍のうち全部ではなく少なくとも１つに対し、ＴＡＡを発現する組み換えＭＶＡを局所的に投与する（いくつかの実施形態では、腫瘍内注射による）、（ｃ）前記対象において新たな腫瘍または転移が何も検出できないことを確認するため、前記対象において腫瘍の検出を行う、という工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所でさらに考察されているように、これらの方法に使用する組み換えＭＶＡはＴＡＡ及び４－１－ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態では、これらの方法に使用する組み換えＭＶＡは、ＴＡＡをコードする異種核酸及び４－１－ＢＢＬをコードする異種核酸を含むが、対象を治療するためにＭＶＡの成分としてかまたは別々に使用される場合に、対象の免疫応答に影響を与え得るかまたは対象の免疫応答に影響を与えることが予想される異種核酸によりコードされるいかなる追加の遺伝子も含まない。
いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍のある対象でのアクセスできない腫瘍を治療する方法であって、複数の腫瘍のうち少なくとも１つのアクセス可能な腫瘍に組み換えＭＶＡを局所的に投与する工程を含み、組み換えＭＶＡが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸及び４－１－ＢＢリガンド（４－１－ＢＢＬ）をコードする第２の核酸を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組み換えＭＶＡは、少なくとも１つの追加のＴＡＡをコードする少なくとも１つの追加の核酸、または少なくとも２つ、３つ、もしくは４つ以上の追加のＴＡＡをコードする少なくとも２つ、３つ、もしくは４つ以上の追加の核酸を含む。いくつかの実施形態では、組み換えＭＶＡを局所的に投与する工程は、腫瘍内注射を含む。
「アクセスできない腫瘍」とは、腫瘍内注射及び／または他の技術の使用等の組み換えＭＶＡの局所投与によって直接治療することが困難な腫瘍を意図している。「アクセスできない腫瘍」または切除不能な腫瘍は、体内の敏感な領域、例えば、重要な神経もしくは血管の近傍もしくは周辺、または脳内、あるいは別の場所であって、手術及び／または組み換えＭＶＡの局所投与が、対象への損傷のリスクとなる可能性がある場所及び／または投与することが困難と考えられる場所に位置している場合がある。本発明は、複数の腫瘍がある対象でのアクセスできない腫瘍または切除不能な腫瘍を治療する方法であって、よりアクセスがしやすい、及び／または局所投与が対象への損傷を引き起こす可能性が高くない異なる腫瘍への局所投与の工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象でのアクセスできない腫瘍を治療する方法を提供し、（ａ）対象において少なくとも１つのアクセスできない腫瘍及び少なくとも１つのアクセス可能な腫瘍を特定すること、及び（ｂ）ＴＡＡを発現する組み換えＭＶＡを、前記対象の少なくとも１つのアクセス可能な腫瘍に局所的に投与すること、を含む。任意選択で、この方法はさらに、腫瘍の増殖が減速または停止したことを確認する、及び／または組み換えＭＶＡの投与の後に前記対象に増大免疫応答または新規免疫応答があるかどうかを決定する、前記アクセスできない腫瘍をモニタリングする工程を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、複数の悪性腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ＴＡＡを発現する組み換えＭＶＡを前記腫瘍のうちの少なくとも１つに局所的に投与して治療腫瘍を生じさせることを含み、治療が、治療腫瘍及び組み換えＭＶＡで直接治療または注射されなかった少なくとも１つの他の腫瘍（「未治療腫瘍」または「未注射腫瘍」とも言う）の腫瘍体積の縮小をもたらす、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、「腫瘍内注射」とは、腫瘍内、または腫瘍の境界内部に投与が行われることを意図している。いくつかの実施形態では、「局所投与」とは、腫瘍に近接して投与が行われることを意図している。当業者は、そのような注射はまた同時に、腫瘍の位置に応じて、例えば、非経口または皮下等の別の種類の投与として特徴付けられ得ることを認識している。
詳細な記載
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
過去において、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作製された（概説については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．１９７５）。このウイルスは、その実質的に変化した特性を考慮して、継代５７０代目でＣＶＡからＭＶＡに改名された。ＭＶＡは５７０代目までさらなる継代を受けた。これらの長期継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その約３１キロベースのゲノム配列が欠失しており、そのため、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１）。この得られたＭＶＡが、完全に複製能のある出発材料と比較して大いに非病原性であることが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ ａｎｄ Ｄａｎｎｅｒ １９７８）。
本発明の実施において有用なＭＶＡとしては、ＭＶＡ－５７２（１９９４年１月２７日にＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として寄託）、ＭＶＡ－５７５（２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託）、ＭＶＡ－Ｉ７２１（Ｓｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９に参照されている）、ＮＩＨクローン１（２００３年３月２７日にＡＴＣＣ（登録商標）ＰＴＡ－５０９５として寄託）、及びＭＶＡ－ＢＮ（２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託）が挙げられる。
より好ましくは、本発明に従って使用されるＭＶＡとしては、ＭＶＡ－ＢＮ及びＭＶＡ－ＢＮ派生物が挙げられる。ＭＶＡ－ＢＮは、ＷＯ０２／０４２４８０に記載されている。「ＭＶＡ－ＢＮ派生物」とは、本明細書に記載されているようなＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分に差異を示す任意のウイルスを指す。
ＭＶＡ－ＢＮ、及びＭＶＡ－ＢＮ派生物は、複製能力がなく、複製能力がないとは、インビボ及びインビトロで生殖複製できないことを意味する。より具体的には、インビトロのＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮ派生物は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で生殖複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ １９８８）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ－２）では生殖複製不能であると説明されている。加えて、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮ派生物は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ウイルス増幅率がＭＶＡ－５７５の少なくとも２分の１、より好ましくは３分の１である。ＭＶＡ－ＢＮ及びＭＶＡ－ＢＮ派生物のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０及びＷＯ０３／０４８１８４に記載されている。
上記で説明したように、インビトロでのヒト細胞株における「生殖複製不能である」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０に記載されており、これはまた、上記のような望ましい特性を有するＭＶＡを得る方法も教示する。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０またはＵＳ６，７６１，８９３に記載されているアッセイを使用して、感染後４日でインビトロでのウイルス増幅率が１未満であるウイルスに当てはまる。
組み換えＭＶＡウイルスの例示的作製
本明細書で開示されている組み換えＭＶＡの作製には、異なる方法を適用してよい。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミドコンストラクトに配置することができる。これとは別に、挿入されるＤＮＡ配列は、プロモーターに連結することができる。このプロモーター－遺伝子連結体は、そのプロモーター－遺伝子連結体が両端で、非必須座位を含有するポックスウイルスＤＮＡ領域に隣接しているＤＮＡ配列と相同なＤＮＡと隣接するよう、プラスミドコンストラクト内に配置することができる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内での増殖により増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドは、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）等の細胞培養物に、培養物がＭＶＡに感染すると同時にトランスフェクトすることができる。プラスミド内の相同ＭＶＡウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするヌクレオチド配列の存在により改変されているＭＶＡを生成し得る。
好ましい実施形態によれば、細胞培養に好適な細胞、例えばＣＥＦ細胞に、ＭＶＡウイルスを感染させることができる。続いて、感染した細胞に、本明細書で提供される核酸のうちの１つ以上等の外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第１のプラスミドベクターを、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で、トランスフェクトすることができる。上記で説明されているように、プラスミドベクターは、ＭＶＡウイルスゲノムの選択された部分への外来配列の挿入を誘導する能力がある配列も含む。任意選択で、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに機能的に連結されたマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットも含有する。選択カセットまたはマーカーカセットの使用により、作製された組み換えＭＶＡの特定及び単離が簡略になる。ただし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。その後、さらなる細胞に、上記のようにして得られた組み換えＭＶＡを感染させ、それに第２の外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第２のベクターをトランスフェクトすることができる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入されるべきであり、第２のベクターにおいても、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子（複数可）の組み込みを誘導する、ポックスウイルスと相同な配列が異なる。相同組み換えが行われた後、２つ以上の外来遺伝子または異種遺伝子を含む組み換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組み換えウイルスに導入する場合、前の感染工程で単離された組み換えウイルスを用いることによって、かつトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子（複数可）を含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。組み換えＭＶＡを作製するために知られている他の技術が多数ある。
本発明の実施では、特に明記しない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組み換え技術の従来技術が用いられ、それらはいずれも当業者の技量の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズ、ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ，Ｈａｍｓ ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ，１９８８を参照のこと。
以下の実施例は、本開示をさらに例示する役割を果たす。それらは、範囲が添付の特許請求の範囲によって決定される本発明を限定するものとして理解されるべきではない。
実施例１：材料及び方法
１．１ ＭＶＡ組み換え体の作製
ＭＶＡ組み換え体の作製を、以前に報告されているように行った［１］。ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）は、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって作製されたが、それはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されている（Ｖ０００８３００８）。オボアルブミンを発現する組み換えＭＶＡ（ＭＶＡ－ＯＶＡ）の作製は以前に報告された［１、２］。４－１ＢＢＬをコードする遺伝子が合成され（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭＶＡ－ＯＶＡゲノム内にクローニングされ、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬが作製された。マウス白血病ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質Ｇｐ７０をコードする遺伝子が合成され（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭＶＡ及びＭＶＡ－４－１ＢＢＬそれぞれのゲノムにクローニングされ、ＭＶＡ－Ｇｐ７０及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬが作製された。動物実験に使用されたウイルスはいずれも、スクロースクッションにより２回精製された。
１．２ 倫理に関する記述
動物実験は、Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ行政機関の動物倫理委員会（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ，Ｓａｃｈｇｅｂｉｅｔ ５４，Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ）によって承認され、動物実験のための承認ガイドラインに従ってＢａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ ＧｍｂＨにて行われた。両側のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍実験は、を行った、ＣＩＭＡ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｖａｒｒａ（Ｐａｍｐｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）にて、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）を遵守して行われた。
１．３ マウス及び腫瘍細胞株
６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ－２ｂ）マウス及びＢａｌｂ／ｃＪ（Ｈ－２ｄ）マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入した。全マウスとも、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ ＧｍｂＨ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｖａｒｒａの動物施設にて機関のガイドラインに従って取り扱い、給餌、飼育及び維持が行われた。
Ｂ１６．ＯＶＡメラノーマ細胞株は、Ｒｏｍａｎ Ｓｐｏｒｒｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）のご厚意により贈与された。Ｂ１６．Ｆ１０（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－６４７５（商標））及びＣＴ２６．ＷＴ（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２６３８（商標））の細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。腫瘍細胞は、１０％ＦＣＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（試薬はいずれもＧｉｂｃｏ製）を添加したＤＭＥＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養された。Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃで行われた実験に使用されたすべての腫瘍細胞株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ陰性について定期的にＰＣＲで検査された。
１．４ 腫瘍細胞注射
マウスに、５×１０５の腫瘍細胞を側腹部に皮下注射した。Ｂ１６．ＯＶＡ及びＢ１６．Ｆ１０に関しては、注射の前に、細胞を７ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）と混合した。皮下の両側腫瘍実験の場合、５×１０５及び１×１０５のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍細胞をそれぞれ、右側腹部及び左側腹部に注射した。腫瘍再投与実験は、腫瘍消失時、３～６か月の間に実施した。皮下再投与は、５×１０５の腫瘍細胞を使用して反対側の側腹部に行った。静脈内再投与は、２×１０５のＣＴ２６．ＷＴ細胞を注射して実施した。キャリパーを使用して腫瘍直径を週２回、定期的に測定した。
１．５ 免疫
腫瘍内注射は、それぞれのＭＶＡ組み換え体を含有する総体積５０μｌを用いて固形腫瘍塊内に投与された。腫瘍分類後０日目、５日目及び８日目に連続腫瘍内注射を実施し、縦の点線でグラフに示した。必要に応じ、末梢血免疫細胞の表現型決定のために、最終腫瘍内免疫から３日後に血液を採取した。
１．６ 細胞の分離
必要に応じ、マウスから脾臓及びリンパ節を採取した。脾臓及びリンパ節の単一細胞懸濁液を、４０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）に通して機械的に破壊することによって調製した。脾臓試料を赤血球溶解（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に供した。
２％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム及び２．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するＰＢＳに血液を採取した。赤血球溶解バッファーで赤血球を溶解させることによって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。上述の器官からの単核球を洗浄し、ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳに再懸濁させて計数し、さらなる分析まで氷上で維持した。１００μｌのＴｒｕｅＣｏｕｎｔ計数用ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腫瘍細胞懸濁液に加えた。
