TWI650418B - 表現前列腺相關抗原類之載體類 - Google Patents

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Abstract

本發明提供(a)包含編碼二、三或多種免疫原性前列腺相關抗原(PAA)多肽之多抗原構建體的載體；(b)包含該載體之組成物；(c)與使用該載體及組成物來引發免疫反應或治療前列腺癌相關的方法。

Description

表現前列腺相關抗原類之載體類 相關申請案之引用
本申請案主張2013年11月1日提交申請之美國臨時申請案號61/898,966之優先權利益，其全部內容以引用方式併入本文。
參考之序列表
本申請案連同序列表以電子格式提交申請。該序列表係以.txt格式提供，其係在2014年10月3日創建，標題為“PC72055_SEQ_LISTING_ST25.txt”，大小為429KB。該包含在.txt檔案中之序列表為本專利說明書的一部分且其全部內容以引用方式併入本文。
本發明大抵關於免疫療法，且具體地說關於用於治療或預防腫瘤性疾病之疫苗和方法。
前列腺癌為全球已開發國家中男性最常被診斷出之癌 症中的第二名且為癌症相關死亡之首要原因的第四名。各種與前列腺相關之抗原(PAA)(諸如前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)及前列腺幹細胞抗原(PSCA))已被證明當與正常之相對部分比較時，其過量表現在前列腺癌細胞。因此，這些抗原代表經由使用以疫苗為根據之免疫療法來誘導針對表現該抗原之癌症的特異性免疫反應的可能目標。(見，例如Marrari,A.,M.lero等人(2007)"Vaccination therapy in prostate cancer."Cancer Immunol Immunother 56(4)：429-45)。
PSCA為具有123個胺基酸之膜蛋白。該天然之全長人PSCA係由SEQ ID NO：21之胺基酸1和4-125所組成(不含分別在第二和第三位置處的丙胺酸和絲胺酸殘基)。PSCA具有高組織特異性且表現在85%以上之前列腺癌標本中，格里森(Gleason)氏評分及雄激素獨立性愈高，則其表現水準隨著增加。其表現在80-100%之前列腺癌骨轉移患者中。
PSA為激肽釋放酶(kallikrein)樣絲胺酸蛋白酶，其全部由沿著前列腺之腺泡和導管排列的柱狀上皮細胞製造。PSA mRNA經轉譯為無活性之具有261個胺基酸的preproPSA前體。PreproPSA具有24個構成前區(信號多肽)和前多肽的額外殘基。釋出前多肽會產生具237個胺基酸之酶催化活性的成熟細胞外形式。該天然之人PSA的全長序列係由SEQ ID NO：15之胺基酸4至263所組成，PSA為器官特異性，因此，其係由良性前列腺增生 (BPH)組織、原發性前列腺癌組織及轉移性前列腺癌組織之上皮細胞產生。
PSMA(亦稱為葉酸水解酶1(FOLH1))係由750個胺基酸所組成。全長之人PSMA的胺基酸序列係提供在SEQ ID NO：1中。PSMA包括胞質結構域(胺基酸1-19)、跨膜結構域(胺基酸20-43)及細胞外結構域(胺基酸44-750)。PSMA被發現在前列腺癌細胞中之表現水準高於正常組織之1000倍。其大量表現在多種其他實體腫瘤，諸如結腸癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、胰臟癌、肺癌、腎癌以及黑色素瘤和肉瘤之新脈管系統上。因此，PSMA被認為不僅特異於前列腺癌細胞，亦為其他癌症之泛癌目標。
雖然已鑑定出大量與腫瘤相關之抗原且這些抗原中有許多已被開發作為以蛋白質為基底或以DNA為基底之疫苗來治療或預防癌症，迄今為止，大多數臨床試驗未能製造出治療產品。研發癌症疫苗的挑戰之一為癌症抗原通常係從自身衍生，因此，免疫原性差，因為免疫系統被自我調控成不會識別自身蛋白。因此，對於增進癌症疫苗之免疫原性或治療效果的方法是有需要的。
現已開發許多用於增進癌症疫苗之免疫原性或增進癌症疫苗之抗腫瘤效力的方法。這類方法之一涉及使用各種免疫調節劑，諸如TLR激動劑、TNFR激動劑、CTLA-4抑制劑及蛋白激酶抑制劑。
Toll樣受體(TLR)為表現在造血細胞和非造血細胞 上之第1型膜受體。TLR族中已鑑定出至少11個成員。這些受體之特徵為其識別致病有機體所表現之病原體相關分子模式(PAMP)的能力。這些先天免疫系統中之受體對隨後之後天免疫反應的極性施加控制。在TLR中，TLR9在免疫反應中的功能已被廣泛地研究。刺激TLR9受體可經由增加促炎細胞因子之產生並將共同刺激分子呈現給T細胞來指引抗原呈遞細胞(APC)朝向觸發強效之由TH1主導的T細胞反應。CpG寡核苷酸(TLR9之配體)被認為是一類強效免疫刺激因子。CpG療法已在小鼠中對多種腫瘤模型進行測試且持續證明能促進腫瘤之抑制或消退。
細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)為免疫球蛋白超家族的成員之一且表現在輔助T細胞之表面上。CTLA-4為CD28依賴性T細胞活化作用之負調節因子且作為適應性免疫反應之抑制檢查點。類似於T細胞共同刺激蛋白CD28，CTLA-4與抗原呈遞細胞上之CD80和CD86結合。CTLA-4傳送抑制信號給T細胞，而CD28傳送刺激信號。在許多疾病狀況中，針對人CTLA-4之人抗體被稱為是免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒和細菌感染，及用於治療癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。各種臨床前研究已證明藉由單株抗體阻斷CTLA-4可增強宿主針對免疫原性腫瘤之免疫反應，甚至可以拒絕腫瘤建立。兩種全長之人類抗人CTLA-4單株抗體(mAb)，易普利單抗(ipilimumab)(MDX-010)及替西木單抗(Tremelimumab)(亦稱為CP-675206)已在臨床試驗中被研究用來治療各 種類型之實體瘤。
腫瘤壞死因子(TNF)超家族為一組與特異性同源細胞表面受體(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族)緊密結合的細胞因子。腫瘤壞死因子超家族的成員透過由配體介導之三聚合化作用，招募數個細胞內適配子來活化多個信號轉導途徑，諸如細胞凋亡、NF-kB途徑、JNK途徑以及免疫和發炎反應。TNF超家族之實例包括CD40配體、OX40配體、4-1BB配體、CD27、CD30配體(CD153)、TNF-α、TNF-β、RANK配體、LT-α、LT-β、GITR配體及LIGHT。TNFR超家族包括，例如CD40、OX40、4-1BB、CD70(CD27配體)、CD30、TNFR2、RANK、LT-β R、HVEM、GITR、TROY及RELT。在TNF成員中，CD40激動劑，包括各種CD40激動性抗體(諸如全長之人激動劑CD40單株抗體CP870893)已被廣泛開發用於療法中。
蛋白激酶為一族催化蛋白質中之特定殘基磷酸化的酶。在臨床研究中已研究將許多激酶抑制劑用於抗癌療法中，該激酶抑制劑包括，例如MK0457、VX-680、ZD6474、MLN8054、AZD2171、SNS-032、PTK787/ZK222584、索拉非尼(Sorafenib)(BAY43-9006)、SU5416、SU6668 AMG706、扎克替馬(Zactima)(ZD6474)、MP-412、達沙替尼(Dasatinib)、CEP-701、(來他替尼(Lestaurtinib))、XL647、XL999、Tykerb、(拉帕替尼(Lapatinib))、MLN518(從前稱 為CT53518)、PKC412、ST1571、AMN107、AEE788、OSI-930、OSI-817、舒尼替尼(Sunitinib)蘋果酸鹽(Sutent；SU11248)、瓦他拉尼(Vatalanib)(PTK787/ZK222584)、SNS-032、SNS-314和阿西替尼(Axitinib)(AG-013736)。吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為兩種口服之EGFR-TKI。
本發明關於從黑猩猩腺病毒ChAd68基因組序列構建，以用於表現二或多種免疫原性PAA多肽之載體。該載體包含(1)C68 DNA序列，(2)用於表現二或多種免疫原性PAA多肽之多抗原構建體，及(3)控制該抗原產物(即，免疫原性PAA多肽)之轉錄和轉譯的調控序列。包含在該載體中之C68 DNA序列係藉由功能性删除一或多個病毒基因而從C68基因組序列衍生，但其足以製造感染性病毒顆粒。於特定之實施態樣中，用於該載體中之C68 DNA序列為在E1和E3區僅有一個功能性缺失的完整C68基因組。
該載體所攜帶之多抗原構建體包含編碼二或多種免疫原性PAA多肽之核苷酸序列，該免疫原性PAA多肽係選自免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。於一些實施態樣中，該載體所攜帶之多抗原構建體包含(1)編碼至少一種免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列，(2)編碼至少一種免疫原性PSA多肽之核苷酸序 列，及(3)編碼至少一種免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列。多抗原構建體亦可包含能由使該構建體所編碼之分別的PAA多肽表現之分隔子序列。分隔子序列之實例包括2A肽序列及IRES。於一些實施態樣中，該載體包含具有下列結構之一的多抗原構建體：(1)PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA；(2)PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA；(3)PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA；和(4)PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA。
於一些實施態樣中，該編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58之核苷酸1115至1825或包含SEQ ID NO：58之核苷酸1106-1825，該編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58之核苷酸1892-2257或包含SEQ ID NO：58之核苷酸1886-2257，而該編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58之核苷酸2333-4543或包含SEQ ID NO：58之核苷酸2324-4543。於一些特定之實施態樣中，該多抗原構建體包含選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：SEQ ID NO：33、34、35和36。於一特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含編碼SEQ ID NO：60之多肽序列的核苷酸序列。於另一特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含SEQ ID NO：61之核苷酸序列。
本發明亦提供包含該載體之組成物。於一些實施態樣中，該組成物為用於在哺乳動物(諸如小鼠、狗、猴或 人)中引發針對PAA之免疫反應的免疫原性組成物。於一些實施態樣中，該組成物為用於將哺乳動物(諸如人)免疫化以抑制異常細胞增殖、提供防止癌症發展之保護(作為預防性治療劑)，或治療與PAA過度表現相關之疾病，諸如癌症，尤其是前列腺癌(作為治療性治療劑)的疫苗組成物。
本發明進一步關於使用該載體或組成物在哺乳動物(尤其是人)中引發針對PAA之免疫反應或治療癌症，諸如前列腺癌的方法。於一些實施態樣中係將該載體或組成物(包括疫苗組成物)與一或多種能增進該載體或組成物之免疫原性或效果的免疫調節劑組合投予哺乳動物，尤其是人。於一些特殊之實施態樣中，該方法涉及共同投予本發明所提供之疫苗與至少一種免疫遏制細胞抑制劑和至少一種免疫效應子細胞增強劑。
第1圖. PJV7563載體之示意圖。
第2圖. 五種病毒2A盒之胺基酸比對。被跳過之甘胺酸-脯胺酸鍵以星號指明。
第3圖. 較佳之EMCV IRES的序列。轉譯起始位點係以星號指明。最小IRES元件不包括下方劃線之EMCV L蛋白的前5個密碼子。
第4圖. 此圖形顯示之小鼠群組的Kaplan-Meier生存曲線係來自評估舒尼替尼蘋果酸鹽(Sutent)及抗小鼠 CTLA-4單株抗體(選殖株9D9)在帶有皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠中對癌症疫苗(疫苗)之抗腫瘤效力的影響之代表性研究。
第5圖. 此圖形描繪INF ELISPOT之結果，此結果來自評估CpG7909和抗CD40抗體(Bioxcell # BE0016-2)對由癌症疫苗(rHER2)誘導之抗原特異性T細胞反應之效果的代表性研究。
第6圖. 此圖形描繪使用細胞內細胞因子染色分析來評估CpG7909對由癌症疫苗(PMED)誘導之免疫反應品質的免疫調節活性之代表性研究之結果，在該細胞內細胞因子染色分析中係測量細胞因子陽性CD8 T細胞。(*表明藉由Student氏T檢驗，P<0.05)
第7圖. 此圖形描繪使用細胞內細胞因子染色分析來評估CpG7909對由癌症疫苗(PMED)誘導之免疫反應品質的免疫調節活性之代表性研究之結果，在該細胞內細胞因子染色分析中係測量細胞因子陽性CD4 T細胞(第7圖)。(*表明藉由Student氏T檢驗，P<0.05)
第8圖. 此圖形描繪使用細胞內細胞因子染色分析來評估激動性抗鼠CD40單株抗體對由癌症疫苗(PMED)誘導之免疫反應品質的免疫調節活性之代表性研究之結果，在該細胞內細胞因子染色分析中係測量細胞因子陽性CD8 T細胞。(*表明藉由Student氏T檢驗，P<0.05)
第9圖. 此圖形描繪使用細胞內細胞因子染色分析來評估激動性抗鼠CD40單株抗體對由癌症疫苗(PMED)誘 導之免疫反應品質的免疫調節活性之代表性研究之結果，在該細胞內細胞因子染色分析中係測量細胞因子陽性CD4 T細胞。(*表明藉由Student氏T檢驗，P<0.05)
第10圖. 此圖形顯示小鼠群組之Kaplan-Meier生存曲線，其係來自評估低劑量舒尼替尼蘋果酸鹽(Sutent)在帶有自發性乳腺腫瘤之BALB/neuT小鼠中對癌症疫苗的抗腫瘤效力之影響的代表性研究。
第11圖. 此圖形顯示AdC68-734載體之基因組組織。CMV Enh/PRO=人巨細胞病毒前早期增強子及啟動子；tet op=四環素操縱子；T2A=明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna)2A；F2A=口蹄疫病毒2A；SV40 pPA=猿猴病毒40多聚腺苷酸化信號；LITR=左側末端反向重複子；RITR=右側末端反向重複子。
第12圖. 點狀繪圖顯示藉由流式細胞術所測得之經表現三聯抗原之AdC68載體轉導的A549細胞表面上之PSMA和PSCA的表現。
第13圖. 經AdC68載體感染之A549的溶胞產物的西方點墨圖。
本發明之詳細說明
A. 定義
術語“佐劑”係指能夠增強、加速或延長由疫苗免疫原誘發之免疫反應的物質。
術語“激動劑”係指促進(誘導、引起、增強或增加)另一分子或受體之活性的物質。術語激動劑包含結合受體(例如抗體、來自另一物種之天然配體的同源物)之物質及促進受體功能，但不與其結合(例如經由活化相關蛋白質)之物質。
術語“拮抗劑”或“抑制劑”係指部分或完全阻斷、抑制或中和另一個分子或受體之生物活性的物質。
術語“共同投予”係指在治療期間將二或多種作用劑投予同一個體。該二或多種作用劑可被包含在單一配製劑中，從而同時投予。或者，該二或多種作用劑可被包含在物理分隔之配製劑中並分開(依序或同時)投予個體。術語“同步地投予”或“同時投予”係指該第一作用劑的投予與該第二作用劑的投予在時間上相互重疊，而術語“依序地投予”或“依序投予”係指該第一作用劑的投予與該第二作用劑的投予在時間上不重疊。
術語“細胞溶質性”意指在宿主細胞表現編碼特定多肽之核苷酸序列後，所表現之多肽保留在宿主細胞內。
術語“簡併變異體”係指與參考核苷酸序列相比較下具有鹼基取代，但由於遺傳密碼之簡併性，其編碼與參考核苷酸序列相同之胺基酸序列的核苷酸序列。
術語“有效量”係指投予哺乳動物之足以在該哺乳動物中引起所需效果的量。
術語指定多肽之“片段”係指較指定之多肽短且與該指定之多肽的序列共享100%同一性的多肽。
在二或多種核酸或多肽序列的背景下，術語“完全相同的”或“同一性”百分比係指當比較和比對最大對應時，相同之二或多種序列或子序列或具有特定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸。
術語“免疫效應子細胞增強劑”或“IEC增強劑”係指能夠增加或增強哺乳動物之一或多種免疫效應子細胞類型的數目、品質或功能的物質。免疫效應子細胞之實例包括細胞溶解性CD8 T細胞、CD40 T細胞、NK細胞及B細胞。
術語“免疫調節劑”係指能改變(例如抑制、減少、增加、增強或刺激)哺乳動物之先天、體液或細胞性免疫系統之任何組分的運作之物質。因此，術語“免疫調節劑”包含如本文所定義之“免疫效應子細胞增強劑”和如本文所定義之“免疫遏制細胞抑制劑“，以及影響哺乳動物之免疫系統的其他組分之物質。
術語“免疫反應”係指脊椎動物宿主之免疫系統對特定物質(諸如抗原或免疫原)的任何可檢測之反應，包括，但不限於先天免疫反應(例如Toll受體傳信級聯反應之活化)、由細胞介導之免疫反應(例如由T細胞，諸如抗原特異性T細胞及免疫系統之非特異性細胞介導之反應)和體液免疫反應(例如由B細胞介導之反應，諸如產生和分泌抗體到血漿、淋巴及/或組織液中)。免疫反應之實例包括Toll樣受體活化之改變(例如增加)、淋巴因子(例如細胞因子(例如Th1、Th2或Th17型細胞因子) 或趨化因子)表現或分泌、巨噬細胞活化、樹突細胞活化、T細胞(例如CD4+或CD8+ T細胞)活化、NK細胞活化、B細胞活化(例如抗體產生及/或分泌)、免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽))與MHC分子結合、誘導細胞毒性T淋巴球(“CTL”)反應、誘導B細胞反應(例如製造抗體)和免疫系統細胞(例如T細胞和B細胞)擴充(例如細胞群生長)及抗原呈遞細胞之抗原處理和呈現增加。術語“免疫反應”亦包含脊椎動物免疫系統之一或多種組分在體外對特定物質(諸如抗原或免疫原)的任何可檢測之反應。
術語“免疫原性”係指不論物質是單獨存在或與載體連接，存有或不存有佐劑時，物質引起、引發、刺激或誘導免疫反應，或改善、增進、增加或延長預先存在之針對特定抗原的免疫反應之能力。
術語“免疫原性PSA多肽”係指針對人PSA蛋白或針對表現人PSA蛋白之細胞的免疫原性多肽。
術語“免疫原性PSCA多肽”係指對人PSCA蛋白或對表現人PSCA蛋白之細胞具致免疫性的多肽。
