KR20160068974A - 전립선-연관 항원의 발현을 위한 벡터 - Google Patents

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 개시내용은 (a) 2, 3개, 또는 그 초과의 면역원성 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 다중-항원 구축물을 포함하는 벡터; (b) 상기 벡터를 포함하는 조성물, (c) 전립선암에 대한 면역 반응을 유도하거나 또는 이를 치료하기 위한 상기 벡터 및 조성물의 사용에 관련된 방법을 제공한다.

Description

전립선-연관 항원의 발현을 위한 벡터{VECTORS FOR EXPRESSION OF PROSTATE-ASSOCIATED ANTIGENS}
관련 출원에 대한 참조
본원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 2013년 11월 1일 출원한 미국 특허 가출원 61/898,966을 기초로 한 우선권을 주장한다.
서열 목록에 대한 참조
본원은 전자 형태의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2014년 10월 6일 생성되고 크기가 429 KB이고 명칭이 "PC72055A_FF_SEQ_LISTING_ST25.txt"인 .txt 형식의 파일로서 제출된다. .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본원 명세서의 일부이고, 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역치료, 구체적으로 신생물 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 및 방법에 관한 것이다.
전립선암은 전세계적으로 선진국에서 남성의 두 번째로 가장 흔히 진단되는 암이고 암 관련 사망의 제4의 주된 원인이다. 다양한 전립선-연관 항원 (PAA), 예컨대 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 및 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA)은 정상적인 대응물에 비해 전립선암 세포에 의해 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 이들 항원은 따라서 백신-기반 면역요법의 사용을 통해 항원을 발현하는 암에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 가능한 표적을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Marrari, A., M. lero, et al. (2007). "Vaccination therapy in prostate cancer." Cancer Immunol Immunother 56(4): 429-45] 참조).
PSCA는 123개 아미노산의 막 단백질이다. 천연 전장 인간 PSCA는 서열 21의 아미노산 1 및 4-125로 이루어진다 (각각 제2 및 제3 위치의 알라닌 및 세린 잔기 미포함). PSCA는 높은 조직 특이성을 갖고, 85% 초과의 전립선암 시료에서 발현되고, 그 발현 수준은 글리슨 점수 (Gleason score) 및 안드로겐 비의존성이 높을수록 증가한다. 이것은 전립선암 환자의 뼈 전이 중 80-100%에서 발현된다.
PSA는 전립선의 선방 및 관의 내부를 막처럼 감싸는 원주형 상피 세포에 의해서만 생산되는 칼리크레인-유사 세린 프로테아제이다. PSA mRNA는 불활성 261-아미노산 프리프로PSA 전구체로서 번역된다. 프리프로PSA는 프리-영역 (신호 폴리펩티드) 및 프로폴리펩티드를 구성하는 24개의 추가의 잔기를 갖는다. 프로폴리펩티드의 방출은 효소 활성을 보이는 237-아미노산의 성숙 세포외 형태를 생성한다. 천연 인간 PSA의 전장 서열은 서열 15의 아미노산 4-263으로 이루어진다. PSA는 장기 특이적이고, 그 결과, 양성 전립선 비대 (BPH) 조직, 원발 전립선암 조직, 및 전이성 전립선암 조직의 상피 세포에 의해 생산된다.
폴레이트 히드롤라제 1 (FOLH1)로도 알려진 PSMA는 750개의 아미노산으로 이루어진다. 전장 인간 PSMA의 아미노산 서열은 서열 1에 제시된다. PSMA는 세포질 도메인 (아미노산 1-19), 막횡단 도메인 (아미노산 20-43), 및 세포외 도메인 (아미노산 44-750)을 포함한다. PSMA는 정상 조직보다 전립선암 세포에서 1000배 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 다양한 다른 고형 종양, 예컨대 결장, 유방, 간, 방광, 췌장, 폐, 신장암 및 흑색종 및 육종의 신생혈관계에서 풍부하게 발현된다. 따라서, PSMA는 전립선암 세포에 특이적인 표적뿐만 아니라 다른 암에 대한 pan-암종 표적으로도 간주된다.
매우 많은 종양-연관 항원이 확인되었고 이들 중 많은 항원이 암의 치료 또는 예방을 위한 단백질-기반 또는 DNA-기반 백신으로 연구되었지만, 지금까지 대부분의 임상 시험은 치료 제품의 생산에 실패하였다. 암 백신 개발에서 하나의 과제는 암 항원이 대체로 자기-유래되고, 따라서 면역 시스템은 자기-단백질을 인식하지 않도록 자기-조절되기 때문에 면역원성이 낮다는 사실이다. 따라서, 암 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 향상시키는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
암 백신의 면역원성 또는 항-종양 효능을 향상시키기 위한 많은 방안이 연구되었다. 그러한 방안 중의 하나는 다양한 면역 조절제, 예컨대 TLR 효능제, TNFR 효능제, CTLA-4 억제제, 및 단백질 키나제 억제제의 사용을 수반한다.
Toll-유사 수용체 (TLR)는 조혈 및 비-조혈 세포에서 발현되는 타입 1 막 수용체이다. 적어도 11개의 멤버가 TLR 패밀리에서 확인되었다. 이들 수용체는 병원성 유기체에 의해 발현되는 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP)을 인식하는 그들의 능력을 특징으로 한다. 선천 면역 시스템에서 이들 수용체는 뒤이은 후천 면역 반응의 극성에 대한 제어력을 발휘한다. TLR 중에서, TLR9가 면역 반응에서의 그의 기능에 대해 심도있게 조사되었다. TLR9 수용체의 자극은 염증유발성 시토카인의 생산 및 T 세포에 대한 공동-자극 분자의 제시를 증가시킴으로써 항원-제시 세포 (APC)를 프라이밍 (priming) 효능있는 TH1-우세 T-세포 반응을 향하도록 유도한다. TLR9에 대한 리간드인 CpG 올리고뉴클레오티드는 효능있는 면역자극 인자의 클래스로 밝혀졌다. CpG 요법은 마우스에서 매우 다양한 종양 모델에 대해 시험되었고, 종양 억제 또는 퇴행을 촉진하는 것으로 일관되게 밝혀졌다.
세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4)는 이뮤노글로불린 수퍼패밀리의 멤버이고, 헬퍼 T 세포의 표면 상에 발현된다. CTLA-4는 CD28 의존성 T 세포 활성화의 음성 조절인자이고, 적응 면역 반응에 대한 억제 검문소 (checkpoint)로서 작용한다. T-세포 공동자극 단백질 CD28과 유사하게, CTLA-4는 항원-제시 세포 상의 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 억제 신호를 T 세포로 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 인간 CTLA-4에 대한 인간 항체는 많은 질환 병태에서, 예컨대 바이러스 및 박테리아 감염의 치료 또는 예방 및 암의 치료를 위한 면역자극 조절제로서 설명되어 있다 (WO 01/14424 및 WO 00/37504). 다양한 전임상 연구는 모노클로날 항체에 의한 CTLA-4 차단이 면역원성 종양에 대한 숙주 면역 반응을 향상시키고, 심지어 확립된 종양을 거부할 수 있음을 보여주었다. 2가지 완전 인간 항-인간 CTLA-4 모노클로날 항체 (mAb)인 이필리무맙 (MDX-010) 및 트레멜리무맙 (CP-675206으로도 알려짐)이 다양한 종류의 고형 종양의 치료를 위한 임상 시험에서 조사되었다.
종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리는 특이적 동족 (cognate) 세포 표면 수용체인 TNF 수용체 (TNFR) 수퍼패밀리에 결합하는 일군의 시토카인이다. 종양 괴사 인자 수퍼패밀리의 멤버는 리간드-매개 삼량체화를 통해 작용하고, 신호 전달 경로, 예컨대 아폽토시스 (apoptosis), NF-κB 경로, JNK 경로, 및 면역 및 염증 반응을 활성화하기 위해 몇몇의 세포내 어댑터의 동원을 유도한다. TNF 수퍼패밀리의 예는 CD40 리간드, OX40 리간드, 4-1BB 리간드, CD27, CD30 리간드 (CD153), TNF-알파, TNF-베타, RANK 리간드, LT-알파, LT-베타, GITR 리간드, 및 LIGHT를 포함한다. TNFR 수퍼패밀리는 예를 들어 CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (CD27 리간드), CD30, TNFR2, RANK, LT-베타 R, HVEM, GITR, TROY, 및 RELT를 포함한다. TNF 멤버 중에서, 다양한 CD40 효능제 항체, 예컨대 완전 인간 효능제 CD40 모노클로날 항체 CP870893을 포함하는 CD40 효능제가 요법에 사용하기 위해 심도있게 연구되었다.
단백질 키나제는 단백질 내의 특정 잔기의 인산화를 촉매하는 효소의 패밀리이다. 많은 키나제 억제제가 항암 요법에 사용하기 위해 임상 조사에서 조사되었고, 이들은 예를 들어 MK0457, VX-680, ZD6474, MLN8054, AZD2171, SNS-032, PTK787/ZK222584, 소라페닙 (BAY43-9006), SU5416, SU6668 AMG706, 작티마 (ZD6474), MP-412, 다사티닙, CEP-701, (레스타우르티닙), XL647, XL999, 티케르브, (라파티닙), MLN518 (이전에 CT53518로 알려짐), PKC412, ST1571, AMN107, AEE 788, OSI-930, OSI-817, 수니티닙 말레이트 (수텐트 (Sutent); SU11248), 바탈라닙 (PTK787/ZK 222584), SNS-032, SNS-314 및 악시티닙 (AG-013736)을 포함한다. 게피티닙 및 에를로티닙은 2가지 경구 이용가능 EGFR-TKI이다.
발명의 개요
본 개시내용은 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드의 발현을 위한 침팬지 아데노바이러스 ChAd68 게놈 서열로부터 구축된 벡터에 관한 것이다. 벡터는 (1) C68 DNA 서열, (2) 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드의 발현을 위한 다중-항원 구축물, 및 (3) 항원 생성물 (즉, 면역원성 PAA 폴리펩티드)의 전사 및 번역을 제어하는 조절 서열을 포함한다. 벡터에 포함되는 C68 DNA 서열은 하나 이상의 바이러스 유전자의 기능적 결실에 의해 C68 게놈 서열로부터 유래되지만, 감염성 바이러스 입자의 생산을 위해 충분하다. 특정 실시양태에서, 벡터 내에 사용된 C68 DNA 서열은 E1 및 E3 영역의 기능적 결실만을 갖는 전체 C68 게놈이다.
벡터에 의해 운반되는 다중-항원 구축물은 면역원성 PSMA 폴리펩티드, 면역원성 PSA 폴리펩티드, 및 면역원성 PSCA 폴리펩티드로부터 선택된 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터에 의해 운반되는 다중-항원 구축물은 (1) 적어도 하나의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (2) 적어도 하나의 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 (3) 적어도 하나의 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다중-항원 구축물은 또한 구축물에 의해 코딩되는 별개의 PAA 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 분리자 (separator) 서열을 포함할 수 있다. 분리자 서열의 예는 2A 펩티드 서열 및 IRES를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 다음 구조 중의 하나를 갖는 다중-항원 구축물을 포함한다:
(1) PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA;
(2) PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA;
(3) PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA; 및
(4) PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA.
일부 실시양태에서, 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58의 뉴클레오티드 1115-1825를 포함하거나 또는 서열 58의 뉴클레오티드 1106-1825를 포함하고, 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58의 뉴클레오티드 1892-2257을 포함하거나 또는 서열 58의 뉴클레오티드 1886-2257을 포함하고, 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58의 뉴클레오티드 2333-4543을 포함하거나 또는 서열 58의 뉴클레오티드 2324-4543을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 33, 34, 35, 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 60의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 61의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 포유동물, 예컨대 마우스, 개, 원숭이, 또는 인간에서 PAA에 대한 면역 반응의 유도에 유용한 면역원성 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암의 발생에 대한 보호를 제공하기 위한 (예방제로서 사용된), 또는 PAA 과다발현과 연관된 장애, 예컨대 암, 특히 전립선암의 치료를 위한 (치료제로서 사용된), 포유동물, 예컨대 인간의 면역화에 유용한 백신 조성물이다.
본 개시내용은 또한 포유동물, 특히 인간에서 PAA에 대한 면역 반응의 유도를 위한 또는 암, 예컨대 전립선암의 치료를 위한 벡터 또는 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터 또는 백신 조성물을 포함하는 조성물은 벡터 또는 조성물의 면역원성 또는 효과를 향상시키는 하나 이상의 면역 조절제와 조합하여 포유동물, 특히 인간에게 투여된다. 일부 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 면역-억제성-세포 억제제 및 적어도 하나의 면역-이펙터-세포 증강제와 조합한, 본 발명에서 제공되는 백신의 동시-투여를 수반한다.
도 1. PJV7563 벡터의 개략도.
도 2. 5개의 바이러스 2A 카세트의 아미노산 정렬. 생략된 글라이신-프롤린 결합은 별표로 표시한다.
도 3. 바람직한 EMCV IRES의 서열. 번역 개시 부위는 별표로 표시한다. 최소 IRES 요소는 EMCV L 단백질의 밑줄친 처음 5개의 코돈을 제외한다.
도 4. 피하 TUBO 종양 보유 BALB/neuT 마우스에서 암 백신 (백신)의 항-종양 효능에 대한 수니티닙 말레이트 (수텐트) 및 항-뮤린 CTLA-4 모노클로날 항체 (클론 9D9)의 효과를 평가하는 대표적인 연구로부터 마우스의 군의 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선을 보여주는 그래프.
도 5. 암 백신 (rHER2)에 의해 유도된 항원 특이적 T 세포 반응에 대한 CpG7909 및 항-CD40 항체 (바이옥셀 (Bioxcell) #BE0016-2)의 효과를 평가하는 IFNγ ELISPOT 결과를 보여주는 그래프.
도 6. 시토카인 양성 CD8 T 세포를 측정하는 세포내 시토카인 염색 검정을 사용하여 암 백신 (PMED)에 의해 유도된 면역 반응의 품질에 대한 CpG7909의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여주는 그래프 (*는 스튜던트 T-시험 (Student's T-test)에 의한 P<0.05를 나타낸다).
도 7. 시토카인 양성 CD4 T 세포 (도 7)를 측정하는 세포내 시토카인 염색 검정을 사용하여 암 백신 (PMED)에 의해 유도된 면역 반응의 품질에 대한 CpG7909의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여주는 그래프 (*는 스튜던트 T-시험에 의한 P<0.05를 나타낸다).
도 8. 시토카인 양성 CD8 T 세포를 측정하는 세포내 시토카인 염색 검정을 사용하여 암 백신 (PMED)에 의해 유도된 면역 반응의 품질에 대한 효능제 항-뮤린 CD40 모노클로날 항체의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여주는 그래프 (*는 스튜던트 T-시험에 의한 P<0.05를 나타낸다).
도 9. 시토카인 양성 CD4 T 세포를 측정하는 세포내 시토카인 염색 검정을 사용하여 암 백신 (PMED)에 의해 유도된 면역 반응의 품질에 대한 효능제 항-뮤린 CD40 모노클로날 항체의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여주는 그래프 (*는 스튜던트 T-시험에 의한 P<0.05를 나타낸다).
도 10. 자발적 유방 종양 보유 BALB/neuT 마우스에서 암 백신의 항-종양 효능에 대한 저용량 수니티닙 말레이트 (수텐트)의 효과를 평가하는 대표적인 연구로부터 마우스의 군의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여주는 그래프.
도 11. AdC68-734 벡터의 게놈 구성을 보여주는 그래프. CMV Enh/pro = 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 (immediate early) 인핸서 및 프로모터; tet op = 테트라사이클린 작동유전자; T2A = 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A; F2A = 구제역 바이러스 2A; SV40 pA = 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화 신호; LITR = 좌측 역위 말단 반복체; RITR = 우측 역위 말단 반복체.
도 12. 유동 세포 분석에 의해 삼중 항원 발현 AdC68 벡터로 형질도입된 A549 세포의 표면 상의 PSMA 및 PSCA의 발현을 보여주는 점 그래프.
도 13. AdC68 벡터에 의해 감염된 A549의 용해물에 대한 웨스턴 블롯 (Western blot).
A. 정의
용어 "아주반트 (adjuvant)"는 백신 면역원에 의해 유도되는 면역 반응을 향상시키거나, 가속화하거나 연장할 수 있는 물질을 의미한다.
용어 "효능제"는 또 다른 분자 또는 수용체의 활성을 촉진하는 (유도, 유발, 향상 또는 증가시키는) 물질을 의미한다. 용어 효능제는 수용체에 결합하는 물질 (예를 들어, 항체, 다른 종으로부터의 천연 리간드의 상동체) 및 그에 대해 결합하지 않으면서 수용체 기능을 촉진하는 물질 (예를 들어, 연관 단백질의 활성화에 의해)을 포함한다.
용어 "길항제" 또는 "억제제"는 또 다른 분자 또는 수용체의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 물질을 의미한다.
용어 "동시-투여"는 치료기간 동안 동일한 대상체에게 2 이상의 작용제의 투여를 의미한다. 2 이상의 작용제는 단일 제제 내에 포함될 수 있고, 따라서 동시에 투여될 수 있다. 별법으로, 2 이상의 작용제는 별개의 물리적 제제 내에 포함될 수 있고, 대상체에 별개로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 용어 "동시에 투여되는" 또는 "동시 투여"는 제1 작용제의 투여와 제2 작용제의 투여가 서로 시간상 중첩됨을 의미하고, 용어 "순차적으로 투여되는" 또는 "순차적 투여"는 제1 작용제의 투여와 제2 작용제의 투여가 서로 시간상 중첩되지 않음을 의미한다.
용어 "세포액형 (cytosolic)"은 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후, 발현된 폴리펩티드가 숙주 세포 내에 보유됨을 의미한다.
용어 "축중성 (degenerate) 변이체"는 참조 뉴클레오티드 서열에 비해 염기의 치환이 존재하지만, 유전자 코드의 축중성 때문에 참조 뉴클레오티드 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "유효량"은 포유동물에서 목적하는 효과를 유도하기에 충분한, 포유동물에게 투여되는 양을 나타낸다.
용어 제시된 폴리펩티드의 "단편"은 제시된 폴리펩티드보다 짧고 제시된 폴리펩티드의 서열과 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 의미한다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 측면에서 용어 "동일한" 또는 % "동일성"은 2 이상의 서열 또는 하위서열이 동일하거나, 또는 최대 대응도로 정렬되고 비교될 때, 특정 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는다는 것을 나타낸다.
용어 "면역-이펙터-세포 증강제" 또는 "IEC 증강제"는 포유동물의 하나 이상의 종류의 면역 이펙터 세포의 수, 품질, 또는 기능을 증가 또는 향상시킬 수 있는 물질을 나타낸다. 면역 이펙터 세포의 예는 세포용해성 CD8 T 세포, CD40 T 세포, NK 세포, 및 B 세포를 포함한다.
용어 "면역 조절제"는 포유동물의 선천, 체액성 또는 세포성 면역 시스템의 임의의 성분의 작용을 변경 (예를 들어, 억제, 감소, 증가, 향상 또는 자극)할 수 있는 물질을 나타낸다. 따라서, 용어 "면역 조절제"는 본원에서 규정되는 "면역-이펙터-세포 증강제", 본원에서 규정되는 "면역-억제성-세포 억제제", 및 포유동물의 면역 시스템의 다른 성분에 영향을 주는 물질을 포함한다.
용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응 (예를 들어, Toll 수용체 신호전달 캐스케이드의 활성화), 세포 매개 면역 반응 (예를 들어, T 세포, 예컨대 면역 시스템의 항원-특이적 T 세포, 및 비-특이적 세포에 의해 매개되는 반응), 및 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 세포에 의해 매개되는 반응, 예컨대 항체의 생성 및 혈장, 림프액, 및/또는 조직 유체 내로의 분비)을 포함하고 이로 제한되지 않는 숙주 척추동물의 면역 시스템에 의한 특정 물질 (예컨대, 항원 또는 면역원)의 임의의 검출가능한 반응을 의미한다. 면역 반응의 예는 Toll-유사 수용체 활성화, 림포카인 (예를 들어, 시토카인 (예를 들어, Th1, Th2 또는 Th17 타입 시토카인) 또는 케모카인) 발현 또는 분비, 대식세포 활성화, 수지상 세포 활성화, T 세포 (예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포) 활성화, NK 세포 활성화, B 세포 활성화 (예를 들어, 항체 생성 및/또는 분비), 면역원 (예를 들어, 항원 (예를 들어, 면역원성 폴리폴리펩티드))의 MHC 분자에 대한 결합, 세포독성 T 림프구 ("CTL") 반응의 유도, B 세포 반응 (예를 들어, 항체 생산)의 유도, 및 면역 시스템의 세포 (예를 들어, T 세포 및 B 세포)의 팽창 (예를 들어, 세포 집단의 성장)의 변경 (예를 들어, 증가), 및 항원 제시 세포에 의한 항원의 처리 및 제시 증가를 포함한다. 용어 "면역 반응"은 또한 시험관 내에서 척추동물의 면역 시스템의 하나 이상의 성분에 의한 특정 물질 (예컨대 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출가능한 반응을 포함한다.
용어 "면역원성"은 단독으로 또는 담체에 연결될 상태에서, 특정 항원에 대한 면역 반응을 야기, 유도, 자극 또는 유발하거나, 또는 기존재하는 면역 반응을 개선, 향상, 증가 또는 연장하는 물질의 능력을 나타낸다.
용어 "면역원성 PSA 폴리펩티드"는 인간 PSA 단백질에 대해 또는 인간 PSA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "면역원성 PSCA 폴리펩티드"는 인간 PSCA 단백질에 대해 또는 인간 PSCA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "면역원성 PSMA 폴리펩티드"는 인간 PSMA 단백질에 대해 또는 인간 PSMA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "면역원성 PAA 폴리펩티드"는 본원에서 규정되는 "면역원성 PSA 폴리펩티드", "면역원성 PSCA 폴리펩티드" 또는 "면역원성 PSMA 폴리펩티드"를 의미한다.
용어 "면역-억제성-세포 억제제" 또는 "ISC 억제제"는 포유동물의 면역 억제성 세포의 수 또는 기능을 감소 또는 억제할 수 있는 물질을 나타낸다. 면역 억제성 세포의 예는 조절 T 세포 ("T reg"), 골수성-유래 억제 세포, 및 종양-연관 대식세포를 포함한다.