１．７ ペプチド再刺激
必要に応じ、単核球を、２．５μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド［ＯＶＡ２５７－２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）；ｐ１５Ｅ６０４－６１１（ＫＳＰＷＦＴＴＬ）；ＡＨ１６－１４（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）］と共にＴ細胞培地及び１０μｇ／ｍｌのＢＦＡ中で３７℃、５％ＣＯ２にて５～６時間インキュベートした。ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。
１．８ フローサイトメトリー
染色前に固定可能ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ生存率キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、単核球懸濁液、ＢＭＤＭまたは腫瘍細胞を暗所で４℃にて３０分間染色した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏｌｅｇｅｎｄからの抗体を使用して単核球を染色した。必要に応じ、Ｈ－２ｋｂ ＯＶＡ２５７－２６４－デキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）、Ｈ－２Ｋｂ ｐ１５Ｅ６０４－６１１－ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）またはＨ－２Ｌｄ ＡＨ１６－１４ ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を使用して細胞懸濁液を染色した。ＦｏｘＰ３転写因子及びＫｉ６７の染色では、ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞を固定した。細胞内サイトカイン染色では、ＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞内サイトカイン検出用に細胞懸濁液を染色及び固定した。デジタルフローサイトメーター（ＬＳＲ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して全細胞について取得し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．３（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。
１．９ ＭＶＡ特異的ＤＮＡゲノムコピーの定量のための定量的リアルタイムＰＣＲ
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを製造者の指示書に従って使用して（Ｑｉａｇｅｎ）組織からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、ＮａｎｏＶｕｅ分光光度計（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）で定量した。簡潔に述べると、ＭＶＡの骨格ＤＮＡ検出のための標的である、ＭＶＡのオープンリーディングフレーム０８２Ｌを発現するプラスミドを使用して、５×１０７のゲノムコピー（ｇｃｓ）で開始する標準曲線を作成した。次いで、特異的プライマーのＭＶＡ０８２Ｌセンス５’－ａｃｇｔｔｔａｇｃｃｇｃｃｔｔｔａａｔａｇａｇ－３’、ＭＶＡ０８２Ｌアンチセンス５’－ｔｇｇｔｃａｇａａｃｔａｔｃｇｔｃｇｔｔｇｇ－３’、及びフルオレセインプローブ６ＦＡＭ－ａａｔｃｃｃａｃｃｇｃｃｔｔｔｃｔｇｇａｔｃｔｃ－ＢＢＱを使用してＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の７５００ソフトウェアにより計算を実施した。ソフトウェアは、あらゆる標準の希釈、コントロール及び反復について閾値サイクル（ＣＴ）を決定し、これは、特定のＤＮＡの遺伝子コピー量の対数に反比例する。標準曲線に基づいて、ソフトウェアが、各反復について測定されるＣＴ値を使用して標的遺伝子のそれぞれの遺伝子コピー数を決定した。試料の量（ｇｃｓ）は、その複製決定値の平均量により計算される。
１．１０ 統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２（Ｗｉｎｄｏｗｓ用）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、図面の説明に記載のように統計解析を実施した。免疫学的データの場合、結果は「平均」及び「平均値の標準誤差」（ＳＥＭ）として示されている。多重比較検定または片側の対応のないスチューデントのｔ検定のいずれかと共に分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、処置群間の統計学的有意性を決定した。処置後の腫瘍担持マウスの生存率の場合、Ｌｏｇ ｒａｎｋ検定を実施して処置群間の統計学的有意性を決定した。
実施例２：４－１ＢＢＬは腫瘍内ＭＶＡ免疫療法を強化する
ポックスウイルスのＩＴ適用は抗腫瘍応答を効果的に誘導することが様々な腫瘍モデルで示されている［２４～２８］。しかしながら、これらの研究の大部分は複製型ウイルスを用いて行われている。ここでは、腫瘍関連抗原（上記で定義したＴＡＡ）及び共刺激分子４－１ＢＢＬをコードする非複製性ポックスウイルスＭＶＡを使用する、確立された腫瘍の局所治療が、強力な抗腫瘍効果を与えるかどうかを検討した。
ＴＡＡオボアルブミン（本明細書ではＭＶＡ－ＯＶＡと呼ぶ）をコードするＭＶＡのＩＴ注射は、確立されたＢ１６．ＯＶＡメラノーマを担持するマウスの腫瘍増殖及び生存延長を制御した（図１のＡ及びＢ）。注目すべきことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのＩＴ投与は、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍担持マウスの腫瘍拒絶を５０％に増大させた（図１のＢ）。最終ＩＴ注射後の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の分析から、局所ＭＶＡ－ＯＶＡ処置により誘発された、ＴＡＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の全身性の増殖が、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬのＩＴ投与によって増大したことが明らかになった（図２Ａ）。
次に、他の独立した、確立された腫瘍モデルを評価した。内在性レトロウイルス抗原Ｇｐ７０をコードするＭＶＡ（本明細書ではＭＶＡ－Ｇｐ７０と呼ぶ）のＩＴ投与［２９、３０］は、Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマにおいて抗腫瘍効果をもたらした（図１のＣ及びＤ）。興味深いことに、ＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬは、腫瘍増殖制御を顕著に延長し、マウスの生存率を顕著に改善した（図１のＣ及びＤ）。同様の結果が、ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬによるＩＴ免疫後のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスにおいて観察された（図１のＥ及びＦ）。ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの局所投与は、８０％超のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍拒絶をもたらした。Ｇｐ７０由来ペプチドによるＰＢＬの再刺激では、Ｂ１６．Ｆ１０及びＣＴ２６．ＷＴの腫瘍を担持するマウスそれぞれにおいて、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ ＩＴレジメン時、ｐ１５Ｅ（Ｈ－２Ｋｂ拘束性Ｇｐ７０ペプチド）特異的及びＡＨ１（Ｈ－２Ｋｄ拘束性Ｇｐ７０ペプチド）特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の強い誘導が明らかになった（それぞれ図２Ｂ及び図２Ｃ）。注目すべきことに、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬまたはＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬのＩＴ処置時に治癒したＣ５７ＢＬ／６マウスの７０％超が白斑を発症した（図２Ｄ及び図２Ｅ）。以上をまとめると、４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡのＩＴ投与は、使用した腫瘍抗原または腫瘍モデルの種類とは関係なく、ＭＶＡ媒介性抗腫瘍免疫応答を増強させる。
実施例３：ＩＴ注射ＭＶＡは腫瘍に局所化し、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の変化を誘導する
ＩＴ ＭＶＡ注射後にＴ細胞がＴｄＬＮで急速に増殖することが確立されたことから、複製欠損ＭＶＡは注射部位にのみに存在するのか、または他の器官へ移行するのかという疑問が生じた。このことに対処するため、ＩＴ注射から６時間後の腫瘍、ＴｄＬＮ、ＮｄＬＮ、脾臓及び血液におけるＭＶＡ由来ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の存在を決定した。重要なことには、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍では大量にＭＶＡ ｇＤＮＡが検出され、ＴｄＬＮで出現は最小限であった（図３のＡ）。
ＩＴ適用後、ＭＶＡ感染は主に腫瘍に限定され、したがって、ウイルスにより誘導された抗腫瘍免疫応答は腫瘍を起源とする可能性が高いことが示された。このことから、ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬのＩＴ注射はＴＭＥの変化を誘導する可能性があるという仮説を立てた。Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍へのＭＶＡまたはＭＶＡ－ＯＶＡのＩＴ注射では、ＰＢＳと比較して炎症誘発性分子ＩＦＮγ及びＴＮＦαのアップレギュレーションがもたらされた。この効果は、ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬにより顕著に増大した（図３のＢ）。興味深いことに、ＩＦＮγ及びＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインがほぼ例外なく４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡによって誘導された（図３のＢ）。
複製型ウイルスは、感染した腫瘍細胞及び免疫細胞の死を誘導する［３３～３５］。ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＴＡＡまたはＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬによる感染は、インビトロでＢ１６．ＯＶＡ及びＣＴ２６．ＷＴの腫瘍細胞の死を増強させた（図７のＡ）。ＭＶＡに選択的に感染することが示されているマクロファージ［３６］は効果的に死滅し、それにより、この効果が４－１ＢＢＬアジュバントによって顕著に増大した（図７のＡ）。細胞死は、自然免疫細胞により感知されて免疫応答の開始に寄与する高移動度ボックス１（ＨＭＧＢ１）等の細胞内タンパク質の放出をもたらす［３７、３８］。４－１ＢＢＬとは関係なく、腫瘍細胞またはマクロファージのＭＶＡ感染後にＨＭＧＢ１の顕著な増大が検出された（図７のＢ）。
今回の結果は、ＭＶＡの局所注射がＭＶＡにコードされた遺伝子のＩＴ発現を生じさせ、ＴＭＥにおける炎症、感染細胞の細胞死、及び免疫原性メディエーターの放出の誘導をもたらしたことを示唆している。
実施例４：局所ＭＶＡ免疫療法は遠位未治療病変の腫瘍増殖を制御する
腫瘍指向性免疫療法の目的は、遠隔転移も根絶する全身性抗腫瘍免疫応答を生じさせることである。ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬによる局所処置は、強い腫瘍特異的Ｔ細胞応答をＴＭＥにおいて誘導しただけではなく、血液でもまた誘導したことから、次に、遠位腫瘍病巣に対するＩＴ ＭＶＡ免疫療法の全身性抗腫瘍能を評価した。ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの左右の側腹部に皮下移植した（図４のＡ）。ＭＶＡ－Ｇｐ７０のＩＴ注射は、ＰＢＳと比較して腫瘍増殖を遅延させた（図４のＢ及びＣ）。ＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ注射は、１０匹中７匹のＣＴ２６．ＷＴ腫瘍担持マウスに治療腫瘍の消失をもたらした（図４のＤ）。重要なことには、ＭＶＡ－Ｇｐ７０及びＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬの局所投与はいずれも腫瘍増殖遅延をもたらし、いくつかの症例では未治療腫瘍病変の完全な腫瘍消失をもたらした（図４のＣ及びＤ）。このデータは、ＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ免疫療法による、遠位未治療腫瘍病変に対する抗腫瘍免疫応答の効果的な誘導を示している。
実施例５：ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ治療は、局所及び全身の腫瘍再投与からの防御を付与する
がんワクチンの主な目標の１つは、腫瘍再発を予防するための長期防御免疫記憶を達成することである。したがって、最初に、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬで誘導された抗腫瘍応答が、局所腫瘍再投与に対して防御する免疫記憶を生じさせるかどうかを評価した（図５Ａ）。コントロールとして使用されたナイーブマウスでは腫瘍が急速に増殖し、一方それまで、ＩＴ ＭＶＡ－ＯＶＡ処置後に治癒していたマウスでは、再投与時の腫瘍再増殖の有病率が高かった。対照的に、それまでにＩＴ ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬを投与されていたマウスの８０％では、二次腫瘍増殖に対して抵抗性であった（１１匹中９匹）（図５Ｂ）。同様の結果が、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ処置後に治癒してＢ１６．Ｆ１０細胞の局所再投与を受けたマウスで得られた。前処置されたマウスの６０％は、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍細胞移植後、腫瘍がないままであった（図６のＡ）。したがって、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ治療は、局所腫瘍再投与に対する強い防御免疫記憶を誘導する。
ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＭＶＡ－ＯＶＡではなくＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬによるＩＴ処置後に腫瘍を拒絶したマウスで再投与の前にすぐに検出することができた（図５Ｃ）。腫瘍細胞注射から７日後、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞集団は顕著に増殖していたが、これは効果的腫瘍認識を示す（図５Ｃ）。脾細胞ＯＶＡ２５７－２６４ペプチド再刺激では、ＩＴ ＭＶＡ－ＯＶＡ－４－１ＢＢＬ療法は、複数サイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の大きな集団を誘導したことが示された（図５Ｅ）。腫瘍再投与後４１日目の脾臓、血液、ＴｄＬＮ及びＮｄＬＮの分析から、分析されたすべての器官におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の蓄積が明らかになった（図５Ｄ）。メモリーサブセット検査［３１］から、ＯＶＡ特異的ＴＣＭ細胞はすべての器官にわたり等しく分布していた一方で、ＴＥＭ細胞は血液、脾臓及びＴｄＬＮに主に見られたが、ＮｄＬＮではみられなかったことが明らかになった（図５Ｆ）。次に、抗腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが示されている組織常在型メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）を分析した［３２、３３］。際だったことに、ＴｄＬＮのみに位置する常在型メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）の相当量の集団も検出することができた（図５Ｆ）［３４］。同様に、血液中のｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ処置時に原発Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍が除去されたマウスへの再投与の前後で検出された（図６のＢ）。さらに、ｐ１５Ｅ特異的なＴＣＭ、ＴＥＭ及びＴＲＭ細胞を、Ｂ１６．Ｆ１０再投与後４２日目に同定することができ（図６のＣ～Ｅ）、それによると、後者はＴｄＬＮのみで見られた（図６のＥ）。今回の結果は、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ免疫療法が、ＴＣＭ細胞、ＴＥＭ細胞及びＴＲＭ細胞を包含する腫瘍特異的メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の多様な集団の誘導をもたらしたことを示している。
ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ注射は、局所の再発腫瘍及び未処置病変の制御を媒介する全身免疫応答を誘導した。我々は、ＩＴ ＭＶＡ注射によって生じた腫瘍特異的Ｔ細胞記憶が、転移再発に対して防御するのではないかと推測した（図５Ｇ）。ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍細胞のＩＶ注射後の肺での腫瘍小結節の肉眼的定量では、ナイーブマウスにおける複数病変の発症が示された。それまでにＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０またはＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬにより治癒したマウスの肺では肉眼的転移性病変は見られなかった（図５Ｈ）。Ｔ細胞分析から、ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬで治癒したマウスにおける多機能性ＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の集団が明らかになった（図５Ｉ）。
以上をまとめると、腫瘍抗原を共刺激分子４－１ＢＢＬと共に発現するよう遺伝子が改変されたＭＶＡを使用する局所免疫療法では、自然免疫及び適応免疫の活性化を併せることにより強い抗腫瘍活性が与えられる。これは、全身性抗腫瘍効果の誘導だけではなく、局所及び全身の腫瘍再投与に対して防御する強力な腫瘍特異的記憶応答の発生ももたらした。
実施例６：結果についてのさらなる考察
