CN101098888A

CN101098888A - Tnf拮抗剂

Info

Publication number: CN101098888A
Application number: CNA2005800464293A
Authority: CN
Inventors: T·L·霍尔泰特; M·H·安德森; H·K·奥托; M·蒙奇; J·D·尼兰德
Original assignee: Roche Bio Denmark AS
Current assignee: Yimunuoniuke Denmark Corp; Anaphore Inc
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2005-11-21
Publication date: 2008-01-02

Abstract

具有改良结合特性和改良效力的基于人四连蛋白C型凝集素样结构域(CTLD)的TNF结合多肽。该多肽包含具有氨基酸序列KRWSRYF(SEQ ID NO：1)的TNF结合结构域。也提供的是制备本发明的多肽的方法。该多肽可用于制备药物组合物，并且可用于治疗具有由TNF介导的病理学的受试者，例如用于治疗类风湿性关节炎。

Description

TNF拮抗剂

发明领域

本发明总的来说涉及可以结合TNF并作为其拮抗剂的多肽和化合物。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF)是由多种细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的同型三聚体细胞因子，其最初是基于它们诱导某种小鼠肿瘤坏死的能力而得以鉴定。TNF是免疫和炎症应答的主要介质之一，并且据知它例如在类风湿性关节炎的发病机理中具有重要作用，所述的类风湿性关节炎是一种普遍的自身免疫炎性疾病，其影响大约0.5-1％的人群。而且，TNF也涉及各种各样疾病的发病机理，包括内毒素休克、脑型疟和移植物抗宿主反应。可溶并且有生物活性形式的TNF由三个相同的17kD蛋白质亚基(同型三聚体)组成，而膜结合形式由三个相同的26kD亚基组成。

重组或修饰蛋白是新兴的一类治疗剂。迄今，已经公开了作为TNF拮抗剂的数种重组或修饰蛋白。特别是，已经寻求能结合并中和TNF的抗体作为抑制TNF活性的手段。英夫利昔单抗(Remicade)和Eternarcept(Enbrel)是两种TNF拮抗剂的实例，它们都已经在美国和欧洲获得了上市核准用于治疗类风湿性关节炎。这两种产品也已经显示能有效地治疗银屑病和节段性回肠炎。英夫利昔单抗是具有鼠可变区和人IgG1和κ恒定区的嵌合抗体，其通过结合可溶和跨膜形式的TNF而中和TNF的生物学活性并抑制TNF与其配体的结合。英夫利昔单抗的结构与天然存在的抗体的结构相似。Eternacept是一种融合蛋白，其由p75 TNF受体的细胞外结构域和人IgG1的铰链和Fc结构域制成。

WO 2004/0398公开了能结合TNF的4种基于人四连蛋白C型凝集素样结构域(CTLD)的特异性结合多肽。该蛋白在环1区的氨基酸序列KVRSRYF(SEQ ID NO：79中的四连蛋白氨基酸116-122)和环3/4区的PRHT、PTNN、PTNR或PNNR(SEQ ID NO：79中的四连蛋白氨基酸146-149)与野生型CTLD不同(参见WO 2004/0398，表4，46页)。

本发明已经鉴定并分离了基于人四连蛋白C型凝集素样结构域的特异性TNF结合蛋白，所述的蛋白具有改良的结合特性和改良的效力。该鉴定的TNF结合蛋白在它们体内抑制和中和TNF的能力方面优于上面的现有技术基于CTLD的TNF结合蛋白。这已经例如通过它们在鼠成纤维细胞系测定法中抑制TNFα介导的细胞毒性的能力得到证明，这根据后面的实施例将是显然的。而且，也已经证明该分离的特异性TNF结合蛋白与可商业获得的TNF拮抗剂英夫利昔单抗(Remicade)和Eternarcept(Enbrel)相比具有较好的TNF拮抗剂特性。

发明概述

因此，本发明在第一方面涉及能结合肿瘤坏死因子(TNF)的多肽，其中所述的多肽含有TNF结合结构域，该结构域包含氨基酸序列KRWSRYF(SEQ ID NO：1)。

在进一步的方面，本发明提供了含有编码上面确定的多肽的序列的核酸，以及提供了制备本发明的特异性多肽的方法，所述的方法包括在所述特异性多肽得以表达的条件下表达所述的核酸并回收所述特异性多肽。

根据本发明的多肽可以用于制备药物组合物，并且可用于治疗患有TNF介导的病理学的受试者的方法，例如治疗类风湿性关节炎的方法，所述的方法包括施用有效量的本发明特异性结合剂给受试者。

本发明的这些及其它方面在下面更详细地描述。

发明详述

本发明涉及以高亲和力、低解离速率与TNF结合并具有高的肿瘤坏死因子(TNF)中和能力的多肽。

如上面提到的，本发明的多肽源于四连蛋白C型凝集素样结构域(CTLD)的支架结构(scaffold structure)。C型凝集素样结构域(CTLD)是已经在大量分离自许多动物种的蛋白质中鉴定的一个蛋白质结构域家族。最初，CTLD结构域被鉴定为通常所说的C型凝集素(钙依赖糖类结合蛋白)共有的结构域并称为“糖识别结构域”(“CRD”)。更近一些，已经变清楚，该结构域是许多真核蛋白质如四连蛋白所共有的，这些真核蛋白中数种不结合糖部分，因而这种典型的结构域被称为CTLD。CTLD由约120个氨基酸残基组成并且，特征性地含有两个或三个链内的二硫桥。

先前在WO/0248189中已经公开了CTLD结构域适合用于生成配体-结合蛋白亚基的随机化文库。该文库通过组合其中CTLD的环-区部分或完全用一个或多个随机化多肽片段替换的四连蛋白CTLD框架结构(framework structure)而构建。

本发明的多肽通过使用这种随机化文库系统构建，其中四连蛋白的CTLD结构域用于构建新的TNF结合多肽。根据本发明的TNF结合多肽通过在体外演化步骤中的一系列仔细操作已经达到了它们高的亲和力和体内抑制并中和TNF的能力。总的来说，本发明包括选取一种高特异性而低亲和力的多肽，通过连续的亲和性和结合动力学成熟步骤。根据本发明的多肽是来自多次选择和成熟步骤的“后代”。

应该理解，本发明涉及能结合并优选中和TNF的多肽，其中所述的多肽包含如SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列。该氨基酸序列已经在四连蛋白CTLD框架结构(SEQ ID NO：79中的氨基酸116-122)中的所谓的环1中产生。该序列提供了特别有利的性质，包括高的TNF中和活性。该氨基酸序列在下面表1中列出：

表1

SEQ ID NO	氨基酸序列
SEQ ID NO	氨基酸序列	1	KRWSRYF

本发明的TNF结合多肽能结合TNF多个部分。根据本发明，术语“能结合肿瘤坏死因子(TNF)”指结合TNF的特异性多肽。在有用的实施方案中，本发明的TNF结合多肽具有对TNF的结合亲和力(Kd)优选是1×10^-8M或更小，该结合亲和力通过表面等离子共振测定。在另外有用的实施方案中，Kd值是少于1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M、1×10^-13M、1×10^-14M，或甚至少于1×10^-15M。在进一步有用的实施方案中，根据本发明的TNF结合多肽的K-解离速率是小于1×10^-3S^-1，例如小于1×10^-4S^-1，包括小于1×10^-5S^-1以及甚至少于1×10^-6S^-1，这通过表面等离子共振测定。术语“K-解离”，如此处使用的，旨在指根据本发明的TNF结合多肽从TNF结合多肽/TNF复合物解离的解离速率常数。术语“表面等离子共振”，如此处使用的，指通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变而使得能分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如通过使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden)。

优选地，本发明的TNF结合多肽能够以这样的方式结合TNF，以该方式它们部分或完全阻断、抑制或中和TNF的生物学活性和/或其它TNF-相关活性。如此处使用的，表述“中和”表示抑制或减少体内或体外测量的TNF的生物活性。根据本发明多肽的TNF中和或拮抗活性可以通过体外测定法如下面实施例中描述的鼠成纤维细胞L929细胞系测定法或HUVEC测定法证明的。备选地，通过体内动物实验测量TNF拮抗剂活性是可能合适的，所述的体内动物实验是如下面实施例描述的通过例如应用Tg197转基因小鼠细胞系进行。

