JP2005532814A - アンドロゲン応答配列の制御下にレポーター核酸を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、癌またはアンドロゲンレセプター機能の欠陥と関連する他の疾患の治療のための選択的アンドロゲンレセプターモデュレーター(SARM)の同定および開発のためのインビボモデルに用いることができる。
Description
本発明は、アンドロゲンレセプター機能のインビボ評価のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物を目的とするものである。さらに本発明は、アンドロゲンレセプター活性をモデュレートする化合物および治療法の開発におけるそのような哺乳動物の用途に関するものである。
組換えDNAおよび遺伝子技術における近年の進歩は、所望の遺伝子配列をレシピエント動物に導入し発現させることを可能にした。このような方法を使用することで、天然には存在しない配列または遺伝子、すなわち、改変されていない動物には通常または天然には存在しない配列または遺伝子を持つような動物が作り出されてきた。この技術はまた、天然に存在する遺伝子または配列の、改変された発現を示す動物を作製するために利用できる。
これらの方法の使用によって作製される動物は、導入した配列または遺伝子を当該動物の幾らかの細胞のみが含み且つ発現する「キメラ」であるか、または、導入した配列または遺伝子を当該動物の全細胞が含んでいる「トランスジェニック」であるかのいずれかとなり得る。したがって、子孫への伝達が当該動物の生殖細胞にその導入された材料が存在するかどうかに依存するキメラ動物に比して、トランスジェニック動物の場合、全ての動物が導入された遺伝材料をその子孫に伝達することができる。
培養哺乳動物細胞の高効率形質転換は、特定のDNA配列を細胞核中に直接マイクロインジェクションすることによって達成されてきた(M. Capecchi, Cell 22: 479-488 (1980))。より詳細には、DNAをマウスの胚にマイクロインジェクションし、得られた子孫にそのDNAが見出されることも証明されている(J. Gordonら、P.N.A.S. U.S.A. 77: 7380-7384 (1980))。このように、或る種のトランスジェニックマウスを作製できることは、記載されそして周知である。
トランスジェニックマウスを作製する基本的方法は、新たに交尾した雌マウスから受精卵を回収し、次いでマウスに移すべき配列または遺伝子を含むDNAを該卵の雄マウスの前核にマイクロインジェクションすることを要する。このマイクロインジェクションした卵を偽妊娠1日の養母の卵管に移植し、分娩まで進行させる。次いでこのマウス新生児を、マイクロインジェクションされたDNAの存在を検出するのに好適な、当該技術分野で知られた手段によって、そのマイクロインジェクションされたDNAの存在について検査する。例えば、T. Wagnerら、P.N.A.S. U.S.A. 78: 6376-6380 (1981)、米国特許第4,873,191号を参照されたく、これは、ウサギβ−グロブリンを赤血球に発現できるマウスの作製を記載している。
アンドロゲンは、主として発育期および成人期の雄の性徴を担っている。正常な成人男性では、主たるアンドロゲンであるテストステロン(T)は約5〜7mg/日が精巣によて産生され、全身の循環系に放出されている。テストステロンまたは一層強力なその代謝産物であるジヒドロテストステロン(DHT)(K. Sundaram, Steroid Biochem. Mol. Biol. 53: 253-257 (1995))は、ステロイド核内ホルモンレセプター(NHR)スーパーファミリーの一員であるアンドロゲンレセプター(AR)に結合する。これら細胞内レセプターはリガンド依存性の転写因子であり、様々な遺伝子の転写を制御している。ARは、前立腺および精嚢、男性および女性の性器、皮膚、精巣、卵巣、軟骨、皮脂腺、毛包、汗腺、心筋、骨格筋および平滑筋、胃腸の小嚢細胞、甲状腺の濾胞細胞、副腎皮質、肝臓、松果体、および多数の脳の皮質領域および皮質下領域(脊髄の運動ニューロンを含む)を含む生殖組織および非生殖組織に広く分布している(A. Negro-Vilar, J. Clin. Endocrinol. Metab., 54(10):3459-62 (1999))。テストステロンはまた、分泌器官および標的器官でアロマターゼによってエストロゲン(エストラジオール−17β)に代謝されることができ(M. Sawayaら、J. Invest. Dermatol. 109: 296-300 (1997), C. Roselliら、Biol. Reprod. 58: 79-87 (1998))、エストロゲンレセプターを介して遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。
アンドロゲンの作用には複数ある。胚では、アンドロゲンは生殖器の男性の表現型への分化を担う。思春期にはアンドロゲン産生の増大は二次性徴を誘発する。さらに、アンドロゲンはまた、社会行動、性欲および身体的外観などのヒトの生活の他の側面にも影響を及ぼす。
たとえば、去勢(テストステロンの停止を引き起こす)は動物の攻撃性の低減に導くことが報告されている(J. Morley, Handbook of Clinical Psychoneuroendocrinology, Nemroff, C.B.およびLoosen, P.T. (編), Guilford, New York, pp. 3-41 (1987))。低テストステロンレベルはまた疲労と関係しており、一方、テストステロン置換はしばしば幸福の一般的な気分を引き起こす(Nolten W.E., Curr Urol Rep. 4:313-9 (2000))。テストステロンは雄マウスで記憶を改善することが示されており(J. Flood, P.N.A.S. U.S.A. 89:1567-1571 (1992))、また、より老齢のマウスでの二重盲検試験によりテストステロンが空間視覚に関する知覚を改善することがわかった(J. Jankowsky, Behav. Neurosci. 108:325-332 (1994))。さらに、研究により男性の遊離のテストステロン血漿レベルとこれら被験者の冠状心疾患の程度との逆の相関が示唆されているという点でアンドロゲンは脈管系に作用すると考えられている(G. Phillipsら、Arterioscler. Thromb. 14:701-706 (1994), K. English, Eur. Heart J. 21:890-894 (2000))。冠状動脈疾患を有する男性の冠状動脈にテストステロンを注入すると、冠状血流の急性の有意の増大という結果となる(C. Webbら、Circulation 100:1690-1696 (1999))。アンドロゲンはまた、内皮細胞の機能(Ongら、Ann. J. Cardiol. 85:14-17 (2000))および心筋虚血(C. Webbら、Ann. J. Cardio. 