물질, 예컨대 치료제 또는 면역 조절제의 인간을 포함한 포유동물에 대한 투여의 측면에서 용어 "피내 투여", 또는 "피내 투여된"은 포유동물의 피부의 진피층 내로의 물질의 전달을 의미한다. 포유동물의 피부는 3개의 층 - 표피, 진피, 및 피하층으로 이루어진다. 표피는 피부의 비교적 얇고, 거친 외부층이다. 표피 내의 대부분의 세포는 각질세포이다. 피부의 다음 층인 진피는 피부의 탄력성과 강도를 부여하는 섬유상의 탄성 조직 (대부분 콜라겐, 엘라스틴, 및 피브릴린으로 이루어짐)의 두꺼운 층이다. 진피는 신경말단, 땀샘 및 지방 (피지) 분비선, 모낭, 및 혈관을 포함한다. 진피의 두께는 피부의 위치에 따라 상이하다. 인간에서, 진피는 눈꺼풀에서 약 0.3 mm이고, 등에서 약 3.0 mm이다. 피하층은 보다 큰 혈관 및 신경을 수용하는 지방 및 연결 조직으로 이루어진다. 이 층의 두께는 신체 전체게 걸쳐, 사람마다 상이하다. 용어 "피내 투여"는 진피층 내로의 물질의 전달을 의미한다. 이와 대조적으로, "피하 투여"는 피하층 내로의 물질의 투여를 의미하고, "국소 투여"는 피부의 표면 상의 물질의 투여를 의미한다.
용어 "국소 투여" 또는 "국소 투여된"은 각각 상기 본원에서 정의한 바와 같은 "외용 (topical) 투여", "피내 투여", 및 "피하 투여"를 포함한다. 상기 용어는 또한 "종양내 투여"를 포함하고, 이것은 종양 내 물질의 투여를 의미한다. 국소 투여는 전신 생체분포가 투여된 물질로 달성될 때까지의 시간 동안 투여 부위 주위에 높은 국소 농도를 허용하는 것이 의도되고, "전신 투여"는 투여된 물질이 혈액 내로 흡수되고 순환계를 통해 신체 전체에 걸친 장기 또는 조직으로 분배됨으로써 신속하게 전신 노출을 달성함이 의도된다.
용어 "포유동물"은 포유류 강의 임의의 동물 종을 의미한다. 포유동물의 예는 다음을 포함한다: 인간; 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이; 실험실 동물, 예컨대 래트, 마우스, 기니 피그; 가축, 예컨대 고양이, 개, 토끼, 소, 양, 염소, 말, 및 돼지; 및 사로잡힌 야생 동물, 예컨대 사자, 호랑이, 코끼리 등.
용어 "막-결합된"은 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후, 발현된 폴리펩티드가 세포의 막에 결합되거나, 부착되거나, 또는 다른 방식으로 회합됨을 의미한다.
용어 "신생물 질환"은 세포가 둘러싸는 정상 조직의 속도를 초과하고 이와 조화되지 않은, 비정상적으로 높고 비제어된 속도로 증식하는 병태를 의미한다. 이것은 대체로 "종양"으로 알려진 고형 병변 또는 덩어리를 야기한다. 이 용어는 양성 및 악성 신생물 질환을 포함한다. 본 개시내용에서 용어 "암"과 교환가능하게 사용되는 용어 "악성 신생물 질환"은 신체의 다른 위치로 전파되는 ("전이"로 알려진) 종양 세포의 능력을 특징으로 하는 신생물 질환을 의미한다. 용어 "양성 신생물 질환"은 종양 세포에 전이 능력이 결여된 신생물 질환을 의미한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 설명되는 성분들이 그의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계로 존재하는 병렬 (juxtaposition)을 의미한다. 트랜스젠 (transgene)에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 트랜스젠의 발현이 제어 서열에 적합한 조건 하에 달성되는 방삭으로 라이게이팅된다.
용어 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 상용성이고 투여되는 대상체에서 유의한 나쁜 효과를 야기하지 않는, 면역원성 또는 백신 조성물 내의 활성 성분 (예를 들어, 항원, 항원-코딩 핵산, 면역 조절제, 또는 아주반트) 이외의 다른 물질을 나타낸다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 코딩 및 비-코딩되는 아미노산, 화학적으로, 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태, 및 변형된 폴리펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "예방하는" 또는 "예방하다"는 (a) 장애 발생 방지 또는 (b) 장애의 발현 또는 장애의 증상 발현의 지연을 의미한다.
용어 "전립선-연관-항원" (또는 PAA)는 전립선 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 또는 동일한 조직 종류의 비-종양 세포보다 종양 세포에 의해 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 TAA (본원에서 규정되는)를 의미한다. PAA의 예는 PSA, PSCA, 및 PSMA를 포함한다.
폴리펩티드의 측면에서 용어 "분비된"은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후, 발현된 폴리펩티드가 숙주 세포의 외부에 분비됨을 의미한다.
면역 조절제, 예컨대 단백질 키나제 억제제의 양을 설명하기 위해 사용될 때 용어 "준최적 (suboptimal) 용량"은 면역 조절제를 환자에게 단독 투여할 때 치료받는 질환에 대한 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해 요구되는 최소량 미만의 면역 조절제의 용량을 나타낸다.
용어 "치료하는", "치료", 또는 "치료하다"는 장애의 제거, 장애의 중증도 감소, 또는 장애의 증상의 중증도 또는 발생 빈도의 감소를 의미한다.
용어 "종양-연관 항원" 또는 "TAA"는 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 또는 동일한 조직 종류의 비-종양 세포보다 종양 세포에 의해 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 항원을 의미한다. 종양-연관 항원은 정상적으로는 숙주에 의해 발현되지 않는 항원일 수 있거나; 정상적으로 숙주에 의해 발현되는 분자의 돌연변이된, 말단절단된 (truncated), 오류폴딩된 (misfolded), 또는 다른 비정상적인 표시일 수 있거나; 정상적으로 발현되지만 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 분자와 동일할 수 있거나; 또는 비정상적인 상황 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양-연관 항원은 예를 들어 단백질 또는 단백질 단편, 복합 탄수화물, 강글리오시드, 합텐, 핵산, 또는 이들 또는 다른 생물학적 분자의 임의의 조합물일 수 있다.
용어 "백신"은 특정 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 포유동물에 투여하기 위한 면역원성 조성물을 의미한다.
용어 "벡터"는 외래 핵산 분자를 수송하거나 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 외래 핵산 분자는 "삽입" 또는 "트랜스젠"으로 언급된다. 벡터는 일반적으로 삽입체 및 벡터의 백본으로서 기능하는 보다 큰 서열로 이루어진다. 용어 "벡터"는 발현 벡터 및 전사 벡터를 모두 포함한다. 용어 "발현 벡터"는 표적 세포에서 삽입체를 발현할 수 있는 벡터를 의미한다. 이것은 일반적으로 삽입체의 발현을 유도하는 제어 서열, 예컨대 인핸서, 프로모터, 및 종결자 (terminator) 서열을 함유한다. 용어 "전사 벡터"는 전사될 수 있지만 번역되지는 않는 벡터를 의미한다. 전사 벡터는 그들의 삽입체를 증폭하기 위해 사용된다. 벡터의 구조 또는 기원을 기초로 하여, 벡터의 주요 유형은 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 및 인공 염색체를 포함한다.
B. 다중-항원 구축물을 함유하는 벡터
한 측면에서, 본 개시내용은 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드의 발현을 위해 침팬지 아데노바이러스 ChAd68의 게놈으로부터 구축된 바이러스 벡터를 제공한다. 침팬지 아데노바이러스 ChAd68은 또한 문헌에서 원숭이 아데노바이러스 25, C68, Chad68, SAdV25, PanAd9, 또는 Pan9로서 언급된다. 편의성을 위해, 침팬지 아데노바이러스 ChAd68을 본 명세서에서 "C68"로서 언급할 수 있고, 침팬지 아데노바이러스 ChAd68의 게놈으로부터 구축된 바이러스 벡터를 "C68 벡터"로서 언급한다. C68의 전장 게놈 서열은 젠뱅크 (Genbank) (기탁 번호 AC_000011.1)로부터 이용가능하고, 서열 57에 제시한다. 추가로, C68의 전장 게놈 서열 및 아데노바이러스 유전자 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, I1, I2, L3, L4, 및 L5의 위치는 US 특허 6,083,716에도 제시되어 있다.
본 개시내용에서 제시되는 C68 벡터는 (1) C68 DNA 서열, (2) 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드의 발현을 위한 다중-항원 구축물을 포함한다. 벡터는 또한 항원 생성물의 전사 및 번역을 제어하는 비-천연 조절 서열을 포함할 수 있다. 비-천연 조절 서열은 C68 게놈의 일부가 아닌 서열을 의미한다. C68 DNA 서열, 다중-항원 구축물, 및 조절 서열은 서로 작동가능하게 연결된다.
C68 벡터는 복제-가능, 조건부 복제-가능, 또는 복제-결여 상태일 수 있다. 복제-가능 C68 벡터는 일반적인 숙주 세포, 즉, 일반적으로 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포에서 복제할 수 있다. 복제-가능 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈 내에, 야생형 아데노바이러스에 비해 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환)를 가질 수 있다. 조건부-복제능 C68 벡터는 미리 결정된 조건 하에 복제하도록 조작된 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 복제-필수 유전자 기능, 예를 들어, 아데노바이러스 초기 영역에 의해 코딩되는 유전자 기능은 유도가능, 억제가능, 또는 조직-특이적 전사 제어 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 복제-결핍 C68 벡터는 벡터가 일반적인 숙주 세포, 특히 벡터에 의해 감염시킬 인간의 세포에서 복제하지 않도록, 예를 들어 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능 또는 영역의 결핍의 결과로서 복제에 필요한 바이러스 게놈의 하나 이상의 유전자 기능 또는 영역의 보완을 필요로 하는 바이러스 벡터이다.
벡터는 면역원성 PAA 폴리펩티드의 클로닝 또는 발현을 위해, 또는 조성물, 예컨대 백신 내의 다중-항원 구축물을 숙주 세포에 또는 숙주 동물, 예컨대 인간에게 전달하기 위해 유용하다. 일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 서열 58의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 벡터; (ii) 서열 58의 뉴클레오티드 9 - 34811을 포함하거나 이로 이루어지는 벡터; 및 (iii) 서열 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터를 제공한다.
본 개시내용에서 제시되는 C68 벡터는 또한 본원에서 구체적으로 설명되거나 예시되는 벡터의 기능적 변이체를 포함한다. "기능적 변이체"는 본원에서 구체적으로 설명되거나 예시되는 벡터 ("모 벡터")의 서열에 비해 돌연변이 (예를 들어, 부가, 결실, 또는 치환)를 포함하지만 모 벡터의 기능 또는 특성을 보유하는 벡터를 의미한다. 예를 들어, 기능적 변이체는 본 개시내용에서 예시되는 모 벡터에 대응하는 코돈-최적화 서열을 포함할 수 있다.
B1. C68 DNA 서열
용어 "C68 DNA 서열"은 C68 게놈 서열의 일부인 DNA 서열을 의미한다. 벡터에 포함되는 C68 DNA 서열은 하나 이상의 바이러스 유전자 또는 게놈 영역의 기능적 결실에 의해 C68 게놈 서열로부터 유래된다. 용어 "기능적 결실"은 바이러스의 충분한 양의 유전자 영역이 제거되거나, 예를 들어 돌연변이 또는 변형에 의해 달리 변경되어, 유전자 영역이 더 이상 유전자 발현의 기능적 생성물을 생산할 수 없거나 그의 정상적인 기능을 다른 방식으로 수행함을 의미한다. 전체 유전자 영역의 결실은 종종 복제-필수 유전자 기능의 붕괴를 필요로 하지 않는다. 그러나, C68 게놈 내의 충분한 공간을 하나 이상의 트랜스젠에 대해 제공하기 위해, 대부분의 하나 이상의 유전자 영역의 제거가 바람직할 수 있다. 유전 물질의 결실이 바람직하지만, 부가 또는 치환에 의한 유전 물질의 돌연변이도 유전자 기능의 붕괴를 위해 적절하다.
일부 실시양태에서, 벡터의 C68 DNA 서열은 아데노바이러스 최조기 유전자 E1a 및 지연된 초기 유전자 E1b의 전체, 또는 충분한 부분을 기능적으로 결실시킴으로써 C68 게놈 서열로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, E1a 및 E1b의 기능적 결실 이외에, 기능적 결실은 또한 하나 이상의 다른 유전자, 예컨대 지연된 초기 유전자 E2a, 지연된 초기 유전자 E3, E4, 임의의 후기 유전자 L1 내지 L5, 중기 유전자 IX, 및 IVa2에도 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터의 구축에 사용하기 위한 C68 DNA 서열은 E1 내의 결실만을 포함할 수 있다. 별법으로, 그의 생물학적 활성의 파괴를 위해 효과적인 전체 유전자 또는 그의 일부의 결실은 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 예시적인 벡터에서, C68 DNA 서열은 E1 유전자 및 E4 유전자의, 또는 E1, E2a 및 E3 유전자의, 또는 E1 및 E3 유전자의, 또는 E3의 결실의 존재 또는 부재 하에 E1, E2a 및 E4 유전자의 기능적 결실 등에 의해 C68 게놈 서열로부터 유래된다. 추가로, 상기 결실은 목적하는 결과를 달성하기 위해 다른 돌연변이, 예컨대 온도-감수성 돌연변이와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, C68 DNA 서열은 E1 및 E3 영역에만 기능적 결실이 존재하는 전체 C68 게놈이다.
일부 특정 실시양태에서, E1 유전자의 기능적 결실은 서열 57의 뉴클레오티드 577-3403의 결실에 의해 또는 서열 57의 뉴클레오티드 456-3012의 결실에 의해 수행되고, E3 유전자의 기능적 결실은 서열 57의 뉴클레오티드 27125-31831의 결실에 의해 또는 서열 57의 뉴클레오티드 27812-31330의 결실에 의해 수행된다. 다른 특정 실시양태에서, 벡터에 포함되는 C68 DNA 서열은 서열 57의 뉴클레오티드 3013 - 27811을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 벡터에 포함되는 C68 DNA 서열은 서열 57의 뉴클레오티드 3013 - 27811 및 31331 - 36519를 포함한다.
다중-항원 구축물은 아데노바이러스 게놈의 임의의 결실된 영역 내로 삽입될 수 있다. 다중-항원 구축물은 또한 존재하는 유전자 영역의 기능을 붕괴시키기 위해 이 유전자 영역 내로 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 결실된 E1 유전자 대신에 삽입된다.
B2. 다중-항원 구축물
용어 "다중-항원 구축물"은 2가지 이상의 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 서열을 나타낸다. 상기 분자 또는 서열은 또한 본원에서 "다중-항원 백신" 또는 "다중-항원 플라스미드"로 언급할 수 있다. 다중-항원 구축물은 2가지의 코딩 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있고, 여기서 각각의 코딩 뉴클레오티드 서열은 개별 면역원성 PAA 폴리펩티드를 발현한다. 상기 구축물을 본원에서 또한 "이중 (dual) 항원 구축물", "이중 항원 백신", 또는 "이중 항원 플라스미드"로서 칭한다. 다중-항원 구축물은 또한 3가지의 코딩 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있고, 여기서 각각의 코딩 뉴클레오티드 서열은 개별 면역원성 PAA 폴리펩티드를 발현한다. 그러한 구축물을 또한 본원에서 "삼중 항원 구축물", "삼중 항원 백신", 또는 "삼중 항원 플라스미드"로서 언급한다. 다중-항원 구축물에 의해 코딩되는 개별 PAA 폴리펩티드는 동일한 항원, 예컨대 PSMA, PSA, 또는 PSCA에 대해 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 이중 항원 구축물은 둘 모두 PSMA에 대해 면역원성인 2가지의 상이한 PAA 항원을 발현할 수 있다. 다중-항원 구축물에 의해 코딩되는 개별 PAA 폴리펩티드는 상이한 항원에 대해 면역원성일 수 있고, 예를 들어, 이중 항원 구축물은 PSMA 및 PSA에 대해 면역원성인 2가지의 PAA 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 다중-항원 구축물은 상이한 항원에 대해 면역원성인 2가지 이상의 개별 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 다음 조합물 중 임의의 하나의 적어도 2가지의 면역원성 PAA 폴리펩티드를 코딩한다:
1) 면역원성 PSMA 폴리펩티드 및 면역원성 PSA 폴리펩티드;
2) 면역원성 PSMA 폴리펩티드 및 면역원성 PSCA 폴리펩티드; 및
3) 면역원성 PSA 폴리펩티드 및 면역원성 PSCA 폴리펩티드.
일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 적어도 하나의 면역원성 PSMA 폴리펩티드, 적어도 하나의 면역원성 PSA 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩한다.
다중-항원 구축물에 의해 발현된 면역원성 PSMA 폴리펩티드는 세포액형, 분비형, 또는 막-결합형일 수 있지만, 바람직하게는 막-결합형이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 PSMA 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
1) 서열 1의 아미노산 서열,
2) 서열 1의 아미노산 15-750;
3) 서열 3의 아미노산 서열;
4) 서열 5의 아미노산 서열;
5) 서열 7의 아미노산 서열;
6) 서열 3의 아미노산 4-739;
7) 서열 5의 아미노산 4-739;
8) 서열 7의 아미노산 4-739;
9) 서열 9의 아미노산 서열; 및
10) 서열 9의 아미노산 4-739.
다중-항원 구축물에 의해 발현된 면역원성 PSA 폴리펩티드는 세포액형, 분비형, 또는 막-결합형일 수 있지만, 바람직하게는 세포액형이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 PSA 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
1) 서열 15의 아미노산 27-263;
2) 서열 17의 아미노산 서열;
3) 서열 17의 아미노산 4-240.
다중-항원 구축물에 의해 발현되는 면역원성 PSCA 폴리펩티드는 전장 인간 PSCA 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 PSCA 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
1) 서열 21의 아미노산 서열;
2) 서열 21의 아미노산 2-125; 및
3) 서열 21의 아미노산 4-125.
일부 다른 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 적어도 하나의 면역원성 PSA 폴리펩티드, 적어도 하나의 면역원성 PSCA 폴리펩티드 및 적어도 하나의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 면역원성 PSA 폴리펩티드는 서열 17의 아미노산 서열 또는 서열 17의 아미노산 4-240을 포함하고, 면역원성 PSCA 폴리펩티드는 서열 21의 아미노산 서열 또는 서열 21의 아미노산 2-125를 포함하고, 면역원성 PSMA 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
1) 서열 1의 아미노산 15-750;
2) 서열 9의 아미노산 4-739; 및
3) 서열 9의 아미노산 서열.
일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 60 또는 64의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 (i) 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (ii) 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서
(1) 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 20의 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 18의 뉴클레오티드 10-720을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 1115-1825를 포함하는 뉴클레오티드 서열; (v) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 1106-1825를 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (vi) 상기 (i) - (v)에 제시된 임의의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(2) 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 22의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 22의 뉴클레오티드 10-375를 포함하는 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 1892-2257을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 1886-2257을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (v) 상기 (i) - (iv)에 제시된 임의의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(3) 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 2의 뉴클레오티드 43-2250을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 4의 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 6의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열 8의 뉴클레오티드 서열; (v) 서열 10의 뉴클레오티드 서열; (vi) 서열 4의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (vii) 서열 6의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (viii) 서열 8의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (ix) 서열 10의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (x) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 2333-4543을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (xi) 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 2324-4543을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (xii) 상기 (i) - (xi)에 제시된 임의의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 특이적 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 1106-1825를 포함하고; 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58 또는 서열 62의 뉴클레오티드 1886-2257을 포함하고; 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 58 또는 서열 63의 뉴클레오티드 2324-4543을 포함한다.
벡터에 의해 운반되는 하나의 다중-항원 구축물로부터 별개의 면역원성 PAA 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하기 위해, 개재하는 서열이 개별 면역원성 PAA 폴리펩티드 (즉, PSA, PSCA, 및 PSMA 폴리펩티드)를 코딩하는 서열들 사이에 포함된다. 이들 개재하는 서열은 하류 면역원성 PAA 폴리펩티드의 별개의 번역을 가능하게 한다. 상기 개재하는 서열은 본 명세서에서 "분리자 서열"로서 언급한다. 단일 벡터로부터 다수의 폴리펩티드의 동시-발현을 위해 사용될 수 있는 임의의 서열은 본 개시내용에서 제시되는 벡터에 분리자 서열로서 사용될 수 있다. 유용한 분리자 서열의 예는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 및 2A 펩티드 서열을 포함한다.
절단 카세트 또는 CHYSEL (시스-작용 (cis-acting) 히드롤라제 요소)로도 언급되는 2A 펩티드 및 2A 펩티드-유사 서열은 약 20개 아미노산 길이이고, 고도로 보존된 카르복시 말단 D-V/I-EXNPGP 모티프를 갖는다 (도 2). 서열은 자연에서 희귀하고, 바이러스, 예컨대 구제역 바이러스 (FMDV), 말 비염 A 바이러스 (ERAV), 뇌심근염 바이러스 (EMCV), 돼지 테스코바이러스 (PTV), 및 토세아 아시그나 바이러스 (TAV)에서 가장 흔하게 발견된다 (Luke, G. A., P. de Felipe, et al. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042). 2A-기반 다중-항원 발현 전략을 이용하여, 다수의 표적 항원을 코딩하는 유전자가 2A 서열에 의해 분리되어 단일 개방 해독 프레임 (open reading frame) 내에 함께 연결된다. 전체 개방 해독 프레임을 단일 프로모터 및 종결자를 갖는 벡터 내로 클로닝된다. 구축물을 숙주 세포로 전달 시에, 다수의 항원을 코딩하는 mRNA가 전사되고, 단일 폴리단백질로서 번역된다. 2A 서열의 번역 동안, 리보솜은 C-말단 글라이신 및 프롤린 사이의 결합을 건너뛴다. 리보솜 건너뜀은 하류 단백질로부터 상류를 방출하는 동시번역 자가촉매적 (cotranslational autocatalytic) "절단"처럼 작용한다. 다수의 폴리펩티드를 동시 발현하는 벡터에서 다양한 2A 펩티드 서열의 사용에 대한 일반적인 정보는 그 개시내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Andrea L. Szymczak & Darrio AA Vignali: Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opinion Biol. Ther. (2005)5(5) 627-638]에서 볼 수 있다. 2가지의 단백질 항원 사이에 2A 서열을 포함시키면, 상류 폴리펩티드의 C-말단 상에 ~20개 아미노산이, 및 하류 단백질의 N-말단에 1개의 아미노산 (프롤린)이 부가된다. 상기 방법의 적용시에, 도처에 존재하는 (ubiquitous) 프로테아제가 카세트를 상류 단백질로부터 절단하도록 프로테아제 절단 부위는 2A 카세트의 N 말단에 포함될 수 있다 (Fang, J., S. Yi, et al. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6): 1153-1159).