今回の研究では、腫瘍指向性ウイルス療法に対して新手法を用い、ＴＡＡ及び共刺激分子４－１ＢＢＬを発現するよう遺伝子改変された非複製性ＭＶＡを使用した。これは、ＭＶＡの優れた免疫刺激特性［１２］とその高い安全性プロファイル［３５］に、４－１ＢＢＬの免疫活性化能［２２］を併せ持つ。ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ注射は、一連の即時及び長期の免疫イベントを活性化させ、最終的に腫瘍根絶をもたらす。ＩＴ ＭＶＡ治療による複数の炎症誘発性メディエーターの誘導は、腫瘍特異的Ｔ細胞の再活性化及び増殖を促進する、それまで免疫抑制性のＴＭＥの根本的な変化を示す。治療効果にとっても、また原発腫瘍に対する局所及び全身の長期免疫記憶の形成にとっても必須の細胞傷害性抗腫瘍免疫応答の定性的及び定量的な著しい変化が、ＭＶＡにコードされた４－１ＢＢＬにより誘発された。
非複製性ＭＶＡのＩＴ注射が強力な治療的抗腫瘍効果を与えることが今回初めて示される。興味深いことに、ＭＶＡではなく熱非働化ＭＶＡのＩＴ送達により、主に細胞傷害性Ｔ細胞の活性化に依存した強い抗腫瘍効果が誘導されたことが報告されている［２５］。この研究とは対照的に、ここでは、追加で発現する４－１ＢＢＬがあるＴＡＡ及び追加で発現する４－１ＢＢＬがないＴＡＡをコードする活性ＭＶＡを利用した。重要なことには、ＭＶＡ－ＴＡＡは単独ですでに腫瘍増殖を遅延させるのに効果的であるが、４－１ＢＢＬとのアジュバント作用により治療効果が顕著に改善し、複数のモデル内の確立された腫瘍の拒絶をもたらした。さらに、抗腫瘍効果は腫瘍抗原の選択とは独立したものであった。モデル抗原ＯＶＡとは別に、内在性レトロウイルスタンパク質Ｇｐ７０をそのＴＡＡとしての免疫原性について検討した。内在性レトロウイルスエレメントは、健全な組織ではエピジェネティックに抑制されているが、様々ながんにおいて再活性化され、発現されている［３６］。同様に、Ｇｐ７０は、いくつかのマウス腫瘍細胞株で高発現している［３７］。ヒトでは、これらの非コード領域が強力な免疫原性特性を有し、したがって、がん免疫療法の優れたＴＡＡ標的となるというエビデンスが増えている［３８～４０］。Ｇｐ７０そのものの性質を考えると［４１］、Ｇｐ７０発現腫瘍モデルにおいてＩＴ ＭＶＡ－Ｇｐ７０－４－１ＢＢＬ療法により得られる強い治療効果は、局所ＭＶＡ療法が、ネオアンチゲンを発現している腫瘍の拒絶を誘導するだけではなく、内在性自己抗原に対する寛容も破綻させることができることを示唆している。
ＩＴウイルス療法では、ウイルスにより誘導される炎症及び細胞死を、免疫抑制性ＴＭＥを変化させるという目的で使う［５０］。この一連の事象が、抗腫瘍特異的免疫を増強させるであろう。同様に、今回のデータは、ＭＶＡ感染が、腫瘍細胞死、ひいてはＨＭＧＢ１の放出を促進し（図７のＡ、７Ｂ）、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと同様であることを示す［５１］。さらに、ＭＶＡのＩＴ注射はＴＭＥ内に強い炎症応答を誘発し、これに、ＭＶＡ関連の複数のサイトカイン及びケモカインの誘導が伴った［５２］。４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡのＩＴ適用では、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍でのＩＦＮγ及びＧＭ－ＣＳＦの濃度が著しく増加した（図３のＢ）。これは、それらの分子の誘導が４－１ＢＢシグナル伝達の下流にあることを示している。事実、ＭＶＡ感染腫瘍細胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のインビトロでの活性化は、ＭＶＡにコードされた４－１ＢＢＬの存在下でのみ、大量のＩＦＮγ及びＧＭ－ＣＳＦ産生をもたらした（図３のＢ）。ＩＴ ｒＭＶＡ投与時のＴｄＬＮ及び他の器官における、ＭＶＡにコードされた抗原の分布及びＴ細胞プライミング能を検討した。ＩＴ注射後の異なる器官内のｒＭＶＡの局在について包括的分析を実施することにより、これに対処した。ＭＶＡ ｇＤＮＡは、大部分が腫瘍部位に限局していた。しかしながら、ＭＶＡ ｇＤＮＡは、腫瘍と比較するとかなり少ない量ではあるが、ＴｄＬＮでも検出された。したがって、ＴｄＬＮもまた、腫瘍特異的Ｔ細胞のプライミング部位としての役割を果たし得る。今回の結果は、ＭＶＡの足蹠への注射後にＭＶＡが流入領域ＬＮの傍皮質領域に局在化することを示す先の研究と一致している［４２］。これと一致して、ＮｄＬＮではタンパク質またはｇＤＮＡは見られなかった。
腫瘍指向性免疫療法の重要な側面は、遠隔転移を根絶させ、長期腫瘍免疫を誘導する全身性抗腫瘍免疫応答を生じさせることである。ここでは、局所的ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置が、ＴＭＥ内で免疫応答を誘発しただけではなく、血液中での全身性の抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答ももたらされたことを示した。さらに、多くの個々の実験及び用いた異なるＴＡＡにわたり、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ処置時にメラノーマを拒絶したマウスは、白斑を発症した。白斑は、毛の色素を沈着させる皮膚のメラノサイトを標的とする自己反応性ＣＤ８ Ｔ細胞によって引き起こされる。これらの細胞がＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬウイルス療法によって活性化されており、抗原拡散を介した可能性が高く、これは、最初に焦点を当てた、主要エピトープ特異的な免疫応答、例えば、Ｇｐ７０またはＯＶＡからの、エピトープ特異性の多様化を説明する現象である。腫瘍抗原拡散は、それによって抗腫瘍応答が拡大し、ＴＡＡ消失による腫瘍エスケープの可能性が阻止されるため、がん免疫療法の望ましい特徴である。
さらに、両側腫瘍モデルから得られた今回のデータで、ＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ注射が、未処置病変において顕著な抗腫瘍効果をもたらすことが明確に実証された。したがって、これらの結果は、局所ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬ投与により誘発された抗腫瘍応答は、原発腫瘍に対するシステム全体の免疫に関連したことを強く示している。
以前の抗原との遭遇の記憶を維持する免疫系の能力は、長期免疫の基本である。ここでは、ＩＴ ＭＶＡ投与時に誘導される免疫記憶の成分を定義した。使用された腫瘍モデルまたはマウス系統にかかわらず、腫瘍消失から数か月後に血中ＴＡＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞がマウスで検出された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度は、４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡを使用した場合に顕著に増加した。それまでにＩＴ ＭＶＡ－ＴＡＡ－４－１ＢＢＬにより治癒したマウスは、ＭＶＡ－ＴＡＡで処置された治癒マウスよりもＢ１６．ＯＶＡまたはＢ１６．Ｆ１０による皮下への腫瘍再投与に対して抵抗性であったことを見出した。それらのマウスからの組織の分析では、Ｔ細胞メモリーサブセットが、血中だけではなく複数の解剖学的部位でも見られること示されたことから、免疫監視が示唆された。抗原特異的なＣＤ８＋ ＴＣＭ及びＴＥＭサブセットの頻度増加が、以前に４－１ＢＢＬをコードするＭＶＡの投与を受けた治癒マウスの局所腫瘍再投与後に脾臓及び血液において検出された。ＣＤ８エフェクター及びメモリーＴ細胞の増殖及び維持を増強させる際に、４－１ＢＢＬ／４－１ＢＢシグナルが特に強力であることは十分に確立されている［４３～４５］。同様に、ＭＶＡにコードされた４－１ＢＢＬ共刺激は、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及びエフェクター機能を増強させ、それにより、強力で多様なメモリーコンパートメントの形成がもたらされた。
血中ＣＤ８＋ ＴＣＭ及びＴＥＭサブセットに加え、常在型ＣＤ８＋ ＴＲＭ細胞は、抗腫瘍免疫で協同することが示されている［３２、３３、４６］。興味深いことに、ＩＴ ４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡの後に治癒したマウスでは、Ｂ１６．ＯＶＡまたはＢ１６．Ｆ１０の局所再投与後、ＴｄＬＮにおいてのみ腫瘍特異的ＴＲＭ細胞の頻度増加が示された。ＣＤ８＋ ＴＲＭ細胞は組織で最初に同定されたが、それらはまた、抗原との再遭遇時にマウスの組織から遊走して流入領域ＬＮに蓄積することもできる［３４、４６、４７］。今回の結果と一致して、４－１ＢＢは、鼻腔内免疫時、肺におけるインフルエンザ特異的ＣＤ８＋ ＴＲＭのプールの確立を促進することが示されている［４８］。ここでは、ＩＴ ４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡの際の、ＴｄＬＮでの腫瘍特異的ＣＤ８＋ ＴＲＭ細胞の増殖と、局所二次腫瘍再投与に対する治癒マウスによる良好な反応との間の関係を仮定する。
がんでは、メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞は、分化または維持状態が最適下であること、及び慢性的に抗原に曝露されていることにより、機能不全にあることが多い［４９］。この現象は、ＩＬ－２及びＴＮＦαが分泌不能であることと関連している［５０、５１］。重要なことには、ＩＴ ４－１ＢＢＬアジュバント添加ＭＶＡは能力の高いＣＤ８＋ Ｔ細胞記憶プールを生じさせ、これが、試験したすべての再投与モデルにおいて、腫瘍抗原との再遭遇時に増殖し、ＩＴ ＭＶＡと比較して多量のＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ－２を産生した。
要約すると、４－１ＢＢＬと併せて腫瘍抗原を発現する非複製性ＭＶＡの局所注射に基づいた、新規の治療プラットフォームをここに記載する。ＩＴウイルス注射は、ＴＭＥに重度の炎症誘発性の変化を誘導し、腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の再活性化及び増殖をもたらした。さらに、局所及び全身の腫瘍再投与から防御する多様なＣＤ８＋ Ｔ細胞メモリー集団の発生が実証された。ＭＶＡの優れた安全性プロファイルと合わせると、今回の前臨床データは、臨床でこの手法を検討することの強い根拠を提供する。
最終所見：本明細書の本文全体を通していくつかの文書が引用されている。本明細書で引用した文書の各々（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書等を含む）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる材料が矛盾するかまたは本明細書と一致しない範囲において、そのようないかなる材料にも本明細書が優先する。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由としてかかる開示に先行する権利がないことを承認すると解釈されるべきではない。
実施例７：医学的使用のためのＭＶＡ組み換え体
７．１ ＭＶＡ組み換え体の構築
本開示の要素を実現させる組み換えＭＶＡウイルスの作製は、示されている導入遺伝子を、かかる導入遺伝子のプロモーターと共にベクターＭＶＡ－ＢＮに挿入することによって行った。導入遺伝子は、導入遺伝子及び選択カセット、ならびにＭＶＡ－ＢＮ内の標的座位と相同な配列を含有する、組み換えプラスミドを用いて挿入された。ウイルスゲノムと組み換えプラスミド間の相同組み換えは、ＭＶＡ－ＢＮに感染させたＣＥＦ細胞への組み換えプラスミドのトランスフェクションによって達成した。選択カセットをその後、第２の工程中に除去したが、その際、選択カセットを挟んでいるｌｏｘＰ部位を特異的に標的として介在配列を切り出すＣＲＥリコンビナーゼを発現しているプラスミドを利用した。別法として、選択カセットの除去を、ＭＶＡ由来の内部反復配列を用いたＭＶＡを介した組み換えによって達成した。
組み換えＭＶＡ－ｍＢＮウイルスの作製の際には、ＣＥＦ細胞培養物にそれぞれＭＶＡ－ＢＮを接種し、それぞれに、対応する組み換えプラスミドをトランスフェクトした。次に、これらの細胞培養物からの試料を、選択圧をかける薬物を含有する培地中のＣＥＦ培養物に接種し、蛍光を発現しているウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。これらのウイルスクローンからの蛍光タンパク質含有選択カセットの欠失は、第２の工程において、各コンストラクトでの選択カセットを挟んでいる２つのｌｏｘＰ部位を含むＣＲＥを介した組み換え、またはＭＶＡを介した内部組み換えによって媒介された。第２の組み換え工程後、ＭＶＡ－ＢＮの標的座位に挿入された導入遺伝子配列（例えば、４－１ＢＢＬ）及びそのプロモーターのみを保持した。選択カセットを欠くプラーク精製済みウイルスのストックを調製した。同定導入遺伝子の発現は、記載されているコンストラクトを接種した細胞で実証される。
７．２ ＨＥＲＶ－Ｋ抗原を含む組み換えＭＶＡ
ＭＶＡに基づくベクター（「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ１－４－１－ＢＢＬ－ＣＤ４０Ｌ」とも呼ばれる「ＭＶＡ－ｍＢＮ４８９」）は、ヒト内在性レトロウイルスＫスーパーファミリータンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ）、具体的には、ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇであるＴＡＡを含めて設計された。ＭＶＡはまた、ヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥをコードするよう、またｈ４－１ＢＢＬ及びｈＣＤ４０Ｌを発現するようにも設計された。
同様の「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ１－４－１－ＢＢＬ」と呼ばれるＭＶＡに基づくベクターは、ＴＡＡＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇならびにヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥを発現するよう、またｈ４－１ＢＢＬを発現するよう設計された。具体的には、ベクター「ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ」（「ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４」または「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ」）は、図８Ａに概略的に例示されている。エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質及び群特異抗原（ｇａｇ）タンパク質をコードするＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子は通常、健全なヒト組織では休眠状態であるが、多くの腫瘍で活性化されている。ＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥは、乳癌及び卵巣癌の細胞において特異的にアップレギュレートされる遺伝子である。共刺激分子４－１－ＢＢＬの追加発現は、ＴＡＡに対する免疫応答を増強させることを意図している。
「ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－Ｐｒａｍｅ－ＦＯＬＲ－ＣＤ４０Ｌと呼ばれる別のＭＶＡに基づくベクターは、ＴＡＡＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ及びＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇならびにヒトのＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥを発現するよう、またｈＣＤ４０Ｌを発現するよう設計された。これらのコンストラクトの各々は、本発明の方法において有用である。
例示的配列は当該技術分野で既知であり、また提供されている配列表にも記載されている。関連するＭＶＡに対して必要な機能を提供する限り、どの配列も本発明の組成物及び方法に使用することができる。
上記のＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ及びｇａｇの配列では、少なくとも１０の代表的配列からアミノ酸コンセンサス配列が生成され、以下に示すように、潜在的な免疫抑制ドメインが変異により不活性化され、部分的に免疫優勢Ｔ細胞エピトープＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌに置き換えられた。好適な配列は、配列番号５（ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ合成タンパク質コンセンサス配列）、配列番号６（ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ合成ヌクレオチド配列）、配列番号７（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ合成タンパク質配列）、及び配列番号８（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬヌクレオチド配列）に記載されている。
Figure 2023503858000001
ＥＲＶＫ－ｅｎｖの改変コンセンサスアミノ酸（上記）の配列：
潜在的な免疫抑制ドメインは変異により不活性化された。導入された変異により、免疫抑制ドメインのかなりの部分が免疫優勢Ｔ細胞エピトープＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌに置き換えられる。
これらのＭＶＡのうちいくつかでは、ｈＦＯＬＲ１及びＰＲＡＭＥは、融合タンパク質として産生されるよう設計された。ＦＯＬＲ１（葉酸受容体アルファ）は、葉酸受容体のファミリーに属する。これは、葉酸及びその誘導体に対する高親和性を有し、膜タンパク質として分泌されるかまたは細胞表面に発現される。膜貫通タンパク質は、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを介して原形質膜に係留されており、タンパク質のＣ末端領域のセリン（Ｓｅｒ）残基を介して小胞体（ＥＲ）内で結合している可能性が高い。ＧＰＩ－アンカーによるＦＯＬＲ１の修飾と、ＥＲでのｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の完全なプロセシングを回避するため、アミノ酸の２３４から２５７までのＣ末端領域（Ｓｅｒ残基を含む）を欠失させた。
ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）は、転写調節因子タンパク質である。これは、ヒトメラノーマの抗原として最初に報告され、自己細胞傷害性のＴ細胞媒介性免疫応答を引き起こし、様々な固形がん及び血液がんで発現する。ＰＲＡＭＥは、レチノイン酸受容体への結合を介してレチノイン酸シグナル伝達を阻害し、それにより、がん細胞に増殖優位性を提供し得る。ＰＲＡＭＥの機能性には核局在化を必要とするため、ＰＲＡＭＥの潜在的な核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の標的変異によって改変した。
したがって、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質のアミノ酸配列では、ＦＯＬＲ１を、Ｃ末端のＧＰＩアンカーシグナルを欠失させることにより改変し、ＰＲＡＭＥでは、２つの潜在的な核局在化シグナルをアミノ酸置換により不活性化させた。この融合タンパク質では、ｈＦＯＬＲ１のＮ末端シグナル配列は、ＰＲＡＭＥの核局在化を回避するための追加的保護機構として働くよう、融合タンパク質のＥＲ指向性及び不完全プロセシングをもたらすはずである。