術語“免疫原性PSMA多肽”係指對人PSMA蛋白或對表現人PSMA蛋白之細胞具致免疫性的多肽。
術語“免疫原性PAA多肽”係指如上文所定義之“免疫原性PSA多肽”、“免疫原性PSCA多肽”或“免疫原性PSMA多肽。
術語“免疫遏制細胞抑制劑”或“ISC抑制劑”係指 能夠減低或抑制哺乳動物之免疫遏制細胞的數目或功能的物質。免疫遏制細胞之實例包括調節性T細胞(“T reg”)、髓源性遏制子細胞及腫瘤相關之巨噬細胞。
在將物質(諸如治療劑或免疫調節劑)投予哺乳動物(包括人)的背景下，術語“皮內投予”或“經皮內投予”係指將物質投遞在哺乳動物皮膚之真皮層中。哺乳動物之皮膚係由三層所組成-表皮、真皮及皮下組織層。表皮為相對薄、堅韌之皮膚外層。表皮中大多數的細胞為角質化細胞。皮膚之下一層，真皮為較厚的纖維和彈性組織層(主要由膠原蛋白、彈性蛋白及原纖蛋白製成)，其賦予皮膚柔韌性和強度。真皮層中含有神經末梢、汗腺及油(皮脂)腺體、毛囊和血管。真皮層之厚度根據皮膚的位置而有所變化。人體中，眼皮上之真皮層厚度為約0.3毫米，而背部之真皮層厚度為約3.0毫米。皮下組織層係由脂肪和容納較大之血管和神經的結締組織所組成。此層之厚度在整個身體及人與人之間有些不同。術語“皮內投予”係指將物質投遞至真皮層的內部。相反地，“皮下投予”係指將物質投予入皮下組織層，而“局部投予”係指將物質投予在皮膚的表面上。
術語“局部投予(local administration)”或“經局部投予(administered locally)”包含各如上文所定義之“局部投予(topical administration)”、“皮內投予”和“皮下投予”。此術語亦包含“腫瘤內投予”，其係指將物質投予在腫瘤的內部。局部投予旨在允許投予部位周 圍具有高局部濃度一段時間，直到已取得投予物質之全身性生物分佈，而“全身性投予”旨在使投予之物質被吸收到血液中，並透過循環系統分佈在整個身體之器官或組織而迅速達到全身性暴露。
術語“哺乳動物”係指哺乳動物綱之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；非人靈長類動物，諸如猴子；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、天竺鼠；家養動物，諸如貓、狗、兔、牛、綿羊、山羊、馬和豬；及圈養之野生動物，諸如獅子、老虎、大象，等。
術語“與膜結合”係指宿主細胞表現編碼特定多肽之核苷酸序列後，該表現之多肽係結合、連接或以其他方式與該細胞之細胞膜聯結。
術語“腫瘤病症”係指其中細胞以異常高且不受控制之速率增殖的狀況，該細胞增殖之速率超過且與周圍正常組織之速率不協調。其通常會導致稱為“腫瘤”之固體損傷或團塊。此術語包含良性和惡性腫瘤病症。可與本發明中之術語“癌症”互換使用之術語“惡性腫瘤病症”係指其特徵為腫瘤細胞有能力擴散到身體之其他位置(稱為“轉移”)的腫瘤病症。術語“良性腫瘤病症”係指其中該腫瘤細胞缺乏轉移能力之腫瘤病症。
術語“可操作地連接”係指並列，其中該組分被描述為處於允許彼等以彼等所欲之方式發揮功能的關係。“可操作地連接”至轉殖基因的控制序列與該轉殖基因的連接方式為使該轉殖基因係在與控制序列相容的條件下表 現出。
術語“醫藥上可接受之賦形劑”係指免疫原性或疫苗組成物中除了該活性成分(例如抗原、編碼抗原之核酸、免疫調節劑或佐劑)外，與活性成分相容且不會在投予該組成物之個體中引起顯著之不良影響的物質。
本文中，術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”可互換使用，且係指任何長度之聚合型胺基酸，其可包括經編碼和非經編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸和具有經修飾之多肽骨幹的多肽。
術語“預防(preventing”或prevent)”係指(a)防止病症發生或(b)延緩病症發病，或病症之症狀發作。
術語“前列腺相關抗原”(或PAA)係指特異表現在前列腺腫瘤細胞上或由腫瘤細胞以較相同組織類型之非腫瘤細胞更高的頻率或密度表現之TAA(如本文所定義者)。PAA之實例包括PSA、PSCA及PSMA。
在多肽的背景下，術語“經分泌出的”係指宿主細胞表現編碼該多肽之核苷酸序列後，所表現之多肽分泌至宿主細胞外。
當用於描述免疫調節劑(諸如蛋白激酶抑制劑)之量時，術語“亞適量”係指當將該免疫調節劑單獨投予患者時，低於該能對接受治療之疾病產生所需療效的最低需求量的免疫調節劑之量。
術語“治療(treating、treatment或treat)”係指廢止病症、降低病症之嚴重性或降低病症之症狀的嚴重性或發 生頻率。
術語“腫瘤相關抗原”或“TAA”係指由腫瘤細胞特異表現，或或由腫瘤細胞以較相同組織類型之非腫瘤細胞更高的頻率或密度表現的抗原。腫瘤相關抗原可為正常情況下宿主不會表現之抗原；其可為宿主正常表現之分子發生突變、截短、錯誤折疊或以其他方式異常表現；其可與正常表現之分子完全相同，但表現水準異常高；或者其可在異常之背景或環境中表現。例如，腫瘤相關抗原可為蛋白或蛋白片段、複合式碳水化合物、神經節苷脂、半抗原、核酸，或這些或其他生物分子之任何組合。
術語“疫苗”係指用於投予哺乳動物以引發針對特定抗原之免疫反應的免疫原性組成物。
術語“載體”係指能夠轉運或轉移外來核酸分子的核酸分子。該外來核酸分子稱為“插入子”或“轉殖基因”。載體通常係由插入子和作為載體骨幹之較大的序列所組成。術語“載體”包含表現載體及轉錄載體。術語“表現載體”係指能在目標細胞中表現該插入子的載體。其通常含有驅動該插入子表現之控制序列，諸如增強子、啟動子和終止子序列。術語“轉錄載體”係指能夠被轉錄但不能被轉譯的載體。轉錄載體係用於擴增其插入子。根據載體之結構或起源，載體之主要類型包括質粒載體、黏粒載體、噬菌體載體(諸如λ噬菌體)、病毒載體(諸如腺病毒(Ad)載體)和人工染色體。
B. 包含多抗原構建體之載體
於一態樣中，本發明提供從黑猩猩腺病毒ChAd68之基因組構建之用於表現二或多種免疫原性PAA多肽的病毒載體。文獻中黑猩猩腺病毒ChAd68亦稱為猿猴腺病毒25、C68、Chad68、SAdV25、PanAd9或Pan9。為了方便起見，本專利說明書中黑猩猩腺病毒ChAd68可稱為“C68”，而從黑猩猩腺病毒ChAd68之基因組構建的病毒載體則稱為“C68載體”。C68之全長基因組序列可從Genbank取得(登錄編號為AC_000011.1)且提供在SEQ ID NO：57中。此外，C68之全長基因組序列及腺病毒基因E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、I1、I2、L3、L4和L5的位置提供在美國專利第6,083,716號中。
本發明提供之C68載體包含(1)C68 DNA序列，及(2)用於表現二或多種免疫原性PAA多肽的多抗原構建體。該載體亦可含有控制抗原產物之轉錄和轉譯的非天然調控序列。非天然調控序列係指非為該C68基因組之一部分的序列。C68 DNA序列、多抗原構建體及調控序列係可操作地彼此連接。
該C68載體可為複製型、條件複製型或複製缺陷型。複製型C68載體可在典型之宿主細胞(即，通常能夠被腺病毒感染之細胞)中複製。與野生型腺病毒相比較，複製型病毒載體之腺病毒基因組中可具有一或多個不會抑制病毒在宿主細胞中複製的突變(例如一或多個缺失、插入及/或取代)。條件複製型C68載體為已經過遺傳工程處理成 能在預定之條件下複製的病毒載體。例如，複製必需基因功能(例如由腺病毒早期區編碼之基因功能)可以可操作地連接至可誘導性、阻遏性或組織特異性轉錄調控序列，例如啟動子。複製缺陷型C68載體為由於，例如缺少一或多個複製必需基因功能或區，使得載體無法在典型的宿主細胞(尤其是那些在欲接受該載體感染之人體中的宿主細胞)中複製，因而需要補充一或多種複製所需要之基因功能或病毒基因組區的病毒載體。
載體可用於選殖或表現免疫原性PAA多肽，或用於遞送組成物(諸如疫苗)中之多抗原構建體給宿主細胞或宿主動物(諸如人類)。於一些特殊之實施態樣中，本發明提供選自由下列所組成之群組的載體(i)包含或由SEQ ID NO：58之核苷酸序列所組成的載體；(ii)包含或由SEQ ID NO：58之核苷酸9至34811所組成的載體；及(iii)包含或由SEQ ID NO：63之核苷酸序列所組成的載體。
本發明所提供之C68載體亦包含本發明所具體描述或舉例說明之載體的功能性變體。“功能性變體”係指相對於本發明所具體描述或舉例說明之載體(“母載體”)的序列而言含有突變(例如加入、缺失或取代)，但保留母載體之功能或性質的載體。例如，功能性變體可包含對應於本發明中舉例說明之母載體的密碼子優化之序列。
B1. C68 DNA序列
術語“C68 DNA序列”係指為C68基因組序列之一部分的DNA序列。包含在載體中之C68 DNA序列係經由從C68基因組序列功能性刪除一或多個病毒基因或基因組區而從C68基因組序列導出。術語“功能性删除”意指從病毒移除或改變(例如經由突變或修改)足量之基因區，從而使該基因區域不再能製造基因表現之功能性產物或以其他方式執行其正常功能。通常不需要删除整個基因區來破壞複製必需的基因功能。然而，為了在C68基因組中提供用於一或多個轉殖基因的足夠空間，除去一或多個基因區的大部分是較理想的。雖然删除遺傳物質是較佳的，經由加入或取代來使遺傳物質發生突變亦適合用於破壞基因功能。
於一些實施態樣中，該載體之C68 DNA序列係藉由功能性刪除腺病毒前早期基因E1a及後早期基因E1b之全部或足夠之部分而從C68基因組序列衍生。於其他實施態樣中，除了功能性刪除E1a及E1b外，亦可功能性刪除一或多個其他基因，諸如後早期基因E2a、後早期基因E3、E4、晚期基因L1至L5中之任一者、中期基因IX及IVa2。因此，用於構建本發明之載體的C68 DNA序列可僅在E1中含有缺失。或者，可以刪除整個基因或刪除部分基因的任一組合方式來有效破壞其生物活性。例如，於一示例性載體中，C68 DNA序列是經由功能性刪除E1基因和E4基因、或功能性删除E1、E2a和E3基因、或功能性删除E1和E3基因、或功能性删除E1、E2a和E4基因、功能性删除或不刪 除E3基因，等來從C68基因組序列衍生。此外，這類刪除可與其他突變，諸如溫度敏感性突變組合使用，以取得所需之結果。於一特定之實施態樣中，C68 DNA序列為僅在E1和E3區中具有功能性缺失的整個C68基因組。
於一些特殊之實施態樣中，功能性刪除E1基因係經由删除SEQ ID NO：57之核苷酸577-3403或經由删除SEQ ID NO：57之核苷酸456-3012來完成，而功能性删除E3基因係經由刪除SEQ ID NO：57之核苷酸27125-31831或經由删除SEQ ID NO：57之核苷酸27812-31330來完成。於其他特殊之實施態樣中，包含在載體中之C68 DNA序列包含SEQ ID NO：57之核苷酸3013-27811。再於其他特殊之實施態樣中，包含在載體中之C68 DNA序列包含SEQ ID NO：57之核苷酸3013-27811及31331-36519。
多抗原構建體可插在腺病毒基因組之任何缺失區中。多抗原構建體亦可插在現存之基因區中，以破壞該區之功能。於一些實施態樣中，該多抗原構建體係插在缺失之E1基因處。
B2. 多抗原構建體
術語“多抗原構建體”係指編碼二或多種PAA多肽之核酸分子或序列。本發明中，這類分子或序列亦可稱為“多抗原疫苗”或“多抗原質粒”。多抗原構建體可攜帶兩種編碼核苷酸序列，其中該編碼核苷酸序列各自表現個別免疫原性PAA多肽。本發明中，這類構建體亦稱為“雙 抗原構建體”、“雙抗原疫苗”或“雙抗原質粒”。多抗原構建體亦可攜帶三種編碼核苷酸序列，其中該編碼核苷酸序列各自表現個別免疫原性PAA多肽。本發明中，這類構建體亦稱為“三聯抗原構建體”、“三聯抗原疫苗”或“三聯抗原質粒”。由多抗原構建體編碼之個別PAA多肽對同一抗原(諸如PSMA、PSA或PSCA)可為免疫原性。例如，雙抗原構建體可表現兩種不同之對PSMA而言均為免疫原性的PAA抗原。由多抗原構建體編碼之個別PAA多肽可對不同抗原為免疫原性，例如，雙抗原構建體可分別表現二種對PSMA和PSA為免疫原性的PAA多肽。較佳地，多抗原構建體編碼二或多種對不同抗原為免疫原性的個別PAA多肽。
於一些實施態樣中，該多抗原構建體編碼至少兩種免疫原性PAA多肽，該至少兩種免疫原性PAA多肽為下列任一種組合：1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；2)免疫原性PSMA多肽和免疫原性PSCA多肽；及3)免疫原性PSA多肽和免疫原性PSCA多肽。
於一些特殊之實施態樣中，該多抗原構建體編碼至少一種免疫原性PSMA多肽、至少一種免疫原性PSA多肽及至少一種免疫原性PSCA多肽。
由多抗原構建體表現之免疫原性PSMA多肽可為細胞溶質型、分泌型或與膜結合型，但較佳為與膜結合型。於一些實施態樣中，該免疫原性PSMA多肽包含選自由下列 所組成之群組的胺基酸序列：1)SEQ ID NO：1之胺基酸序列，2)SEQ ID NO：1之胺基酸15-750；3)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；4)SEQ ID NO：5之胺基酸序列；5)SEQ ID NO：7之胺基酸序列；6)SEQ ID NO：3之胺基酸4-739；7)SEQ ID NO：5之胺基酸4-739；8)SEQ ID NO：7之胺基酸4-739；9)SEQ ID NO：9之胺基酸序列；及10)SEQ ID NO：9之胺基酸4-739。
由多抗原構建體表現之免疫原性PSA多肽可為細胞溶質型、分泌型或與膜結合型，但較佳為細胞溶質型。於一些實施態樣中，該免疫原性PSA多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：1)SEQ ID NO：15之胺基酸27-263；2)SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及3)SEQ ID NO：17之胺基酸4-240。
由多抗原構建體表現之免疫原性PSCA多肽可為全長之人PSCA蛋白。於一些實施態樣中，該免疫原性PSCA多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：1)SEQ ID NO：21之胺基酸序列；2)SEQ ID NO：21之胺基酸2-125；及3)SEQ ID NO：21之胺基酸4-125。
於一些其他實施態樣中，該多抗原構建體編碼至少一種免疫原性PSA多肽、至少一種免疫原性PSCA多肽及至少一種免疫原性PSMA多肽，其中該免疫原性PSA多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240，其中該免疫原性PSCA多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列或SEQ ID NO：21之胺基酸2-125，且其中該免疫原性PSMA多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：1)SEQ ID NO：1之胺基酸15-750；2)SEQ ID NO：9之胺基酸4-739；及3)SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
於一些特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含編碼SEQ ID NO：60或64之胺基酸序列的核苷酸序列。
於一些特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含：(i)編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列，(ii)編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列，及(iii)編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列，其中：
(1)該編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組(i)SEQ ID NO：18之核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO：20之核苷酸序列；(iii)包含SEQ ID NO：18之核苷酸10-720的核苷酸序列；(iv)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸1115-1825的核苷酸序列；(v)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸1106-1825的核苷酸序列；及(vi)提供在上述 (i)至(v)中之任一核苷酸序列的簡併變體。
(2)該編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組(i)SEQ ID NO：22之核苷酸序列；(ii)包含SEQ ID NO：22之核苷酸10-375的核苷酸序列；(iii)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸1892-2257的核苷酸序列；(iv)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸1886-2257的核苷酸序列；及(v)提供在上述(i)至(iv)中之任一核苷酸序列的簡併變體。
(3)該編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組(i)SEQ ID NO：2之核苷酸43-2250的核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO：6之核苷酸序列；(iv)SEQ ID NO：8之核苷酸序列；(v)SEQ ID NO：10之核苷酸序列；(vi)包含SEQ ID NO：4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；(vii)包含SEQ ID NO：6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；(viii)包含SEQ ID NO：8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；(ix)包含SEQ ID NO：10之核苷酸10-2217的核苷酸序列；(x)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸2333-4543的核苷酸序列；(xi)包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸2324-4543的核苷酸序列；及(xii)提供在上述(i)至(xi)中之任一核苷酸序列的簡併變體。