在本文中，术语“肿瘤坏死因子” (在此简写为TNF)旨在指人细胞因子，该因子的可溶和生物活性形式由三个相同的17kD非共价结合的蛋白质亚基组成，而膜结合形式由三个相同的26kD蛋白质亚基组成。特别是本术语旨在指ExPASy：the proteomics server forin-depth protein knowledge and analysis Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003)(通过网址 http://www.expasy.org登陆)中登录名称“TNFA_HUMAN”和主要登陆号P01375下描述的蛋白质。TNF的结构进一步在例如Pennica D.等，(1984)Nature 312：724-729中描述。通常用于TNF的同义词包括TNF-alpha、肿瘤坏死因子配体超家族成员2、TNF-α和恶液质素。

如上面提到的，本发明的多肽包含基本如KRWSRYF(SEQ ID NO：1)列出的氨基酸序列。“基本如......列出的”指本发明的多肽将包含与本发明的氨基酸序列KRWSRYF相同或者高度同源的氨基酸序列。“高度同源”指的是序列KRWSRYF的7个氨基酸中1、2、3或甚至是4个可以由其它氨基酸取代。因而，根据本发明，本发明的多肽可以包含与氨基酸序列KRWSRYF(SEQ ID NO：1)有至少43％、57％、71％、86％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。优选地，氨基酸的取代是保守性取代，该保守性取代导致具有与具有初始氨基酸序列的多肽类似的功能和化学特性的多肽。基于相同的侧链性质，天然出现的氨基酸残基可以分成(重叠的)几类：

(1)疏水性氨酸基酸：丙氨酸(Ala；A)、缬氨酸(Val；V)、亮氨酸(Leu；L)、异亮氨酸(Ile；I)、脯氨酸(Pro；P)、色氨酸(Trp；W)、苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)和甲硫氨酸(Met，M)；

(2)亲水性氨基酸：丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、天冬氨酸(Asn；N)、谷氨酰胺(Glu；Q)、谷氨酸(Glu；E)、天冬氨酸(Asp；D)、赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)；

(3)芳香族氨基酸：色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、苯丙氨酸(Phe；F)；

(4)酸性氨基酸：天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)；

(5)碱性氨基酸：赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)；

(6)带电氨基酸：天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)、赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)；

(7)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly；G))、脯氨酸(Pro；P)。

保守性氨基酸取代涉及将一种上述氨基酸类型的一个成员替换相同类型的另一成员。保守性改变可以包含非常规氨基酸残基，所述的非常规氨基酸残基通常通过化学肽合成来整合而不是通过在生物系统中合成。

正如从以下实施例将会明白的，本发明人发现，本发明的多肽，除上面的序列KRWSRYF外，进一步包含通常的氨基酸序列基序PX₁PX₂N(SEQ ID NO：2)，其中X₁和X₂是各自独立的氨基酸残基，其具有特别有利的特性，包括高的TNF中和活性。

在一个进一步的实施方案中，根据本发明的多肽包含另外的共有氨基酸序列基序X₁PX₂PX₃NX₄(SEQ ID NO：3)，其中X₁是选自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的亲水性氨基酸；X₂和X₃是各自独立的氨基酸残基，并且X₄是选自M、A、V、L、P、W、F、Y和C的疏水性氨基酸。在一个进一步有用的实施方案中，根据本发明的多肽进一步包含氨基酸序列X₁PX₂PX₃NX₄(SEQ ID NO：3)，其中X₁是选自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的亲水性氨基酸；X₂和X₃是各自独立的氨基酸残基，并且X₄是选自W、F和Y的芳香族氨基酸。

在当前优选的实施方案中，根据本发明的多肽含有选自如下表2中SEQ ID NO 2-28列出的氨基酸序列：

表2

SEQ ID NO	氨基酸序列
SEQ ID NO	氨基酸序列	2	PXPXN
3	XPXPXNX	2	PXPXN
3	XPXPXNX	4	ELPQHAQPDPSNW
5	EHSSDAQPDPSNW	4	ELPQHAQPDPSNW
5	EHSSDAQPDPSNW	6	RETTDAQPDPSNW

7	GRKEDAQPDPSNW
7	GRKEDAQPDPSNW	8	KLPQHANPSPSNW
9	LLPQHANPNPSNW	8	KLPQHANPSPSNW
9	LLPQHANPNPSNW	10	KLPQHAHPEPSNW
11	ALPQHASPSPSNW	10	KLPQHAHPEPSNW
11	ALPQHASPSPSNW	12	MLEKDAQPDPSNW
13	GRKEDAQPDPSNW	12	MLEKDAQPDPSNW
13	GRKEDAQPDPSNW	14	ARTQDAQPDPSNW
15	ERNRDAQPDPSNW	14	ARTQDAQPDPSNW
15	ERNRDAQPDPSNW	16	VRQRDAQPDPSNW
17	ERPEDAQPDPSNW	16	VRQRDAQPDPSNW
17	ERPEDAQPDPSNW	18	SRQEDAQPDPSNW
19	ERLRDSQPDPSNW	18	SRQEDAQPDPSNW
19	ERLRDSQPDPSNW	20	ASMKDAQPDPSNW
21	QLPQHADPAPSNW	20	ASMKDAQPDPSNW
21	QLPQHADPAPSNW	22	LLPQHEQPEPSNW
23	ELASDAQPDPANW	22	LLPQHEQPEPSNW
23	ELASDAQPDPANW	24	ELIRDAQPDPANW
25	ELLSDAQPDPVNW	24	ELIRDAQPDPANW
25	ELLSDAQPDPVNW	26	ERRQDAQPDPSNW
27	ERLADAQPDPFNW	26	ERRQDAQPDPSNW
27	ERLADAQPDPFNW	28	EGIEWAQPDPTNF

从表2清楚地看出，序列基序PXPXN可以在所有已鉴定的序列(SEQID NO：4-28)找到。因而，可以考虑，如先前描述地，也可以将氨基酸取代(例如保守性取代)应用于上表2中显示的氨基酸序列。因而，可以考虑将序列SEQ ID NO：4-28的13个氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个用另外的氨基酸取代。因而，根据本发明，根据本发明的多肽可以进一步包含与任意氨基酸序列SEQ ID NO：4-28具有至少约23％、31％、38％、46％、54％、62％、69％、77％、85％或92％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。优选地，氨基酸的取代是保守性取代，该保守性取代导致具有与具有初始氨基酸序列的多肽类似的功能和化学特性的多肽。

本发明技术人员将认识到，可以将根据本发明的多种鉴定的氨基酸序列插入进特异性结合剂结构。因而，根据本发明的给定氨基酸序列可以形成部分的任何合适的蛋白质框架结构或由它携带，前提是得到的多肽保持其如上定义的结合TNF并优选中和TNF的生物活性的能力。然而，在优选的实施方案中，用于携带产生的本发明氨基酸序列的结构将一般是C型凝集素样结构域(CTLD)或其实质部分，其中产生的氨基酸序列SEQ ID NO：1位于对应CTLD的环1区(例如人四连蛋白氨基酸的环1区(SEQ ID NO：79中的氨基酸116-122))的位置。类似地，C型凝集素样结构域(CTLD)或其实质部分可以进一步包含选自SEQ ID NO 2-28的产生的氨基酸序列，其优选位于对应CTLD的环3/4区(例如人四连蛋白氨基酸的环1区(SEQ ID NO：79中的氨基酸116-122))的位置。

在当前优选的实施方案中，本发明的氨基酸连接至源于四连蛋白(如人四连蛋白)的CTLD框架结构并因而由其携带。优选地，源于人四连蛋白的CTLD结构域是基本如SEQ ID NO：79中残基50-181列出的氨基酸序列。

正如根据下面的实施例将变得明显的，本发明人另外发现根据本发明的多肽，其中源于四连蛋白的C型凝集素样结构域是基本如SEQID NO：79中残基50-181列出的氨基酸序列，并且其中165号天冬氨酸残基突变为甘氨酸，具有特别好的TNF中和性质。