83:437-439 (1999); K. English, Circulation 102:1906-1911 (2000))に対して有利に作用する。性欲の点に関しては、テストステロンはクロスセクショナル研究(R. Schiaviら、Psychosom. Med. 53:363-374 (1991))および介入(interventional)研究(Moralesら、J. Urol. 157(3):849-854 (1997); I. Klepschら、Endocrinologie 20(4):289-293 (1982))の両者で明らかに性衝動を改善する。外観および体の作りに対するアンドロゲンの作用については、テストステロンはより老齢の男性で低レベルのテストステロンで筋力を向上させるとの観念を支持する男性における幾つかの研究が存在する(R. Baumgartnerら、Mech. Ageing Dev. 107(2):123-136 (1999); R. Sihら、J. Clin. Endocr. Metab. 82: 1661-167 (1997); R. Orrellら、J. R. Soc. Med. 88:454-46 (1995))。骨に対するアンドロゲンの作用に関しては、骨の無機物密度が男性では年齢とともに低下し(H. Burgerら、Ann. J. Epidem. 147(9):871-879 (1998))、テストステロン置換療法を受けた性機能低下症の老齢の男性で増加することが示されている(P. Snyderら、J. Clin. Endocr. Metab. 84:1966-1972 (1999); I. Reidら、Arch. Intern. Med. 156:1173-117 (1996))。
アンドロゲンがこれほども多くの生理的な関連する系に作用するメカニズムについての正確な理解が欠如しているにもかかわらず、ARが何故に医薬の発見および患者の治療の複数の領域で重要な標的であるかは容易に理解できる。腫瘍学の領域では、たとえば、アンドロゲンレセプター機能のインヒビター(アンタゴニストまたは部分的なアンタゴニスト)はアンドロゲン依存性の前立腺癌の治療に有用であり、一方、ARのアゴニストまたは部分的なアゴニストは乳癌の治療に適用できる。代謝および内分泌疾患については、アンドロゲンレセプター機能のアゴニストまたは部分的なアゴニストは、加齢関連疾患および幾つかの疾患状態(後天性免疫不全症候群(AIDS)を含むが、これに限られるものではない)における悪液質の状態の治療に有用である。機能的なARはまた種々の骨細胞でも同定されているため、アンドロゲンの投与は男性および女性で骨格の発育および維持に対して有利に作用する。
アンドロゲン療法の進歩は、所望とするアンドロゲン活性を所望としないまたは投与量の制限を受ける副作用から分離することができないことにより制限されている。選択的なエストロゲンレセプターモデュレーター(所望としない副作用を排除または最小にしながら、エストロゲンレセプターへのターゲティングにおいてある程度の組織選択性を有する)の開発における最近の進歩は、同様のアプローチが選択的なアンドロゲンレセプターモデュレーター(SARM)などのような他のNHRにも利用できることを示唆している(たとえば、A. Negro-Vilar, J. Clin. Endocr. Metab 54(10):3459-3462 (1999); P. Reidら、Investigational New Drugs 17:271-284 (1999)を参照)。
今日、アンドロゲンレセプターの機能をインビボで明らかにするために幾つかのアプローチが採用されている。精巣性女性化した雄(tfm;testicular feminized male)マウス(M. Lyonら、Nature 227: 1217-1219 (1970))は機能の喪失の一例を表すが、AR遺伝子のN末端領域に単一の点変異を有していて早すぎる停止コドンという結果となる(M. Gasparら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:8606-8610 (1991))。tfmマウスはヒトでの完全型男性ホルモン不応性症候群(cAIS)と等価であり、遺伝的には不妊の雄であると考えられる。それゆえ、tfmマウスはAR遺伝子突然変異についてホモ接合性の遺伝的に雌と考えられるマウスの作製には用いることはできない。tfmキャリヤーの雌をAR遺伝子突然変異についてキメラである雄とともに飼育することにより、ホモ接合性のtfm雌がごく少数だけ作製された。これら後者の動物について行った研究から、機能性のARを有することはその生殖能にとって重要ではないことが明らかとなった(M. Lyonら、Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 208:1-12 (1980))。しかしながら、成体マウスでのAR機能の解明にこれら動物を使用することには限界がある。これら動物は生涯を通じて当該レセプターを欠くので、観察される表現型の幾つかは発育の際の機能性のARの欠如の結果でありうる。逆に、プロバシン(probasin)、前立腺特異的プロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウス系統が作製されている(Y. Yanら、Prostate 32:129-139 (1997))。この系統や関連する系統はARの機能を評価するのに有用な手段であるが、前立腺でのARの機能を定めることに限られている。
故に、アンドロゲンレセプターの組織特異的な活性の評価のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを開発することは興味深い。そのようなモデルを使用して、薬理学的剤の組織特異的活性並びに雄および雌の様々な器官でのアンドロゲンレセプターの活性を研究することができる。ここに記載する本発明は、アンドロゲン制御されたプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を用いたそのようなモデルを表すものである。
本発明は、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。一つの態様において、レポーターはルシフェラーゼである。他の側面において、アンドロゲン応答配列は2XDR−1である。
本発明はまた、本発明のトランスジェニックマウスから単離した細胞であってそのゲノムが該核酸構築物を含むものをも提供する。
本発明はまた、本発明のトランスジェニックマウスから単離した細胞を含むマウス細胞系統をも提供する。
本発明はまた、アンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含む単離した核酸構築物であって、アンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする核酸構築物をも提供する。一つの側面において、レポーターはルシフェラーゼである。他の側面において、アンドロゲン応答配列は2XDR−1である。