본 발명에서 사용될 수 있는 특이적 2A-펩티드 서열의 예는 문헌 [Andrea L. Szymczak & Darrio AA Vignali: Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opinion Biol. Ther. (2005)5(5) 627-638]에 개시되어 있고, 표 1에 제공한다.
<표 1> 2A-펩티드 서열
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내부 리보솜 유입 부위 (IRES)는 특정 RNA 분자의 5' 비번역 영역에서 발견되는 RNA 요소 (도 3)이다 (Bonnal, S., C. Boutonnet, et al. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31 (1): 427-428). 이들은 하류 개방 해독 프레임의 번역을 용이하게 하기 위해 진핵 리보솜을 RNA로 유인한다. 정상적인 세포 7-메틸구아노신 캡(cap)-의존성 번역과 달리, IRES-매개 번역은 RNA 분자 내에서 먼 AUG 코돈에서 개시할 수 있다. 고효율 과정은 다중시스트론성 발현 벡터에서 사용하기 위해 이용될 수 있다 (Bochkov, Y. A. and A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288). 바람직한 EMCV IRES (pIRES)의 서열을 도 3 및 서열 59에 제공한다. 최소 EMCV IRES (mIRES)는 도 3에 제시된 바와 같이 EMCV L 단백질의 밑줄친 처음 5개의 코돈을 제외한다. 일반적으로, 2개의 트랜스젠은 2개의 별개의 개방 해독 프레임이 IRES에 의해 분리되는 바와 같이 프로모터와 전사 종결자 사이에서 벡터 내로 삽입된다. 구축물을 숙주 세포로 전달할 때, 두 트랜스젠을 모두 코딩하는 하나의 긴 전사체가 전사될 것이다. 제1 ORF는 전통적인 캡-의존성 방식으로 번역되고, IRES 상류의 중지 코돈 코돈에서 종결될 것이다. 제2 ORF는 IRES를 사용하여 캡-비의존성 방식으로 번역될 것이다. 상기 방식으로, 단일 발현 카세트를 갖는 벡터로부터 전사되는 단일 mRNA로부터 2가지의 독립적인 단백질이 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 59의 뉴클레오티드 1-553을 포함하는 EMCV IRES를 포함한다.
일반적으로, 다중-항원 구축물 상의 2개의 면역원성 PAA 폴리펩티드-코딩 서열 사이에 단지 1개의 분리자 서열이 필요하다. 다중-항원 구축물 상의 분리자 서열, 및 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 순서를 식 (I)에 제시한다:
PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
여기서, (i) PAA1, PAA2, 및 PAA3이 상이한 PAA 폴리펩티드를 코딩할 경우, PAA1, PAA2, 및 PAA3은 각각 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, (ii) SS1 및 SS2는 분리자 서열이고, 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 식 (I)의 다중-항원 구축물을 포함하고, 여기서
(i) PAA1은 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
(ii) PAA2는 면역원성 PSCA 또는 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고 (여기서, PAA2는 면역원성 PSCA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, PAA3은 면역원성 PSMA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 그 반대이고);
(iii) SS1은 2A-펩티드 서열이고;
(iv) SS2는 2A-펩티드 서열 또는 IRES이다.
일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
(1) PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA;
(2) PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA;
(3) PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA; 및
(4) PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA.
구체적인 실시양태에서, 벡터는 식 (I)의 구조를 갖는 다중-항원 구축물을 포함한다:
PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
여기서,
(i) PAA1은 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 1115-1825를 포함하거나 또는 서열 58 또는 63의 1106-1114를 포함하고;
(ii) PAA2는 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 1892-2257을 포함하거나 또는 서열 58 또는 63의 1886-2257을 포함하고;
(iii) PAA3은 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 2333-4543을 포함하거나 또는 서열 58 또는 63의 2324-4543을 포함하고;
(iv) SS1은 T2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
(v) SS2는 F2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
다중-항원 구축물은 또한 면역원성 PAA 폴리펩티드 (즉, 면역원성 PSA, PSCA, 또는 PSMA 폴리펩티드)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 하류 분리자 서열 사이에 링커 (linker) 서열을 포함할 수 있다. 그러한 링커 서열의 한 예는 글라이신-세린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 60의 아미노산 서열을 코딩하거나 서열 61의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 서열 61의 뉴클레오티드 서열, 서열 65의 뉴클레오티드 서열, 서열 66의 뉴클레오티드 서열, 및 임의의 상기 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
B3. 조절 서열
상기 설명된 분리자 서열 및 링커 서열 외에, 벡터는 코딩된 PAA 폴리펩티드의 효율적인 발현을 유도하는 다른 비-천연 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열의 예는 (1) 전사 개시, 종결, 프로모터, 및 인핸서 서열; (2) 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 (splicing) 및 폴리아데닐화 신호; (3) 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; (4) 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코자크 (Kozak) 컨센서스 (consensus) 서열); (5) 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 (6) 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 포유동물 세포 내에서 효율적인 발현을 유도하기 위해 본 개시내용에 의해 제시되는 벡터 내에 사용할 수 있는 프로모터 시스템의 예는 SV40 프로모터, 닭 B 액틴 프로모터, 인간 연장 (elongation) 인자 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 원숭이 CMV 프로모터, 뮤린 CMV 프로모터, 위광견병 (psudorabies) 프로모터, 로우스 (Rous) 육종 바이러스 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 뮤린 백혈병 바이러스 LTR 프로모터, 조류 백혈증 바이러스 LTR 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR 프로모터, 플라스미노겐 활성제 억제제 프로모터, CYR61, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인 프로모터, 마우스 포스포에놀-피루베이트 카르복시키나제 프로모터, 소 B-락토글로불린 프로모터, 소 프로락틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 전사 종결 신호의 예는 SV40 폴리아데닐화 (폴리A); 소 성장 호르몬 폴리A; 토끼 B 글로빈 폴리A; HSV 티미딘 키나제, 당단백질 B, 및 당단백질 D; HPV E 및 L, 및 합성 종결자를 포함한다.
일부 실시양태에서, C68 벡터는 임의로 CMV 인핸서, 및 SV40 폴리A와 함께 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다.
C. 다중-항원 구축물을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물 (벡터 조성물)
본 개시내용은 또한 본 개시내용에서 제시되는 벡터를 포함하는 조성물 (본원에서 "벡터 조성물")을 제공한다. 벡터 조성물은 시험관 내에서 또는 인간을 포함한 포유동물에서 생체 내에서 PAA 단백질에 대한 면역 반응의 유도에 유용하다. 벡터 조성물은 벡터를 단독으로 포함할 수 있거나, 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터 조성물은 본 개시내용에서 제시되는 벡터 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다. 제약 조성물에 적합한 부형제는 관련 기술 분야에 알려져 있다. 부형제는 수성 용액, 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함할 수 있다. 비-수성 부형제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 부형제의 예는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 적합한 부형제는 또한 벡터의 세포 흡수를 돕는 물질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비정상적인 세포 증식을 억제하고, 암의 발병에 대한 보호를 제공하거나 (예방제로서 사용된), 또는 PAA 과다발현과 연관된 암의 치료를 위해 (치료제로서 사용된), 또는 특정 인간 PAA, 예컨대 PSMA, PSA, 및 PSCA에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 인간에 투여하기 위한 백신 조성물이다. 백신 조성물은 하나 이상의 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 백신 조성물 내에 포함될 수 있는 아주반트의 예는 아래에서 제공된다.
D. 벡터 및 벡터 조성물의 용도
다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 논의된 벡터 또는 벡터를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 유효량의 (1) 다중-항원 구축물을 함유하는 벡터, 또는 (2) 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 특히 인간에서 PAA에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간에서 비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 비정상적인 세포 증식은 PAA의 과다발현과 연관된다. 방법은 포유동물에게 유효량의 (1) 2 이상의 면역원성 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 다중-항원 구축물을 함유하는 벡터, 또는 (2) 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인간에서 전립선의 비정상적인 세포 증식을 억제하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 PSMA를 과다발현하는 전립선에서 비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에게 유효량의 (1) 다중-항원 구축물을 함유하는 벡터, 또는 (2) 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 전립선암의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 다중-항원 구축물은 면역원성 PSMA 폴리펩티드, 면역원성 PSA 폴리펩티드, 및 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 삼중 항원 구축물이다.
벡터 또는 벡터 조성물은 관련 기술 분야에 알려진 많은 방법에 의해 인간을 포함한 동물에게 투여될 수 있다. 적합한 방법의 예는 다음을 포함한다: (1) 근육내, 피내, 표피내, 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 복강내 투여, (2) 경구 투여, 및 (3) 외용 적용 (예컨대 눈, 비내, 및 질내 적용). 핵산 백신 조성물의 피내 또는 표피내 투여의 한가지 특정 방법은 유전자 총 전달 기술, 예컨대 PowderMed에 의해 시판되는 입자 매개 표피 전달 (Particle Mediated Epidermal Delivery) (PMED™) 백신 전달 장치의 사용을 수반한다. 핵산 백신의 근육내 투여를 위한 또 다른 특정 방법은 주사 및 이후의 전기천공이다.
제시된 방법에서 투여되는 벡터 또는 벡터 조성물의 유효량은 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 많은 인자에 따라 결정될 것이다. 암, 예컨대 전립선암의 치료 방법에서, 유효량 결정에서 고려될 수 있는 인자는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: (1) 대상체의 면역 상태 및 건강을 포함하는, 치료되는 대상체, (2) 치료되는 암의 중증도 또는 병기, (3) 발현되는 특정 면역원성 PAA 폴리펩티드, (4) 요구되는 보호 또는 치료의 정도, (5) 투여 방법 및 스케줄, (6) 사용되는 제제, 및 (7) 다른 치료제 (예컨대 아주반트 또는 면역 조절제)의 동시-투여. 예를 들어, 벡터의 유효량은 핵산 백신 조성물이 수성 용액으로 제제화되고 피하 침 주사 또는 공기압 (pneumatic) 주사에 의해 투여될 때 2 ㎍/용량 - 10 mg/용량의 범위일 수 있는 반면, 핵산이 코팅된 금 비드로 제조되고 유전자 총 기술을 사용하여 전달될 때는 단지 16 ng/용량 - 16 ㎍/용량이 필요할 수 있다.
본 개시내용에서 제시되는 벡터 또는 백신 조성물을 포함하는 벡터 조성물은 하나 이상의 아주반트와 함께 사용될 수 있다. 적합한 아주반트의 예는 다음을 포함한다: (1) 수중유 에멀젼 제제 (다른 특이적 면역자극제, 예컨대 무라밀 폴리펩티드 또는 박테리아 세포벽 성분 함유 또는 비함유), 예컨대 MF59™ (5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 (Tween) 80, 및 0.5% 소르비탄 트리올레에이트 함유) 및 SAF (10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉 (pluronic)-블록 중합체 L121, 및 thr-MDP 함유); (2) 사포닌 아주반트, 예컨대 QS21, 스티물론(STIMULON)™ (캠브리지 바이오사이언스 (Cambridge Bioscience), 미국 매사추세츠주 워세스터), 아비스코(Abisco)® (이스코노바 (Isconova), 스웨덴), 또는 이스코매트릭스(Iscomatrix)® (커먼웰쓰 시럼 래버러토리스 (Commonwealth Serum Laboratories), 호주); (3) 완전 프로인트 (Freund) 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA); (4) CpG 모티프를 포함하는, 즉 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드 (여기서, 시토신이 메틸화되지 않음)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 문헌 [Krieg, Vaccine (2000) 19:618-622]; [Krieg, Curr Opin Mol Ther (2001) 3:15-24]; WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 및 WO 98/52581); 및 (5) 알루미늄 염 (예컨대 명반 (alum), 인산알루미늄, 수산화알루미늄)을 포함하는 금속 염; (12) 사포닌 및 수중유 에멀젼 (예를 들어 WO 99/11241)를 포함한다.
본 개시내용에서 제시되는 벡터 또는 벡터 조성물은 하나 이상의 면역 조절제와 함께 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 (1) 유효량의 본 발명에서 제공되는 벡터, 벡터 조성물, 또는 백신; (2) 유효량의 적어도 하나의 면역-억제성-세포 억제제 (ISC 억제제); 및 (3) 유효량의 적어도 하나의 면역-이펙터-세포 증강제 (IEC 증강제)를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 특히 인간에서 전립선암의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 본 개시내용에서 "백신-기반 면역치료 요법" (또는 "VBIR")로 언급된다.
IEC 증강제 및 ISC 억제제는 임의의 적합한 방법 및 (1) 전신 투여, 예컨대 정맥내, 근육내, 또는 경구 투여, 및 (2) 국소 투여, 예컨대 피내 및 피하 투여를 포함하는 경로에 의해 투여될 수 있다. 적절한 또는 적합한 경우, 국소 투여가 일반적으로 전신 투여보다 바람직하다. 임의의 IEC 증강제 및 ISC 억제제의 국소 투여는 약제의 국소 투여를 위해 적합한 포유동물의 신체의 임의의 위치에서 수행할 수 있지만; 이들 면역 조절제는 백신 배액 (draining) 림프절에 아주 근접하게 국소 투여되는 것이 보다 바람직하다.
단일 클래스의 IEC 증강제로부터의 2가지 이상의 특이적 IEC 증강제 (예를 들어, 2가지 CTLA-길항제)를 ISC 억제제와 조합하여 투여할 수 있다. 추가로, 2가지 이상의 상이한 클래스의 IEC 증강제로부터의 2가지 이상의 특이적 IEC 증강제 (예를 들어, 하나의 CTLA-4 길항제 및 하나의 TLR 효능제, 또는 하나의 CTLA-4 길항제 및 하나의 PD-1 길항제)가 함께 투여될 수 있다. 유사하게, 단일 클래스의 ISC 억제제로부터의 2가지 이상의 특이적 ISC 억제제 (예를 들어, 2가지 이상의 단백질 키나제 억제제)를 IEC 증강제와 조합하여 투여할 수 있다. 추가로, 2가지 이상의 상이한 클래스의 ISC 억제제로부터의 2가지 이상의 특이적 ISC 억제제 (예를 들어, 하나의 단백질 키나제 억제제 및 하나의 COX-2 억제제)가 함께 투여될 수 있다.
벡터 또는 벡터 조성물은 사용되는 임의의 또는 모든 면역 조절제 (즉, ISC 억제제 및 IEC 증강제)와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 유사하게, 2 이상의 면역 조절제가 사용될 때, 이들은 동시에 또는 서로 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 또는 벡터 조성물은 한 면역 조절제에 대해 동시에 (예를 들어, 혼합물로) 투여되지만, 하나 이상의 추가의 면역 조절제에 대해서는 순차적으로 투여될 수 있다. 벡터 또는 벡터 조성물 및 면역 조절제의 동시-투여는 항원 및 면역 조절제가 동시에 투여되지 않는 경우에도, 백신 및 적어도 하나의 면역 조절제가 각각 투여 부위, 예컨대 백신 배액 림프절에 동시에 존재하도록 투여되는 경우를 포함할 수 있다. 백신 및 면역 조절제의 동시-투여는 또한 백신 또는 면역 조절제가 투여 부위로부터 청소되지만, 청소된 백신 또는 면역 조절제의 적어도 하나의 세포 효과가 적어도 하나 이상의 추가의 면역 조절제가 투여 부위에 투여될 때까지, 투여 부위, 예컨대 백신 배액 림프절에서 지속되는 경우를 포함할 수 있다. 핵산 백신이 CpG와 조합하여 투여되는 경우에, 백신 및 CpG는 단일 제제에 함유되고, 임의의 적합한 방법에 의해 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공동-제제 (혼합물) 내의 핵산 백신 및 CpG는 전기천공과 조합하여 근육내 주사에 의해 투여된다.
임의의 ISC 억제제는 본 발명에서 제공되는 벡터 또는 벡터 조성물과 조합으로 사용될 수 있다. ISC 억제제의 클래스의 예는 PD-1/PD-L1 길항제, 단백질 키나제 억제제, 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제, 포스포디에스테라제 타입 5 (PDE5) 억제제, 및 DNA 가교결합제를 포함한다. PD-1/PD-L1 길항제의 예는 항-PD-1 및 PD-L1 모노클로날 항체를 포함한다. COX-2 억제제의 예는 셀레콕시브 및 로페콕시브를 포함한다. PDE5 억제제의 예는 아바나필, 로데나필, 미로데나필, 실데나필, 타다라필, 바데나필, 유데나필, 및 자프리나스트를 포함한다. DNA 가교결합제의 예는 시클로포스파미드를 포함한다. 특이적 단백질 키나제 억제제의 예는 아래에 상세히 설명한다.
용어 "단백질 키나제 억제제"는 단백질 키나제의 선택적 또는 비-선택적 억제제로서 작용하는 임의의 물질을 나타낸다. 용어 "단백질 키나제"는 아데노신 트리인산염의 말단 인산염의 단백질 기질 내의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기로의 전달을 촉매하는 효소를 나타낸다. 단백질 키나제는 수용체 티로신 키나제 및 비-수용체 티로신 키나제를 포함한다. 수용체 티로신 키나제의 예는 EGFR (예를 들어, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-II1R, IRR (인슐린 수용체-관련 수용체), PDGFR (예를 들어, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (백혈구 티로신 키나제), ALK (역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106을 포함한다. 비-수용체 티로신 키나제의 예는 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK를 포함한다. 본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에서, 단백질 키나제 억제제는 최적하 용량으로 포유동물에게 투여된다. 용어 "최적하 용량"은 표적 신생물 질환에 대해 티로신 키나제 억제제를 단제요법으로 투여할 때 (즉, 단백질 키나제 억제제가 임의의 다른 치료제 없이 단독으로 투여되는 경우) 최소 유효 용량 미만의 용량을 나타낸다.
백신-기반 면역치료 요법에서 사용하기 위해 적합한 특이적 단백질 키나제 억제제의 예는 라파티닙, AZD 2171, ET18OCH 3, 인디루빈-3'-옥심, NSC-154020, PD 169316, 퀘르세틴, 로스코비틴, 트리시리빈, ZD1839, 5-로도투베르시딘, 아다포스틴, 알로이신, 알스테르파울론, 아미노게니스테인, API-2, 아피게닌, 아르크티게닌, ARRY-334543, 악시티닙, AY-22989, AZD 2171, 비스인돌릴말레이미드 IX, CCI-779, 켈레리트린, DMPQ, DRB, 에델포신, ENMD-981693, 엘브스타틴 유사체, 에를로티닙, 파수딜, 게피티닙 (ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, 히드록시파수딜, 켄파울론, KN-62, KY12420, LFM-A13, 루테올린, LY294002, LY-294002, 말로톡신, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, 오로마우신, 옥신돌 I, PD 153035, PD 98059, 플로리진, 피세아타놀, 피크로포도필린, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK-222584, 푸르바라놀 A, 라파뮨, 라파마이신, Ro 31-8220, 로트레린, SB202190, SB203580, 시롤리무스, SL327, SP600125, 스타우로스포린, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, 세막사닙, SU6656, SU6668, syk 억제제, TBB, TCN, 티르포스틴 AG 1024, 티르포스틴 AG 490, 티르포스틴 AG 825, 티르포스틴 AG 957, U0126, W-7, 워트만닌, Y-27632, 작티마, ZM 252868, 게피티닙, 수니티닙 말레이트, 에를로티닙, 라파티닙, 카넬티닙, 세막시닙, 바탈라닙, 소라페닙, 이마티닙, 다사티닙, 레플루노미드, 반데타닙, 및 닐로티닙을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 키나제 억제제는 하나 초과의 특이적 키나제에 대해 작용하는 억제제인 다중-키나제 억제제이다. 다중-키나제 억제제의 예는 이마티닙, 소라페닙, 라파티닙, BIRB-796, 및 AZD-1152, AMG706, 작티마, MP-412, 소라페닙, 다사티닙, 레스타우르티닙, XL647, XL999, 라파티닙, MLN518 (또한 CT53518로서 공지됨), PKC412, ST1571, AEE 788, OSI-930, OSI-817, 수니티닙 말레이트, 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, 보수티닙, 템시롤리스무스 및 닐로티닙을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 티로신 키나제 억제제는 수니티닙, 소라페닙, 또는 수니티닙 또는 소라페닙의 제약상 허용되는 염 또는 유도체 (예컨대 말레이트 또는 토실레이트)이다.
화이자 인크. (Pfizer Inc.)에서 상표명 수텐트로서 시판되는 수니티닙 말레이트는 화학적으로 N-[2-(디에틸아미노)에틸]-5-[(Z)-(5-플루오로-1,2-디히드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리딘)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복스아미드를 갖는 부탄디온산, 히드록시-, (2S)-, 화합물 (1:1)로서 설명된다. 화합물, 그의 합성, 및 특정 다형체는 미국 특허 6,573,293, 미국 특허 공개 2003-0229229, 2003-0069298 및 2005-0059824, 및 문헌 [J. M. Manley, M. J. Kalman, B. G. Conway, C. C. Ball, J. L Havens and R. Vaidyanathan, "Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indolinones", J. Org. Chew. 68, 6447-6450 (2003)]에 기재되어 있다. 수니티닙 및 그의 L-말레이트 염의 제조는 PCT 공개 WO 2004/024127에 기재되어 있다. 수니티닙 말레이트는 제거가 힘든 (unresectable) 국소 진행성 또는 전이성 질환이 있는 환자에서 위장관 기질 종양, 진행성 신세포 암종, 및 진행성의 고도 분화된 췌장 신경내분비 종양의 치료를 위해 미국에서 승인받았다. 인간을 위한 위장관 기질 종양 (GIST) 및 진행성 신세포 암종 (RCC)에 대한 수니티닙 말레이트의 권장 용량은 50 mg 1일 1회 경구 복용으로 치료의 4주 스케줄에 이어 2주 휴약 (off)이다 (스케줄 4/2). 췌장 신경내분비 종양 (pNET)에 대한 수니티닙 말레이트의 권장 용량은 37.5 mg 1일 1회 경구 복용이다.