於另一特定之實施態樣中，該多抗原構建體包含編碼 免疫原性PSA多肽之核苷酸序列、編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列，及編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列，其中：該編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸1106-1825；該編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：62之核苷酸1886-2257；且該編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列包含SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：63之核苷酸2324-4543。
為了使來自載體所攜帶之單一多抗原構建體的分別免疫原性PAA多肽表現，插入序列係包含在編碼個別免疫原性PAA多肽(即，PSA、PSCA及PSMA多肽)之序列間。這些插入序列使下游之免疫原性PAA多肽能夠分別轉譯。本專利說明書中，這類插入序列被稱為“分隔子序列”。可用於共同表現多種來自單一載體之多肽的任何序列可作為本發明所提供之載體中的分隔子序列。有用之分隔子序列的實例包括內部核糖體進入位點(IRES)及2A肽序列。
2A肽及2A肽樣序列(亦稱為裂解盒或CHYSEL(順式水解酶組件))約長20個胺基酸，其具有經高度保守之羧基端D-V/I-EXNPGP基序(motif)(第2圖)。該序列在自然中很少，最常在病毒中找到，諸如口蹄疫病毒(FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬鐵士古病毒(teschovirus)(PTV)及明脈扁刺蛾β四體病毒(TAV)(Luke,G.A.,P.de Felipe， 等人(2008)."Occurrence,function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042)。藉著以2A為基礎之多抗原表現策略，在單一開放閱讀框中將編碼多個標靶抗原之基因連接在一起，藉由2A序列隔開。將整個開放閱讀框選殖入具有單一啟動子和終止子的載體中。當將構建體遞送至宿主細胞時，編碼該多種抗原之mRNA被轉錄和轉譯為單一多聚蛋白。在轉譯2A序列期間，核糖體略過C端甘胺酸和脯胺酸之間的鍵。核糖體略過的行為像從下游釋出上游之共轉譯自催化“裂解”。關於在共同表現多種多肽之載體中使用各種2A肽序列的一般信息可在Andrea L.Szymczak & Darrio AA Vignali：Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.Expert Opinion Biol.Ther.(2005)5(5)627-638中找到，其揭示內容以引用方式併入本文。在兩個蛋白抗原之間納入2A序列導致在上游多肽之C端上添加20個胺基酸及在下游蛋白之N端添加1個胺基酸(脯胺酸)。在此方法的改編版中，可在2A盒之N端納入蛋白酶裂解位點，從而使得到處存在之蛋白酶將該2A盒從上游蛋白裂解(Fang,J.,S.Yi，等人(2007)."An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6)：1153-1159)。
可用於本發明中之特異性2A肽序列之實例揭示於Andrea L.Szymczak & Darrio AA Vignali：Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.Expert Opinion Biol.Ther.(2005)5(5)627-638中且提供於表1中。
內部核糖體進入位點(IRES)為某些RNA分子之5'非轉譯區中所發現的RNA元件(第3圖)(Bonnal,S.,C.Boutonnet等人(2003)。"IRESdb：the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31(1)：427-428)。他們吸引真核核糖體至RNA，以促進下游開放閱讀框架轉譯。不同於正常之細胞性7-甲基鳥苷帽依賴性轉譯，IRES介導之轉譯可從RNA分子內部深處之AUG密碼子開始。該高度有效之方法可被開發用於多順反子表現載體 中(Bochkov,Y.A.and A.C.Palmenberg(2006)."Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3)：283-284,286,288)。較佳之EMCV IRES(pIRES)的序列提供於第3圖和SEQ ID NO：59中。最小EMCV IRES(mIRES)排除如第3圖所示之下方劃線的EMCV L蛋白的前5個密碼子。通常，當2個分開之開放閱讀框被IRES分開時，2個轉殖基因係插在啟動子和轉錄終止子之間的載體中。當該構建體被投遞至宿主細胞中時可轉錄編碼兩個轉殖基因之單一長轉錄子。第一個ORF將以傳統的帽依賴性方式被轉譯，終止於IRES之終止密碼子上游。第二個ORF將使用IRES，以帽獨立性方式轉譯。以此方式，從具單一表現盒之載體轉錄之單一mRNA可產生兩種獨立的蛋白質。於一些實施態樣中，該多抗原構建體包含含有SEQ ID NO：59之核苷酸1-553的EMCV IRES。
通常，在多抗原構建體上的2種免疫原性PAA多肽編碼序列之間只需要一個分隔子序列。在多抗原構建體上之分隔子序列及編碼PAA多肽之核苷酸序列的順序顯示於式(I)中：PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
其中：(i)PAA1、PAA2及PAA3各自為編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列、編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列或編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列，唯該 PAA1、PAA2及PAA3編碼不同的PAA多肽，且(ii)SS1及SS2為分隔子序列且可為相同或相異。
在一些實施態樣中，該載體包含式(I)之多抗原構建體，其中：(i)PAA1為編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列；(ii)PAA2為編碼免疫原性PSCA或PSMA多肽之核苷酸序列(其中PAA2為編碼免疫原性PSCA之核苷酸序列，而PAA3為編碼免疫原性PSMA之核苷酸序列，或是反過來)；(iii)SS1為2A肽序列；且(iv)SS2為2A肽序列或IRES。
於一些特殊之實施態樣中，該多抗原構建體具有選自由下列所組成之群組的結構：(1)PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA；(2)PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA；(3)PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA；及(4)PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA
於一特定之實施態樣中，該載體包含具有式(I)之結構的多抗原構建體：PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
其中：(i)PAA1為編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列且包含SEQ ID NO：58之核苷酸1115至1825或包含SEQ ID NO：58或63之核苷酸1106至1114； (ii)PAA2為編碼免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列且包含SEQ ID NO：58之核苷酸1892至2257或包含SEQ ID NO：58或63之核苷酸1886至2257；(iii)PAA3為編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列且包含SEQ ID NO：58之核苷酸2333至4543或包含SEQ ID NO：58或63之核苷酸2324至4543；(iv)SS1為編碼T2A之核苷酸序列；且(v)SS2為編碼F2A之核苷酸序列。
該多抗原構建體亦可包含位於編碼免疫原性PAA多肽(即，免疫原性PSA、PSCA或PSMA多肽)之核苷酸序列與下游分隔子序列之間的連接子序列。一種這類連接子序列的實例為編碼甘胺酸-絲胺酸之核苷酸序列。
於一些特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含編碼SEQ ID NO：60之胺基酸序列或編碼SEQ ID NO：61之胺基酸序列的核苷酸序列。於一特殊之實施態樣中，該多抗原構建體包含選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：SEQ ID NO：61之核苷酸序列、SEQ ID NO：65之核苷酸序列、SEQ ID NO：66之核苷酸序列及該核苷酸序列中任一序列之簡併變體。
B3. 調控序列
除了上述之分隔子序列和連接子序列外，該載體可包含其他非天然調控序列以驅動經編碼之PAA多肽的有效表現。調控序列之實例包括：(1)轉錄起始、終止、啟動 子及增強子序列；(2)有效之RNA加工信號，諸如剪接及多腺苷酸化之信號；(3)穩定細胞質mRNA之序列；(4)增進轉譯效率之序列(即，Kozak共有序列(consensus sequence))；(5)增進蛋白質之穩定性的序列；及(6)增進蛋白質分泌之序列。可用於本發明所提供之載體中以驅動在哺乳動物細胞中有效表現的啟動子系統之實例包括SV40啟動子、雞B肌動蛋白啟動子、人延伸因子啟動子、人巨細胞病毒(CMV)啟動子、猿CMV啟動子、鼠CMV啟動子、偽狂犬病啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)啟動子、磷酸甘油酸激酶啟動子、鼠白血病病毒LTR啟動子、禽白血病病毒LTR啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、莫洛尼(moloney)鼠白血病病毒LTR啟動子、纖溶酶原活化物抑制劑啟動子、CYR61、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白啟動子、小鼠磷酸烯醇丙酮酸羧激酶啟動子、牛β-乳球蛋白啟動子、牛泌乳素啟動子、泛素C啟動子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子。轉錄終止信號之實例包括SV40多聚腺苷酸化(多聚A)；牛生長激素多聚A；兔B球蛋白多聚A；HSV胸苷激酶、糖蛋白B及糖蛋白D；HPV E和L，及合成之終止子。
於一些實施態樣中，該C68載體包含人巨細胞病毒(CMV)啟動子，隨意地帶有CMV增強子及SV40多聚A。
C. 包含攜帶多抗原構建體之載體的組成物(載體組成 物)
本發明亦提供包含由本發明提供之載體的組成物(本文中“載體組成物”)。該載體組成物可用於在哺乳動物(包括人)體外或體內引發針對PAA蛋白之免疫反應。該載體組成物可僅包含載體，或可進一步包含賦形劑。
於一些實施態樣中，該載體組成物為醫藥組成物，其包含由本發明提供之載體及醫藥上可接受之賦形劑。用於醫藥組成物之合適的賦形劑為本技藝所已知。該賦形劑可包括水溶液、非水溶液、懸浮液及乳液。非水性賦形劑之實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油，諸如橄欖油及可注射之有機酯，諸如油酸乙酯。水性賦形劑之實例包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩衝之介質。合適之賦形劑亦包括協助細胞攝入載體之作用劑。
於一些實施態樣中，該醫藥組成物為用於投予人類，以抑制異常細胞增殖，從而防止癌症發展(作為預防性)，或用於治療與PAA過度表現相關之癌症(作為治療性)，或用於引發針對特殊之人PAA(諸如PSMA、PSA和PSCA)的免疫反應之疫苗組成物。該疫苗組成物可進一步包含一或多種佐劑。可包含在疫苗組成物中之佐劑的實例提供於下文中。
D. 載體和載體組成物之用途
於其他態樣中，本發明提供使用載體或包含上述載體之組成物的方法。
於一態樣中，本發明提供在哺乳動物(尤其是人)中引發針對PAA之免疫反應的方法，其包含投予哺乳動物有效量之(1)含有多抗原構建體之載體，或(2)包含這類載體之組成物。
於另一態樣中，本發明提供抑制人體中異常之細胞增殖的方法，其中該異常之細胞增殖與PAA過度表現有關。該方法包含投予哺乳動物有效量之(1)含有編碼二或多種免疫原性PAA多肽的多抗原構建體之載體，或(2)包含這類載體之組成物。於一些實施態樣中，該方法係用於抑制人體中前列腺中之異常細胞增殖。於一特殊之實施態樣中，本發明提供抑制過度表現PSMA之前列腺中細胞異常增殖的方法。於一些實施態樣中，本發明提供治療人體中前列腺癌之方法，其包含投予人體有效量之(1)含有多抗原構建體之載體，或(2)包含這類載體之組成物。於一較佳之實施態樣中，該多抗原構建體為編碼免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽和免疫原性PSCA多肽之三聯抗原構建體。
該載體或載體組成物可藉由本技藝中已知之多種方法投予動物，包括人。適合之方法的實例包括：(1)肌肉內、皮內、表皮內、靜脈內、動脈內、皮下或膜內投予，(2)口服投予，及(3)局部施用(諸如眼內、鼻內和陰道內施用)。一種皮內或表皮內投予核酸疫苗組成物的特定方法涉及使用基因槍遞送技術，諸如由PowderMed銷售之粒子介導之表皮遞送(Particle Mediated Epidermal Delivery)(PMEDTM)疫苗遞送裝置。用於肌肉內投予核酸疫苗的另一特殊方法為先注射，再進行電穿孔。
欲在指定之方法中投予的載體或載體組成物的有效量可由熟習本技藝之人士很容易地测定，且將取決於許多因素。於治療癌症(諸如前列腺癌)之方法中，可被視為決定有效量的因素包括，但不限於：(1)欲治療之個體，包括個體的免疫狀態和健康，(2)欲治療之癌症的嚴重程度或階段，(3)表現之特定的免疫原性PAA多肽，(4)所需之防護或治療的程度，(5)投予方法和時間表，(6)所使用之配製劑，及(7)共同投予之其他治療劑(諸如佐劑或免疫調節劑)。例如，當該核酸疫苗組成物被配製成水溶液並藉由皮下注射針注射或氣動注射(pneumatic injection)投予時，該載體之有效量可在2微克/劑量至10毫克/劑量之範圍內，而當該核酸被製備成經塗層之金粒並使用基因槍技術投遞時，該載體之有效量僅為16毫微克/劑量至16微克/劑量。
本發明所提供之載體或載體組成物(包括疫苗組成物)可與一或多種佐劑一起使用。合適之佐劑的實例包括：(1)水包油乳液製劑(常有或不帶有其他特異性免疫刺激劑，諸如胞壁醯多肽或細菌細胞壁組分)，諸如MF59TM(含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80及0.5%山梨糖醇三油酸酯)和SAF(含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP)；(2)皂苷佐劑，諸如QS21、STIMULONTM(劍橋生物科學，麻州 Worcester)、Abisco®(瑞典，Isconova)或Iscomatrix®(澳洲Commonwealth血清實驗室)；(3)完全弗氏(Freund)佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(4)含有CpG基序(即，含有至少一個CG二核苷酸)之寡核苷酸，其中該胞嘧啶為未經甲基化的(例如Krieg,Vaccine(2000)19：618-622；Krieg,Curr Opin Mol Ther(2001)3：15-24；WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919及WO 98/52581)；及(5)金屬鹽，包括鋁鹽(諸如明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁)；(12)皂素和水包油乳劑(例如WO 99/11241)。
本發明所提供之載體或載體組成物可與一或多種免疫調節劑一起使用。於一進一步之態樣中，本發明提供治療哺乳動物(尤其是人)之前列腺癌的方法，該方法包含投予該哺乳動物：(1)有效量之本發明所提供的載體、載體組成物或疫苗；(2)有效量之至少一種免疫遏制細胞之抑制劑(ISC抑制劑)；及(3)有效量之至少一種免疫效應子細胞增強劑(IEC增強劑)。此方法在本發明中亦稱為“以疫苗為基礎之免疫治療攝生法”(或“VBIR”)。
IEC增強劑和ISC抑制劑可藉由任何合適之方法和途徑來投予，包括(1)全身性投予，諸如靜脈內、肌肉內或口服投予，和(2)局部投予，諸如皮內和皮下投予。當適當或合適時，局部投予通常優於全身投予。任何IEC增強劑和ISC抑制劑之局部投予可在哺乳動物身體之任何適 合局部投予藥物的位置進行；然而，更佳地，這些免疫調節劑係在靠近疫苗引流淋巴結處局部投予。
來自單一IEC增強劑類別之二或多種特異性IEC增強劑(舉例而言，二種CTLA-拮抗劑)可與ISC抑制劑組合投予。此外，可將來自二或多種不同IEC增強劑類別之二或多種特異性IEC增強劑(舉例而言，一種CTLA-4拮抗劑及一種TLR激動劑，或一種CTLA-4拮抗劑及一種PD-1拮抗劑)一起投予。類似地，可將來自單一ISC抑制劑類別之二或多種特異性ISC抑制劑(舉例而言，二或多種蛋白激酶抑制劑)與IEC增強劑組合投予。此外，可將來自二或多種不同ISC抑制劑類別之二或多種特異性ISC抑制劑(舉例而言，一種蛋白激酶抑制劑及一COX-2抑制劑)一起投予。
該載體或載體組成物可與所使用之任一或全部免疫調節劑(即，ISC抑制劑和IEC增強劑)同時或依序投予。類似地，當使用二或多種免疫調節劑時，其可相對於彼此同時或依次投予。於一些實施態樣中，載體或載體組成物相對於一種免疫調節劑而言為同時投予(例如在混合物中)，但相對於一或多種額外之免疫調節劑而言為依序投予。共同投予載體或載體組成物和免疫調節劑可包括其中投予該疫苗和至少一種免疫調節劑，從而使其各自同時存在於投予部位(諸如疫苗引流淋巴結)的情況，即使該抗原和免疫調節劑並未同時投予。共同投予疫苗和免疫調節劑亦可包括其中該疫苗或免疫調節劑從投予部位被清除， 但至少一種該清除之疫苗或免疫調節劑的細胞效果會持續存在於投予位置(諸如疫苗引流淋巴結)至少持續到有一或多種額外之免疫調節劑投予至該投予位置的情況。在其中將核酸疫苗與CpG組合投予的情況中，疫苗和CpG可包含在單一配製劑中並藉由任何合適之方法一起投予。於一些實施態樣中，在共製劑(混合物)中之核酸疫苗和CpG係藉由肌肉內注射，加上電穿孔法投予。
