ES2715890T3 - Vectores de expresión de antígenos asociados a la próstata - Google Patents

Vectores de expresión de antígenos asociados a la próstata Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Un vector C68 que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de C68; y (b) una construcción multiantígeno que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA citosólico inmunogénico, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, y en el que la construcción multiantígeno comprende además una secuencia separadora entre dos secuencias de nucleótidos que codifican dos polipéptidos inmunogénicos diferentes y tiene la estructura de fórmula (I): PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I) en el que en la fórmula (I): (i) PAA1, PAA2 y PAA3 es,cada uno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, a condición de que PAA1, PAA2, y PAA3 codifiquen diferentes polipéptidos PAA, y (ii) SS1 y SS2 son secuencias separadoras y pueden ser iguales o diferentes.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores de expresión de antígenos asociados a la próstata
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 61/898.966 presentada el 1 de noviembre de 2013.
Referencia al listado de secuencias
Esta solicitud se está presentando junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo en formato .txt titulado PC72055_SEQ_LISTING_ST25.txt, creado el 3 de octubre de 2014 y que tiene un tamaño de 429 KB. El listado de secuencias contenido en el archivo .txt es parte de la memoria descriptiva.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a inmunoterapia y específicamente a vacunas. En el presente documento también se desvelan procedimientos para tratar o prevenir trastornos neoplásicos.
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es el segundo cáncer diagnosticado con mayor frecuencia y la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en hombres en los países desarrollados de todo el mundo. Se ha demostrado que varios antígenos asociados con la próstata (PAA), como el antígeno de próstata específico (PSA), el antígeno de próstata específico de membrana (PSMA) y el antígeno de células madre de la próstata (PSCA) están sobreexpresados por las células de cáncer de próstata en comparación con sus equivalentes normales. Estos antígenos, por lo tanto, representan posibles dianas para inducir respuestas inmunitarias específicas contra los cánceres que expresan los antígenos mediante el uso de inmunoterapia basada en vacunas. (Véase, por ejemplo, Marrari, A., M. lero, y col. (2007). "Vaccination therapy in prostate cancer." Cancer Immunol Immunother 56(4): 429­ 45)
PSCA es una proteína de membrana de 123 aminoácidos. El PSCA humano nativo de longitud completa consiste en los aminoácidos 1 y 4-125 de la SEQ ID NO:21 (sin los restos de alanina y serina en la segunda y tercera posición respectivamente). El PSCA tiene una alta especificidad de tejido y se expresa en más del 85% de las muestras de cáncer de próstata, y los niveles de expresión aumentan con las puntuaciones más altas de Gleason y con independencia de los andrógenos. Se expresa en el 80-100% de las metástasis óseas de pacientes con cáncer de próstata.
El PSA es una serina proteasa similar a la calicreína que se produce exclusivamente por las células epiteliales columnares que recubren los acinos y los conductos de la glándula prostática. El ARNm de PSA se traduce como un precursor preproPSA inactivo de 261 aminoácidos. PreproPSA tiene 24 restos adicionales que constituyen la prerregión (el polipéptido señal) y el propolipéptido. La liberación del propolipéptido da como resultado la forma extracelular madura de 237 aminoácidos, que es enzimáticamente activa. La secuencia de longitud completa del PSA humano nativo consiste en los aminoácidos 4-263 de la SEQ ID NO:15. El PSA es específico de órgano y, como resultado, es producido por las células epiteliales del tejido hiperplásico de próstata benigno (HPB), tejido de cáncer de próstata primario y tejido de cáncer de próstata metastásico.
El PSMA, también conocido como Folato hidrolasa 1 (FOLH1), está compuesto por 750 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del PSMA humano de longitud completa se proporciona en la SEQ ID NO:1. El PSMA incluye un dominio citoplasmático (aminoácidos 1-19), un dominio transmembrana (aminoácidos 20-43) y un dominio extracelular (aminoácidos 44-750). Se encontró que el PSMA se expresaba en células de cáncer de próstata a niveles 1000 veces más altos que en tejidos normales. Se expresa abundantemente en la nueva vasculatura de una variedad de tumores sólidos diferentes como cáncer de colon, mama, hígado, vejiga, páncreas, pulmón, riñón, así como melanoma y sarcomas. Por lo tanto, el PSMA se considera una diana no solo específica para las células de cáncer de próstata, sino también una diana de pan carcinoma para otros tipos de cáncer.
Si bien se ha identificado un gran número de antígenos asociados a tumores y muchos de estos antígenos se han explorado como vacunas basadas en proteínas o en ADN para el tratamiento o la prevención de cánceres, la mayoría de los ensayos clínicos hasta el momento no han logrado producir un producto terapéutico. Uno de los desafíos en el desarrollo de vacunas contra el cáncer reside en el hecho de que los antígenos del cáncer generalmente derivan de sí mismos y, por lo tanto, son poco inmunogénicos porque el sistema inmunitario se autorregula para no reconocer las proteínas propias. En consecuencia, existe la necesidad de un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de las vacunas contra el cáncer.
Se han explorado numerosos enfoques para mejorar la inmunogenicidad o mejorar la eficacia antitumoral de las vacunas contra el cáncer. Uno de tales enfoques implica el uso de varios moduladores inmunitarios, tales como agonistas de TLR, agonistas de TNFR, inhibidores de CTLA-4 e inhibidores de proteínas quinasas.
Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores de membrana de tipo 1 que se expresan en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Se han identificado al menos 11 miembros en la familia TLR. Estos receptores se caracterizan por su capacidad para reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) expresados por organismos patógenos. Estos receptores ejercen control, en los sistemas inmunitarios innatos, sobre la polaridad de la respuesta inmunitaria adquirida subsiguiente. Entre los TLR, se ha investigado ampliamente TLR9 por sus funciones en las respuestas inmunitarias. La estimulación del receptor TLR9 dirige a las células presentadoras de antígenos (APC) a cebar respuestas potentes de linfocitos T dominados por Th1, al aumentar la producción de citoquinas proinflamatorias y la presentación de moléculas coestimuladoras a los linfocitos T. Se encontró que los oligonucleótidos CpG, ligandos para TLR9, son una clase de potentes factores inmunoestimuladores. Se ha probado la terapia con CpG contra una amplia variedad de modelos de tumores en ratones y se ha demostrado que promueve la inhibición o regresión de tumores.
El antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y se expresa en la superficie de los linfocitos T auxiliares. CTLA-4 es un regulador negativo de la activación de los linfocitos T dependientes de CD28 y actúa como un punto de control inhibitorio para la respuesta inmunitaria adaptativa. Similar a la proteína CD28, coestimuladora de linfocitos T, CTLA-4 se une a CD80 y CD86 en células presentadoras de antígenos. CTLA-4 transmite una señal inhibitoria a los linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimulante. Los anticuerpos humanos contra CTLA-4 humano se han descrito como moduladores de la inmunoestimulación en varias afecciones de enfermedades, tal como el tratamiento o la prevención de infecciones víricas y bacterianas y para el tratamiento del cáncer (documentos WO 01/14424 y WO 00/37504). Varios estudios preclínicos han demostrado que el bloqueo de CTLA-4 por anticuerpos monoclonales mejora la respuesta inmunitaria del hospedador contra tumores inmunogénicos, e incluso puede rechazar tumores establecidos. Se han investigado dos anticuerpos monoclonales CTLA-4 anti-humanos (mAb) completamente humanos, ipilimumab (MDX-010) y Tremelimumab (también conocido como CP-675206), en ensayos clínicos en el tratamiento de diversos tipos de tumores sólidos.
La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) es un grupo de citoquinas que se acoplan a receptores específicos de la superficie celular afines, la superfamilia del receptor del TNF (TNFR). Los miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral actúan a través de la trimerización mediada por ligando, lo que provoca el reclutamiento de varios adaptadores intracelulares para activar múltiples vías de transducción de señales, como la apoptosis, la vía NF-kB, la vía JNK, así como las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Ejemplos de la superfamilia de TNF incluyen ligandos CD40, ligandos OX40, ligandos 4-1BB, CD27, ligando CD30 (CD153), TNF-alfa, TNF-beta, ligandos rAn K, LT-alfa, LT-beta, ligandos GITR y LIGHT. La superfamilia de TNFR incluye, por ejemplo, CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (ligando CD27), CD30, TNFR2, RANK, LT-beta R, HVEM, GITR, TROY y RELT. Entre los miembros del TNF, los agonistas de CD40, incluidos varios anticuerpos agonísticos de CD40, como el anticuerpo monoclonal agonista de CD40 completamente humano CP870893, han sido ampliamente explorados para su uso en terapias.
Las proteínas quinasas son una familia de enzimas que catalizan la fosforilación de restos específicos en proteínas. Se han investigado varios inhibidores de quinasas en la investigación clínica para su uso en terapias contra el cáncer, que incluyen, por ejemplo, MK0457, VX-680, ZD6474, MLN8054, AZD2171, SNS-032, PTK787/ZK222584, Sorafenib (BAY43-9006), SU5416, SU6668 AMG706, Zactima (ZD6474), MP-412, Dasatinib, CEP-701, (Lestaurtinib), XL647, x L999, Tykerb, (Lapatinib), MLN518, (anteriormente conocido como CT53518), PKC412, ST1571, AMN107, AEE 788, OSI-930, OSI-817, Malato de sunitinib (Sutent; SU11248), Vatalanib (PTK787/ZK 222584), SNS-032, SNS-314 y Axitinib (AG-013736). Gefitinib y Erlotinib son dos EGFR-TKI oralmente disponibles.
Ferraro B. y col. (Human Vaccines, Supplement, 2011, páginas 120-127) desvela la administración conjunta de una vacuna de ADN que codifica el antígeno próstata específico (PSA) y el antígeno de próstata específico de membrana (PSMA) en un modelo de ratón de cáncer de próstata.
Waeckerle-Men Y y col. (Cancer Immunology, Immunotherapy, 2006, vol. 55, no. 12, páginas 1524-1533) desvela la inmunoterapia autóloga basada en células dendríticas en pacientes con cáncer de próstata avanzado resistente a las hormonas.
El documento WO 2009/046739 desvela composiciones inmunoestimuladoras que comprenden al menos un ARN, que codifica al menos dos antígenos seleccionados del grupo que consiste en PSA (antígeno de próstata específico), PSMA (antígeno de próstata específico de membrana), PSCA (antígeno de células madre de próstata) y STEAP (Seis Antígenos Epiteliales Transmembrana de la Próstata).
Cohen C. y col. (Journal of General Virology, 2002, vol. 83, no. 1, páginas 151-155) desvela una forma de replicación defectuosa de adenovirus de chimpancé tipo 68 (C68).
Peruzzi y col. (Vaccine, 2009, vol. 27, no. 9, páginas 1293-1300) desvela un adenovirus recombinante E1-E3 eliminado basado en el serotipo 3 de chimpancé (ChAd3) para expresar la proteína del antígeno carcinoembrionario humano (CEA) o los dominios extracelulares/transmembrana de neu de rata (ECD.TM).
Karan D y col. (Nature Reviews Urology, 2012, vol. 9, no. 7, páginas 376-385) se refiere a una vacuna bivalente basada en Ad5 que codifica una fusión de ADNc de PSA y PSCA humano (Ad5-PSA/PSCA) como una terapia potencial para el cáncer de próstata. El polipéptido PSA utilizado es la proteína PSA de longitud completa humana compuesta de 262 aminoácidos.
Sumario de la divulgación
La presente divulgación se refiere a vectores construidos a partir de secuencias genómicas del adenovirus de chimpancé ChAd68 para la expresión de dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos. El vector comprende (1) una secuencia de ADN de C68, (2) una construcción multiantígeno para la expresión de dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos, y (3) secuencias reguladoras que controlan la transcripción y traducción de los productos antigénicos (es decir, los polipéptidos PAA inmunogénicos). La secuencia de ADN de C68 incluida en el vector deriva de la secuencia genómica de C68 por deleción funcional de uno o más genes virales, pero es suficiente para la producción de una partícula viral infecciosa. En una realización particular, la secuencia de ADN de C68 utilizada en el vector es el genoma completo de C68 con deleciones funcionales únicamente en las regiones E1 y E3.
La construcción multiantígeno portada por el vector comprende secuencias de nucleótidos que codifican dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos seleccionados del polipéptido PSMA inmunogénico, polipéptido PSA inmunogénico y polipéptido PSCA inmunogénico. En algunas realizaciones, la construcción multiantígeno portada por el vector comprende (1) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido PSMA inmunogénico, (2) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido PSA inmunogénico, y (3) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido PSCA inmunogénico. Las construcciones multiantígeno también pueden incluir secuencias separadoras que permiten la expresión de polipéptidos PAA separados codificados por la construcción. Ejemplos de secuencias separadoras incluyen secuencias de péptidos 2A e IRES. En algunas realizaciones, el vector comprende una construcción multiantígeno que tiene una de las siguientes estructuras: (1) PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA;
(2) PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA;
(3) PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA; y
(4) PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSA inmunogénico comprende los nucleótidos 1115-1825 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 1106-1825 de la SEQ ID NO:58, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSCA inmunogénico comprende los nucleótidos 1892-2257 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58, y la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSMA inmunogénico comprende los nucleótidos 2333-4543 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58. En algunas realizaciones específicas, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:33, 34, 35 y 36. En una realización particular, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO:60. En otra realización particular, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:61.
La presente divulgación también proporciona composiciones que comprenden los vectores. En algunas realizaciones, La composición es una composición inmunogénica útil para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA en un mamífero, tal como un ratón, perro, mono o ser humano. En algunas realizaciones, la composición es una composición de vacuna útil para la inmunización de un mamífero, tal como un ser humano, para inhibir la proliferación celular anormal, para proporcionar protección contra el desarrollo de cáncer (utilizado como un agente profiláctico) o para el tratamiento de trastornos (usado como un agente terapéutico) asociado con la sobreexpresión de PAA, tal como cáncer, en particular, cáncer de próstata.
La presente divulgación se refiere además a procedimientos para usar los vectores o composiciones para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA, o para tratar cánceres, tales como cánceres de próstata, en un mamífero, en particular, un ser humano. En algunas realizaciones, los vectores o composiciones, incluidas las composiciones de vacunas, se administran al mamífero, en particular al ser humano, en combinación con uno o más moduladores inmunitarios que potencian la inmunogenicidad o el efecto de los vectores o composiciones. En algunas realizaciones particulares, el procedimiento implica la administración conjunta de una vacuna proporcionada por la presente divulgación en combinación con al menos un inhibidor de células inmunosupresoras y al menos un potenciador de células inmunoefectoras.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1. Ilustración esquemática del vector PJV7563.
FIG. 2. Alineación de aminoácidos de cinco casetes virales 2A. Los enlaces de glicina-prolina omitidos están indicados por asteriscos.
FIG. 3. Secuencia del IRES de EMCV preferido. El sitio de iniciación de la traducción se indica con un asterisco. El elemento IRES mínimo excluye los primeros 5 codones subrayados de la proteína L de EMCV.
FIG. 4. Gráfico que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa el efecto del malato de sunitinib (Sutent) y un anticuerpo monoclonal CTLA-4 antimurino (clon 9D9) sobre la eficacia antitumoral de una vacuna contra el cáncer (vacuna) en ratones BALB/neuT con tumor TUBO subcutáneo.
FIG. 5. Gráfico que muestra los resultados de ELISPOT de IFN^ de un estudio representativo que evalúa el efecto de CpG7909 y un anticuerpo anti-CD40 (Bioxcell n.° BE0016-2) en las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno inducidas por una vacuna contra el cáncer (rHER2).
FIG. 6. Gráficos que muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de CpG7909 sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por una vacuna contra el cáncer (PMED) utilizando el ensayo de tinción intracelular de citoquinas, en el que se midieron los linfocitos T CD8 positivos en citoquinas. (* indica P <0,05 por la prueba T de Student).
FIG. 7. Gráficos que muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de CpG7909 sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por una vacuna contra el cáncer (PMED) utilizando el ensayo de tinción intracelular de citoquinas, en el que se midieron los linfocitos T CD4 positivos en citoquinas (FIG. 7). (* indica P <0,05 por la prueba T de Student).
FIG. 8. Gráficos que muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de anticuerpo monoclonal agonista CD40 anti-murino sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por una vacuna contra el cáncer (PMED) utilizando el ensayo de tinción de citoquinas intracelulares, en el que se midieron los linfocitos T CD8 positivos en citoquinas. (* indica P <0,05 por la prueba T de Student)
FIG. 9. Gráficos que muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de anticuerpo monoclonal agonista CD40 anti-murino sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por una vacuna contra el cáncer (PMED) utilizando el ensayo de tinción de citoquinas intracelulares, en el que se midieron los linfocitos T CD4 positivos en citoquinas. (* indica P <0,05 por la prueba T de Student)
FIG. 10. Gráfico que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa el efecto del malato de sunitinib en dosis bajas (Sutent) sobre la eficacia antitumoral de una vacuna contra el cáncer en ratones BALB/neuT con tumores mamarios espontáneos.
FIG. 11. Gráfico que muestra la organización genómica del vector AdC68-734. CMV pot/pro = potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano; tet op = operador de tetraciclina; T2A = Virus Thosea asigna 2A; f2a = Virus de la fiebre aftosa 2A; SV40 pA = señal de poliadenilación del Virus Simio 40; LITR = repetición terminal invertida izquierda; RITR = repetición terminal invertida derecha.
FIG. 12. Las gráficas de puntos muestran la expresión de PSMA y PSCA en la superficie de las células A549 transducidas con vectores AdC68 que expresan triple antígeno mediante citometría de flujo.
FIG. 13. Transferencia Western de lisados de A549 infectadas por vectores AdC68.
Descripción detallada de la invención
A. Definiciones
El término "adyuvante" se refiere a una sustancia que es capaz de potenciar, acelerar o prolongar una respuesta inmunitaria provocada por un inmunógeno de vacuna.
El término "agonista" se refiere a una sustancia que promueve (induce, causa, potencia o aumenta) la actividad de otra molécula o un receptor. El término agonista abarca sustancias que se unen al receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie) y sustancias que promueven la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, activando una proteína asociada).
El término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una sustancia que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de otra molécula o receptor.
La expresión "administración conjunta" se refiere a la administración de dos o más agentes al mismo sujeto durante un período de tratamiento. Los dos o más agentes pueden abarcarse en una única formulación y, por lo tanto, administrarse simultáneamente. Como alternativa, los dos o más agentes pueden estar en formulaciones físicas separadas y administrarse por separado, de forma secuencial o simultánea, al sujeto. La expresión "administrado simultáneamente" o "administración simultánea" significa que la administración del primer agente y la de un segundo agente se superponen en el tiempo entre sí, mientras que la expresión "administrado secuencialmente" o "administración secuencial" significa que la administración del primer agente y la de un segundo agente no se superponen en el tiempo entre sí.
El término "citosólico" significa que, después de que una célula hospedadora exprese una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido particular, el polipéptido expresado se retiene dentro de la célula huésped.
La expresión "variante degenerada" se refieren a una secuencia de nucleótidos que tiene sustituciones de bases en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia pero, debido a la degeneración del código genético, codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de nucleótidos de referencia.
La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad administrada a un mamífero que es suficiente para causar un efecto deseado en el mamífero.
El término "fragmento" de un polipéptido dado se refiere a un polipéptido que es más corto que el polipéptido dado y comparte una identidad del 100% con la secuencia del polipéptido dado.
El término "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia.
La expresión "potenciador de las células inmunoefectoras" o "potenciador de IEC" se refiere a una sustancia capaz de aumentar o potenciar el número, calidad o función de uno o más tipos de células inmunoefectoras de un mamífero. Ejemplos de células inmunoefectoras incluyen linfocitos T CD8 citolíticos, linfocitos T CD40, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos B.
La expresión "modulador inmunitario" se refiere a una sustancia capaz de alterar (por ejemplo, inhibir, disminuir, aumentar, potenciar o estimular) el funcionamiento de cualquier componente del sistema inmunitario innato, humoral o celular de un mamífero. Por lo tanto, la expresión "modulador inmunitario" abarca el "potenciador de células inmunoefectoras" como se define en el presente documento y el "inhibidor de células inmunosupresoras " como se define en el presente documento, así como una sustancia que afecta a otros componentes del sistema inmunitario de un mamífero.