백신-기반 면역치료 요법에서, 수니티닙 말레이트는 단일 용량으로 또는 다수 용량으로 경구 투여될 수 있다. 대개, 수니티닙 말레이트는 2, 3, 4주 이상의 연속 매주 용량으로 전달된 후, 수니티닙 말레이트를 투여하지 않는 약 1 또는 2주 이상의 "휴약" 기간을 갖는다. 한 실시양태에서, 용량은 약 4주 동안 전달되고, 2주 휴약 기간을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 수니티닙 말레이트는 2주 동안 전달되고, 1주 휴약 기간을 갖는다. 그러나, 또한 전체 치료 기간 동안 "휴약" 기간 없이 전달될 수 있다. 백신-기반 면역치료 요법에서 인간에게 경구 투여되는 수니티닙 말레이트의 유효량은 대개 용량당 사람당 40 mg 미만이다. 예를 들어, 매일 사람당 37.5, 31.25, 25, 18.75, 12.5, 6.25 mg으로 경구 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수니티닙 말레이트는 용량당 사람당 1 - 25 mg의 범위로 경구 투여된다. 일부 다른 실시양태에서, 수니티닙 말레이트는 용량당 사람당 6.25, 12.5, 또는 18.75 mg의 범위로 경구 투여된다. 다른 투여 치료계획 및 변형이 예측가능하고, 의사의 지도를 통해 결정될 것이다.
상표명 넥사바 (NEXAVAR)로서 시판되는 소라페닙 토실레이트는 또한 다중-키나제 억제제이다. 그의 화학명은 4-(4-{3-[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]유레이도}페녹시)-N-메틸피리딘-2-카르복스아미드이다. 이것은 원발 신장암 (진행성 신세포 암종) 및 진행성 원발 간암 (간세포 암종)의 치료를 위해 미국에서 승인받았다. 권장 1일 용량은 400 mg 1일 2회 경구 복용이다. 본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에서, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량은 대개 매일 사람당 400 mg 미만이다. 일부 실시양태에서, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량은 매일 사람당 10 - 300 mg 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 소라페닙 토실레이트의 유효량은 매일 사람당 10 - 200 mg 범위, 예컨대 매일 사람당 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200 mg이다.
상표명 인라이타(INLYTA)로 시판되는 악시티닙은 VEGF 수용체 1, 2, 및 3의 선택적 억제제이다. 그의 화학명은 (N-메틸-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일술파닐]-벤즈아미드이다. 이것은 이전의 한 가지 전신요법 치료에 실패한 후 진행성 신세포 암종의 치료를 위해 승인받았다. 개시 용량은 5 mg 1일 2회 경구 복용이다. 용량 조정은 개인의 안전성 및 내약성에 근거하여 이루어질 수 있다. 본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에서, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량은 대개 1일 2회 5 mg 미만이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량은 1일 2회 1-5 mg이다. 일부 다른 실시양태에서, 경구 투여되는 악시티닙의 유효량은 1일 2회 1, 2, 3, 4, 또는 5 mg이다.
백신-기반 면역치료 요법에서, 임의의 IEC 증강제를 사용할 수 있다. 이들은 소분자 또는 큰 분자 (예컨대 단백질, 폴리펩티드, DNA, RNA, 및 항체)일 수 있다. 사용할 수 있는 IEC 증강제의 예는 TNFR 효능제, CTLA-4 길항제, TLR 효능제, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 길항제 (예컨대 항-PD-1 항체 CT-011), 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 리간드 1 (PD-L1) 길항제 (예컨대 BMS-936559), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3) 길항제, 및 T 세포 이뮤노글로불린- 및 뮤신-도메인-함유 분자-3 (TIM-3) 길항제를 포함한다. 특이적 TNFR 효능제, CTLA-4 길항제, 및 TLR 효능제의 예를 본원에서 아래에 상세히 제공한다.
TNFR 효능제
TNFR 효능제의 예는 OX40, 4-1BB (예컨대 BMS-663513), GITR (예컨대 TRX518), 및 CD40의 효능제를 포함한다. 특이적 CD40 효능제의 예를 본원에서 아래에 상세히 설명한다.
CD40 효능제는 세포 상의 CD40 수용체에 결합하는 물질이고 하나 이상의 CD40 또는 CD40L 연관 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, CD40 "효능제"는 CD40 "리간드"를 포괄한다.
CD40 효능제의 예는 CD40 효능제 항체, CD40 효능제 항체의 단편, CD40 리간드 (CD40L), 및 CD40L의 단편 및 유도체, 예컨대 올리고머체 (예를 들어, 2가, 삼량체성 CD40L), 그의 변이체를 함유하는 융합 단백질을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 CD40 리간드는 세포 상의 하나 이상의 CD40 수용체에 결합하고 활성화시킬 수 있는 임의의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 적합한 CD40 리간드는 예를 들어, 미국 특허 6,482,411; 미국 특허 6,410,711; 미국 특허 6,391,637; 및 미국 특허 5,981,724에 기재되어 있고, 모든 상기 특허 및 출원과 여기에 개시된 CD40L 서열을 전체를 본원에 참조로 포함시킨다. 인간 CD40 리간드가 인간 치료법에서 사용하기 위해 바람직할 것이지만, 임의의 종으로부터의 CD40 리간드를 본 발명에서 사용할 수 있다. 다른 동물 종에서 사용하기 위해, 예컨대 수의과 실시양태에서, 치료받는 동물에 매칭시킨 CD40 리간드의 종이 바람직할 것이다. 특정 실시양태에서, CD40 리간드는 천연 형성 gp39 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 올리고머뿐만 아니라 올리고머화 서열을 포함하는 gp39 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 (및 코딩 핵산)을 포함한 gp39 펩티드 또는 단백질 올리고머이다. 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 올리고머가 본 발명의 특정 측면에서 바람직한 한편, 본 발명의 다른 측면에서, 올리고머 구조가 하나 이상의 CD40 수용체(들)에 결합하고 활성화시키는 능력을 보유하는 한 보다 큰 올리고머 구조가 사용을 위해 고려된다.
특정 다른 실시양태에서, CD40 효능제는 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항체는 인간, 인간화 또는 부분-인간 키메라 항-CD40 항체일 수 있다. 특이적 항-CD40 모노클로날 항체의 예는 G28-5, mAb89, EA-5 또는 S2C6 모노클로날 항체, 및 CP870893을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CD40 효능제 항체는 CP870893 또는 다세투주맙 (SGN-40)이다.
CP-870,893은 항-종양 치료제로서 임상 조사된 완전 인간 효능제 CD40 모노클로날 항체 (mAb)이다. CP870,893의 구조 및 제조는 WO2003041070에 개시되어 있다 (여기서, 항체는 내부 확인된 "21.4.1"에 의해 확인된다). CP-870,893의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 각각 서열 40 및 서열 41에 제시한다. 임상 시험에서, CP870,893은 일반적으로 주입당 0.05 - 0.25 mg/kg 범위의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되었다. I상 임상 연구에서, CP-870893의 최대 허용 용량 (MTD)은 0.2 mg/kg인 것으로 추정되고, 용량-제한 독성은 등급 3 CRS 및 등급 3 두드러기를 포함하였다 (Jens Ruter et al.: Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors. [Cancer Biology & Therapy 10:10, 983-993; November 15, 2010]). 본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에서, CP-870,893은 피내, 피하, 또는 외용 투여될 수 있다. 피내 투여되는 것이 바람직하다. 치료법에서 투여할 CP870893의 유효량은 일반적으로 0.2 mg/kg 미만, 대개 0.01 mg - 0.15 mg/kg, 또는 0.05 - 0.1 mg/kg 범위이다.
다세투주맙 (또한 SGN-40 또는 huS2C6로서도 알려짐; CAS 번호 88-486-59-9)은 무통성 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종 및 다발 골수종에 대한 임상 시험에서 조사되고 있는 또 다른 항-CD40 효능제 항체이다. 임상 시험에서, 다세투주맙은 2 mg/kg 내지 16 mg/kg 범위의 매주 용량으로 정맥내 투여되었다. 본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에서, 다세투주맙은 피내, 피하, 또는 외용 투여될 수 있다. 피내 투여되는 것이 바람직하다. 백신-기반 면역치료 요법에서 투여될 다세투주맙의 유효량은 일반적으로 16 mg/kg 미만, 대개 0.2 mg - 14 mg/kg 또는 0.5 - 8 mg/kg, 또는 1 - 5 mg/kg 범위이다.
CTLA -4 억제제.
본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법에 사용하기 위해 적합한 항-CTLA-4 길항제는 비제한적으로 항-CTLA-4 항체 (예컨대 인간 항-CTLA-4 항체, 마우스 항-CTLA-4 항체, 포유동물 항-CTLA-4 항체, 인간화 항-CTLA-4 항체, 모노클로날 항-CTLA-4 항체, 폴리클로날 항-CTLA-4 항체, 키메라 항-CTLA-4 항체, 항-CTLA-4 도메인 항체), 항-CTLA-4 항체의 단편 (예컨대 단일쇄 항-CTLA-4 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 및 경쇄 항-CTLA-4 단편), 및 공동-자극 경로에 작용성인 CTLA-4의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 억제제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다.
예르보이 (YERVOY)로서 시판되는 이필리무맙 (또한 MEX-010 또는 MDX-101로도 알려짐)은 인간 항-인간 CTLA-4 항체이다. 이필리무맙은 또한 그의 CAS 등록 No. 477202-00-9로 언급할 수 있고, 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 PCT 공개 WO01/14424에 항체 10DI로서 개시되어 있다. 이필리무맙을 포함하는 제약 조성물의 예는 PCT 공개 WO2007/67959에 제공되어 있다. 이필리무맙은 제거가 힘든 또는 전이성 흑색종의 치료에 대해 미국에서 승인받았다. 단제요법으로서 이필리무맙의 권장 용량은 총 4회 용량에 대해 3주마다 정맥내 투여되는 3 mg/kg이다. 본 발명에서 제공되는 방법에서, 이필리무맙은 국소, 특히 피내 또는 피하 투여된다. 국소 투여되는 이필리무맙의 유효량은 대개 사람당 5 - 200 mg/용량의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙의 유효량은 사람당 10 - 150 mg/용량의 범위 내에 있다. 일부 특정 실시양태에서, 이필리무맙의 유효량은 사람당 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 mg/용량이다.
트레멜리무맙(또한 CP-675,206로서 공지됨)은 완전 인간 IgG2 모노클로날 항체이고, CAS 번호 745013-59-6를 갖는다. 트레멜리무맙은 모든 목적을 위해 그 전문을 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,682,736에 항체 11.2.1로 개시되어 있다. 트레멜리무맙의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 각각 서열 42 및 43에 제시한다. 트레멜리무맙은 흑색종 및 유방암을 비롯한 다양한 종양의 치료를 위해 임상 시험에서 연구되고 있고; 여기서, 트레멜리무맙은 0.01 내지 15 mg/kg의 용량 범위에서 단일 용량으로서 또는 다수 용량으로서 4주 또는 12주마다 정맥내 투여된다. 본 발명에서 제공되는 치료법에서, 트레멜리무맙은 국소, 특히 피내 또는 피하 투여된다. 피내 또는 피하 투여되는 트레멜리무맙의 유효량은 대개 사람당 5 - 200 mg/용량의 범위이다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 사람당 10 - 150 mg/용량의 범위 내에 있다. 일부 특정 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 사람당 약 10, 25, 37.5, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 mg/용량이다.
Toll-유사 수용체 ( TLR ) 효능제.
용어 "toll-유사 수용체 효능제" 또는 "TLR 효능제"는 toll-유사 수용체 (TLR)의 효능제로서 작용하는 화합물을 나타낸다. 이것은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, 및 TLR11 또는 그의 조합물의 효능제를 포함한다. 달리 지시되지 않으면, TLR 효능제 화합물에 대한 언급은 임의의 이성질체 (예를 들어, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체), 염, 용매화물, 다형체 등을 비롯한 임의의 제약상 허용되는 형태의 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 화합물이 광학 활성이면, 화합물에 대한 언급은 각각의 화합물의 거울상이성질체 및 거울상이성질체의 라세미체 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 화합물은 하나 이상의 특정 TLR의 효능제 (예를 들어, TLR7 효능제, TLR8 효능제, 또는 TLR7/8 효능제)로서 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, TLR 효능제는 TLR9 효능제, 특히 CpG 올리고뉴클레오티드 (또는 CpG.ODN)이다. CpG 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 결합에 의해 연결된 시토신에 이어지는 구아닌을 함유하는 짧은 핵산 분자이고, 여기서 시토신의 피리미딘 고리는 메틸화되지 않는다. CpG 모티프는 중심 CpG의 (3' 및 5' 측면 상에) 측면에 있는 적어도 하나의 염기에 의해 둘러싸인, 메틸화되지 않은 중심 CpG를 포함하는 염기의 패턴이다. CpG 올리고뉴클레오티드는 D 및 K 올리고뉴클레오티드를 모두 포함한다. 전체 CpG 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않을 수 있거나, 또는 일부가 메틸화되지 않을 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 유용한 CpG 올리고뉴클레오티드의 예는 미국 특허 6194388, 6207646, 6214806, 628371, 6239116, 및 6339068에 개시된 것을 포함한다.
본원에서 제공되는 방법에서 유용한 특정 CpG 올리고뉴클레오티드의 예는 다음을 포함한다:
5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG 7909);
5'TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG 24555); 및
5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG 10103).
CpG7909 (합성 24량체 단일 가닥 올리고뉴클레오티드)는 암의 치료를 위해 단제요법으로서 및 화학요법제와 조합으로, 및 암 및 감염성 질환에 대한 백신을 위한 아주반트로서 광범하게 조사되었다. CpG 7909의 단일 정맥내 용량은 1.05 mg/kg까지 임상 효과 및 유의한 독성 없이 잘 견뎌진 한편, 단일 용량 피하 CpG 7909는 근육통 및 구성적 효과의 용량 제한 독성을 가지면서 0.45 mg/kg의 최대 허용 용량 (MTD)을 가졌음이 보고되었다 (문헌 [Zent, Clive S, et al.: Phase I clinical trial of CpG 7909 (PF-03512676) in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 53(2):211-217(7)(2012)] 참조). 본원에서 제공되는 치료법에서, CpG7909는 주사에 의해 근육 내로 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 백신 배액 림프절에 근접하게, 특히 피내 또는 피하 투여에 의해 국소 투여되는 것이 바람직하다. 핵산 백신, 예컨대 DNA 백신과 함께 사용하기 위해, CpG는 바람직하게는 단일 제제 내에 백신과 함께 동시-조제되고, 전기천공과 연결된 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 근육내, 피내, 또는 피하 투여에 의한 CpG7909의 유효량은 대개 10 ㎍/용량 - 10 mg/용량의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CpG7909의 유효량은 0.05 mg - 14 mg/용량의 범위 내에 있다. 일부 특정 실시양태에서, CpG7909의 유효량은 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1 mg/용량이다. CpG 24555 및 CpG 10103을 비롯한 다른 CpG 올리고뉴클레오티드가 유사한 방식 및 용량 수준으로 투여될 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에게 (1) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 적어도 하나의 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 신생물 질환의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 향상시키는 방법을 제공하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 소라페닙 토실레이트, 수니티닙 말레이트, 악시티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, 보수티닙, 템시롤리스무스, 또는 닐로티닙으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 하나의 IEC 증강제는 CTLA-4 억제제, TLR 효능제, 또는 CD40 효능제로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 치료법은 인간에게 (1) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제 및 (2) 유효량의 적어도 하나의 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 악시티닙, 소라페닙 토실레이트, 또는 수니티닙 말레이트로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 하나의 IEC 증강제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙로부터 선택된 CTLA-4 억제제이다. 일부 추가의 바람직한 실시양태에서, 치료법은 인간에게 (1) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 적어도 2가지 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 수니티닙 또는 악시티닙으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 2가지 IEC 증강제는 트레멜리무맙, 및 CpG7909, CpG2455, 또는 CpG10103으로부터 선택된 TLR 효능제이다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에게 (1) 인간 PAA에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 유효량의 백신, (2) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제, 및 (3) 유효량의 적어도 하나의 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 전립선암의 치료 방법을 제공하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 소라페닙 토실레이트, 수니티닙 말레이트, 악시티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, 보수티닙, 템시롤리스무스, 또는 닐로티닙으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 하나의 IEC 증강제는 CTLA-4 억제제, TLR 효능제, 또는 CD40 효능제로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 방법은 인간에게 (1) 인간 PAA에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 유효량의 백신, (2) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제, 및 (3) 유효량의 적어도 하나의 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 소라페닙 토실레이트, 수니티닙 말레이트, 또는 악시티닙으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 하나의 IEC 증강제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙으로부터 선택된 CTLA-4 억제제이다.
일부 추가의 특이적 실시양태에서, 방법은 인간에게 (1) 유효량의 적어도 하나의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 적어도 2가지 IEC 증강제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISC 억제제는 수니티닙 또는 악시티닙으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제이고, 적어도 2가지 IEC 증강제는 트레멜리무맙, 및 CpG7909, CpG2455, 또는 CpG10103으로부터 선택된 TLR 효능제이다.
추가의 치료제.
본원에서 제공되는 백신-기반 면역치료 요법은 추가의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 화학요법제 및 호르몬 치료제를 비롯한 매우 다양한 암 치료제가 사용될 수 있다. 용어 "화학요법제"는 암 세포의 사멸을 유발하거나, 암 세포의 성장, 분할, 수복, 및/또는 기능을 저해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 나타낸다. 특정 화학요법제의 예는 아비라테론 아세테이트, 카바지탁셀, 데가렐릭스, 데노수맙, 도세탁셀, 엔잘루타미드, 류프롤라이드 아세테이트, 프레드니손, 시푸류셀-T, 및 염화라듐223을 포함한다. 용어 "호르몬 치료제"는 호르몬의 생산을 억제 또는 제거하거나, 또는 암 세포의 성장 및/또는 생존에 대한 호르몬의 효과를 억제 또는 중화시키는 화학적 또는 생물학적 물질을 나타낸다. 특정 호르몬 치료제의 예는 류프롤라이드, 고세렐린, 트립토렐린, 히스트렐린, 비칼루타미드, 플루타미드, 및 닐루타미드를 포함한다. 본원에서 제공되는 VBIR은 (1) 난소, 고환, 부신선 및 뇌하수체와 같은, 호르몬의 생산에 관여하는 장기 또는 분비샘의 전부 또는 일부를 제거하는 수술적 방법, 및 (2) 환자의 장기 또는 분비샘이 표적화된 호르몬의 생산을 억제 또는 제거하기 위해 충분한 양의 방사선에 노출되는 방사선 치료를 비롯한 다른 치료법과 조합으로 또한 사용될 수 있다.
E. 실시예
다음 실시예를 본 발명의 특정 실시양태를 예시하기 위해 제공한다. 이것은 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 및 그 취지와 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 용도 및 조건에 맞도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 이룰 수 있다.
실시예 1. 인간 PSMA 단백질로부터 유래된 세포액형, 분비형, 및 막-결합형 형식의 항원
1A. 면역원성 PSMA 폴리펩티드의 설계
세포액형, 분비형, 및 변형된 형식의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 구축물을 천연 인간 PSMA 단백질 서열에 기반하여 구축하고, 항-종양 이펙터 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 각각의 인간 PSMA 항원 형식의 구조 및 제조를 다음과 같이 제공한다.
1A1. 인간 PSMA 세포액형 항원. 세포액형 형태의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 일단 발현된 후에 면역원성 폴리펩티드를 세포 내부에 보유하도록 설계하였다. 인간 PSMA의 세포질 도메인 (아미노산 1-19) 및 막횡단 도메인 (아미노산 20-43)을 제거하여, 서열 1의 인간 PSMA의 아미노산 44-750 (세포외 도메인 또는 ECD)로 이루어지는 세포액형 PSMA 폴리펩티드를 생성하였다. 발현을 향상시키기 위해 또는 클로닝을 용이하게 하기 위해 최적 코자크 서열 "MAS"를 폴리펩티드의 N-말단에 첨가할 수 있다.
1A2. 인간 PSMA 분비형 항원. 분비형 형태의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 일단 발현된 후에 폴리펩티드를 세포 외부로 분비하도록 설계하였다. 분비형 폴리펩티드는 서열 1의 인간 PSMA의 아미노산 44-750 (ECD), 아미노산 서열 ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD을 갖는 Ig 카파 분비 요소, 및 일단 발현된 후에 PSMA 항원의 분비를 최대화하기 위해 N-말단에 2-아미노산 링커 (AA)로 이루어진다.
1A3. 인간 PSMA 막-결합형 항원. 면역원성 PSMA 막-결합형 폴리펩티드를 폴리펩티드를 세포 표면 상에 안정화시키도록 설계하였다. 인간 PSMA 단백질의 처음 14개 아미노산을 제거하고, 생성된 면역원성 폴리펩티드는 서열 1의 인간 PSMA 단백질의 아미노산 15-750으로 이루어진다. 서열 1의 천연 인간 PSMA 단백질의 아미노산 15-750으로 이루어지고 천연 인간 PSMA 단백질과 100% 서열 동일성을 공유하는 면역원성 폴리펩티드를 본원에서 "인간 PSMA 변형된", "hPSMA 변형된", 또는 "hPSMAmod" 항원으로 또한 칭한다. 인간 PSMA 변형된 항원 (서열 9)의 변이체인 다음 3가지 면역원성 PSMA 폴리펩티드 ("셔플링된 (shuffled) PSMA 변형된 항원"으로서 언급함)를 또한 생성하였다:
(1) 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 셔플링된 PSMA 변형된 항원 1;
(2) 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2; 및
(3) 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 셔플링된 PSMA 변형된 항원 3.
셔플링된 PSMA 변형된 항원 1, 2, 및 3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 각각 서열 4, 6, 및 8에 제시한다.
1B. PSMA 항원을 발현하기 위한 DNA 플라스미드의 제조
PSMA 세포액형, PSMA 분비형, 및 PSMA 변형된 항원을 코딩하는 DNA 구축물을 동물에서 생체내 시험을 위해 적합한 PJV7563 벡터 내로 개별적으로 클로닝하였다 (도 1). 설계 완전성 (integrity)을 확인하기 위해, PJV7563 벡터 내의 DNA의 양 가닥을 서열 결정하였다.