任何ISC抑制劑均可與由本發明所提供之載體或載體組成物組合使用。ISC抑制劑類別之實例包括PD-1/PD-L1拮抗劑、蛋白激酶抑制劑、環氧合酶-2(COX-2)抑制劑、磷酸二酯酶第5型(PDE5)抑制劑和DNA交聯劑。PD-1/PD-L1拮抗劑之實例包括抗PD-1和PD-L1單株抗體。COX-2抑制劑之實例包括塞來昔布(celecoxib)和羅非昔布(rofecoxib)。PDE5抑制劑之實例包括阿伐那非(avanafil)、羅地那非(lodenafil)、米羅那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、優地那非(udenafil)和扎普司特(zaprinast)。DNA交聯劑之實例為環磷醯胺。特定蛋白激酶抑制劑之實例詳細描述於下文中。
術語“蛋白激酶抑制劑”係指作為蛋白激酶之選擇性或非選擇性抑制劑的任何物質。術語“蛋白激酶”係指催化三磷酸腺苷之末端磷酸化物轉移到蛋白受質中之酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的酶。蛋白激酶包括受體酪胺酸 激酶及非受體酪胺酸激酶。受體酪胺酸激酶之實例包括表皮生長因子受體(EGFR)(例如EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、INSR(胰島素受體)、IGF-IR、IGF-Ⅱ 1R、IRR(胰島素受體相關受體)、PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、CSF-1R、FGFR 1-4、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、LTK(白血球酪胺酸激酶)、ALK(間變性淋巴瘤(anaplastic lymphoma)激酶)、ROR1-2、MUSK、AATYK1-3及RTK 106。非受體酪胺酸激酶之實例包括BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack及LIMK。於本發明所提供之以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中，該蛋白激酶抑制劑係以亞適量投予哺乳動物。術語“亞適量”係指當在單一療法(即，其中單獨投予該蛋白激酶抑制劑，而無任何其他治療劑)中投予用於標的腫瘤病症之酪胺酸激酶抑制劑時，該劑量之量低於最低有效劑量。
適合用於以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中之特異性蛋白激酶抑制劑之實例包括拉帕替尼、AZD2171、ET180CH3、靛玉紅-3'-肟(indirubin-3'-oxime)、NSC-154020、PD 169316、槲皮素(quercetin)、羅可威汀(roscovitine)、曲西立濱(triciribine)、ZD1839、5- 碘殺結核菌素(5-Iodotubercidin)、艾達弗汀(adaphostin)、阿洛辛(aloisine)、歐特包隆(alsterpaullone)、胺基染料木素(aminogenistein)、API-2、芹苷元(apigenin)、牛蒡苷元(arctigenin)、ARRY-334543、阿西替尼、AY-1022989、AZD 2171、雙吲哚馬來醯亞胺(Bisindolylmaleimide)IX、CCI-779、白屈菜紅(chelerythrine)、DMPQ、DRB、依地福新(edelfosine)、ENMD-981693、厄斯他汀(erbstatin)類似物、厄洛替尼、法舒地爾(fasudil)、吉非替尼(ZD1839)、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羥基法舒地爾、肯包隆(kenpaullone)、KN-62、KY12420、LFM-A13、木犀草素(luteolin)、LY294002、LY-294002、馬洛托辛(mallotoxin)、ML-9、MLN608、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奧羅莫星(olomoucine)、羥吲哚I、PD 153035、PD 98059、根皮苷(phloridzin)、白皮杉醇(piceatannol)、鬼臼苦素(picropodophyllin)、PKI、PP1、PP2、PTK787/ZK222584、PTK787/ZK-222584、普瓦蘭諾(purvalanol)A、斥消靈(rapamune)、雷帕黴素(rapamycin)、Ro 31-8220、咖馬林(rottlerin)、SB202190、SB203580、西羅莫司(sirolimus)、SL327、SP600125、星形孢菌素(staurosporine)、STI-571、SU1498、SU4312、SU5416、司馬沙尼(semaxanib)、SU6656、SU6668、syk抑制劑、TBB、TCN、酪胺酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)AG1024、酪胺酸磷酸化抑制劑 AG490、酪胺酸磷酸化抑制劑AG825、酪胺酸磷酸化抑制劑AG957、U0126、W-7、渥曼青黴素(wortmannin)、Y-27632、扎克替馬、ZM252868、吉非替尼、舒尼替尼蘋果酸鹽、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼(canertinib)、司馬沙尼、瓦他拉尼、索拉非尼、伊馬替尼、達沙替尼、來氟米特(leflunomide)、凡德他尼(vandetanib)及尼洛替尼。
於一些實施態樣中，該蛋白激酶抑制劑為多激酶抑制劑，其為作用在一種以上之特定激酶的抑制劑。多激酶抑制劑之實例包括伊馬替尼、索拉非尼、拉帕替尼、BIRB-796、和AZD-1152、AMG706、扎克替馬、MP-412、索拉非尼、達沙替尼、來他替尼、XL647、XL999、拉帕替尼、MLN518(亦稱為CT53518)、PKC412、ST1571、AEE788、OSI-930、OSI-817、舒尼替尼蘋果酸鹽、厄洛替尼、吉非替尼、阿西替尼、波舒替尼、西羅莫司及尼羅替尼。於一些特殊之實施態樣中，該酪胺酸激酶抑制劑為舒尼替尼、索拉非尼或其醫藥上可接受之鹽或衍生物(諸如蘋果酸鹽或甲苯磺酸鹽)。
舒尼替尼蘋果酸鹽(其係由輝瑞公司銷售，商品名為索坦(SUTENT))在化學上的描述為具N-〔2-(二乙胺基)乙基〕-5-〔(Z)-(5-氟-1,2-二氫-2-合氧基-3H-亞吲哚-3-基)甲基〕-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧醯胺之丁二酸、羥基、(2S)-化合物(1：1)。該化合物、其合成方法及特定之多晶型描述於下列刊物中：美國專利第 6,573,293號、美國專利刊物第2003-0229229、2003-0069298和2005-0059824號，及J.M.Manley,M.J.Kalman,B.G.Conway,C.C.Ball,J.L Havens and R.Vaidyanathan,"Early Amidation Approach to 3-〔(4-amido)pyrrol-2-y1〕-2-indolinones," J.Org.Chew.68,6447-6450(2003)。舒尼替尼及其L-蘋果酸鹽之配製劑描述於PCT刊物第WO2004/024127號中。舒尼替尼蘋果酸鹽已在美國被核准用於治療患有不能手術切除之局部晚期或轉移性疾病的患者之胃腸道間質瘤、晚期腎細胞癌和漸進之分化良好的胰腺神經內分泌腫瘤。用於人類胃腸道間質瘤(GIST)和晚期腎細胞癌(RCC)之舒尼替尼蘋果酸鹽的推薦劑量為在4週之治療期間每天口服一次50毫克，隨後停藥2週(計劃表4/2)。用於胰腺神經內分泌腫瘤(pNET)之舒尼替尼蘋果酸鹽的推薦劑量為每日口服一次37.5毫克。
在以疫苗為基礎之免疫治療攝生法中可將舒尼替尼蘋果酸鹽在單一劑量或數個劑量中經口投予。通常，將舒尼替尼蘋果酸鹽連續投遞二、三、四或更多個每週劑量，隨後為約1或2週、或更久之“停藥”期，其中不投遞酸舒尼替尼舒尼替尼蘋果酸鹽。於一實施態樣中，將劑量投遞約4週，停藥2週。於另一實施態樣中，將舒尼替尼蘋果酸鹽投遞二週，停藥1週。然而，亦可在整個治療期中持續投遞劑量，無“停藥”期。在以疫苗為基礎之免疫治療攝生法中經口投予人之舒尼替尼蘋果酸鹽的有效量通常低於每 人每劑量40毫克。例如，可經口投予每人每天37.5、31.25、25、18.75、12.5、6.25毫克。於一些實施態樣中，可經口投予每人每劑量在1至25毫克之範圍內的舒尼替尼蘋果酸鹽。於一些其他實施態樣中，可經口投予每人每劑量在6.25、12.5或18.75毫克之範圍內的舒尼替尼蘋果酸鹽。其他劑量攝生法和變化是可以預見且將透過醫師之指導來測定。
以商品名NEXAVAR銷售之索拉非尼甲苯磺酸鹽亦為多激酶抑制劑。其化學名稱為4-(4-{3-〔4-氯-3-(三氟甲基)苯基〕脲基}苯氧基)-N-甲基吡啶-2-羧醯胺。其已被美國核准用於治療原發性腎癌(晚期腎細胞癌)及晚期原發性肝癌(肝細胞癌)。建議之每日劑量為每日口服兩次400毫升。在本發明所提供之以疫苗為基礎之免疫治療攝生法中，經口投予之索拉非尼甲苯磺酸鹽的有效量通常為每天每人低於400毫克。於一些實施態樣中，經口投予之索拉非尼甲苯磺酸鹽的有效量係在每人每天10至300毫克之範圍內。於一些其他實施態樣中，經口投予之索拉非尼甲苯磺酸鹽的有效量為每人每天10至200毫克，諸如每人每天10、20、60、80、100、120、140、160、180或200毫克。
以商品名INLYTA銷售之阿西替尼為VEGF受體1、2和3之選擇性抑制劑。其化學名稱為(N-甲基-2-〔3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基〕-苯甲醯胺。其已被核准在個人先前之全身療法失敗後用於治療晚 期腎細胞癌。起始劑量為每日口服5毫克兩次。劑量調整可根據個體之安全性和耐受性進行。在本發明所提供之以疫苗為基礎之免疫治療攝生法中，口服投予之阿西替尼的有效量通常低於每天投予5毫克兩次。於一些其他實施態樣中，口服投予之阿西替尼的有效否係介於每天投予1至5毫克兩次。於一些其他實施態樣中，口服投予之阿西替尼的有效量係在每天投予1、2、3、4或5毫克之間。
在該以疫苗為基礎之免疫治療攝生法中可使用任何IEC增強劑。其可為小分子或大分子(諸如蛋白質、多肽、DNA、RNA和抗體)。可使用之IEC增強劑的實例包括腫瘤壞死因子受體(TNFR)激動劑、CTLA-4拮抗劑、TLR激動劑、計劃性細胞死亡蛋白1(PD-1)拮抗劑(諸如抗PD-1抗體CT-011)及計劃性細胞死亡蛋白1配體1(PD-L1)拮抗劑(諸如BMS-936559)、淋巴細胞活化基因3(LAG3)拮抗劑及T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(TIM-3)拮抗劑。特異性TNFR激動劑、CTLA-4拮抗劑及TLR激動劑之實例詳細提供於下文中。
TNFR激動劑。
TNFR激動劑之實例包括OX40，4-1BB(諸如BMS-663513)，GITR(諸如TRX518)及CD40之激動劑。特異性CD40激動劑之實例詳細描述於下文中。
CD40激動劑為結合細胞上之CD40受體且有能力增加一或多種CD40或CD40L之相關活性的物質。因此，CD40“激動劑”包含CD40“配體”。
CD40激動劑之實例包括CD40激動性抗體、片段CD40激動性抗體、CD40配體(CD40L)及CD40L之片段和衍生物，諸如寡聚型者(例如二價、三聚CD40L)、含有融合蛋白者及其變體。
用於本發明之CD40配體包括任何肽、多肽或蛋白質、或編碼可以結合並活化細胞上之一或多個CD40受體之肽、多肽或蛋白質的核酸。合適之CD40配體描述於，例如美國專利案第6,482,411號；美國專利案第6,410,711號；美國專利案第6,391,637號；和美國專利案第5,981,724號，這些專利和申請案，以及其中揭示的CD40L序列全部以引用方式併入本文。雖然人CD40配體較宜用於人的療法中，來自任何物種之CD40配體均可用於本發明中。在用於其他動物物種方面(諸如在獸醫之實施態樣中)，與接受治療之動物相匹配的CD40配體物種將是較佳的。於某些實施態樣中，該CD40配體為gp39肽或蛋白寡聚體，包括天然形成之gp39肽、多肽或蛋白質寡聚物，以及包含寡聚化序列之gp39肽、多肽、蛋白質(及編碼核酸)。雖然於本發明之某些態樣中，寡聚物，諸如二聚體、三聚體和四聚體為較佳者，於本發明之其他態樣中考慮使用較大之寡聚體結構，只要該寡聚結構保留其結合並活化一或多種CD40受體之能力。
於某些其他實施態樣中，該CD40激動劑為抗CD40抗體或其抗原結合片段。該抗體可為人、人化或部分人嵌合型抗-CD40抗體。特異性抗CD40單株抗體之實例包括G28- 5、mAb89、EA-5或S2C6單株抗體及CP870893。於一特殊之實施態樣中，該抗CD40激動劑抗體為CP870893或達西珠單抗(dacetuzumab)(SGN-40)。
CP-870,893為已在臨床上調查作為抗腫瘤療法之全人激動性CD40單株抗體(mAb)。CP870,893之結構和製備方法揭示於WO 2003041070(其中該抗體係藉由內部鑑定之“21.4.1”鑑定)中。CP-870,893之重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中。在臨床試驗中，CP870,893係經由靜脈輸注投予通常在每次輸注0.05至0.25毫克/公斤之範圍內的劑量。在第I期臨床研究中，CP-870893之最大耐受劑量(MTD)估計為0.2毫克/公斤，該劑量限制性毒性包括第3級CRS和第3級蕁麻疹。〔Jens Ruter等人：Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors.Cancer Biology & Therapy 10：10,983-993；November 15,2010.〕。在本發明所提供之以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中，可經由皮內、皮下或局部途徑投予CP-870893。較佳地，其係經由皮內途徑投予。該攝生法中欲投予之CP870893的有效量一般低於0.2毫克/公斤，通常在0.01毫克至0.15毫克/公斤，或0.05毫克至0.1毫克/公斤之範圍內。
達西珠單抗(亦稱為SGN-40或huS2C6；CAS編號88-486-59-9)為另一已在臨床試驗中被研究用於緩慢進展性淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤之抗CD40 激動劑抗體。在臨床試驗中，每週經由靜脈內途徑投予劑量在2毫克/公斤至16毫克/公斤之範圍內的達西珠單抗。在本發明所提供之以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中，可經由皮內、皮下或局部途徑投予達西珠單抗。較佳地，其係經由皮內途徑投予。在以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中，欲投予之達西珠單抗的有效量一般低於16毫克/公斤，通常在0.02毫克至14毫克/公斤，或0.5毫克至8毫克/公斤或1-5毫克/公斤之範圍內。
CTLA-4抑制劑。
用於本發明所提供之以疫苗為基礎的免疫治療攝生法中的合適抗CTLA-4拮抗劑包括，但不限於抗CTLA-4抗體(諸如人抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人化抗CTLA-4抗體、單株抗CTLA-4抗體、多株抗CTLA-4抗體、嵌合型抗CTLA-4抗體、抗CTLA-4結構域抗體)、抗CTLA-4抗體之片段(諸如單鏈抗-CTLA-4片段、重鏈抗-CTLA-4片段和輕鏈抗CTLA-4片段)及激動該共刺激通道之CTLA-4抑制劑。於一些實施態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利姆單抗(Ipilimumab)或替西木單抗(Tremelimumab)。
易普利姆單抗(亦稱為MEX-010或MDX-101)，商品名為YERVOY，是一種人抗人CTLA-4抗體。易普利姆單抗亦可以其CAS登記號477202-00-9稱呼，且在PCT刊物第WO 01/14424號(其全部內容以引入方式納入本文中)中揭示為抗體10DI。包含易普利姆單抗的醫藥組成物之實例 提供於PCT刊物第WO2007/67959號中。易普利姆單抗在美國被核准用於治療不能手術切除的或轉移性黑色素瘤。作為單一療法之易普利姆單抗的推薦劑量為每3週經由靜脈內投予3毫克/公斤，共4個劑量。於本發明所提供之方法中，易普利姆單抗係經由局部途徑投予，尤其是經由皮內或皮下投予。局部投予之易普利姆單抗的有效量通常係在每人每劑量5至200毫克之範圍內。於一些實施態樣中，易普利姆單抗之有效量係在每人每劑量10至150毫克之範圍內。於一些特殊之實施態樣中，易普利姆單抗之有效量為約每人10、25、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑量。
替西木單抗(亦稱為CP-675,206)為全人IgG2單株抗體且具有CAS編號745013-59-6。美國專利案第6,682,736號(其全部內容以引用方式併入本文且用於所有目的)中所揭示之替西木單抗為抗體11.2.1。替西木單抗之重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別列舉於SEQ IND NO：42和43中。替西木單抗已在臨床試驗中被研究用於治療各種腫瘤，包括黑色素瘤和乳癌；其中替西木單抗係以單一劑量或多劑量形式每4週或12週經由靜脈內途徑投予在0.01和15毫克/公斤之範圍內的劑量。本發明所提供之攝生法中係經由局部途徑投予替西木單抗，尤其是經由皮內或皮下途徑投予。經由皮內或皮下途徑投予之替西木單抗的有效量通常係在每人5至200毫克/劑量之範圍內。於一些實施態樣中，替西木單抗之有效量為每人每劑量在10-150毫克/劑 量之範圍內。於一些特殊之實施態樣中，替西木單抗之有效量為每人約10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑量。
Toll樣受體(TLR)激動劑。
術語“toll樣受體激動劑”或“TLR激動劑”係指作為toll樣受體(TLR)之激動劑的化合物。這包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10及TLR11之激動劑或彼等之組合。除非另外指明，對TLR激動劑化合物之引用可包括該化合物之任何醫藥上可接受之形式，包括任何異構體(例如非對映異構體或對映異構體)、鹽、溶劑化物、多晶型物及類似物。尤其是，若化合物為光學活性，對該化合物之引用可包括各個化合物對映異構體及該對映異構體之外消旋混合物。另外，化合物可被識別為一或多個特足TLR之激動劑(例如TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR7/8激動劑)。