本発明はまた、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されている標的マウスを得る方法であって、その際、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができ、下記工程:
(a)第一の雌マウスからの受精卵をゾル化し、
(b)該核酸構築物を含むトランスジーンを受精卵に移し、
(c)工程(b)の受精卵を偽妊娠した第二の雌マウスの子宮に移し、ついで
(d)該第二の雌マウスを、
(i)該第二の雌マウスが、工程(c)の該受精卵からの胚で妊娠し、
(ii)該胚が該標的マウスに発育し、および
(iii)該標的マウスが該第二の雌マウスから生存して生まれる
ように保持する
ことを含み、その際、該標的マウスのゲノムは該核酸構築物を含み、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができる、ことを特徴とする方法をも包含する。
(a)第一の雌マウスからの受精卵をゾル化し、
(b)該核酸構築物を含むトランスジーンを受精卵に移し、
(c)工程(b)の受精卵を偽妊娠した第二の雌マウスの子宮に移し、ついで
(d)該第二の雌マウスを、
(i)該第二の雌マウスが、工程(c)の該受精卵からの胚で妊娠し、
(ii)該胚が該標的マウスに発育し、および
(iii)該標的マウスが該第二の雌マウスから生存して生まれる
ように保持する
ことを含み、その際、該標的マウスのゲノムは該核酸構築物を含み、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができる、ことを特徴とする方法をも包含する。
本発明はまた、レポーター核酸を発現するトランスジェニックマウス細胞系統の製造方法をも包含し、該方法は、(a)本発明のトランスジェニックマウスから細胞を単離し、ついで(b)該トランスジェニックマウス細胞系統が該レポーター核酸を発現するように、単離した細胞を単離した細胞の増殖および生存を保持する条件下に置くことを含む。
本発明はまた、アンドロゲンレセプターのモデュレーターをスクリーニングする方法であって、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、ついでアンドロゲンレセプターの活性に対する該被験物質の作用をアッセイすることを含む方法をも提供する。アンドロゲンレセプターのモデュレーターは、癌などのAR機能の欠陥と関連する疾患を治療するのに特に有用である。一つの側面において、本発明は、アンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたはアゴニストである被験物質を同定する方法を提供し、該方法は、(a)本発明のトランスジェニックマウス中での該レポーターの発現を決定し、(b)本発明のトランスジェニックマウスに該被験物質を投与して投与後の該レポーターの発現を決定し、(c)該工程(a)および該工程(b)での該レポーターの発現を比較する、その際、該工程(b)での該レポーターの発現の増大は該被験物質を該アンドロゲンレセプターのアゴニストとして同定し、該工程(b)での該レポーターの発現の低減は該被験物質を該アンドロゲンレセプターのアンタゴニストとして同定する、ことを含む。
本発明はさらに、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物は該アンドロゲンレセプター核酸が発現されたときだけ該レポーター核酸を器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。それゆえ、該レポーター核酸の発現は該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御される。
本発明は、その生殖細胞および体細胞がアンドロゲンレセプターを発現しうるプロモーターの制御下、すなわちアンドロゲン応答配列の制御下でレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物がアンドロゲンレセプターが活性化された場合にルシフェラーゼを器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物を包含する。アンドロゲンレセプターが活性化されている細胞はレポーター遺伝子の発現によって容易に決定することができ、レポーター遺伝子の発現は当業者に知られた標準的なバイオルミネセンス画像化法により測定することができる。本発明の好ましい態様において、非ヒト哺乳動物はマウスであり、トランスジーン構築物はレポーター遺伝子を含み、2コピーのアンドロゲン応答配列DR−1(2XDR−1)(配列番号3)を含むプロモーターによって制御されたルシフェラーゼcDNA(配列番号2)およびCMVプロモーター(配列番号5)によって制御されたラットアンドロゲンレセプターcDNA(配列番号4)を含む。本発明はさらに、有性生殖で繁殖させた後にその子孫がアンドロゲン制御されたレポーター遺伝子を有する生存したトランスジェニック動物に発育することのできる、アンドロゲン制御されたレポーター遺伝子を有する非ヒト哺乳動物胚を包含する。本発明はさらに、哺乳動物のゲノム中への最終的な挿入のためにプラスミド中にクローニングした選択したプロモーターとレポーター遺伝子およびラットAR cDNAまたはDNAセグメントを含むDNA構築物を包含する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、活性なアンドロゲンレセプターを含む組織での光の放射を特徴とする。本発明の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、アンドロゲンレセプター活性をモデュレートする分子および化合物の同定および最適化のためにヒトAR機能のモデルまたは代理として利用される。そのようにして同定した分子および化合物は、AR機能の欠陥と関連する疾患(前立腺癌および男性更年期障害を含むがこれらに限られるものではない)の予防および治療に用いることができる。それゆえ、本発明は、アンドロゲンレセプターの活性を種々の器官および組織でモニターするためのインビボ系を提供する。
本発明のさらなる目的は、アンドロゲンレセプターを含む種々の組織でアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することのできる選択的アンドロゲンレセプターモデュレーター(SARM)を同定する方法を提供することである。一つの態様において、ホルモン依存性の腫瘍でのアンタゴニスト活性が、ホルモン依存性の腫瘍細胞株でインビトロかまたはインビボのいずれかにて成長の抑制についてスクリーニングすることにより確認される。他の態様では、潜在的なSARMの活性はまた正常な非腫瘍細胞株で評価される。あるいは、ホルモン依存性のレポーター遺伝子を発現する動物モデルは、動物の種々の組織での潜在的なSARMの活性を評価するのに用いることができる。それゆえ、本発明はまた、アンドロゲンレセプターの選択的モデュレーターの同定のための非ヒト哺乳動物および方法、およびそのようにして同定した選択的モデュレーターを含む医薬組成物をも提供する。