서열 확인된 클론으로부터 대규모 플라스미드 DNA 제제 (퀴아젠 (Qiagen)/CsCl)를 생산하였다. 플라스미드 DNA의 품질은 높은 260/280 비, 높은 수퍼코일드 (super coiled)/닉드 (nicked) DNA 비, 낮은 내독소 수준 (<10 U/mg DNA) 및 음성 생물부하 (bio burden)에 의해 확인하였다.
1C. 포유동물 세포 내에서 PSMA 구축물의 발현
PSMA 세포액형, 분비형, 및 변형된 항원의 발현을 FACS에 의해 결정하였다. 포유동물 293 세포를 다양한 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 PJV7563 PMED 벡터로 형질감염시켰다. 3일 후에, 293 세포를 마우스 항-PSMA 항체에 이어 형광 접합된 (FITC) 래트 항-마우스 2차 항체로 염색하였다. 결과를 표 2에 제시한다. 데이타를 음성 대조군에 비해 평균 형광 강도 (MFI)로서 기록하였고, 이것은 인간 PSMA 변형된 항원이 세포 표면 상에 발현되는 것을 확인하였다.
<표 2> 세포 표면 상의 인간 PSMA 변형된 항원의 발현
Figure pct00002
실시예 2. 다양한 면역원성 PSA 폴리펩티드의 설계
3A. 면역원성 PSA 폴리펩티드의 구축
3가지 상이한 면역원성 PSMA 폴리펩티드 형태 (예를 들어, 세포액형, 막-결합형, 및 분비형 형태)에 대해 실시예 1에 설명된 것과 유사하게, 3가지 형태의 면역원성 PSA 폴리펩티드를 또한 인간 PSA 서열에 기반하여 설계하였다. 세포액형 형태의 면역원성 PSA 폴리펩티드 (이것은 천연 인간 PSA의 아미노산 25-261로 이루어짐)는 분비 신호 및 프로 (pro) 도메인 (아미노산 1-24)을 결실시킴으로써 구축하였다. 상기 세포액형 면역원성 PSA 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열 17에 제공한다. 분비형 형태의 PSA 폴리펩티드는 천연 전장 인간 PSA (아미노산 1-261)이다. 막-결합형 형태의 면역원성 PSA 폴리펩티드는 면역원성 PSA 폴리펩티드 세포액형 형태 (천연 인간 PSA의 아미노산 25-261)를 인간 PSMA 막횡단 도메인 (인간 PSMA의 아미노산 15-54)에 연결시킴으로써 구축하였다.
3B. 파스퇴르 및 HLA A24 마우스에서 면역 반응
연구 설계. 8 내지 10주령 HLA A2 파스퇴르 마우스 또는 HLA A24 마우스를 실시예 1에 설명된 바와 같이 각각의 백신접종 사이에 2주 간격을 갖는 초회접종(prime)/추가접종(boost)/추가접종 요법으로, 실시예 3A에 제공된 PMED를 이용하여 다양한 PSA 항원을 발현하는 DNA로 면역화하였다. 항원 특이적 T 및 B 세포 반응을, 마지막 면역화의 7일 후에 인터페론-감마 (IFNγ) ELISPOT 검정 및 샌드위치 (sandwich) ELISA에서 측정하였다.
표 3에 제시된 ELISpot 데이타는 세포액형 및 막-결합형 형태의 면역원성 PSA 폴리펩티드가 모두 세포액형 PSA 항원을 발현하도록 아데노바이러스로 형질유도된 인간 종양 세포 (SKmel5-Ad-PSA)를 인식하지만 eGFP를 발현하도록 아데노바이러스로 형질유도된 세포 (SKmel5-Ad-eGFP)를 인식하지 않는 T 세포를 유도할 수 있음을 나타낸다. 이들 2가지 항원은 또한 PSA 단백질에 대한 반응을 야기하였다. PSA 분비형 항원은 SKmel5-Ad-PSA 또는 PSA 단백질에 대해 T 세포를 유도하지 못하였다. SFC>50을 양성으로 간주한다.
<표 3> PSA+ HLA A2.1+ SKmel5 인간 암세포에 대한 파스퇴르 마우스에서 PSA 항원에 의한 T 세포 반응의 유도
Figure pct00003
<표 4> 샌드위치 ELISA 검정에 의해 측정된 항-PSA 항체 반응의 유도
Figure pct00004
표 4의 데이타는 분비형 및 막-결합형 형태의 면역원성 PSA 폴리펩티드가 모두 항-PSA 항체 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 3. 다중-항원 백신 구축물의 구축
본 실시예에서, 상이한 전략을 이용하는 다중-항원 구축물을 포함하는 플라스미드의 구축을 설명한다. 이들 플라스미드는 pPJV7563과 동일한 일반적인 플라스미드 백본을 공유한다. 달리 특정되지 않으면, 다중-항원 구축물에 포함되는 유전자는 (1) 서열 9의 면역원성 PSMA 폴리펩티드, (2) 서열 21의 아미노산 2-125를 포함하는 면역원성 PSCA 폴리펩티드, 및 (3) 서열 17의 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩한다.
실시예 3A. 이중 항원 구축물을 포함하는 플라스미드
3A1. 다중 프로모터를 이용하는 플라스미드의 구축
플라스미드 460 ( PSMA / PSCA 이중 프로모터). 부위-지정 돌연변이유발, PCR, 및 제한 단편 삽입의 기술을 이용하여 플라스미드 460을 구축하였다. 먼저, Kpn I 제한 부위를 제조자의 프로토콜 (퀵체인지 (Quickchange) 키트, 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타클라라)에 따라 MD5 및 MD6 프라이머를 사용하는 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 플라스미드 5259 내에서 CMV 프로모터의 상류에 도입하였다. 두 번째로, 최소 CMV 프로모터, 인간 PSMA, 및 토끼 B 글로불린 전사 종결자로 이루어지는 발현 카세트를, Kpn I 제한 부위를 보유하는 프라이머 (MD7 및 MD8)을 이용하여 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 앰플리콘을 Kpn I로 소화시키고, 소 창자 알칼리성 포스파타제 (CIP)-처리한 플라스미드 5259의 새로 도입된 Kpn I 부위 내로 삽입하였다.
3A2. 2A 펩티드를 이용하는 이중 항원 구축물의 구축
플라스미드 451 ( PSMA - T2A - PSCA). 플라스미드 451은 중복 (overlapping) PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, 인간 PSMA 아미노산 15-750을 코딩하는 유전자를, 프라이머 119 및 117을 사용하여 주형 (template)으로서 플라스미드 5166을 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 전장 인간 PSCA를 코딩하는 유전자를, 프라이머 118 및 120을 사용하여 주형으로서 플라스미드 5259를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. PCR은 PSMA의 3' 단부 및 PSCA의 5' 단부에서 중복 TAV 2A (T2A) 서열의 부가를 일으켰다. 앰플리콘들을 함께 혼합하고, 프라이머 119 및 120을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. PSMA-T2A-PSCA 앰플리콘을 Nhe I 및 Bgl II로 소화시키고, 유사하게 소화시킨 플라스미드 5166 내로 삽입하였다. 높은 절단 효율을 촉진시키기 위해 글라이신-세린 링커를 PSMA 및 T2A 카세트 사이에 포함시켰다.
플라스미드 454 ( PSCA - F2A - PSMA). 플라스미드 454는 PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 생성하였다. 먼저, 전장 인간 PSCA를 코딩하는 유전자를, 프라이머 42 및 132를 사용하여 주형으로서 플라스미드 5259를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 앰플리콘을 BamH I로 소화시키고 유사하게 소화시킨, CIP-처리된 플라스미드 5300 내로 삽입하였다. 높은 절단 효율을 촉진시키기 위해 글라이신-세린 링커를 PSCA 및 FMDV 2A (F2A) 카세트 사이에 포함시켰다.
플라스미드 5300 (PSA- F2A - PSMA). 플라스미드 5300을 중복 PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, PSA 아미노산 25-261을 코딩하는 유전자를, 프라이머 MD1 및 MD2를 사용하여 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 인간 PSMA 아미노산 15-750을 코딩하는 유전자를, 프라이머 MD3 및 MD4를 사용하여 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. PCR은 PSA의 3' 단부 및 PSMA의 5' 단부에서 겹치는 F2A 서열의 부가를 일으켰다. 앰플리콘들을 함께 혼합하고 PCR에 의해 연장시켰다. PSA-F2A-PSMA 앰플리콘을 Nhe I 및 Bgl II로 소화시키고, 유사하게 소화시킨 플라스미드 pPJV7563 내로 삽입하였다.
3A3. 내부 리보솜 유입 부위를 이용하는 이중 항원 구축물
플라스미드 449 ( PSMA - mIRES - PSCA). 플라스미드 449는 중복 PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, 전장 인간 PSCA를 코딩하는 유전자를, 프라이머 124 및 123을 사용하여 플라스미드 5259로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 최소 EMCV IRES를, 프라이머 101 및 125를 사용하여 pShuttle-IRES로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 겹치는 앰플리콘들을 함께 혼합하고, 프라이머 101 및 123을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. IRES-PSCA 앰플리콘을 Bgl II 및 BamH I로 소화시키고, Bgl II-소화시킨, CIP-처리된 플라스미드 5166 내로 삽입하였다. 자발적 돌연변이를 IRES 내에 고정하기 위해, Avr II 내지 Kpn I 서열을 함유하는 IRES를 pShuttle-IRES로부터 동등한 단편으로 교체하였다.
플라스미드 603 ( PSCA - pIRES - PSMA). 플라스미드 603은 PCR 및 무접합 클로닝 (seamless cloning)의 기술을 이용하여 구축하였다. 그의 3' 단부에서 바람직한 EMCV IRES에 부착된 전장 인간 PSCA를 코딩하는 유전자를, 프라이머 SD546 및 SD547를 사용하여 플라스미드 455로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 인간 PSMA 아미노산 15-750을 코딩하는 유전자를, 프라이머 SD548 및 SD550을 이용하여 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 2개의 겹치는 PCR 앰플리콘을 제조자의 지시 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 따라 무접합 클로닝에 의해 Nhe I 및 Bgl II-소화시킨 pPJV7563 내로 삽입하였다.
플라스미드 455 ( PSCA - mIRES - PSA). 플라스미드 455는 중복 PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, 인간 PSA 아미노산 25-261을 코딩하는 유전자를, 프라이머 115 및 114를 사용하여 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 최소 EMCV IRES를, 프라이머 101 및 116을 사용하여 pShuttle-IRES로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 겹치는 앰플리콘들을 함께 혼합하고, 프라이머 101 및 114를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. IRES-PSA 앰플리콘을 Bgl II 및 BamH I로 소화시키고, Bgl II-소화시킨, CIP-처리된 플라스미드 5259 내로 삽입하였다. 자발적 돌연변이를 상기 클론 내에 고정하기 위해, Bgl II 내지 BstE II 서열을 신선한 중복 PCR 반응으로부터 동등한 단편으로 교체하였다.
실시예 3B. 삼중 항원 구축물을 포함하는 플라스미드
일반적 전략. PSA-F2A-PSMA, PSMA-mIRES-PSCA, PSMA-T2A-PSCA, PSA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA, PSCA-pIRES-PSMA, 및 PSMA-mIRES-PSA를 비롯한 많은 이중 항원 플라스미드가 삼중 항원 플라스미드 벡터 내로 다양한 조합으로 포함시키기 위해 선택되었다. 모든 경우에, 플라스미드 벡터는 모 pPJV7563 플라스미드 백본에 기반하였다. 4가지 플라스미드 벡터 (플라스미드 456, 457, 458, 및 459)는 3가지 모든 항원의 발현을 유도하기 위해 토끼 B 글로불린 전사 종결자를 갖는 단일 전체 CMV 프로모터를 이용하였다. 2가지 다른 플라스미드 벡터 (플라스미드 846 및 850)는 3가지 항원의 발현을 유도시키기 위해 IRES 또는 2A와 조합으로 이중 프로모터 전략을 포함하였다. 다수의 2A 카세트를 갖는 플라스미드는, 플라스미드/벡터 증폭 동안 제1 및 제2 카세트 사이에 재조합의 가능성을 최소화하기 위해 상이한 카세트를 보유하도록 조작하였다. 항원 발현은 유동 세포 분석 (도 7a 및 7b) 및 웨스턴 블로팅 (도 8a 및 8b)에 의해 입증되었다.
플라스미드 456 (PSA- F2A - PSMA - mIRES - PSCA). 플라스미드 456은 제한 단편 교환에 의해 구축하였다. 플라스미드 5300을 Nhe I 및 Hpa I로 소화시키고, ~1.8 kb 삽입체를 유사하게 소화시킨 플라스미드 449 내로 라이게이팅하였다.
플라스미드 457 (PSA- F2A - PSMA - T2A - PSCA). 플라스미드 457은 제한 단편 교환에 의해 구축하였다. 플라스미드 5300을 Nhe I 및 Hpa I로 소화시키고, ~1.8 kb 삽입체를 유사하게 소화시킨 플라스미드 451 내로 라이게이팅하였다.
플라스미드 458 (PSA- T2A - PSCA - F2A - PSMA). 플라스미드 458은 PCR 및 제한 단편 교환의 기술을 이용하여 구축하였다. 인간 PSA 아미노산 25-261을 코딩하는 유전자를, 프라이머 119 및 139를 사용하여 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭하여, 3' 단부에서 T2A 서열 및 Nhe I 제한 부위의 부가를 일으켰다. 앰플리콘을 Nhe I로 소화시키고, 유사하게 소화시킨 플라스미드 454 내로 삽입하였다.
플라스미드 459 ( PSCA - F2A - PSMA - mIRES - PSA). 플라스미드 459는 제한 단편 교환의해 구축하였다. 플라스미드 454를 Nhe I 및 Bgl II로 소화시키고, PSCA-F2A-PSMA 함유 삽입체를 유사하게 소화시킨 플라스미드 455 내로 라이게이팅시켰다.
플라스미드 846 ( CBA -PSA, CMV - PSCA - pIRES - PSMA). 플라스미드 846은 PCR 및 무접합 클로닝의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, 1) 닭 베타 액틴 (CBA) 유전자로부터 프로모터 및 5' 비번역 영역, 2) 하이브리드 닭 베타 액틴/토끼 베타 글로빈 인트론, 3) 인간 PSA 아미노산 25-261을 코딩하는 유전자, 및 4) 소 성장 호르몬 종결자로 이루어진 발현 카세트를 합성하였다. 상기 PSA 발현 카세트를, 프라이머 3SalICBA 및 5SalIBGH를 사용하여 플라스미드 796으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 앰플리콘을 진아트 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 (GeneArt Seamless Cloning and Assembly) 키트 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 플라스미드 603의 SalI 부위 내로 클로닝하였다. 상기 플라스미드의 세포 내로 전달 시에, PSA 발현은 CBA 프로모터에서 유도될 것인 한편, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV 프로모터에서 유도될 것이다.
플라스미드 850 ( CBA -PSA, CMV - PSCA - F2A - PSMA ). 플라스미드 850은 PCR 및 무접합 클로닝의 기술을 이용하여 구축하였다. 먼저, CBA 프로모터-유도된 PSA 발현 카세트를, 프라이머 3SalICBA 및 5SalIBGH를 사용하여 플라스미드 796으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 앰플리콘을 진아트 심리스 클로닝을 사용하여 플라스미드 454의 SalI 부위 내로 클로닝하였다. 상기 플라스미드의 세포 내로 전달 시에, PSA 발현은 CBA 프로모터에서 유도될 것인 한편, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV 프로모터에서 유도될 것이다.
플라스미드 916 (PSA- T2A - PSCA - F2A - PSMA ). 플라스미드 916은 PCR 및 깁슨 (Gibson) 클로닝의 기술을 이용하여 구축하였다. 3가지 PAA 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 PCR에 의해 증폭하고, 깁슨 클로닝 기술에 의해 pPJV7563의 Nhe I/Bgl II 부위 내로 라이게이팅하였다. 플라스미드 916의 완전 뉴클레오티드 서열을 서열 62에 제시한다. 플라스미드 458 및 플라스미드 916은 3가지 면역원성 PAA 폴리펩티드를 포함하는 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 상기 아미노산 서열을 서열 60에 제시한다. 3가지 PAA 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드 916 내의 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되고, 또한 서열 61에 제시된다.
<표 21> 다중-항원 플라스미드의 구축에 사용된 프라이머의 목록
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 3C. 삼중 항원 아데노바이러스 벡터
일반적 전략. DNA 플라스미드를 사용할 때와 같이, 바이러스 벡터는 다수의 전립선암 항원을 전달하도록 조작될 수 있다. 다중-항원 구축물 - 이중 프로모터, 2A 펩티드, 및 내부 내부 리보솜 유입 부위 - 에 대한 상기 설명된 3가지 다중-항원 발현 전략을 다양한 조합으로 포함시켜 삼중 항원 아데노바이러스 벡터를 생성하였다. 간단히 설명하면, 다중-항원 발현 카세트를, 2개의 카피의 테트라사이클린 작동유전자 서열 (TetO2)을 보유하도록 변형된 pShuttle-CMV 플라스미드 내로 클로닝하였다. 재조합 아데노바이러스 혈청형 5 벡터는 제조자의 프로토콜 (애질런트 테크놀로지스, 인크., 미국 캘리포니아주 산타클라라)에 따라 애드이지 벡터 시스템 (AdEasy Vector System)을 이용하여 생성하였다. 바이러스를 HEK293 세포 내에서 증폭하고, 표준 프로토콜에 따라 이중 염화세슘 밴딩 (banding)에 의해 정제하였다. 생체내 연구에 앞서, 바이러스 원액 (stock)을 바이러스 입자 농도, 감염 역가, 무균성, 내독소, 게놈 및 트랜스젠 완전성, 트랜스젠 동일성 및 발현에 대해 철저하게 특성화하였다.
아데노바이러스 -733 (PSA- F2A - PSMA - T2A - PSCA ). Ad-733은 플라스미드 457의 바이러스 동등물이다. 3가지 항원의 발현은 Tet 억제유전자 (repressor) 발현 HEK293 세포주 내에서 대규모 생산 동안 트랜스젠 발현을 억제하기 위한 테트라사이클린 작동유전자를 갖는 단일 CMV 프로모터에서 유도된다. 다중-항원 발현 전략은 2개의 상이한 2A 서열을 포함한다.
아데노바이러스 -734 (PSA- T2A - PSCA - F2A - PSMA ). Ad-734는 플라스미드 458의 바이러스 동등물이다. 3가지 항원의 발현은 Tet 억제유전자 발현 HEK293 세포주 내에서 대규모 생산 동안 트랜스젠 발현을 억제하기 위한 테트라사이클린 작동유전자를 갖는 단일 CMV 프로모터에서 유도된다. 다중-항원 발현 전략은 2개의 상이한 2A 서열을 포함한다.
아데노바이러스 -735 ( PSCA - F2A - PSMA - mIRES -PSA). Ad-735는 플라스미드 459의 바이러스 동등물이다. 3가지 항원의 발현은 Tet 억제유전자 발현 HEK293 세포주 내에서 대규모 생산 동안 트랜스젠 발현을 억제하기 위한 테트라사이클린 작동유전자를 갖는 단일 CMV 프로모터에서 유도된다. 다중-항원 발현 전략은 2A 서열 및 IRES를 포함한다.
아데노바이러스 -796 ( CBA -PSA, CMV - PSCA - pIRES - PSMA ). Ad-796은 플라스미드 846의 바이러스 동등물이다. PSA의 발현은 닭 베타 액틴 프로모터에서 유도되는 한편, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV-TetO2 프로모터에서 유도된다. 다중-항원 발현 전략은 2개의 프로모터 및 IRES를 포함한다.
아데노바이러스 -809 ( CBA -PSA, CMV - PSCA - F2A - PSMA ). Ad-809는 플라스미드 850의 바이러스 동등물이다. PSA의 발현은 닭 베타 액틴 프로모터에서 유도되는 한편, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV-TetO2 프로모터에서 유도된다. 다중-항원 발현 전략은 2개의 프로모터 및 2A 서열을 포함한다.
실시예 4. 수니티닙 및 항-CTLA-4 항체와의 조합물 내에서 백신의 항암 효능
수니티닙 및 항-CTLA-4 모노클로날 항체 (클론 9D9)와의 조합물 내에서 암 백신의 항-종양 효능을 피하 TUBO 종양 보유 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다.
연구 절차. 간단히 설명하면, 각각의 군 당 10마리 마우스에게 종양 이식 후 제10일에 시작하여 제64일까지 비히클 또는 수니티닙 말레이트 20 mg/kg를 매일 경구 투여하였다. 아데노바이러스 벡터로서 항원을 코딩하지 않거나 (대조군 백신) 서열 54의 래트 Her-2 항원을 코딩하는 (암 백신) DNA 구축물을 사용한 백신접종을 제13일에 개시하고, 이어서, 후속적으로 DNA에 의한 각각의 항원 (HBV 항원 또는 rHer-2)의 2회의 매주 면역화, 2회의 격주 면역화, 및 7회의 매주 면역화를 수행하였다. 항-뮤린 CTLA-4 모노클로날 항체로 치료한 마우스의 군 (막힌 원 및 빈 삼각형)에게 PMED 주사 직후에 제20, 27, 41, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 및 97일에 250 ㎍의 항체를 복강내 주사하였다.
결과. 도 4는 암 백신과 조합물로 수니티닙 및 항-뮤린 CTLA-4 모노클로날 항체 (클론 9D9)의 항-종양 효능을 평가하는 대표적인 연구로부터 마우스의 군의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 대조군 백신 (빈 원), 항-뮤린 CTLA-4 모노클로날 항체 (빈 삼각형) 또는 암 백신 (막힌 삼각형)과 함께 수텐트로 치료한 마우스에서 생존 시간 증가가 관찰되었다. 항-뮤린 CTLA-4과 조합한 수텐트 및 암 백신으로 치료한 마우스 (막힌 원)에서 추가의 생존 증가가 관찰되었다. P 값은 로그 순위 검정 (log-rank test)에 의해 계산하였다.