La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier respuesta detectable a una sustancia particular (tal como un antígeno o inmunógeno) por el sistema inmunitario de un animal vertebrado hospedador, que incluye, pero sin limitación, respuestas inmunitarias innatas (p. ej., activación de la cascada de señalización del receptor Toll), respuestas inmunitarias mediadas por células (p. ej., respuestas mediadas por linfocitos T, tal como linfocitos T específicos de antígeno y células no específicas del sistema inmunitario) y respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, respuestas mediadas por linfocitos B, como la generación y secreción de anticuerpos en el plasma, la linfa y/o los fluidos tisulares). Ejemplos de respuestas inmunitarias incluyen una alteración (por ejemplo, un aumento) en la activación del receptor tipo Toll, expresión o secreción de linfoquinas (por ejemplo, citoquinas (por ejemplo, citoquinas de tipo Th1, Th2 o Th17) o quimioquinas), activación de macrófagos, activación de células dendríticas, activación de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos CD4+ o CD8+), activación de linfocitos citolíticos naturales, activación de linfocitos B (p. ej., generación y/o secreción de anticuerpos), unión de un inmunógeno (p. ej., Antígeno (p. ej., polipéptido inmunogénico)) a una molécula del MHC, inducción de una respuesta de linfocitos T citotóxicos ("CTL"), inducción de una respuesta de linfocitos B (p. ej., producción de anticuerpos) y, expansión (p. ej., el crecimiento de una población de células) de células del sistema inmunitario (p. ej., linfocitos T y linfocitos B), y un mayor procesamiento y presentación del antígeno por células presentadoras de antígenos. La expresión "respuesta inmunitaria" también abarca cualquier respuesta detectable a una sustancia particular (como un antígeno o inmunógeno) por uno o más componentes del sistema inmunitario de un animal vertebrado in vitro.
El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para causar, provocar, estimular o inducir una respuesta inmunitaria, o para mejorar, potenciar, aumentar o prolongar una respuesta inmunitaria preexistente, contra un antígeno particular, ya sea solo o cuando está unido a un transportador, en presencia o ausencia de un adyuvante.
La expresión "polipéptido PSA inmunogénico" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSA humana o contra células que expresan la proteína PSA humana.
La expresión "polipéptido PSCA inmunogénico" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSCA humana o contra células que expresan la proteína PSCA humana.
La expresión "polipéptido PSMA inmunogénico" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSMA humana o contra células que expresan la proteína PSMA humana.
La expresión "polipéptido PAA inmunogénico" se refiere a un "polipéptido PSA inmunogénico", un "polipéptido PSCA inmunogénico", o un "polipéptido PSMA inmunogénico" como se define en el presente documento anteriormente. La expresión "inhibidor de células inmunosupresoras" o "inhibidor de ISC" se refiere a una sustancia capaz de reducir o suprimir el número o la función de las células inmunosupresoras de un mamífero. Ejemplos de células inmunosupresoras incluyen linfocitos T reguladores ("T regs"), células supresoras derivadas de mieloides y macrófagos asociados a tumores.
La expresión "administración intradérmica", o "administrado por vía intradérmica", en el contexto de la administración de una sustancia, como un agente terapéutico o un modulador inmunitario, a un mamífero incluyendo un ser humano, se refiere al suministro de la sustancia en la capa dermis de la piel del mamífero. La piel de un mamífero se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la capa subcutánea. La epidermis es la capa externa de la piel relativamente delgada y resistente. La mayoría de las células en la epidermis son queratinocitos. La dermis, la siguiente capa de la piel, es una capa gruesa de tejido fibroso y elástico (compuesta principalmente de colágeno, elastina y fibrilina) que da a la piel su flexibilidad y resistencia. La dermis contiene terminaciones nerviosas, glándulas sudoríparas y glándulas grasas (sebáceas), folículos pilosos y vasos sanguíneos. La dermis varía en espesor dependiendo de la ubicación de la piel. En seres humanos, es de aproximadamente 0,3 mm en el párpado y de aproximadamente 3,0 mm en la espalda. La capa subcutánea está formada por tejido graso y conectivo que alberga vasos sanguíneos y nervios más grandes. El grosor de esta capa varía a lo largo del cuerpo y de persona a persona. La expresión "administración intradérmica" se refiere al suministro de una sustancia al interior de la capa de la dermis. En cambio, "administración subcutánea" se refiere a la administración de una sustancia en la capa subcutánea y "administración tópica" se refiere a la administración de una sustancia sobre la superficie de la piel. La expresión "administración local" o "administrado localmente" abarca "administración tópica", "administración intradérmica" y "administración subcutánea", cada una como se define en el presente documento anteriormente. Esta expresión también abarca la "administración intratumoral", que se refiere a la administración de una sustancia en el interior de un tumor. La administración local se destina a permitir altas concentraciones locales alrededor del sitio de administración durante un período de tiempo hasta que se logre la biodistribución sistémica con la sustancia administrada, mientras que la "administración sistémica" se destina a que la sustancia administrada se absorba en la sangre y alcance la exposición sistémica rápidamente al distribuirse a través del sistema circulatorio a órganos o tejidos en todo el cuerpo.
El término "mamífero" se refiere a cualquier especie animal de la clase Mammalia. Ejemplos de mamíferos incluyen: seres humanos; primates no humanos tales como monos; animales de laboratorio tales como ratas, ratones, conejillos de indias; animales domésticos tales como gatos, perros, conejos, vacas, ovejas, cabras, caballos y cerdos; y animales salvajes cautivos tal como leones, tigres, elefantes y similares.
La expresión "unido a la membrana" significa que después de que una célula hospedadora exprese una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido particular, el polipéptido expresado se une a, se adhiere a o se asocia de otro modo a, la membrana de la célula.
La expresión "trastorno neoplásico" se refiere a una afección en la cual las células proliferan a una tasa anormalmente alta e incontrolada, la tasa supera y no está coordinada con la de los tejidos normales circundantes. Por lo general, da como resultado una lesión sólida o tumoración conocida como "tumor". Esta expresión abarca trastornos neoplásicos benignos y malignos. La expresión "trastorno neoplásico maligno", que se usa indistintamente con el término "cáncer" en la presente divulgación, se refiere a un trastorno neoplásico caracterizado por la capacidad de las células tumorales para propagarse a otras ubicaciones en el cuerpo (conocido como "metástasis" ). La expresión "trastorno neoplásico benigno" se refiere a un trastorno neoplásico en el que las células tumorales carecen de la capacidad de metastatizar.
La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia control "unida operativamente" a un transgén se liga de tal manera que la expresión del transgén se logra en condiciones compatibles con las secuencias control.
La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia en una composición inmunogénica o de vacuna, distinta de los principios activos (por ejemplo, el antígeno, el ácido nucleico que codifica el antígeno, el modulador inmunitario o el adyuvante) que es compatible con los principios activos y no causa un efecto adverso significativo en los sujetos a los que se administra.
Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados química o bioquímicamente o derivatizados, y polipéptidos que tienen cadenas principales polipeptídicas modificadas.
La expresión "que previene" o "prevenir" se refiere a (a) evitar que se produzca un trastorno o (b) retrasar la aparición de un trastorno o la aparición de los síntomas de un trastorno.
La expresión "antígeno asociado a la próstata" (o PAA) se refiere al TAA (como se define en el presente documento) que se expresa específicamente en las células tumorales de la próstata o se expresa a una frecuencia o densidad mayor por parte de las células tumorales que por las células no tumorales del mismo tipo de tejido. Ejemplos de PAA incluyen PSA, PSCA y PSMA.
El término "secretado" en el contexto de un polipéptido significa que después de que una célula hospedadora exprese una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, el polipéptido expresado se secreta fuera de la célula hospedadora.
La expresión "dosis subóptima" cuando se usa para describir la cantidad de un modulador inmunitario, como un inhibidor de proteínas quinasas, se refiere a una dosis del modulador inmunitario que está por debajo de la cantidad mínima requerida para producir el efecto terapéutico deseado para la enfermedad que se está tratando cuando el modulador inmunitario se administra solo a un paciente.
La expresión "que trata", "tratamiento", o "tratar" se refiere a derogar un trastorno, reducir la gravedad de un trastorno o reducir la gravedad o frecuencia de aparición de un síntoma de un trastorno.
La expresión "antígeno asociado a tumor" o "TAA" se refiere a un antígeno que se expresa específicamente por células tumorales o se expresa a una mayor frecuencia o densidad por células tumorales que por células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los antígenos asociados a tumores pueden ser antígenos que normalmente no se expresan por el hospedador; pueden estar mutados, truncados, plegados incorrectamente o sino ser manifestaciones anormales de las moléculas normalmente expresadas por el hospedador; pueden ser idénticas a las moléculas normalmente expresadas pero expresadas en niveles anormalmente altos; o pueden expresarse en un contexto o entorno que es anormal. Los antígenos asociados a tumores pueden ser, por ejemplo, proteínas o fragmentos de proteínas, carbohidratos complejos, gangliósidos, haptenos, ácidos nucleicos o cualquier combinación de éstas u otras moléculas biológicas.
El término "vacuna" se refiere a una composición inmunogénica para su administración a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria contra un antígeno particular.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o transferir una molécula de ácido nucleico extraña. La molécula de ácido nucleico extraña se conoce como "inserto" o "transgén". Un vector generalmente consiste en un inserto y una secuencia más grande que sirve como la estructura del vector. El término "vector" abarca tanto vectores de expresión como vectores de transcripción. La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector capaz de expresar el inserto en la célula diana. Por lo general, contiene secuencias control, tales como secuencias potenciadoras, promotoras y terminadoras, que dirigen la expresión del inserto. La expresión "vector de transcripción" se refiere a un vector que se puede transcribir pero no traducir. Los vectores de transcripción se utilizan para amplificar su inserto. Según la estructura o el origen de los vectores, los principales tipos de vectores incluyen vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores de fagos como el fago lambda, vectores virales tal como vectores adenovirus (Ad) y cromosomas artificiales.
B. VECTORES QUE CONTIENEN UNA CONSTRUCCIÓN MULTIANTIGENO
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un vector viral construido a partir del genoma del adenovirus de chimpancé ChAd68 para la expresión de dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos. El adenovirus de chimpancé ChAd68 también se conoce en la literatura como adenovirus simio 25, C68, Chad68, SAdV25, PanAd9 o Pan9. Por conveniencia, el adenovirus de chimpancé ChAd68 se puede denominar en esta especificación como "C68" y el vector viral construido a partir del genoma del adenovirus de chimpancé ChAd68 se denomina "vector C68". La secuencia genómica de longitud completa de C68 está disponible en Genbank (Número de Acceso AC_000011.1) y se proporciona en la SEQ ID NO:57. Además, la secuencia genómica completa de C68 y la ubicación de los genes de adenovirus E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, I1, I2, L3, L4 y L5 también se proporcionan en la patente de Estados Unidos 6.083.716.
El vector C68 proporcionado por la presente divulgación comprende (1) una secuencia de ADN C68, y (2) una construcción multiantígeno para la expresión de dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos. El vector también puede contener secuencias reguladoras no nativas que controlan la transcripción y traducción de los productos antigénicos. Las secuencias reguladoras no nativas se refieren a secuencias que no forman parte del genoma de C68. La secuencia de ADN C68, la construcción multiantígeno y las secuencias reguladoras están operativamente unidas entre sí.
El vector C68 puede ser competente para la replicación, condicionalmente competente para la replicación o deficiente en replicación. Un vector C68 competente para la replicación puede replicarse en células hospedadoras típicas, es decir, células que normalmente pueden infectarse por un adenovirus. Un vector viral competente para la replicación puede tener una o más mutaciones en comparación con el adenovirus de tipo silvestre (por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones) en el genoma del adenovirus que no inhibe la replicación viral en las células hospedadoras. Un vector C68 de replicación condicional es un vector viral que se ha diseñado para replicarse en condiciones predeterminadas. Por ejemplo, las funciones génicas esenciales para la replicación, por ejemplo, las funciones génicas codificadas por las regiones tempranas adenovirales, pueden unirse operativamente a una secuencia de control de la transcripción inducible, suprimible o específica del tejido, por ejemplo, un promotor. Un vector C68 deficiente en la replicación es un vector viral que requiere la complementación de una o más funciones génicas o regiones del genoma viral que se requieren para la replicación, como resultado de, por ejemplo, una deficiencia en una o más funciones o regiones génicas esenciales para la replicación, de modo que el vector no se replique en las células hospedadoras típicas, especialmente en aquellas de un ser humano que se va a infectar por el vector.
Los vectores son útiles para clonar o expresar los polipéptidos PAA inmunogénicos, o para suministrar la construcción multiantígeno en una composición, tal como una vacuna, a una célula hospedadora o a un animal hospedador, tal como un ser humano. En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un vector seleccionado del grupo que consiste en (i) un vector que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:58; (ii) un vector que comprende o consiste en los nucleótidos 9 - 34811 de la SEQ ID NO:58; y (iii) un vector que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:63.
El vector C68 proporcionado por la presente divulgación también abarca variantes funcionales de los vectores específicamente descritos o ejemplificados en la presente divulgación. Una "variante funcional" se refiere a un vector que contiene mutaciones (p. ej., adiciones, deleciones o sustituciones) en relación con la secuencia de un vector ("vector precursor") específicamente descrito o ejemplificado en la presente divulgación, pero que conserva la función o propiedad del vector precursor. Por ejemplo, la variante funcional puede comprender una secuencia optimizada por codones correspondiente a un vector precursor ejemplificado en la presente divulgación.
B1. La secuencia de ADN de C68
La expresión "secuencia de ADN de C68" se refiere a una secuencia de ADN que forma parte de la secuencia genómica de C68. La secuencia de ADN de C68 incluida en el vector deriva de la secuencia genómica de C68 por deleción funcional de uno o más genes o regiones genómicas virales. La expresión "deleción funcional" significa que una cantidad suficiente de la región del gen del virus se elimina o se modifica de otra manera, por ejemplo, mediante mutación o modificación, de modo que la región del gen ya no es capaz de producir productos funcionales de la expresión génica o está realizando su función normal de otra manera. A menudo no es necesaria la deleción de una región génica completa para la interrupción de una función génica esencial para la replicación. Sin embargo, con el fin de proporcionar suficiente espacio en el genoma de C68 para uno o más transgenes, puede ser deseable la eliminación de la mayoría de una o más regiones génicas. Si bien se prefiere la deleción del material genético, la mutación del material genético por adición o sustitución también es apropiada para interrumpir la función del gen. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN de C68 del vector deriva de la secuencia genómica de C68 al eliminar funcionalmente la totalidad, o una porción suficiente, del gen temprano inmediato E1a y del gen temprano retrasado E1b del adenovirus. En otras realizaciones, además de la deleción funcional de E1a y E1b, la deleción funcional también se puede realizar en uno o más genes distintos, como el gen temprano retrasado E2a, el gen temprano retrasado e3, E4, cualquiera de los genes tardíos L1 a L5, los genes intermedios IX y IVa2. Por lo tanto, la secuencia de ADN de C68 para su uso en la construcción del vector de la invención puede contener deleciones solo en E1. Como alternativa, se pueden usar deleciones de genes completos o porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector ejemplar, la secuencia de ADN de C68 deriva de la secuencia genómica de C68 mediante deleciones funcionales de los genes E1 y del gen E4, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E3, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin deleción de E3, y así sucesivamente. Además, dichas deleciones se pueden usar en combinación con otras mutaciones, como las mutaciones sensibles a la temperatura, para lograr un resultado deseado. En una realización particular, la secuencia de ADN de C68 es el genoma completo de C68 únicamente con deleciones funcionales en las regiones E1 y E3. En algunas realizaciones particulares, la deleción funcional del gen E1 se realiza mediante la deleción de los nucleótidos 577-3403 de la SEQ ID NO:57 o mediante la deleción de los nucleótidos 456-3012 de la SEQ ID NO:57, y la deleción funcional del gen E3 se realiza mediante la deleción de los nucleótidos 27125 -31831 de la SEQ ID NO:57 o mediante la deleción de los nucleótidos 27812-31330 de la SEQ ID NO:57. En otras realizaciones particulares, la secuencia de ADN de C68 incluida en el vector comprende los nucleótidos 3013 - 27811 de la SEQ ID NO:57. Aún en otras realizaciones particulares, la secuencia de ADN de C68 incluida en el vector comprende los nucleótidos 3013 - 27811 y 31331 - 36519 de la SEQ ID NO:57.
La construcción multiantígeno puede insertarse en cualquier región eliminada del genoma del adenovirus. La construcción multiantígeno también puede insertarse en una región de un gen existente para interrumpir la función de esa región. En algunas realizaciones, la construcción multiantígeno se inserta en lugar del gen E1 eliminado. B2. Las construcciones multiantígeno
La expresión "construcción multiantígeno" se refiere a una molécula o secuencia de ácido nucleico que codifica dos o más polipéptidos PAA. Dichas moléculas o secuencias también pueden denominarse "vacuna multiantígeno" o "plásmido multiantígeno" en la presente divulgación. Una construcción multiantígeno puede portar dos secuencias de nucleótidos codificantes en la que cada una de las secuencias de nucleótidos codificantes expresa un polipéptido PAA inmunogénico individual. Tal construcción también se denomina "construcción de antígeno dual", "vacuna de antígeno dual", o "plásmido de antígeno dual" en la presente divulgación. Una construcción multiantígeno también puede portar tres secuencias de nucleótidos codificantes en la que cada una de las secuencias de nucleótidos codificantes expresa un polipéptido PAA inmunogénico individual. Tal construcción también se denomina "construcción de triple antígeno", "vacuna de triple antígeno", o "plásmido de triple antígeno" en la presente divulgación. Los polipéptidos PAA individuales codificados por una construcción multiantígeno pueden ser inmunogénicos contra el mismo antígeno, tal como PSMA, PSA o PSCA. Por ejemplo, una construcción de antígeno dual puede expresar dos antígenos PAA diferentes que son, ambos, inmunogénicos contra PSMA. Los polipéptidos PAA individuales codificados por una construcción multiantígeno pueden ser inmunogénicos contra diferentes antígenos, por ejemplo, una construcción de antígeno dual puede expresar dos polipéptidos PAA que son inmunogénicos contra PSMA y PSA, respectivamente. Se prefiere que una construcción multiantígeno codifique dos o más polipéptidos PAA individuales que sean inmunogénicos contra diferentes antígenos.
En algunas realizaciones, la construcción multiantígeno codifica al menos dos polipéptidos PAA inmunogénicos en cualquiera de las siguientes combinaciones:
1) un polipéptido PSMA inmunogénico y un polipéptido PSA inmunogénico;
2 ) un polipéptido PSMA inmunogénico y un polipéptido PSCA inmunogénico; y
3 ) un polipéptido PSA inmunogénico y polipéptido PSCA inmunogénico.
En algunas realizaciones particulares, la construcción multiantígeno codifica al menos un polipéptido PSMA inmunogénico, al menos un polipéptido PSA inmunogénico, y al menos un polipéptido PSCA inmunogénico.
El polipéptido PSMA inmunogénico expresado por una construcción multiantígeno puede ser citosólico, secretado o unido a la membrana, pero preferentemente unido a la membrana. En algunas realizaciones, el polipéptido PSMA inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
1 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1,
2) los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO:1;
3 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3;
4 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5;
5 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7;
6) los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:3;
7) los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:5;
8) los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:7;
9 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9; y
10) los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:9.
El polipéptido PSA inmunogénico expresado por una construcción multiantígeno puede ser citosólico, secretado o unido a la membrana, pero preferentemente citosólico. En algunas realizaciones, el polipéptido PSA inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
1) los aminoácidos 27-263 de la SEQ ID NO:15;
2 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17; y
3) los aminoácidos 4 - 240 de la SEQ ID NO:17.