在一个实施方案中，根据本发明的多肽是基于源于四连蛋白的CTLD框架的单体TNF结合多肽，其包括如以下的多肽：TN3-2-B1-C22(SEQ ID NO：29)、TN3-2-B1-C31(SEQ ID NO：30)、TN3-2-B1-C24(SEQID NO：31)、TN3-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：32)、TN3-2-B1-c22-1(SEQID NO：33)、TN3-2-B1-c22-2(SEQ ID NO：34)、TN3-2-B1-c22-3(SEQID NO：35)、TN3-2-B1-c22-4(SEQ ID NO：36)、TN3-2-B1-c22-6(SEQID NO：37)、TN3-2-B1-c22-7(SEQ ID NO：38)、TN3-2-B1-c22-8(SEQ IDNO：39)、TN3-2-B1-c22-9(SEQ ID NO：40)、TN3-2-B1-c22-10(SEQ IDNO：41)、TN3-2-B1-c22-11(SEQ ID NO：42)、TN3-2-B1-c22-12(SEQ IDNO：43)、TN3-2-B1-c22-13(SEQ ID NO：44)、TN3-2-B1-c22-14(SEQID NO：45)、TN3-2-B1-c22-15(SEQ ID NO：46)、TN3-2-B1-c22-16(SEQID NO：47)、TN3-2-B1-c7(SEQ ID NO：48)、TN3-2-B1-C19(SEQ IDNO：49)、TN3-2-B1-C1(SEQ ID NO：50)、TN3-2-B1-C20(SEQ ID NO：51)、TN3-2-B1-C53(SEQ ID NO：52)和TN3-2-B1-C29(SEQ ID NO：53)。

为了提供提高的效力或中和能力、减少的毒性、减少的免疫原性、延长的血浆半衰期和/或防止蛋白水解降解，在有用的实施方案中本发明的多肽可通过N末端或C-末端或一个氨基酸残基的侧链连接至载体。示例性的载体包括Fc结构域、线性聚合物如聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、葡聚糖；支链聚合物；脂质；胆固醇类(如类固醇)；糖或寡糖；或任意天然的或合成的蛋白质、多肽或肽，包括人血清白蛋白。连接至载体的根据本发明的多肽的一个实例是称为GG-I10-TN-2-B1-C22-7的聚乙二醇化TNF结合多肽，其可以在实施例5中找到。

在一特别优选的实施方案中，本发明的TNF结合多肽由多聚化结构域携带或连接至其上。在本文中，术语“多聚化结构域”是能与其它的、类似的或相同的多聚化结构域相互作用的肽、蛋白质或蛋白质的部分。所述的相互作用是产生多聚化蛋白质或多肽的相互作用类型。这种相互作用可以由该多聚化结构域的组分之间的共价键以及通过氢键力、疏水力、范德华力和盐桥引起。在有用的实施方案中，所述的多聚化结构域是二聚化结构域、三聚化结构域、四聚化结构域、五聚化结构域或六聚化结构域。三聚化结构域的一个实施例在WO95/31540中公开，其描述了含有胶原凝素颈区(neck region)的多肽。构成该胶原凝素颈区的氨基酸序列可以连接至任何选择的多肽。三聚体则可以在合适的条件下用含有胶原凝素颈区氨基酸序列的三个多肽制成。

在当前一个优选的实施方案中，C型凝集素样结构域由源于四连蛋白的三聚化结构域携带或连接至其上，并且更特别含有该四连蛋白三聚化结构元件(后面称为TTSE)，其先前已经在WO 98/56906中详细描述了。TTSE的氨基酸序列在SEQ ID NO：80中显示；TTSE的三聚化效果由卷曲的卷曲结构(coil structure)引起，该卷曲结构与两个另外的TTSE的卷曲的卷曲结构相互作用形成三体α螺旋卷曲的卷曲三聚体，该三聚体格外稳定，甚至是在相当高的温度下。术语TTSE也旨在包含蛋白的四连蛋白家族天然存在成员的TTSE变体、已经在氨基酸序列中修饰而没有在任何实质程度上对TTSE形成α螺旋卷曲的卷曲三聚体有不利影响的变体。因而，根据本发明的多肽可以包含TTSE作为三聚化结构域，其包含与SEQ ID NO：80的序列具有至少68％的氨基酸序列同一性，例如至少75％(包括至少87％，如至少92％)的序列。据此，TTSE(SEQ ID NO：50)的半胱氨酸50可以有利地诱变为丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或诱变为任何其它合适的氨基酸残基以便避免形成不希望的链间二硫桥，该二硫桥的形成可以导致不希望的多聚化。

在一个进一步的实施方案中，TTSE三聚化结构域(SEQ ID NO：50)可以通过下面进行修饰：(i)整合进聚组氨酸序列和/或凝血因子Xa切割位点，(ii)用Ser取代Cys50，以及(iii)包括C-末端KGS序列。这种修饰的TTSE的实例在SEQ ID NO：81中给出，并且称为TripA。

根据本发明的数种不同三聚体多肽的实例在下面实例中提供，在所述的三聚体多肽中应用了上面的TTSE三聚化结构域。这些包括基于三聚体CTLD的TNF结合多肽：TN2-2-B1-C22(SEQ ID NO：54)、TN2-2-B1-C31(SEQ ID NO：55)、TN2-2-B1-C24(SEQ ID NO：56)、TN2-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：57)、TN2-2-B1-c22-1(SEQ ID NO：58)、TN2-2-B1-c22-2(SEQ ID NO：59)、TN2-2-B1-c22-3(SEQ ID NO：60)、TN2-2-B1-c22-4(SEQ ID NO：61)、TN2-2-B1-c22-6(SEQ ID NO：62)、TN2-2-B1-c22-7(SEQ ID NO：63)、TN2-2-B1-c22-8(SEQ ID NO：64)、TN2-2-B1-c22-9(SEQ ID NO：65)、TN2-2-B1-c22-10(SEQ ID NO：66)、TN2-2-B1-c22-11(SEQ ID NO：67)、TN2-2-B1-c22-12(SEQ ID NO：68)、TN2-2-B1-c22-13(SEQ ID NO：69)、TN2-2-B1-c22-14(SEQ ID NO：70)、TN2-2-B1-c22-15(SEQ ID NO：71)、TN2-2-B1-c22-16(SEQ ID NO：72)、TN2-2-B1-c7(SEQ ID NO：73)、TN2-2-B1-C19(SEQ ID NO：74)、TN2-2-B1-C1(SEQ ID NO：75)、TN2-2-B1-C20(SEQ ID NO：76)、TN2-2-B1-C53(SEQ ID NO：77)、TN2-2-B1-C29(SEQ ID NO：78)和GG-I10-TN-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：79)。

根据本发明，根据本发明的TNF结合多肽可以连接至该三聚化结构域的N-或C-末端氨基酸残基上。然而，也设想在某些实施方案中，有利地是将本发明的TNF结合多肽连接至单体的三聚化结构域的N-末端和C-末端两者，并因而提供了含有六个能结合并中和TNF的特异性多肽的三聚体多肽。

应该理解，可任选将一柔性分子连接体插入本发明的TNF结合多肽和三聚化结构域之间并共价连接。在某些实施方案中，该连接体是约1-20个氨基酸残基的多肽序列。该连接体可以少于10个氨基酸，更优选5、4、3、2或1个氨基酸。在某些案例中可能9、8、7或6个氨基酸是合适的。在有用的实施方案中，该连接体基本是非免疫原性的，不易于蛋白水解裂解并且不包含已知能与其它残基(如半胱氨酸残基)相互作用的氨基酸残基。

本发明进一步提供了编码本发明的多肽的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。在一个优选的方面，本发明提供了编码本发明的多肽的核酸，所述的多肽包括包含如氨基酸序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NOs 2-28、SEQ ID NOs 29-53列出的氨基酸序列的多肽，并且更优选包括整个三聚体多肽SEQ ID NOs 54-78。

本发明也提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，所述构建体含有如上描述的至少一种核酸。可以选择或构建合适的载体，使其包含合适的调控序列(包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷化序列、增强子序列)、标记序列和根据需要的其它序列。根据需要，载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。对于进一步的细节，参见例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrook et al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

本发明也提供包含如上的一种或多种构建体的重组宿主细胞。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒体系。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞以及许多其它细胞系。一种通常的优选的细菌宿主是大肠杆菌。