アンドロゲンレセプターは、正常な生理プロセス、すなわち男性の性徴、並びに前立腺癌などの病理状態に関与する多くの遺伝子プログラムの発現を制御するホルモン制御された転写因子である。アンドロゲンレセプターのこれら活性は細胞の種類に特異的であり、これら細胞の種類のそれぞれにおいて共存する多くの補因子に依存している。
本発明は、そのゲノムにルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子(その発現は活性化されたアンドロゲンレセプターにより制御される)、並びに機能的なアンドロゲンレセプターを発現するようにデザインされた遺伝子操作したベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に関する。ホタルからのルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを注射すると、動物は酵素ルシフェラーゼが産生されている組織から光を放射し、遺伝子操作したかまたは内生のいずれかのアンドロゲンレセプターの活性を示す。
本発明の好ましい態様においてはレポーター遺伝子はルシフェラーゼであるが、当業者であれば他のレポーター遺伝子の選択および使用の仕方がわかるであろう。そのような他のレポーター遺伝子としては、グリーン蛍光タンパク質(GFP)、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ドーパミン2レセプター(D2R)、チミジンキナーゼ(TK)、アルカリホスファターゼ(AP)またはELISAによって検出できる一般的なタグが挙げられる。好ましい態様において、ルシフェラーゼはIvisTM Imaging System(Xeragon Corporation、アラメダ、カリフォルニア)で用いる。
本発明により提供されるのは、2つの直列反復1アンドロゲン応答配列(direct repeat-1 androgen response elements)(2XDR−1 ARE)(配列番号3)を含むプロモーターの制御下にルシフェラーゼcDNAおよびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号5)の制御下にラットアンドロゲンレセプターcDNA(配列番号4)を発現するトランスジェニック系統の確立である。DR−1は11塩基対の配列(5’GGAACGGAACA3’)(配列番号6)であり、重複する直列反復として配向した2つの潜在的なコア結合部位からなる。DR−1は、ランダム配列選択アッセイでのヒトAR DNA結合ドメイン融合タンパク質のDNAへの結合により、強力なアンドロゲン応答配列(ARE)として同定された(Z. Zhouら、J. Biol. Chem., 272:8227-8235 (1997))。2コピーのDR−1の直列の配置は、糖質コルチコイドレセプターと比較してAR結合に対する強力な嗜好およびトランス活性化を示した(上掲)。肺、心臓、肝臓、および精巣を含む複数の器官でトランスジーンを発現するマウスの系統を作製した;このトランスジーンを有するマウスはいかなる異常もきたさなかった。本明細書に記載するトランスジェニック動物は、アンドロゲンレセプターの活性をモデュレートする生物学的および化学的残基の同定、開発、および最適化に利用することができる。そのような残基は、今度は前立腺癌、男性更年期障害、およびホルモン補充など(これらに限られるものではない)の治療に用いることができる。
pGL3ベクター(Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン)からのルシフェラーゼcDNA(配列番号2)が2つのDR−1 ARE(配列番号3)(Z. Zhouら、J. Biol. Chem., 272:8227-8235 (1997))を含むプロモーターの制御下に置かれ、効率的なメッセージプロセシングのためにニワトリベータ−グロビンイントロンおよびポリA配列によりフランキングされた構築物を作製した。当業者であれば制御ルシフェラーゼ発現のためにDR−1に加えて他のAREを選択および使用できるであろう。停止転写カセットによって分離されて、同ベクターは反対方向にてラットアンドロゲンレセプターcDNA(配列番号4)の発現を制御するCMVプロモーター(配列番号5)並びに効率的なメッセージプロセシングのためにSV40ウイルスイントロンおよびポリA配列を含んでいる(図1)。CMVプロモーター(配列番号5)は、インビボで動物にて発現されたときに下流配列の転写を殆どあらゆる組織で遍在的に駆動させる。当業者であれば本発明のトランスジーンを他の組織特異的プロモーターの制御下にてベクター中にクローニングすることができるであろう。
以下の実施例に記載する好ましい態様では、構築物は遺伝子操作されたルシフェラーゼ遺伝子をアンドロゲンレセプターによって制御されるプロモーターの制御下に含む(図2A〜2D、配列番号1)。当業者であれば、糖質コルチコイド、プロゲステロン、鉱質コルチコイド、およびエストロゲンレセプターなどのステロイド核内ホルモンレセプターファミリーの他の成員の特徴付けに有用な他の構築物を作製できることを認識するであろう。例として(これに限られることを意図するものではない)、本発明のトランスジーンは、DR−1アンドロゲン応答配列、あるいは他のARE、たとえばC3、PSA−AREまたはプロバシン−AREを含むプロモーター、または糖質コルチコイド応答配列、プロゲステロン応答配列、鉱質コルチコイド応答配列もしくはエストラジオール応答配列を含むプロモーターを含む。
本発明で使用するヌクレオチド配列(cDNA)は、パブリックドメインで利用可能な配列に基づき(たとえば、GenBank)、標準分子生物学技術を用いてクローニングした(Maniatusら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2 (1991))。
構築物はまた、たとえば、標的ゲノム中への導入、トランスジェニック哺乳動物中でのその発現位置、トランスジーン発現のオン/オフ外部制御、および当該技術分野で一般的に知られている他の所望の特徴を媒体すべく、トランスジーンと結合して(トランスジーンと融合するなどして)選択した核酸領域をも含んでいてよい。
上記の同定したDNA構築物を受精した卵母細胞の前核にマイクロインジェクションすると、トランスジーン(ARLuc)DNAを有する4匹のファウンダー(founder)マウスの生成という結果となった。これら4匹のマウスのうち3匹が、トランスジーンをメンデルの法則に従って子孫に受け継がせることがわかった。これら3つの系統からのマウスを、引き続きルシフェラーゼ遺伝子の発現について複数の組織で調べた。図7からわかるように、系統26として同定された一つのトランスジェニックマウスは、肺、心臓、および精巣において特に高レベルのアンドロゲン応答性ルシフェラーゼトランスジーン発現を有していた。