於一些實施態樣中，該TLR激動劑為TLR9激動劑，尤其是CpG寡核苷酸(或CpG.ODN)。CpG寡核苷酸為一種短核酸分子，其含有胞嘧啶，其後為藉由磷酸鍵連接之鳥嘌呤，其中該胞嘧啶之嘧啶環為未經甲基化的。CpG基序為一種鹼基之樣式，其中包含未經甲基化之中央CpG，此中央CpG被至少一個鄰接中央CpG(3'和5'側)的鹼基包圍。CpG寡核苷酸包括D和K寡核苷酸二者。整個CpG寡核苷酸可為未經甲基化的，或者部分CpG寡核苷酸可為未經甲基化的。用於本發明所提供之方法中的CpG寡核苷酸 之實例包括那些揭示於美國專利案第6194388、6207646、6214806、628371、6239116和6339068號中者。
用於本發明所提供之方法中的特殊CpG寡核苷酸之實例包括：5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'(CpG7909)；5'TCGTCGTTITTCGGTGCTTTT3'(CpG24555)；及5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'(CPG10103)。
CpG7909(合成之24聚體單股寡核苷酸)已被廣泛研究以單一療法之形式用於治療癌症，及與化療劑和用於該針對癌症和傳染性疾病之疫苗的佐劑組合來治療癌症。據報導，CpG7909之單一靜脈內劑量的耐受性良好，沒有臨床影響且在高達1.05毫克/公斤之劑量下無顯著毒性，而經由皮下投予單一劑量之CpG7909可具有0.45毫克/公斤之最大耐受劑量(MTD)，其具有肌痛和體質影響的劑量限制性毒性。〔見Zent,Clive S，等人：Phase I clinical trial of CpG 7909(PF-03512676)in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia.Leukemia and Lymphoma,53(2)：211-217(7)(2012)〕。在本發明所提供之攝生法中，可藉由注射或經由任何其他合適的方法將CpG7909投予入肌肉內。較佳地，局部投予在疫苗引流淋巴結附近，尤其是經由皮內或皮下投予。為了與核酸疫苗(諸如DNA疫苗)一起使用，較佳地，可將CpG與疫苗共同配製在單一配製劑中，並經由肌肉內注射加上電穿孔來投予。經由肌肉內、皮內或皮下投予之CpG7909的有 效量通常在10微克/劑量至10毫克/劑量的範圍內。於一些實施態樣中，CpG7909之有效量係在0.05毫克至14毫克/劑量的範圍內。於一些特殊之實施態樣中，CpG7909之有效量為約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1毫克/劑量。其他CpG寡核苷酸，包括CpG 24555和CpG10103，可以類似的方式和劑量水準投予。
於一些特殊之實施態樣中，本發明提供增強用於治療人體之腫瘤性疾病之疫苗的免疫原性或治療效果的方法，其包含投予人(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自下列群組之蛋白激酶抑制劑：索拉非尼甲苯磺酸鹽、舒尼替尼蘋果酸鹽、阿西替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿西替尼、波舒替尼、坦羅莫司(temsirolismus)或尼羅替尼，且其中該至少一種IEC增強劑係選自CTLA-4抑制劑、TLR激動劑或CD40激動劑。於一些較佳之實施態樣中，攝生法包含投予人(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自下列群組之蛋白激酶抑制劑：阿西替尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽或舒尼替尼蘋果酸鹽，且其中該至少一種IEC增強劑為選自易普利姆單抗或替西木單抗之CTLA-4抑制劑。於一些更佳之實施態樣中，該攝生法包含投予人(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少二種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少 二種IEC增強劑為替西木單抗及選自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR激動劑。
於一些其他實施態樣中，本發明提供治療人前列腺癌的方法，其包含投予人(1)有效量之能引發針對人PAA之免疫反應的疫苗，(2)有效量之至少一種ISC抑制劑，及(3)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自下列群組之蛋白激酶抑制劑：索拉非尼甲苯磺酸鹽、舒尼替尼蘋果酸鹽、阿西替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿西替尼、波舒替尼、坦羅莫司或尼羅替尼，且其中該至少一種IEC增強劑係選自CTLA-4抑制劑、TLR激動劑或CD40激動劑。於一些較佳之實施態樣中，該方法包含投予人(1)有效量之能引發針對人PAA之免疫反應的疫苗，(2)有效量之至少一種ISC抑制劑，及(3)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自下列群組之蛋白激酶抑制劑：索拉非尼甲苯磺酸鹽、舒尼替尼蘋果酸鹽或阿西替尼，且其中該至少一種IEC增強劑為選自易普利姆單抗或替西木單抗之CTLA-4抑制劑。
於一些更特別之實施態樣中，該方法包含投予人(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少二種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少二種IEC增強劑為替西木單抗及選自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR激動劑。
額外之治療劑。
本發明所提供之以疫苗為基礎的免疫治療攝生法可進一步包含額外之治療劑。可使用之癌症治療劑有很多種，包括化療劑及激素治療劑。術語“化療劑”係指可導致癌細胞死亡或干擾癌細胞生長、分裂、修復及/或功能的化學或生物物質。特殊之化療劑的實例包括：醋酸阿比特龍(abiraterone acetate)、卡巴他(cabazitaxel)、地加瑞克(degarelix)、狄諾塞麥(denosumab)、多西紫杉醇(docetaxel)、恩雜魯胺(enzalutamide)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、潑尼松(prednisone)、西普留塞-T(sipuleucel-T)及二氯化鐳223。術語“激素治療劑”係指抑制或排除激素製造，或抑制或抵消激素對癌細胞之生長及/或存活的影響之化學或生物物質。特殊之激素治療劑的實例包括亮丙瑞林、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、組胺瑞林(histrelin)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)及尼魯米特(nilutamide)。本發明所提供之VBIR亦可與其他療法組合使用，包括：(1)除去全部或部分參與製造激素之器官或腺體(諸如卵巢、睾丸、腎上腺和腦垂體)的手術方法，和(2)放射治療，其中係使患者之器官或腺體接受量足以抑制或消除標的激素製造的放射線照射量。
E. 實施例
下列實施例係用於說明本發明之某些實施態樣。它們 不應被解釋為在任何方面限制本發明的範圍。從上述討論和這些實施例，熟習本技藝之人士可確定本發明之必要特徵，且在不偏離本發明之精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種改變和修改，以使本發明適應各種用途和條件。
實施例1. 源自人PSMA蛋白之細胞溶質型、分泌型及與膜結合形式的抗原
1A. 設計免疫原性PSMA多肽
根據天然人PSMA蛋白序列構建編碼細胞溶質型、分泌型及經修飾形式之免疫原性PSMA多肽的DNA構建體並測試彼等誘導抗腫瘤效應子免疫反應之能力。人PSMA抗原之各個形式的結構和製備方法提供於下。
1A1. 人PSMA細胞溶質型抗原。設計細胞溶質形式之免疫原性PSMA多肽以在該免疫原性多肽一旦被表現時將其保留在細胞內。除去人PSMA之胞質結構域(胺基酸1至19)及跨膜結構域(胺基酸20至43)，產生由SEQ ID NO：1之人PSMA的胺基酸44至750(胞外結構域或ECD)所組成之細胞溶質型PSMA多肽。最佳Kozak序列“MAS”可以添加在多肽之N端以增強表現或促進選殖。
1A2. 人PSMA分泌型抗原。設計分泌型免疫原性PSMA多肽以在該免疫原性多肽一旦被表現時將該多肽分泌至細胞外。該分泌型多肽係由SEQ ID NO：1之人PSMA的胺基酸44至750(ECD)和Ig κ分泌元件所組成，該Ig κ 具有胺基酸序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD且在N端具有二-胺基酸連接子(AA)，以在該PSMA抗原一旦被表現時將其分泌最大化。
1A3. 與膜結合型人PSMA抗原。設計與膜結合型免疫原性PSMA多肽以將該多肽穩定在細胞表面上。除去人PSMA蛋白之前14個胺基酸，所產生之免疫原性多肽係由SEQ ID NO：1之人PSMA的胺基酸15至750所組成。該由SEQ ID NO：1之天然人PSMA蛋白的胺基酸15至750所組成並與天然人PSMA蛋白分享100%之序列同一性的免疫原性多肽在本發明中亦稱為“經修飾之人PSMA”、“經修飾之hPSMA”或“hPSMAmod”抗原。亦產生下列三種為經修飾之人PSMA抗原(SEQ ID NO：9)之變體的免疫原性PSMA多肽(稱為“經修飾之重排的PSMA抗原”)：(1)具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的經修飾之重排的PSMA抗原1；(2)具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的經修飾之重排的PSMA抗原2；及(3)具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的經修飾之重排的PSMA抗原3。
該編碼經修飾之重排的PSMA抗原1、2和3之核苷酸序列分別列在SEQ ID NO：4、6和8中。
1B. 用於表現PSMA抗原之DNA質粒的製備方法
將編碼PSMA細胞溶質型、PSMA分泌型及經修飾之 PSMA抗原的DNA構建體個別選殖入適合用於在動物中進行體內試驗的PJV7563載體中(第1圖)。將在PJV7563載體中之DNA的兩股進行測序，以確認設計完整性。
從序列確認之選殖株製造大規模之質粒DNA製劑(Qiagen/CsCl)。藉由高260/280比、高超螺旋/帶切口之DNA比、低內毒素量(<10U/毫克DNA)及陰性初始污染菌來確認質粒DNA之品質。
1C. 在哺乳動物細胞中表現PSMA構建體
藉由流式細胞儀(FACS)測定PSMA細胞溶質型、分泌型和經修飾之抗原的表現。以編碼各種免疫原性PSMA多肽之PJV7563 PMED載體轉染哺乳動物293細胞。三天後，先以小鼠抗PSMA抗體，再以與螢光素共軛結合(FITC)之大鼠抗小鼠二級抗體為293細胞染色。結果呈現於表2中。報告之數據為相相對於陰性對照組之平均螢光強度(MFI)，其確認經修飾之人PSMA抗原表現在細胞表面上。
實施例2. 設計各種免疫原性PSA多肽
3A. 構建免疫原性PSA多肽
類似於實施例1中用於三種不同的免疫原性PSMA多肽形式(例如細胞溶質型、與膜結合型及分泌型)之描述，亦根據人PSA序列設計三種形式之免疫原性PSA多肽。經由刪除分泌信號和前結構域(胺基酸1至24)來構建由天然人PSA之胺基酸25至261所組成的細胞溶質型免疫原性PSA多肽。細胞溶質型免疫原性PSA多肽的胺基酸序列提供於SEQ ID NO：17中。分泌型PSA多肽為天然之全長人PSA(胺基酸1至261)。經由將細胞溶質型免疫原性PSA多肽(天然人PSA之胺基酸25至261)連接至人PSMA跨膜結構域(人PSMA之胺基酸15至54)來構建與膜結合型免疫原性PSA多肽。
3B. 巴斯德(Pasteur)及HLA A24小鼠中的免疫反應
研究設計。依實施例1中之描述在初次免疫/加強免疫/加強免疫攝生法(每次疫苗接種之間間隔兩週)中使用實施例3A中所提供之PMED，以表現各種PSA抗原之DNA將8至10週齡之HLA A2巴斯德小鼠或HLA A24小鼠免疫化。在末次免疫後7天，在干擾素-γ(IFN γ)ELISPOT分析及三明治ELISA中測量抗原特異性T細胞和B細胞反應。
表3中所示之ELISpot數據指明細胞溶質型和與膜結合型免疫原性PSA多肽均能夠誘導能識別該經腺病毒轉導以表現細胞溶質型PSA抗原(SKmel5-Ad-PSA)之人腫瘤細 胞，但不能識別經腺病毒轉導以表現eGFP(SKmel5-AD-EGFP)之細胞的T細胞。此兩種抗原亦引發對PSA蛋白質之反應。PSA分泌型抗原無法誘導識別SKmel5-Ad-PSA或PSA蛋白兩者之T細胞。SFC>50被認為是陽性。
表4中之數據證明，分泌型和與膜結合型免疫原性PSA多肽能夠誘導抗PSA抗體反應。
實施例3. 構建多抗原疫苗構建體
本實施例中描述使用不同策略來構建包含多抗原構建體的質粒。這些質粒與pPJV7563分享相同的一般質粒骨幹。除非另外具體指明，包含在多抗原構建體中之基因編碼(1)SEQ ID NO：9之免疫原性PSMA多肽，(2)包含SEQ ID NO：21之胺基酸2至125的免疫原性PSCA多肽，及 (3)SEQ ID NO：17之免疫原性PSA多肽。
實施例3A. 包含雙重抗原構建體之質粒
3A1. 使用多個啟動子構建質粒
質粒460(PSMA/PSCA雙啟動子)。使用位點定向誘變、PCR和限制性片段插入的技術構建質粒460。首先，根據製造商之議定計劃(Quickchange試劑盒，加州聖塔克拉拉，Agilent科技公司)，使用定點誘變，以MD5和MD6引物在質粒5259中之CMV啟動子的上游引入Kpn I限制位點。其次，使用攜帶Kpn I限制位點之引物(MD7和MD8)，藉由PCR，從質粒5166擴增由最小CMV啟動子、人PSMA及兔子β球蛋白轉錄終止子所組成之表現盒。以KpnI分解PCR擴增子並插入該新引入之經小牛腸鹼性磷酸酶(CIP)處理的質粒5259之Kpn I位點中。
3A2. 使用2A肽構建雙抗原構建體
質粒451(PSMA-T2A-PSCA)。使用重疊PCR和限制片段交換的技術構建質粒451。首先，使用質粒5166作為模板，並使用引物119和117藉由PCR來擴增該編碼人PSMA之胺基酸15至750的基因。該編碼全長人PSCA之基因係使用質粒5259作為模板，並使用引物118和120，藉由PCR來擴增。PCR造成PSMA之3'端和PSCA之5'端增加重疊的TAV2A(T2A)序列。將擴增子混合在一起，並使用引物119和120，藉由PCR擴增。以Nhe I和Bgl Ⅱ分解PSMA- T2A-PSCA擴增子，並將其插入經類似方法分解之質粒5166中。在PSMA和T2A盒之間包含一個甘胺酸-絲胺酸連接子，以促進高裂解效率。
質粒454(PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR和限制片段交換的技術創建質粒454。首先，使用質粒5259作為模板，並使用引物42和132藉由PCR來擴增該編碼全長人PSCA之基因。以BamH I分解該擴增子，並將其插入經類似方法分解，經CIP處理之質粒5300中。在PSCA和FMDV2A(F2A)盒之間包含一個甘胺酸-絲胺酸連接子，以促進高裂解效率。
質粒5300(PSA-F2A-PSMA)。使用重疊PCR和限制片段交換的技術構建質粒5300。首先，使用引物MD1和MD2，藉由PCR從質粒5297擴增該編碼PSA之胺基酸25至261的基因。該編碼人PSMA之胺基酸15至750之基因係使用引物MD3和MD4，藉由PCR從質粒5166擴增。PCR造成PSA之3'端和PSMA之5'端增加重疊的F2A序列。將擴增子混合在一起，並藉由PCR延伸。以Nhe I和Bgl Ⅱ分解PSMA-F2A-PSCA擴增子，並將其插入經類似方法分解之質粒pPJV7563中。
3A3. 使用內部核糖體進入位點之雙抗原構建體
質粒449(PSMA-mIRES-PSCA)。使用重疊PCR和限制片段交換的技術構建質粒449。首先，使用引物124和123，藉由PCR從質粒5259擴增編碼全長人PSCA之基因。 使用引物101和125，藉由PCR從pShuttle-IRES擴增最小EMCV IRES。將重疊擴增子混合在一起，並使用引物101和123藉由PCR擴增。以Bgl Ⅱ和BamH I分解IRES-PSCA擴增子並將其插入經Bgl Ⅱ分解，經CIP處理之質粒5166中。為了解決IRES內之自發性突變，以來自pShuttle-IRES之等效片段置換含有Avr Ⅱ至Kpn I序列之IRES。
質粒603(PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR和無縫選殖之技術構建質粒603。使用引物SD546和SD547，藉由PCR從質粒455擴增該編碼全長人PSCA之基因，該基因之3'端連接較佳之EMCV IRES。使用引物SD548和SD550，藉由PCR從質粒5166擴增該編碼人PSMA之胺基酸15至750的基因。根據製造商之說明書(Invitrogen公司，加州Carlsbad)，藉由無縫選殖將兩個重疊的PCR擴增子插入以Nhe I和Bgl Ⅱ分解之pPJV7563中。
質粒455(PSCA-mIRES-PSA)。使用重疊PCR和限制片段交換的技術構建質粒455。首先，使用引物115和114，藉由PCR從質粒5297擴增該編碼人PSA之胺基酸25至261的基因。使用引物101和116，藉由PCR從pShuttle-IRES擴增最小EMCV IRES。將重疊擴增子混合在一起，並使用引物101和114，藉由PCR擴增。以Bgl Ⅱ和BamH分解IRES-PSA擴增子並將其插入經Bgl Ⅱ分解，經CIP處理之質粒5259中。為了解決此選殖株內之自發性突變，以來自新的重疊PCR反應的等效片段置換Bgl Ⅱ至BstE Ⅱ序列。
實施例3B. 包含三聯抗原構建體之質粒
一般策略。選擇多種雙抗原質粒，包括PSA-F2A-P SMA、PSMA-mIRES-PSCA、PSMA-T2A-PSCA、PSA-T2A-PSCA、PSCA-F2A-PSMA、PSCA-pIRESPSMA及PSMA-mIRES-PSA，將它們以各種組合併入三聯抗原質粒載體中。在所有情況下，該質粒載體係以母pPJV7563質粒骨幹為基礎。四個質粒載體(質粒456、457、458及459)利用具有兔子B球蛋白轉錄終止子之單一完整CMV啟動子來驅動所有三種抗原之表現。兩種其他質粒載體(質粒846和850)併入雙啟動子策略與IRES或2A之組合以驅動該三種抗原之表現。將具有多個2A盒之質粒進行遺傳工程處理以攜帶不同的盒，以將質粒/載體擴增期間第一和第二盒之間的重組可能性最小化。藉由流式細胞術(第7A和7B圖)和西方點墨(第8A和8B圖)證明抗原之表現。