El polipéptido PSCA inmunogénico expresado por una construcción multiantígeno puede ser la proteína PSCA humana de longitud completa. En algunas realizaciones, el polipéptido PSCA inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
1 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21;
2) los aminoácidos 2-125 de la SEQ ID NO: 21; y
3) los aminoácidos 4-125 de la SEQ ID NO:21.
En algunas otras realizaciones, la construcción multiantígeno codifica al menos un polipéptido PSA inmunogénico, al menos un polipéptido PSCA inmunogénico, y al menos un polipéptido PSMA inmunogénico, en la que el polipéptido PSA inmunogénico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17 o los aminoácidos 4 - 240 de la SEQ ID NO:17, en la que el polipéptido PSCA inmunogénico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21 o los aminoácidos 2-125 de la SEQ ID NO:21, y en la que el polipéptido PSMA inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
1) los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO:1;
2) los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:9; y
3 ) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9.
En algunas realizaciones particulares, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60 o 64.
En algunas realizaciones particulares, la construcción multiantígeno comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico, (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, y (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, en la que: (1) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSA inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:18; (ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:20; (iii) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-720 de la SEQ ID NO:18; (iv) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1115-1825 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ ID NO:63; (v) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1106-1825 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ ID NO:63; y (vi) una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en (i) - (v) anteriormente.
(2) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSCA inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:22; (iii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-375 de la SEQ ID NO:22; (iv) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1892-2257 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ ID NO:63; (iv) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ iD No :63; y (vi) una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en (i) - (iv) anteriormente; y
(3) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSMA inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (iii) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 43-2250 de la SEQ ID NO:2; (ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:4; (iii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:6; (iv) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:8; (v) las secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:10; (vi) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-2217 de la SEQ ID NO:4; (vii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-2217 de la SEQ ID NO:6; (viii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-2217 de la SEQ ID NO:8; (ix) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-2217 de la SEQ ID NO:10; (x) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 2333­ 4543 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ ID NO:63; (xi) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58 o la SEQ ID NO:63; y (xii) una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en (i) - (xi) anteriormente.
En otra realización específica, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMa inmunogénico, en la que: la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSA inmunogénico comprende los nucleótidos 1106-1825 de la SEQ ID NO:58 o de la SEQ ID NO:63; la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSCA inmunogénico comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58 o de la SEQ ID NO:62; y la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSMA inmunogénico comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58 o de la SEQ ID NO:63.
Con el fin de permitir la expresión de polipéptidos PAA inmunogénicos separados a partir de una única construcción multiantígeno portada por el vector, se incluyen secuencias intercaladas entre las secuencias que codifican los polipéptidos PAA inmunogénicos individuales (es decir, polipéptidos PSA, PSCA y PSMA). Estas secuencias intercaladas permiten la traducción separada del polipéptido pAa inmunogénico cadena abajo. Dicha secuencia intercalada se denomina "secuencia separadora" en la memoria descriptiva. Cualquier secuencia que pueda usarse para la expresión conjunta de múltiples polipéptidos a partir de un solo vector puede usarse como secuencia separadora en el vector proporcionado por la presente divulgación. Ejemplos de secuencias separadoras útiles incluyen sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias de péptidos 2A.
Las secuencias de péptidos 2A y similares a péptidos 2A, también denominadas casetes de escisión o CHYSEL (elementos de hidrolasa que actúan en cis), tienen una longitud de aproximadamente 20 aminoácidos con un motivo D-V/I-EXNPGP carboxilo terminal altamente conservado (Figura 2). Las secuencias son raras en la naturaleza, se encuentran más comúnmente en virus tal como el virus de la fiebre aftosa (FMDV), el virus de la rinitis equina A (ERAV), el virus de la encefalomiocarditis (EMCV), el teschovirus porcino (PTV) y el virus Thosea asigna ( TAV) (Luke, G. A., P. de Felipe, y col. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042). Con una estrategia de expresión multiántigeno basada en 2A, los genes que codifican múltiples antígenos diana se unen entre sí en un único marco de lectura abierto, separados por secuencias 2A. Todo el marco de lectura abierto se clona en un vector con un promotor y terminador únicos. Tras el suministro de las construcciones a una célula hospedadora, el ARNm que codifica los antígenos múltiples se transcribe y traduce como una única poliproteína. Durante la traducción de las secuencias 2A, los ribosomas omiten el enlace entre la glicina y la prolina C-terminal. La omisión ribosómica actúa como una "escisión" autocatalítica cotraduccional que libera cadena arriba las proteínas cadena abajo. La información general sobre el uso de varias secuencias de péptidos 2A en vectores que coexpresan múltiples polipéptidos puede encontrarse en Andrea L. Szymczak y Darrio AA Vignali: Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opinion Biol. Ther. (2005)5(5) 627-638. La incorporación de una secuencia 2A entre dos antígenos proteicos da como resultado la adición de -20 aminoácidos en el extremo C del polipéptido cadena arriba y 1 aminoácido (prolina) en el extremo N de la proteína cadena abajo. En una adaptación de este procedimiento, los sitios de escisión de proteasas pueden incorporarse en el extremo N del casete 2A de modo que las proteasas ubicuas escindan el casete de la proteína cadena arriba (Fang, J., S. Yi, y col. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6): 1153-1159).
Ejemplos de secuencias de péptidos 2A específicas que pueden usarse en la presente invención se desvelan en Andrea L. Szymczak & Darrio Aa Vignali: Development of 2a peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opinion Biol. Ther. (2005)5(5) 627-638, y se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1. Secuencias de péptidos 2A
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continuación
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Los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) son elementos de ARN (Figura 3) que se encuentran en las regiones 5 ' no traducidas de ciertas moléculas de ARN (Bonnal, S., C. Boutonnet, y col. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31(1): 427-428). Atraen ribosomas eucariotas al ARN para facilitar la traducción de los marcos de lectura abiertos cadena abajo. A diferencia de la traducción dependiente de caperuza de 7-metilguanosina celular normal, la traducción mediada por IRES puede iniciarse en codones de AUG en una molécula de ARN. El proceso altamente eficaz puede explotarse para su uso en vectores de expresión multicistrónicos (Bochkov, Y. A. y A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288). La secuencia de un IRES de EMCV preferido (pIRES) se proporciona en la Figura 3 y la SeQ ID NO:59. El IRES de EMCV mínimo (mIRES) excluye los primeros cinco codones subrayados de la proteína L de EMCV, como se muestra en la Figura 3. Normalmente, se insertan dos transgenes en un vector entre un promotor y un terminador de la transcripción como dos marcos de lectura abiertos aislados, separados por un IRES. Tras el suministro de las construcciones a una célula hospedadora, se transcribirá un solo transcrito largo que codifica ambos transgenes. El primer ORF se traducirá de la manera dependiente de caperuza tradicional, terminando en un codón de parada cadena arriba del IRES. El segundo ORF se traducirá de manera independiente de la caperuza utilizando el IRES. De esta forma, pueden producirse dos proteínas independientes a partir de un solo ARNm transcrito de un vector con un solo casete de expresión. En algunas realizaciones, la construcción multiantígeno comprende un IRES de EMCV que comprende los nucleótidos 1-553 de la SEQ ID NO:59.
Normalmente, solo se necesita una secuencia separadora entre dos secuencias codificantes de polipéptidos PAA inmunogénicos en una construcción multiantígeno. El orden de las secuencias separadoras y las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos PAA en una construcción multiantígeno se muestra en la fórmula (I):
PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
En la que: (i) PAA1, PAA2 y PAA3 es,cada uno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, siempre que PAA1, PAA2 y PAA3 codifiquen diferentes polipéptidos PAA, y (ii) SS1 y SS2 son secuencias separadoras y pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, el vector comprende una construcción multiantígeno de fórmula (I) en la que:
(i) PAA1 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico;
(ii) PAA2 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA o PSMA inmunogénico. (cuando PAA2 es una secuencia de nucleótidos que codifica un PSCA inmunogénico, entonces PAA3 es una secuencia de nucleótidos que codifica un PSMA inmunogénico, o viceversa);
(iii) SS1 es una secuencia de péptido 2A; y
(iv) SS2 es una secuencia de péptido 2A o un IRES.
En algunas realizaciones particulares, la construcción multiantígeno tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
(1) PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA;
(2) PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA;
(3) PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA; y
(4) PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA
En una realización específica, el vector comprende una construcción multiantígeno que tiene una estructura de fórmula (I):
PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
en la que:
(i) PAA1 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico y comprende los nucleótidos 1115-1825 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 1106-1114 de la SEQ ID NO:58 o 63; (ii) PAA2 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico y comprende los nucleótidos 1892-2257 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58 o 63; (iii) PAA3 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico y comprende los nucleótidos 2333-4543 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58 o 63; (iv) SS1 es una secuencia de nucleótidos que codifica T2A; y
(v) SS2 es una secuencia de nucleótidos que codifica F2A.
Las construcciones multiantígeno también puede incluir una secuencia enlazadora posicionada entre una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PAA inmunogénico (es decir, un polipéptido PSA, PSCA o PSMA inmunogénico) y una secuencia separadora cadena abajo. Un ejemplo de dicha secuencia enlazadora es una secuencia de nucleótidos que codifica glicina-serina.
En algunas realizaciones particulares, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60 o codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:61. En una realización particular, la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de los grupos que consisten en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:61, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:65, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:66 y una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos.
B3. Secuencias Reguladoras
Además de las secuencias separadoras y las secuencias enlazadoras descritas en el presente documento anteriormente, el vector puede comprender otras secuencias reguladoras no nativas para dirigir la expresión eficaz de los polipéptidos PAA codificados. Ejemplos de las secuencias reguladoras incluyen (1) secuencias de iniciación, terminación, promotor y potenciador de la transcripción; (2) señales de procesamiento de ARN eficaces, tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; (3) secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; (4) secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); (5) secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y (6) secuencias que potencian la secreción de proteínas. Ejemplos de sistemas promotores que pueden usarse en los vectores proporcionados por la presente divulgación para dirigir la expresión eficaz en células de mamíferos incluyen el promotor SV40, promotor de actina B de pollo, promotor del factor de elongación humano, promotor del citomegalovirus humano (CMV), promotor del CMV de simio, promotor del CMV murino, promotor de pseudorrabia, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la fosfoglicerato quinasa, promotor LTR del virus de la leucemia murina, promotor LTR del virus de la leucosis aviar, promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, promotor LTR del Virus de la leucemia murina de Moloney, promotor del inhibidor del activador del plasminógeno, CYR61, promotor tardío del adenovirus principal, promotor de metalotioneína de ratón, promotor de fosfoenol-piruvato carboxiquinasa de ratón, promotor de B-lactoglobulina bovina, promotor de prolactina bovina, promotor de ubiquitina C y promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Ejemplos de señales de terminación de la transcripción incluyen poliadenilación de SV40 (poliA); poliA de la hormona de crecimiento bovino; poli A de globina B de conejo; timidina quinasa de HSV, glicoproteína B y glicoproteína D; HPV E y L y terminadores sintéticos.
En algunas realizaciones, los vectores C68 comprenden un promotor de citomegalovirus humano (CMV), opcionalmente con el potenciador de CMV, y un SV40 poliA.
C. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UN VECTOR QUE PORTA UNA CONSTRUCCIÓN MULTIANTIGENO (COMPOSICIONES DE VECTOR)
La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un vector proporcionado por la presente divulgación (en el presente documento "composición de vector"). Las composiciones de vector son útiles para provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína PAA in vitro o in vivo en un mamífero, incluyendo un ser humano. La composición de vector puede comprender los vectores solos, o puede comprender además un excipiente.
En algunas realizaciones, la composición de vector es una composición farmacéutica, que comprende un vector proporcionado por la presente divulgación y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes adecuados para composiciones farmacéuticas son conocidos en la técnica. Los excipientes pueden incluir soluciones acuosas, soluciones no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de excipientes no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva o ésteres inyectables tales como oleato de etilo. Ejemplos de excipientes acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidas las soluciones salinas y medios tamponados. Los excipientes adecuados también incluyen agentes que ayudan en la captación celular del vector.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una composición de vacuna para la administración a seres humanos para inhibir la proliferación celular anormal, proporcionando protección contra el desarrollo de cáncer (utilizado como un agente profiláctico) o para el tratamiento del cáncer (usado como un agente terapéutico) asociado con una sobreexpresión de PAA, o para provocar una respuesta inmunitaria a un PAA humano particular, tal como PSMA, PSA o PSCA. La composición de vacuna comprenderá adicionalmente uno o más adyuvantes. Se proporcionan ejemplos de adyuvantes que pueden incluirse en las composiciones de vacuna en el presente documento, a continuación.
D. USOS DE LOS VECTORES Y COMPOSICIONES DE VECTOR
En otros aspectos, La presente divulgación proporciona procedimientos para usar el vector o composición que comprende los vectores descritos anteriormente en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA en un mamífero, en particular, un ser humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de (1) un vector que contiene una construcción multiantígeno, o (2) una composición que comprende dichos vectores.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación celular anormal en un ser humano, en el que la proliferación celular anormal está asociada con la sobreexpresión de un PAA. El procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de (1) un vector que contiene una construcción multiantígeno que codifica dos o más polipéptidos PAA inmunogénicos, o (2) una composición que comprende dichos vectores. En algunas realizaciones, el procedimiento es para inhibir la proliferación celular anormal en la próstata en un ser humano. En una realización particular, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación celular anormal en la próstata que sobreexpresa PSMA. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar cáncer de próstata en un ser humano, que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de (1) un vector que contiene una construcción multiantígeno o (2) una composición que comprende dichos vectores. En una realización preferida, la construcción multiantígeno es una construcción de triple antígeno que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, un polipéptido PSA inmunogénico y un polipéptido PSCa inmunogénico.
Los vectores o composiciones de vector pueden administrarse a un animal, incluido un ser humano, mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Ejemplos de procedimientos adecuados incluyen: (1) administración intramuscular, intradérmica, intraepidérmica, intravenosa, intraarterial, subcutánea o intraperitoneal, (2) administración oral, y (3) aplicación tópica (como aplicación ocular, intranasal e intravaginal). Un procedimiento particular de administración intradérmica o intraepidérmica de una composición de vacuna de ácido nucleico implica el uso de tecnología de suministro de pistola génica, tal como el dispositivo de suministro de vacuna de Suministro Epidérmico Mediado por Partículas (PMED ™) comercializado por PowderMed. Otro procedimiento particular para la administración intramuscular de una vacuna de ácido nucleico es la inyección seguida de electroporación.
El experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad eficaz del vector o composición de vector que se administrará en un procedimiento dado y dependerá de varios factores. En un procedimiento para tratar el cáncer, tal como el cáncer de próstata, los factores que pueden considerarse para determinar la cantidad eficaz incluyen, pero sin limitación: (1) el sujeto a tratar, incluyendo el estado inmunitario y la salud del sujeto, (2) la gravedad o etapa del cáncer a tratar, (3) los polipéptidos PAA inmunogénicos específicos expresados, (4) el grado de protección o tratamiento deseado, (5) el procedimiento y calendario de administración, (6) las formulaciones utilizadas, y (7) la administración conjunta de otros agentes terapéuticos (como adyuvantes o moduladores inmunitarios). Por ejemplo, las cantidades eficaces del vector pueden estar en el intervalo de 2 pg/dosis -10 mg/dosis cuando la composición de la vacuna de ácido nucleico se formula como una solución acuosa y se administra mediante inyección de aguja hipodérmica o inyección neumática, mientras que, se pueden requerir solo 16 ng/dosis -16 pg/dosis cuando el ácido nucleico se prepara como perlas de oro recubiertas y se suministra mediante una tecnología de pistola génica. Los vectores o composiciones de vector, incluidas las composiciones de vacunas, proporcionados por la presente divulgación se puede usar junto con uno o más adyuvantes. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen: (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como polipéptidos de muramil o componentes de pared celular bacteriana), tal como MF59 ™ (que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de trioleato de sorbitán) y SAF (que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado con pluronic L121 y thr-MDP); (2) adyuvantes de saponina, tales como QS21, STlMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), Abisco® (Isconova, Sweden), o Iscomatrix® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia); (3 ) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (4) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG, es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, donde la citosina no está metilada (por ejemplo, Krieg, Vaccine (2000) 19:618-622; Krieg, Curr Opin Mol Ther (2001) 3:15-24; documento WO 98/40100, documento WO 98/55495, documento WO 98/37919 y documento WO 98/52581); y (5) sal metálica que incluye sales de aluminio (como alumbre, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio); (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, el documento WO 99/11241).
Los vectores o composiciones de vector proporcionados por la presente divulgación se puede usar junto con uno o más moduladores inmunitarios. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar cáncer de próstata en un mamífero, en particular, un ser humano, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero: (1 ) una cantidad eficaz de un vector, composición de vector o vacuna proporcionada por la presente invención; (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de células inmunosupresoras (inhibidor de ISC); y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de células inmunoefectoras (potenciador de IEC). Este procedimiento también se conoce, en la presente divulgación, como "régimen de inmunoterapia basada en vacunas" (o "VBIR"). Los potenciadores de IEC y los inhibidores de ISC pueden administrarse por cualquier procedimiento y vía adecuados, que incluyen (1) la administración sistémica, tal como la administración intravenosa, intramuscular u oral, y (2) la administración local, tal como la administración intradérmica y subcutánea. Cuando sea apropiado o adecuado, la administración local se prefiere generalmente a la administración sistémica. La administración local de cualquier potenciador de IEC e inhibidor de ISC se puede llevar a cabo en cualquier lugar del cuerpo del mamífero que sea adecuado para la administración local de productos farmacéuticos; sin embargo, es más preferente que estos moduladores inmunitarios se administren localmente cerca del ganglio linfático que drena la vacuna.
Se pueden administrar dos o más potenciadores de IEC específicos de una sola clase de potenciadores de IEC (por ejemplo, dos antagonistas de CTLa ) en combinación con los inhibidores de ISC. Además, se pueden administrar juntos dos o más potenciadores específicos de IEC de dos o más clases diferentes de potenciadores de IEC (por ejemplo, un antagonista de CTLA-4 y un agonista de TLR, o un antagonista de CTLA-4 y un antagonista de PD-1). De manera similar, se pueden administrar dos o más inhibidores de ISC específicos de una sola clase de inhibidores de ISC (por ejemplo, dos o más inhibidores de proteínas quinasas) en combinación con los potenciadores de IEC. Además, se pueden administrar juntos dos o más inhibidores de ISC específicos de dos o más clases diferentes de inhibidores de ISC (por ejemplo, un inhibidor de proteínas quinasas y un inhibidor de COX-2).
Los vectores o composiciones de vector pueden administrarse simultánea o secuencialmente con cualquiera o todos los moduladores inmunitarios (es decir, inhibidores de ISC y potenciadores de IEC) utilizados. De manera similar, cuando se usan dos o más moduladores inmunitarios, pueden administrarse simultánea o secuencialmente uno respecto al otro. En algunas realizaciones, un vector o composición de vector se administra simultáneamente (por ejemplo, en una mezcla) con respecto a un modulador inmunitario, pero secuencialmente con respecto a uno o más moduladores inmunitarios adicionales. La administración conjunta del vector o la composición de vector y los moduladores inmunitarios pueden incluir casos en los que se administran la vacuna y al menos un modulador inmunitario de manera que cada uno esté presente en el sitio de administración, tal como un ganglio linfático que drena la vacuna, al mismo tiempo, aunque el antígeno y los moduladores inmunitarios no se administren simultáneamente. La administración conjunta de la vacuna y los moduladores inmunitarios también puede incluir casos en los que la vacuna o el modulador inmunitario se elimina del sitio de administración, pero al menos un efecto celular de la vacuna o el modulador inmunitario eliminados persiste en el sitio de administración, tal como un ganglio linfático que drena la vacuna, al menos hasta que se administren uno o más moduladores inmunitarios adicionales en el sitio de administración. En los casos en que se administra una vacuna de ácido nucleico en combinación con un CpG, la vacuna y el CpG pueden estar contenidas en una única formulación y administrarse juntas por cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, la vacuna de ácido nucleico y CpG en una formulación conjunta (mezcla) se administran mediante inyección intramuscular en combinación con electroporación.