ヒトＦＯＬＲ１及びヒトＰＲＡＭＥのタンパク質配列はそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００７９３．１及びＮＰ＿００１２７８６４４．１に基づいた。上記の改変に加え、融合タンパク質のヌクレオチド配列をヒトのコドン使用について最適化し、ポリヌクレオチド区間、反復エレメント、及び負のシス作用エレメントを除去した。なお、ヌクレオチド配列は、配列番号１０（「ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合」ヌクレオチド配列）に記載され、融合タンパク質配列は、配列番号９に記載されている。
Figure 2023503858000002
ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質（上記）の配列：
改変ヒトＦＯＬＲ１（Ｎ末端部）とＰＲＡＭＥ（Ｃ末端部）の融合体であるｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質のアミノ酸配列。ＦＯＬＲ１は、Ｃ末端のＧＰＩアンカーシグナルを欠失させることにより改変されている（取り消し線文字）。ＰＲＡＭＥ（下線付き文字）では、開始メチオニンを欠失させ、２つの潜在的な核局在化シグナルをアミノ酸置換により不活性化させた（太字、下線付き文字）。
このＭＶＡに使用した膜結合型ヒト４－１ＢＢＬのタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１と１００％の同一性を示し、使用された膜結合型ヒトＣＤ４０Ｌのタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１と１００％の同一性を示す。４－１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌいずれの場合も、ヌクレオチド配列をヒトのコドン使用について最適化し、ポリヌクレオチド区間、反復エレメント、及び負のシス作用エレメントを除去した。
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１．からのｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は配列番号１に記載されており、ｈＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列は配列番号２に記載されている。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬのアミノ酸配列は配列番号３に記載されており、ｈ４－１ＢＢＬのヌクレオチド配列は配列番号４に記載されている。
各コード領域は、ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ及びｈ４－１ＢＢＬがいずれもＰｒ１３２８プロモーターの制御下に置かれた以外は、異なるプロモーターの制御下に置かれた。Ｐｒ１３２８プロモーター（１００ｂｐの長さ）は、ワクシニアウイルスプロモーターＰｒＢ２Ｒの正確なホモログである。これは、前初期の強い発現及び後期の低レベルでの発現を誘導する。組み換えＭＶＡ－ｍＢＮ４８９では、Ｐｒ１３．５長プロモーターがＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬの発現を誘導する。このプロモーターは、天然ＭＶＡ１３．５Ｌ遺伝子の発現を誘導する０１４Ｌ／１３．５Ｌ間の１２４ｂｐの遺伝子間領域を含み、２つの初期プロモーターコア配列によって生じる非常に強い初期発現を示す（Ｗｅｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ７３５１１を参照のこと）。ここでｈＣＤ４０Ｌの発現を誘導するために用いたＭＶＡ１－４０ｋプロモーターは、ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｈ領域から１６１ｂｐの断片として１９８６年に最初に単離された。これは、１５８ｂｐのワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ、及び後期遺伝子転写因子ＶＬＴＦ－４を誘導する０９４Ｌ／０９５Ｒの遺伝子間領域内のＭＶＡゲノムを含む。ここでｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質の発現を誘導するために用いたプロモーターＰｒＨ５ｍは、ワクシニアウイルスＨ５遺伝子プロモーターの改変型である。これは、強い初期及び後期エレメントからなり、組み換えＭＶＡの感染の初期及び後期の両段階における発現をもたらす（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４：１４５１－５８を参照のこと）。
ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４に基づいて（上記を参照のこと）、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬに改変が含有されるよう、さらに別のベクターが設計された。得られたベクターは「ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２」と呼ばれ、図９のＣに概略的に例示されている。ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２はまた、改変ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬに加え、ＥＲＶＫ－ｇａｇ、ｈＦＯＬＲ１－ｈＰＲＡＭＥ融合タンパク質、及びｈ４－１ＢＢＬもコードする。
本来、ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖは、翻訳後に切断されるシグナルペプチド、表面（ＳＵ）及び膜貫通ユニット（ＴＭ）からなる。２つのドメインへの切断は、細胞のプロテアーゼにより達成される。ＲＳＫＲ切断モチーフは、全長９０ｋＤａのタンパク質を切断してＳＵ（およそ６０ｋＤａ）ドメインとＴＭ（およそ４０ｋＤａ）ドメインにするのに必要かつ十分である。上記のＭＶＡ－ｍＢＮ４９４の調製についての記載のように、少なくとも１０の代表的配列に由来するｅｎｖのアミノ酸コンセンサス配列が生成され、ＴＭの潜在的な免疫抑制ドメインが変異によって不活性化された。導入された変異により、免疫抑制ドメインのかなりの部分が免疫優勢Ｔ細胞エピトープＨＥＲＶ－Ｋ－ｍｅｌに置き換えられた。この導入遺伝子（ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４に使用）をＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬと命名した（図９のＡ）。
ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４と比較して、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬのＴＭドメインは、ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２では欠失している。このＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬバリアントを「ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３」と呼ぶことにし、欠失させたＲＳＫＲフューリン切断部位を除くＳＵドメイン全体で構成されている。ＭＥＬペプチドをＣ末端に挿入し、続けてＴＭドメインの６つのアミノ酸（疎水性の強い融合ペプチド配列を除外）を挿入した。さらに、この改変ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬを、ヒトＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体に由来する膜アンカーを付加することにより原形質膜に指向させた。この膜アンカーを、可動性のグリシン含有リンカーを介してＳＵドメインに結合させた（図９のＢ）。得られたＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬバリアント、すなわち、ＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３は、ＭＶＡ－ｍＢＮ５０２に含有されている（図９のＣ）。バリアントの好適な配列は、配列番号１１（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３合成タンパク質配列）及び配列番号１２（ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３ヌクレオチド配列）に記載されている。
７．３ ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ（ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ）の生物活性
ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ（すなわち、ＭＶＡ－ＨＥＲＶ－ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥ－ｈ４－１－ＢＢＬ；上記も参照のこと）による感染が、ヒト細胞でのＨＬＡ分子によるワクチン由来腫瘍抗原の提示をもたらすかどうかを調べた。このために、抗原提示細胞上のＨＬＡ－ＡＢＣペプチド複合体を免疫沈降させ、質量分析法により同定することができるのはどちらのＨＬＡ結合ペプチドなのかを分析した。
抗原はＨＬＡクラスＩに搭載され得るため（Ｎｙａｍｂｕｒａ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６）、まず、ヒト単核球細胞株ＴＨＰ－１を、抗原提示能を示すマクロファージに分化させた（Ｄａｉｇｎｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０）。事実、ＴＨＰ－１細胞は、米国及び欧州で最も頻度が高いハプロタイプの１つである（集団の約３０％）ＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋を発現する。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇとは別に、ＴＨＰ－１細胞は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５及びＨＬＡ－Ｃ＊０３を発現するという報告があった（Ｂａｔｔｌｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）。ここでは、８×１０５／ｍｌのＴＨＰ－１細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート）の存在下で３日間培養してから培地を交換し、細胞を、ＰＭＡの非存在下でさらに２日間培養した。５日目、細胞に、４のＩｎｆＵ（感染単位）のＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴを１２時間感染させた。図８Ｂに示されるように、ＨＥＲＶＫ－ｅｎｖ／ＭＥＬ、ＨＥＲＶＫ－ｇａｇ及び融合タンパク質ＦＯＬＲ１－ＰＲＡＭＥは、ＴＨＰ－１細胞のＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ感染後に発現された（図８Ｂの「ｍＢＮ４９４」）。対照的に、非感染ＴＨＰ－１細胞では抗原は内因性発現されなかった（図８Ｂの「ｃｔｒ」）。
次に、「ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ」ＨＬＡ－ＡＢＣリガンドーム分析（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を実施した。ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴ感染細胞では、４つの腫瘍抗原由来ペプチド、すなわち、ＨＥＲＶ－ＫｅｎｖペプチドＩＬＴＥＶＬＫＧＶ、ＨＥＲＶ－ＫｇａｇペプチドＹＬＳＦＩＫＩＬＬ及びＰＲＡＭＥペプチドのＡＬＱＳＬＬＱＨＬ及びＳＬＬＱＨＬＩＧＬが同定された。同定された２つのＰＲＡＭＥペプチドは大部分が重複しており、共通のコアエピトープを共有している可能性が高い。どちらのペプチドも、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に非常に強く結合することが予測されているため、ＡＬＱＳＬＬＱＨＬは、結合順位がＨＬＡ－Ｂ＊１５とほぼ同様である。注目すべきことに、ＰＲＡＭＥペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬは、ヒトにおいて、免疫原性ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に提示される細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープとしてすでに報告されている（Ｋｅｓｓｌｅｒ ＪＨ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，２００１）。勘案すると、データから、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴにより発現された抗原は、感染細胞のＨＬＡに取り込まれ得ることが示されている。
さらに、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴが、４－１－ＢＢＬを、その受容体である４－１－ＢＢに結合する機能性形態で発現する能力について試験した。その目的のため、市販キット（「４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙ」、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。アッセイは、ｈ４－１－ＢＢを発現している遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔＴ細胞株、及び４－１－ＢＢリガンド刺激に応答することができる応答エレメント（ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターからなる。ｈ４－１－ＢＢがｈ４－１－ＢＢＬによって刺激されると、ＲＥは、細胞内部での細胞ルシフェラーゼ産生を活性化させる。細胞を溶解させ、「Ｂｉｏ－Ｇｌｏ」試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した後、ルミノメーターを使用して発光を測定し、定量する。簡潔に述べると、ＨｅＬａ細胞を播種し（１×１０６）、それぞれに、図８Ｃに示すＭＶＡに基づくコンストラクトを感染させ（ＴＣＩＤ５０＝２）、一晩（３７℃、５％ＣＯ２）培養した後、Ｊｕｒｋａｔ－ｈ４－１－ＢＢ細胞と共に（ＨｅＬａ：Ｊｕｒｋａｔ＝４：１の比）６時間共培養した。Ｆｃと架橋させたＨｉｓタグ付きｈ４－１ＢＢＬを参照（陽性コントロール）として使用し、１μｇ／ｍｌの架橋ｈ４－１ＢＢｌと共に培養したＪｕｒｋａｔ－ｈ４－１ＢＢ細胞によるルシフェラーゼ発現を１に設定した（図８Ｃ、点線）。ＭＶＡ－ＢＮ（すなわち、ｈ４－１－ＢＢＬをコードしない）を骨格コントロールとして使用した。図８Ｃに示されるように、ｈ４－１－ＢＢＬを発現しているＭＶＡに基づくベクターで感染させたＨｅＬａ細胞では、参照と比較して（共培養Ｊｕｒｋａｔ－ｈ４－１－ＢＢ細胞により）６倍高いルシフェラーゼ産生が誘導された。注目すべきことに、ＭＶＡ－ＢＮ－４ＩＴにより媒介されたルシフェラーゼ産生は、ＭＶＡベクターを発現している他の２つのｈ４－１－ＢＢＬにより媒介されたものよりもさらに高かった。したがって、ＭＶＡ－ｍＢＮ４９４は、自身の４－１ＢＢ受容体に効果的に結合する機能性ｈ４－１－ＢＢＬを発現する。
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列及びアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な略号を、またアミノ酸については１文字表記または３文字表記のいずれかを用いて示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、表示されている鎖へのいかなる言及によっても、その相補鎖が含まれると理解される。
配列表中の配列：
配列番号１：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列。（２６１アミノ酸）
配列番号２：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌ（７９２ヌクレオチド）
配列番号３：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬ（２５４アミノ酸）
配列番号４：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬ
配列番号５：ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ（６６６アミノ酸）の合成コンセンサス配列
配列番号６：ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ；ヌクレオチド配列
配列番号７：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（６９９アミノ酸）の合成配列
配列番号８：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬのヌクレオチド配列
配列番号９：ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
配列番号１０：ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）のヌクレオチド配列
配列番号１１：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（５１７アミノ酸）の合成配列
配列番号１２：ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３のヌクレオチド配列
配列番号１
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１からのｈＣＤ４０Ｌ。（２６１アミノ酸）
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号２
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００６５．１．からのｈＣＤ４０Ｌ。（７９２ヌクレオチド）
ヌクレオチド配列：