系統26からの3匹の雄トランスジェニックマウス(1匹の非トランスジェニックマウスおよび2匹のトランスジェニックマウス)に、39日齢のときに150mg/kg体重のルシフェリンを麻酔の15分前に注射し、IVISTM Imaging System(Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア)に置き、ルシフェラーゼを冷却した荷電結合素子(CCD)IVISTMカメラ(Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア)で検出し、画像を製造業者によってデザインされたLiving ImageR Software(Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア)で捕捉した。図8Aおよび図8Bに示すように、非トランスジェニックの対照とは対照的に、両トランスジェニックマウスはルミネセンスを呈示し、生殖器領域で優先的なルシフェラーゼ発現を示していた。この発現がアンドロゲン依存性であることを確認するため、これらトランスジェニックマウスの一方を去勢した1週間後に同じ動物で同じ研究を繰り返した。図8Bは去勢したマウスでのルミネセンスの消失を示しており、ルシフェラーゼのアンドロゲン依存性の発現が確認された。
いかなる理論によっても拘泥されることを意図するものではないが、生殖器領域で観察された高いルミネセンスは、精巣がアンドロゲンが合成される器官であり、それゆえアンドロゲンレセプターの活性が最大であるに違いないとの事実によるものと考えられた。この考えを検証するため、150mg/kg体重のルシフェリンを注射した後に対照マウスおよびトランスジェニックマウスから精巣を単離し、カメラに暴露した。図9に示すように、非トランスジェニック動物からの精巣とは対照的に、トランスジェニック動物からの精巣は実質的な光を放射し、このことからもルシフェラーゼ発現のアンドロゲン依存性が確認された。
ルシフェラーゼの発現に対するアンドロゲンの作用をさらに確認するため、系統26からの2対のマウスに2mg/kg体重のテストステロンを皮下注射した後の0日目および1日目に画像化した。図10A〜10Dに示すように、テストステロン処理は全光子放射を1.5〜3.7倍増大させた(トランスジェニックマウスタグ#454およびタグ#453を処理前のそのベースラインと比較)。非トランスジェニック対照と比較した処理動物の比は、それぞれ16.2倍および29.0倍であった。
第一にルシフェラーゼ活性を単一の器官で測定する可能性、第二にこれら器官でのアンドロゲン機能の差異を検出する能力を試験するため、ルシフェラーゼ活性を脳、肺、肝臓、四頭筋、精嚢、および心臓から調製した全抽出物で測定した。図11に示すように、トランスジェニックマウスのテストステロン処理は、対応する非トランスジェニック対照からの抽出物に対して、脳(3.4倍)、四頭筋(7.2倍)、精嚢(4.2倍)、および心臓(3.8倍)でのルシフェラーゼ活性の増大を促進した。
本発明のトランスジェニック動物はまた、アンドロゲンレセプター機能の欠陥と関連のある疾患、とりわけ癌の治療のための化合物または薬物療法の開発に有用である。「アンドロゲンレセプター機能の欠陥」とは、野生型のアンドロゲンレセプターに関して異常な発現、すなわちアップレギュレーションかまたはダウンレギュレーションされた仕方での異常な発現の結果としての機能を意味する。この有用性を示すため、3群のマウスをそれぞれテストステロン(2mg/kg、皮下)で処理、テストステロンおよびCasodexR(50mg/kg、経口)で処理、または未処理とした。図12に示すように、ビカルタミド(CasodexR)は、四頭筋、骨、前立腺−精嚢でのテストステロン誘発ルシフェラーゼ発現を許容しうる機能範囲で(四頭筋ではテストステロン作用の92%抑制(未処理に対して5.8倍の誘発)、骨ではテストステロン作用の86%抑制(未処理に対して3.3倍の誘発)、および前立腺−精嚢ではテストステロン作用の90%抑制(未処理に対して5.6倍の誘発))抑制した。腎臓では応答は観察されなかった。
以上、本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することで、より容易に理解できる。これら実施例は例示のために提供するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例1.ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン構築物
A.pGL3/2XDR−1ルシフェラーゼ
等価モル量の相補的オリゴヌクレオチドDR−1(F)(ARE)(配列番号7)およびDR−1(R)(ARE)(配列番号8)をアニールし、ついでXhoI消化したpGL3−プロモータープラスミド(Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン)中にライゲートした。オリゴヌクレオチドDR−1(F)(ARE)(配列番号7)は、配列:5’−TCGAGTCCTGAAGGAACGGAACAGACTGA−3’を有する。オリゴヌクレオチドDR−1(R)(ARE)は、配列:5’−TCGATCAGTCTGTTCCGTTCCTTCAGGAC−3’(配列番号8)を有する。等価モル量の相補的オリゴヌクレオチド1XDR−1(F)(配列番号9)および1XDR−1(R)(配列番号10)をアニールし、ついで両者をSacI/XhoI消化したpGL3/1XDR−1/ルシフェラーゼプラスミド中にライゲートすることにより、第二のDR−1応答配列をpGL3/1XDR−1/ルシフェラーゼに存在するDR−1配列の上流に挿入した。オリゴヌクレオチド1XDR−1(F)(配列番号9)は、配列:5’−CGTCCTGAAGGAACGGAACAGACTGA−3’を有する。オリゴヌクレオチド1XDR−1(R)(配列番号10)は、配列:5’−TCGATCAGTCTGTTCCGTTTTTCCTTCAGGACGAGCT−3’を有する。
実施例1.ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン構築物
A.pGL3/2XDR−1ルシフェラーゼ