Se puede usar cualquier inhibidor de ISC en combinación con los vectores o composiciones de vector proporcionados por la presente invención. Ejemplos de clases de inhibidores de ISC incluyen antagonistas de PD-1/PD-L1, inhibidores de proteínas quinasas, inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2), inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) y reticulantes de ADN. Ejemplos de antagonistas de PD-1/PD-L1 incluyen anticuerpos monoclonales anti-PD-1 y PD-L1. Ejemplos de inhibidores de COX-2 incluyen celecoxib y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores de PDE5 incluyen avanafilo, lodenafilo, mirodenafilo, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, udenafilo y zaprinast. Un ejemplo de reticulantes de ADN es ciclofosfamida. Ejemplos de inhibidores de proteínas quinasas específicos se describen en detalle a continuación.
La expresión "inhibidor de proteínas quinasas" se refiere a cualquier sustancia que actúa como un inhibidor selectivo o no selectivo de una proteína quinasa. La expresión "proteínas quinasas" se refiere a las enzimas que catalizan la transferencia del fosfato terminal de trifosfato de adenosina a restos de tirosina, serina o treonina en sustratos de proteínas. Las proteínas quinasas incluyen receptores de tirosina quinasas y tirosina quinasas no receptoras. Ejemplos receptores de tirosina quinasas incluyen EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-II1R, IRR (receptor de insulina relacionado con el receptor), PDGFR (p.ej., PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (tirosina quinasa de leucocitos), ALK (quinasa de linfoma anaplásico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 y RTK 106. Ejemplos de tirosina quinasas no receptoras incluyen BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK. En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la presente descripción, los inhibidores de proteínas quinasas se administran al mamífero en una dosis subóptima. La expresión "dosis subóptima" se refiere a la cantidad de dosis que está por debajo de la dosis mínima eficaz cuando se administra el inhibidor de tirosina quinasa en una monoterapia (es decir, cuando el inhibidor de proteínas quinasas se administra solo sin ningún otro agente terapéutico) para el trastorno neoplásico diana. Ejemplos de inhibidores de proteínas quinasas específicos adecuados para su uso en el régimen de inmunoterapia basada en vacunas incluyen lapatinib, AZD 2171, ET18OCH 3, indirubín-3'-oxima, NSC-154020, PD 169316, quecertina, roscovitina, triciribina, ZD1839, 5-lodotubercidina, adafostina, aloisina, alsterpaulona, aminogenisteína, API-2, apigenina, arctigenina, ARRY-334543, axitinib, AY-22989, AZD 2171, Bisindolilmaleimida IX, CCI-779, queleritrina, DMPQ, DRB, edelfosina, ENMD-981693, análogo de erbstatina, erlotinib, fasudilo, gefitinib (ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, hidroxifasudilo, kenpaulona, KN-62, KY12420, LFM-A13, luteolina, LY294002, LY-294002, malotoxina, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, olomoucina, oxindola I, PD 153035, PD 98059, floridzina, piceatanol, picropodofilina, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK-222584, purvalanol A, rapamune, rapamicina, Ro 31-8220, rottlerina, SB202190, SB203580, sirolimus, SL327, SP600125, staurosporina, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, semaxanib, SU6656, SU6668, inhibidor de syk, TBB, TCN, tirfostina AG 1024, tirfostina AG 490, tirfostina AG 825, tirfostina AG 957, U0126, W-7, wortmannina, Y-27632, zactima, ZM 252868. gefitinib, malato de sunitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, semaxinib, vatalanib, sorafenib, imatinib, dasatinib, leflunomida, vandetanib y nilotinib.
En algunas realizaciones, el inhibidor de proteínas quinasas es un inhibidor multiquinasa, que es un inhibidor que actúa sobre más de una quinasa específica. Ejemplos de inhibidores multiquinasa incluyen imatinib, sorafenib, lapatinib, BIRB-796 y AZD-1152, AMG706, zactima, MP-412, sorafenib, dasatinib, lestaurtinib, XL647, XL999, lapatinib, MLN518, (también conocido como CT53518), PKC412, ST1571, AEE 788, OSI-930, OSI-817, malato de sunitinib, erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus y nilotinib. En algunas realizaciones particulares, el inhibidor de tirosina quinasa es sunitinib, sorafenib, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable (tal como un malato o un tosilato) de sunitinib o sorafenib.
El malato de sunitinib, que se comercializa por Pfizer Inc. con el nombre comercial SUTENT, se describe químicamente como ácido butanodióico, hidroxi-, (2S) -, compuesto con N- [2- (dietilamino) etil] -5 - [(Z) - (5-fluoro-1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilidina) metil] -2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida (1: 1). El compuesto, su síntesis y polimorfos particulares se describen en la patente de e E.UU. N° 6.573.293, en las publicaciones de Patente de Estados Unidos números 2003-0229229, 2003-0069298 y 2005-0059824, y en J. M. Manley, M. J. Kalman, B. G. Conway, C. C. Ball, J. L Havens and R. Vaidyanathan, "Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indolinones," J. Org. Chew. 68, 6447-6450 (2003). Las formulaciones de sunitinib y su sal de L-malato se describen en la publicación PCT No. WO 2004/024127. Se ha aprobado el malato de sunitinib en los EE. UU. Para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal, carcinoma de células renales avanzado y tumores neuroendocrinos pancreáticos progresivos y bien diferenciados en pacientes con enfermedad localmente avanzada no resecable o metastásica. La dosis recomendada de malato de sunitinib para el tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y el carcinoma avanzado de células renales (RCC) para seres humanos es de 50 mg tomados por vía oral una vez al día, en un programa de 4 semanas de tratamiento seguido de 2 semanas de descanso (Programa 4/2). La dosis recomendada de malato de sunitinib para los tumores neuroendocrinos pancreáticos (pNET) es de 37,5 mg tomados por vía oral una vez al día.
En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas, se puede administrar malato de sunitinib por vía oral en una sola dosis o en dosis múltiples. Normalmente, se suministra malato de sunitinib en dos, tres, cuatro o más dosis semanales consecutivas seguidas de un período de "descanso" de aproximadamente 1 o 2 semanas, o más, cuando no se suministra malato de sunitinib. En una realización, las dosis se suministran durante aproximadamente 4 semanas, con 2 semanas de descanso. En otra realización, se suministra malato de sunitinib durante dos semanas, con 1 semana de descanso. Sin embargo, también se puede suministrar sin un "período de "descanso" durante todo el período de tratamiento. La cantidad eficaz de malato de sunitinib administrado por vía oral a un ser humano en el régimen de inmunoterapia basada en vacunas suele ser inferior a 40 mg por persona por dosis. Por ejemplo, se puede administrar por vía oral a 37,5, 31,25, 25, 18,75, 12,5, 6,25 mg por persona por día. En algunas realizaciones, se administra malato de sunitinib por vía oral en el intervalo de 1 a 25 mg por persona por dosis. En algunas otras realizaciones, se administra malato de sunitinib por vía oral en el intervalo de 6,25, 12,5 o 18,75 mg por persona por dosis. Otros regímenes de dosificación y variaciones son previsibles, y se determinarán a través de la orientación del médico.
El tosilato de sorafenib, que se comercializa con el nombre comercial NEXAVAR, también es un inhibidor multiquinasa. Su nombre químico es 4- (4- {3- [4-cloro-3- (trifluorometil) fenil] ureido} fenoxi) -N-metilpiridinina-2-carboxamida. Está aprobado en los EE. UU. para el tratamiento del cáncer de riñón primario (carcinoma de células renales avanzado) y del cáncer de hígado primario avanzado (carcinoma hepatocelular). La dosis diaria recomendada es de 400 mg tomados por vía oral dos veces al día. En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la presente descripción, la cantidad eficaz de tosilato de sorafenib administrada por vía oral suele ser inferior a 400 mg por persona por día. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de tosilato de sorafenib administrada por vía oral está en el intervalo de 10 a 300 mg por persona por día. En algunas otras realizaciones, la cantidad eficaz de tosilato de sorafenib administrada por vía oral está entre 10 - 200 mg por persona por día, tal como 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, o 200 mg por persona por día.
Axitinib, que se comercializa con el nombre comercial INLYTA, es un inhibidor selectivo de los receptores de VEGF 1, 2 y 3. Su nombre químico es (N-metil-2-[3-((E) -2-piridín-2-il-vinil) -1H-indazol-6-ilsulfanil]-benzamida. Está aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales avanzado después del fracaso de una terapia sistémica previa. La dosis inicial es de 5 mg tomados por vía oral dos veces al día. Los ajustes de dosis se pueden realizar en función de la seguridad y la tolerabilidad individuales. En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la presente descripción, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral suele ser inferior a 5 mg dos veces la día. En algunas otras realizaciones, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral está entre 1 -5 mg dos veces la día. En algunas otras realizaciones, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral está entre 1, 2, 3, 4 o 5 mg dos veces al día.
En los regímenes de inmunoterapia basados en vacuna, se puede utilizar cualquier potenciador de IEC. Pueden ser moléculas pequeñas o moléculas grandes (tales como proteínas, polipéptido, ADN, ARN y anticuerpo). Ejemplos de potenciadores de IEC que se pueden usar incluyen agonistas de TNFR, antagonistas de CTLA-4, agonistas de TLR, antagonistas de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) (como el anticuerpo CT-011 anti-PD-1) y antagonistas del ligando 1 de proteína de muerte celular programada 1 (PD-L1) (como BMS-936559), antagonistas del gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) y antagonistas de la molécula que contiene el dominio de inmunoglobulina y mucina -3 (TIM-3). Ejemplos de agonistas de TNFR específicos, antagonistas de CTLA-4 y agonistas de TLR se proporcionan en detalle en el presente documento, a continuación.
Agonistas de TNFR.
Ejemplos de agonistas de TNFR incluyen agonistas de OX40, 4-1BB (como BMS-663513), GITR (como TRX518) y CD40. Ejemplos de agonistas de CD40 específicos se describen en detalle en el presente documento, a continuación.
Los agonistas de CD40 son sustancias que se unen a un receptor CD40 en una célula y son capaces de aumentar una o más actividades asociadas a CD40 o CD40L. Por lo tanto, los "agonistas" de CD40 abarcan los "ligandos" de CD40.
Ejemplos de agonistas de CD40 incluyen anticuerpos agonísticos de CD40, fragmentos de anticuerpos agonísticos de CD40, ligandos de CD40 (CD40L) y fragmentos y derivados de CD40L tales como oligoméricos (por ejemplo, CD40L bivalentes, triméricos), que contienen proteínas de fusión y variantes de los mismos.
Los ligandos de CD40 para su uso en la presente invención incluyen cualquier péptido, polipéptido o proteína, o un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína que puede unirse y activar uno o más receptores CD40 en una célula. Se describen ligandos de CD40 adecuados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6.482.411; patente de Estados Unidos No.6.410.711; patente de Estados Unidos n.° 6.391.637; y patente de Estados Unidos n.° 5.981.724. Aunque se preferirán ligandos de CD40 humanos para su uso en terapia humana, pueden usarse en la invención ligandos de CD40 de cualquier especie. Para su uso en otras especies animales, tales como en realizaciones veterinarias, se preferirá una especie de ligando de CD40 adaptada al animal que se está tratando. En determinadas realizaciones, el ligando de CD40 es un péptido u oligómero de proteína gp39, que incluye péptidos, polipéptidos o proteínas gp39 de forma natural, así como péptidos, polipéptidos, proteínas gp39 (y ácidos nucleicos codificantes) que comprenden una secuencia de oligomerización. Aunque se prefieren oligómeros tales como dímeros, trímeros y tetrámeros en ciertos aspectos de la invención, en otros aspectos de la invención se contemplan, para su uso, estructuras oligoméricas más grandes, siempre que la estructura oligomérica retenga la capacidad de unirse y activar uno o más receptor(es) CD40.
En algunas otras realizaciones, el agonista de CD40 es un anticuerpo anti-CD40, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD40 quimérico humano, humanizado o parcialmente humano. Ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-CD40 específicos incluyen el anticuerpo monoclonal G28-5, mAb89, EA-5 o S2C6, y CP870893. En una realización particular, el anticuerpo agonista anti-CD40 es CP870893 o dacetuzumab (SGN-40).
CP-870,893 es un anticuerpo monoclonal CD40 agonístico completamente humano (mAb) que se ha investigado clínicamente como una terapia antitumoral. La estructura y preparación de CP870,893 se desvelan en el documento WO2003041070 (en el que el anticuerpo se identifica por el interno identificado "21.4.1"). Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera de CP-870,893 se exponen en la SEQ ID NO:40 y en la SEQ ID NO:41, respectivamente. En ensayos clínicos, se administró CP870,893 por infusión intravenosa en dosis generalmente en los intervalos de 0,05 a 0,25 mg/kg por infusión. En un estudio clínico de fase I, la dosis máxima tolerada (DMT) de CP-870893 se estimó en 0,2 mg/kg y las toxicidades limitantes de la dosis incluyeron CRS de grado 3 y urticaria de grado 3. [Jens Ruter y col.: Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors. Cancer Biology & Therapy 10:10, 983-993; 15 de Noviembre de 2010.]. En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la presente descripción, CP-870,893 puede administrarse por vía intradérmica, subcutánea o tópica. Se prefiere que se administre por vía intradérmica. La cantidad eficaz de CP870893 a administrar en el régimen generalmente es inferior a 0.2 mg/kg, típicamente en el intervalo de 0,01 mg - 0,15 mg/kg, o 0,05 - 0,1 mg/kg.
Dacetuzumab (también conocido como SGN-40 o huS2C6; número de CAS 88-486-59-9) es otro anticuerpo anti-CD40 agonista que se ha investigado en ensayos clínicos para linfomas indolentes, linfomas difusos de linfocitos B grandes y Mieloma Múltiple. En los ensayos clínicos, dacetuzumab se administró por vía intravenosa en dosis semanales que oscilaron entre 2 mg/kg y 16 mg/kg. En el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la presente descripción, se puede administrar dacetuzumab por vía intradérmica, subcutánea o tópica. Se prefiere que se administre por vía intradérmica. La cantidad eficaz de dacetuzumab a administrar en el régimen de inmunoterapia basada en vacunas generalmente es inferior a 16 mg/kg, típicamente en el intervalo de 0,2 mg -14 mg/kg, o 0,5 - 8 mg/kg o 1 - 5 mg/kg.
Inhibidores de CTLA-4.
Agentes antagonistas anti-CTLA-4 adecuados para su uso en el régimen de inmunoterapia basada en vacunas proporcionado por la divulgación incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-CTLA-4 (tal como anticuerpos anti-CTLA-4 humanos, anticuerpos anti-CTLA-4 de ratón, anticuerpos anti-CTLA-4 de mamífero, anticuerpos anti-CTLA-4 humanizados, anticuerpos anti-CTLA-4 monoclonales, anticuerpos anti-CTLA-4 policlonales, anticuerpos anti-CTLA-4 quiméricos, anticuerpos de dominio anti-CTLA-4), fragmentos de anticuerpos anti-CTLA-4 (tales como (fragmentos de cadena simple anti-CTLA-4, fragmentos de cadena pesada anti-CTLA-4 y fragmentos de cadena ligera anti-CTLA-4) e inhibidores de CTLA-4 que agonizan la vía coestimulante. En algunas realizaciones, el inhibidor de CTLA-4 es Ipilimumab o Tremelimumab.
Ipilimumab (también conocido como MEX-010 o MDX-101), comercializado como YERVOY, es un anticuerpo CTLA-4 anti-humano humano. Ipilimumab también puede denominarse por su Registro CAS No. 477202-00-9, y se desvela como el anticuerpo 10DI en la publicación PCT N.° WO01/14424. En la publicación PCT No. WO2007/67959 se proporcionan ejemplos de composiciones farmacéuticas que comprenden Ipilimumab. Ipilimumab está aprobado en los EE. UU. para el tratamiento del melanoma no resecable o metastásico. La dosis recomendada de Ipilimumab como monoterapia es de 3 mg/kg por administración intravenosa cada 3 semanas para un total de 4 dosis. En los procedimientos proporcionados por la presente invención, Ipilimumab se administra localmente, particularmente por vía intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Ipilimumab administrada localmente está generalmente en el intervalo de 5 a 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de Ipilimumab administrada está en el intervalo de 10 - 150 mg/dosis por persona por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de Ipilimumab es aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
Tremelimumab (también conocido como CP-675,206) es un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano y tiene el número CAS 745013-59-6. Tremelimumab se desvela como el anticuerpo 11.2.1 en la patente de EE. UU. N.^ 6.682.736. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera de Tremelimumab se exponen en las SEQ IND NO:42 y 43, respectivamente. Tremelimumab se ha investigado en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes tumores, incluyendo melanoma y cáncer de mama; en los que se administró Tremelimumab por vía intravenosa como dosis única o como dosis múltiples cada 4 o 12 semanas en el intervalo de dosis de 0,01 y 15 mg/kg. En los regímenes proporcionados por la presente invención, Tremelimumab se administra localmente, particularmente por vía intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Tremelimumab administrada por vía intradérmica o subcutánea está generalmente en el intervalo de 5 - 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de Tremelimumab está en el intervalo de 10 -150 mg/dosis por persona por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de Tremelimumab es aproximadamente 10, 25, 37.5, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
Agonistas de Receptores tipo Toll (TLR).
La expresión "agonista del receptor tipo toll" o "agonista de TLR" se refiere a un compuesto que actúa como un agonista de un receptor tipo toll (TLR). Esto incluye agonistas de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 y TLR11 o una combinación de los mismos. A menos que se indique lo contrario, la referencia a un compuesto agonista de TLR puede incluir el compuesto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier isómero (por ejemplo, diastereómero o enantiómero), sal, solvato, polimorfo y similares. En particular, si un compuesto es ópticamente activo, la referencia al compuesto puede incluir cada uno de los enantiómeros del compuesto así como mezclas racémicas de los enantiómeros. Asimismo, un compuesto puede identificarse como un agonista de uno o más TLR particulares (por ejemplo, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 o un agonista de TLR7/8).
En algunas realizaciones, los agonistas de TLR son agonistas de TLR9, particularmente oligonucleótidos CpG (o CpG.ODN). Un oligonucleótido CpG es una molécula de ácido nucleico corta que contiene una citosina seguida de una guanina unida por un enlace fosfato en el que el anillo de pirimidina de la citosina no está metilado. Un motivo CpG es un patrón de bases que incluye un CpG central no metilado rodeado por al menos una base que flanquea (en los lados 3 'y 5' de) el CpG central. Los oligonucleótidos CpG incluyen oligonucleótidos tanto D como K. El oligonucleótido CpG completo puede estar no metilado o las porciones pueden estar no metiladas. Ejemplos de oligonucleótidos CpG útiles en los procedimientos proporcionados por la presente divulgación incluyen los desvelados en las patentes de EE. UU. Números 6194388, 6207646, 6214806, 628371,6239116 y 6339068.
Ejemplos de oligonucleótidos CpG particulares útiles en los procedimientos proporcionados por la presente divulgación incluyen:
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG 7909);
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG 24555); y
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG 10103).
CpG7909, un oligonucleótido monocatenario sintético de 24 meros, se ha investigado extensivamente para el tratamiento del cáncer como una monoterapia y en combinación con agentes quimioterapéuticos, así como un adyuvante para vacunas contra el cáncer y enfermedades infecciosas. Se informó que una dosis intravenosa única de CpG 7909 era bien tolerada sin efectos clínicos y sin toxicidad significativa hasta 1,05 mg/kg, mientras que una dosis subcutánea única de CpG 7909 tuvo una dosis máxima tolerada (DMT) de 0,45 mg/kg con toxicidad limitante de la dosis de la mialgia y efectos constitucionales. [Véase Zent, Clive S, y col: Phase I clinical trial of CpG 7909 (PF-03512676) in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 53(2):211-217(7)(2012)]. En los regímenes proporcionados por la presente divulgación, CpG7909 puede administrarse por inyección en el músculo o por cualquier otro procedimiento adecuado. Se prefiere que se administre localmente cerca del ganglio linfático que drena la vacuna, particularmente por administración intradérmica o subcutánea. Para su uso con una vacuna de ácido nucleico, como una vacuna de ADN, un CpG se puede formular conjuntamente preferentemente con la vacuna en una única formulación y administrarse por inyección intramuscular junto con electroporación. La cantidad eficaz de CpG7909 por administración intramuscular, intradérmica o subcutánea está típicamente en el intervalo de 10 pg/dosis - 10 mg/dosis. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de CpG7909 está en el intervalo de 0,05 mg -14 mg/dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de CpG7909 es aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 051 mg/dosis. Otros oligonucleótidos CpG, incluyendo CpG 24555 y CpG 10103, pueden administrarse de manera y niveles de dosis similares.