ａｔｇａｔｃｇａｇａｃａｔａｃａａｃｃａｇａｃａａｇｃｃｃｔａｇａａｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｇａｃｔｇｃｃｔａｔｃａｇｃａｔｇａａｇａｔｃｔｔｃａｔｇｔａｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇａｔｃａｃｃｃａｇａｔｇａｔｃｇｇｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｔｔｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｇａｃｇｇｃｔｇｇａｃａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｇａｇａｇａａａｃｃｔｇｃａｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｔｇｔｔｃａｔｇａａｇａｃｃａｔｃｃａｇｃｇｇｔｇｃａａｃａｃｃｇｇｃｇａｇａｇａａｇｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｇｃｇａｇｇａａａｔｃａａｇａｇｃｃａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｔｔｃｇｔｇａａｇｇａｃａｔｃａｔｇｃｔｇａａｃａａａｇａｇｇａａａｃｇａａｇａａａｇａｇａａｃｔｃｃｔｔｃｇａｇａｔｇｃａｇａａｇｇｇｃｇａｃｃａｇａａｔｃｃｔｃａｇａｔｃｇｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｃａａｃａａｇｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｇｇｇｃｃｇａｇａａｇｇｇｃｔａｃｔａｃａｃｃａｔｇａｇｃａａｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｔｇｇａｇａａｃｇｇｃａａｇｃａｇｃｔｇａｃａｇｔｇａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃｔａｃａｔｃｔａｃｇｃｃｃａａｇｔｇａｃｃｔｔｃｔｇｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇｃｃａｇｃｔｃｔｃａｇｇｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｃｔｇｇｃａｇａｔｔｃｇａｇｃｇｇａｔｔｃｔｇｃｔｇａｇａｇｃｃｇｃｃａａｃａｃａｃａｃａｇｃａｇｃｇｃｃａａａｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃａｇｃａｇｔｃｔａｔｔｃａｃｃｔｃｇｇｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｔｇａａｔｇｔｇａｃａｇａｃｃｃｔａｇｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃａｃｇｇｃａｃｃｇｇｃｔｔｔａｃａｔｃｔｔｔｃｇｇａｃｔｇｃｔｇａａｇｃｔｇｔｇａｔｇａｔａｇ
配列番号３
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１．からのｈ４－１ＢＢＬ（２５４アミノ酸）
ＭＥＹＡＳＤＡＳＬＤＰＥＡＰＷＰＰＡＰＲＡＲＡＣＲＶＬＰＷＡＬＶＡＧＬＬＬＬＬＬＬＡＡＡＣＡＶＦＬＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ
配列番号４
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１からのｈ４－１ＢＢＬ。
ヌクレオチド配列：
ａｔｇｇａａｔａｃｇｃｃａｇｃｇａｃｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｃｔｃｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃａｇｃｔｃｃｔａｇａｇｃｃａｇｇｇｃｔｔｇｔａｇａｇｔｇｃｔｇｃｃｔｔｇｇｇｃｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｔｇｃｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｇｃｇｃａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｇｃｔｔｇｔｃｃａｔｇｇｇｃｔｇｔｇｔｃａｇｇａｇｃｃａｇａｇｃａｔｃｔｃｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｃｇｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａｃｔｇａｇａｇａｇｇｇａｃｃｔｇａａｃｔｇａｇｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｃｔｇｃｔｃｇａｃｃｔｇａｇａｃａｇｇｇｃａｔｇｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃｃａｇａａｔｇｔｇｃｔｇｃｔｇａｔｔｇａｔｇｇｃｃｃｔｃｔｇａｇｃｔｇｇｔａｃａｇｃｇａｔｃｃｔｇｇａｃｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔａｇｃｃｔｇａｃｔｇｇａｇｇｃｃｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇａｇｇａｃａｃｃａａａｇａａｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃａａｇｇｃｔｇｇｃｇｔｇｔａｃｔａｃｇｔｇｔｔｃｔｔｔｃａｇｃｔｇｇａａｃｔｇｃｇｇａｇａｇｔｇｇｔｇｇｃａｇｇｃｇａａｇｇａｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｇｃａｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｇａｇａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇａｃａｇｔｔｇａｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｃｇａａｇｃｃａｇａａａｃａｇｃｇｃｃｔｔｔｇｇｃｔｔｃｃａａｇｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｇａｇａｃｔｇｇｇａｇｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃａｃａｇａａｇｃａａｇａｇｃａａｇａｃａｃｇｃｃｔｇｇｃａｇｃｔｔａｃａｃａａｇｇｃｇｃｔａｃａｇｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｔｔｃａｇａｇｔｇａｃａｃｃｔｇａｇａｔｔｃｃａｇｃｔｇｇｃｔｔｇｃｃａｔｃｔｃｃｔｃｇｃａｇｃｇａｇｔａａｔｇａ
配列番号５
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ（６９９アミノ酸）
ＭＮＰＳＥＭＱＲＫＡＰＰＲＲＲＲＨＲＮＲＡＰＬＴＨＫＭＮＫＭＶＴＳＥＥＱＭＫＬＰＳＴＫＫＡＥＰＰＴＷＡＱＬＫＫＬＴＱＬＡＴＫＹＬＥＮＴＫＶＴＱＴＰＥＳＭＬＬＡＡＬＭＩＶＳＭＶＶＳＬＰＭＰＡＧＡＡＡＡＮＹＴＹＷＡＹＶＰＦＰＰＭＩＲＡＶＴＷＭＤＮＰＩＥＶＹＶＮＤＳＶＷＶＰＧＰＩＤＤＲＣＰＡＫＰＥＥＥＧＭＭＩＮＩＳＩＧＹＲＹＰＰＩＣＬＧＲＡＰＧＣＬＭＰＡＶＱＮＷＬＶＥＶＰＴＶＳＰＩＳＲＦＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬＲＰＲＶＮＹＬＱＤＦＳＹＱＲＳＬＫＦＲＰＫＧＫＰＣＰＫＥＩＰＫＥＳＫＮＴＥＶＬＶＷＥＥＣＶＡＮＳＡＶＩＬＱＮＮＥＦＧＴＩＩＤＷＡＰＲＧＱＦＹＨＮＣＳＧＱＴＱＳＣＰＳＡＱＶＳＰＡＶＤＳＤＬＴＥＳＬＤＫＨＫＨＫＫＬＱＳＦＹＰＷＥＷＧＥＫＧＩＳＴＰＲＰＫＩＩＳＰＶＳＧＰＥＨＰＥＬＷＲＬＴＶＡＳＨＨＩＲＩＷＳＧＮＱＴＬＥＴＲＤＲＫＰＦＹＴＶＤＬＮＳＳＬＴＶＰＬＱＳＣＶＫＰＰＹＭＬＶＶＧＮＩＶＩＫＰＤＳＱＴＩＴＣＥＮＣＲＬＬＴＣＩＤＳＴＦＮＷＱＨＲＩＬＬＶＲＡＲＥＧＶＷＩＰＶＳＭＤＲＰＷＥＡＳＰＳＶＨＩＬＴＥＶＬＫＧＶＬＮＲＳＫＲＦＩＦＴＬＩＡＶＩＭＧＬＩＡＶＴＡＴＡＡＶＡＧＶＡＬＨＳＳＶＱＳＶＮＦＶＮＤＷＱＫＮＳＴＲＬＷＮＳＱＳＳＩＤＱＫＭＬＡＶＩＳＣＡＶＱＴＶＩＷＭＧＤＲＬＭＳＬＥＨＲＦＱＬＱＣＤＷＮＴＳＤＦＣＩＴＰＱＩＹＮＥＳＥＨＨＷＤＭＶＲＲＨＬＱＧＲＥＤＮＬＴＬＤＩＳＫＬＫＥＱＩＦＥＡＳＫＡＨＬＮＬＶＰＧＴＥＡＩＡＧＶＡＤＧＬＡＮＬＮＰＶＴＷＶＫＴＩＧＳＴＴＩＩＮＬＩＬＩＬＶＣＬＦＣＬＬＬＶＣＲＣＴＱＱＬＲＲＤＳＤＨＲＥＲＡＭＭＴＭＡＶＬＳＫＲＫＧＧＮＶＧＫＳＫＲＤＱＩＶＴＶＳＶ
配列番号６
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ
ヌクレオチド配列
ａｔｇａａｃｃｃｔａｇｃｇａｇａｔｇｃａｇａｇａａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔａｇａｃｇｇａｇａａｇａｃａｃａｇａａａｃａｇｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇａｃａｃａｃａａｇａｔｇａａｃａａｇａｔｇｇｔｃａｃｃａｇｃｇａｇｇａａｃａｇａｔｇａａａｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｇｃｃｇａｇｃｃｔｃｃａａｃａｔｇｇｇｃｔｃａｇｃｔｇａａｇａａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｔａｃｃｔｇｇａｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇａｃｃｃａｇａｃａｃｃｔｇａｇａｇｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃｔｇａｔｇａｔｃｇｔｇｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｃｃｔａｔｇｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃａａｃｔａｃａｃａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｃｔａｔｇａｔｃａｇａｇｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａｔｇｇａｃａａｃｃｃｔａｔｔｇａｇｇｔｇｔａｃｇｔｇａａｃｇａｃａｇｃｇｔｇｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｇａｃｃｔａｔｃｇａｃｇａｔａｇａｔｇｔｃｃｔｇｃｃａａａｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃａａｃａｔｃａｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃｇｇｔａｔｃｃｔｃｃａａｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃａｇａｇｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇａａｇｔｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｔｔｃａｃｃｔａｃｃａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃａｔｇａｇｃｃｔｃａｇａｃｃｔａｇａｇｔｇａａｃｔａｃｔｔｇｃａｇｇａｃｔｔｃａｇｃｔａｔｃａｇｃｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｇａｃｃｃａａｇｇｇａａａｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔａａａｇａｇａｔｔｃｃｃａａａｇａｇｔｃｃａａｇａａｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇｔｇｇｇａａｇａｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔｃｔｇｃｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｃａｇａａｃａａｃｇａｇｔｔｃｇｇｃａｃｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｇｇｇｃｔｃｃｔａｇａｇｇｃｃａｇｔｔｃｔａｃｃａｃａａｔｔｇｃａｇｃｇｇａｃａｇａｃａｃａｇａｇｃｔｇｔｃｃｔａｇｃｇｃａｃａａｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇａｔｃｔｇａｃｃｇａｇａｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｃａｃａａａｃａｃａａｇａａａｃｔｔｃａｇａｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｔｇｇｇｇａｇａｇａａｇｇｇｃａｔｃｔｃｔａｃａｃｃａａｇｇｃｃｔａａｇａｔｃａｔｔａｇｃｃｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｃａｇａａｃａｔｃｃｃｇａａｃｔｔｔｇｇａｇａｃｔｇａｃａｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｃａｃａｔｃａｇａａｔｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｔｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａａｃａｃｇｇｇａｃａｇａａａｇｃｃｃｔｔｃｔａｃａｃｃｇｔｃｇａｔｃｔｇａａｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｔｇｔｇｔｇａａｇｃｃｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇｇｇｃａａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａｇｃｃｃｇａｃｔｃｃｃａｇａｃｃａｔｃａｃａｔｇｃｇａｇａａｃｔｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｃｇａｃａｇｃａｃｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃａｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｃｇａｇｃｔａｇａｇａａｇｇｃｇｔｇｔｇｇａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔａｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔｔｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｃａｃａｔｔｃｔｇａｃａｇａｇｇｔｇｃｔｇａａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｃａａｃａｇａｔｃｃａａｇｃｇｇｔｔｃａｔｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｔｃｇｃｃｇｔｃａｔｃａｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｔｇｃｔｇｔｇａｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｔａｇｃｔｃｔｇｔｇｃａｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｔｃｇｔｇａａｃｇａｔｔｇｇｃａｇａａｇａａｃａｇｃａｃａｃｇｇｃｔｇｔｇｇａａｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃａｔｃｇａｃｃａｇａａｇａｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇｃａｇａｃａｇｔｔａｔｃｔｇｇａｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｃｔｇａｔｇａｇｃｃｔｇｇａａｃａｃｃｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｃａｇｔｇｃｇａｃｔｇｇａａｔａｃｃａｇｃｇａｃｔｔｃｔｇｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａｇａｔｃｔａｃａａｃｇａｇａｇｃｇａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｇａｔａｔｇｇｔｃｃｇａａｇｇｃａｔｃｔｇｃａｇｇｇｃａｇａｇａｇｇａｃａａｃｃｔｇａｃａｃｔｇｇａｃａｔｃａｇｃａａｇｃｔｇａａａｇａｇｃａｇａｔｃｔｔｃｇａｇｇｃｃａｇｃａａｇｇｃｔｃａｃｃｔｇａａｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇａａｇｃｔａｔｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｇｃａｇａｔｇｇｃｃｔｇｇｃｃａａｔｃｔｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｃｃｔｇｇｇｔｃａａｇａｃｃａｔｃｇｇｃａｇｃａｃｃａｃａａｔｃａｔｃａａｃｃｔｇａｔｃｃｔｇａｔｃｃｔｃｇｔｇｔｇｃｃｔｇｔｔｔｔｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｔｇｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｇｃｔｇａｇａａｇａｇａｃａｇｃｇａｃｃａｔａｇａｇａａａｇａｇｃｃａｔｇａｔｇａｃｃａｔｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇａｇｃａａｇａｇａａａｇｇｇａｇｇｃａａｃｇｔｇｇｇｃａａｇａｇｃａａｇｃｇｇｇａｔｃａｇａｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｔｔｔｇａｔａａ
配列番号７
ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ（６６６アミノ酸）
ＭＧＱＴＫＳＫＩＫＳＫＹＡＳＹＬＳＦＩＫＩＬＬＫＲＧＧＶＫＶＳＴＫＮＬＩＫＬＦＱＩＩＥＱＦＣＰＷＦＰＥＱＧＴＬＤＬＫＤＷＫＲＩＧＫＥＬＫＱＡＧＲＫＧＮＩＩＰＬＴＶＷＮＤＷＡＩＩＫＡＡＬＥＰＦＱＴＥＥＤＳＶＳＶＳＤＡＰＧＳＣＩＩＤＣＮＥＮＴＲＫＫＳＱＫＥＴＥＳＬＨＣＥＹＶＡＥＰＶＭＡＱＳＴＱＮＶＤＹＮＱＬＱＥＶＩＹＰＥＴＬＫＬＥＧＫＧＰＥＬＶＧＰＳＥＳＫＰＲＧＴＳＰＬＰＡＧＱＶＰＶＴＬＱＰＱＫＱＶＫＥＮＫＴＱＰＰＶＡＹＱＹＷＰＰＡＥＬＱＹＲＰＰＰＥＳＱＹＧＹＰＧＭＰＰＡＰＱＧＲＡＰＹＰＱＰＰＴＲＲＬＮＰＴＡＰＰＳＲＱＧＳＥＬＨＥＩＩＤＫＳＲＫＥＧＤＴＥＡＷＱＦＰＶＴＬＥＰＭＰＰＧＥＧＡＱＥＧＥＰＰＴＶＥＡＲＹＫＳＦＳＩＫＭＬＫＤＭＫＥＧＶＫＱＹＧＰＮＳＰＹＭＲＴＬＬＤＳＩＡＨＧＨＲＬＩＰＹＤＷＥＩＬＡＫＳＳＬＳＰＳＱＦＬＱＦＫＴＷＷＩＤＧＶＱＥＱＶＲＲＮＲＡＡＮＰＰＶＮＩＤＡＤＱＬＬＧＩＧＱＮＷＳＴＩＳＱＱＡＬＭＱＮＥＡＩＥＱＶＲＡＩＣＬＲＡＷＥＫＩＱＤＰＧＳＴＣＰＳＦＮＴＶＲＱＧＳＫＥＰＹＰＤＦＶＡＲＬＱＤＶＡＱＫＳＩＡＤＥＫＡＲＫＶＩＶＥＬＭＡＹＥＮＡＮＰＥＣＱＳＡＩＫＰＬＫＧＫＶＰＡＧＳＤＶＩＳＥＹＶＫＡＣＤＧＩＧＧＡＭＨＫＡＭＬＭＡＱＡＩＴＧＶＶＬＧＧＱＶＲＴＦＧＧＫＣＹＮＣＧＱＩＧＨＬＫＫＮＣＰＶＬＮＫＱＮＩＴＩＱＡＴＴＴＧＲＥＰＰＤＬＣＰＲＣＫＫＧＫＨＷＡＳＱＣＲＳＫＦＤＫＮＧＱＰＬＳＧＮＥＱＲＧＱＰＱＡＰＱＱＴＧＡＦＰＩＱＰＦＶＰＱＧＦＱＧＱＱＰＰＬＳＱＶＦＱＧＩＳＱＬＰＱＹＮＮＣＰＰＰＱＡＡＶＱＱ
配列番号８
ＥＲＶ－Ｋ－ｇａｇ
ヌクレオチド配列