本发明的多肽的表达可以方便地通过在合适条件下培养含有例如如下面实施例2中详细描述的核酸的重组宿主细胞完成。优选地，表达在期望的蛋白质可以容易地从其中分离并在体外重折叠的表达系统中进行。作为一个一般性的问题，原核表达系统是优选的，包括基于大肠杆菌的系统，因为可以获得高产量的蛋白质并且可以利用有效的纯化和重折叠策略。因而，不需要过度的试验而选择合适的或合意的表达系统是完全在技术人员的能力和判断力之内。类似地，一旦选择了本发明多肽的一级氨基酸序列，考虑这些因素如所选择的宿主中的密码子偏爱、在宿主中分泌信号序列的需要、信号序列内蛋白酶切割位点的引入等，本领域一般技术人员可以容易地设计合适的多核苷酸例如编码期望蛋白质的重组DNA构建体。可以将这些重组DNA构建体按读码框插入进许多合适选择的宿主的表达载体的任意一种中。合适的或合意的表达载体的选择同样是完全在熟练从业人员的能力和辨别力范围内的事情。优选地，表达载体将包括强启动子来驱动所述重组构建体的表达。最后，本发明的多肽可以用本领域熟知的合适标准方法来分离，并任选让其接受进行进一步的处理如冷冻干燥。本发明的多肽也可以通过选择本领域已知的合适的材料和反应条件通过化学合成产生。

本发明的多肽将通常以药物组合物的形式施用，所述的药物组合物除了所述多肽外可以包含至少一种组分，并任选其它治疗成分。因而，根据本发明的药物组合物，并且对于根据本发明的用途，除活性成分外可以包含可药用赋型剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员熟知的材料。所述的材料在与其它成分兼容的意义上是可接受的并且对其接受者是无毒的。一般来说，用于制备药物组合物的方法包括将活性成分与另外的组分联合的步骤。

用于经口施用的药物组合物可以是以片剂、胶囊剂、粉剂或液体的形式施用。片剂可以包含固体载体如明胶或辅料。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内注射或在病患位点注射，活性成分将是肠胃外可接受的含水溶液的形式，所述的含水溶液是无热源的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够用例如等渗载体(如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液)制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

药物组合物可以单独或与其它治疗结合施用，根据要治疗的疾病所述的施用是同时或顺序进行。其它治疗可以包括施用合适剂量的疼痛缓解药物如非甾体抗炎药物(如阿斯匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片制剂如吗啡或止吐剂。

本发明的治疗应用包括通过施用给受试者治疗有效量的本发明多肽或药物组合物治疗患有TNF介导的病理学的受试者。

如上提到的，TNF是免疫和炎症应答的一种主要介质，并且例如已知其在由TNF介导的广泛疾病的发病机理中起重要作用。如此处使用的，“TNF-介导的疾病”或“TNF介导的病理学”指TNF相关的病理学或疾病。TNF相关的病理学或疾病包括但不限于以下：

(A)急性和慢性免疫和自身免疫病理学，例如但不限于类风湿性关节炎(RA)、青少年慢性关节炎(JCA)、甲状腺炎、移植物抗宿主病(GVHD)、硬皮症、糖尿病、格雷夫斯病、变态反应，与同种异体移植相关的急性或慢性免疫疾病，例如但不限于肾脏移植、心脏移植、骨髓移植、肝脏移植、胰腺移植、小肠移植、肺移植和皮肤移植；

(B)感染，包括但不限于，脓毒病综合征、恶病质、急性或慢性细菌感染引起的循环性虚脱和休克、急性和慢性寄生性和/或传染性疾病、细菌、病毒或真菌，如人免疫缺陷症病毒(HIV)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)(包括恶病质、自身免疫障碍、艾滋病痴呆复合征和感染的症状)；

(C)炎性疾病，例如慢性炎性病理学，例如但不限于，结节病、慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎；血管炎性病理学，例如但不限于，弥散性血管内凝血、动脉粥样硬化、川畸病理学和血管炎综合征，例如但不限于，结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、亨诺-许兰紫癜、巨细胞动脉炎和肾脏微管炎；慢性活动性肝炎；斯耶格伦综合征；脊椎关节病，例如强直性脊柱炎、银屑病关节炎和脊椎炎、肠病性关节炎和脊椎炎、反应性关节炎和与炎性肠病相关的关节炎；以及色素膜炎；

(D)神经变性疾病，包括但不限于脱髓鞘性病，例如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；重症肌无力；锥体外束病和小脑障碍，例如皮质脊髓系统的损伤；基底神经节的障碍或小脑障碍；运动亢进障碍，例如亨廷顿舞蹈病和老年性舞蹈病；药物诱导的运动障碍例如由阻断中枢神经系统(CNS)多巴胺受体的药物诱导的运动障碍；运动不足障碍，例如帕金森病；进行性核上性麻痹；小脑和脊髓小脑障碍，例如小脑的结构性损伤；脊髓小脑变性病(脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调、小脑皮质变性、多系统变性病(Mencel、代-托二氏、Shi-Drager和MachadoJoseph))和系统性障碍(雷弗素姆病、血β脂蛋白缺乏症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统障碍)；运动单位障碍，例如神经源性肌萎缩(前角细胞变性，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿耳茨海默病；中年的唐氏综合征；弥漫性Lewy体疾病；Lewy体类型的老年性痴呆；韦-科二氏综合征；慢性酒精中毒；原发性胆汁性肝硬变；隐原性纤维化肺泡炎和其它纤维化肺疾病；溶血性贫血；克雅氏病；亚急性硬化性全脑炎、哈-斯二氏病；和拳击员痴呆或它们的任意亚型；

(E)涉及TNF-分泌肿瘤的恶性病理学或其它涉及TNF的恶性肿瘤，例如但不限于，白血病(急性、慢性髓细胞性、慢性淋巴细胞性和/或骨髓增生异常综合征)；淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤，例如恶性淋巴瘤(伯基特淋巴瘤或蕈样霉菌病))；

(F)涉及过量TNF的恶病质综合征和其它病理学和疾病，例如但不限于癌恶病质、寄生虫病和心脏衰竭；以及

(G)乙醇诱导的肝炎和其它形式的慢性肝炎。

本发明的多肽可以通过任何合适的途径，通常是注射进血流中或直接注射进TNF介导的疾病的位点中而直接施用给有此需要的受试者或患者。

例如对于诊断目的、测定方法和诊断试剂盒，本发明的多肽也可以用可检测或功能性标记物标记。可检测标记物包括放射性标记物(如¹²⁵I、¹³¹I和⁹⁹Tc)和荧光探针(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红、氨基甲基香豆素和藻红蛋白)，它们可以用蛋白质标记领域已知的常规化学连接至本发明的多肽上。标记也可以包括酶标记如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分如生物素，其可以通过结合至特异性相关的可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)而得以检测。功能性标记物包括设计来靶向TNF影响区域的位点的物质。这些功能性标记物包括毒素(如蓖麻毒素)和酶(如细菌羧肽酶或硝基还原酶)，其能够在TNF影响的区域的位点处将前药转化为活性药物。

因而，本发明也提供用于检测样品中的TNF的测定方法，所述的方法包括(i)将样品与根据本发明的多肽接触，并(ii)检测所述多肽与TNF的结合。

本发明现在将在以下非限制性实例和图中通过举例说明的方式描述。

附图描述

图1显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的细胞测定法使用作为完全的三聚体形式(TN2B1C22)和作为单体(TN3-2-B1-c22)的TNF拮抗剂TN2-2-B1-C22，并与Enbrel、Remicade和TNF受体II片段(RII)相比较。

图2显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的细胞测定法使用作为单体(TN3-B1-C22-7)的TNF拮抗剂TN2-2-B1-C22-7，并与Enbrel、Remicade和TNF受体II片段(RII)相比较。

图3显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的细胞测定法使用作为完整三聚体形式(TN2B1C31)的TNF拮抗剂TN2-2-B1-C31，并与Enbrel、Remicade和TNF受体II片段(RII)相比较。

图4显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的细胞测定法使用作为完整三聚体形式(TN2B1C24)的TNF拮抗剂TN2-2-B1-C24，并与Enbrel、Remicade和TNF受体II片段(RII)相比较。

图5显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的测定法使用TNF拮抗剂TN2-2-B1-C22-8、TN2-2-B1-C22-14、TN2-2-B1-C22-2、TN2-2-B1-C22-7、TN2-2-B1-C22-12、TN2-2-B1-C22-19，并与Enbrel、Remicade和TNF受体II片段(RII)比较。

图6显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的测定法使用TNF拮抗剂TN2-2-B1-C22-8、TN2-2-B1-C22-7和TN2-2-B1-C31，并与Enbrel和Remicade相比较。