실시예 5. 암 백신에 의해 유도된 면역 반응에 대한 CpG 또는 CD40 효능제의 효과
BALB /c 마우스에서 면역원성 연구
암에 의해 유도된 항원 특이적 면역 반응의 규모 (magnitude) 및 품질에 대한 면역 조절제의 국소 투여의 효과를 BALB/c 마우스에서 조사하였고, 여기서 면역 반응은 IFNγ ELISPOT 검정 또는 세포내 시토카인 염색 검정을 이용하여 rHER2 특이적 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다. 간단히 설명하면, 지시된 바와 같이 군 당 4 내지 6마리 암컷 BALB/c 마우스를 PMED 전달 시스템에 의해 rHER2 항원 서열 (서열 54)을 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 면역화하였다. PMED 작동 후 후속적으로 면역 조절제, CpG7909 (PF-03512676) 및 항-CD40 모노클로날 효능제 항체를 백신 배액 서혜 림프절에 근접하게 피내 주사에 의해 국소 투여하였다. 항원 특이적 T 세포 반응은 아래에 설명된 절차에 따라 IFNγ ELISPOT 또는 세포내 시토카인 염색 검정에 의해 측정하였다.
세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정
rHer-2 특이적 다기능성 (다중-시토카인 양성) T 세포 면역 반응은 ICS 검정에 의해 개별 동물로부터 단리된 비장세포 또는 PBMC로부터 측정하였다. 대개 1e6개 비장세포를 브레펠딘 (Brefeldin A) 1 ㎍/ml 및 펩티드 자극제 (rHer-2 특이적 CD8 p66, rHer-2 특이적 CD4 p169 또는 비관련 HBV p87) 10 ㎍/ml과 함께 5hr 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 인큐베이팅하였다. 자극 후에, 비장세포를 세척하고, Fcγ 차단제 (항-마우스 CD16/CD32)로 10 min 동안 4℃에서 차단한 후, 라이브/데드 아쿠아 스테인 (Live/dead aqua stain), 항-마우스 CD3ePE-Cy7, 항-마우스 CD8a 퍼시픽 블루 (Pacific blue), 및 항-마우스 CD45R/B220 PerCP-Cy5.5로 20 min 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 4℃에서 철야 고정하고, 비디 픽스/펌 (BD fix/perm) 용액으로 30 min 동안 RT에서 투과시키고, 항-마우스 IFNγ APC, 항-마우스 TNFα Alexa488 및 항-마우스 IL-2 PE와 함께 30 min 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 유동 세포 분석에 의한 분석을 위해 20,000개의 CD4 또는 CD8 T 세포를 획득하였다. 각각의 동물의 전체 비장마다 항원 특이적 단일, 이중 또는 삼중 시토카인 양성 T 세포의 총 수는 비관련 펩티드 HBV에 대한 rHer-2 특이적 반응을 백신 특이적 반응으로부터 공제함으로써 계산하고 비장으로부터 단리된 비장세포의 총수로 정규화한다.
IFNγ ELISPOT 검정 결과
도 5는 지시된 바와 같은 면역 조절제가 제공될 때 rHER2 백신에 의해 유도된 항원 특이적 T 세포 반응의 규모를 평가하는 대표적인 연구로부터 마우스의 군으로부터 IFNγ ELISPOT 결과를 보여준다. 간단히 설명하면, 치료군 당 각각의 마우스 (n=4)를, PMED에 의해 rHER2 항원 서열 (서열 54)을 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 구축물, 그 직후에 지시된 바와 같이 100 ㎍의 대조군 래트 IgG 모노클로날 항체 (바이옥셀 #BE0089: 대조군 mAb) 또는 50 ㎍ CpG7909 또는 100 ㎍의 항-CD40 모노클로날 항체 (바이옥셀 #BE0016-2: a-CD40 mAb)로 면역화하였다. 항원 특이적 면역 반응은 PMED 작동 7일 후에 대조군 또는 rHer-2 특이적 p66 펩티드와 10 ㎍/ml 농도로 혼합된 5e5 비장세포로부터 IFNγ ELISPOT 검정에 의해 측정하였다. 1e5 CD8 T 세포를 함유하는 비장세포로부터 총 IFNγ 분비 세포의 수는 개별 동물로부터 ELISPOT 결과로부터 계산하고, 비장세포 내의 CD8 T 세포의 % 및 각각의 군의 평균 및 평균의 표준 오차를 그래프로 그렸다. 도시된 바와 같이, CpG7909 및 항-CD40 모노클로날 항체는 모두 대조군 항체를 투여한 마우스에 비해 rHer-2 DNA에 의해 유도된 항원 특이적 면역 반응의 규모를 유의하게 향상시켰다.
세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정 결과. 도 6 및 7은 세포내 시토카인 염색 검정에 의한 백신 유도된 면역 반응의 품질에 대한 CpG 7909의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여준다. 간단히 설명하면, 각각의 동물을 4주 간격으로 PMED에 의해 전달된 rHER2 항원 서열 (서열 54)을 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 2회 면역화하였다. 각각의 군 내의 마우스 (n=5)에게 PMED에 의한 두 DNA 면역화 직후에 우측 백신 배액 서혜 림프절에 근접하게 PBS (PMED 군) 또는 50 ㎍의 CpG 7909 (PMED+CpG 군)의 피내 주사를 투여하였다. PMED에 의한 마지막 면역화의 7일 후에, IFNγ, TNFα 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 다기능성 CD8 또는 CD4 T 세포를 검출하기 위해 각각의 개별 마우스로부터 단리한 비장세포에 대해 ICS 검정을 수행하였다. PBS에 비해 CpG 7909의 국소 전달로 치료한 마우스로부터, rHer-2 특이적 다중-시토카인 양성 CD8 및 CD4 T 세포 반응의 유의한 증가가 검출되었다. PBS에 비해 CpG7909의 국소 전달을 투여한 동물에서, 단일 시토카인 양성 CD8 집단의 증가가 관찰되었다.
도 8 및 9는 세포내 시토카인 염색 검정에 의한 백신 유도된 면역 반응의 품질에 대한 효능제 항-CD40 모노클로날 항체의 면역조절 활성을 평가하는 대표적인 연구의 결과를 보여준다. 간단히 설명하면, 각각의 동물을 4주 간격으로 PMED에 의해 전달된 rHER2 항원 서열 (서열 54)을 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 2회 면역화하였다. 각각의 군 내의 마우스 (n=6)에게 우측 백신 배액 서혜 림프절에 근접하게 이소형 IgG 대조군 (IgG를 갖는 PMED) 또는 항-CD40 모노클로날 항체 (aCD40을 갖는 PMED)의 100 ㎍의 피내 주사를, 제1 면역화의 1일 후에 PMED에 의해 투여하였다. 마지막 PMED의 7일 후에, IFNγ, TNFα 및/또는 IL-2를 분비하는 rHer-2 특이적 다기능성 CD8 또는 CD4 T 세포를 검출하기 위해 각각의 개별 마우스로부터 단리한 비장세포에 대해 ICS 검정을 수행하였다. 이소형 IgG 대조군에 비해 항-CD40 모노클로날 항체의 국소 전달로 치료한 마우스로부터 rHer-2 특이적 삼중-시토카인 양성 CD8 및 CD4 T 세포 반응의 유의한 증가가 검출되었다. 국소 제공한 항-CD40 모노클로날 항체에 의한 rHer-2 특이적 단일 및 이중 시토카인 양성 CD4 T 세포의 유의한 증가가 또한 관찰되었다.
실시예 6. 저용량 수니티닙과 조합한 암 백신의 항암 효능
저용량 수니티닙과 조합한 항암 백신의 항-종양 효능을 자발적 유방 지방층 (mammary pad) 종양을 갖는 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다.
동물 치료. 간단히 설명하면, 13-14주령 암컷 마우스에게 수니티닙 말레이트 (수텐트)를 5 mg/kg로 112일 동안 1일 2회 경구 투여하였다. 항원을 전달하지 않는 대조군 백신, 및 서열 54의 래트 Her-2 항원을 전달하는 암 백신 (rHer-2)을 초회접종으로서 제3일에 아데노바이러스 주사에 의해 제공한 후, 각각 HBV 항원 (대조군 백신) 또는 rHer-2 (암 백신)을 전달하는 DNA의 PMED를 7회 격주 투여하였다. 생존 종점은 10개의 모든 유방 지방층이 종양 양성으로 될 때 또는 임의의 유방 종양의 부피가 2000 mm3에 도달할 때 결정되었다.
결과. 결과를 도 10에 제시한다. 이전에 공개된 수텐트의 약동학적 프로파일 (Mendel, D., Laird, D., et al.: "In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship". Clinical Cancer Research, 203, 9:327-337)에 비해, 5 mg/kg로 1일 2회 투여한 마우스에서 수텐트의 CMax는 마우스 및 인간에서 효율적인 항종양 효능을 달성하기 위해 필요한 최소 혈액 수준보다 유의하게 더 낮은 것으로 예상된다. 데이타는 저용량 수텐트 단제요법으로 치료한 마우스의 생존의 신속하고 일시적인 개선을 보여준다. 그러나, 암 백신과 함께 제공될 때, 생존의 보다 지속적이고 유의한 개선이 관찰되었다 (로그 순위 검정에 의해 P<0.0001).
실시예 7. CpG의 국소 투여에 의한 백신-유도된 면역 반응의 향상
본 발명에서 제공된 인간 PSMA 핵산에 의해 유도된 면역 반응에 대한 CpG (PF-03512676)의 국소 투여의 면역 향상을 원숭이 연구에서 조사하였고, 여기서 면역 반응은 IFNγ ELISPOT 검정을 이용하여 PSMA 특이적 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다.
동물 치료 및 샘플 수집. 6개의 군의 필리핀 원숭이 (chineses cynomolgus macaque) (각각의 시험군 당 6마리 (#1 내지 6))를 전기천공에 의해 전달된 인간 PSMA 변형된 항원 (서열 9의 폴리펩티드)를 코딩하는 플라스미드 DNA로 면역화하였다. 간단히 설명하면, 제0일에 모든 동물에게 5 mg의 플라스미드 DNA의 양측 근육내 주사에 이어 전기천공 (DNA EP)을 적용하였다. 후속적으로, 전기천공 직후에, 군 2에게 DNA 주사 부위에 근접하게 1 mg 명반과 혼합한 2 mg의 CpG의 양측 근육내 주사를 투여하였다. 군 3 및 4에게 각각 제0일 또는 제3일에 DNA 주사 부위에 근접하게 명반 없이 전달된 2 mg의 CpG의 양측 근육내 주사를 투여하였다. 군 5에게 제3일에 백신 배액 서혜 림프절에 근접하게 전달된 2 mg의 CpG의 양측 피내 주사를 투여하였다. 군 6에게 제0일에 근육 내로 동시-전기천공된 DNA 용액과 혼합한 200 ㎍의 CpG의 양측 주사를 투여하였다.
IFNγ ELISPOT 검정 절차. DNA 면역화의 15일 후에 각각의 동물로부터 말초 혈액 샘플을 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 혈액 샘플로부터 단리하고, IFNγ ELISPOT 검정으로 분석하여 PSMA 특이적 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히 설명하면, 개별 동물로부터 4e5 PBMC를 IFNγ ELISPOT 플레이트 내에서 각각 2 ㎍/ml로 PSMA 특이적 펩티드 또는 비특이적 대조군 펩티드의 풀 (pool) (인간 HER2 펩티드 풀)과 함께 웰마다 플레이팅하였다. 각각의 PSMA 특이적 펩티드 풀의 조성을 표 24A에 제공한다. 플레이트를 16 hr 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이팅하고, 세척하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션 후에 발색시켰다. IFNγ 스팟 형성 세포 (SFC: spot forming cell)의 수를 CTL 판독기에 의해 계수하였다. 각각의 조건을 이중으로 수행하였다.
결과. 표 6은 근육내 (군 2, 3, 4, 및 5) 또는 피내 주사 (군 6)에 의해 국소 제공된, CpG를 갖지 않는 (군 1) 또는 CpG를 갖는 (PF-03512676) 백신에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응을 평가하고 비교하는 대표적인 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 보여준다. 보고된 PSMA 특이적 반응은 비특이적 대조군 펩티드 (인간 HER2 펩티드 풀)에 대한 SFC의 평균 수를 PSMA 펩티드 풀에 대한 SFC의 평균 수로부터 공제함으로써 계산하고, 1e6 PBMC를 사용하여 관찰된 SFC에 대해 정규화하였다. ∧는 스팟의 수가 계수하기에 너무 많기 때문에 계수가 정확하지 않음을 지시한다. ND는 결정되지 않음을 지시한다.
6마리의 모든 동물 (군 1)에서 CpG (PF-03512676)의 부재 하에 다수의 PSMA 특이적 펩티드 풀에 대해 PSMA 특이적 IFNγ T 세포 반응을 검출하였다. 측정된 PSMA 펩티드에 대한 전체 반응은 DNA 전기천공의 3일 후에 근육내 (군 4: 3/6) 또는 피내 (군 5: 2/6) 주사에 의해 CpG (PF-03512676)를 추가로 투여한 몇몇 동물에서 보통으로 더 높았다. 그러나, CpG를 동일한 날에 전기천공 직후에 후속적으로 전달할 때 (군 2 및 3), 명반을 혼합하든 혼합하지 않든 간에 몇몇 동물은 높은 반응을 생성하지 못하였다 (군 2: 4/6 및 군 3: 3/6). 그러나, 10배 더 낮은 용량의 CpG를 근육 (군 6) 내로 DNA 용액과 함께 동시-전기천공했을 때 4/6 동물에서 보다 높은 순수한 반응이 검출되었고, 여기서 CpG를 투여하지 않은 동물 (군 1)에 비해 펩티드 풀 H1 및 R1에 대해 통계상 보다 높은 반응 (P<0.05)을 가졌다. 데이타는 저용량의 CpG가 근육 내로 동시-전기천공될 때 DNA 백신에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 보여준다.
<표 6> CpG를 갖지 않는 (군 1) 또는 CpG를 갖는 (군 2, 3, 4, 5 및 6) DNA 백신에 의해 유도된 PSMA 특이적 IFNγ T 세포 반응을 DNA 전기천공의 15일 후에 PBMC로부터 IFNγ ELISPOT 검정에 의해 측정한다.
Figure pct00007
실시예 8.
항-CTLA-4 항체의 국소 투여에 의한 백신-유도된 면역 반응의 향상
붉은털원숭이 (rhesus) PSMA 핵산에 의해 유도된 면역 반응에 대한 항-CTLA-4 모노클로날 항체 (CP-675,206)의 저용량 피하 투여의 효과를 원숭이 연구에서 조사하였고, 여기서, 면역 반응은 IFNγ ELISPOT 검정을 이용하여 PSMA 특이적 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다. 연구에 사용된 붉은털원숭이 PSMA 핵산은 서열 56에 제시된 서열을 갖고, 서열 55의 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩한다.
동물 치료 및 샘플 수집. 5개의 군의 수컷 히말라야 원숭이 (Indian rhesus macaque) (각각의 시험군 당 7마리 (#1 내지 7))를 양측 근육내 주사 (2x 5e10 V.P.)에 의해 전달된 붉은털원숭이 PSMA 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 아데노바이러스로 면역화하였다. 아데노바이러스 주사 직후에, 군 1에게 비히클을 투여하고, 군 2 내지 4에게 백신 배액 림프절에 근접하게 각각 2x 25 mg, 2x 16.7 mg 및 2x 8.4 mg의 용량으로 항-CTLA-4 항체 (CP-675,206)의 양측 피하 주사를 투여하였다.
면역화의 9일 후에, 각각의 동물로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하고, IFNγ ELISPOT 검정으로 분석하여 붉은털원숭이 PSMA 특이적 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히 설명하면, 개별 동물로부터 4e5 PBMC를 IFNγ ELISPOT 플레이트 내에서 각각 2 ㎍/ml의 붉은털원숭이 PSMA 특이적 펩티드의 풀 (표 24A에 규정된 P1, P2, P3 또는 R1+R2) 또는 비특이적 대조군 펩티드 (인간 HER2 펩티드 풀)과 함께 웰마다 플레이팅하였다. 플레이트를 16 hr 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이팅하고, 세척하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션 후에 발색시켰다. IFNγ 스팟 형성 세포 (SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 계수하였다. 각각의 조건을 이중으로 수행하였다. 붉은털원숭이 PSMA 특이적 펩티드 풀의 배경 조정된 SFC로부터 이중실험의 평균을 1e6 PBMC에서의 반응에 대해 정규화하였다. 각각의 개별 동물로부터 펩티드 풀에 대한 개별 및 합계 반응을 표 29에 제시한다.
IFNγ ELISPOT 검정 절차. IFNγ에 특이적인 포획 항체 (비디 바이오사이언스 (BD Bioscience), #51-2525kc)를 미세플레이트 내에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막 상에 4℃에서 철야 코팅하였다. 플레이트를 혈청/단백질로 차단하여, 항체에 대한 비특이적 결합을 방지하였다. 차단 후에, 이펙터 세포 (예컨대, 면역화한 마우스로부터 단리된 비장세포, 또는 히말라야 원숭이로부터 단리된 PBMC) 및 표적 (예컨대, 펩티드 라이브러리 (library)로부터 PSMA 펩티드, 항원 특이적 펩티드로 펄싱한 표적 세포, 또는 관련 항원을 발현하는 종양 세포)을 웰에 첨가하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 철야 인큐베이팅하였다. 이펙터 세포에 의해 분비된 시토카인은 PVDF 막의 표면 상에서 코팅 항체에 의해 포획되었다. 세포 및 배양 배지를 제거한 후에, 검출을 위해 100 ㎕의 비오티닐화 폴리클로날 항-인간 IFNγ 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 스트렙타비딘-양고추냉이 페록시다제 및 침전 기질, 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC)을 제조자 (맙테크 (Mabtech))의 프로토콜에 따라 첨가하여 적색 스팟을 생성함으로써 스팟을 시각화하였다. 각각의 스팟은 단일 시토카인 생산 T 세포를 나타낸다.
결과. 표 7은 백신 배액 림프절에 근접하게 피하 주사에 의해 국소 제공된, 항-CTLA-4 모노클로날 항체 (CP-675,206)을 갖지 않는 (군 1) 또는 갖는 (군 2-4) 백신에 의해 유도된 T 세포 반응을 비교하는 대표적인 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 보여준다. 백신은 50 mg 용량의 항-CTLA-4 항체 (CP-675,206)의 국소 투여 (군 2, 어림값을 이용하여 스튜던트 T-시험에 의한 P=0.001)에 의해 유의하게 향상된 면역 반응 (군 1)을 생성하였다. 반응은 각각 33.4 mg (군 3: 어림값을 이용하여 스튜던트 T-시험에 의한 P=0.004) 및 16.7 mg (군 4: 스튜던트 T-시험에 의한 P=0.05)의 저용량의 항-CTLA-4 항체에 의해 또한 유의하게 향상되었다. 데이타는 피하 주사에 의해 전달된 저용량의 항-CTLA-4가 백신 유도된 면역 반응을 유의하게 향상시킬 수 있음을 제안한다.
<표 7> 항-CTLA-4 항체 (CP-675,206)의 피하 주사를 갖지 않는 (군 1) 또는 갖는 백신에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응. ∧는 많은 스팟 수 때문에 계수가 어림됨을 지시한다. TNTC는 계수하기에 너무 많음을 의미한다.
Figure pct00008
실시예 9. 저용량 수니티닙에 의한 골수 유래 면역억제 세포의 면역조절
다음 실시예는 비-종양 마우스 모델에서 생체 내에서 골수 유래 면역억제 세포 (MDSC)에 대한 저용량 수니티닙의 면역조절 효과를 설명하기 위해 제공된다.
연구 절차.
MDSC 농축 비장세포를 생성하기 위해, TUBO 세포 (1x106)를 5마리 BALB/neuT 마우스의 옆구리 내에 이식하고, 종양 부피가 1000-1500 mm3에 도달할 때까지 약 20-30일 동안 방치하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고, 비장을 제거하고, MDSC 농축 비장세포를 회수하였다. 비장세포를 10분 동안 5 μΜ CFSE로 표지하고, PBS로 세척하고, 계수하였다. 표지된 세포를 후속적으로 PBS 용액 내에 5x107개 비장세포/ml로 재현탁하고, i.v. 꼬리 정맥 주사를 통해 나이브 (naive) BALB/c 수여체 마우스 내로 입양 전달하였다. 입양 전달 (adoptive transfer)의 3일 전에, 수여체 마우스에게 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 비히클 또는 수니티닙 말레이트 (수텐트)의 1일 2회 투여를 시작하였다. 입양 전달 이후, 수여체 마우스에게 추가의 2일 동안 비히클 또는 수니티닙의 1일 2회 투여를 계속하고, 그 후에 마우스를 희생시키고, 비장을 제거하고, 비장세포를 회수하고, 표현형 분석을 위해 처리하였다.
비장세포를 계수하고, FACS 염색 완충제 (PBS, 0.2% (w/v) 소 혈청 알부민, 및 0.02% (w/v) 소듐 아지드) 내에 5x106개 세포/ml로 재현탁하였다. 비장세포의 유동 세포측정 염색을 위해, 2.5x106개 세포를 먼저, Fc 수용체를 차단하고 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 CD16/CD32에 대한 항체와 함께 10분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 비장세포를 20분 동안 4℃에서 뮤린 세포 표면 마커에 대한 적절한 형광단 접합된 항체 (바이오레전드 (Biolegend))로 염색하였다. T 세포 (항-CD3 (퍼시픽 블루), 클론 17A2) 및 MDSC (항-GR-1 (APC), 클론 RB6-8C5 및 항-CD11b (PerCp Cy5.5), 클론 M1/70). 라이브/데드 스테인이 또한 포함되었다. 항체 인큐베이션 후에, 염색된 비장세포를 2 ml의 FACS 완충제로 세척하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 0.2 ml의 FACS 완충제 내에 재현탁한 후에, 비디 CANTO II 유동 세포측정기 상에서 데이타 획득을 수행하였다. 입양 전달된 MDSC 생존에 대한 수니티닙 또는 비히클의 효과를 모니터링하기 위해, 본 발명자들은 라이브 단일항 게이트 (live, singlet gate)에서 CFSE+,CD3-,GR1+,CD11b+의 백분율을 계산하였다. 이어서, 본 발명자들은 어떠한 실제 세포수가 총 비장세포 계수의 백분율을 나타내는지 계산함으로써 비장 당 입양 전달된 MDSC의 수를 결정하였다. 데이타를 플로조 (FloJo) 및 그래프패드 (Graph pad) 소프트웨어에 의해 분석하였다.