等価モル量の相補的オリゴヌクレオチドDR−1(F)(ARE)(配列番号7)およびDR−1(R)(ARE)(配列番号8)をアニールし、ついでXhoI消化したpGL3−プロモータープラスミド(Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン)中にライゲートした。オリゴヌクレオチドDR−1(F)(ARE)(配列番号7)は、配列:5’−TCGAGTCCTGAAGGAACGGAACAGACTGA−3’を有する。オリゴヌクレオチドDR−1(R)(ARE)は、配列:5’−TCGATCAGTCTGTTCCGTTCCTTCAGGAC−3’(配列番号8)を有する。等価モル量の相補的オリゴヌクレオチド1XDR−1(F)(配列番号9)および1XDR−1(R)(配列番号10)をアニールし、ついで両者をSacI/XhoI消化したpGL3/1XDR−1/ルシフェラーゼプラスミド中にライゲートすることにより、第二のDR−1応答配列をpGL3/1XDR−1/ルシフェラーゼに存在するDR−1配列の上流に挿入した。オリゴヌクレオチド1XDR−1(F)(配列番号9)は、配列:5’−CGTCCTGAAGGAACGGAACAGACTGA−3’を有する。オリゴヌクレオチド1XDR−1(R)(配列番号10)は、配列:5’−TCGATCAGTCTGTTCCGTTTTTCCTTCAGGACGAGCT−3’を有する。
B.ARE−LUC/CMV−rAR
標準分子生物学技術、たとえば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2 (1991)を用いて発現構築物の作製を行った。ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン構築物(配列番号1)の全配列を図2A〜2Dに示す。
標準分子生物学技術、たとえば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2 (1991)を用いて発現構築物の作製を行った。ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン構築物(配列番号1)の全配列を図2A〜2Dに示す。
配列番号4のヌクレオチド配列を含みラットアンドロゲンレセプターの全アミノ酸配列をコードするNotI断片をpcDNA−rARから単離し、クレノーを用いて平滑末端とした。ついで、この断片をSmaI/AfeI制限処理したpCMV−TSIRにクローニングして中間体のpCMV−rARtempを作製した。プラスミドpTetIndをNotIおよびBglIIで制限処理し、クレノーで平滑末端とし、自己に対してライゲートした。ついで、得られたプラスミドをEcoRVおよびXbaIで消化し、pGL3−pro/2XDR−1の消化後に単離したEcoICRI/XbaI断片のサブクローニングのためのベクターとして用いた。この断片は、アンドロゲン応答性プロモーター(最小SV40プロモーター(配列番号3)の5’プライミング末端に2つのアンドロゲン応答配列を融合することによって作製した)、並びに完全長ルシフェラーゼタンパク質をコードする配列(配列番号2)からなっていた。得られたプラスミドをp2XDR−1−Luctemp−1と称した。5’末端にXhoI部位および3’末端にSalI部位でフランキングされた停止転写カセットを、pBS302を鋳型として用いたPCRにより作製した。XhoI/SalI制限処理したPCR断片をXhoI制限処理したp2XDR−1−LucTemp1中に、停止転写カセットの3’末端がアンドロゲン応答性プロモーターの5’末端のちょうど上流に挿入されるような方向でサブクローニングした。得られたプラスミドをp2XDR−1−Luctemp−2と称した。ついで、このプラスミドをXhoIおよびXbaIで消化し、停止転写カセット、アンドロゲン応答性プロモーター、およびルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を含む断片をXhoI/XbaI制限処理したpCMV−ARtemp中に挿入した。これによりARE−LUC/CMV−rARプラスミドが完成した。ARE−LUC/CMV−rARのPmeI/PacI消化により生成した8.6kb DNA断片を、ARLucトランスジェニック動物を作製すべくマウス胚にマイクロインジェクションするために単離した。
実施例2.トランスジェニックマウスの作製および飼育
上記構築物からのPmeI/PacI断片をC57Bl/6XDBA2F2(B6D2F2)胚の前核中にマイクロインジェクションすることにより、ARE−LUC/CMV−rAR構築物を有するトランスジェニックマウスを作製した。胚の作製は、Hoganらにより記載された技術(Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual、第2版、Brigid Hogan, Rosa Beddington, Frank Constantini,およびElizabeth Lacey編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994))を用い、ハイブリッドスタッド(stud)B6D2雄を同じバックグラウンドの処女雌(Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ)に集団内(in-house)交配することにより行った。注射した胚を偽妊娠のICR雌マウス(Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ)に移し、分娩まで進行させた。5〜8日齢のときに足指および尾の試料をトランスジーンのDNA分析のために採取した。トランスジーンを有するマウスを、CMVプロモーターとベクター中のDR−1配列、上流プライマー5’CTTGGCTTGCTTTGCTATTTA3’(配列番号11)および下流プライマー5’ATGTGGTATGGCTGATTATGA3’(配列番号12)との間を妨害するインシュレーター停止カセット配列を検出すべくデザインしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)戦略により同定した。ついで、トランスジーンを有することが示されたファウンダーマウス(F0)をICRバックグラウンドに非近交系交配し、その子孫(F1)をメンデルの法則でのトランスジーンの移動について再び試験した。マウスはすべて靴箱施設(shoebox housing)に収容し、12/12明暗サイクルで食物および水を自由に取らせ、AAALAC公認設備にて協会(institutional)ACUCのガイドラインのもとに人道的に扱われた。