質粒456(PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA)。藉由限制片段交換來構建質粒456。以Nhe I和Hpa分解質粒5300並將該~1.8kb之插入物連接入經類似方法分解之質粒449中。
質粒457(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。藉由限制片段交換來構建質粒457。以Nhe I和Hpa分解質粒5300並將該~1.8kb之插入物連接入經類似方法分解之質粒451中。
質粒458(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR和限制片段交換的技術構建質粒458。使用引物119和139， 藉由PCR從質粒5297擴增該編碼人PSA之胺基酸25至261的基因，導致3'端增加T2A序列及Nhe I限制位點。以Nhe I分解擴增子並將其插入經類似方法分解之質粒454中。
質粒459(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。藉由限制片段交換來構建質粒459。以Nhe I和Bgl Ⅱ分解質粒454並將該含有PSCA-F2A-PSMA的插入子連接入經類似方法分解之質粒455中。
質粒846(CBA-PSA、CMV-PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR和無縫選殖之技術構建質粒846。首先，合成由下列者所組成之表現盒1)來自雞β肌動蛋白(CBA)基因之啟動子和5'非轉譯區，2)混合之雞β肌動蛋白/兔子β球蛋白內含子，3)編碼人PSA之胺基酸25至261的基因，及4)牛生長激素終止子。使用引物3 Sa Ⅱ CBA及5Sa Ⅱ BGH，藉由PCR從質粒796擴增PSA表現盒。擴增子係使用GeneArt無縫選殖和組裝套組(Invitrogen公司，加州Carlsbad)選殖入質粒603之Sa Ⅱ位點。當將此質粒遞送入細胞時，PSA表現會驅動CBA啟動子，而PSCA和PSMA表現將會驅動CMV啟動子。
質粒850(CBA-PSA，CMV-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR和無縫選殖之技術構建質粒850。首先，使用引物3 Sa Ⅱ CBA和5 Sa Ⅱ BGH，藉由PCR從質粒796擴增該由CBA啟動子驅動之PSA表現盒。使用GeneArt無縫選殖將擴增子選殖入質粒454之Sa Ⅱ位點。當將此質粒遞送入細胞時，PSA表現會驅動CBA啟動子，而PSCA和PSMA表現將會驅 動CMV啟動子。
質粒916((PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR和Gibson選殖之技術構建質粒916。藉由PCR擴增該編碼3種PAA多肽之基因並藉由Gibson選殖技術連接入pPJV7563之Nhe I/Bgl Ⅱ位點。質粒916之完整核苷酸序列列於SEQ ID NO：62中。質粒458和質粒916編碼包含該三種免疫原性PAA多肽的相同胺基酸序列，該胺基酸序列列於SEQ ID NO：60中。質粒916中之編碼該包含三種PAA多肽之胺基酸序列的核苷酸序列係經密碼子優化且亦列於SEQ ID NO：61中。
實施例3C. 三聯抗原腺病毒載體
一般策略。如同DNA質粒，可將病毒載體經遺傳工程處理以投遞多種前列腺癌抗原。將上述之用於多抗原構建體的三種多抗原表現策略-雙啟動子、2A肽及內部核糖體進入位點-以各種組合合併，以創建三聯抗原腺病毒載體。簡單地說，將多抗原表現盒選殖入經修飾以攜帶兩份四環素操縱子序列(TetO2)之副本的pShuttle-CMV質粒中。根據製造商(Agilent科技公司，加州Santa Clara)的實驗計劃使用AdEasy載體系統創建重組之腺病毒血清型5載體。將病毒在HEK293細胞中擴增，並根據標準實驗計劃藉由雙氯化銫顯帶法純化。在體內研究之前，充分決定病毒貯存液之下列特點：病毒粒子之濃度、感染性力價、無效性、內毒素，基因組和轉殖基因完整性、轉殖基因特性及表現。
腺病毒-733(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。Ad-733為 質粒457之病毒等效物。在大規模製造表現Tet遏制子之HEK293株期間，該三種抗原之表現驅動具四環素操縱子之單一CMV啟動子，以遏制轉殖基因之表現。多抗原表現策略包含兩種不同的2A序列。
腺病毒-734(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-734為質粒458之病毒等效物。在大規模製造表現Tet遏制子之HEK293株期間，該三種抗原之表現驅動具四環素操縱子之單一CMV啟動子，以遏制轉殖基因之表現。多抗原表現策略包含兩種不同的2A序列。
腺病毒-735(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。Ad-735為質粒459之病毒等效物。在大規模製造表現Tet遏制子之HEK293株期間，該三種抗原之表現驅動具四環素操縱子之單一CMV啟動子，以遏制轉殖基因之表現。多抗原表現策略包括兩種不同的2A序列和IRES。
腺病毒-796(CBA-PSA，CMV-PSCA-的pIRES-PSMA)。Ad-796為質粒846之病毒等效物。PSA之表現驅動雞β肌動蛋白啟動子，而PSCA和PSMA之表現驅動CMV-TetO2啟動子。多抗原表現策略包括兩個啟動子和IRES。
腺病毒-809(CBA-PSA，CMV-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-809為質粒850之病毒等效物。PSA之表現驅動雞β肌動蛋白啟動子，而PSCA和PSMA之表現驅動CMV-TetO2啟動子。多抗原表現策略包含兩個啟動子和2A序列。
實施例4. 疫苗與舒尼替尼和抗CTLA-4抗體之組合的抗腫瘤效力
在帶有皮下TUBO腫瘤之BALB/NeuT小鼠中調查癌症疫苗與舒尼替尼和抗CTLA-4單株抗體(選殖株9D9)之組合的抗腫瘤效力。
研究程序。簡單地說，每組10隻小鼠在植入腫瘤後第10天開始每日口服載劑或舒尼替尼蘋果酸鹽20毫克/公斤直到第64天。從第13天開始，以未編碼抗原(對照疫苗)或編碼SEQ ID NO：54之大鼠Her-2抗原(癌症疫苗)的DNA構建體在腺病毒載體中為小鼠進行疫苗接種，隨後以DNA進行2次相關抗原(HBV抗原或rHer-2)之週免疫化，2次雙週免疫化及7次週免疫化。該以抗小鼠CTLA-4單株抗體治療之小鼠群組(實心圓和空心三角形)係在注射PMED之後的第20、27、41、55、62、69、76、83、90和97天經由腹膜內途徑注射250微克抗體。
結果。第4圖顯示小鼠群組之Kaplan-Meier生存曲線，其係來自評估舒尼替尼及抗小鼠CTLA-4單株抗體(選殖株9D9)與癌症疫苗組合時的抗腫瘤效力之代表性研究。在以Sutent和對照疫苗(空心圓圈)、抗小鼠CTLA-4單株抗體(空心三角形)或癌症疫苗(實心三角形)治療之小鼠中可觀察到生存時間增加。在以舒尼替尼和癌症疫苗及小鼠CTLA-4之組合(實心圓圈)治療的小鼠中可觀察到生存期進一步增加。藉由對數等級(log-rank)檢驗計算P值。
實施例5. CPG或CD40激動劑對由癌症疫苗誘導之免疫反應的影響
在BALB/c小鼠中之免疫原性研究
在BALB/c小鼠中調查局部投予免疫調節劑對由癌症誘導之抗原特異性免疫反應之幅度和品質的影響，其中係使用IFN γ ELISPOT分析或細胞內細胞因子染色分析測量rHER2特異性T細胞反應來估計免疫反應。簡單地說，依指示，藉由PMED遞送系統以編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質粒表現構建體將每組4至6隻之雌BALB/c小鼠免疫化。在PMED啟動之後接著在接近該疫苗引流腹股溝淋巴結處經由皮內注射局部投予免疫調節劑，CpG7909(PF-03512676)和抗CD40單株激動性抗體。根據下述程序，藉由IFN γ ELISPOT或細胞內細胞因子染色分析測量抗原特異性T細胞反應。
胞內細胞因子染色(ICS)分析
藉由ICS分析測量從個別動物分離出之脾細胞或PBMC的rHer-2特異性多功能(多細胞因子陽性)T細胞免疫反應。通常，將1e6個脾細胞與1微克/毫升之布雷菲爾德菌素A(Brefeldin A)和10微克/毫升之肽刺激劑(rHer-2特異性CD8 p66、rHer-2特異性CD4 p169或不相關之HBV p87)在37℃，5%CO2培養箱中培育5小時。在刺激後，清洗脾細胞並在4℃，以Fc阻斷劑(抗小鼠CD16/CD32)阻 斷10分鐘，再以Live/Dead Aqua染色、抗小鼠CD3ePE-Cy7、抗小鼠CD8a Pacific blue及抗小鼠CD45R/B220 PerCP-Cy5.5染色20分鐘。清洗細胞，在4℃下，以4%三聚甲醛固定一整夜，在室溫下以BD fix/perm溶液滲透化30分鐘並在室溫下與抗小鼠IFN γ APC、抗小鼠TNF Alexa488及抗小鼠IL-2 PE一起培育30分鐘。清洗細胞並取得20000個CD4或CD8 T細胞以藉由流式細胞儀分析。從疫苗特異性反應減去對不相關肽HBV的rHer-2特異性反應，並相對於自脾分離出之脾細胞的總數量進行標準化，以計算每隻動物之全部脾臟的抗原特異性單一、雙重或三重細胞因子陽性T細胞的總數。
IFN γ ELISPOT分析結果
第5圖顯示當依指示給予免疫調節劑時，評估由rHER2疫苗誘導之抗原特異性T細胞反應之幅度的代表性研究在小鼠群組中所取得之IFN γ ELISPOT結果。簡單地說，依指示，藉由PMED以編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質粒表現構建體將每一治療組之每隻小鼠(n=4)免疫化，緊接著以100微克之對照大鼠IgG單株抗體(Bioxcell # BE0089：對照mAb)或50克之CpG7909或100微克之抗CD40單株抗體(Bioxcell # BE0016-2：抗CD40mAb)進行免疫化。在PMED啟動後7天，藉由IFN γ ELISPOT分析測量來自與對照組或10微克/毫升濃度之rHer-2特異性p66肽混合的5e5個脾細胞的抗原特異性免疫 反應。從來自個別動物之ELISPOT結果計算含有le5個CD8 T細胞之脾細胞的總IFN γ分泌細胞的數量並繪製脾細胞中之CD8 T細胞的%及各組之平均值和平均值的標準差。如圖所示，與接受對照抗體之小鼠相比較，CpG7909和抗CD40單株抗體均顯著增加由rHer-2 DNA誘導之抗原特異性免疫反應的幅度。
細胞內細胞因子染色(ICS)分析結果。第6圖和第7圖顯示出藉由細胞內細胞因子染色分析評估CpG7909對由疫苗誘導之免疫反應品質的免疫調節活性之代表性研究的結果。簡單地說，藉由PMED投遞編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質粒表現構建體將每隻小鼠免疫化二次，二次免疫化之間間隔4週。在藉由PMED進行DNA免疫化後不久，在接近右側疫苗引流腹股溝淋巴結處經由皮內注射給予各組中之小鼠(n=5)PBS(PMED組)或50克之CpG7909(PMED+ CpG組)。最後一次藉由PMED免疫化後七天，在從各個別小鼠中分離出的脾細胞上進行ICS分析以檢測分泌IFN γ、TNF及/或IL-2之抗原特異性多功能CD8或CD4 T細胞。與PBS組相比較，以局部遞送之CpG 7909來治療之小鼠中可檢測到顯著增加之rHer-2特異性多細胞因子陽性CD8和CD4 T細胞反應。與PBS相比較，接受局部投遞CpG7909之動物中可觀察到單一細胞因子陽性CD8群增加。
第8圖和第9圖顯示出藉由胞內細胞因子染色分析評估激動性抗鼠CD40單株抗體對由疫苗誘導之免疫反應品質 的免疫調節活性之代表性研究之結果。簡單地說，藉由PMED投遞編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質粒表現構建體將每隻動物免疫化二次，二次免疫化之間間隔4週。在藉由PMED投予第一次免疫化後一天，在接近右側疫苗引流腹股溝淋巴結處經由皮內注射來給予各組中之小鼠(n=6)100克同型IgG對照組(PMED+IgG)或抗CD40單株抗體(PMED+aCD40)。最後一次藉由PMED免疫化後七天，在從各個別小鼠中分離出的脾細胞上進行ICS分析以檢測分泌IFN、TNF及/或IL-2之rHer-2特異性多功能CD8或CD4 T細胞。與同型IgG對照組相比較，以局部遞送之抗CD40單株抗體治療之小鼠中可檢測到rHer-2特異性三重細胞因子陽性CD8和CD4 T細胞反應顯著增加。以局部投遞之抗CD40單株抗體治療之動物中亦可檢測到rHer-2特異性單一及雙重細胞因子陽性CD4 T細胞顯著增加。
實施例6. 抗癌疫苗與低劑量舒尼替尼之組合的抗癌效力
在具有自發性乳腺墊腫瘤之BALB/neuT小鼠中調查抗癌疫苗與低劑量之舒尼替尼的組合之抗腫瘤效力。
動物治療。簡單地說，經由口服給予13至14週齡之雌性小鼠5毫克/公斤之舒尼替尼蘋果酸鹽(Sutent)共112天，每天兩次。在第3天藉由腺病毒注射給予小鼠對照疫苗(其不投遞抗原)及癌症疫苗(其投遞SEQ ID NO：54之大鼠Her-2抗原(rHer-2)來作為初次疫苗接種，隨後藉 由投遞DNA之PMED分別投遞7次HBV抗原(對照疫苗)或rHer-2(癌症疫苗)，每兩週投予一次。當所有10個乳腺墊轉變成腫瘤陽性或當任一乳腺腫瘤的體積達到2000立方毫米時確定存活終點。
結果。結果呈現於第10圖中。與先前發表之Sutent的藥代動力學變化形廓(Mendel,D.,Laird,D.等人："In vivo antitumor activity of SU11248,a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth facfor and platelet-derived growth factor receptors：determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamics relationship".Clinical Cancer Research,203,9：327-337)相比較，在每天接受兩次5毫克/公斤劑量之小鼠中的舒尼替尼之Cmax預計會明顯低於在小鼠和人中取得有效之抗腫瘤效力所需要之最低血液濃度。該數據證明以低劑量Sutent單一療法治療之小鼠的存活被快速且暫時改善。然而，當給予癌症疫苗時可觀察到存活情況更持久且顯著之存活改善(藉由對數等級檢驗，P<0.0001)。
實施例7. 藉由局部投予CpG增強由疫苗誘導之免疫反應
在猴子研究中調查局部投予CpG(PF-03512676)對由本發明提供之人PSMA核酸所誘導之免疫反應的免疫增強作用，其中係使用IFN γ ELISPOT分析藉由測量PSMA特異性T細胞反應來評估該免疫反應。
動物處理及樣本採集。經由電穿孔投遞編碼經修飾之 人PSMA抗原(SEQ ID NO：9之多肽)的質粒DNA來將六組中國食蟹獼猴(Chinese cynomolgus macaques)(每一測試組6隻(# 1至6))免疫化。簡單地說，所有動物在第0天接受二側肌肉內注射5毫克之質粒DNA，接著進行電穿孔(DNA EP)。緊接在電穿孔後，第2組在接近DNA注射部位接受二側肌肉內注射2毫克之CpG與1毫克明礬之混合物。第3和4組分別在第0天或第3天在接近DNA注射部位接受二側肌肉內注射2毫克之CpG，但不投遞明礬。第5組於第3天在接近疫苗引流腹股溝淋巴結處接受二側肌肉內注射2毫克之CpG。第6組於第0天經由共電穿孔接受二側注射200克之CpG與DNA溶液之混合物。
IFNy ELISPOT分析程序。在DNA免疫化後十五天從每隻動物收集周邊血液樣本。從血液樣本中分離出周邊血液單核細胞(PBMC)，並進行IFN γ ELISPOT分析以測量PSMA特異性T細胞反應。簡單地說，在各具有2微克/毫升PSMA特異性肽或非特異性對照肽之匯集庫(人HER2肽匯集庫)的IFN γ ELISPOT盤的每一孔中接種來自個別動物之4e5個PBMC。各PSMA特異性肽匯集庫之組成提供於表24A中。將盤在37℃和5%CO2中培育16小時，培育後按照製造商之指示清洗及發展。藉由CTL閱讀器計算IFN γ斑點形成細胞(SFC)的數目。每一條件重複進行二次。
結果。表6顯示評估和比較IFN γ T細胞反應的代表性IFN γ ELISPOT分析之結果，該IFN γ T細胞反應係經由肌肉內注射(第2、3、4和5組)或皮內注射(第6組) 用於局部給予之帶有CpG(PF-03512676)(第1組)或不帶有CpG的疫苗來誘導。所報告之PSMA特異性反應的計算方法係將針對非特異性對照肽(人HER2肽匯集庫)之SFC的平均數目從針對PSMA肽匯集庫之SFC的平均數目減去並對以1e6個PBMC觀察到之SFC進行標準化。^表示該計數不準確，因為斑點之數目太多無法計算。ND表示尚未測定。
在所有六隻動物(第1組)中偵測針對無CpG(PF-03512676)存在時多個PSMA特異性肽匯集庫之PSMA特異性IFN γ T細胞反應。在DNA電穿孔後3天經由肌肉內注射(第4組：3/6)或皮內注射(第5組：2/6)接受額外之CPG(PF-03512676)的幾隻動物中測得之針對PSMA肽的總反應稍高。然而，當在電穿孔後同一天緊接著投遞CpG(第2和3組)時，有幾隻動物，無法產生高反應(第2組：4/6和第3組：3/6)，不論是否混合或不混合使用明礬。然而，當將十倍低之CpG劑量與DNA溶液共電穿孔入肌肉中(第6組)時可在4/6之動物中檢測到較高之淨反應，當與未接受CpG之動物(第1組)相比較時，對肽匯集庫H1和R1具有統計學上較高之反應(P<0.05)。此數據證明當與DNA溶液共電穿孔入肌肉時，低劑量之CpG能有效地增強由DNA疫苗所誘導之IFN γ T細胞反應。
實施例8. 藉由局部投予抗CTLA-4抗體增強由疫苗誘導之免疫反應
在猴子研究中調查皮下投予低劑量之抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)對由獼猴PSMA核酸所誘導之免疫反應的影響，其中係經由使用IFN γ ELISPOT分析測量PSMA特異性T細胞反應來評估該免疫反應。在該研究中所使用之獼猴PSMA核酸具有如SEQ ID NO：56中所列出之序列並編碼SEQ ID NO：55之免疫原性PSMA多肽。
動物處理及樣本採集。經由二側肌肉內注射投遞編碼經修飾之獼猴PSMA多肽的腺病毒(2×5e10 V.P.)來將五組雄性印度獼猴(每一測試組7隻(# 1至7))免疫化。緊接在注射腺病毒後，第1組接受載劑，第2至4組在接近疫苗引流淋巴結處分別接受二側皮下注射劑量為2×25毫克、2×16.7毫克和2×8.4毫克之抗CTLA-4抗體(CP-675,206)。