En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un procedimiento para potenciar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un ser humano, que comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de tosilato de sorafenib, malato de sunitinib, axitinib, erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus, o nilotiniben y en el que el al menos un potenciador de IEC se selecciona de un inhibidor de CTLA-4, un agonista de TLR, o un agonista de CD40. En algunas realizaciones preferidas, el régimen comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de axitinib, tosilato de sorafenib, o malato de sunitinib, y en el que el al menos un potenciador de IEC es un inhibidor de CTLA-4 seleccionado de Ipilimumab o Tremelimumab. En algunas realizaciones preferidas adicionales, el régimen comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos dos potenciadores de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de sunitinib o axitinib y en el que los al menos dos potenciadores de IEC son Tremelimumab y un agonista de TLR seleccionado de CpG7909, CpG2455 o CpG10103.
En algunas otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano, que comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA humano, (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC, y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de tosilato de sorafenib, malato de sunitinib, axitinib, erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus, o nilotiniben y en el que el al menos un potenciador de IEC se selecciona de un inhibidor de CTLA-4, un agonista de TLR, o un agonista de CD40. En algunas realizaciones preferidas, el procedimiento comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA humano, (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de iSc , y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de tosilato de sorafenib, malato de sunitinib o axitinib, y en el que el al menos un potenciador de IEC es un inhibidor de CTLA-4 seleccionado de Ipilimumab o Tremelimumab.
En algunas realizaciones específicas adicionales, el procedimiento comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos dos potenciadores de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado de sunitinib o axitinib y en el que los al menos dos potenciadores de IEC son Tremelimumab y un agonista de TLR seleccionado de CpG7909, CpG2455 o CpG10103.
Agentes terapéuticos adicionales.
El régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación puede comprender además un agente terapéutico adicional. Se puede usar una amplia variedad de agentes terapéuticos contra el cáncer, incluidos agentes quimioterapéuticos y agentes terapéuticos hormonales. La expresión "agente quimioterapéutico" se refiere a una sustancia química o biológica que puede causar la muerte de las células cancerosas o interferir con el crecimiento, la división, la reparación y/o la función de las células cancerosas. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos particulares incluyen: acetato de abiraterona, cabazitaxel, degarelix, denosumab, docetaxel, enzalutamida, acetato de leuprolida, prednisona, sipuleucel-T y dicloruro de radio 223. La expresión "agente terapéutico hormonal" se refiere a una sustancia química o biológica que inhibe o elimina la producción de una hormona, o inhibe o contrarresta el efecto de una hormona sobre el crecimiento y/o la supervivencia de las células cancerosas. Ejemplos de agentes terapéuticos hormonales particulares incluyen leuprolida, goserelina, triptorelina, histrelina, bicalutamida, flutamida y nilutamida. El VBIR proporcionado por la presente divulgación también se puede usar en combinación con otras terapias, que incluyen (1) procedimientos quirúrgicos que eliminan la totalidad o parte de los órganos o glándulas que participan en la producción de la hormona, como los ovarios, los testículos, la glándula suprarrenal, y la glándula pituitaria, y (2) tratamiento de radiación, en el que los órganos o glándulas del paciente se someten a radiación en una cantidad suficiente para inhibir o eliminar la producción de la hormona diana.
E. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas realizaciones de la invención. No deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ninguna manera. A partir del análisis anterior y de estos ejemplos, un experto en la materia puede determinar las características esenciales de la invención.
Ejemplo 1. Antígenos en formatos citosólicos, secretados y unidos a la membrana derivados de la proteína
PSMA humana
IA. Diseño de polipéptidos PSMA inmunogénicos
Las construcciones de ADN que codifican polipéptidos PSMA inmunogénicos en formatos citosólicos, secretados y modificados se construyeron basándose en la secuencia de la proteína PSMA humana nativa y se probó su capacidad para inducir respuestas inmunitarias efectoras antitumorales. La estructura y preparación de cada uno de los formatos de antígeno PSMA humano se proporcionan a continuación.
1A1. Antígeno PSMA humano citosólico. Se diseñó un polipéptido PSMA inmunogénico en forma citosólica para retener el polipéptido inmunogénico dentro de la célula una vez expresado. Se eliminaron el dominio citoplasmático (aminoácidos 1-19) y el dominio transmembrana (aminoácidos 20-43) de PSMA humano, dando como resultado un polipéptido PSMA citosólico que consiste en los aminoácidos 44-750 (dominio extracelular o ECD) del PSMA humano de la SEQ ID NO:1. Se puede agregar la secuencia de Kozak óptima "MAS" al extremo N del polipéptido para potenciar la expresión o para facilitar la clonación.
1A2. Antígeno PSMA humano secretado. Se diseñó un polipéptido PSMA inmunogénico en forma secretada para secretar el polipéptido fuera de la célula una vez expresado. El polipéptido secretado se produce con los aminoácidos 44-750 (ECD) del PSMA humano de la SEQ ID NO:1 y el elemento secretor de Ig Kappa que tiene la secuencia de aminoácidos ETDTLLLWVLLLLWVPGSTGD y un enlazador de dos aminoácidos (AA) en el extremo N para maximizar la secreción del antígeno PSMA una vez expresado.
1A3. Antígeno PSMA humano unido a la membrana. Se diseñó un polipéptido PSMA inmunogénico unido a la membrana para estabilizar el polipéptido en la superficie celular. Los primeros 14 aminoácidos de la proteína PSMA humana se eliminaron y el polipéptido inmunógeno resultante consiste en los aminoácidos 15 - 750 de la proteína
PSMA humana de la SEQ ID NO:1. El polipéptido inmunogénico que consiste en los aminoácidos 15 - 750 de la proteína PSMA humana nativa de la SEQ ID NO:1 y comparte una identidad de secuencia del 100% con la proteína
PSMA humana nativa también se conoce, en la presente divulgación, como antígeno "PSMA humano modificado", "hPSMA modificado", o "hPSMAmod". También se generaron los siguientes tres polipéptidos PSMA inmunogénicos (denominados "antígenos PSMA modificados redistribuidos") que son variantes del antígeno PSMA humano modificado (SEQ ID NO:9):
(1) antígeno PSMA modificado redistribuido 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3;
(2) antígeno PSMA modificado redistribuido 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (3) antígeno PSMA modificado redistribuido 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7. Las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos PSMA modificados redistribuidos 1, 2 y 3 se exponen en
las SEQ ID NO: 4, 6, y 8, respectivamente.
IB. Preparación de plásmidos de ADN para Expresar los antígenos PSMA
Las construcciones de ADN que codifican los antígenos PSMA citosólico, PSMA secretados y PSMA modificados se clonaron individualmente en el vector PJV7563 que era adecuado para pruebas in vivo en animales (Figura 1). Se secuenciaron ambas cadenas del ADN en los vectores PJV7563 para confirmar la integridad del diseño.
Se produjo una preparación de ADN plásmido a gran escala (Qiagen/CsCI) a partir de un clon de secuencia confirmada. La calidad del ADN plásmido se confirmó mediante una proporción alta de 260/280, una proporción alta de ADN serpentín/ mellado, niveles bajos de endotoxinas (<10 U/mg de ADN) y carga biológica negativa.
IC. Expresión de construcciones de PSMA en células de mamíferos
Se determinó la expresión de los antígenos PSMA citosólicos, secretados y modificados mediante FACS. Las células
293 de mamífero se transfectaron con los vectores PMED PJV7563 que codifican los diferentes polipéptidos PSMA inmunogénicos. Tres días después, se tiñeron las células 293 con anticuerpo anti-PSMA de ratón, seguido de un anticuerpo secundario anti-ratón de rata conjugado fluorescente (FITC). Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Los datos se informaron como intensidad de fluorescencia media (MFI) sobre los controles negativos, confirmaron que el antígeno PSMA humano modificado se expresa en la superficie celular.
Tabla 2. Expresión del antígeno PSMA Humano Modificado en la superficie celular
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Ejemplo 2. Diseño de diferentes polipéptidos PSA inmunogénicos
3A. Construcción de polipéptidos PSA inmunogénicos
De manera similar a lo que se describió en el Ejemplo 1 para las tres formas de polipéptidos PSMA inmunogénicos diferentes (por ejemplo, las formas citosólica, unida a membrana y secretada), los polipéptidos PSA inmunogénicos en las tres formas también se diseñaron basándose en la secuencia de PSA humano. Un polipéptido PSA inmunogénico en forma citosólica, que consiste en los aminoácidos 25-261 del PSA humano nativo, se construye eliminando la señal secretora y el dominio pro (aminoácidos 1-24). La secuencia de aminoácidos de este polipéptido PSA inmunogénico se proporciona en la SEQ ID NO:17. La forma secretada del polipéptido PSA es el PSA humano de longitud completa nativo (aminoácidos 1-261). Se construye un polipéptido PSA inmunogénico en forma unida a membrana enlazando la forma citosólica del polipéptido PSA inmunogénico (aminoácidos 25-261 del PSA humano nativo) al dominio transmembrana de PSMA humano (aminoácidos 15-54 de PSMA humano).
3B. Respuestas inmunitarias en ratones Pasteur y HLA A24
Diseño del estudio. Se inmunizaron ratones Pasteur HLA A2 o ratones HLA A24 de ocho a 10 semanas de edad con ADN que expresaba los diferentes antígenos PSA usando PMED proporcionado en el Ejemplo 3A en un régimen de cebado/refuerzo/refuerzo con intervalos de dos semanas entre cada vacunación como se describe en el Ejemplo 1. Las respuestas de los linfocitos T y B específicas de antígeno se midieron 7 días después de la última inmunización en un ensayo ELISPOT de interferón gamma (IFNy) y ELISA tipo sándwich.
Los datos de ELISpot mostrados en la Tabla 3 indican que los polipéptidos PSA inmunogénicos en formas tanto citosólicas como unidas a la membrana son capaces de inducir linfocitos T que reconocen células tumorales humanas transducidas con adenovirus para expresar el antígeno PSA citosólico (SKmeI5-Ad-PSA) pero no células transducidas con adenovirus para expresar eGFP (SKmeI5-Ad-eGFP). Estos dos antígenos también provocaron respuesta a la proteína PSA. El antígeno PSA secretado no pudo inducir a los linfocitos T a la proteína tanto SKmeI5-Ad-PSA como PSA. SFC> 50 se considera positivo.
Tabla 3. La inducción de respuestas de linfocitos T por los antígenos PSA en ratones Pasteur a células de cáncer humano PSA+HLA A2.1+SKmeI5
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Tabla 4. La inducción de la respuesta de anticuerpos anti-PSA medida por un ensayo ELISA sándwich
Figure imgf000022_0003
Los datos en la Tabla 4 demuestran que los polipéptidos PSA inmunogénicos en formas tanto secretadas como unidas a la membrana son capaces de inducir respuestas de anticuerpos anti-PSA.
Ejemplo 3. Construcción de construcciones de vacunas multiantígeno
En este Ejemplo, se describen construcciones de plásmidos que comprenden una construcción multiantígeno usando diferentes estrategias. Estos plásmidos comparten la misma estructura general de plásmido como pPJV7563. A menos que se especifique otra cosa, los genes incluidos en las construcciones multiantígeno codifican (1) un polipéptido PSMA inmunogénico de la SEQ ID NO:9, (2) un polipéptido PSCA inmunogénico que comprende los aminoácidos 2-125 de la SEQ ID NO:21, y (3) un polipéptido PsA inmunogénico de la SEQ ID N°: 17.
Ejemplo 3A. Plásmidos que comprenden una construcción de antígeno dual
3A1. Construcción de Plásmido utilizando múltiples promotores
Plásmido 460 (promotor dual de PSMA/PSCA). El plásmido 460 se construyó utilizando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR e inserción de fragmentos de restricción. En primer lugar, se introdujo un sitio de restricción Kpn I cadena arriba del promotor de CMV en el plásmido 5259 utilizando mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores MD5 y MD6 de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit Quickchange, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). En segundo lugar, se amplificó por PCR un casete de expresión que consiste en un promotor de CMV mínimo, PSMA humano y terminador de la transcripción de globulina B de conejo a partir del plásmido 5166 usando cebadores que portaban sitios de restricción KpnI (MD7 y MD8). El amplicón de PCR se digirió con Kpn I y se insertó en el sitio Kpn I recién introducido del plásmido 5259 tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP).
3A2. Construcción de construcciones de antígenos duales utilizando péptidos 2A
Plásmido 451 (PSMA-T2A-PSCA). El plásmido 451 se construyó utilizando las técnicas de PCR solapante y el intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 del PSMA humano utilizando el plásmido 5166 como plantilla con los cebadores 119 y 117. Se amplificó por PCR el gen que codifica el PSCA humano de longitud completa utilizando el plásmido 5259 como plantilla con los cebadores 118 y 120. La PCR dio como resultado la adición de secuencias TAV 2A (T2A) solapantes en el extremo 3' de PSMA y en el extremo 5' de PSCA. Los amplicones se mezclaron y se amplificaron por pCr con los cebadores 119 y 120. El amplicón PSMA-T2A-PSCA se digirió con Nhe I y Bgl II y se insertó en el plásmido 5166 digerido de manera similar. Se incluyó un enlazador de glicina-serina entre PSMA y el casete T2A para promover una alta eficacia de escisión.
Plásmido 454 (PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 454 se creó utilizando las técnicas de PCR y el intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica el PSCA humano de longitud completa utilizando el plásmido 5259 como plantilla con los cebadores 42 y 132. El amplicón se digirió con BamH I y se insertó en el plásmido 5300 tratado con CIP digerido de manera similar. Se incluyó un enlazador de glicina-serina entre PSCA y el casete FMDV 2A (F2A) para promover una alta eficacia de escisión.
Plásmido 5300 (PSA-F2A-PSMA) El plásmido 5300 se construyó utilizando las técnicas de PCR solapante y el intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 del PSA a partir del plásmido 5297 con los cebadores MD1 y MD2. Se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 del PSMA humano a partir del plásmido 5166 con los cebadores MD3 y MD4. La PCR dio como resultado la adición de secuencias F2A solapantes en el extremo 3' de PSA y en el extremo 5' de PSMA. Los amplicones se mezclaron y extendieron por PCR. El amplicón PSA-F2A-PSMA se digirió con Nhe I y Bgl II y se insertó en el plásmido pPJV7563 digerido de manera similar.
3A3. Construcciones de antígenos duales que utilizan sitios internos de entrada al ribosoma
Plásmido 449 (PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 449 se construyó utilizando las técnicas de PCR solapante y el intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica el PSCA humano de longitud completa a partir del plásmido 5259 con los cebadores 124 y 123. Se amplificó por PCR el IRES de EMCV mínimo a partir de pShuttle-IRES con los cebadores 101 y 125. Los amplicones solapantes se mezclaron y se amplificaron por PCR con los cebadores 101 y 123. El amplicón IRES-PSCA se digirió con Bgl II y BamH I y se insertó en el plásmido 5166 tratado con CIP digerido con Bgl II. Para fijar una mutación espontánea dentro del IRES, el IRES que contiene la secuencia Avr II a Kpn I se reemplazó con un fragmento equivalente a partir de pShuttle-IRES.
Plásmido 603 (PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 603 se construyó utilizando las técnicas de PCR y clonación sin interrupción. Se amplificó el gen que codifica el PSCA humano de longitud completa unido en su extremo 3 'a un IRES de EMCV preferido a partir del plásmido 455 mediante PCR con los cebadores SD546 y SD547. Se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 del PSMA humano a partir del plásmido 5166 utilizando los cebadores SD548 y SD550. Los dos amplicones de PCR solapantes se insertaron en pPJV7563 digerido con Nhe I y Bgl II mediante clonación sin interrupciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Plásmido 455 (PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 455 se construyó utilizando las técnicas de PCR solapante y el intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 del PSA humano a partir del plásmido 5297 con los cebadores 115 y 114. Se amplificó por PCR el IRES de EMCV mínimo a partir de pShuttle-IRES con los cebadores 101 y 116. Los amplicones solapantes se mezclaron y se amplificaron por PCR con los cebadores 101 y 114. El amplicón IRES-PSA se digirió con Bgl II y BamH I y se insertó en el plásmido 5259 tratado con CIP digerido con Bgl II. Para fijar una mutación espontánea dentro de este clon, la secuencia de Bgl II a BstE II se reemplazó con un fragmento equivalente de una nueva reacción de PCR solapante.
Ejemplo 3b. Plásmidos que comprenden una construcción de triple antígeno
Estrategia General. Se seleccionaron varios plásmidos de antígeno dual, que incluyen PSA-F2A-PSMA, PSMA-mlRES-PSCA, PSMA-T2A-PSCA, PSA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA, PSCA-pIRES-PSMA, and PSMA-mIRES-PSA, para su incorporación en diversas combinaciones en plásmidos vectores de triple antígeno. En todos los casos, los plásmidos vectores se basaron en la estructura del plásmido pPJV7563 precursor. Cuatro plásmidos vectores (plásmidos 456, 457, 458 y 459) utilizaron un único promotor de CMV completo con un terminador de la transcripción de globulina B de conejo para dirigir la expresión de los tres antígenos. Otros dos plásmidos vectores (plásmidos 846 y 850) incorporaron una estrategia de promotor dual en combinación con un IRES o 2A para dirigir la expresión de los tres antígenos. Los plásmidos con casetes 2A múltiples se diseñaron para portar casetes diferentes para minimizar la probabilidad de recombinación entre el primer y segundo casete durante la amplificación de plásmido/vector. La expresión del antígeno se demostró mediante citometría de flujo (Figuras 7A y 7B) y transferencia Western (Figuras 8A y 8B).
Plásmido 456 (PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 456 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 5300 se digirió con Nhe I y Hpa I y el inserto de ~ 1,8 kb se ligó en el plásmido 449 digerido de manera similar.
Plásmido 457 (PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA). El plásmido 457 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 5300 se digirió con Nhe I y Hpa I y el inserto de ~ 1,8 kb se ligó en el plásmido 451 digerido de manera similar.
Plásmido 458 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 458 se construyó utilizando las técnicas de PCR y el intercambio de fragmentos de restricción. Se amplificó por PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 del PSA humano a partir del plásmido 5297 con los cebadores 119 y 139, dando como resultado la adición de una secuencia T2A y un sitio de restricción Nhe I en el extremo 3 '. El amplicón se digirió con Nhe I y se insertó en el plásmido 454 digerido de manera similar.
Plásmido 459 (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 459 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 454 se digirió con Nhe I y BgI II y el inserto que contenía PSCA-F2A-PSMA se ligó con el plásmido 455 digerido de manera similar.
Plásmido 846 (PSMA-mIRES-PSCA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA). El plásmido 846 se construyó utilizando las técnicas de PCR y clonación sin interrupción. En primer lugar, se sintetizó un casete de expresión que consistía en 1) el promotor y la región 5 'no traducida del gen de la beta actina de pollo (CBA), 2) un intrón híbrido de beta actina de pollo/beta globina de conejo, 3) el gen que codifica los aminoácidos 25 -261 del PSA humano, y 4) el terminador de la hormona de crecimiento bovino. Se amplificó este casete de expresión de PSA por PCR a partir del plásmido 796 con los cebadores 3SallCBA y 5SallBGH. El amplicón se clonó en el sitio Sall del plásmido 603 utilizando un kit de Clonación sin interrupciones y Ensamblaje de GeneArt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tras el suministro de este plásmido en una célula, la expresión de PSA se eliminará del promotor de CBA, mientras que la expresión de PSCA y PSMA se eliminará del promotor de CMV.