上記構築物からのPmeI/PacI断片をC57Bl/6XDBA2F2(B6D2F2)胚の前核中にマイクロインジェクションすることにより、ARE−LUC/CMV−rAR構築物を有するトランスジェニックマウスを作製した。胚の作製は、Hoganらにより記載された技術(Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual、第2版、Brigid Hogan, Rosa Beddington, Frank Constantini,およびElizabeth Lacey編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994))を用い、ハイブリッドスタッド(stud)B6D2雄を同じバックグラウンドの処女雌(Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ)に集団内(in-house)交配することにより行った。注射した胚を偽妊娠のICR雌マウス(Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ)に移し、分娩まで進行させた。5〜8日齢のときに足指および尾の試料をトランスジーンのDNA分析のために採取した。トランスジーンを有するマウスを、CMVプロモーターとベクター中のDR−1配列、上流プライマー5’CTTGGCTTGCTTTGCTATTTA3’(配列番号11)および下流プライマー5’ATGTGGTATGGCTGATTATGA3’(配列番号12)との間を妨害するインシュレーター停止カセット配列を検出すべくデザインしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)戦略により同定した。ついで、トランスジーンを有することが示されたファウンダーマウス(F0)をICRバックグラウンドに非近交系交配し、その子孫(F1)をメンデルの法則でのトランスジーンの移動について再び試験した。マウスはすべて靴箱施設(shoebox housing)に収容し、12/12明暗サイクルで食物および水を自由に取らせ、AAALAC公認設備にて協会(institutional)ACUCのガイドラインのもとに人道的に扱われた。
実施例3.遺伝子発現分析
ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン発現の検出はノーザンブロット分析により行った。トランスジーンの発現を有していたトランスジェニック系統を同定するため、ファウンダーからのF1子孫を安楽死させ、その肺、心臓、肝臓、および精巣を回収した。試料を液体窒素中でフラッシュ凍結し、mRNA単離のときまで貯蔵した。全RNAを、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液、たとえばTrizolR LS Reagentシステム(GIBCOTM Invitrogen Corporation、カールスバード、カリフォルニア)を製造業者の記載に従って使用して単離した。これらのRNA単離物からmRNAを、Oligotex Direct mRNAキットを製造業者(Operon/QIAGEN、バレンシア、カリフォルニア)の推奨に従って用いて抽出した。mRNAを17.6%ホルムアルデヒドを用いた変性条件下、1.0%アガロースゲル電気泳動で分離し、ハイブリダイゼーションする前に毛管ブロッティングによりナイロンメンブレン(Hybond-N、Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン)に移した。ARE−LUC/CMV−rARメッセージの検出は、ルシフェラーゼmRNAを検出すべくデザインされた607bpの放射性標識プローブ(Ready-to-Go kit, New England Nuclear/Perkin ElmerTM Life Sciences、ボストン、マサチューセッツ)にRNAをハイブリダイズさせることにより行った。この607bpの断片は、鋳型としてのpGL3ベクターおよびオリゴヌクレオチドLUC(F):5’−GGTAACCCAGTAGATCCAGAG−3’(配列番号13)およびLUC(R):5’−GGAAGACGCCAAAAACATAAAG−3’(配列番号14)を用いたPCRにより作製した。ハイブリダイゼーションはRapid−hyb緩衝液(Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン)中で一夜行い、プローブの非特異的なアニーリングはストリンジェント条件下(0.1×SSC、2%SDS中、65℃で2×20分)で複数回洗浄することにより排除した。ルシフェラーゼメッセージへのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、phosphoimager(Model FLA-2000, Mfr. Fuji Film、スタンフォード、コネチカット)で検出した。
ARE−LUC/CMV−rARトランスジーン発現の検出はノーザンブロット分析により行った。トランスジーンの発現を有していたトランスジェニック系統を同定するため、ファウンダーからのF1子孫を安楽死させ、その肺、心臓、肝臓、および精巣を回収した。試料を液体窒素中でフラッシュ凍結し、mRNA単離のときまで貯蔵した。全RNAを、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液、たとえばTrizolR LS Reagentシステム(GIBCOTM Invitrogen Corporation、カールスバード、カリフォルニア)を製造業者の記載に従って使用して単離した。これらのRNA単離物からmRNAを、Oligotex Direct mRNAキットを製造業者(Operon/QIAGEN、バレンシア、カリフォルニア)の推奨に従って用いて抽出した。mRNAを17.6%ホルムアルデヒドを用いた変性条件下、1.0%アガロースゲル電気泳動で分離し、ハイブリダイゼーションする前に毛管ブロッティングによりナイロンメンブレン(Hybond-N、Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン)に移した。ARE−LUC/CMV−rARメッセージの検出は、ルシフェラーゼmRNAを検出すべくデザインされた607bpの放射性標識プローブ(Ready-to-Go kit, New England Nuclear/Perkin ElmerTM Life Sciences、ボストン、マサチューセッツ)にRNAをハイブリダイズさせることにより行った。この607bpの断片は、鋳型としてのpGL3ベクターおよびオリゴヌクレオチドLUC(F):5’−GGTAACCCAGTAGATCCAGAG−3’(配列番号13)およびLUC(R):5’−GGAAGACGCCAAAAACATAAAG−3’(配列番号14)を用いたPCRにより作製した。ハイブリダイゼーションはRapid−hyb緩衝液(Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン)中で一夜行い、プローブの非特異的なアニーリングはストリンジェント条件下(0.1×SSC、2%SDS中、65℃で2×20分)で複数回洗浄することにより排除した。ルシフェラーゼメッセージへのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、phosphoimager(Model FLA-2000, Mfr. Fuji Film、スタンフォード、コネチカット)で検出した。
実施例4.インビボでのルシフェラーゼ画像化