ａｔｇｇｇａｃａｇａｃｃａａｇａｇｔａａｇａｔｃａａｇｔｃｔａａｇｔａｃｇｃｃａｇｃｔａｃｃｔｃａｇｃｔｔｃａｔｃａａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｇｇｃｇｔｇａａａｇｔｇｔｃｃａｃｃａａｇａａｃｃｔｇａｔｃａａｇｃｔｇｔｔｃｃａｇａｔｃａｔｃｇａｇｃａｇｔｔｃｔｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇａｇｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇａｔｃｔｇａａｇｇａｃｔｇｇａａｇｃｇｇａｔｃｇｇｃａａａｇａｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃａｇａａａｇｇｇｃａａｃａｔｃａｔｃｃｃｔｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｇｇａａｃｇａｃｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａａａｇｃａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｃｃｔｔｃｃａｇａｃｃｇａａｇａｇｇａｔａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇａｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃａｇｃｔｇｃａｔｃａｔｃｇａｃｔｇｃａａｃｇａｇａａｃａｃｃｃｇｇａａｇａａｇｔｃｃｃａｇａａａｇａｇａｃａｇａｇａｇｃｃｔｇｃａｃｔｇｃｇａｇｔａｃｇｔｇｇｃｃｇａａｃｃｔｇｔｇａｔｇｇｃｔｃａｇａｇｃａｃｃｃａｇａａｃｇｔｇｇａｃｔａｃａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｇａａｇｔｇａｔｃｔａｔｃｃｃｇａａａｃａｃｔｇａａｇｃｔｇｇａａｇｇｃａａｇｇｇａｃｃｔｇａａｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｇａｇｔｃｔａａｇｃｃｃａｇａｇｇｃａｃａｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃａｇｇｔｇｃｃａｇｔｇａｃａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃａｇａａａｃａａｇｔｇａａａｇａｇａａｃａａｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｔｇｇｃｃｔａｃｃａｇｔａｔｔｇｇｃｃｔｃｃａｇｃｃｇａｇｃｔｇｃａｇｔａｃａｇａｃｃｔｃｃｔｃｃａｇａｇａｇｃｃａｇｔａｃｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｇａａｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｃａａｇｇｃａｇａｇｃｔｃｃｔｔａｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃｔａｃｃａｇａｃｇｇｃｔｇａａｃｃｃｔａｃａｇｃｔｃｃｔｃｃｔａｇｃａｇａｃａｇｇｇｃｔｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｇａｇａｔｃａｔｔｇａｃａａｇａｇｃｃｇｇａａａｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃａｇｔｔｔｃｃｃｇｔｔａｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｃｇａａｇｇｃｇｃｔｃａａｇａａｇｇｃｇａａｃｃｔｃｃｔａｃａｇｔｇｇａａｇｃｃａｇｇｔａｃａａｇａｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃａａｇａｔｇｃｔｇａａｇｇａｃａｔｇａａｇｇａａｇｇｃｇｔｃａａｇｃａｇｔａｃｇｇａｃｃｔａａｃａｇｃｃｃａｔａｃａｔｇｃｇｇａｃｃｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｃｔａｔｔｇｃｃｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｇｃｔｇａｔｃｃｃｔｔａｃｇａｔｔｇｇｇａｇａｔｃｃｔｇｇｃｔａａｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｃｔａｇｃｃａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｔｃａａｇａｃｃｔｇｇｔｇｇａｔｃｇａｃｇｇｃｇｔｇｃａａｇａａｃａａｇｔｇａｇａｃｇｇａａｃａｇａｇｃｔｇｃｃａａｔｃｃｔｃｃｔｇｔｇａａｃａｔｃｇａｃｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｇａａｔｃｇｇｃｃａｇａａｔｔｇｇａｇｃａｃｃａｔｃｔｃｔｃａｇｃａｇｇｃｔｃｔｇａｔｇｃａｇａａｃｇａｇｇｃｃａｔｔｇａａｃａａｇｔｃａｇａｇｃｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｇａｇｃｔｔｇｇｇａｇａａｇａｔｔｃａｇｇａｃｃｃａｇｇｃａｇｃａｃａｔｇｔｃｃｃａｇｃｔｔｃａａｔａｃｃｇｔｔｃｇｇｃａｇｇｇｃａｇｃａａａｇａｇｃｃｃｔａｔｃｃｔｇａｃｔｔｔｇｔｇｇｃｔａｇａｃｔｇｃａｇｇａｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａａｇｔｃｔａｔｔｇｃｃｇａｃｇａｇａａｇｇｃｔｃｇｇａａａｇｔｇａｔｃｇｔｇｇａａｃｔｇａｔｇｇｃｃｔａｃｇａｇａａｃｇｃｔａａｔｃｃａｇａｇｔｇｃｃａｇａｇｃｇｃｃａｔｃａａｇｃｃｃｔｔｇａａｇｇｇｃａａａｇｔｇｃｃｔｇｃｃｇｇａｔｃｃｇａｔｇｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｔａｔｇｔｇａａｇｇｃｃｔｇｃｇａｃｇｇａａｔｃｇｇａｇｇｔｇｃｃａｔｇｃａｃａａａｇｃｃａｔｇｃｔｇａｔｇｇｃａｃａｇｇｃｃａｔｃａｃｔｇｇｃｇｔｔｇｔｇｃｔｃｇｇａｇｇａｃａａｇｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｔｇｇａｇｇｃａａｇｔｇｃｔａｃａａｃｔｇｔｇｇｃｃａｇａｔｃｇｇａｃａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｃｔｇｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｃａｇａａｃａｔｃａｃｃａｔｃｃａｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｇｃａｇａｇａａｃｃｔｃｃａｇａｔｃｔｇｔｇｃｃｃｔａｇａｔｇｃａａｇａａｇｇｇｃａａｇｃａｃｔｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｔｇｃａｇａａｇｃａａｇｔｔｃｇａｃａａｇａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｔｇａｇｃｇｇｃａａｃｇａａｃａａａｇａｇｇａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇｃａｇａｃｔｇｇｃｇｃａｔｔｔｃｃａａｔｃｃａｇｃｃｃｔｔｃｇｔｇｃｃｔｃａａｇｇｃｔｔｃｃａｇｇｇａｃａａｃａｇｃｃｔｃｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇｔｔｃｃａｇｇｇｃａｔｔａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｃａｇｔａｃａａｃａａｃｔｇｃｃｃｔｃｃａｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｃｔｇｔｇｃａｇｃａｇｔｇａｔｇａ
配列番号９
ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
ＭＡＱＲＭＴＴＱＬＬＬＬＬＶＷＶＡＶＶＧＥＡＱＴＲＩＡＷＡＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫＰＧＰＥＤＫＬＨＥＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶＬＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥＱＷＷＥＤＣＲＴＳＹＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷＮＷＴＳＧＦＮＫＣＡＶＧＡＡＣＱＰＦＨＦＹＦＰＴＰＴＶＬＣＮＥＩＷＴＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＰＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＥＲＲＲＬＷＧＳＩＱＳＲＹＩＳＭＳＶＷＴＳＰＲＲＬＶＥＬＡＧＱＳＬＬＫＤＥＡＬＡＩＡＡＬＥＬＬＰＲＥＬＦＰＰＬＦＭＡＡＦＤＧＲＨＳＱＴＬＫＡＭＶＱＡＷＰＦＴＣＬＰＬＧＶＬＭＫＧＱＨＬＨＬＥＴＦＫＡＶＬＤＧＬＤＶＬＬＡＱＥＶＲＰＲＲＷＫＬＱＶＬＤＬＲＫＮＳＨＱＤＦＷＴＶＷＳＧＮＲＡＳＬＹＳＦＰＥＰＥＡＡＱＰＭＴＴＫＡＫＶＤＧＬＳＴＥＡＥＱＰＦＩＰＶＥＶＬＶＤＬＦＬＫＥＧＡＣＤＥＬＦＳＹＬＩＥＫＶＡＡＫＫＮＶＬＲＬＣＣＫＫＬＫＩＦＡＭＰＭＱＤＩＫＭＩＬＫＭＶＱＬＤＳＩＥＤＬＥＶＴＣＴＷＫＬＰＴＬＡＫＦＳＰＹＬＧＱＭＩＮＬＲＲＬＬＬＳＨＩＨＡＳＳＹＩＳＰＥＫＥＥＱＹＩＡＱＦＴＳＱＦＬＳＬＱＣＬＱＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬＲＧＲＬＤＱＬＬＲＨＶＭＮＰＬＥＴＬＳＩＴＮＣＲＬＳＥＧＤＶＭＨＬＳＱＳＰＳＶＳＱＬＳＶＬＳＬＳＧＶＭＬＴＤＶＳＰＥＰＬＱＡＬＬＥＲＡＳＡＴＬＱＤＬＶＦＤＥＣＧＩＴＤＤＱＬＬＡＬＬＰＳＬＳＨＣＳＱＬＴＴＬＳＦＹＧＮＳＩＳＩＳＡＬＱＳＬＬＱＨＬＩＧＬＳＮＬＴＨＶＬＹＰＶＰＬＥＳＹＥＤＩＨＧＴＬＨＬＥＲＬＡＹＬＨＡＲＬＲＥＬＬＣＥＬＧＲＰＳＭＶＷＬＳＡＮＰＣＰＨＣＧＤＲＴＦＹＤＰＥＰＩＬＣＰＣＦＭＰＮ
配列番号１０
ｈＦＯＬＲ１Δ＿ｈＰＲＡＭＥΔ融合体（７４１アミノ酸）
ヌクレオチド配列
ｔｇｇｃｃｃａｇａｇａａｔｇａｃｃａｃａｃａａｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｔｔｇｃｃｇｔｔｇｔｔｇｇａｇａｇｇｃｃｃａｇａｃｃａｇａａｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｇｃｔｇａａｃｇｔｇｔｇｃａｔｇａａｃｇｃｃａａｇｃａｔｃａｃａａａｇａｇａａｇｃｃｔｇｇａｃｃｔｇａａｇａｃａａｇｃｔｇｃａｔｇａａｃａｇｔｇｔｃｇｇｃｃｔｔｇｇａｇａａａｇａａｔｇｃｔｔｇｃｔｇｔａｇｃａｃｃａａｃａｃｃａｇｃｃａａｇａｇｇｃｃｃａｃａａｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｔａｃｃｔｇｔａｃｃｇｇｔｔｃａａｃｔｇｇａａｃｃａｃｔｇｃｇｇａｇａａａｔｇｇｃｔｃｃｔｇｃｃｔｇｃａａｇａｇａｃａｃｔｔｃａｔｃｃａｇｇａｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｔａｃｇａｇｔｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｔｃｇｇａｃｃｔｔｇｇａｔｃｃａｇｃａａｇｔｇｇａｃｃａｇａｇｃｔｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｇｇｇｔｇｃｔｇａａｔｇｔｇｃｃｃｔｔｇｔｇｃａａａｇａｇｇａｔｔｇｃｇａｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔｔｇｃｃｇｇａｃｃａｇｃｔａｃａｃａｔｇｔａａｇａｇｃａａｃｔｇｇｃａｃａａａｇｇｃｔｇｇａａｃｔｇｇａｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａａｃａａｇｔｇｔｇｃｃｇｔｇｇｇａｇｃｔｇｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃａｃｔｔｃｔａｃｔｔｃｃｃａａｃａｃｃｔａｃｃｇｔｇｃｔｇｔｇｃａａｃｇａａａｔｃｔｇｇａｃｃｃａｃａｇｃｔａｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃｔａｃａｇｃａｇａｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃｃａｇａｔｇｔｇｇｔｔｃｇａｔｃｃｃｇｃｔｃａｇｇｇｃａａｔｃｃｃａａｔｇａｇｇａａｇｔｇｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｃｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｔｇｇａａａｇａａｇａａｇｇｃｔｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｃｃａｇａｇｃｃｇｇｔａｃａｔｔａｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇｔｇｇａｃａａｇｃｃｃｔａｇａｃｇｇｃｔｇｇｔｔｇａａｃｔｇｇｃｔｇｇａｃａｇａｇｃｃｔｇｃｔｃａａｇｇａｔｇａｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔａｇａｇａｇｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｔｃｔｇｔｔｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇａｃｇｇｃａｇａｃａｃａｇｃｃａｇａｃａｃｔｇａａａｇｃｃａｔｇｇｔｇｃａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｃａｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｔｇａｔｇａａｇｇｇｃｃａｇｃａｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｇａａａｃｃｔｔｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｇｃｔｃａａｇａｇｇｔｇａｇｇｃｃｔｃｇｇｃｇｔｔｇｇａａａｃｔｇｃａｇｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｇｇａａｇａａｃｔｃｔｃａｃｃａｇｇａｔｔｔｃｔｇｇａｃｃｇｔｔｔｇｇｔｃｃｇｇｃａａｃａｇａｇｃｃａｇｃｃｔｇｔａｃａｇｃｔｔｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇａｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃａｔｇａｃｃａｃａａａｇｇｃｃａａａｇｔｇｇａｔｇｇｃｃｔｇａｇｃａｃａｇａｇｇｃｃｇａｇｃａｇｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｇｔｃｇａａｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇａａａｇａａｇｇａｇｃｃｔｇｃｇａｔｇａｇｃｔｇｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｔｔｇａｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｃｃａａｇａａｇａａｃｇｔｇｃｔｇｃｇｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃａａｇａａｇｃｔｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｃｃａｔｇｃｃｔａｔｇｃａｇｇａｔａｔｃａａｇａｔｇａｔｃｃｔｇａａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇａｃａｇｃａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇｃｃｃａｃａｃｔｇｇｃｃａａｇｔｔｃａｇｃｃｃｔｔａｃｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｇａｔｔａａｃｃｔｇｃｇｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃａｃａｔｃｃａｃｇｃｃａｇｃｔｃｃｔａｃａｔｃａｇｃｃｃｔｇａｇａａａｇａｇｇａａｃａｇｔａｔａｔｃｇｃｃｃａｇｔｔｃａｃａａｇｃｃａｇｔｔｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｔａｃｇｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇｔｔｃｔｔｔｃｔｇａｇａｇｇｃａｇｇｃｔｇｇａｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｃｇｇｃａｃｇｔｇａｔｇａａｃｃｃｔｃｔｇｇａａａｃｃｃｔｇａｇｃａｔｃａｃｃａａｃｔｇｔａｇａｃｔｇａｇｃｇａｇｇｇｃｇａｃｇｔｇａｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｇｇｃｇｔｇａｔｇｃｔｇａｃｃｇａｔｇｔｇａｇｃｃｃｔｇａａｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｔｇｇａａａｇａｇｃｃｔｃｃｇｃｔａｃｔｃｔｇｃａｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｔｔｃｇａｔｇａｇｔｇｃｇｇｃａｔｃａｃｃｇａｔｇａｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｃａａｇｃｃｔｇａｇｃｃａｃｔｇｔａｇｃｃａｇｃｔｇａｃａａｃｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔａｃｇｇｃａａｃａｇｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｇｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｃａｔｃｔｇａｔｃｇｇｃｃｔｇｔｃｃａａｔｃｔｇａｃｃｃａｃｇｔｇｃｔｇｔａｃｃｃｔｇｔｇｃｃａｃｔｇｇａａａｇｃｔａｃｇａｇｇａｃａｔｃｃａｃｇｇａａｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｃｇａｇａｇａｃｔｇｇｃｃｔａｔｃｔｇｃａｔｇｃｔｃｇｇｃｔｇａｇａｇａａｃｔｇｃｔｇｔｇｃｇａａｃｔｇｇｇｃａｇａｃｃｃａｇｃａｔｇｇｔｔｔｇｇｃｔｇａｇｃｇｃｃａａｔｃｃａｔｇｔｃｃｔｃａｃｔｇｔｇｇｃｇａｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔａｔｃｃｔｇｔｇｔｃｃｔｔｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｃａａｃｔａａｔａｇ
配列番号１１
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３（５１７アミノ酸）
ＭＮＰＳＥＭＱＲＫＡＰＰＲＲＲＲＨＲＮＲＡＰＬＴＨＫＭＮＫＭＶＴＳＥＥＱＭＫＬＰＳＴＫＫＡＥＰＰＴＷＡＱＬＫＫＬＴＱＬＡＴＫＹＬＥＮＴＫＶＴＱＴＰＥＳＭＬＬＡＡＬＭＩＶＳＭＶＶＳＬＰＭＰＡＧＡＡＡＡＮＹＴＹＷＡＹＶＰＦＰＰＭＩＲＡＶＴＷＭＤＮＰＩＥＶＹＶＮＤＳＶＷＶＰＧＰＩＤＤＲＣＰＡＫＰＥＥＥＧＭＭＩＮＩＳＩＧＹＲＹＰＰＩＣＬＧＲＡＰＧＣＬＭＰＡＶＱＮＷＬＶＥＶＰＴＶＳＰＩＳＲＦＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬＲＰＲＶＮＹＬＱＤＦＳＹＱＲＳＬＫＦＲＰＫＧＫＰＣＰＫＥＩＰＫＥＳＫＮＴＥＶＬＶＷＥＥＣＶＡＮＳＡＶＩＬＱＮＮＥＦＧＴＩＩＤＷＡＰＲＧＱＦＹＨＮＣＳＧＱＴＱＳＣＰＳＡＱＶＳＰＡＶＤＳＤＬＴＥＳＬＤＫＨＫＨＫＫＬＱＳＦＹＰＷＥＷＧＥＫＧＩＳＴＰＲＰＫＩＩＳＰＶＳＧＰＥＨＰＥＬＷＲＬＴＶＡＳＨＨＩＲＩＷＳＧＮＱＴＬＥＴＲＤＲＫＰＦＹＴＶＤＬＮＳＳＬＴＶＰＬＱＳＣＶＫＰＰＹＭＬＶＶＧＮＩＶＩＫＰＤＳＱＴＩＴＣＥＮＣＲＬＬＴＣＩＤＳＴＦＮＷＱＨＲＩＬＬＶＲＡＲＥＧＶＷＩＰＶＳＭＤＲＰＷＥＡＳＰＳＶＨＩＬＴＥＶＬＫＧＶＬＮＭＬＡＶＩＳＣＡＶＡＧＶＡＬＨＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ
配列番号１２
ＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ＿０３
ヌクレオチド配列