Plásmido 850 (PSMA-mIRES-PSCA, CMV-PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 850 se construyó utilizando las técnicas de PCR y clonación sin interrupción. En primer lugar, se amplificó el casete de expresión de PSA dirigido por el promotor de CBA por PCR a partir del plásmido 796 con los cebadores 3SallCBA y 5SallBGH. El amplicón se clonó en el sitio Sall del plásmido 454 utilizando un kit de Clonación sin interrupciones de GeneArt. Tras el suministro de este plásmido en una célula, la expresión de PSA se eliminará del promotor de CBA, mientras que la expresión de PSCA y PSMA se eliminará del promotor de CMV.
Plásmido 916 ((PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 916 se construyó utilizando las técnicas de PCR y clonación de Gibson. Los genes que codifican los tres polipéptidos PAA se amplificaron por PCR y se ligaron en los sitios Nhe I/Bgl II de pPJV7563 mediante técnicas de clonación de Gibson. La secuencia de nucleótidos completa del Plásmido 916 se establece en la SEQ ID NO:62. El plásmido 458 y el plásmido 916 codifican la misma secuencia de aminoácidos que comprende los tres polipéptidos PAA inmunogénicos, cuya secuencia de aminoácidos se establece en la SEQ ID NO:60. La secuencia de nucleótidos en el Plásmido 916 que codifica la secuencia de aminoácidos que comprende los tres polipéptidos PAA está optimizada por codones y también se establece en la SEQ ID NO:61.
Tabla 21. Lista de Cebadores Utilizados en la Construcción de los Plásmidos Multiantígeno
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Ejemplo 3C. Vectores de adenovirus de triple antígeno
Estrategia General. Al igual que con los plásmidos de ADN, los vectores virales pueden diseñarse para suministrar múltiples antígenos de cáncer de próstata. Las tres estrategias de expresión multiantígeno descritas anteriormente para construcciones multiantígeno - promotores duales, péptidos 2A y sitios internos de entrada al ribosoma - se incorporaron en varias combinaciones para crear vectores de adenovirus de triple antígeno. En resumen, se clonaron los casetes de expresión multiantígeno en un plásmido pShuttle-CMV modificado para portar dos copias de la secuencia del operador de tetraciclina (TetO2). Los vectores del serotipo 5 de adenovirus recombinante se crearon utilizando el sistema de vectores AdEasy de acuerdo con los protocolos del fabricante (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Los virus se amplificaron en células HEK293 y se purificaron mediante una doble banda de cloruro de cesio de acuerdo con los protocolos convencionales. Antes de los estudios in vivo, se caracterizaron exhaustivamente las reservas víricas por la concentración de partículas víricas, título de infectividad, esterilidad, endotoxina, integridad genómica y transgénica, identidad y expresión del transgén.
Adenovirus-733 (PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA). Ad-733 es el equivalente viral del plásmido 457. La expresión de los tres antígenos se elimina de un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión transgénica durante la producción a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos secuencias 2A diferentes.
Adenovirus-734 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA). Ad-734 es el equivalente viral del plásmido 458. La expresión de los tres antígenos se elimina de un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión transgénica durante la producción a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos secuencias 2A diferentes.
Adenovirus-735 (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA). Ad-735 es el equivalente viral del plásmido 459. La expresión de los tres antígenos se elimina de un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión transgénica durante la producción a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen una secuencia 2A y un IRES.
Adenovirus-796 (PSMA-mIRES-PSCA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA). Ad-796 es el equivalente viral del plásmido 846. La expresión de PSA se elimina del promotor de la beta actina de pollo, mientras que la expresión de PSCA y PSMA se elimina del promotor de CMV-TetO2. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos promotores y un IRES.
Adenovirus-809 (PSMA-mIRES-PSCA, CMV-PSCA-F2A-PSMA). Ad-809 es el equivalente viral del plásmido 850. La expresión de PSA se elimina del promotor de la beta actina de pollo, mientras que la expresión de PSCA y PSMA se elimina del promotor de CMV-TetO2. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos promotores y una secuencia 2A.
Ejemplo 4. Eficacia anticancerosa de la vacuna en combinación con sunitinib y anticuerpo anti-CTLA-4 Se investigó la eficacia antitumoral de una vacuna contra el cáncer en combinación con sunitinib y anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (clon 9D9) en ratones BALB/neuT con tumor TUBO subcutáneo.
Procedimiento de estudio. En resumen, diez ratones por cada grupo recibieron una dosis oral diaria de vehículo o malato de sunitinib a 20 mg/kg a partir del día 10 después del implante del tumor hasta el día 64. La vacunación con construcciones de ADN que no codifican antígeno (vacuna control) o un antígeno Her-2 de rata SEQ ID NO:54 (vacuna contra el cáncer) como vectores de adenovirus se inició el día 13 seguida, a continuación, por dos inmunizaciones semanales, dos inmunizaciones quincenales y siete inmunizaciones semanales de los antígenos respectivos (antígenos HBV o rHer-2) por ADN. Los grupos de ratones (círculo cerrado y triángulo abierto) que se trataron con anticuerpo monoclonal CTLA-4 anti-murino se inyectaron por vía intraperitoneal con 250 |jg del anticuerpo en los días 20, 27, 41, 55, 62, 69, 76, 83, 90 y 97 justo después de las inyecciones de PMED.
Resultados. La Figura 4 muestra la curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la eficacia antitumoral de sunitinib y el anticuerpo monoclonal CTLA-4 anti-murino (clon 9D9) en combinación con una vacuna contra el cáncer. Se observó un aumento del tiempo de supervivencia en ratones tratados con Sutent con vacuna control (círculo abierto), anticuerpo monoclonal CTLA-4 anti-murino (triángulo abierto) o vacuna contra el cáncer (triángulo cerrado). Se observó un aumento adicional de la supervivencia en ratones tratados con Sutent y vacuna contra el cáncer en combinación con CTLA-4 anti-murino (círculo cerrado). Los valores de p se calcularon mediante la prueba de log-rank.
Ejemplo 5. Efecto de CPG o agonista de CD40 en las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna contra el cáncer
Estudios de inmunogenicidad en ratones BALB/c
Se investigó el efecto de la administración local de moduladores inmunitarios en la magnitud y calidad de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno inducidas por un cáncer, en ratones BALB/c, en los que la respuesta inmunitaria se evaluó midiendo las respuestas de linfocitos T específicos de rHER2 utilizando el ensayo ELISPOT de IFNy o ensayo de tinción de citoquinas intracelulares. En resumen, se inmunizaron de 4 a 6 ratones BALB/c hembra por grupo, según se indica, con construcciones de expresión de plásmidos de ADN que codifican secuencias de antígeno rHER2 (SEQ ID NO:54) mediante un sistema de suministro PMED. Los moduladores inmunitarios, CpG7909 (PF-03512676) y el anticuerpo agonista monoclonal anti-CD40, se administraron localmente mediante inyecciones intradérmicas en la proximidad del ganglio linfático inguinal que drena la vacuna posteriormente después de las actuaciones de PMED. Las respuestas de los linfocitos T específicos de antígeno se midieron mediante ELISPOT de IFNy o mediante un ensayo de tinción intracelular de citoquinas de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.
Ensayo de tinción intracelular de citoquinas (ICS)
Las respuestas inmunitarias de linfocitos T polifuncionales (positivas a múltiples citoquinas) a rHer-2 se midieron a partir de esplenocitos o PBMC aisladas de animales individuales mediante un ensayo ICS. Típicamente, se incubaron 1e6 esplenocitos con Brefeldin A a 1 pg/ml y péptido estimulante (CD8 p66 específico de rHer-2, CD4 p169 específico de rHer-2 o HBV p87 irrelevante) a 10 pg/ml durante 5 horas a 37 °C en un Incubadora con 5% CO2. Después de la estimulación, los esplenocitos se lavaron y se bloquearon con el bloqueante Fch (CD16/CD32 anti­ ratón ) durante 10 min. a 4 °C seguido de una tinción de 20 minutos con tinte de agua viva/muerta, CD3ePE-Cy7 anti-ratón, azul pacífico CD8a anti-ratón y CD45R/B220 PerCP-Cy5.5 anti-ratón. Se lavaron las células, fijadas con 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 °C, permeabilizadas con solución BD fix/perm durante 30 min a temperatura ambiente e incubadas con IFNy APC anti-ratón, TNF^ Alexa488 anti-ratón y PE IL-2 anti-ratón durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se adquirieron 20.000 linfocitos T CD4 o CD8 para su análisis por citometría de flujo. El número total de linfocitos T positivos para citoquinas únicas, dobles o triples específicos de antígeno por bazo total de cada animal se calcula restando las respuestas específicas de rHer-2 al péptido HVB irrelevante de las respuestas específicas de la vacuna y se normaliza al número total de esplenocitos aislados del bazo.
Resultados del ensayo ELISPOT de IFNy
La Figura 5 muestra los resultados de ELISPOT de IFNy de grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la magnitud de las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno inducidas por la vacuna rHER2 cuando se administra con los moduladores inmunitarios como se indica. En resumen, cada ratón por grupo de tratamiento (n = 4) se inmunizó con construcciones de expresión de plásmidos de ADN que codifican secuencias de antígeno rHER2 (SEQ ID NO:54) por PMED inmediatamente seguido por 100 pg de anticuerpo monoclonal IgG de rata control (Bioxcell n.° BE0089: mAb control ) o 50 hg de CpG7909 o 100 pg de anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Bioxcell n.° BE0016-2: mAb a-CD40 ) como se indica. Las respuestas inmunitarias específicas de antígeno se midieron mediante el ensayo ELISPOT de IFNy a partir de 5e5 esplenocitos mezclados con péptidos p66 control o específicos de rHer-2 a una concentración de 10 pg/ml, 7 días después de la actuación de PMED. Se calculó el número de células secretoras de IFNy totales a partir de esplenocitos que contenían 1e5 linfocitos T CD8 a partir de los resultados de ELISPOT de animales individuales y se representó el porcentaje de linfocitos T CD8 en esplenocitos y la media y el error estándar de la media de cada grupo. Tal como muestra, tanto CpG7909 como el anticuerpo monoclonal anti-CD40 potenciaron significativamente la magnitud de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno inducidas por el ADN de rHer-2 en comparación con los ratones que recibieron anticuerpos control.
Resultados del Ensayo de Tinción Intracelular de Citoquinas (ICS). Las Figuras 6 y 7 muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de CpG 7909 sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante el ensayo de tinción intracelular de citoquinas. En resumen, cada animal se inmunizó dos veces con las construcciones de expresión de plásmidos de ADN que codifican las secuencias del antígeno rHER2 (SEQ ID NO:54) suministradas por PMED con un intervalo de 4 semanas. Los ratones de cada grupo (n = 5) recibieron inyecciones intradérmicas de PBS (grupo PMED) o 50 hg de CpG 7909 (grupo PMED CpG) en la proximidad del lado derecho del ganglio inguinal que drena la vacuna inmediatamente después de ambas inmunizaciones con ADN por PMED. Siete días después de la última inmunización por PMED, se realizó un ensayo ICS en los esplenocitos aislados de cada ratón individual para detectar linfocitos T CD8 o CD4 polifuncionales específicos de antígeno que secretan IFNy, TNF^ y/ o IL- 2. Se detectó un aumento significativo en las respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 positivos a múltiples citoquinas específicos de rHer-2 en ratones tratados con el suministro local de CpG 7909 en comparación con PBS. Se observó un aumento en la población de CD8 positivos para citoquinas únicas en los animales que recibieron suministro local de la administración de CpG7909 en comparación con PBS.
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 agonístico sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante el ensayo de tinción intracelular de citoquinas. En resumen, cada animal se inmunizó dos veces mediante construcciones de expresión de plásmidos de ADN que codifican las secuencias del antígeno rHER2 (SEQ ID NO:54) suministradas por PMED con un intervalo de 4 semanas. Los ratones de cada grupo (n = 6) recibieron 100 hg de inyecciones intradérmicas del isotipo de IgG control (PMED con IgG) o anticuerpo monoclonal anti-CD40 (PMED con aCD40) cerca del lado derecho del ganglio inguinal que drena la vacuna, un día después de que la primera inmunización se suministrara por PMED. Siete días después del último PMED, se realizó un ensayo iCs en los esplenocitos aislados de cada ratón individual para detectar linfocitos T CD8 o CD4 polifuncionales específicos de rHer-2 que secretan IFNn, TNF^ y/o IL-2. Se detectó un aumento significativo en las respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 positivos a triples citoquinas específicos de rHer-2 en ratones tratados con el suministro local de anticuerpo monoclonal anti-CD40 en comparación con el isotipo de IgG control. También hubo aumentos significativos en los linfocitos T CD4 positivos para citoquinas únicas y dobles específicos de rHer-2 por el anticuerpo monoclonal anti-CD40 administrado localmente.
Ejemplo 6. Eficacia anticancerosa de la vacuna contra el cáncer en combinación con dosis bajas de sunitinib Se investigó la eficacia antitumoral de la vacuna contra el cáncer en combinación con sunitinib a baja dosis en ratones BALB/neuT con tumores espontáneos de la almohadilla mamaria.
Tratamiento de animales. En resumen, Se administró por vía oral, a ratones hembra de 13-14 semanas de edad, malato de sunitinib (Sutent) a 5 mg/kg durante 112 días dos veces al día. La vacuna de control, que no suministra antígeno, y la vacuna contra el cáncer que suministra un antígeno Her-2 de rata de la SEQ ID NO:54 (rHer-2), se administraron mediante inyecciones de adenovirus el día 3 como principal, seguidas de 7 administraciones quincenales de PMED del ADN que suministra los antígenos del HBV (vacuna control) o rHer-2 (vacuna contra el cáncer) respectivamente. El punto final de supervivencia se determinó cuando las diez almohadillas mamarias se convirtieron en tumor positivo o cuando el volumen de cualquiera de los tumores mamarios alcanzó los 2000 mm3. Resultados. Los resultados se presentan en la Figura 10. En comparación con el perfil farmacocinético publicado anteriormente de Sutent (Mendel, D., Laird, D., y col.: "In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship". Clinical Cancer Research, 203, 9:327-337) se espera que la CMax de Sutent en ratones dosificados dos veces al día a 5 mg/kg sea significativamente más baja que los niveles sanguíneos mínimos necesarios para lograr una eficacia antitumoral eficaz en ratones y hombres. Los datos muestran una mejora rápida y temporal en la supervivencia de los ratones tratados con monoterapia con Sutent en dosis bajas. Sin embargo, cuando se administró con la vacuna contra el cáncer, se observó una mejoría más persistente y significativa de la supervivencia (P <0,0001 mediante la prueba del orden logarítmico).
Ejemplo 7. Potenciación de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante la administración local de CPG
Se investigó la potenciación inmunitaria de la administración local de CpG (PF-03512676) en las respuestas inmunitarias inducidas por un ácido nucleico de PSMA humano proporcionada por la invención, en un estudio con monos, en el que se evaluó la respuesta inmunitaria midiendo las respuestas de linfocitos T específicos de PSMA usando un ensayo ELISPOT de IFNy.
Tratamiento de Animales y Recogida de Muestras. Se inmunizaron seis grupos de macacos cynomolgus chinos, seis (n.° 1 a 6) por cada grupo de prueba, con un ADN plásmido que codifica el antígeno PSMA modificado humano (el polipéptido de la SEQ ID NO:9) suministrado por electroporación. En resumen, todos los animales recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 5 mg de ADN plásmido seguido de electroporación (ADN EP) en el día 0. Posteriormente, justo después de la electroporación, el grupo 2 recibió inyecciones intramusculares bilaterales de 2 mg de CpG mezclados con 1 mg de alumbre cerca de los sitios de inyección de ADN. Los grupos 3 y 4 recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 2 mg de CpG suministrados sin alumbre cerca de los sitios de inyección de ADN el día 0 o el día 3, respectivamente. El grupo 5 recibió 2 mg de inyecciones intradérmicas bilaterales de CpG, suministradas cerca de los ganglios inguinales que drenan la vacuna, el día 3. El grupo 6 recibió inyecciones bilaterales de 200 hg de CpG mezclados con la solución de ADN que se electroporó conjuntamente en el músculo el día 0.
Procedimiento del ensayo ELISPOT de IFNy. Las muestras de sangre periférica se recogieron de cada animal quince días después de la inmunización con ADN. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de las muestras de sangre y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicos de PSMA. En resumen, se colocaron en placas 4e5 de PBMC de animales individuales por pocillo con grupos de péptidos específicos de PSMA o péptidos control no específicos (grupo de péptidos de HER2 humano) cada uno a 2 pg/ml en placas ELISPOT de IFNy. La composición de cada uno de los grupos de péptidos específicos de PSMA se proporciona en la Tabla 24A. Las placas se incubaron durante 16 horas a 37 °C y 5% de CO2 y se lavaron y desarrollaron después de la incubación según las instrucciones del fabricante. El número de células formadoras de puntos productoras de IFNy (SFC) se contó mediante un lector CTL. Cada condición se realizó por duplicado.
Resultados. La Tabla 6 muestra el resultado de un ensayo ELISPOT de IFNy representativo que evalúa y compara las respuestas de linfocitos T productores de IFNy inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con CpG (PF-03512676) administrada localmente por inyecciones intramusculares (grupos 2, 3, 4 y 5) o intradérmicas (grupo 6). La respuesta específica de PSMA informada se calculó restando el número promedio de SFC de los péptidos control no específicos (Grupo de péptidos HER2 humanos) del número promedio de SFC de los Grupos de péptidos de PSMA y se normalizó a las s Fc observadas con 1e6 de PBMC. A indica que el recuento no es exacto porque el número de puntos era demasiado numeroso para contar. ND indica no determinado.
Las respuestas de linfocitos T específicos de PSMA a IFNy se detectaron en múltiples grupos de péptidos específicos de PSMA en ausencia de CpG (PF-03512676) en los seis animales (grupo 1). Las respuestas totales a los péptidos PSMA medidos fueron moderadamente más altas en unos pocos animales que recibieron adicionalmente CpG (PF-03512676) por inyección intramuscular (grupo 4: 3/6) o intradérmica (grupo 5: 2/6) 3 días después de la electroporación de ADN. Sin embargo, cuando se suministró posteriormente CpG justo después de la electroporación el mismo día (grupos 2 y 3), hubo varios animales que no produjeron respuestas altas (grupo 2: 4/6 y grupo 3: 3/6), ya sea mezclado o no con alumbre. Sin embargo, se detectaron respuestas netas más altas en 4/6 animales cuando se electroporó una dosis diez veces menor de CpG junto con la solución de ADN en el músculo (grupo 6) con una respuesta estadísticamente mayor (P <0,05) a los grupos de péptidos H1 y R1 en comparación con animales que no recibieron CpG (grupo 1). Los datos muestran que una dosis baja de CpG puede potenciar eficazmente las respuestas de los linfocitos T a IFNy inducidas por una vacuna de a Dn cuando se electroporan conjuntamente en el músculo.
Tabla 6. Las respuestas de linfocitos T productores de IFNy específicos de PSMA inducidas por la vacuna de ADN sin (Grupo 1) o con CpG (Grupos 2, 3, 4, 5 y 6) se miden mediante ensayo ELISPOT de IFNy a partir PBMC, 15 días después de la electroporación de ADN
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Ejemplo 8. Potenciación de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante la administración local de Anticuerpos anti-CTLA-4
El efecto de la administración subcutánea de bajas dosis de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) sobre las respuestas inmunitarias inducidas por un ácido nucleico de PSMA de rhesus se investigó en un estudio con monos, en el que se evaluó la respuesta inmunitaria mediante la medición respuestas de linfocitos T específicos de PSMA utilizando un ensayo ELISPOT de IFNy. El ácido nucleico de PSMA de rhesus utilizado en el estudio tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO:56) y codifica un polipéptido PSMA inmunogénico de la SEQ ID NO:55.