图7显示了HUVEC测定法中TNF诱导的IL6和IL8生产的抑制，所述的测定法使用TN3-2-B1-C31、TN3-2-B1-C22-7、TN3-2-B1-C22-8，并与Enbrel和Remicade相比较。

图8显示了L929细胞测定法中TNF的抑制，所述的测定法使用了聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(20kPEG-GG-I10-TN-2-B1-C22-7)、非聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(GG C22-7)和未突变的TN-2-B1-C22-7(C22-7)(SEQ ID NO：32)。Enbrel和Remicade用作对照。

图9显示了在小鼠中TNF诱导的IL-6产生的阻断，所述的小鼠用TN2-2-B1-C31以三种不同的浓度注射：每只小鼠12.5、25和50μg。30分钟后，用3μg人TNF静脉内注射小鼠。

图10显示了在小鼠中TNF诱导的MCP-1产生的阻断，所述的小鼠用TN2-2-B1-C31以三种不同的浓度注射：每只小鼠12.5、25和50μg。30分钟后，用3μg人TNF静脉内注射小鼠。

图11显示了对不同组的小鼠的关节炎评分，所述的小鼠用3种不同剂量的TN2-2-B1-C31(在图中称为“Borean construct”)、盐水溶液(阴性对照)、野生型四连蛋白(阴性对照)和Remicade(阳性对照)处理。

实施例

实施例1：TNF结合多肽的分离和构建

将四连蛋白(SEQ ID NO：6)C型凝集素样结构域(CTLD)的支架结构，如先前在WO/0248 189中公开的，用于分离和构建TNF结合多肽。开发的TNF结合多肽通过仔细操作的一系列体外成熟步骤获得了它们的效力。对高特异性但是低亲和力的第一种候选分子进行连续的亲和力和结合动力学成熟步骤，得到的候选物是成熟的第3和第4个步骤的“后代”。成熟用噬菌体展示技术，基本上如WO/0248189中描述的进行。

鉴定的基于单体CTLD的TNF结合克隆在下表3中列出，一起列出了它们对应的SEQ ID NO和环1和环3/4氨基酸序列。

表3

单体克隆	SEQ ID NO	环1序列	环3/4序列	其它突变a
单体克隆	SEQ ID NO	环1序列	环3/4序列	其它突变a	TN3-2-B1-C22	29	KRWSRYF	ELPQHAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-C31	30	KRWSRYF	EHSSDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-C22	29	KRWSRYF	ELPQHAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-C31	30	KRWSRYF	EHSSDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-C24	31	KRWSRYF	ERTTDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-C22-7	32	KRWSRYF	GRKEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-C24	31	KRWSRYF	ERTTDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-C22-7	32	KRWSRYF	GRKEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-1	33	KRWSRYF	KLPQHANPSPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-2	34	KRWSRYF	LLPQHANPNPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-1	33	KRWSRYF	KLPQHANPSPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-2	34	KRWSRYF	LLPQHANPNPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-3	35	KRWSRYF	KLPQHAHPEPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-4	36	KRWSRYF	ALPQHASPSPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-3	35	KRWSRYF	KLPQHAHPEPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-4	36	KRWSRYF	ALPQHASPSPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-6	37	KRWSRYF	MLEKDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-7	38	KRWSRYF	GRKEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-6	37	KRWSRYF	MLEKDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-7	38	KRWSRYF	GRKEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-8	39	KRWSRYF	ARTQDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-9	40	KRWSRYF	ERNRDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-8	39	KRWSRYF	ARTQDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-9	40	KRWSRYF	ERNRDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-10	41	KRWSRYF	VRQRDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-11	42	KRWSRYF	ERPEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-10	41	KRWSRYF	VRQRDAQPDPSNW	D165G

TN3-2-B1-c22-12	43	KRWSRYF	SRQEDAQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-12	43	KRWSRYF	SRQEDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-13	44	KRWSRYF	ERLRDSQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-14	45	KRWSRYF	ASMKDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-13	44	KRWSRYF	ERLRDSQPDPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-14	45	KRWSRYF	ASMKDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-15	46	KRWSRYF	QLPQHADPAPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-16	47	KRWSRYF	LLPQHEQPEPSNW	D165G	TN3-2-B1-c22-15	46	KRWSRYF	QLPQHADPAPSNW	D165G
TN3-2-B1-c22-16	47	KRWSRYF	LLPQHEQPEPSNW	D165G	TN3-2-B1-c7	48	KRWSRYF	ELASDAQPDPANW	D165G
TN3-2-B1-C19	49	KRWSRYF	ELIRDAQPDPANW	D165G	TN3-2-B1-c7	48	KRWSRYF	ELASDAQPDPANW	D165G
TN3-2-B1-C19	49	KRWSRYF	ELIRDAQPDPANW	D165G	TN3-2-B1-C1	50	KRWSRYF	ELLSDAQPDPVNW	D165G
TN3-2-B1-C20	51	KRWSRYF	ERRQDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-C1	50	KRWSRYF	ELLSDAQPDPVNW	D165G
TN3-2-B1-C20	51	KRWSRYF	ERRQDAQPDPSNW	D165G	TN3-2-B1-C53	52	KRWSRYF	ERLADAQPDPFNW	D165G
TN3-2-B1-C29	53	KRWSRYF	EGIEWAQPDPTNF	D165G	TN3-2-B1-C53	52	KRWSRYF	ERLADAQPDPFNW	D165G

a：四连蛋白中的环1和环3/4位置外的突变；wt：野生型

鉴定的克隆也用四连蛋白三聚化结构元件(TTSE；SEQ ID NO：80)以三聚体形式产生。上面鉴定的克隆对应的三聚体形式在下表4中列出。

表4

三聚体克隆	SEQ ID NO	相应的单聚体克隆
三聚体克隆	SEQ ID NO	相应的单聚体克隆	TN2-2-B1-C22	54	TN3-2-B1-C22
TN2-2-B1-C31	55	TN3-2-B1-C31	TN2-2-B1-C22	54	TN3-2-B1-C22
TN2-2-B1-C31	55	TN3-2-B1-C31	TN2-2-B1-C24	56	TN3-2-B1-C24
TN2-2-B1-C22-7	57	TN3-2-B1-C22-7	TN2-2-B1-C24	56	TN3-2-B1-C24
TN2-2-B1-C22-7	57	TN3-2-B1-C22-7	TN2-2-B1-c22-1	58	TN3-2-B1-c22-1

TN2-2-B1-c22-2	59	TN3-2-B1-c22-2
TN2-2-B1-c22-2	59	TN3-2-B1-c22-2	TN2-2-B1-c22-3	60	TN3-2-B1-c22-3
TN2-2-B1-c22-4	61	TN3-2-B1-c22-4	TN2-2-B1-c22-3	60	TN3-2-B1-c22-3
TN2-2-B1-c22-4	61	TN3-2-B1-c22-4	TN2-2-B1-c22-6	62	TN3-2-B1-c22-6
TN2-2-B1-c22-7	63	TN3-2-B1-c22-7	TN2-2-B1-c22-6	62	TN3-2-B1-c22-6
TN2-2-B1-c22-7	63	TN3-2-B1-c22-7	TN2-2-B1-c22-8	64	TN3-2-B1-c22-8
TN2-2-B1-c22-9	65	TN3-2-B1-c22-9	TN2-2-B1-c22-8	64	TN3-2-B1-c22-8
TN2-2-B1-c22-9	65	TN3-2-B1-c22-9	TN2-2-B1-c22-10	66	TN3-2-B1-c22-10
TN2-2-B1-c22-11	67	TN3-2-B1-c22-11	TN2-2-B1-c22-10	66	TN3-2-B1-c22-10
TN2-2-B1-c22-11	67	TN3-2-B1-c22-11	TN2-2-B1-c22-12	68	TN3-2-B1-c22-12
TN2-2-B1-c22-13	69	TN3-2-B1-c22-13	TN2-2-B1-c22-12	68	TN3-2-B1-c22-12
TN2-2-B1-c22-13	69	TN3-2-B1-c22-13	TN2-2-B1-c22-14	70	TN3-2-B1-c22-14
TN2-2-B1-c22-15	71	TN3-2-B1-c22-15	TN2-2-B1-c22-14	70	TN3-2-B1-c22-14
TN2-2-B1-c22-15	71	TN3-2-B1-c22-15	TN2-2-B1-c22-16	72	TN3-2-B1-c22-16
TN2-2-B1-c7	73	TN3-2-B1-c7	TN2-2-B1-c22-16	72	TN3-2-B1-c22-16
TN2-2-B1-c7	73	TN3-2-B1-c7	TN2-2-B1-C19	74	TN3-2-B1-C19
TN2-2-B1-C1	75	TN3-2-B1-C1	TN2-2-B1-C19	74	TN3-2-B1-C19
TN2-2-B1-C1	75	TN3-2-B1-C1	TN2-2-B1-C20	76	TN3-2-B1-C20
TN2-2-B1-C53	77	TN3-2-B1-C53	TN2-2-B1-C20	76	TN3-2-B1-C20
TN2-2-B1-C53	77	TN3-2-B1-C53	TN2-2-B1-C29	78	TN3-2-B1-C29