在免疫後9天，從每一隻動物分離出周邊血液單核細胞(PBMC)，並進行IFN γ ELISPOT分析以測量獼猴PSMA特異性T細胞反應。簡單地說，在各具有2微克/毫升獼猴PSMA特異性肽類(表24A中定義之P1、P2、P3或R1+R2)匯集庫或非特異性對照肽(人HER2肽匯集庫)的IFN γ ELISPOT盤的每一孔中接種來自個別動物之4e5個PBMC。將盤在37℃和5%CO2下培育16小時，並在培育後按照製造商之指示清洗及發展。藉由CTL閱讀器計算IFN γ斑點形成細胞(SFC)的數目。重複進行每種條件二次。將來自背景值已調整之彌猴PSMA特異性肽匯集庫之SFC的一式兩份之平均值對1e6個PBMC中之反應標準化。 來自各個別動物之針對肽匯集庫的個別和總和反應呈現於表29中。
IFN γ ELISPOT分析程序。在4℃下將特異於IFN γ之捕捉抗體(BD Bioscience公司，# 51-2525kc)塗覆在微量盤中之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上一整夜。以血清/蛋白質阻斷該盤，以防止非特異性結合該抗體。阻斷後，將效應子細胞(諸如從免疫化小鼠分離出之脾細胞或從獼猴分離出之PBMC)和標的物(諸如來自肽集合庫之PSMA肽、以抗原特異性肽脈衝之靶細胞或表現相關抗原的腫瘤細胞)加入孔中並在37℃，5%CO2培養箱中培育一整夜。效應子細胞所分泌之細胞因子被塗層在PVDF膜之表面上的抗體捕獲。移除細胞和培養基後，將100微升之生物素化的多株抗人lFNy抗體加入每一個孔中以進行檢測。依製造商(Mabtech)之議定計劃添加鏈黴抗生物素蛋白辣根過氧化物酶和沉澱受質，3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)來將斑點可視化，以得到紅色斑點。每個點代表單一之分泌細胞因子的T細胞。
結果。表7顯示出代表性IFN γ ELISPOT分析之結果，其比較在接近疫苗引流淋巴結處經由皮下注射局部投予之不含有抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)(第1組)，或含有抗CTLA-4單株抗體(第2至4組)的疫苗所誘導之T細胞反應。該疫苗產生之免疫反應(第1組)被局部投予之劑量為50毫克的抗CTLA-4抗體(CP-675,206)顯著增強(第2組，使用低估值，藉由Student T檢驗，P =0.001)。該反應亦分別被33.4毫克(第3組，使用低估值，藉由Student T檢驗，P=0.004)和16.7毫克(第4組，藉由Student T檢驗，P=0.05)之低劑量抗CTLA-4抗體顯著增強。此數據表明藉由皮下注射投遞之低劑量抗CTLA-4顯著增強由疫苗誘導之免疫反應。
實施例9. 藉由低劑量舒尼替尼免疫調節髓源性抑制細胞
所提供之下列實施例係說明在非腫瘤小鼠模型中，低 劑量之舒尼替尼在體內對髓源性抑制細胞(MDSC)的免疫調節作用。
研究程序。
為了產生富集MDSC之脾細胞，將TUBO細胞(1×106)植入5隻BALB/neuUT小鼠的二側，並保持約20-30天，直到腫瘤體積達到1000至1500立方毫米。然後，將小鼠處死，除去脾臟並回收富集MDSC之脾臟。以5μM之CFSE將脾細胞標記10分鐘，以PBS清洗並計數。隨後，將經標記之細胞以5×107脾細胞/毫升之密度再懸浮於PBS溶液中並經由尾靜脈之靜脈內注射繼承轉移到未接受過試驗之BALB/c受體小鼠中。在繼承轉移開始前三天，該受體小鼠每天二次接受載劑或劑量為5毫克/公斤、10毫克/公斤和20毫克/公斤之舒尼替尼蘋果酸鹽(Sutent)。繼承轉移之後，受體小鼠持續額外每天接受二次載劑或舒尼替尼劑量2天，之後，處死小鼠，取出脾臟，回收脾細胞並處理之以供表型分析。
計算脾細胞之數目，並以5×106細胞/毫升之密度再懸浮於FACS染色緩衝液(PBS、0.2%(重量/體積)牛血清白蛋白及0.02%(重量/體積)疊氮化鈉)中。為了以流式細胞術將脾細胞染色，先將2.5×106細胞與針對CD16/CD32之抗體在4℃一起培育10分鐘，以阻斷Fc受體並將非特異性結合減至最少。然後，以適當之與針對鼠細胞表面標記之抗體(Biolegend公司)共軛結合的螢光團將脾細胞在4℃染色20分鐘。在T細胞(抗CD3(太平洋藍)，選殖株 17A2)方面及MDSC(抗GR-1(APC)，選殖株RB6-8C5及抗CD11b(PerCp Cy5.5)，選殖株M1/70)方面，亦包含live/dead染色。與抗體一起培育後，以2毫升FACS緩衝液清洗經染色之脾細胞，藉由離心沉澱成小丸並重新懸浮於0.2毫升之FACS緩衝液中，再在BD CANTO Ⅱ流式細胞儀上採集數據。為了監控舒尼替尼或載劑對繼承轉移之MDSC存活的影響，我們計算在活，單態閘門中之CFSE+、CD3-、GR1+、CD11b+的百分比。然後，經由計算總脾細胞數之百分比所代表之確實的細胞數來測定每一脾臟之繼承轉移的MDSC數。藉由FloJo和Craph Pad軟體來分析數據。
結果。表27中呈現之數據代表繼承轉移後2天，從每天投予二次載劑或5毫克/公斤、10毫克/公斤和20毫克/公斤之舒尼替尼劑量之小鼠(n=7/組)的每一脾臟中回收之繼承轉移的CFSE+、CD3-、GR1+、CD11b+細胞之平均數。使用Dunnett氏多重比較試驗來比較舒尼替尼給藥組對0毫克/公斤(載劑)組，藉由單因素ANOVA來測定統計學顯著性。該數據證明與經載劑處理之對照組相比較，即使當投予5毫克/公斤之低劑量時，每日投予二次舒尼替尼劑量可對MDSC具有體內免疫調節作用，這造成回收之MDSC的數目統計學上顯著降低。
實施例10. 三聯抗原腺病毒及DNA構建體之免疫原性
所提供之下列實施例係用於說明表現由本發明提供之PSMA、PSCA和PSA的三聯抗原疫苗構建體(無論為在腺病毒載體形式或DNA質粒形式)在非人靈長類動物中引發針對所有3種經編碼之抗原的特異性T細胞反應之能力。
體內研究程序。初次免疫後9天，比較本發明所提供之5種各自表現三種抗原(PSMA、PSCA和PSA；Ad-733、Ad-734、Ad-735、Ad-796及Ad-809)的腺病毒載體與各自僅表現單一抗原(PSMA、PSA或PSCA)之3種腺病毒載體的混合物之T細胞免疫原性。評估對表現單一抗原之單一腺病毒(第1-3組)的反應以證明特異性。簡言地說，經由肌肉內途徑為印度獼猴(第1組和第3組，n=6，第2組，n=7，第4至9組，n=8)共注射1e11個V.P.，隨後在同一天經由皮內途徑注射10毫克/公斤之抗CTLA-4。在注射後九天，從每一隻動物分離出周圍血液單核細胞(PBMC)並進行IFN ELISPOT分析以測量PSMA、PSA或PSCA特異性T細胞反應。
注射腺病毒和抗CTLA-4後13週，當T細胞反應已縮 小，令猴子接受藉由電穿孔投遞之DNA(第1組：PSMA，質粒5166；第2組：PSA，質粒5297；第3組：PSCA，質粒5259；第4組：PSMA、PSA和PSCA，質粒5166，5259和5297之混合物；第5組：質粒457；第6組：質粒458；第7組：質粒459；第8組：質粒796及第9組：質粒809)疫苗接種加強劑。歸納來說，每隻動物接受共5毫克之本發明所提供的質粒DNA，其投遞與初次免疫所使用之腺病毒中編碼的相同表現盒。在加強接種後九天，從每隻動物分離出周圍血液單核細胞(PBMC)並進行IFN γ ELISPOT分析。
IFN γ EL/SPOT分析。簡單地說，將每孔4e5個來自個別動物之PBMC與各為2微克/毫升之PSMA特異性肽匯集庫P1、P2、P3或H1和H2(表9A)、PSA特異性匯集庫1或2(表9B)、PSCA特異性匯集庫(表10)或非特異性對照肽(人HER2肽匯集庫)接種在IFN γ ELISPOT盤中。將這些盤在37℃和5%CO2中培育16小時，培育後按照製造商之指示清洗及發展。藉由CTL閱讀器計算IFN γ斑點形成細胞(SFC)的數目。重複進行每種條件二次。將來自背景值已調整抗原特異性肽匯集庫之SFC的一式兩份之平均值對1e6個PBMC中之反應標準化。表中之抗原特異性反應呈現針對該對應抗原特異性肽或肽匯集庫之反應的總和。
結果：表11代表在印度獼猴中評估T細胞免疫原性之研究，此研究係藉由IFN γ ELISPOT比較各自表現所有三種抗原之5種不同腺病毒與各自僅表現單一抗原之3種腺病 毒的混合物來評估T細胞免疫原性。大多數僅接受Ad-PSMA注射之動物(第1組)誘導對PSMA之特異性反應，但不會誘導對PSA或PSCA之特異性反應(Student氏T檢驗，P<0.03，從統計分析除去一隻被優先誘導出對PSCA之反應的動物(# 4))。僅接受Ad-PSA注射之動物(第2組)誘導對PSA之特異性反應，但不會誘導對PSMA或PSCA之特異性反應(Student氏T檢驗，P<0.02)。僅接受Ad-PSCA注射之動物(第3組)誘導對PSCA之特異性反應，但不會誘導對PSMA或PSA之特異性反應(Student氏T檢驗，P<0.03)。所有五種表現三聯抗原之腺病毒載體(第5至9組)均誘導對所有三種抗原之IFN T細胞反應，其幅度隨動物而變化。由表現三聯抗原之腺病毒誘導之對PSCA的反應幅度與個別載體之混合物(第4組)所誘導的反應幅度相似。然而，由Ad-809(第9組)誘導之對PSMA的反應及由Ad-796(第8組)誘導之對PSA的反應之幅度分別顯著優於該混合物(Student氏T檢驗，P=0.04及P=0.02)。這些結果指出在非人靈長類動物中以表現三聯抗原之腺病毒進行疫苗接種能夠引發相當於或優於以個別腺病毒之混合物進行疫苗接種所產生之T細胞免疫反應。
表12顯示IFN γ ELISPOT的結果，其代表的研究係評估先藉由腺病毒遞送本發明所提供之五種不同的三聯抗原表現盒與抗CTLA-4，隨後以對應之質粒DNA進行電穿孔加強免疫化的免疫原性。將此免疫反應與以類似方法先藉由腺病毒遞送三種表現單一抗原之構建體的混合物與抗 CTLA-4進行初次免疫，隨後進行DNA電穿孔加強免疫化後所產生之免疫反應相比較。
所有僅接受Ad-PSMA與抗CTLA-4，再接受質粒PSMA免疫接種之動物(第1組)誘導對PSMA之特異性反應，但不會誘導對PSA或PSCA之特異性反應。類似地，所有僅接受Ad-PSA與抗CTLA-4，再接受質粒PSA免疫接種之動物(第2組)誘導對PSA之特異性反應，但不會誘導對PSMA或PSCA之特異性反應，最後，所有僅接受Ad-PSCA與抗CTLA-4，再接受質粒PSCA免疫接種之動物(第3組)誘導對PSCA之特異性反應，但不會誘導對PSMA或PSA之特異性反應(Student氏T檢驗，P<0.01)。
所有已經以表現三聯抗原之載體(第5至9組)或該混合物(第4組)免疫化的動物均被誘導出針對所有三種抗原的IFN γ T細胞反應。在所有這些組(第4至9組)中分別檢測到之PSCA或PSA特異性IF γ T細胞的頻率類似。然而，接受三聯抗原表現載體疫苗接種的構建體第7和9組所產生之針對PSMA的反應頻率顯著高於以3種表現單一抗原之構建體的混合物進行疫苗接種者(第4組)。這些結果指明在一個表現盒中之腺病毒和表現三聯抗原之DNA疫苗可在非人靈長類動物中引發等於或優於由腺病毒和表現單一抗原之DNA的混合物所引發者之IFN γ T細胞反應。
實施例11. 構建C68載體
11A. 構建載體AdC68-734
AdC68-734為以黑猩猩腺病毒C68為基礎之複製缺陷型腺病毒載體，該黑猩猩腺病毒C68編碼三種免疫原性PAA多肽-免疫原性PSA多肽、免疫原性PSCA多肽及免疫原性PSMA多肽。在矽片上設計載體序列。首先，從GenBank取得基線全長C68序列(定義：猴腺病毒25，完整基因組；登錄編號AC_000011.1)。將文獻中描述之5個點突變引入序列中。(Roshorm,Y.,M.G.Cottingham，等人(2012)."T cells induced by recombinant chimpanzee adenovirus alone and in prime-boost regimens decrease chimeric EcoHIV/NDK challenge virus load." Eur J Immunol 42(12)：3243-3255)接著，刪除病毒早期轉錄區1(E1)之2.6萬個鹼基對，以使該載體為複製無能，並移除早期轉錄區3(E3)之3.5萬個鹼基對，以在載體中創建用於轉基因表現盒之空間。(Tatsis，N，L Tesema，等人(2006)Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers.Gene Ther.13：421-429)然後，將高效真核表現盒引入E1區中。該表現盒包括下列組分：(A)巨細胞病毒(CMV)前早期增強子/啟動子，(B)Tet操縱子(四環素抑制子之結合位點)，(C)多抗原構建體，其包含(1)編碼人PSA之胺基酸25至261的核苷酸序列，(2)編碼甘胺酸-絲胺酸連接子和明脈扁刺蛾β四體病毒2A肽(T2A)之順式水解酶元件，(3)編碼人PSCA之胺基酸2至123的核苷酸序列，(4)編碼甘胺酸-絲胺酸連接子和口蹄疫病毒2A肽(F2A)之順式水解酶元件，及(5)編 碼人PSMA之胺基酸15至750的核苷酸序列，及(D)SV40多聚A轉錄終止信號。最後，在病毒基因組中之每個端點插入Pacl限制性位點，以促進從母桿狀病毒(Bacmid)釋出基因組。在病毒繁殖期間除去來自Pacl限制性位點之核苷酸，因此，不會被併入載體產物本身的基因組中。整個載體AdC68-734之核苷酸序列(包括Pacl限制性位點)列於SEQ ID NO：58中。併入載體AdC68-734中(以及質粒458中)之多抗原構建體(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)亦列於SEQ ID NO：61中。由SEQ ID NO：61之多抗原構建體編碼的胺基酸序列列於SEQ ID NO：60中。表13中提供載體AdC68-734之組分。
在矽片設計之後，在多步驟方法中利用體外寡核苷酸合成及隨後之在大腸桿菌和酵母菌中由重組介導之中間組裝來生物合成具有34,819個鹼基對之序列。最後，將病毒基因組插入用於繁殖之細菌人工染色體(pCC1BAC-LCyeast-TRP Trunc)。在製造過程之多個步驟中進行次世代測序(MiSeq技術)，包括用於創建病毒種子貯存物 的最後一批桿狀病毒17.3.3.22。病毒種子貯存物係經由以Pacl分解桿狀病毒17.3.3.22來，以從BAC骨幹釋出AdC68-734基因組來產生。將線性化之核酸轉染入E1互補性黏附HEK293細胞株，且當出現可見之細胞病變效應並形成腺病毒灶持，經由多輪的冷凍/解凍收穫培養物，以將病毒從細胞釋出。藉由標準技術擴增並純化病毒。桿狀病毒17.3.3.22之遺傳組織提供於第11圖中。
11B. 構建額外之C68載體
以類似於AdC68-734之方式構建額外之三聯抗原C68載體。一些額外載體涉及C68基因組中與載體AdC68-734略有不同之功能性缺失，而其他則納入不同的多抗原構建體。根據這些實例及本發明之其他描述，熟習本技藝之人士將能從C68構建用於表現病毒多抗原構建體之額外載體，所有這些均在本發明的範圍之內。
(1)AdC68X-734及AdC68W-734
載體AdC68X-734之構建係從C68開始，透過刪除SEQ ID NO：57之C68基因組的核苷酸577-3403(E1區)及27125-31831(E2區)來功能性刪除C68基因組之E1和E3區，並在刪除之E1區中插入SEQ ID NO：61之三聯抗原構建體(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)來進行。載體AdC68W-734與載體AdC68-734完全相同，除了AdC68W-734在C68 NDA序列中含有一或多種突變。
(2)AdC68X-733和AdC68X-735
分別以SEQ ID NO：65和66之三聯抗原構建體取代被納入AdC68X-734載體中之三聯抗原構建體來創建載體AdC68X-733和AdC68X-735。該被納入載體AdC68X-733中之多抗原構建體(即，PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)與該被納入質粒457中者相同，且該被納入載體AdC68X-735中之多抗原構建體(即，PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)與該被納入質粒459中者相同。
11C. 研究生產力表徵
製造AdC68-734之各種研究級批次並測試生產力。以Pacl分解桿狀病毒以從BAC骨幹釋出載體基因組，並將線性化之核酸轉染入E1互補性黏附HEK293細胞株。當可見到大量的細胞病變效應及腺病毒灶時，藉由多輪之冷凍/解凍收穫該培養物以從細胞釋出病毒。在組織培養瓶中，將來自這些0代培養(P0)的病毒在至少一次額外的傳代中進行擴增，然後作為用於研究規模之生產運行中的種子貯存物(每批~0.5至3e13個總病毒顆粒)。總體而言，執行11次生產運行(5次在HEK293懸浮細胞中，6次在HEK293黏附細胞中)。每一經初次感染細胞之平均單位生產力為15000+/-6000個純化之病毒顆粒，病毒顆粒：感染單位比為55。研究規模生產力匯總於表14中。
11D. 抗原表現
從經AdC68載體感染之A549細胞，藉由流式細胞術測量PSMA和PSCA之表面表現(第12圖)並藉由西方點墨分析測量PSMA、PSCA和PSA的總細胞表現(第13圖)(MOI=10,000)。在感染後2天，以抗PSCA(異硫氰酸螢光素共軛結合之單株抗體1G8〔1：200〕)和PSMA抗體(別藻藍蛋白(allophycocyanin)共軛結合之單株抗體J591〔1：200〕)為經Mock和AdC68感染之細胞染色以供進行流式細胞術分析。在大多數被表現不同三聯抗原之AdC68載體感染的細胞中可檢測到不同程度之PSCA和PSMA的表面表現。從經AdC68X-809感染之細胞檢測到相對較高之PSCA和PSMA的表現程度，而從經AdC68X-733感染之細胞檢測到相對較低之表現程度。感染後2天，將 來自約1×105個感染細胞之總細胞溶胞產物裝填在十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠的每一泳道上。接著，將凝膠轉移到用於檢測PSA、PSMA和PSCA蛋白的膜上，使用特異於PSA、PSMA和PSCA之初級抗體藉由西方點墨分析來進行檢測。在經感染之細胞上檢測到所有三種抗原之不同程度的表現。雖然從經AdC68-734和AdC68X-735感染之溶胞產物中檢測到之PSMA和PSCA的表現程度相當類似，從AdC68-734溶胞產物中所檢測到之PSA的表現程度較從AdC68-735溶胞產物中所檢測到者更高。
11E. 免疫原性
進行由各種三聯抗原AdC68載體所誘導之CD8IFN γ反應的頭對頭比較。以1e9或1e10個VP之AdC68-734、AdC68X-735、AdC68X-809或Ad5-734在四頭肌為各組小鼠(每組n=5)進行免疫接種。在免疫後第13天從每隻動物收集脾臟以測量小鼠中之IFN γ CD8+ T細胞反應。分離出脾細胞，並進行IFN γ ELISPOT分析以測量PSMA、PSCA和PSA特異性T細胞反應。簡單地說，將2.5至5×105個來自經免疫化動物之脾細胞在10微克/毫升之個別的人PSMA、PSCA或PSA特異性肽的存在下進行培養。該15聚體之肽先前被確定為含有針對各個前列腺抗原之CD8+ T細胞抗原決定部位。與單獨之培養基一起培養的脾細胞作為對照組。每種條件重複進行三次。將盤在37℃和5%CO2下培育20小時，培育後按照製造商之指示清洗及發展。藉 由CTL閱讀器計算IFN γ SFC的數目。結果顯示已減除單獨培養基之背景值並已對1×106個脾細胞標準化的PSMA、PSCA和PSA特異性SFC的平均數目。