결과. 표 27에 제시된 데이타는 비히클 또는 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg 수니티닙을 1일 2회 투여한 마우스로부터, 입양 전달 2일 후에 비장 (n=7/군) 당 회수된 입양 전달된 CSFE+,CD3-,GR1+,CD11b+ 세포의 평균 수를 나타낸다. 통계적 유의성은 수니티닙 투여군을 0 mg/kg (비히클) 군에 대해 비교하는, 던넷 (Dunnett)의 다중 비교 검정을 이용하여 일원 (one-way) ANOVA에 의해 결정하였다. 데이타는 생체 내에서 1일 2회 투여한 수니티닙이 5 mg/kg만큼 적게 투여할 때에조차 비히클 처리 대조군에 비해 회수된 수의 통계상 유의한 감소를 일으켜, MDSC에 대해 면역조절 효과를 가짐을 입증한다.
<표 8> 비장으로부터 회수된 CFSE+,CD3-,GR1+,CD11b+ MDSC의 평균 수
Figure pct00009
실시예 10. 삼중 항원 아데노바이러스 및 DNA 구축물의 면역원성
다음 실시예는 비-인간 영장류에서 3가지 모든 코딩된 항원에 대한 특이적 T 세포 반응을 일으키는, 본 발명에서 제공된 3가지 항원 PSMA, PSCA 및 PSA를 발현하는 삼중 항원 백신 구축물 (아데노바이러스 벡터 또는 DNA 플라스미드의 형태)의 능력을 설명하도록 제공된다.
생체내 연구 절차. 각각 본 발명에서 제공된 3가지 항원을 발현하는 5가지 아데노바이러스 벡터 (PSMA, PSCA 및 PSA; Ad-733, Ad-734, Ad-735, Ad-796 및 Ad-809)의 T 세포 면역원성을, 초회접종 9일 후에 각각 단지 단일 항원 (PSMA, PSA 또는 PSCA)을 발현하는 3가지 아데노바이러스 벡터의 혼합물과 비교하였다. 특이성을 입증하기 위해, 단일 항원을 발현하는 단일 아데노바이러스에 대한 반응 (군 1-3)을 평가하였다. 간단히 설명하면, 히말라야 원숭이 (군 1 및 3에 대해 n=6, 군 2에 대해 n=7, 군 4-9에 대해 n=8)에게 총 1e11 V.P.를 근육내 주사한 후, 동일한 날에 항-CTLA-4를 10 mg/kg로 피내 주사하였다. 주사 9일 후에, 각각의 동물로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하고, IFNγ ELISPOT 검정으로 분석하여 PSMA, PSA 및 PSCA 특이적 T 세포 반응을 측정하였다.
T 세포 반응이 축소되는 아데노바이러스 및 항-CTLA-4 주사의 13주 후에, 원숭이에게 DNA (군 1: PSMA, 플라스미드 5166; 군 2: PSA, 플라스미드 5297; 군 3: PSCA, 플라스미드 5259; 군 4: PSMA, PSA 및 PSCA의 혼합물, 플라스미드 5166, 5259 및 5297; 군 4: 플라스미드 457; 군 6: 플라스미드 458; 군 7: 플라스미드 459; 군 8: 플라스미드 796, 및 군 9: 플라스미드 809) 추가 백신접종을 전기천공에 의해 전달하였다. 요약하면, 각각의 동물에게 초회접종에 사용된 아데노바이러스 내에 코딩된 동일한 발현 카세트를 전달하는 본 발명에서 제공된 플라스미드 DNA 총 5 mg을 투여하였다. 추가 백신접종의 9일 후에, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 각각의 동물로부터 단리하고, IFNγ ELISPOT 검정으로 분석하였다.
IFNγ ELISPOT 검정. 간단히 설명하면, 개별 동물로부터 4e5 PBMC를 IFNγ ELISPOT 플레이트 내에서 각각 2 ㎍/ml로 PSMA 특이적 펩티드 풀 P1, P2, P3 또는 H1 및 H2 (표 9A), PSA 특이적 풀 1 또는 2 (표 9B), PSCA 특이적 풀 (표 10) 또는 비특이적 대조군 펩티드 (인간 HER2 펩티드 풀)와 함께 웰 마다 플레이팅하였다. 플레이트를 16 hr 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이팅하고, 세척하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션 후에 발색시켰다. IFNγ 스팟 형성 세포 (SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 계수하였다. 각각의 조건을 이중으로 수행하였다. 항원 특이적 펩티드 풀의 배경 조정된 SFC로부터 이중실험의 평균을 1e6 PBMC에서 반응에 대해 정규화하였다. 표에서 항원 특이적 반응은 대응하는 항원 특이적 펩티드 또는 펩티드 풀에 대한 반응의 합계를 제시한다.
결과: 표 11은 IFNγ ELISPOT에 의한 히말라야 원숭이에서 각각 단일 항원을 발현하는 3가지 아데노바이러스의 혼합물에 비해, 각각 3가지 모든 항원을 발현하는 5가지 상이한 아데노바이러스의 T 세포 면역원성을 평가하는 연구를 나타낸다. 단지 Ad-PSMA 주사를 투여받은 대다수의 동물 (군 1)은 PSMA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만, PSA 또는 PSCA에 대해서는 그렇지 않았다 (스튜던트 T-시험, P<0.03. PSCA에 대한 반응을 우선적으로 유도한 1마리 동물 (#4)은 통계 분석으로부터 제거하였다). 단지 Ad-PSA의 주사를 투여받은 동물 (군 2)은 PSA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만, PSMA 또는 PSCA에 대해서는 그렇지 않았다 (스튜던트 T-시험, P<0.02). 단지 Ad-PSCA의 주사를 투여받은 동물 (군 3)은 PSCA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만, PSMA 또는 PSA에 대해서는 그렇지 않았다 (스튜던트 T-시험, P<0.03). 5가지 모든 삼중-항원 발현 아데노바이러스 벡터 (군 5-9)는 3가지 모든 항원에 대해 IFNγ T 세포 반응을 유도하였고, 그 규모는 동물마다 다양하였다. 삼중 항원 발현 아데노바이러스에 의해 유도된 PSCA에 대한 반응의 규모는 개별 벡터의 혼합물 (군 4)과 유사하였다. 그러나, Ad-809 (군 9)에 의해 유도된 PSMA에 대한 반응 및 Ad-796 (군 8)에 의해 유도된 PSA에 대한 반응의 규모는 혼합물에 비해 각각 유의하게 우월하였다 (스튜던트 T-시험, P=0.04 및 P=0.02). 이들 결과는 삼중 항원을 발현하는 아데노바이러스를 사용하여 백신접종이 비-인간 영장류에서 개별 아데노바이러스의 혼합물을 사용한 백신접종에 비해 동등하거나 우월한 T 세포 면역 반응을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
표 12는 IFNγ ELISPOT 결과가 항-CTLA-4와 조합으로 아데노바이러스 초회접종에 이어 대응하는 플라스미드 DNA의 전기천공 추가접종에 의해 전달된 본 발명에서 제공된 5가지 상이한 삼중 항원 발현 카세트의 면역원성을 평가하는 연구를 나타냄을 보여준다. 면역 반응을 항-CTLA-4의 아데노바이러스 초회접종 및 DNA 전기천공 추가접종 면역화에 의해 유사하게 전달된 단일 항원을 발현하는 3가지 구축물의 혼합물에 비교하였다.
단지 항-CTLA-4와 함께 Ad-PSMA에 이어 플라스미드-PSMA (군 1) 면역화를 투여받은 모든 동물은 PSMA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만 PSA 또는 PSCA에 대해서는 그렇지 않았다. 유사하게, 단지 항-CTLA-4와 함께 Ad-PSA에 이어 플라스미드-PSA 면역화 (군 2)를 투여받은 모든 동물은 PSA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만 PSMA 또는 PSCA에 대해서는 그렇지 않았고, 마지막으로, 단지 항-CTLA-4와 함께 Ad-PSCA에 이어 플라스미드-PSCA (군 3) 면역화를 투여받은 모든 동물은 PSCA에 대한 특이적 반응을 유도하였지만 PSMA 또는 PSA에 대해서는 그렇지 않았다 (스튜던트 T-시험, P<0.01).
삼중-항원 발현 벡터 (군 5-9) 또는 혼합물 (군 4)로 면역화한 모든 동물은 3가지 모든 항원에 대해 IFNγ T 세포 반응을 유도하였다. 검출된 PSCA 또는 PSA 특이적 IFNγ T 세포의 빈도는 각각 이들 모든 군 (군 4-9)에서 유사하였다. 그러나, 삼중 항원 발현 벡터 백신접종을 투여받은 구성체 군 7 및 9는 3가지 단일 항원 발현 구축물의 혼합물 (군 4)보다 PSMA에 대한 유의하게 더 높은 빈도의 반응을 생성하였다. 이들 결과는 하나의 카세트 내에 아데노바이러스 및 삼중 항원을 발현하는 DNA 백신이 비-인간 영장류에서 아데노바이러스 및 단일 항원을 발현하는 DNA의 혼합물에 비해 동등하거나 우월한 IFNγ T 세포 반응을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
<표 9A> PSMA 펩티드 풀*
Figure pct00010
Figure pct00011
<표 9B> PSA 펩티드 풀: PSA 펩티드 라이브러리로부터 13개의 아미노산이 겹치는 15개의 아미노산 펩티드의 아미노산 위치 및 서열을 제시한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
<표 10> PSCA 펩티드 풀: PSCA 펩티드 라이브러리로부터 13개의 아미노산이 겹치는 15개의 아미노산 펩티드의 아미노산 위치 및 서열을 제시한다.
Figure pct00014
Figure pct00015
<표 11> ELISPOT 검정에 의해 분석된 항-CTLA-4와 함께 아데노바이러스 초회접종 후 단일 항원 (군 1: Ad-PSMA; 군 2: Ad-PSA; 군 3: Ad-PSCA; 군 4: Ad-PSMA, Ad-PSA 및 Ad-PSCA의 혼합물) 또는 삼중 항원 발현 아데노바이러스 벡터 (군 4: Ad-733; 군 6: Ad-734; 군 7: Ad-735; 군 8: Ad-796, 및 군 9: Ad-809)에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응.
Figure pct00016
Figure pct00017
<표 12> ELISPOT 검정에 의해 분석된 항-CTLA-4와 함께 아데노바이러스 초회접종 및 DNA 전기천공 추가접종 면역화 후에, 단일 항원 (군 1: PSMA; 군 2: PSA; 군 3: PSCA; 군 4: PSMA, PSA 및 PSCA의 혼합물) 또는 삼중 항원 발현 벡터 (군 5-9)에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 11. C68 벡터의 구축
11A. 벡터 AdC68-734 구축
AdC68-734는 3가지 면역원성 PAA 폴리펩티드, 즉 면역원성 PSA 폴리펩티드, 면역원성 PSCA 폴리펩티드 및 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 침팬지 아데노바이러스 C68에 기반한 복제 불능 아데노바이러스 벡터이다. 벡터 서열을 인 실리코 설계하였다. 먼저, 기준선 전장 C68 서열을 젠뱅크로부터 입수하였다 (정의: 원숭이 아데노바이러스 25, 완전 게놈; 기탁 번호 AC_000011.1). 문헌에 설명된 5개의 점 돌연변이를 서열 내로 도입하였다 (Roshorm, Y., M. G. Cottingham, et al. (2012). "T cells induced by recombinant chimpanzee adenovirus alone and in prime-boost regimens decrease chimeric EcoHIV/NDK challenge virus load." Eur J Immunol 42(12): 3243-3255). 다음, 2.6 kb의 바이러스 초기 전사 영역 1 (E1)을 결실시켜, 벡터를 복제 불능으로 만들고, 3.5 kb의 초기 전사 영역 3 (E3)을 제거하여 트랜스젠 발현 카세트를 위한 벡터 내에 공간을 생성하였다 (Tatsis, N., L. Tesema, et al. (2006). Chimpanze-origin adenovirus vectors as vaccine carriers. Gene Ther. 13: 421-429). 이어서, 고도로 효율적인 진핵 발현 카세트를 E1 영역 내로 도입하였다. 발현 카세트는 다음 성분들을 포함하였다: (A) 사이토메갈로 (CMV) 최조기 인핸서/프로모터, (B) Tet 작동유전자 (테트라사이클린 억제유전자에 대한 결합 부위), (C) 다음을 포함하는 다중-항원 구축물: (1) 인간 PSA의 아미노산 25 내지 261을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (2) 글라이신-세린 링커를 코딩하는 시스-작용 히드롤라제 요소 및 토세아 아시그나 바이러스 2A 펩티드 (T2A), (3) 인간 PSCA의 아미노산 2 내지 123을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (4) 글라이신-세린 링커를 코딩하는 시스-작용 히드롤라제 요소 및 구제역 바이러스 2A 펩티드 (F2A), 및 (5) 인간 PSMA의 아미노산 15 내지 750을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (D) SV40 폴리A 전사 종결 신호. 마지막으로, PacI 제한 부위를 바이러스 게놈의 각각의 단부에 삽입하여, 모 Bacmid로부터 게놈을 방출을 용이하게 하였다. 바이러스 증식 동안 PacI 제한 부위로부터 뉴클레오티드는 제거되고, 따라서, 벡터 생성물 자체의 게놈 내에 포함되지 않는다. 전체 벡터 AdC68-734의 뉴클레오티드 서열 (PacI 제한 부위 포함)을 서열 58에 제시한다. 벡터 AdC68-734 내에 (및 플라스미드 458 내에) 포함된 다중-항원 구축물 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)을 또한 서열 61에 제시한다. 서열 61의 다중-항원 구축물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 서열 60에 제시한다. 벡터 AdC68-734의 성분들을 표 13에 제공한다.
<표 13> 벡터 AdC68-734의 성분들
Figure pct00021
인 실리코 설계 이후, 34,819개 염기쌍 서열을 시험관내 올리고 합성 및 이. 콜라이(E. coli) 및 효모 내에서 후속적인 재조합-매개 중간체 조립을 이용하는 다-단계 공정으로 생화학적으로 합성하였다. 바이러스 게놈을 증식을 위해 최종적으로 박테리아 인공 염색체 (pCC1BAC-LCyeast-TRP Trunc) 내로 삽입하였다. 바이러스 씨드 (seed) 원액을 생성하기 위해 사용된 최종 Bacmid 17.3.3.22 로트를 포함하여, 차세대 서열결정 (MiSeq 기술)을 생산 공정에서 다수 단계로 수행하였다. 바이러스 씨드 원액은 Bacmid 17.3.3.22를 PacI로 소화시켜 BAC 백본으로부터 AdC68-734 게놈을 방출시켜 생성하였다. 선형화된 핵산을 E1 보완 부착성 HEK293 세포주 내로 형질감염시키고, 가시적인 세포변성 효과 및 아데노바이러스 병소 형성시에, 세포로부터 바이러스를 방출시키기 위해 배양액을 다수 라운드의 동결/해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 표준 기술에 의해 증폭하고 정제하였다. Bacmid 17.3.3.22의 유전적 구성을 도 11에 제공한다.
11B. 추가의 C68 벡터의 구축
추가의 삼중 항원 C68 벡터를 AdC68-734와 유사한 방식으로 구축하였다. 일부의 추가의 벡터는 벡터 AdC68-734의 것과 경미하게 상이한 C68 게놈 내의 기능적 결실을 포함하는 반면, 다른 벡터는 상이한 다중-항원 구축물을 포함한다. 이들 예 및 본 개시내용의 다른 설명을 기초로 하여, 통상의 기술자는 다양한 다중-항원 구축물을 발현하기 위해 추가의 벡터를 C68로부터 구축할 수 있을 것이고, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
(1) AdC68X-734 및 AdC68W-734
벡터 AdC68X-734는 서열 57의 C68 게놈의 뉴클레오티드 577-3403 (E1 영역) 및 27125-31831 (E2 영역)의 결실을 통한 C68 게놈의 E1 및 E3 영역의 기능적 결실에 의해 및 결실된 E1 영역 내의 서열 61의 삼중 항원 구축물 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)의 삽입에 의해 C68로부터 구축하였다. AdC68W-734가 C68 NDA 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고는, 벡터 AdC68W-734는 벡터 벡터 AdC68-734와 동일하다.
(2) AdC68X-733 및 AdC68X-735
AdC68X-734 벡터에 포함된 삼중 항원-구축물을 각각 서열 65 및 66의 삼중 항원 구축물로 교체함으로써 벡터 AdC68X-733 및 AdC68X-735를 생성하였다. 벡터 AdC68X-733에 포함된 다중-항원 구축물 (즉, PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)은 플라스미드 457에 포함된 것과 동일하고, 벡터 AdC68X-735에 포함된 다중-항원 구축물 (즉, PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)은 플라스미드 459 내의 것과 동일하다.
11C. 연구 생산성 특성
AdC68-734의 다양한 연구 등급 로트를 생산하고, 생산성에 대해 시험하였다. Bacmid를 PacI로 소화시켜 BAC 백본으로부터 벡터 게놈을 방출시키고, 선형화된 핵산을 E1 보완 부착성 HEK293 세포주 내로 형질감염시켰다. 광범한 세포변성 효과 및 아데노바이러스 병소가 가시화될 때, 세포로부터 바이러스를 방출시키기 위해 배양액을 다수 라운드의 동결/해동에 의해 수거하였다. 이들 계대배양 0 (P0) 배양액으로부터의 바이러스를 조직 배양 플라스크에서 적어도 하나의 추가의 계대배양으로 증폭한 후, 연구 규모 생산의 실행을 위한 씨드 원액 (로트당 ~0.5 내지 3e13 총 바이러스 입자)으로 사용하였다. 총 11회의 생산 실행을 실시하였다 (HEK293 현탁액 세포에서 5회 및 HEK293 부착성 세포에서 6회). 평균 비생산성은 초기 감염된 세포당 정제된 15,000 +/- 6,000개 바이러스 입자이었고, 바이러스 입자:감염 단위 비는 55이었다. 연구 규모 생산성을 표 14에 요약한다.
<표 14> 연구 규모 생산 로트의 비생산성 및 감염성
Figure pct00022
*생산에 사용된 후기 계대배양 HEK293 현탁액 세포
11D. 항원 발현
PSMA 및 PSCA의 표면 발현을 유동 세포 분석 (도 12)에 의해 측정하고, PSMA, PSCA 및 PSA의 총 세포 발현을 MOI=10,000에서 AdC68-벡터 감염된 A549 세포로부터 웨스턴 블롯 분석 (도 13)에 의해 측정하였다. 모의 (mock) 및 AdC68 감염된 세포를 감염의 2일 후에 유동 세포측정 분석을 위해 항-PSCA (플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 모노클로날 항체 1G8 [1:200]) 및 PSMA 항체 (알로피코시아닌-접합된 모노클로날 항체 J591 [1:200])로 염색하였다. PSCA 및 PSMA의 표면 발현은 상이한 삼중 항원-발현 AdC68 벡터로 다양한 수준으로 감염된 대다수의 세포로부터 검출되었다. PSCA 및 PSMA의 비교적 보다 높은 수준의 발현이 AdC68X-809 감염된 세포로부터 검출되었고, 보다 낮은 수준은 AdC68X-733 감염된 세포로부터 검출되었다. 감염 2일 후에, 약 1x105개의 감염된 세포로부터 총 세포 용해물을 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔의 각각의 레인 (lane) 상에 로딩하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 PSA, PSMA, 및 PSCA에 특이적인 1차 항체를 사용하여 PSA, PSMA, 및 PSCA 단백질을 검출하기 위해 겔을 후속적으로 막에 옮겼다. 3개의 모든 항원의 발현이 감염된 세포 내에서 다양한 정도로 검출되었다. 비교적 유사한 수준의 PSMA 및 PSCA가 AdC68-734 및 AdC68X-735 감염된 용해물로부터 검출된 반면, AdC68X-735 용해물에 비해 보다 높은 수준의 PSA가 AdC68-734 용해물로부터 검출되었다.
11E. 면역원성
다양한 삼중 항원 AdC68 벡터에 의해 유도된 CD8 IFNγ 반응의 직접적인 (head-to head) 비교를 수행하였다. 각각의 군의 마우스 (군당 n=5)를 사두근에서 1e9 또는 1e10 VP로 AdC68-734, AdC68X-735, AdC68X-809, 또는 Ad5-734로 면역화하였다. 면역화 후 제13일에 각각의 동물로부터의 비장을 수집함으로써 마우스에서 IFNγ CD8+ T 세포 반응을 측정하였다. 비장세포를 단리하고, IFNγ ELISPOT 검정으로 분석하여 PSMA, PSCA, 및 PSA-특이적 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히 설명하면, 면역화한 동물로부터의 2.5 내지 5x105개의 비장세포를 10 ㎍/ml에서 개별 인간 PSMA, PSCA, 또는 PSA-특이적 펩티드의 존재 하에 배양하였다. 15-mer 펩티드는 각각의 전립선 항원에 대한 CD8+ T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 이전에 규정되었다. 배지 단독으로 배양된 비장세포를 대조군으로서 사용하였다. 각각의 조건을 삼중으로 수행하였다. 플레이트를 20h 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이팅하고, 세척하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션 후에 발색시켰다. IFNγ SFC의 수를 CTL 판독기에 의해 계수하였다. 결과는 배지 단독 배경 값을 뺀, 1x106개의 비장세포에 대해 정규화된 PSMA, PSCA, 및 PSA-특이적 SFC의 평균 수를 보여준다.
요약하면, 모든 삼중 항원 발현 AdC68 벡터는 규모는 상이하지만, 3가지 모든 항원에 대해 면역 반응을 유도하였다. 1e9 VP에서, AdC68 벡터에 의한 PSMA에 대한 반응은 Ad5와 유사하였다. 3가지 AdC68 벡터에 의한 PSCA에 대한 반응은 Ad5에 의해 유도된 반응에 비해 유사하거나 더 낮은 반면, PSA에 대한 반응은 시험한 모든 벡터에 비해 Ad68-735를 사용할 때 더 낮았다. 그러나, 1e10 VP에서, AdC68-809는 AdC68-734, AdC68-735 또는 Ad5에 비해 3가지 모든 항원에 대해 유사하거나 더 우수한 반응을 유도하였다. 결과를 표 15에 제공한다.