实施例2：TNF结合多肽的产生和纯化

本发明的TNF结合多肽一般用下列方法产生和纯化。从含有质粒载体(含有TNF结合多肽的编码序列)的单个BL21-AI菌落，让具有100μg/mL Amp的2×TY中的6L培养物生长至A600＝0.8，随后用0.2％L-阿拉伯糖对其诱导并持续表达4小时。

采集细胞并回收包涵体。将来自6L培养物的压缩的细胞沉淀颗粒在100mL 50mM Tris-HCL pH8.0，25w/v％蔗糖、1mM EDTA(裂解缓冲液)中通过超声匀化。然后每100mL-裂解缓冲液加入100mg溶菌酶并混合，随后让样品保留在室温下15分钟。然后将样品超声处理2-5分钟，中间混合。加入100mL 0.2M NaCl、1w/v％脱氧胆酸钠盐、1w/v％Nonidet P40、20mM Tris-HCl，pH7.5、2mM EDTA(去垢缓冲液)并混合样品并再次超声处理。通过在4℃、8.000rpm下离心25分钟回收包涵体。弃去上清液并将沉淀颗粒再悬浮于100mL0.5w/v％Triton X-100、1mM EDTA，pH8中。通过在4℃、8.000rpm下离心25分钟回收包涵体。再次重复用Triton X-100缓冲液洗涤。通过在4℃、12.000rpm下离心5分钟回收包涵体。

将包涵体再悬浮于50mL 6M胍、50mM Tris pH8.0、50mM DTT中。将溶液在Sephadex G-25 Fine matrix柱上与8M脲、50mM TrispH8.0、500mM NaCl、5mM β-merc进行缓冲交换。

然后在NiNTA IMAC柱(NiNTA琼脂糖购自Qiagen)捕获蛋白质并用8M脲、50mM Tris pH8.0、500mM NaCl、5mM β-merc洗涤该柱。然后在8M脲、50mM Tris pH8.0、500mM NaCl、5mM β-merc、20mM EDTA中洗脱蛋白质。

将来自NiNTA IMAC捕获柱的捕获洗脱液用于1L量的稀释重折叠。将含有3M脲、50mM甘氨酸pH9.5、250mM NaCl、2mM CaCl₂、0.3mM胱胺的1L重折叠缓冲液过滤并置于7℃冷藏室中的2L瓶中。加入磁性搅拌棒并将搅拌设置为250rpm。然后将变性的捕获洗脱液蛋白质溶液用蠕动泵以100μL/分钟的恒定流速缓慢滴入重折叠缓冲液中。当重折叠结束时最终的蛋白质浓度为250μg/mL。

用从8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM Tris、2mM CaCl₂至8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM Tris、2mM CaCl₂、400mM NaCl的梯度(R.T.)在SP-Sepharose(Amersham)上除去多聚体。然后用总基质体积约400mL的Sephadex G-25 Fine matrix装填柱子，并以10ml/min速率用1M脲、25mM NaCl、25mM Tris，pH7.0平衡。

将来自SP-琼脂糖柱的洗脱液以约8ml/min的流速上样至Sephadex G-25 Fine matrix上。用1M脲、25mM NaCl、25mM Tris，pH7.0以约8ml/min的流速洗脱蛋白质。合并洗脱液并测量蛋白质的浓度。

以相当于1∶250％w/w(mg GrB/mg三聚体TNF结合多肽)的比率加入粒酶B。加入该酶后将溶液轻轻混合并在25℃下孵育24小时。消化后，将固体脲加入进该溶液产生8M脲溶液并将pH用1M醋酸钠调至pH4.5。

精选TNF结合多肽并在Source 15S柱(Amersham)上用从8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM Tris、2mM CaCl₂至8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM Tris、2mM CaCl₂、1000mM NaCl的梯度(R.T.)浓缩。最后，洗脱的单体级分可以在Sephadex G-25 Fine matrix上通过凝胶过滤在25mM醋酸钠pH5.0、50mM NaCl、50mM蔗糖中配制。该步骤产量多于95％并且蛋白质能抵抗多次冻-融循环而通过A410没有可见的或可测量的沉淀产生。

实施例3：TNF结合多肽的生物学活性

将表4中显示的选择的TNF结合多肽，即TN2-2-B1-C22、TN2-2-B1-C31、TN2-2-B1-C24、TN2-2-B1-C22-7、TN2-2-B1-C22-2、TN2-2-B1-C22-8、TN2-2-B1-C22-12、TN2-2-B1-C22-14、TN2-2-B1-C22-19以及单体TN3-2-B1-C22和TN3-2-B1-C22-7(分别对应TN2-2-B1-C22和TN2-2-B1-C22-7)用L929肿瘤细胞系(一种鼠成纤维样细胞)通过测量它们抑制TNF的生物学活性的能力进行测定。将选择的克隆的TNF中和活性与可商业获得的TNF拮抗剂Remicade(Eternacept)、Enbrel(英夫利昔单抗)和可溶性TNF受体II(TNFRII/TNFRSF1B，R&D Systems Catalog no.1089-R2-025/CF)比较。

TNF抑制测定根据以下测定方法进行：将L929细胞(ECACC no.：85011425)在安排测定前一天以3×10⁵/ml涂板。在开始试验前必须让细胞贴壁并变成汇合。将75μL体积的细胞悬液加入进平底96-孔微量滴定板(Nunclon；Cat.No.：167008)中。保留一行8个孔没有细胞，作为ELISA酶标仪的空白。将试验样品稀释进含有2μg/ml放线菌素D的培养基中得到1μg/ml放线菌素D的最终培养物浓度，这时加入至细胞中。将放线菌素D(Sigma)以20μg/ml溶解于PBS中(如果必要，升温至37℃)并以5ml(或适当量)等份在-20℃下保存。根据需要解冻出人TNF并用培养基稀释至4μg/ml-解冻的浓缩溶液在4℃下稳定多达2周。对培养基中的试验样品进行一系列稀释(4倍适合于TNF QC)。然后以不同浓度稀释试验样品与人TNF的比例为1∶1。对于每次稀释加入75μl体积至L929细胞，重复三份。在每个板上包括一个阴性对照(即仅组织培养基)和一个阳性对照(没有阻断剂的人TNF)。加入试验样品后在37℃、5％CO₂下孵育所述微量滴定板16小时。用MTT(3-[4，5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二-苯基-溴化四唑)测量细胞增殖，MTT是CellTiter 96非-放射性细胞增殖测定试剂盒(Promega)的一部分：解冻MTS-和PMS溶液。为了制备足够用于含有在150μl体积中培养的细胞的96孔板，用无菌技术从棕色试剂瓶中移出3.0ml MTS溶液并转移至试管中。在加入含有细胞的培养板前立即将150μl PMS溶液加至3.0ml MTS溶液中。轻轻旋转晃动试管以确保合并的MTS/PMS溶液完全混合。吸移30μl合并的MTS/PMS溶液进含有150μl培养基中的细胞的96孔测定板的每个孔中。将该板在潮湿的、5％CO₂气氛中于37℃孵育1-4小时。用ELISA酶标仪纪录490nm下的吸光度。

上面的TNF抑制测定获得的结果在图1、2、3、4、5和6中说明。从图1、3和4中清楚地看出，三聚体克隆TN2B1C22、TN2B1C31和TN2B1C24(对应单体TN3-2-B1-C22、TN3-2-B1-C31和TN3-2-B1-C24)与Remicade(英夫利昔单抗)和可溶性TNF受体II(RII)相比全部具有相当的或更好的TNF中和能力。特别是，可以从图1和3看出，TN2-2-B1-C22和TN2-2-B1-C31也优于Enbrel。图1显示，单体形式的TN2B1C22(即TN3-2-B1-C22)的TNF抑制能力与Remicade相当。从图2可以看出，单体形式的TN2B1C22-7(即TN3-B1-C22-7)优于Remicade。