ａｔｇａａｃｃｃｔａｇｃｇａｇａｔｇｃａｇａｇａａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔａｇａｃｇｇａｇａａｇａｃａｃａｇａａａｃａｇｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇａｃａｃａｃａａｇａｔｇａａｃａａｇａｔｇｇｔｃａｃｃａｇｃｇａｇｇａａｃａｇａｔｇａａａｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃａａｇａａｇｇｃｃｇａｇｃｃｔｃｃａａｃａｔｇｇｇｃｔｃａｇｃｔｇａａｇａａａｃｔｇａｃｃｃａｇｃｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｔａｃｃｔｇｇａｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇａｃｃｃａｇａｃａｃｃｔｇａｇａｇｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃｔｃｔｇａｔｇａｔｃｇｔｇｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｃｃｔａｔｇｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃａａｃｔａｃａｃａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｃｔａｔｇａｔｃａｇａｇｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａｔｇｇａｃａａｃｃｃｔａｔｔｇａｇｇｔｇｔａｃｇｔｇａａｃｇａｃａｇｃｇｔｇｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｇａｃｃｔａｔｃｇａｃｇａｔａｇａｔｇｔｃｃｔｇｃｃａａａｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃａａｃａｔｃａｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃｇｇｔａｔｃｃｔｃｃａａｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃａｇａｇｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔａｔｇｃｃａｇｃｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇａａｇｔｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇｔｔｃａｃｃｔａｃｃａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃａｔｇａｇｃｃｔｃａｇａｃｃｔａｇａｇｔｇａａｃｔａｃｔｔｇｃａｇｇａｃｔｔｃａｇｃｔａｔｃａｇｃｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｇａｃｃｃａａｇｇｇａａａｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔａａａｇａｇａｔｔｃｃｃａａａｇａｇｔｃｃａａｇａａｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇｔｇｇｇａａｇａｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔｃｔｇｃｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｃａｇａａｃａａｃｇａｇｔｔｃｇｇｃａｃｃａｔｃａｔｔｇａｃｔｇｇｇｃｔｃｃｔａｇａｇｇｃｃａｇｔｔｃｔａｃｃａｃａａｔｔｇｃａｇｃｇｇａｃａｇａｃａｃａｇａｇｃｔｇｔｃｃｔａｇｃｇｃａｃａａｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇａｔｃｔｇａｃｃｇａｇａｇｃｃｔｇｇａｃａａｇｃａｃａａａｃａｃａａｇａａａｃｔｔｃａｇａｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｔｇｇｇｇａｇａｇａａｇｇｇｃａｔｃｔｃｔａｃａｃｃａａｇｇｃｃｔａａｇａｔｃａｔｔａｇｃｃｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｃａｇａａｃａｔｃｃｃｇａａｃｔｔｔｇｇａｇａｃｔｇａｃａｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｃａｃａｔｃａｇａａｔｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｔｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａａｃａｃｇｇｇａｃａｇａａａｇｃｃｃｔｔｃｔａｃａｃｃｇｔｃｇａｔｃｔｇａａｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｔｇｔｇｔｇａａｇｃｃｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇｇｇｃａａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａｇｃｃｃｇａｃｔｃｃｃａｇａｃｃａｔｃａｃａｔｇｃｇａｇａａｃｔｇｃａｇａｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｃｇａｃａｇｃａｃｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃａｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｃｇａｇｃｔａｇａｇａａｇｇｃｇｔｇｔｇｇａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔａｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔｔｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｃｃｔａｇｃｇｔｇｃａｃａｔｔｃｔｇａｃａｇａｇｇｔｇｃｔｇａａｇｇｇｃｇｔｇｃｔｃａａｃａｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇａｇｔｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｃｔｃｔｇｃｃａｔｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇａｔｔａｔｇｃｔｇｔｇｇｃａｇａａｇａａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａｔａａ
参考文献
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１２． Ｐｒｉｃｅ ＰＪ，Ｔｏｒｒｅｓ－Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ＬＥ，Ｂｒａｎｄｍｕｌｌｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ： ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１３；３１（３９）：４２３１－４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３．０３．０１７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１３／０３／２６］
１３． Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ Ｃ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ，Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＴＬＲ９，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００８；１１８（５）：１７７６－８４．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ３３９４０［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００８／０４／１０］
１４． Ｈａｒｒｅｒ Ｅ，Ｂａｕｅｒｌｅ Ｍ，Ｆｅｒｓｔｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｎ ＨＡＡＲＴ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ－１ ｎｅｆ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＶＡ： ｓａｆｅｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ ２００５；１０（２）：２８５－３００．［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００５／０５／０４］
１５． Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｔｚａｔｚａｒｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｃｔｕａｌｌｙ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈａｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｓｔｒａｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９；２７（５２）：７４４２－５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００９．０５．０９５［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００９／０６／２３］
１６． Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ Ｈ，Ｐａｔｚｏｌｄ Ｊ，Ｋａｓｓｕｂ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＶＡ ｗｉｔｈ ＣＤ４０Ｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；４：２５１．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００２５１［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１３／０８／３０］
１７． Ｍｅｄｉｎａ－Ｅｃｈｅｖｅｒｚ Ｊ，Ｈｉｎｔｅｒｂｅｒｇｅｒ Ｍ，Ｔｅｓｔｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９；１０（１）：５０４１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１２９９８－６［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１９／１１／０７］
１８． Ｌａｗｌｅｒ ＳＥ，Ｓｐｅｒａｎｚａ ＭＣ，Ｃｈｏ ＣＦ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ ２０１７；３（６）：８４１－４９．ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｏｎｃｏｌ．２０１６．２０６４
１９． Ｗａｔｔｓ ＣＷＧＨＹＬＡＪＭＴＨ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ４－１ＢＢ ａｎｄ ４－１ＢＢＬ：ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００９
２０． Ｈｅｎｄｒｉｋｓ Ｊ，Ｘｉａｏ Ｙ，Ｒｏｓｓｅｎ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｄｕｒｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ，ＣＤ２７，４－１ＢＢ，ａｎｄ ＯＸ４０ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７５（３）：１６６５－７６．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７５．３．１６６５
２１． Ｐａｌａｚｏｎ Ａ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｆｏｒｅｒｏ Ｉ，Ｔｅｉｊｅｉｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＨＩＦ－１ａｌｐｈａ ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１２；２（７）：６０８－２３．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１１－０３１４［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１２／０６／２２］
２２． Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ Ｔ，Ｃｕｒｒａｎ ＭＡ．４－１ＢＢ Ａｇｏｎｉｓｔｓ： Ｍｕｌｔｉ－Ｐｏｔｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１５；５：１１７．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．００１１７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１５／０６／２５］
２３． Ｉｍａｉ Ｃ，Ｍｉｈａｒａ Ｋ，Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ４－１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｐｒｏｖｏｋｅ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００４；１８（４）：６７６－８４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｌｅｕ．２４０３３０２
２４． Ｎａｋａｏ Ｓ，Ａｒａｉ Ｙ，Ｔａｓａｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－７ ａｎｄ ＩＬ－１２ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０２０；１２（５２６）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｘ７９９２［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０２０／０１／１７］
２５． Ｄａｉ Ｐ，Ｗａｎｇ Ｗ，Ｙａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ（ｉＭＶＡ）ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ＳＴＩＮＧ ａｎｄ Ｂａｔｆ３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；２（１１）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｉｍｍｕｎｏｌ．ａａｌ１７１３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１７／０８／０２］
２６． Ｋｕｄｏ－Ｓａｉｔｏ Ｃ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｈｏｄｇｅ ＪＷ． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ／ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０（３）：１０９０－９．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ｃｃｒ－０３－０１４５［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００４／０２／１２］
２７． Ｒｉｖａｄｅｎｅｉｒａ ＤＢ，ＤｅＰｅａｕｘ Ｋ，Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ Ｅｎｆｏｒｃｅ Ｌｅｐｔｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｔｕｍｏｒ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１９；５１（３）：５４８－６０ ｅ４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１９．０７．００３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１９／０９／０１］
２８． Ｋｉｍ ＨＳ，Ｋｉｍ－Ｓｃｈｕｌｚｅ Ｓ，Ｋｉｍ ＤＷ，ｅｔ ａｌ．Ｈｏｓｔ ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ４－１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（２１）：８５１６－２５．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０９－２５２２
２９． Ｈｕａｎｇ ＡＹ，Ｇｕｌｄｅｎ ＰＨ，Ｗｏｏｄｓ ＡＳ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｄｅｒｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９６；９３（１８）：９７３０－５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９３．１８．９７３０［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：１９９６／０９／０３］
３０． Ｒｉｓｓｅｒ Ｒ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ＪＭ，ＭｃＣｕｂｒｅｙ Ｊ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｏｕｓｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １９８３；１７：８５－１２１．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｇｅ．１７．１２０１８３．０００５０５［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：１９８３／０１／０１］
３１． Ｋａｅｃｈ ＳＭ，Ｔａｎ ＪＴ，Ｗｈｅｒｒｙ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｇｉｖｅ ｒｉｓｅ ｔｏ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；４（１２）：１１９１－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１００９［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００３／１１／２０］
３２． Ｅｎａｍｏｒａｄｏ Ｍ，Ｉｂｏｒｒａ Ｓ，Ｐｒｉｅｇｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１７；８：１６０７３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１６０７３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１７／０７／１８］