<표 15> IFNγ ELISPOT 검정에 의해 C57BL6 마우스에서 PSMA, PSA, 및 PSCA를 동시 발현하는 AdC68 벡터에 의한 IFNγ T 세포 면역원성
Figure pct00023
선택된 가공되지 않은 서열
서열 1. 전장 인간 PSMA의 아미노산 서열
Figure pct00024
서열 2. 서열 1의 전장 인간 PSMA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00025
서열 3. PSMA 셔플링된 항원 1의 아미노산 서열
서열 4. 서열 3의 PSMA 셔플링된 항원 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 5. PSMA 셔플링된 항원 2의 아미노산 서열
서열 6. 서열 5의 PSMA 셔플링된 항원 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 7. PSMA 셔플링된 항원 3의 아미노산 서열
서열 8. 서열 7의 PSMA 셔플링된 항원 3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 9. 막 -결합형 PSMA 항원의 아미노산 서열
Figure pct00026
서열 10. 서열 9의 막-결합형 PSMA 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00027
서열 11. 세포액형 PSMA 항원의 아미노산 서열
서열 12. 서열 11의 세포액형 PSMA 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 13. 분비형 PSMA 항원의 아미노산 서열
서열 14. 서열 13의 분비형 PSMA 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 15. 전장 인간 PSA의 아미노산 서열
Figure pct00028
서열 16. 서열 15의 전장 인간 PSA의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00029
서열 17. 세포액형 PSA 항원의 아미노산 서열
Figure pct00030
서열 18. 서열 17의 세포액형 PSA 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00031
서열 19. 막 -결합형 PSA 항원의 아미노산 서열
Figure pct00032
서열 20. 서열 19의 막-결합형 PSA 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00033
서열 21. 전장 인간 PSCA의 아미노산 서열
Figure pct00034
서열 22. 서열 21의 전장 인간 PSCA의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00035
서열 23. 플라스미드 5166의 뉴클레오티드 서열
서열 24. 플라스미드 5259의 뉴클레오티드 서열
서열 25. 플라스미드 5297의 뉴클레오티드 서열
서열 26. 플라스미드 460의 뉴클레오티드 서열
서열 27. 플라스미드 451의 뉴클레오티드 서열
서열 28. 플라스미드 454의 뉴클레오티드 서열
서열 29. 플라스미드 5300의 뉴클레오티드 서열
서열 30. 플라스미드 449의 뉴클레오티드 서열
서열 31. 플라스미드 603의 뉴클레오티드 서열
서열 32. 플라스미드 455의 뉴클레오티드 서열
서열 33. 플라스미드 456의 뉴클레오티드 서열
서열 34. 플라스미드 457의 뉴클레오티드 서열
서열 35. 플라스미드 458의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
서열 36. 플라스미드 459의 뉴클레오티드 서열
서열 37. P셔틀 IRES의 뉴클레오티드 서열
서열 38. Her-2 항원의 아미노산 서열
서열 39. 서열 38의 Her-2 항원 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
서열 40. 항-CD40 항체 CP870,893의 중쇄의 아미노산 서열:
Figure pct00041
서열 41. 항-CD40 항체 CP870,893의 경쇄의 아미노산 서열:
Figure pct00042
서열 42. 항- CTLA -4 항체 트레멜리무맙의 중쇄의 아미노산 서열:
Figure pct00043
서열 43. 항- CTLA -4 항체 트레멜리무맙의 경쇄의 아미노산 서열:
Figure pct00044
서열 44. CpG 7909의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00045
서열 45. CpG 24555의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00046
서열 46. CpG 10103의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00047
서열 47. eGFP의 아미노산 서열
서열 48. HBV 코어 항원의 아미노산 서열
서열 49. HBV 표면 항원의 아미노산 서열
서열 50. 붉은털원숭이 PSMA ECD 단백질의 아미노산 서열
서열 51. 래트 Her-2 p66 펩티드 (H-2d T 세포 에피토프 )의 아미노산 서열
서열 52. 래트 Her-2 p169 펩티드 (H-2d T 세포 에피토프 )의 아미노산 서열
서열 53. HBV 코어 항원 p87 펩티드의 아미노산 서열
서열 54. 래트 Her-2 항원 ( rHer - 2)의 아미노산 서열
서열 55. 붉은털원숭이 PSMA 항원의 아미노산 서열
서열 56. 서열 55의 붉은털원숭이 PSMA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 57. 원숭이 아데노바이러스 25 (C68)의 완전 게놈
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
서열 58. AdC68 -734 벡터의 완전 서열
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
서열 59: 바람직한 EMCV IRES ( pIRES )의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00077
(최소 EMCV IRES (mIRES)에는 밑줄친 15개의 뉴클레오티드가 결여됨)
서열 60. 면역원성 PSA, PSCA , 및 PSMA 폴리펩티드 (플라스미드 916 및 벡터 AdC68 -734 및 AdC68W -734에 의해 코딩됨)를 포함하는 아미노산 서열
Figure pct00078
서열 61. 서열 60의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00079
Figure pct00080
서열 62. 플라스미드 916의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
서열 63. AdC68W -734 벡터의 완전한 서열
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
서열 64. 면역원성 PSA, PSMA , 및 PSCA 폴리펩티드 (플라스미드 457 및 벡터 AdC68X-733에 의해 코딩됨)를 포함하는 아미노산 서열
Figure pct00099
서열 65. 서열 64의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
서열 66. 플라스미드 459 및 벡터 AdC68X -735 내에 통합된 다중-항원 구축물 (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. <120> VECTORS FOR EXPRESSION OF PROSTATE-ASSOCIATED ANTIGENS <130> PC72055A <150> US 61/898,966 <151> 2013-11-01 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile 65 70 75 80 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile 85 90 95 Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320 Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val 340 345 350 Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly 370 375 380 Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg 385 390 395 400 Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415 Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430 Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val 450 455 460 Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480 Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495 Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 510 Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu 515 520 525 Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 535 540 Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575 Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val 580 585 590 Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605 Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr 610 615 620 Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu 660 665 670 Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg 675 680 685 His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser 690 695 700 Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp 705 710 715 720 Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala 725 730 735 Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala 740 745 750 <210> 2 <211> 2250 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtggaatc tccttcacga aaccgactcg gctgtggcca ccgcgcgccg cccgcgctgg 60 ctgtgcgctg gggcgctggt gctggcgggt ggcttctttc tcctcggctt cctcttcggg 120 tggtttataa aatcctccaa tgaagctact aacattactc caaagcataa tatgaaagca 180 tttttggatg aattgaaagc tgagaacatc aagaagttct tatataattt tacacagata 240 ccacatttag caggaacaga acaaaacttt cagcttgcaa agcaaattca atcccagtgg 300 aaagaatttg gcctggattc tgttgagcta gcacattatg atgtcctgtt gtcctaccca 360 aataagactc atcccaacta catctcaata attaatgaag atggaaatga gattttcaac 420 acatcattat ttgaaccacc tcctccagga tatgaaaatg tttcggatat tgtaccacct 480 ttcagtgctt tctctcctca aggaatgcca gagggcgatc tagtgtatgt taactatgca 540 cgaactgaag acttctttaa attggaacgg gacatgaaaa tcaattgctc tgggaaaatt 600 gtaattgcca gatatgggaa agttttcaga ggaaataagg ttaaaaatgc ccagctggca 660 ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc tggggtgaag 720 tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa tatcctaaat 780 ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca ggttacccag caaatgaata tgcttatagg 840 cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca agtattcctg ttcatccaat tggatactat 900 gatgcacaga agctcctaga aaaaatgggt ggctcagcac caccagatag cagctggaga 960 ggaagtctca aagtgcccta caatgttgga cctggcttta ctggaaactt ttctacacaa 1020 aaagtcaaga tgcacatcca ctctaccaat gaagtgacaa gaatttacaa tgtgataggt 1080 actctcagag gagcagtgga accagacaga tatgtcattc tgggaggtca ccgggactca 1140 tgggtgtttg gtggtattga ccctcagagt ggagcagctg ttgttcatga aattgtgagg 1200 agctttggaa cactgaaaaa ggaagggtgg agacctagaa gaacaatttt gtttgcaagc 1260 tgggatgcag aagaatttgg tcttcttggt tctactgagt gggcagagga gaattcaaga 1320 ctccttcaag agcgtggcgt ggcttatatt aatgctgact catctataga aggaaactac 1380 actctgagag ttgattgtac accgctgatg tacagcttgg tacacaacct aacaaaagag 1440 ctgaaaagcc ctgatgaagg ctttgaaggc aaatctcttt atgaaagttg gactaaaaaa 1500 agtccttccc cagagttcag tggcatgccc aggataagca aattgggatc tggaaatgat 1560 tttgaggtgt tcttccaacg acttggaatt gcttcaggca gagcacggta tactaaaaat 1620 tgggaaacaa acaaattcag cggctatcca ctgtatcaca gtgtctatga aacatatgag 1680 ttggtggaaa agttttatga tccaatgttt aaatatcacc tcactgtggc ccaggttcga 1740 ggagggatgg tgtttgagct agccaattcc atagtgctcc cttttgattg tcgagattat 1800 gctgtagttt taagaaagta tgctgacaaa atctacagta tttctatgaa acatccacag 1860 gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca 1920 gaaattgctt ccaagttcag tgagagactc caggactttg acaaaagcaa cccaatagta 1980 ttaagaatga tgaatgatca actcatgttt ctggaaagag catttattga tccattaggg 2040 ttaccagaca ggccttttta taggcatgtc atctatgctc caagcagcca caacaagtat 2100 gcaggggagt cattcccagg aatttatgat gctctgtttg atattgaaag caaagtggac 2160 ccttccaagg cctggggaga agtgaagaga cagatttatg ttgcagcctt cacagtgcag 2220 gcagctgcag agactttgag tgaagtagcc 2250 <210> 3 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic construct <400> 3 Met Ala Ser Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile 20 25 30 Lys Ser Ser Ser Glu Ala Thr Asn Ile Ser Pro Gln His Asn Val Lys 35 40 45 Ala Phe Leu Asp Glu Met Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr 50 55 60 Leu Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln 65 70 75 80 Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ala Glu Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser 85 90 95 Val Glu Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Glu Thr 100 105 110 His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asp Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe 115 120 125 Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Ile Ser 130 135 140 Asp Val Val Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu 145 150 155 160 Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys 165 170 175 Leu Glu Arg Glu Leu Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Leu Ile Ala 180 185 190 Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu 195 200 205 Ala Gly Ala Lys Gly Ile Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly 225 230 235 240 Gly Val Gln Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro 245 250 255 Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Glu Leu 260 265 270 Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr 275 280 285 Tyr Asp Ala Gln Lys 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ccaggatatg aaaatgtttc ggatattgta 420 ccacctttca gtgctttctc tcctcaagga atgccagagg gcgatctagt gtatgttaac 480 tatgcacgaa ctgaagactt ctttaaattg gaacgggaca tgaaaatcaa ttgctctggg 540 aaaattgtaa ttgccagata tgggaaagtt ttcagaggaa ataaggttaa aaatgcccag 600 ctggcagggg ccaaaggagt cattctctac tccgaccctg ctgactactt tgctcctggg 660 gtgaagtcct atccagatgg ttggaatctt cctggaggtg gtgtccagcg tggaaatatc 720 ctaaatctga atggtgcagg agaccctctc acaccaggtt acccagcaaa tgaatatgct 780 tataggcgtg gaattgcaga ggctgttggt cttccaagta ttcctgttca tccaattgga 840 tactatgatg cacagaagct cctagaaaaa atgggtggct cagcaccacc agatagcagc 900 tggagaggaa gtctcaaagt gccctacaat gttggacctg gctttactgg aaacttttct 960 acacaaaaag tcaagatgca catccactct accaatgaag tgacaagaat ttacaatgtg 1020 ataggtactc tcagaggagc agtggaacca gacagatatg tcattctggg aggtcaccgg 1080 gactcatggg tgtttggtgg tattgaccct cagagtggag cagctgttgt tcatgaaatt 1140 gtgaggagct ttggaacact gaaaaaggaa gggtggagac ctagaagaac aattttgttt 1200 gcaagctggg atgcagaaga atttggtctt cttggttcta 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gcatgatgaa 2580 tatgtacccg ggagtggtgg gcatggatgg ggttaccttt atgaacatga ggttcagggg 2640 agatgggtat aatggcacgg tctttatggc caataccaag ctgacagtcc atggctgctc 2700 cttctttggg tttaataaca cctgcatcga ggcctggggt caggtcggtg tgaggggctg 2760 cagtttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcaggacc aagagtatgc tgtccgtgaa 2820 gaaatgcttg tttgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag ccagaatccg 2880 ccactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgtgc aagggcaatg ctaagatcaa 2940 gcataatatg atctgtggag cctcggacga gcgcggctac cagatgctga cctgcgccgg 3000 cgggaacagc catatgctgg ccaccgtaca tgtggcttcc catgctcgca agccctggcc 3060 cgagttcgag cacaatgtca tgaccaggtg caatatgcat ctggggtccc gccgaggcat 3120 gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 3180 gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 3240 atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 3300 ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 3360 caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt 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catcacacga 2280 tttgatgctg cttcggctct cggaaccggc cgagctcacc gacgcagtga aggtcatgga 2340 cctccctacg caagagcctg ctctcggtac cacttgttac gcatcgggat ggggctccat 2400 cgagccggaa gaattcctga ccccgaaaaa gctgcagtgc gtggatctgc acgtgatttc 2460 gaatgacgtg tgcgcgcaag tgcatccaca aaaggtcact aagttcatgc tgtgcgccgg 2520 aaggtggacc ggcggaaaat cgacctgttc cggcgacagc ggaggcccac tcgtgtgcaa 2580 cggtgtgctg cagggcatca ctagctgggg atcagaaccg tgcgcgcttc cggagcggcc 2640 ctcgctctac acgaaggtgg tgcactaccg caaatggatt aaagatacca tcgtcgcaaa 2700 ccctggatcc gaaggtaggg gttcattatt gacctgtgga gatgtcgaag aaaacccagg 2760 acccgctagc aaagcagtgc tgctggcgct cctgatggct ggactcgcgc tgcagcctgg 2820 aaccgccctg ctctgttact cgtgcaaggc ccaagtctcg aatgaggact gtttgcaagt 2880 ggaaaactgc acccagctcg gagaacaatg ctggactgca cggatccgcg ctgtcggcct 2940 gctgaccgtg atctccaaag ggtgctcatt gaactgcgtg gacgatagcc aggactacta 3000 cgtgggaaag aagaatatca cttgttgcga cacggatctt tgcaacgcgt ccggagcgca 3060 cgccctgcag ccagcagccg ccattctggc cctgcttccg gccctggggt 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Ser Phe 865 870 875 880 Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys 885 890 895 Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser Asn Pro Ile Val Leu 900 905 910 Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp 915 920 925 Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala 930 935 940 Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr 945 950 955 960 Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Trp 965 970 975 Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala 980 985 990 Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala Gly Ser Glu Gly Arg Gly Ser 995 1000 1005 Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Ser 1010 1015 1020 Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln 1025 1030 1035 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser 1040 1045 1050 Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu 1055 1060 1065 Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val 1070 1075 1080 Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp 1085 1090 1095 Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu 1100 1105 1110 Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile 1115 1120 1125 Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly 1130 1135 1140 Gln Leu 1145 <210> 65 <211> 246 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 atggctagca tcgtcggagg gtgggagtgc gaaaagcact cacagccatg gcaggtcctg 60 gtcgcctcgc gcggacgcgc cgtgtgtgga ggtgtgctgg tccacccgca gtgggtgttg 120 actgcggccc attgcatcag aaataagtcc gtgatcctct tggggagaca ttccctgttt 180 caccccgaag atactggaca ggtgttccaa gtgagccact ccttcccgca tccactgtac 240 gacatg 246 <210> 66 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 atggctagca aagcagtgct gctggcgctc ctgatggctg gactcgcgct gcagcctgga 60 accgccctgc tctgttactc gtgcaaggcc caagtctcga atgaggactg tttgcaagtg 120 gaaaactgca cccagctcgg agaacaatgc tggactgcac ggatccgcgc tgtcggcctg 180 ctgaccgtga tctccaaagg gtgctcattg aactgcgtgg acgatagcca ggactactac 240 gtggg 245

Claims (24)

  1. (a) C68 뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다중-항원 구축물
    을 포함하는 C68 벡터.
  2. 제1항에 있어서, C68 뉴클레오티드 서열이 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결여된 서열 57의 서열이고, 여기서 면역원성 PSA 폴리펩티드는 서열 15의 아미노산 27-263 또는 서열 17의 아미노산 4-240을 포함하고, 면역원성 PSCA 폴리펩티드는 서열 21의 아미노산 서열 또는 서열 21의 아미노산 4-125를 포함하고, 면역원성 PSMA 폴리펩티드는
    1) 서열 1의 아미노산 15-750을 포함하는 폴리펩티드;
    2) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    5) 서열 9의 아미노산 4-739를 포함하는 폴리펩티드;
    6) 서열 3의 아미노산 4-739를 포함하는 폴리펩티드;
    7) 서열 5의 아미노산 4-739를 포함하는 폴리펩티드;
    8) 서열 7의 아미노산 4-739를 포함하는 폴리펩티드; 및
    9) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 C68 벡터.
  3. 제2항에 있어서, C68 뉴클레오티드 서열이 E1A, E1B, 및 E3의 유전자가 결여된 서열 57의 서열이고, 다중-항원 구축물이 2개의 상이한 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 분리자 서열을 추가로 포함하고 하기 식 (I)의 구조를 갖는 것인 C68 벡터.
    1. PAA1-SS1-PAA2-SS2-PAA3 (I)
    2. 식 (I)에서,
    (i) PAA1, PAA2, 및 PAA3이 상이한 PAA 폴리펩티드를 코딩할 경우, PAA1, PAA2, 및 PAA3은 각각 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고,
    (ii) SS1 및 SS2는 분리자 서열이며, 동일하거나 상이할 수 있다.
  4. 제3항에 있어서, 분리자 서열이 2A 펩티드 서열 및 IRES로부터 선택되는 것인 C68 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 2A 펩티드 서열이 FMDV, ERAV, PTV1, EMC-B, EMCV, TME-GD7, ERBV, TaV, DrosC, CrPV, ABPV, IFV, 돼지 로타바이러스, 인간 로타바이러스, 티. 브루세이(T. brucei) TSR1, 및 티. 크루지(T. cruzi) AP 엔도뉴클레아제의 2A-펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; IRES가 EMCV IRES인 C68 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 식 (I)에서 PAA1이 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 C68 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) PAA1이 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    (ii) PAA2가 면역원성 PSCA 또는 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    (iii) SS1이 2A-펩티드 서열이고;
    (iv) SS2가 2A-펩티드 서열 또는 EMCV IRES인 C68 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 2A-펩티드 서열이 FMDV 2A-펩티드 서열 또는 TAV 2A-펩티드 서열인 C68 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    (1) 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 20의 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 18의 뉴클레오티드 10-720을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열 58의 뉴클레오티드 1115-1825를 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (v) 서열 58의 뉴클레오티드 1106-1825를 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (2) 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열 22의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 22의 뉴클레오티드 10-372를 포함하는 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 58의 뉴클레오티드 1892-2257을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (iv) 서열 58의 뉴클레오티드 1886-2257을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (3) 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열 2의 뉴클레오티드 43-2250을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열 4의 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열 6의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열 8의 뉴클레오티드 서열; (v) 서열 10의 뉴클레오티드 서열; (vi) 서열 4의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (vii) 서열 6의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (viii) 서열 8의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (ix) 서열 10의 뉴클레오티드 10-2217을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (x) 서열 58의 뉴클레오티드 2333-4543을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 (xi) 서열 58의 뉴클레오티드 2324-4543을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 C68 벡터.
  10. 제3항에 있어서, 식 (I)에서
    (1) PAA1이 면역원성 PSA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 1115-1825를 포함하거나 서열 58의 1106-1114를 포함하고;
    (2) PAA2가 면역원성 PSCA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 1892-2257을 포함하거나 서열 58의 1886-2257을 포함하고;
    (3) PAA3이 면역원성 PSMA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 58의 뉴클레오티드 2333-4543을 포함하거나 서열 58의 2324-4543을 포함하고;
    (4) SS1이 T2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    (5) SS2가 F2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 C68 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 다중-항원 구축물이 서열 60 또는 서열 64의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 C68 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 다중-항원 구축물이 서열 61, 서열 65, 서열 66의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 61, 서열 65, 서열 66의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체를 포함하는 것인 C68 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, CMV 프로모터를 추가로 포함하는 C68 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 서열 58의 뉴클레오티드 서열, 서열 58의 뉴클레오티드 9-34811, 또는 서열 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 C68 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 C68 벡터를 포함하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 C68 벡터를 포함하는 세포.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  18. 제17항에 따른 유효량의 제약 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 전립선암의 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 인간에게 유효량의 면역 조절제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 인간에게 (a) 유효량의 적어도 하나의 면역-억제성-세포 억제제 및 (b) 유효량의 적어도 하나의 면역-이펙터-세포 증강제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 면역-억제성-세포 억제제가 단백질 키나제 억제제, COX-2 억제제, 및 PDE5 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되고, 면역-이펙터-세포 증강제가 CTLA-4 억제제, CD40 효능제, TLR 효능제, 4-1 BB 효능제, OX40 효능제, GITR 효능제, PD-1 길항제, 및 PD-L1 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (1) 단백질 키나제 억제제가 이마티닙, 소라페닙, 라파티닙, 작티마 MP-412, 다사티닙, 레스타우르티닙, 수니티닙 말레이트, 악시티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 보수티닙, 템시롤리스무스, 및 닐로티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (2) CTLA-4 억제제가 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (3) CD40 효능제가 G28-5, mAb89, EA-5, S2C6, CP870893, 및 다세투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-CD40 항체이고;
    (4) TLR 효능제가 CpG 24555, CpG 10103, CpG7909, 및 CpG1018로 이루어진 군으로부터 선택되는 CpG 올리고뉴클레오티드인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 면역-억제성-세포 억제제가 소라페닙, 다사티닙, 이마티닙, 악시티닙, 및 수니티닙 말레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 억제제이고, 면역-이펙터-세포 증강제가 트레멜리무맙인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 면역-억제성-세포 억제제가 소라페닙, 다사티닙, 이마티닙, 악시티닙, 및 수니티닙 말레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 억제제이고, 면역-이펙터-세포 증강제가 CpG24555, CpG10103, CpG7909, 및 CpG1018로 이루어진 군으로부터 선택되는 CpG 올리고뉴클레오티드인 방법.
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