实施例4：HUVEC测定法

人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)是分离自脐带的原代未转化的人细胞。该细胞可以在培养物中传代几次。脐带静脉内皮细胞对TNF敏感。在用TNF激活后，该细胞开始产生炎性细胞因子如IL8和IL6。这些应答代表了在细菌感染后的第一道防线。为了研究TNF结合多肽的效力，我们试验了TNF诱导的IL6和IL8生产的抑制。

在EGM-2培养基中开始测定前一天涂布HUVEC细胞(Cambrex Lot.Nr.2f1828)。在开始试验前必须让细胞贴壁并变成汇合。以每孔200μl 5×10⁴/mL HUVEC细胞悬液吸移进平底96孔微量滴定板(Nunclon；Cat.No.：167008)的孔中。在培养基中稀释试验样品。试验样品如下制备：将标明浓度的TNF结合多肽、Enbrel或Remicade与3ng/ml人TNF孵育15分钟，然后将100μg所述溶液加至HUVEC细胞中，得到1ng/ml的TNF终浓度。确切的稀释范围取决于试验样品的性质和靶标的灵敏性。每个板包括一个阴性对照(即仅组织培养基)和一个阳性对照。加入试验样品后在37℃、5％CO₂下孵育所述微量滴定板16-24小时。

第二天从板孔收集上清液并根据人IL-6 & IL-8-ELISA(96孔maxisorp Nunc板)的方法进行IL6和IL8(10×稀释)Elisa来测量TNF诱导的细胞因子。下列材料用于ELISA：人重组IL-6：Cat.No.：206-IL-010(R&D Systems)、单克隆抗-人IL-6抗体Code no.：MAB 206(R&D Systems)、生物素化抗-人IL-6抗体Cat.No.：BAF206(R&DSystems)、人重组IL-8：Cat.No.：208-IL(R&D Systems)、单克隆抗-人IL-8抗体Code no.：MAB 208(R&D Systems)、生物素化抗-人IL-8抗体Cat.No.：BAF208(R&D Systems)。

TNF结合多肽TN3-2-B1-C31、TN3-2-B1-C22-7、TN3-2-B1-C22-8在上面的HUVEC测定法中试验。该试验得到的结果在图6和7中说明。如可以从这些图看到的，TNF结合多肽TN3-2-B1-C31，TN3-2-B1-C22-7，TN3-2-B1-C22-8完全能阻断IL8(图6)和IL6(图7)的诱导。在这方面，TNF结合多肽TN3-2-B1-C22-7(C22-7)和TN3-2-B1-C22-8(C22-8)与Enbrel一样好并且显著好于Remicade。

实施例5：聚乙二醇化TNF结合多肽GG-I10-TN-2-B1-C22-7

三聚体TNF结合多肽GG-I10-TN-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：79)基本如实施例2中描述的制备，不同的是所述的溶液在Sephadex G-25Fine matrix柱上缓冲改变为下面提到的聚乙二醇化缓冲液。

已经通过在N-末端删除序列中的前9个氨基酸并在N末端加入两个甘氨酸残基采用这种构建体用于聚乙二醇化。将含有20mM NaCNBH₃的8M脲、50mM NaH₂PO₄ pH6.0、50mM NaCl中的0.5mg/mLGG-I10-TN-2-B1-C22-7溶液加入至10摩尔过量的甲氧基聚(乙二醇)丁醛(mPEG-ALD)，所述的mPEG-ALD具有20kDa的平均分子量。在约20℃下过夜搅拌反应物。随后，通过SDS-PAGE测定蛋白质和mPEG-ALD之间的反应程度。

为了从未反应的单体分离聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7，进行了阳离子交换柱层析。将在8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mMCaCl₂中平衡的1mL Source 15S柱(Amersham)用反应混合物上样并将从8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM CaCl₂至8M脲、50mM醋酸钠pH4.5、2mM CaCl₂、1000mM NaCl的线性梯度用于将聚乙二醇化蛋白和未聚乙二醇化蛋白分级。

L929测定法如实施例3中描述的进行，所述的测定法使用了聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(20kPEG-GG-I10-TN-2-B1-C22-7)、非聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(GG C22-7)和未突变的TN-2-B1-C22-7(C22-7)(SEQ ID NO：32)。Enbrel和Remicade用作对照。

如从图8可以看出的，在体外测定法中所述聚乙二醇化物质的效力与未聚乙二醇化的物质没有显著不同。

实施例6：小鼠中炎性细胞因子诱导的体内阻断

用3种不同浓度的TNF结合多肽TN2-2-B1-C31注射小鼠：每只小鼠12.5、25和50μg。30分钟后，用3μg人TNF静脉内注射小鼠。通常可以在对照中看到，人TNF诱导炎性细胞因子(如IL-6和MCP-1)产生。然而，如从图9和10中看到的，TNF结合多肽TN2-2-B1-C31能阻断这些炎性细胞因子的诱导。

实施例6：类风湿性关节炎诱导的体内预防。

Tg197转基因小鼠品系表达人TNF。该小鼠携带5个拷贝的人TNF并在3-4周大时发展多关节炎。该疾病在第4周时是临床上可检测的，其具有踝关节肿胀和变形。在8-10周大时这导致严重的关节破坏和后腿腿部运动的受损。进行性体重减轻是常见的。TNF中和剂的适当施用防止了该疾病的发展。为了试验本发明TNF结合多肽在预防Tg197鼠关节炎模型中的多关节炎的效力，将TN-2-B1-C31施用给多组Tg197小鼠，这些小鼠在年龄和体重上是相当的。在3-4周大时开始预防性治疗。TNF结合多肽以三种剂量施用：3.3、1.0和0.5mg/kg，每周三次，腹膜内(i.p.)施用5周。在第二次i.p.注射和试验末期提取血液样品。

评估关节炎的严重性并表示为AS-0至AS-3的关节炎评分范围，其中0是无关节炎以及3是由于关节中软骨降解和骨降解引起的完全变跛。

图11显示了对不同组的小鼠的关节炎评分，所述的小鼠用3种不同剂量的TN2-2-B1-C31(在图中称为“Borean construct”)、盐水溶液(阴性对照)、野生型四连蛋白(阴性对照)和Remicade(阳性对照)处理。如可以在图11中看到的，TN2-2-B1-C31剂量越高关节炎评分越低。这表明TN2-2-B1-C31治疗类风湿性关节炎是有效的。

序列表

<110>Borean Pharma A/S

<120>TNF拮抗剂

<130>16291

<160>81

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>1

Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>任何氨基酸残基

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸残基

<400>2

Pro Xaa Pro Xaa Asn

1 5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>亲水性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>疏水性氨基酸

<400>3

Xaa Pro Xaa Pro Xaa Asn Xaa

1 5

<210>4

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>4

Glu Leu Pro Gln His Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>5

Glu His Ser Ser Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Ash Trp

1 5 10

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>6

Arg Glu Thr Thr Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>7

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>7

Gly Arg Lys Glu Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>8

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>8

Lys Leu Pro Gln His Ala Asn Pro Ser Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>9

Leu Leu Pro Gln His Ala Asn Pro Asn Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>10

Lys Leu Pro Gln His Ala His Pro Glu Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>11

Ala Leu Pro Gln His Ala Ser Pro Ser Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>12

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>12

Met Leu Glu Lys Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>13

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>13

Gly Arg Lys Glu Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>14

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>14

Ala Arg Thr Gln Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>15

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>15

Glu Arg Asn Arg Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>16

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>16

Val Arg Gln Arg Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>17

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>17

Glu Arg Pro Glu Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>18

Ser Arg Gln Glu Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>19

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>19

Glu Arg Leu Arg Asp Ser Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>20

Ala Ser Met Lys Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>21

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>21

Gln Leu Pro Gln His Ala Asp Pro Ala Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>22

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>22

Leu Leu Pro Gln His Glu Gln Pro Glu Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>23