インビボ画像化によるルシフェラーゼ発現の検出に割り当てたマウスに、画像化の15分前にPBS中の150mg/kgのルシフェリンを注射する。ついで、マウスにアベルチン(PBS中の2.5%溶液を0.3ml)を注射することにより化学的拘束(chemical restraint)下に置く。麻酔したマウスを、冷却したCCD IVISTMカメラおよびステージを含む暗箱であるIVISTM Imaging System(Xenogen Corporation、アメラダ、カリフォルニア)中に置く。2分間の画像捕捉の後、画像をLiving ImageR Software(Xenogen、アラメダ、カリフォルニア)で処理する。組織の画像化のためには、二酸化炭素による安楽死の15分前にマウスにルシフェリンを注射し、組織を切り出し、同様に画像化する。
インビボ画像化によるルシフェラーゼ発現の検出に割り当てたマウスに、画像化の15分前にPBS中の150mg/kgのルシフェリンを注射する。ついで、マウスにアベルチン(PBS中の2.5%溶液を0.3ml)を注射することにより化学的拘束(chemical restraint)下に置く。麻酔したマウスを、冷却したCCD IVISTMカメラおよびステージを含む暗箱であるIVISTM Imaging System(Xenogen Corporation、アメラダ、カリフォルニア)中に置く。2分間の画像捕捉の後、画像をLiving ImageR Software(Xenogen、アラメダ、カリフォルニア)で処理する。組織の画像化のためには、二酸化炭素による安楽死の15分前にマウスにルシフェリンを注射し、組織を切り出し、同様に画像化する。
実施例5.全器官抽出物でのルシフェラーゼ活性の測定
心臓、肺、肝臓、筋肉、脳、骨、精嚢(前立腺を含む)、および精巣を回収し、アッセイのときまでフラッシュ凍結した。抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイキット(LUC1−1KT)(Sigma)を用いて評価した。液体窒素の存在下、乳鉢と乳棒により組織を細かい粉末に破砕し、ついで1mlの溶解緩衝液中に入れた。不溶性物質は14,000rpmで10分間遠心分離(エッペンドルフマイクロ遠心管)することにより除いた。最上層の脂質層を廃棄し、上澄み液を回収した。Bradfordアッセイ(M. Bradford, Anal. Biochem. 1976, 72: 248-254)を3つずつ行ってタンパク質濃度を決定した。ルシフェラーゼ基質を含む100μlのアッセイ緩衝液に3つずつ、組織当たり100μgの全タンパク質を加えた。化学ルミネセンスをコスターブラック96ウエルプレート中、Beckmanトップカウントによりカウント/秒にて測定した。
心臓、肺、肝臓、筋肉、脳、骨、精嚢(前立腺を含む)、および精巣を回収し、アッセイのときまでフラッシュ凍結した。抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイキット(LUC1−1KT)(Sigma)を用いて評価した。液体窒素の存在下、乳鉢と乳棒により組織を細かい粉末に破砕し、ついで1mlの溶解緩衝液中に入れた。不溶性物質は14,000rpmで10分間遠心分離(エッペンドルフマイクロ遠心管)することにより除いた。最上層の脂質層を廃棄し、上澄み液を回収した。Bradfordアッセイ(M. Bradford, Anal. Biochem. 1976, 72: 248-254)を3つずつ行ってタンパク質濃度を決定した。ルシフェラーゼ基質を含む100μlのアッセイ緩衝液に3つずつ、組織当たり100μgの全タンパク質を加えた。化学ルミネセンスをコスターブラック96ウエルプレート中、Beckmanトップカウントによりカウント/秒にて測定した。
Claims (14)
- そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 該レポーターがルシフェラーゼである、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 該アンドロゲン応答配列が2XDR−1である、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項1に記載のトランスジェニックマウスから単離した細胞であって、そのゲノムが該核酸構築物を含むことを特徴とする、細胞。
- 該レポーターがルシフェラーゼである、請求項4に記載の細胞。
- 該アンドロゲン応答配列が2XDR−1である、請求項4に記載の細胞。
- 請求項4に記載の細胞を含むマウス細胞系統。
- アンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含む単離した核酸構築物であって、アンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする核酸構築物。
- 該レポーターがルシフェラーゼである、請求項8に記載の構築物。
- 該アンドロゲン応答配列が2XDR−1である、請求項8に記載の構築物。
- そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されている標的マウスを得る方法であって、その際、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができ、下記工程:
(a)第一の雌マウスからの受精卵をゾル化し、
(b)該核酸構築物を含むトランスジーンを受精卵に移し、
(c)工程(b)の受精卵を偽妊娠した第二の雌マウスの子宮に移し、ついで
(d)該第二の雌マウスを、
(i)該第二の雌マウスが、工程(c)の該受精卵からの胚で妊娠し、
(ii)該胚が該標的マウスに発育し、および
(iii)該標的マウスが該第二の雌マウスから生存して生まれる
ように保持する
ことを含み、その際、該標的マウスのゲノムは該核酸構築物を含み、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができる、ことを特徴とする方法。 - レポーター核酸を発現するトランスジェニックマウス細胞系統の製造方法であって、
(a)請求項1に記載のトランスジェニックマウスから細胞を単離し、ついで
(b)該トランスジェニックマウス細胞系統が該レポーター核酸を発現するように、単離した細胞を単離した細胞の増殖および生存を保持する条件下に置く
ことを含む方法。 - アンドロゲンレセプターのモデュレーターをスクリーニングする方法であって、被験物質を請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、ついでアンドロゲンレセプターの活性に対する該被験物質の作用をアッセイすることを含む方法。
- そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列(ARE)を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物は該アンドロゲンレセプター核酸が発現されたときだけ該レポーター核酸を器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
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