３３． Ｎｉｚａｒｄ Ｍ，Ｒｏｕｓｓｅｌ Ｈ，Ｄｉｎｉｚ ＭＯ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１７；８：１５２２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５２２１［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１７／０５／２６］
３４． Ｂｅｕｒａ ＬＫ，Ｗｉｊｅｙｅｓｉｎｇｈｅ Ｓ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｇｉｖｅ Ｒｉｓｅ ｔｏ Ｌｙｍｐｈ－Ｎｏｄｅ－Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８；４８（２）：３２７－３８ ｅ５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１８．０１．０１５［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１８／０２／２２］
３５． Ｏｖｅｒｔｏｎ ＥＴ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＳＪ，Ｗａｇｎｅｒ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｏｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ ＭＶＡ：Ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１８；１３（４）：ｅ０１９５８９７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９５８９７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１８／０４／１４］
３６． Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ Ｇ，Ｓｔｏｙｅ ＪＰ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ： ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｏｏｄ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６；１６（４）：２０７－１９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ．２０１６．２７
３７． Ｓｃｒｉｍｉｅｒｉ Ｆ，Ａｓｋｅｗ Ｄ，Ｃｏｒｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ７０ ｉｓ ａ ｓｈａｒｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３；２（１１）：ｅ２６８８９．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｏｎｃｉ．２６８８９
３８． Ａｔｔｅｒｍａｎｎ ＡＳ，Ｂｊｅｒｒｅｇａａｒｄ ＡＭ，Ｓａｉｎｉ ＳＫ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１８；２９（１１）：２１８３－９１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｙ４１３
３９． Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ，Ｒａｄｖａｎｙｉ Ｌ，Ｒｙｃａｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８（１４）：５８６９－７７．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０７－６８３８
４０． Ｋｏｎｇ Ｙ，Ｒｏｓｅ ＣＭ，Ｃａｓｓ ＡＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９；１０（１）：５２２８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１３０３５－２
４１． ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＡ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＲＴ，Ｊｏｒｄａｎ ＫＲ，ｅｔ ａｌ．Ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２００８；２６（１５）：１８６３－７３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００８．０１．０５２［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００８／０３／１１］
４２． Ｒｅｙｎｏｓｏ ＧＶ，Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ＡＳ，Ｓｈａｎｎｏｎ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．Ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｃｏｎｄｕｉｔｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｖｉｒｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９；２０（５）：６０２－１２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９０－０１９－０３４２－０［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１９／０３／２０］
４３． Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｕｌｅｔｅ ＡＲ，Ｌａｂｉａｎｏ Ｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｒｕｉｚ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６；４６（３）：５１３－２２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２０１４４５３８８［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１６／０１／１７］
４４． Ｂｅｒｔｒａｍ ＥＭ，Ｌａｕ Ｐ，Ｗａｔｔｓ ＴＨ．Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ４－１ＢＢ ｖｅｒｓｕｓ ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ： ４－１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６８（８）：３７７７－８５．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６８．８．３７７７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００２／０４／０９］
４５． Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ ＪＥ，Ｋｅｒｒ ＪＰ，Ｒｏｇｅｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＣＤ２７ ａｎｄ ４－１ＢＢ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９３（１）：２４４－５１．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０１２１７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１４／０５／２７］
４６． Ｐａｒｋ ＳＬ，Ｂｕｚｚａｉ Ａ，Ｒａｕｔｅｌａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅｌａｎｏｍａ－ｉｍｍｕｎｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｓｋｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１９；５６５（７７３９）：３６６－７１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１８－０８１２－９［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１９／０１／０２］
４７． Ｓｃｈｅｎｋｅｌ ＪＭ，Ｆｒａｓｅｒ ＫＡ，Ｍａｓｏｐｕｓｔ Ｄ．Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ： ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｃｃｕｐｙ ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ ｎｉｃｈｅｓ ｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２（７）：２９６１－４．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１４００００３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１４／０３／０７］
４８． Ｚｈｏｕ ＡＣ，Ｗａｇａｒ ＬＥ，Ｗｏｒｔｚｍａｎ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ４－１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ． Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；１０（５）：１２９４－３０９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｉ．２０１６．１２４［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１７／０１／０５］
４９． Ｒｅａｄｉｎｇ ＪＬ，Ｇａｌｖｅｚ－Ｃａｎｃｉｎｏ Ｆ，Ｓｗａｎｔｏｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１８；２８３（１）：１９４－２１２．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２６５７［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０１８／０４／１８］
５０． Ｗｈｅｒｒｙ ＥＪ，Ｂｌａｔｔｍａｎ ＪＮ，Ｍｕｒａｌｉ－Ｋｒｉｓｈｎａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒａｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｌｔｅｒｓ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７（８）：４９１１－２７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７７．８．４９１１－４９２７．２００３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２００３／０３／２９］
５１． Ａｐｐａｙ Ｖ，Ｎｉｘｏｎ ＤＦ，Ｄｏｎａｈｏｅ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．ＨＩＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｂｕｔ ａｒｅ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００；１９２（１）：６３－７５．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．１９２．１．６３［オンライン先行出版（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｆｉｒｓｔ）：２０００／０７／０６］

Claims (15)

  1. （ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
    （ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
    を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、
    対象での固形腫瘍の、その寛解中または寛解後の再発予防における使用のためのものであり、前記寛解が、前記固形腫瘍に対する前記組み換えＭＶＡの局所の、好ましくは腫瘍内への投与によって誘導される、前記組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ。
  2. （ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
    （ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
    を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、
    対象での全身性抗腫瘍免疫応答の誘導における使用のためのものであり、固形腫瘍に対して前記組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与される、前記組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ。
  3. （ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
    （ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
    を含む、組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、
    対象での二次腫瘍の治療、予防及び／または再発予防における使用のためのものであり、関連する原発固形腫瘍に対して前記組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、前記二次腫瘍には投与されない、あるいは
    対象での原発固形腫瘍の治療及び／または再発予防における使用のためのものであり、関連する二次性固形腫瘍に対して前記組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、前記原発固形腫瘍には投与されない、あるいは
    対象での二次腫瘍の治療、予防及び／または再発予防における使用のためのものであり、別の関連する二次性固形腫瘍に対して前記組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されるが、最初に言及した二次腫瘍には投与されない、前記組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ。
  4. 前記組み換えＭＶＡが、
    （ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸と、
    （ｂ）４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第２の核酸と、
    （ｃ）ＴＡＡをコードする少なくとも１つのさらなる核酸と、を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  5. 前記ＴＡＡが、ネオアンチゲンまたは内在性自己抗原である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  6. 前記ＴＡＡが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）タンパク質、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）ペプチド、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ２）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、及び前記内在性レトロウイルスペプチドＭＥＬ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  7. 前記ＥＲＶタンパク質が、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリー由来であり、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ）タンパク質及びＨＥＲＶ－Ｋ ｇａｇタンパク質から選択される、請求項６に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  8. 前記ＥＲＶペプチドが、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）ファミリー由来であり、好ましくは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－ｅｎｖ／ＭＥＬ）の偽遺伝子から選択される、請求項６に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  9. 前記固形腫瘍が、悪性腫瘍、好ましくは、メラノーマまたはがん性の乳房腫瘍、結腸腫瘍もしくは卵巣腫瘍である、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  10. 前記二次腫瘍が、転移である、請求項３～９のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  11. 前記組み換えＭＶＡが局所に、好ましくは腫瘍内に投与されない前記腫瘍が、郭清できないかまたは手術によるアクセスが困難である、請求項３～１０のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  12. 前記組み換えＭＶＡが、ヒト細胞株において生殖複製不能である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  13. 前記組み換えＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ－ＢＮに由来する、請求項１２に記載の使用のための組み換えＭＶＡ。
  14. 複数の腫瘍を有する対象での免疫応答を刺激する方法であって、少なくとも１つの、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１－ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを、前記対象の全腫瘍数よりも少ない腫瘍に対して局所的に投与する工程を含み、前記対象において前記ＴＡＡに対する免疫応答が刺激される、前記方法。
  15. 少なくとも１つのアクセスできない腫瘍及び少なくとも１つのアクセス可能な腫瘍を有する対象を治療する方法であって、少なくとも１つの、ＴＡＡをコードする第１の核酸と、４－１－ＢＢＬをコードする第２の核酸とを含む組み換えＭＶＡを、前記対象の少なくとも１つのアクセス可能な腫瘍に対して局所的に投与することを含み、それにより、前記アクセスできない腫瘍の増殖を低下または停止させる、前記方法。
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