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>23

Glu Leu Ala Ser Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ala Asn Trp

1 5 10

<210>24

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>24

Glu Leu Ile Arg Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ala Asn Trp

1 5 10

<210>25

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>25

Glu Leu Leu Ser Asp Ala Gln Pro Asp Pro Val Asn Trp

1 5 10

<210>26

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>26

Glu Arg Arg Gln Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp

1 5 10

<210>27

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>27

Glu Arg Leu Ala Asp Ala Gln Pro Asp Pro Phe Asn Trp

1 5 10

<210>28

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>28

Glu Gly Ile Glu Trp Ala Gln Pro Asp Pro Thr Asn Phe

1 5 10

<210>29

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>29

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Leu Pro Gln

85 90 95

His Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>30

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>30

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu His Ser Ser

85 90 95

Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>31

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>31

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Arg Thr Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>32

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>32

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Gly Arg Lys Glu

85 90 95

Asp Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>33

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>33

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Lys Leu Pro Gln

85 90 95

His Ala Asn Pro Ser Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>34

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>34

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Leu Pro Gln

85 90 95

His Ala Asn Pro Asn Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>35

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>35

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp

20 25 30

Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala

50 55 60

Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val

65 70 75 80

Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Lys Leu Pro Gln

85 90 95

His Ala His Pro Glu Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val

130 135

<210>36

<211>137

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>36

Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys

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<213>智人

<400>79

Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp

1 5 10 15

Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr

20 25 30

Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr

35 40 45

Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe

50 55 60

Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg

65 70 75 80

Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu

85 90 95

Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu

100 105 110

Gly Leu Asn Asp Met Ala Ala Glu Gly Thr Trp Val Asp Met Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro

130 135 140

Asp Gly Gly Lys Thr Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn

145 150 155 160

Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys

165 170 175

Gln Phe Gly Ile Val

180

<210>80

<211>51

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>80

Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp

1 5 10 15

Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr

20 25 30

Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr

35 40 45

Val Cys Leu

50

<210>81

<211>73

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工的

<400>81

Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Gln Gly Arg Ser

1 5 10 15

Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala

20 25 30

Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg

35 40 45

Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala

50 55 60

Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Ser

65 70

Claims

1.能结合肿瘤坏死因子(TNF)的多肽，其中所述的多肽包含氨基酸序列KRWSRYF(SEQ ID NO：1)。

2.根据权利要求1的多肽，其中所述的氨基酸序列形成C型凝集素样结构域的一部分。

3.根据权利要求2的多肽，其中所述C型凝集素样结构域源于四连蛋白。

4.根据权利要求3的多肽，其中源于四连蛋白的C型凝集素样结构域是基本如SEQ ID NO：79中的残基50-181列出的氨基酸序列。

5.根据权利要求4的多肽，其中SEQ ID NO：79中的165号天冬氨酸残基突变为甘氨酸。

6.根据权利要求1的多肽，所述多肽进一步包含氨基酸序列PX₁PX₂N(SEQ ID NO：2)，其中X₁和X₂各自独立地是氨基酸残基。

7.根据权利要求1的多肽，所述多肽进一步包含氨基酸序列X₁PX₂PX₃NX₄(SEQ ID NO：3)，其中X₁是选自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的亲水性氨基酸；X₂和X₃各自独立地是氨基酸残基，以及X₄是选自M、A、V、L、P、W、F、Y和C的疏水性氨基酸。

8.根据权利要求1的多肽，所述多肽进一步包含氨基酸序列X₁PX₂PX₃NX₄(SEQ ID NO：3)，其中X₁是选自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的亲水性氨基酸；X₂和X₃各自独立地是氨基酸残基，以及X₄是选自W、F和Y的芳香族氨基酸。

9.根据权利要求1的多肽，所述多肽进一步包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。

10.根据权利要求9的多肽，所述多肽选自TN3-2-B1-C22(SEQ IDNO：29)、TN3-2-B1-C31(SEQ ID NO：30)、TN3-2-B1-C24(SEQ ID NO：31)、TN3-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：32)、TN3-2-B1-c22-1(SEQ ID NO：33)、TN3-2-B1-c22-2(SEQ ID NO：34)、TN3-2-B1-c22-3(SEQ ID NO：35)、TN3-2-B1-c22-4(SEQ ID NO：36)、TN3-2-B1-c22-6(SEQ ID NO：37)、TN3-2-B1-c22-7(SEQ ID NO：38)、TN3-2-B1-c22-8(SEQ ID NO：39)、TN3-2-B1-c22-9(SEQ ID NO：40)、TN3-2-B1-c22-10(SEQ ID NO：41)、TN3-2-B1-c22-11(SEQ ID NO：42)、TN3-2-B1-c22-12(SEQ ID NO：43)、TN3-2-B1-c22-13(SEQ ID NO：44)、TN3-2-B1-c22-14(SEQ ID NO：45)、TN3-2-B1-c22-15(SEQ ID NO：46)、TN3-2-B1-c22-16(SEQ ID NO：47)、TN3-2-B1-c7(SEQ ID NO：48)、TN3-2-B1-C19(SEQ ID NO：49)、TN3-2-B1-C1(SEQ ID NO：50)、TN3-2-B1-C20(SEQ ID NO：51)、TN3-2-B1-C53(SEQ ID NO：52)和TN3-2-B1-C29(SEQ ID NO：53)。

11.根据权利要求3的多肽，其中所述C型凝集素样结构域连接至源于四连蛋白的三聚化结构域。

12.根据权利要求11的多肽，其中所述源于四连蛋白的三聚化结构域包含与SEQ ID NO：80的序列具有至少68％氨基酸序列同一性的序列。

13.根据权利要求12的多肽，其中所述氨基酸序列同一性是至少75％，例如至少87％，包括至少92％。

14.根据权利要求11的多肽，其中所述源于四连蛋白的三聚化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：81。

15.根据权利要求11的多肽，所述多肽选自TN2-2-B1-C22(SEQID NO：54)、TN2-2-B1-C31(SEQ ID NO：55)、TN2-2-B1-C24(SEQ IDNO：56)、TN2-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：57)、TN2-2-B1-c22-1(SEQ IDNO：58)、TN2-2-B1-c22-2(SEQ ID NO：59)、TN2-2-B1-c22-3(SEQ IDNO：60)、TN2-2-B1-c22-4(SEQ ID NO：61)、TN2-2-B1-c22-6(SEQ IDNO：62)、TN2-2-B1-c22-7(SEQ ID NO：63)、TN2-2-B1-c22-8(SEQ IDNO：64)、TN2-2-B1-c22-9(SEQ ID NO：65)、TN2-2-B1-c22-10(SEQ IDNO：66)、TN2-2-B1-c22-11(SEQ ID NO：67)、TN2-2-B1-c22-12(SEQID NO：68)、TN2-2-B1-c22-13(SEQ ID NO：69)、TN2-2-B1-c22-14(SEQID NO：70)、TN2-2-B1-c22-15(SEQ ID NO：71)、TN2-2-B1-c22-16(SEQID NO：72)、TN2-2-B1-c7(SEQ ID NO：73)、TN2-2-B1-C19(SEQ IDNO：74)、TN2-2-B1-C1(SEQ ID NO：75)、TN2-2-B1-C20(SEQ ID NO：76)、TN2-2-B1-C53(SEQ ID NO：77)、TN2-2-B1-C29(SEQ ID NO：78)和GG-I10-TN-2-B1-C22-7(SEQ ID NO：79)。

16.分离的核酸，所述核酸包含编码权利要求1-15任意一项中定义的多肽的序列。

17.表达载体，所述表达载体包含权利要求16的分离的核酸。

18.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求17的表达载体。

19.用于制备如权利要求1-15任意一项中定义的能结合TNF的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在所述多肽得以表达的条件下表达权利要求16的分离的核酸，以及(ii)回收所述多肽。

20.药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1-15任意一项的多肽。

21.治疗患有由TNF介导的病理学的受试者的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-15任意一项的多肽或根据权利要求20的组合物给所述受试者。

22.根据权利要求21的方法，其中所述由TNF介导的病理学选自类风湿性关节炎、银屑病和节段性回肠炎。

23.用于检测样品中的TNF的测定方法，所述方法包括(i)让所述样品与根据权利要求1-15任意一项的多肽接触，并(ii)检测TNF与所述多肽的结合。

24.如权利要求1-15任意一项定义的多肽，所述多肽用作药物。

25.如权利要求1-15任意一项定义的多肽，所述多肽用于治疗由TNF介导的疾病。

26.如权利要求1-15任意一项中定义的多肽在制备药物制剂中的用途。