Tratamiento de Animales y Recogida de Muestras. Se inmunizaron cinco grupos de macacos rhesus indios masculinos, siete (n. ° 1 a 7) por cada grupo de prueba con un adenovirus que codifica un polipéptido PSMA modificado de rhesus administrado mediante inyecciones intramusculares bilaterales (2x 5e10 V.P.). Inmediatamente después de las inyecciones de adenovirus, el grupo 1 recibió el vehículo y los grupos 2 a 4 recibieron inyecciones subcutáneas bilaterales de anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a dosis de 2x 25 mg, 2x 16,7 mg y 2x 8,4 mg respectivamente cerca del ganglio linfático que drena la vacuna.
Nueve días después de la inmunización, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo IELISPOT de IFNy para medir las respuestas de los linfocitos T específicos de PSMA de rhesus. En resumen, 4e5 PBMC de animales individuales se sembraron por pocillo con grupos de péptidos específicos de PSMA de rhesus (P1, P2, P3 o R1 R2 definidos en la Tabla 24a ) o péptidos de control no específicos (grupo de péptidos de HER2 humano) cada uno a 2 pg/ml en placas de ELISPOT de IFNa Las placas se incubaron durante 16 horas a 37 °C y 5% de CO2 y se lavaron y desarrollaron después de la incubación según las instrucciones del fabricante. El número de células formadoras de puntos productoras de IFNy (SFC) se contó mediante un lector CTL. Cada condición se realizó por duplicado. El promedio de los duplicados de la SFC ajustado al nivel de fondo de los Grupos de péptidos específicos de PSMA de rhesus se normalizó con la respuesta en 1e6 PBMC. Las respuestas individuales y de la suma a los grupos de péptidos de cada animal individual se presentan en la Tabla 29.
Procedimiento del ensayo ELISPOT de IFNy. Un anticuerpo de captura específico para IFNy (nBD Bioscience, n.° 51-2525kc) se aplica sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) en una microplaca durante la noche a 4 °C. La placa se bloquea con suero/proteína para evitar la unión no específica al anticuerpo. Después del bloqueo, se añaden a los pocillos células efectoras (como esplenocitos aislados de ratones inmunizados o PBMC aisladas de macacos rhesus) y dianas (como péptidos PSMA de biblioteca de péptidos, células diana pulsadas con péptidos específicos de antígeno o células tumorales que expresan los antígenos relevantes) y se incuban durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Las citoquinas secretadas por células efectoras son capturadas por el anticuerpo de recubrimiento en la superficie de la membrana de PVDF. Después de eliminar las células y los medios de cultivo, se agregaron 100 pl de un anticuerpo policlonal biotinilado productor de IFNy anti-humano a cada uno de los pocillos para la detección. Los puntos se visualizan agregando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y el sustrato precipitado, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), para producir puntos de color rojo según el protocolo del fabricante (Mabtech). Cada punto representa un linfocito T que produce citoquinas únicas.
Resultados. La Tabla 7 muestra los resultados de un ensayo ELISPOT de IFNy representativo que compara las respuestas de linfocitos T inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con (grupos 2-4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675,206) administrado localmente por inyecciones subcutáneas cerca del ganglio linfático que drena la vacuna. La vacuna generó una respuesta inmunitaria (grupo 1) que se potenció significativamente por la administración local del anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a una dosis de 50 mg (grupo 2, P = 0,001 por la prueba T de Student utilizando valores subestimados). La respuesta también se potenció significativamente con dosis bajas de anticuerpo anti-CTLA-4 a 33,4 mg (grupo 3: P = 0,004 mediante la prueba T de Student utilizando valores subestimados) y 16,7 mg (grupo 4: P = 0,05 mediante la prueba T de Student) respectivamente. Los datos sugieren que las dosis bajas de anti-CTLA-4 suministradas por inyección subcutánea pueden potenciar significativamente las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna.
Tabla 7. Respuestas de linfocitos T productores de IFNy inducidas por la vacuna sin (Grupo 1) o con inyecciones subcutáneas de anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675,206). A indica que el recuento está subestimado debido a la gran cantidad de puntos. TNTC significa demasiado numeroso para contar.
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Ejemplo 9. Inmunomodulación de células supresoras derivadas mieloides por dosis bajas de sunitinib El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar los efectos inmunomoduladores de la dosis baja de sunitinib en Células Supresoras Derivadas de Mieloides (MDSC) in vivo, en un modelo de ratón no tumoral.
Procedimientos de estudio.
Para generar esplenocitos enriquecidos con MDSC, se implantaron células TUBO (1x106) en los flancos de 5 ratones BALB/neuT, y se dejaron durante aprox. 20-30 días hasta que el volumen del tumor alcanzó entre 1000­ 1500 mm3 Los ratones se sacrificaron, a continuación, se extirparon los bazos y se recuperaron los esplenocitos enriquecidos con MDSC. Los esplenocitos se marcaron durante 10 minutos con CFSE 5 j M, se lavaron con PBS y se contaron. Las células marcadas se resuspendieron posteriormente a 5x107 esplenocitos/ml en solución de PBS y se transfirieron de forma adoptiva a través de una inyección i.v. de la vena de la cola en ratones receptores BALB/c no tratados previamente. Tres días antes de la transferencia adoptiva, se comenzó a dosificar a los ratones receptores dos veces al día con vehículo o malato de sunitinib (Sutent) a 5 mg/kg, 10 mg/kg y 20 mg/kg. Después de la transferencia adoptiva, los ratones receptores continuaron recibiendo una dosificación dos veces al día de vehículo o sunitinib durante dos días más, después de lo cual los ratones se sacrificaron, se extrajeron los bazos, se recuperaron los esplenocitos y se procesaron para el análisis fenotípico.
Los esplenocitos se contaron y se resuspendieron a 5x106 células/ml en tampón de tinción FACS (PBS, albúmina de suero bovino al 0,2% (p/v) y azida sódica al 0,02% (p/v)). Para la tinción de esplenocitos para citometría de flujo, primero se incubaron 2.5x106 células con anticuerpos a CD16/CD32, 10 minutos a 4 °C, para bloquear los receptores Fc y minimizar la unión no específica. Los esplenocitos se tiñeron a continuación, durante 20 minutos a 4 °C con anticuerpos conjugados con fluoróforos apropiados (Biolegend) para marcadores de superficie celular murinos. Para linfocitos T (anti-CD3 (azul pacífico), clon 17A2) y para MDSC (anti-GR-1 (APC), clon RB6-8C5 y anti-CD11b (PerCp Cy5.5), clon M1/70). También se incluyó un tinte vivo/muerto. Tras la incubación del anticuerpo, los esplenocitos teñidos se lavaron con 2 ml de tampón FACS, se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 0,2 ml de tampón FACS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo BD CANTO II. Para monitorizar el efecto de Sunitinib o Vehículo en la supervivencia de MDSC transferida de forma adoptiva, se calculó el porcentaje de CFSE+, CD3-, GR1 , CD11b+ en la ventana de análisis singlete en vivo. a continuación,se determinó el número de MDSC transferidas de forma adoptiva por bazo calculando qué número real de células es el porcentaje representado del recuento total de esplenocitos. Los datos se analizaron por software FloJo y Graph Pad.
Resultados. Los datos presentados en la Tabla 27 representan el número medio de células CS-FE , CD3-, GR1 , CD11b transferidas de forma adoptiva recuperadas por bazo (n = 7/grupo), 2 días después de la transferencia adoptiva, de ratones dosificados dos veces al día con cualquier Vehículo o 5 mg/kg, 10 mg/kg y 20 mg/kg de Sunitinib. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de un solo uso mediante la prueba de comparación múltiple de Dunnett, comparando los grupos administrados con dosis de Sunitinib con el grupo de 0 mg/kg (vehículo). Los datos demuestran que Sunitinib, dosificado dos veces al día, in vivo, tiene un efecto inmunomodulador en las MDSC, incluso cuando se administra en dosis tan bajas como 5 mg/kg, lo que da como resultado una reducción estadísticamente significativa en los números recuperados cuando se compara con el grupo de control tratado con vehículo.
Tabla 8. Número medio de MDSC CFSE+, CD3-, GR1 , CD11b+ recuperadas de bazo
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Ejemplo 10. Inmunogenicidad de construcciones de adenovirus de triple antígeno y ADN
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar la capacidad de las construcciones de vacunas de triple antígeno (ya sea en forma de vector de adenovirus o plásmido de ADN) que expresan tres antígenos PSMA, PSCA y PSA proporcionados por la invención para provocar respuestas de linfocitos T específicos para los tres antígenos codificados en primates no humanos.
Procedimientos de Estudio In Vivo. La inmunogenicidad de linfocitos T de cinco vectores de adenovirus que expresan cada uno tres antígenos (PSMA, PSCA y PSA; Ad-733, Ad-734, Ad-735, Ad-796 y Ad-809) proporcionados por la invención se comparó con la mezcla de tres vectores de adenovirus que expresan cada uno un antígeno único (PSMA, PSA o PSCA), 9 días después del cebado. La respuesta a un único adenovirus que expresa un antígeno único (grupos 1-3) se evaluó para demostrar la especificidad. En resumen, se inyectaron por vía intramuscular macacos rhesus indios (n = 6 para los grupos 1 y 3, n = 7 para el grupo 2 y n = 8 para los grupos 4-9) con un total de 1e11 V.P. seguido de inyecciones intradérmicas de anti-CTLA-4 a 10 mg/kg en el mismo día. Nueve días después de las inyecciones, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo IELISPOT de IFN^ para medir las respuestas de los linfocitos T específicos de PSMA, PSA y PSCA. Trece semanas después de las inyecciones de adenovirus y anti-CTLA-4 cuando se han establecido las respuestas de los linfocitos T, los monos recibieron vacunas de refuerzo de ADN (Grupo 1: PSMA, plásmido 5166; Grupo 2: PSA, plásmido 5297; Grupo 3: PSCA, plásmido 5259; Grupo 4: mezcla de PSMA, PSA y PSCA, plásmidos 5166, 5259 y 5297; Grupo 4: plásmido 457; Grupo 6: plásmido 458; Grupo 7: plásmido 459; Grupo 8: plásmido 796 y Grupo 9: plásmido 809) administradas por electroporación. En resumen, cada animal recibió un total de 5 mg de ADN plásmido proporcionado por la invención que suministra el mismo casete de expresión codificado en el adenovirus utilizado en el cebado. Nueve días después de la vacunación de refuerzo, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy.
Ensayo ELISPOT de IFNy. En resumen, 4e5 PBMC de animales individuales se sembraron por pocillo con grupos de péptidos específicos de Ps MA, P1, P2, P3 o H1 y H2 (Tabla 9A), grupo específico de PsA 1 o 2 (Tabla 9B), grupo específico de PSCA (Tabla 10) o los péptidos control no específicos (grupo de péptidos HER2 humanos) cada uno a 2 |jg/ml en placas de ELISPOT de IFNy. Las placas se incubaron durante 16 horas a 37 °C y 5% de CO2 y se lavaron y desarrollaron después de la incubación según las instrucciones del fabricante. El número de células formadoras de puntos productoras de IFNy (SFC) se contó mediante un lector CTL. Cada condición se realizó por duplicado. El promedio de los duplicados de la SFC ajustado al nivel de fondo de los Grupos de péptidos específicos de antígeno se normalizó con la respuesta en 1e6 PBMC. Las respuestas específicas de antígeno en las tablas presentan la suma de las respuestas a los correspondientes péptidos o grupos de péptidos específicos de antígeno. Resultados: La Tabla 11 representa un estudio que evalúa la inmunogenicidad de los linfocitos T de cinco adenovirus diferentes, que expresan cada uno los tres antígenos en comparación con la mezcla de tres adenovirus que expresan cada uno un único antígeno en macacos rhesus indios por ELISPOT de IFNy. La mayoría de los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSMA (grupo 1) indujeron respuestas específicas a PSMA pero no a PSA o PSCA (prueba T de Student, P<0,03. Un animal (n.° 4) que indujo respuestas a PSCA de manera preferente se eliminó del análisis estadístico). Los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSA (grupo 2) indujeron respuestas específicas a PSA pero no a PSMA o PSCA (prueba T de Student, P<0,02). Los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSCA (grupo 3) indujeron respuestas específicas a PSCA pero no a PSMA o PSA (prueba T de Student, P<0,03). Los cinco vectores de adenovirus que expresan triple antígeno (grupos 5-9) indujeron respuestas de linfocitos T a IFN^ a los tres antígenos cuya magnitud varió según el animal. La magnitud de las respuestas a PSCA inducidas por los adenovirus que expresan triple antígeno fue similar a la de mezcla de vectores individuales (grupo 4). Sin embargo, la magnitud de las respuestas a PSMA inducidas por Ad-809 (grupo 9) y las respuestas a PSA inducidas por Ad-796 (grupo 8) fueron cada una significativamente superiores a la mezcla (prueba T de Student, P = 0,04 y P = 0,02) respectivamente. Estos resultados indican que la vacunación con un adenovirus que expresan antígenos triples puede provocar respuestas inmunitarias de linfocitos T equivalentes o superiores a la vacunación con la mezcla de adenovirus individuales en primates no humanos.
La Tabla 12 muestra que los resultados ELISPOT de IFNy representan un estudio que evalúa la inmunogenicidad de los cinco casetes de expresión de triple antígeno proporcionados en la invención suministrados por un cebado de adenovirus en combinación con anti-CTLA-4 seguido de un refuerzo por electroporación del ADN plásmido correspondiente. Las respuestas inmunitarias se comparan con la mezcla de tres construcciones que expresan un antígeno único suministrado de manera similar por un cebado de adenovirus con inmunizaciones con anti-CTLA-4 y con refuerzo por electroporación de ADN.
Todos los animales que solo recibieron Ad-PSMA con anti-CTLA-4 seguido de inmunizaciones con plásmido-PSMA (grupo 1) indujeron respuestas específicas a PSMA pero no a PSA o PSCA. De manera similar,todos los animales que solo recibieron Ad-PSA con anti-CTLA-4 seguido de inmunizaciones con plásmido-PSA (grupo 2) indujeron respuestas específicas a PSA pero no a PSMA o PSCA y finalmente todos los animales que solo recibieron Ad-PSCA con anti-CTLA-4 seguido de inmunizaciones con plásmido-PSCA (grupo 3) indujeron respuestas específicas a PSCA pero no a PSMA o PSA (prueba T de Student, P<0,01).
Todos los animales que fueron inmunizados con los vectores que expresan triple antígeno(grupos 5-9) o la mezcla (grupo 4) indujeron respuestas de linfocitos T productores de IFNy a los tres antígenos. La frecuencia de linfocitos T productores de IFNy específicos de PSCA o PSA detectados fue similar en todos estos grupos (grupos 4-9) respectivamente. Sin embargo, los grupos de construcciones 7 y 9 que recibieron vacunas con el vector de expresión de triple antígeno produjeron una frecuencia significativamente mayor de respuestas a PSMA que la mezcla de tres construcciones de expresión de antígeno único (grupo 4). Estos resultados indican que las vacunas de adenovirus y ADN que expresan antígenos triples en un casete pueden provocar respuestas de linfocitos T productores de IFNy equivalentes o superiores a la mezcla de adenovirus y ADN que expresan los antígenos únicos en primates no humanos.
Tabla 9A. Grupos de péptidos de PSMA *
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Tabla 9B. Grupos de péptidos PSA: se muestra la posición de los aminoácidos y la secuencia de quince péptidos de aminoácidos solapantes con trece aminoácidos de la biblioteca de péptidos de PSA.
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Tabla 10. Grupos de péptidos PSCA: Se muestra la posición de los aminoácidos y la secuencia de quince péptidos de aminoácidos solapantes con trece aminoácidos de la biblioteca de péptidos de PSCA.
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Tabla 11. Respuestas de linfocitos T productores de IFNy inducidas por el antígeno único (Grupo 1: Ad-PSMA; Grupo 2: Ad-PSA; Grupo 3: Ad-PSCA; Grupo 4: mezcla de Ad-PSMA, Ad-PSA y Ad-PSCA) o por vectores de adenovirus que expresan triple antígeno (Grupo 4: Ad-733; Grupo 6: Ad-734; Grupo 7: Ad-735; Grupo 8: Ad-796 y Grupo 9: Ad-809) después de cebado con adenovirus con anti-CTLA-4 analizado mediante el ensayo ELISPOT.
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Tabla 12. Respuestas de linfocitos T productores de IFNy inducidas por el antígeno único (Grupo 1: PSMA; Grupo 2: PSA; Grupo 3: PSCA; Grupo 4: mezcla de PSMA, PSA y PSCA) o vectores de expresión de triple antígeno (Grupos 5 - 9) después de cebado de adenovirus con inmunizaciones con anti-CTLA-4 y con refuerzo por electroporación de ADN analizadas mediante el ensayo ELISPOT.
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Ejemplo 11. Construcción de vectores C68
11A. Construcción del vector AdC68-734
AdC68-734 es un vector de adenovirus incompetente para la replicación basado en el adenovirus C68 de chimpancé que codifica tres polipéptidos PAA inmunogénicos: un polipéptido PSA inmunogénico, un polipéptido PSCA inmunogénico y un polipéptido PSMA inmunogénico. La secuencia del vector se diseñó in silico. En primer lugar, la secuencia de C68 de longitud completa de referencia se obtuvo de Genbank (Definición: Adenovirus de simio 25, genoma completo; número de acceso AC_000011.1). Se introdujeron en la secuencia cinco mutaciones puntuales descritas en la literatura. (Roshorm, Y., M. G. Cottingham, y col. (2012). "T cells induced by recombinant chimpanzee adenovirus alone and in prime-boost regimens decrease chimeric EcoHIV/NDK challenge virus load." Eur J Immunol 42(12): 3243-3255) A continuación, se eliminaron 2,6 kilobases de la región de transcripción temprana viral 1 (E1) para hacer que el vector fuera incompetente para la replicación, y se eliminaron 3,5 kilobases de la región de transcripción temprana 3 (E3) para crear espacio en el vector para el casete de expresión transgénico. (Tatsis, N., L. Tesema, y col. (2006). Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers. Gene Ther. 13: 421-429) A continuación, se introdujo un casete de expresión eucariótico altamente eficaz en la región E1. El casete de expresión incluía los siguientes componentes: (A) Potenciador /promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), (B) Operador Tet (sitio de enlace para el represor de tetraciclina), (C) la construcción multiantígeno que comprende (1) secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 25 a 261 del PSA humano, (2) Elemento de hidrolasa que actúa en Cis que codifica un enlazador de glicina-serina y el péptido 2A (T2A) del virus Thosea asigna, (3) secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 2 a 123 del PSCA humano, (4) Elemento de hidrolasa que actúa en Cis que codifica un enlazador de glicina-serina y el péptido 2A del Virus de la Fiebre Aftosa (F2A) y (5) secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 15 a 750 del PSMA humano, y (D) señal de terminación de la transcripción SV40 poliA. Finalmente, se insertaron sitios de restricción de Pacl en cada extremo del genoma viral para facilitar la liberación del genoma del Bacmid precursor. Los nucleótidos de los sitios de restricción PacI se eliminan durante la propagación viral y, por lo tanto, no se incorporan en el genoma del vector producto de sí mismo. Una secuencia de nucleótidos de todo el vector AdC68-734, que incluye los sitios de restricción Pacl, se expone en la SEQ ID NO:58. La construcción multiantígeno (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA) incorporada en el vector AdC68-734 (así como en el plásmido 458) también se describe en la SEQ ID NO:61. La secuencia de aminoácidos codificada por la construcción multiantígeno de la SEQ ID NO:61 se expone en la SEQ ID NO:60. Los componentes del vector AdC68-734 se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13. Componentes del vector AdC68-734
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Siguiendo el diseño in silico, la secuencia de 34.819 pares de bases se sintetizó bioquímicamente en un procedimiento de múltiples etapas que utiliza la síntesis de oligo in vitro y el posterior ensamblaje intermedio mediado por recombinación en E. coli y levadura. El genoma viral se insertó finalmente en un cromosoma artificial bacteriano (pCC1BAC-LCyeast-TRP Trunc) para la propagación. La secuenciación de nueva generación (tecnología MiSeq) se realizó en varias etapas del procedimiento de producción, incluido el lote final Bacmid 17.3.3.22 que se usó para crear la materia prima de semillas virales. La reserva de semillas virales se generó mediante la digestión de Bacmid 17.3.3.22 con Pacl para liberar el genoma AdC68-734 de la estructura de BAC. El ácido nucleico linealizado se transfectó en una línea celular HEK293 adherente complementada con E1 y, tras los efectos citopáticos y formación de focos de adenovirus visibles, se recogieron los cultivos mediante múltiples rondas de congelación/descongelación para liberar el virus de las células. Los virus se amplificaron y purificaron por técnicas convencionales. La organización genética de Bacmid 17.3.3.22 se proporciona en la Figura 11.