總之，表現所有三種抗原之AdC68載體誘導對所有三種抗原之免疫反應，但幅度不同。由1e9個VP之AdC68載體所誘導之對PSMA的反應類似於Ad5。由該三種AdC68載體誘導之對PSCA的反應類似於或低於由Ad5誘導者，而由Ad68-735所誘導之對PSA的反應較以所有測試載體所誘導的反應幅度低。然而，與AdC68-734、AdC68-735或Ad5相比較，由1e10個VP之AdC68-809誘導之對所有三種抗原的反應與彼等類似或較佳。結果呈現於表15中。
選擇原始序列
SEQ ID NO：1.全長人PSMA之胺基酸序列
SEQ ID NO：2.編碼SEQ ID NO：1之全長人PSMA的核苷酸序列
SEQ ID NO：3.PSMA重排抗原1之胺基酸序列
SEQ ID NO：4.編碼SEQ ID NO：3之PSMA重排抗原1之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：5.PSMA重排抗原2之胺基酸序列
SEQ ID NO：6.編碼SEQ ID NO：5之PSMA重排抗原2之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：7.PSMA重排抗原3之胺基酸序列
SEQ ID NO：8.編碼SEQ ID NO：7之PSMA重排抗原3之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：9.與膜結合型PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：10.編碼SEQ ID NO：9之與膜結合型PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：11.細胞溶質型PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：12.編碼SEQ ID NO：11之細胞溶質型PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：13.分泌型PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：14.編碼SEQ ID NO：13之分泌型PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：15.全長人PSA之胺基酸序列
SEQ ID NO：16.編碼SEQ ID NO：15之全長人PSA之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：17.細胞溶質型PSA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：18.編碼SEQ ID NO：17之細胞溶質型PSA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：19.與膜結合型PSA抗原之胺基酸序列
SSEQ ID NO：20.編碼SEQ ID NO：19之與膜結合型PSA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：21.全長人PSCA之胺基酸序列MASKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL
SEQ ID NO：22.編碼SEQ ID NO：21之全長人PSCA之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：23.質粒5166之核苷酸序列
SEQ ID NO：24.質粒5259之核苷酸序列
SEQ ID NO：25.質粒5297之核苷酸序列
SEQ ID NO：26.質粒460之核苷酸序列
SEQ ID NO：27.質粒451之核苷酸序列
SEQ ID NO：28.質粒454之核苷酸序列
SEQ ID NO：29.質粒5300之核苷酸序列
SEQ ID NO：30.質粒449之核苷酸序列
SEQ ID NO：31.質粒603之核苷酸序列
SEQ ID NO：32.質粒455之核苷酸序列
SEQ ID NO：33.質粒456之核苷酸序列
SEQ ID NO：34.質粒457之核苷酸序列
SEQ ID NO：35.質粒458之核苷酸序列
SEQ ID NO：36.質粒459之核苷酸序列
SEQ ID NO：37.PSHUTTLE IRES之核苷酸序列
SEQ ID NO：38.Her-2抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：39.編碼SEQ ID NO：38之Her-2抗原之胺基酸序列的核酸序列
SEQ ID NO：40.抗CD40抗體CP870,893之重鏈的胺基酸序列
SEQ ID NO：41.抗CD40抗體CP870,893之輕鏈的胺基酸序列
SEQ ID NO：42.抗CTLA-4抗體替西木單抗之重鏈的胺基酸序列
SEQ ID NO：43.抗CTLA-4抗體替西木單抗之輕鏈的胺基酸序列
SEQ ID NO：44.CpG 7909之核苷酸序列5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'
SEQ ID NO：45.CpG 24555之核苷酸序列5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'
SEQ ID NO：46.CpG 10103之核苷酸序列5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'
SEQ ID NO：47.eGFP之胺基酸序列
SEQ ID NO：48.HBV核心抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：49.HBV表面抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：50.彌猴PSMA ECD蛋白之胺基酸序列
SEQ ID NO：51.大鼠Her-2 p66肽(H-2d T細胞抗原決定部位)之胺基酸序列
SEQ ID NO：52.大鼠Her-2 p169肽(H-2dT細胞抗原決定部位)之胺基酸序列
SEQ ID NO：53.HBV核心抗原p87肽之胺基酸序列
SEQ ID NO：54.大鼠Her-2抗原(rHer-2)之胺基酸序列
SEQ ID NO：55.彌猴PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：56.編碼SEQ ID NO：55之彌猴PSMA抗原之核苷酸序列
SEQ ID NO：57.猿猴腺病毒25(C68)之完整基因組
SEQ ID NO：58.AdC68-734載體之完整序列
SEQ ID NO：59.較佳之EMCV IRES(pIRES)的核苷酸序列 (最小EMCV IRES(mIRES)缺乏下方劃線的15個核苷酸)
SEQ ID NO：60.包含免疫原性PSA、PSCA及PSMA多肽的胺基酸序列(由質粒916及載體AdC68-734和AdC68W-734編碼)
SEQ ID NO：61.編碼SEQ ID NO：60之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：62.質粒916之核苷酸序列
SEQ ID NO：63.AdC68W-734載體之完整序列
SEQ ID NO：64.包含免疫原性PSA、PSCA及PSMA多肽的胺基酸序列(由質粒457及載體AdC68X-733編碼)
SEQ ID NO：65.編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核苷 酸序列
SEQ ID NO：66.納入質粒459及載體AdC68X-735中之多抗原構建體(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)的核苷酸序列
<110> 輝瑞股份有限公司(PFIZER INC.)
<120> 表現前列腺相關抗原類之載體類
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<141> 2014-10-29
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 51
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 52
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 53
<210> 54
<211> 957
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 54
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<211> 739
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 55
<210> 56
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 合成之構建體
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<212> DNA
<213> 猿猴腺病毒第25型
<400> 57
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<223> 合成之構建體
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
<400> 59
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
<400> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
<400> 61
<210> 62
<211> 7182
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
<400> 62
<210> 63
<211> 34803
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成之有機體
<400> 63
<210> 64
<211> 1145
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
<400> 64
<210> 65
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 65
<210> 66
<211> 245
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 66

Claims (20)

  1. 一種C68 DNA載體，其包含：(1)缺乏基因E1A、E1B及E3之SEQ ID NO：57的C68核苷酸序列；及(2)多抗原構建體，其包含至少2個編碼核苷酸序列，其中該至少2個編碼核苷酸序列編碼2種不同免疫原性PAA多肽，該2種不同免疫原性PAA多肽係選自由下列所組成之群組：(i)免疫原性PSMA多肽和免疫原性PSA多肽；及(ii)免疫原性PSA多肽和免疫原性PSCA多肽，其中該免疫原性PSA多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸27至263之胺基酸序列；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸4至240之胺基酸序列；及(c)SEQ ID NO：17之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之C68 DNA載體，其中該C68核苷酸序列為進一步缺乏至少一個選自由下列所組成之群組的基因之SEQ ID NO：57的序列：E2A、E2B、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
  3. 如申請專利範圍第2項之C68 DNA載體，其中該免疫原性PSA多肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第3項之C68 DNA載體，其中該免疫原性PSCA多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組：(1)SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(2)SEQ ID NO：21之胺基酸2至125；及(3)SEQ ID NO：21之胺基酸4至125。
  5. 如申請專利範圍第4項之C68 DNA載體，其中該免疫原性PSMA多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組：(1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸15至750的多肽；(2)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的多肽；(3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的多肽；(4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的多肽；(5)包含SEQ ID NO：9之胺基酸4至739的多肽；(6)包含SEQ ID NO：3之胺基酸4至739的多肽；(7)包含SEQ ID NO：5之胺基酸4至739的多肽；(8)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4至739的多肽；及(9)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的多肽。
  6. 如申請專利範圍第4項之C68 DNA載體，其中該多抗原構建體進一步在該2個編碼核苷酸序列之間包含分隔子序列。
  7. 如申請專利範圍第6項之C68 DNA載體，其中該分隔子序列係選自由下列所組成之群組：(1)編碼2A肽序列之核苷酸序列；和(2)內部核糖體進入位點(IRES)序列。
  8. 如申請專利範圍第7項之C68 DNA載體，其中該2A肽序列係選自由下列所組成之群組：FMDV、ERAV、PTV1、EMC-B、EMCV、TME-GD7、ERBV、TaV、DrosC、CrPV、ABPV、IFV、豬輪狀病毒、人輪狀病毒、布氏錐蟲TSR1及克氏錐蟲AP核酸內切酶之2A肽序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之C68 DNA載體，其中該2A肽序列係選自由下列所組成之群組：FMDV 2A肽序列和TAV 2A肽序列。
  10. 如申請專利範圍第7項之C68 DNA載體，其中該IRES序列係EMCV IRES序列。
  11. 如申請專利範圍第2項之C68 DNA載體，其中編碼該免疫原性PSA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組：(1)SEQ ID NO：18之核苷酸序列；(2)SEQ ID NO：20之核苷酸序列；(3)包含SEQ ID NO：18之核苷酸10至720的核苷酸序列；及(4)上述(1)至(3)之核苷酸序列的任一者之簡併變異體。
  12. 如申請專利範圍第11項之C68 DNA載體，其中編碼該免疫原性PSCA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組：(1)SEQ ID NO：22之核苷酸序列；(2)包含SEQ ID NO：22之核苷酸10至372之核苷酸序列；及(3)SEQ ID NO：22之核苷酸序列的簡併變異體、或包含SEQ ID NO：22之核苷酸10至372之核苷酸序列的簡併變異體。
  13. 如申請專利範圍第12項之C68 DNA載體，其中編碼該免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列係選自由下列所組成之群組：(1)包含SEQ ID NO：2之核苷酸43至2250的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；(3)SEQ ID NO：6之核苷酸序列；(4)SEQ ID NO：8之核苷酸序列；(5)SEQ ID NO：10之核苷酸序列；(6)包含SEQ ID NO：4之核苷酸10至2217的核苷酸序列；(7)包含SEQ ID NO：6之核苷酸10至2217的核苷酸序列；(8)包含SEQ ID NO：8之核苷酸10至2217的核苷酸序列；(9)包含SEQ ID NO：10之核苷酸10至2217的核苷酸序列；(10)包含SEQ ID NO：58之核苷酸2333至4543的核苷酸序列；(11)包含SEQ ID NO：58之核苷酸2324至4543的核苷酸序列；及(12)上述(1)至(11)之核苷酸序列的任一者之簡併變異體。
  14. 如申請專利範圍第1項之C68 DNA載體，其中該多抗原構建體包含SEQ ID NO：28之核苷酸序列或彼之簡併變異體。
  15. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之C68 DNA載體。
  16. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之C68 DNA載體。
  17. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之C68 DNA載體和醫藥上可接受之賦形劑。
  18. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之C68 DNA載體於製造用於治療人體之前列腺癌的藥物之用途。
  19. 如申請專利範圍第18項之用途，其中該藥物進一步包含免疫調節劑。
  20. 如申請專利範圍第19項之用途，其中該免疫調節劑係選自由下列所組成之群組：CTLA-4抑制劑、CD40激動劑、TLR激動劑、4-1BB激動劑、OX40激動劑、GITR激動劑、PD-1拮抗劑及PD-L1拮抗劑。
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