IIB . Construcciones de vectores C68 adicionales
Se construyeron vectores C68 adicionales de triple antígeno de forma similar a AdC68-734. Algunos de los vectores adicionales implican deleciones funcionales en el genoma de C68 que son ligeramente diferentes de las del Vector AdC68-734, mientras que otros incorporan diferentes construcciones multiantígeno. Basándose en estos ejemplos y en otra descripción de la presente divulgación, una persona experta en la materia podría construir vectores adicionales de C68 para expresar diferentes construcciones multiántigeno, todas las cuales están dentro del ámbito de la presente invención.
(1) AdC68X-734 y AdC68W-734
El vector AdC68X-734 se construyó a partir de C68 por deleción funcional de las regiones E1 y E3 del genoma de C68 a través de deleciones de los nucleótidos 577-3403 (región E1) y 27125-31831 (región E2) del genoma de C68 de la SEQ ID NO:57. y por inserción de la construcción de triple antígeno (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA) de la SEQ ID NO:61 en la región E1 eliminada. El vector AdC68W-734 es idéntico al vector AdC68-734, excepto que AdC68W-734 contiene una o más mutaciones en la secuencia de ADN de C68.
(2) AdC68X-733 y AdC68X-735
Los vectores AdC68X-733 y AdC68X-735 se crearon reemplazando la construcción de triple antígeno incorporada en el vector AdC68X-734 con la construcción de triple antígeno de las SEQ ID NO:65 y 66, respectivamente. La construcción multiantígeno incorporada en el vector AdC68X-733 (es decir, PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA) es la misma que la incorporada en el plásmido 457 y la construcción multiantígeno incorporada en el vector AdC68X-735 (es decir, PSCA F2A-PSMA-MIRES-PSA) es la misma que en el plásmido 459.
IIC . Caracterización de la Productividad de la Investigación
Se produjeron varios lotes de grado de investigación de AdC68-734 y se probaron para determinar la productividad. Bacmid se digirió con Pacl para liberar el genoma del vector desde la estructura de BAC y el ácido nucleico linealizado se transfectó en líneas celulares HEK293 adherentes complementadas con E1. Cuando los efectos citopáticos extensos y los focos de adenovirus fueron visibles, se recogieron los cultivos mediante múltiples rondas de congelación/descongelación para liberar el virus de las células. Los virus de estos cultivos del Pasaje 0 (P0) se amplificaron al menos un pasaje adicional en matraces de cultivo de tejidos y a continuación se utilizaron como reservas de semillas para ejecuciones de producción a escala de investigación (-0,5 a 3e13 partículas virales totales por lote). En total, se ejecutaron 11 ciclos de producción (cinco en células HEK293 en suspensión y seis en células HEK293 adherentes). La productividad específica promedio fue de 15.000 /- 6.000 partículas virales purificadas por célula infectada inicial, con una proporción de partículas virales: unidad infecciosa de 55. Las productividades a escala de investigación se resumen en la Tabla 14.
Tabla 14. Productividades e infectividades específicas de lotes de producción a escala de investigación L t P d ti id d ífi ( tí l i l ifi d / él l ) R l ió tí l i l id d i f i
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IID . Expresión de antígenos
La expresión en superficie de PSMA y PSCA se midió por citometría de flujo (Figura 12) y la expresión celular total de PSMA, PSCA y PSA se midió por análisis de transferencia Western (Figura 13) de células A549 infectadas con el vector AdC68 a una MOI = 10.000. Las células simuladas e infectadas con AdC68 se tiñeron con anti-PSCA (anticuerpo 1G8 monoclonal conjugado con isotiocianato de fluoresceína [1: 200]) y anticuerpos de PSMA (anticuerpo J591 monoclonal conjugado con aloficocianina [1: 200]) para el análisis citométrico de flujo, 2 días después de la infección. La expresión en superficie de PSCA y PSMA se detectó en la mayoría de las células infectadas con los diferentes vectores AdC68 que expresan triple antígeno con niveles variables. Se detectaron niveles relativamente más altos de expresión de PSCA y PSMA en células infectadas con AdC68X-809 y se detectaron niveles más bajos en células infectadas con AdC68X-733.Dos días después de la infección, se cargaron lisados celulares totales de aproximadamente 1x105 células infectadas en cada carril de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Posteriormente, el gel se transfirió a una membrana para la detección de proteínas PSA, PSMA y PSCA utilizando anticuerpos primarios específicos para PSA, PSMA y PSCA mediante análisis de transferencia Western. Las expresiones de los tres antígenos se detectaron en las células infectadas en diversos grados. Si bien se detectaron niveles relativamente similares de PSMA y PSCA en lisados infectados con AdC68-734 y AdC68X-735, se detectaron niveles más altos de PSA en lisados con AdC68-734 en comparación con aquellos con AdC68X-735.
IIE . Inmunogenicidad
Se realizó una comparación directa de las respuestas de CD8 productores de IFNy inducidas por varios vectores AdC68 de triple antígeno. Cada grupo de ratones (n = 5 por grupo) se inmunizó con AdC68-734, AdC68X-735, AdC68X-809 o Ad5-734 a 1e9 o 1e10 VP en el cuádriceps. Las respuestas de linfocitos T CD8+ productores de IFNy en los ratones se midieron recogiendo los bazos de cada animal el día 13 después de la inmunización. Los esplenocitos se aislaron y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicos de PSMA, PSCA y PSA. En resumen, Se cultivaron 2,5 a 5x105 esplenocitos de animales inmunizados en presencia de péptidos específicos de PSMA, PSCA o PSA humanos individuales a 10 pg/ml. Los péptidos de 15 meros se definieron previamente para contener epítopos de linfocitos T CD8 para cada antígeno de próstata. Los esplenocitos cultivados con medio solo sirvieron como control. Cada condición se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C y 5% de CO2, se lavaron y desarrollaron después de la incubación según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de SFC productoras de IFNy mediante un lector CTL. Los resultados muestran el número promedio de SFC específicas de PSMA, PSCA y PSA con los valores de fondo del medio solo restados y normalizados a 1x106 esplenocitos.
En resumen, todos los vectores de AdC68 que expresan triple antígeno indujeron respuestas inmunitarias a los tres antígenos pero en diferente magnitud. En 1e9 VP, la respuesta a PSMA por los vectores AdC68 fue similar a Ad5. La respuesta al PSCA por los tres vectores AdC68 fue similar o inferior a la respuesta inducida por Ad5, mientras que la respuesta al PSA fue menor con Ad68-735 en comparación con todos los vectores probados. Sin embargo, en 1e10VP, AdC68-809 indujo respuestas similares o mejores a los tres antígenos en comparación con AdC68-734, AdC68-735 o Ad5. Los resultados se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15. Inmunogenicidad de linfocitos T productores de IFNy por vectores AdC68 que coexpresan PSMA, PSA y PSCA en ratones C57BL6 mediante el ensayo ELISPOT de IFNy
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(continuación)
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SECUENCIAS BRUTAS SELECCIONADAS
SEQ ID NO: 1. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL PSMA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA
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SEQ ID NO: 2. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA EL PSMA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE LA SEQ ID NO: 1
Figure imgf000044_0001
SEQ ID NO: 3. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSMA REDISTRIBUIDO 1
SEQ ID NO: 4. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA REDISTRIBUIDO 1 DE LA SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 5. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSMA REDISTRIBUIDO 2
SEQ ID NO: 6. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA REDISTRIBUIDO 2 DE LA SEQ ID N°: 5
SEQ ID NO: 7. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSMA REDISTRIBUIDO 3
SEQ ID NO: 8. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA REDISTRIBUIDO 3 DE LA SEQ ID N°: 7
SEQ ID NO: 9. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSMA UNIDO A LA MEMBRANA
Figure imgf000045_0001
SEQ ID NO: 10. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA UNIDO A LA MEMBRANA DE LA SEQ ID N°: 9
Figure imgf000045_0002
SEQ ID NO: 11. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSMA CITOSÓLICO
SEQ ID NO: 12. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA CITOSÓLICO DE LA SEQ ID N°: 11
SEQ ID NO: 13. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSMA SECRETADO
SEQ ID NO: 14. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSMA SECRETADO DE LA SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 15. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL PSA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA
Figure imgf000046_0001
SEQ ID NO: 16. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL PSA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE LA SEQ ID NO: 15
Figure imgf000046_0002
SEQ ID NO: 17. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSA CITOSÓLICO
Figure imgf000046_0003
SEQ ID NO: 18. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTIGENO PSA CITOSÓLICO DE LA SEQ ID NO: 17
Figure imgf000046_0004
SEQ ID NO: 19. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSA UNIDO A LA MEMBRANA
Figure imgf000047_0001
SEQ ID NO:20. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DEL ANTIGENO PSA UNIDO A LA MEMBRANA DE LA SEQ ID NO:19
Figure imgf000047_0002
SEQ ID NO: 21. SECUENCIA DE AMINOACIDOS DEL PSCA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA
Figure imgf000047_0003
SEQ ID NO: 22. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DEL ANTIGENO PSCA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE LA SEQ ID NO: 21
Figure imgf000047_0004
SEQ ID NO:23. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DEL PLÁSMIDO 5166
SEQ ID NO:24. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5259
SEQ ID NO:25. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5297
SEQ ID NO:26. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 460
SEQ ID NO:27. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 451
SEQ ID NO:28. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 454
SEQ ID NO:29. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5300
SEQ ID NO:30. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 449
SEQ ID NO:31. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 603
SEQ ID NO:32. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 455
SEQ ID NO:33. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 456
SEQ ID NO:34. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 457
SEQ ID NO:35. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 458
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
SEQ ID NO:36. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 459
SEQ ID NO:37. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE PSHUTTLE IRES
SEQ ID NO:38. Secuencia de aminoácidos del antígeno Her-2:
SEQ ID NO:39. Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno Her-2 de la SEQ ID NO: 38
SEQ ID NO:40. Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo CP870,893 anti-CD40:
Figure imgf000052_0001
SEQ ID NO:41. Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo CP870,893 anti-CD40:
Figure imgf000052_0002
SEQ ID NO:42. Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo Tremelimumab anti-CTLA-4
Figure imgf000052_0003
SEQ ID NO:43. Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo Tremelimumab anti-CTLA-4
Figure imgf000052_0004
SEQ ID NO:44. Secuencia de nucleótidos de CpG 7909
Figure imgf000052_0005
SEQ ID NO:45. Secuencia de nucleótidos de CpG 24555
Figure imgf000052_0006
SEQ ID NO:46. Secuencia de nucleótidos de CpG 10103
Figure imgf000052_0007
SEQ ID NO:47. Secuencia de aminoácidos eGFP
SEQ ID NO:48. Secuencia de aminoácidos del antígeno de núcleo de HBV
SEQ ID NO:49. Secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie de HBV
SEQ ID NO:50. Secuencia de aminoácidos de la proteína del DEC de PSMA de Rhesus:
SEQ ID NO:51. Secuencia de aminoácidos del péptido Her-2 p66 de rata (epítopo de linfocitos T H-2d) SEQ ID NO:52. Secuencia de aminoácidos del péptido Her-2 p169 de rata (epítopo de linfocitos T H-2d) SEQ ID NO:53. Secuencia de aminoácidos del péptido p87 del antígeno del núcleo de HBV SEQ ID NO:54. Secuencia de aminoácidos de un antígeno Her-2 de rata (rHer-2):
SEQ ID NO:55. Secuencia de aminoácidos del antígeno PSMA de Rhesus:
SEQ ID NO:56. Secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno PSMA de Rhesus de la SEQ ID NO: 55" SEQ ID NO:57. Genoma completo de Adenovirus Simio 25 (C68)
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
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Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
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Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
SEQ ID NO:58. Secuencia completa del vector AdC68-734
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
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Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
SEQ ID NO:59. Secuencia de nucleótidos de los IRES de EMCV preferidos (pIRES)
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000076_0001
(El IRES mínimo de EMCV (mIRES) carece de los 15 nucleótidos subrayados)
SEQ ID NO: 60. Secuencia de Aminoácidos que Comprende un polipéptido PSA, PSCA y PSMA Inmunogénico (codificado por el plásmido 916 y los vectores AdC68-734 y AdC68W-734)
Figure imgf000076_0002
SEQ ID NO:61. Secuencia de Nucleótidos que Codifica la Secuencia de Aminoácidos de la SEQ ID NO:60.
Figure imgf000076_0003
Figure imgf000077_0001
SEQ ID NO: 62. Secuencia de Nucleótidos del Plásmido 916
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
SEQ ID NO:63. Secuencia completa del vector AdC68W-734
Figure imgf000080_0002
Figure imgf000081_0001
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Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
SEQ ID NO:64. Secuencia de Aminoácidos que Comprende un polipéptido PSA, PSMA y PSCA Inmunogénico (Codificado por el Plásmido 457 y el Vector Adc68x-733)
Figure imgf000091_0002
SEQ ID NO:65. Secuencia de Nucleótidos que Codifica la Secuencia de Aminoácidos de la SEQ ID NO:64
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
SEQ ID NO:66. Secuencia de Nucleótidos de la Construcción Multiantígeno (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA) Incorporada en el Plásmido 459 y en el Vector Adc68x-735
Figure imgf000093_0002
Figure imgf000094_0001

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un vector C68 que comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos de C68; y
(b) una construcción multiantígeno que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA citosólico inmunogénico, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, y en el que la construcción multiantígeno comprende además una secuencia separadora entre dos secuencias de nucleótidos que codifican dos polipéptidos inmunogénicos diferentes y tiene la estructura de fórmula (I):
PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
en el que en la fórmula (I):
(i) PAA1, PAA2 y PAA3 es,cada uno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico, o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico, a condición de que PAA1, PAA2, y PAA3 codifiquen diferentes polipéptidos PAA, y
(ii) SS1 y SS2 son secuencias separadoras y pueden ser iguales o diferentes.
2. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos de C68 es la secuencia de la SEQ ID NO:57 que carece de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5, en el que el polipéptido PSA inmunogénico comprende los aminoácidos 27-263 de la SEQ ID NO:15 o los aminoácidos 4 - 240 de la SEQ ID NO:17, en el que el polipéptido PSCA inmunogénico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21 o los aminoácidos 4-125 de la SEQ ID NO:21, y en el que el polipéptido PSMA inmunogénico seleccionada del grupo que consiste en:
1) un polipéptido que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO:1;
2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3;
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5;
4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7;
5) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:9;
6) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:3;
7) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:5;
8) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO:7; y
9) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9.
3. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos de C68 es la secuencia de la SEQ ID NO:57 que carece de los genes de E1A, E1B y E3.
4. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las secuencias separadoras se seleccionan de secuencias de péptidos 2A e IRES.
5. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la secuencia de péptido 2A se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de péptido 2A de FMDV, ERa V, PTV1, EMC-B, EMc V, TME-GD7, ERBV, TaV, DrosC, CrPV, ABPV, IFV, Rotavirus porcino, rotavirus humano, TSR1 de T brucei, y endonucleasa AP de T cruzi; y en el que el IRES es un IRES de e McV.
6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, en el que PAA1 en la fórmula (I) es una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSA citosólico inmunogénico o una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSCA inmunogénico.
7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que:
(i) PAA1 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA inmunogénico;
(ii) PAA2 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA o PSMA inmunogénico;
(iii) SS1 es una secuencia de péptido 2A; y
(iv) SS2 es una secuencia de péptido 2A o un IRES de EMCV.
8. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia de péptido 2A es la secuencia de péptido 2A de FMDV o la secuencia de péptido 2A de TAV.
9. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 8, en el que:
(1) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSA citosólico inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:18; (ii) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10-720 de la SEQ ID NO:18; (iii) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1115-1825 de la SEQ ID NO:58; y (iv) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1106-1825 de la SEQ ID NO:58;
(2) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSCA inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:22; (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 372 de la SEQ ID NO:22; (iii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1892-2257 de la SEQ ID NO:58; y (iv) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58; y
(3) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PSMA inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en: (iii) la secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 43-2250 de la SEQ ID NO:2; (ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:4; (iii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:6; (iv) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:8; (v) las secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:10; (vi) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO:4; (vii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO:6; (viii) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO:8; (ix) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO:10; (x) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 2333-4543 de la SEQ ID NO:58; y (xi) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58.
10. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 3, en el que en la fórmula (I):
(1) PAA1 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSA citosólico inmunogénico y comprende los nucleótidos 1115-1825 de la SEQ ID NO:58;
(2) PAA2 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSCA inmunogénico y comprende los nucleótidos 1892-2257 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 1886-2257 de la SEQ ID NO:58;
(3) PAA3 es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PSMA inmunogénico y comprende los nucleótidos 2333-4543 de la SEQ ID NO:58 o comprende los nucleótidos 2324-4543 de la SEQ ID NO:58;
(4) SS1 es una secuencia de nucleótidos que codifica T2A; y
(5) SS2 es una secuencia de nucleótidos que codifica F2A.
11. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60 o de la SEQ ID NO:64.
12. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la construcción multiantígeno comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 o una variante degenerada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66.
13. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 12, que comprende adicionalmente un promotor de CMV.
14. El vector C68 de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:58, los nucleótidos 9-34811 de la SEQ ID NO:58, o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:63.
15. Una composición que comprende un vector C68 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
16. Una célula que comprende un vector C68 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
17. Una composición farmacéutica que comprende un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17 para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano.
19. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 18, en la que dicho procedimiento comprende además administrar al ser humano una cantidad eficaz de un modulador inmunitario.
20. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 18, en la que dicho procedimiento comprende además administrar al ser humano (a) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de células inmunosupresoras y (b) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de células inmunoefectoras.
21. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 20, en la que el inhibidor de células inmunosupresoras se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de proteínas quinasas, un inhibidor de COX-2 y un inhibidor de PDE5, y en la que el potenciador de células inmunoefectoras se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de CTLA-4, un agonista de CD40, un agonista de TLR, un agonista de 4-1BB, un agonista de OX40, un agonista de GITR, un antagonista de PD-1 y un antagonista de PD-L1.
22. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 21, en la que:
(1) el inhibidor de las proteínas quinasas se selecciona del grupo que consiste en imatinib, sorafenib, lapatinib, zactima MP-412, dasatinib, lestaurtinib, malato de sunitinib, axitinib, erlotinib, gefitinib, bosutinib, temsirolismus y nilotinib;
(2) el inhibidor de CTLA-4 se selecciona del grupo que consiste en ipilimumab y tremelimumab;
(3) el agonista de CD40 es un anticuerpo anti-CD40 seleccionado del grupo que consiste en G28-5, mAb89, EA-5, S2C6, CP870893 y dacetuzumab; y
(4) el agonista de TLR es un oligonucleótido CpG seleccionado del grupo que consiste en CpG 24555, CpG 10103, CpG7909 y CpG1018.
23. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 22, en la que el inhibidor de células inmunosupresoras es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado del grupo que consiste en sorafenib, dasatinib, imatinib, axitinib y malato de sunitinib y en la que el potenciador de células inmunoefectoras es tremelimumab.
24. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 22, en la que el inhibidor de células inmunosupresoras es un inhibidor de proteínas quinasas seleccionado del grupo que consiste en sorafenib, dasatinib, imatinib, axitinib y malato de sunitinib, y en la que el potenciador de células inmunoefectoras es un oligonucleótido CpG seleccionado del grupo que consiste en CpG24555, CpG10103, CpG7909 y CpG1018.
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